KR20110096292A - 간암 진단용 마커로서의 ｓｏｃｓ6의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 진단용 마커로서의 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6)의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 SOCS6 유전자를 이용한 간암 진단용 마커, 이를 이용한 간암 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 간암을 진단하는 방법에 관한 것이고, 또한, SOCS6 유전자 또는 단백질의 발현을 증가시켜 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SOCS6 유전자는 정상의 세포 또는 조직에 비해 간암이 발병된 조직 또는 세포에서 발현양이 감소되는 것으로 확인됨에 따라 SOCS6 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 SOCS6가 종양 억제자로서의 역할을 할 수 있으므로 이를 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제의 용도로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

간암 진단용 마커로서의 ＳＯＣＳ6의 용도{Use of SOCS6 as a hepatocellular carcinomar diagnostic marker}

본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커, 간암 진단용 조성물, 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암 진단 방법 및 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

간암은 세계적으로 발생 빈도가 높고 치명적인 암의 하나로, 매년 100 만명의 환자들이 간암으로 사망하고 있으며, 특히 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생되는 가장 흔한 암이다(Parkin, et al., Int . J. Cancer , 80, 827-841, 1999, Luo et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1 st Ed., pp. 435-445, 1997, Chen et al., J. Gastroenterol . Hepatol . 12, S294-308, 1997). 간암의 발생은 간 조직에 B형 간염과 C형 간염 바이러스의 감염 및 아플라톡신 β1의 노출이 그 원인으로 보고되고 있으며(Bosch, et al., Semin. Cancer Dis . 19, 271-285, 1999, Luo, et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1 st Ed., pp. 435- 445, 1997), TGF-α(transforming growth factor α) 및 TGF-β와 같은 몇 가지 생장인자(growth factor)들이 간암의 진행기작에 연관됨이 보고되고 있고, 암 억제인자로 잘 알려진 RB 및 p53 단백질도 간암 형성 과정에 중요한 역할을 수행하는 후보 유전자들로 밝혀졌다(Collier, et al., Liver , 13, 151-155, 1993, Naka, et al., Anticancer Res . 18, 555-564, 1998). 이 외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암의 환자조직에서 확인된다는 보고가 있다(Park, et al., Cancer Res. 59, 307-310, 1999).

그러나 간암의 발병 기작에 대한 정확한 원인은 아직까지 밝혀지지 않고 있으며, 간암의 발병과 관련된다고 밝혀진 유전자들 또한 간암 환자들의 외적 특성과 임상 특성을 정확하게 반영하지 못하고 있다.

또한, 지난 수년간 암에 대한 원인규명, 진단방법 및 치료방법에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 아직까지 암을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 개발되지 못하고 있다. 따라서 암을 초기 단계에 발견하여 외과적 수술 또는 약물 치료에 의해 암세포를 제거하거나 성장을 억제하는 것이 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.

최근에는 암을 조기에 진단하기 위하여 종양 마커를 이용한 진단방법이 사용되고 있는데, 이는 종양 마커의 경우, 체내의 특정 암 세포에서 과발현되는 경우가 많기 때문에 종양 마커가 기준치 이상으로 발현되었다는 것이 확인되면 바로 특정 장기의 암을 진단할 수 있기 때문이다. 또한 종양 마커를 이용한 암의 진단은 대부분 항체를 이용한 혈액 검사방법으로 수행되고 있으며, 일부는 조직 추출액, 소변, 대변 등을 이용하여 검사하기도 한다. 그러나 종양 마커는 암이 발생하는 장소에 따라 그 종류가 다양하고, 사람에게 생기는 모든 암을 확인할 수 있는 종양 마커는 없으며, 진단이 가능한 종양 마커가 없는 암의 종류도 많다.

한편, 간암의 대표적인 종양 마커로는 알파-페토프로틴, 즉, 알파태아단백(Alpha-Fetoprotein:AFP)이 사용되고 있는데, AFP는 간세포가 형질전환되어 암세포로 탈분화 되었을 때 비정상적으로 생성되는 당단백질로서, 원발성 간암, 간염, 간경변 및 태아성암 등의 발견과 치료경과의 관찰에 이용되고 있다. 또한, 최근에는 이 외에도 DCP(Des-gamma carboxyprothrombin), PIVKA-II(prothrombin induced by vitamin K absence-II), AFP-L3(lens cularis agglutinin-reactive) 및 GPC3(glypican-3) 등이 간암을 진단할 수 있는지에 관한 연구가 진행되고 있다.

그러나 종래 사용되고 있는 AFP 간암 마커의 경우, 조기 간암 진단시 저감도 및 저특이성을 보이고 있으며, 간경변이나 간염의 악화시에도 발견되고 있어 조기의 간암을 특이적으로 진단하기에는 많은 문제점이 있다.

또한, 간암 치료를 위해 고주파 열 치료나 다양한 방사선 치료법이 개발되었으나 이러한 기술의 개발에도 불구하고 간암 발병 후의 장기 생존율은 매우 낮으며 수술 후에도 재발이 빈번히 발생하고 있다. 그러나 간암의 진단 시기에 따른 예후가 간암 발병 후의 생존율에 큰 영향을 준다는 보고가 발표된 이후 최근에는 간암의 조기 진단 바이오 마커의 개발이 임상적으로 중요한 이슈로 대두되고 있다. 따라서 조기 간암의 진단율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 새로운 종양 마커의 개발이 시급한 실정이다.

또한, 간암을 치료하기 위해 사용되는 방법으로는 눈에 보이는 병소를 대상으로 하는 외과적 수술법, 라디오파 소작요법(radio-wave thermocauterization therapy), 에탄올 주입요법 및 마이크로웨이브 응고 괴사요법 등이 있으며, 전신요법으로서의 화학요법이 있다. 그러나 이러한 다양한 치료 방법에도 불구하고 치료 성적이 반드시 양호한 것은 아니며, 종래의 치료 방법의 경우 인체 내에서 각종 부작용이 발생한다는 문제점이 있다. 따라서 간암에 대해서 어느 정도의 치료 성적을 안정하게 보증하는 표준적인 치료방법이 없는 이상 간암을 초기에 진단할 수 있는 방법 및 기존에 알려지지 않은 새로운 진단 마커를 통한 보다 정확하고 신속한 간암 진단 방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, SOCS(suppressors of cytokine signaling) 단백질들은 사이토카인(cytokine) 신호전달의 음성적 피드백 조절인자(negative feedback regulator) 그룹에 속하며, 자누스 키나아제/신호 전달인자(Janus kinase/signal transducer) 및 전사 (JAK/STAT) 경로의 활성인자(activator)들을 포함하고 있는 것으로 알려져 있으며(Krebs D. L. and Hilton D. J. SOCS: physiological suppressors of cytokine signaling. J Cell Sci 2000; 113 (Pt 16):2813-9), 최근 보고된 자료에 의하면, SOCS 단백질들은 인슐린 수용체(insulin receptor, IR), EGFR 및 KIT를 포함하는 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase, RTK) 신호전달의 음성 조절인자로 작용할 수 있다는 내용이 보고되었다(Emanuelli B., et al. SOCS-3 is an insulin-induced negative regulator of insulin signaling. J Biol Chem 2000; 275:15985-91, Kario E., et al. Suppressors of cytokine signaling 4 and 5 regulate epidermal growth factor receptor signaling. J Biol Chem 2005; 280:7038-48, Bayle J., et al. Suppressor of cytokine signaling 6 associates with KIT and regulates KIT receptor signaling. J Biol Chem 2004; 279:12249-59).

SOCS 패밀리 중에서 SOCS6는 SOCS1-3 및 CIS와 같은 다른 SOCS 단백질들처럼 JAK/STAT 경로를 조절하지 않는다는 사실이 밝혀졌고(Masuhara M., et al. Cloning and characterization of novel CIS family genes. Biochem Biophys Res Commun 1997; 239:439-46), 나아가 SH2 도메인 및 SOCS 박스를 통해 E3 유비퀴틴 리가아제, 힘-산화(heme-oxidized) IRP2 유비퀴틴 리가아제-1(HOIL-1)에 결합함으로써 표적 단백질들을 프로테아좀에 의해 분해(proteasomal degradation)시킬 수 있도록 작용한다는 사실이 밝혀져 있다(Bayle J., et al. The E3 ubiquitin ligase HOIL-1 induces the polyubiquitination and degradation of SOCS6 associated proteins. FEBS Lett 2006; 580:2609-14). SOCS6는 ERK1/2, AKT 및 IRS-1의 활성을 포함한 IR 신호전달을 약화시키는 작용을 하는 것으로 밝혀졌고(Mooney R. A., et al. Suppressors of cytokine signaling-1 and -6 associate with and inhibit the insulin receptor. A potential mechanism for cytokine-mediated insulin resistance. J Biol Chem 2001; 276:25889-93.), 또한, SOCS6의 경우, KIT와 상호작용하며 줄기세포인자-매개의(stem cell factor-mediated) KIT 신호전달을 음성적으로 조절한다는 내용이 보고된 바 있다(Bayle J., et al. Suppressor of cytokine signaling 6 associates with KIT and regulates KIT receptor signaling. J Biol Chem 2004; 279:12249-59). 그러나 이러한 결과들은 SOCS6가 사이토킨 신호전달이 아니라 RTK 신호전달의 억제자임을 시사한다.

한편, SOCS 단백질 중에서 특히 SOCS6의 경우, 간암 발병과 상관성이 있으며, 이를 간암 진단을 위한 마커 또는 간암의 치료제를 위한 타겟으로 사용할 수 있다는 내용에 대해서는 아직까지 전혀 보고된 바가 없다.

그러므로 본 발명의 목적은 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 SOCS6 유전자의 수준 또는 SOCS6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트 및 간암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 SOCS6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6)를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 SOCS6 (suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 SOCS6 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SOCS6 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자의 수준 또는 SOCS6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SOCS6 유전자의 수준을 측정하는 물질은 SOCS6 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SOCS6 단백질의 수준을 측정하는 물질은 SOCS6 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은,

(a) 생물학적 시료에 존재하는 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 SOCS6 유전자 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SOCS6 유전자의 발현양 또는 SOCS6 단백질의 양을 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) SOCS6 (suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 SOCS6 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성을 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6)를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 SOCS6 유전자는 정상의 세포 또는 조직에 비해 간암이 발병된 조직 또는 세포에서 발현양이 감소되는 것으로 확인됨에 따라 SOCS6 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 SOCS6가 종양 억제자로서의 역할을 할 수 있으므로 이를 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제의 용도로 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 간암 조직과 정상 조직 및 간암 세포와 정상 세포에서의 SOCS6의 발현정도를 비교 측정한 것을 나타낸 것으로서, 1a는 조직샘플을 대상으로 웨스턴 블럿을 수행한 것이고, 1b는 세포샘플들을 대상으로 웨스턴 블럿을 수행한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 정상 및 간암 조직 샘플내에서 SOCS6의 발현 정도를 면역조직화학적 염색 방법을 통해 비교 분석한 사진을 나타낸 것으로서, 2a 및 2c는 정상조직을 대상으로 관찰한 것이며, 2b 및 2d는 간암조직을 대상으로 관찰한 것을 나타낸 것이고, 2a 및 2b 는 X200 배율에서, 2c 및 2d는 X400배율에서 관찰한 것이다.

본 발명은 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 SOCS6 단백질을 포함하는 신규한 간암 진단용 마커를 제공함에 특징이 있다.

기존에 간암 진단을 위해 사용되고 있는 대부분의 마커의 경우, 간암을 정확하게 진단하는 비율이 비교적 낮고 간암 이외의 다른 질병들과도 뚜렷한 구분을 보이지 않아 간암에 대한 예민도 및 특이도가 낮은 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 새로운 간암 진단용 마커를 발굴하기 위해 간암 조직 및 비-간암 조직에서 발현의 차이를 보이는 유전자를 조사한 결과, SOCS6 (suppressors of cytokine signaling 6) 유전자가 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 낮게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 SOCS6 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었고, SOCS6의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내었다.

이에 본 발명자들은 정상 세포에 비해 간암 세포에서 SOCS6 유전자의 발현이 감소되는 현상을 확임함에 따라 SOCS6 유전자를 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 예상할 수 있었으며, 본 발명의 일실시예에 따르면, 간암 환자의 조직 및 정상 조직에서의 SOCS6 유전자의 발현 정도를 웨스턴 블럿과 면역조직화학적 염색법을 통해 관찰한 결과, SOCS6 유전자의 발현은 정상샘플에 비해 종양 샘플들에서 거의 모두 감소되는 것으로 나타났다(도 1 및 2 참조).

한편, 종래 보고된 연구자료에 따르면, SOCSs, 특히 SOCS1 및 SOCS3가 하향조절, 즉 발현양이 감소되면 간암 세포 내에서 JAK/STAT 경로의 활성이 동반된다는 내용이 보고된 바 있으며, SOCS3-결함 마우스에서 간암발병(hepatocarcinogenesis)이 유도된다는 내용이 보고된 바 있다(Ogata H., et al. Deletion of the SOCS3 gene in liver parenchymal cells promotes hepatitis-induced hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 2006; 131:179-93).

따라서 이러한 결과들은 SOCS1 및 SOCS3가 종양 억제인자로 작용함으로써 간암의 성장에 관여한다는 것을 나타낸다.

또한, 일반적으로 암-관련 신호전달 경로에서 SOCS6의 작용에 대해서는 단지, SOCS6가 KIT 발현이상을 일으키지 않는 ERK1/2 및 p38 활성의 상류(upstream)에 있는 줄기세포인자 유도 KIT 수용체 신호전달(stem-cell-factor induced KIT receptor signaling)의 음성적 조절인자라는 내용이 밝혀졌을 뿐(Bayle J., et al. Suppressor of cytokine signaling 6 associates with KIT and regulates KIT receptor signaling. J Biol Chem 2004; 279:12249-59), 이 외의 작용에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 SOCS6 역시 종양 억제인자로 작용할 수 있을 것으로 예상하였고, 상기와 같은 일실시예를 통해 간암 조직 및 세포에서 SOCS6의 발현이 억제된다는 사실을 확인함에 따라 SOCS6가 종양 억제인자로서의 역할을 하며, 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였다.

따라서 본 발명은 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 SOCS6 단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 간암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포에서 발현양이 감소하는 SOCS6 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 SOCS6 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 SOCS6 유전자의 수준 또는 SOCS6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 SOCS6 유전자의 수준은, 바람직하게 SOCS6 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 SOCS6 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 SOCS6 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 SOCS6 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 SOCS6 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 SOCS6 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 SOCS6 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 SOCS6 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 SOCS6 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 SOCS6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 간암 진단용 키트에 포함되는 간암 진단용 조성물은 SOCS6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 간암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 SOCS6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, SOCS6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 SOCS6 유전자의 발현수준 또는 SOCS6 단백질 수준을 측정하여 간암을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정서상조군 시료의 SOCS6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 SOCS6 유전자의 발현수준 또는 SOCS6 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 간암 조직 또는 간암 세포주를 정상 조직 또는 정상 세포주와 비교하여 각각의 세포 또는 조직에서 발현되는 SOCS6의 발현수준을 웨스턴 블럿을 통해 비교하였다. 그 결과, 간암이 발생한 샘플에서의 SOCS6 단백질 발현정도가 정상 샘플에 비해 감소함을 확인함으로써, 상기 본 발명에 따른 간암 진단 방법은 생물학적 시료에서의 SOCS6 발현 수준이 대조군에 비해 감소되는 것으로 나타날 경우, 이를 간암이 발병된 것으로 진단할 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 SOCS6 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

또한, 상기 SOCS6 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 SOCS6 단백질 수준 측정은 항체를 이용할 수도 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 SOCS6 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 SOCS6 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 SOCS6 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 SOCS6 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 SOCS6 유전자 또는 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다.

상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드 또는 천연 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성이 증가되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 SOCS6 유전자의 발현양, SOCS6 단백질의 양 또는 SOCS6 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

나아가, 본 발명에서 SOCS6 유전자 또는 단백질의 발현이 정상조직 또는 정상세포에 비해 간암조직 또는 간암세포에서 감소된다는 사실을 통해 본 발명자들은 SOCS6가 종양 억제자로 작용할 수 있으며 따라서 SOCS6를 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제로서 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 SOCS6를 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 SOCS6 단백질 또는 SOCS6 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 SOCS6 유전자를 함유하는 발현 벡터를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 상기 SOCS6 단백질은 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열로부터 코팅되는 폴리펩타이드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드일 수 있다.

또한, 본 발명의 SOCS6 단백질은 서열번호 1의 염기서열로부터 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 SOCS6와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 Grim19의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 SOCS6의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 Grim19의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 SOCS6의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질　등이 이에 포함될 수 있다. 본 발명에서 SOCS6 단백질은 DNA 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있으며 이를 위하여 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 SOCS6 단백질은 상기 SOCS6 유전자를 사용하여 세균, 효모, 식물 세포주 및 동물 세포주 내에서 재조합 방식으로 주입하는 유전공학 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물에 포함되는 발현벡터는 상기 SOCS6 유전자가 삽입된 발현벡터를 말하며 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 SOCS6 단백질 또는 SOCS6 유전자를 포함하는 발현벡터를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 간암의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 간암의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 간암의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 간암의 증상을 경감시킴.

(4) 간암의 재발을 예방함, 및

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

시료의 준비

(1) 조직 샘플

10명의 환자들로부터 67개의 냉동 간암(hepatocelullar carcinoma)조직 샘플을 얻었다. 본 실시예에서 사용된 상기 조직 샘플들은 카톨릭대학교 의과대학 윤리검토위원회의 승인을 받은 것이며, 헬싱키 선언의 요구에 부합되도록 사전에 참가자들로부터 동의를 받았다. 또한 대조군으로는 정상의 조직 샘플을 수득하여 사용하였다.

(2) 세포배양

10% 소태아혈청(fetal bovine serum) (Lonza, Walkersville, MD, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycine) (GIBCO BRL., Gaithersburg, MD, USA)을 포함한 RPMI1640 배지(Lonza, Walkersville, MD, USA) 에서 11개의 간암세포주인 Hep3B, HepG2, PLC/PRF/5, SNU-182, SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-423, SNU-449, 및 SNU-475를 배양하였다. 불멸화된 정상 간세포주(immortalized normal liver cell line)인 THLE-3은 BEGM Bulletkit(Lonza, Walkersville, MD, USA)가 보충된 BEBM(Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 배양하였다.

< 실시예 2>

웨스턴 블럿 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 수득한 간암 조직 및 간암 세포들에 대해 SOCS6의 발현양상을 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 웨스턴 블럿 수행을 위해 먼저, 상기 실시예 1에서 배양한 세포들은 50 ㎍/ml 의 페닐메탄-설포닐플루오라이드(phenylmethane-sulfonylfluoride, PMSF) 및 1X Complete protease inhibitor cocktail tablets (PMSF, Roche, Mannheim, Germany)을 포함한 RIPA (Radio Immunoprecipitation) 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1mM)를 이용하여 세포 용해물(whole-cell lysates)을 수득하였고, 간암 조직으로부터의 단백질은 T-PER^TM 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 간암 조직으로부터 추출하였다. 이후, 상기 과정을 통해 각각의 세포 및 조직으로부터 추출한 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였으며, 샘플의 흡광도는 VICTOR3^TM multilabel plate reader로 570 nm에서 확인하였다. SDS-PAGE로 10㎍의 단백질들을 분리시키고, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane) (Amersham, Buckinghamshire, UK) 위로 옮겼다. 상기 막(membrane)은 0.05% 의 Tween-20 (USB corporation, Cleveland, OH, USA)을 포함한 TBS (tris-buffered saline)에서 5% 스킴밀크(skimmed milk)로 1시간 동안 블러킹을 시켰으며, 이후, 상기 막을 1차 항체들 및 HRP-연결(conjugated)된 2차 항체(Pierce, Rockford, IL, USA)와 함께 각각 밤새동안 및 1시간 동안 배양시켰다. 이때 항체로는 항-SOCS6 및 항-α-튜뷸린(anti-α-tubulin)을 Santa cruz biotechnology (Delaware, CA, USA)에서 구입하여 사용하였고, 신호 검출을 위해서는 ECL plus Western blotting detection system (Amersham, Buckinghmashire, UK)을 사용하여 수행하였다. 또한 상기 멤브레인은 LAS 3000 image analyzer (Fuji Photo Film, Japan)로 측정하였고, 이때 대조군으로는 정상 세포인 THLE-3 및 정상 조직을 사용하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

웨스턴 블럿 수행 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 간암 조직의 경우 정상세포이 배해 SOCS6의 발현이 현저하게 감소된 것으로 나타났으며(도 1a 참조), 간암 세포주에서의 내생적(endogenous) SOCS6의 발현을 측정한 결과, 대체로 매우 적은 양으로 SOCS6가 발현되고 있거나 또는 아예 발현되지 않고 있다는 것을 알 수 있었다(도 1b 참조).

< 실시예 3>

면역조직화학( Immunohistochemistry ) 염색법을 통한 SOCS6 의 발현분석

상기 실시예 2의 결과를 통해 본 발명자들은 SOCS6가 정상조직에 비해 간암 조직에서 발현양이 현저히 감소되는지를 확인할 수 있었고, 나아가 이러한 결과를 보다 확실히 검증하기 위해 간암 조직에서의 SOCS6 발현을 면역조직화학적 분석을 통해 조사하였다. 면역조직화학적 분석을 위해 6개의 간암 조직 슬라이드 및 하나의 간암 조직 마이크로어레이를 사용하였다. 항원을 회수하기 위해 전자렌지에서 상기 슬라이드들을 sodium citrate 버퍼 (pH 6.0)로 30분간 끓인 후, 20분간 식혔다. 신호의 증폭은 스트렙타비딘-퍼옥시다제(streptavidin-peroxidase) 및 비오틴화 티라미드(biotinylated tyramide)를 포함하는 renaissance TSA indirect kit (NEN Life Science, Boston, MA., USA)를 사용하였으며, 단계적인(graded) 에탄올 용액을 통해 물로 수화시킨 후에, 내생적인 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)을 파괴하기 위해 상기 슬라이드들에 PBS에서 1% H₂O₂를 실온에서 15 분간 처리하였다. 이후, 20분간 TNT 버퍼(0.1 M Tris-HCl, pH7.4, 0.15 M NaCl 및 0.05% Tween-20)로 세척한 후에, 상기 슬라이드들에 TNB 버퍼(1M Tris-HCl, pH7.4, 0.15 M NaCl 및 0.5% blocking reagent)를 처리하였다. 이후, 상기 조직들은 4℃에서 SOCS6에 대한 1차 항체(1:500) 와 함께 밤새 반응시켰고, 검출은 비오틴화 염소 항-토끼 항체(biotinylated goat anti-rabbit antibody) (Sigma, St.Louis, MO., USA)를 이용하여 수행하였으며, 퍼옥시다제-연결(peroxidase-linked) 아비딘-비오틴 복합체(avidin-biotin complex)와 함께 배양시켰다. 크로모겐(chromogen)으로 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하였고, 그 후 상기 슬라이드들을 Mayer's hematoxylin으로 대조염색(counterstain)하였다. TMA의 평가는 2명의 병리학자에 의해 독립적으로 이루어졌으며 불일치하는 부분에서는, multi-head microscope을 사용하여 공동으로 TMA를 재평가함으로써 의견 일치를 이루었다. 면역염색(immunostaining)의 강도는 1+ (약), 2+ (중), 및 3+ (강)로 등급화 하였다. 면역염색된 세포들의 수가 10% 미만인 경우에는 그 샘플을 네거티브(negative)로 간주하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

면역조직화학적 염색 분석 결과, 정상적인 간세포(hepatocyte)에서는 세포질에서 강한 양성 염색을 나타내었으나, 간암 조직에서는 음성적이거나 약한 양성 염색을 나타냄을 통해 상기 실시예 2의 결과와 동일하게 정상조직에 비해 간암조직의 경우, SOCS6의 발현이 억제되고 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 간암 세포에서 특이적으로 SOCS6 유전자의 발현이 감소되는 사실을 최초로 확인함에 따라 SOCS6를 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있다는 사실 및 SOCS6가 종양 억제 유전자로 작용할 수 있음에 따라 간암의 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of SOCS6 as a hepatocellular carcinomar diagnostic marker <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOCS6 gene sequence <400> 1 atgaagaaaa ttagtcttaa aaccttacgg aaatctttta acttgaataa aagtaaagaa 60 gaaactgatt tcatggtagt acaacaacca tcgctagcca gtgactttgg aaaagatgat 120 tccttatttg gtagctgcta tggtaaagat atggccagct gcgatatcaa cggtgaagat 180 gaaaaaggcg gaaaaaacag atcaaaaagc gagagcctga tgggtacgct aaaaaggcgg 240 ctttctgcaa aacagaagtc aaaaggcaag gcgggcacac cctctgggag ctctgccgac 300 gaggacacct tctcctcctc ctcagcaccc atagtcttta aagacgtgag agctcagagg 360 ccgataaggt ccacgtcgct ccgcagccat cactacagtc ccgcgccgtg gcctctgcgg 420 cccacaaact ccgaggagac ctgcatcaag atggaggtga gagtcaaggc cttggttcac 480 tcttccagcc cgagtccagc cctgaatggc gtccggaagg atttccacga cctccagtct 540 gagaccacgt gccaggagca agccaattca ctgaagagct cggcttctca taatggagac 600 ctgcatcttc acctggatga acatgtgcct gtcgttattg gacttatgcc tcaggactac 660 attcagtata ctgtgccttt agatgagggg atgtatcctt tggaaggatc acggagctat 720 tgtctggaca gctcttctcc catggaagtc tctgcggttc ctcctcaagt gggagggcgc 780 gctttccccg aggatgagag tcaggtagac caggacctag ttgtcgcccc agagatcttc 840 gtggatcagt ccgtgaatgg cttgttgatt ggcaccacgg gagtcatgtt gcagagcccg 900 agagcgggtc acgatgatgt ccctccactc tcaccattgc tacctccaat gcagaataat 960 caaatccaaa ggaacttcag tggactcact ggcacagaag cccacgtggc tgaaagtatg 1020 cgctgtcatt tgaattttga tccgaactct gctcctgggg ttgcaagagt ttatgactca 1080 gtgcaaagta gtggtcccat ggttgtgaca agccttacag aggagctgaa aaaacttgca 1140 aagcaaggat ggtactgggg accaatcaca cgttgggagg cagaagggaa gctagcaaac 1200 gtgccagatg gttcttttct tgttcgggac agttctgacg accgttacct tttaagcttg 1260 agctttcgct cccatggtaa aacacttcac actagaattg agcactcaaa tggtaggttt 1320 agcttttatg aacagccaga tgtggaagga catacgtcca tagttgatct aattgagcat 1380 tcaatcaggg actctgaaaa tggagctttt tgttattcaa ggtctcggct gcctggatct 1440 gcaacttacc ccgtcagact gaccaaccca gtgtcccggt tcatgcaggt gcgctcgttg 1500 cagtacctgt gtcgttttgt tatacgtcag tataccagaa tagacttaat tcagaaactg 1560 cctttgccaa acaaaatgaa ggattattta caggagaagc actactga 1608 <210> 2 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SOCS6 amino acid sequence <400> 2 Met Lys Lys Ile Ser Leu Lys Thr Leu Arg Lys Ser Phe Asn Leu Asn 1 5 10 15 Lys Ser Lys Glu Glu Thr Asp Phe Met Val Val Gln Gln Pro Ser Leu 20 25 30 Ala Ser Asp Phe Gly Lys Asp Asp Ser Leu Phe Gly Ser Cys Tyr Gly 35 40 45 Lys Asp Met Ala Ser Cys Asp Ile Asn Gly Glu Asp Glu Lys Gly Gly 50 55 60 Lys Asn Arg Ser Lys Ser Glu Ser Leu Met Gly Thr Leu Lys Arg Arg 65 70 75 80 Leu Ser Ala Lys Gln Lys Ser Lys Gly Lys Ala Gly Thr Pro Ser Gly 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Glu Asp Thr Phe Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ile Val 100 105 110 Phe Lys Asp Val Arg Ala Gln Arg Pro Ile Arg Ser Thr Ser Leu Arg 115 120 125 Ser His His Tyr Ser Pro Ala Pro Trp Pro Leu Arg Pro Thr Asn Ser 130 135 140 Glu Glu Thr Cys Ile Lys Met Glu Val Arg Val Lys Ala Leu Val His 145 150 155 160 Ser Ser Ser Pro Ser Pro Ala Leu Asn Gly Val Arg Lys Asp Phe His 165 170 175 Asp Leu Gln Ser Glu Thr Thr Cys Gln Glu Gln Ala Asn Ser Leu Lys 180 185 190 Ser Ser Ala Ser His Asn Gly Asp Leu His Leu His Leu Asp Glu His 195 200 205 Val Pro Val Val Ile Gly Leu Met Pro Gln Asp Tyr Ile Gln Tyr Thr 210 215 220 Val Pro Leu Asp Glu Gly Met Tyr Pro Leu Glu Gly Ser Arg Ser Tyr 225 230 235 240 Cys Leu Asp Ser Ser Ser Pro Met Glu Val Ser Ala Val Pro Pro Gln 245 250 255 Val Gly Gly Arg Ala Phe Pro Glu Asp Glu Ser Gln Val Asp Gln Asp 260 265 270 Leu Val Val Ala Pro Glu Ile Phe Val Asp Gln Ser Val Asn Gly Leu 275 280 285 Leu Ile Gly Thr Thr Gly Val Met Leu Gln Ser Pro Arg Ala Gly His 290 295 300 Asp Asp Val Pro Pro Leu Ser Pro Leu Leu Pro Pro Met Gln Asn Asn 305 310 315 320 Gln Ile Gln Arg Asn Phe Ser Gly Leu Thr Gly Thr Glu Ala His Val 325 330 335 Ala Glu Ser Met Arg Cys His Leu Asn Phe Asp Pro Asn Ser Ala Pro 340 345 350 Gly Val Ala Arg Val Tyr Asp Ser Val Gln Ser Ser Gly Pro Met Val 355 360 365 Val Thr Ser Leu Thr Glu Glu Leu Lys Lys Leu Ala Lys Gln Gly Trp 370 375 380 Tyr Trp Gly Pro Ile Thr Arg Trp Glu Ala Glu Gly Lys Leu Ala Asn 385 390 395 400 Val Pro Asp Gly Ser Phe Leu Val Arg Asp Ser Ser Asp Asp Arg Tyr 405 410 415 Leu Leu Ser Leu Ser Phe Arg Ser His Gly Lys Thr Leu His Thr Arg 420 425 430 Ile Glu His Ser Asn Gly Arg Phe Ser Phe Tyr Glu Gln Pro Asp Val 435 440 445 Glu Gly His Thr Ser Ile Val Asp Leu Ile Glu His Ser Ile Arg Asp 450 455 460 Ser Glu Asn Gly Ala Phe Cys Tyr Ser Arg Ser Arg Leu Pro Gly Ser 465 470 475 480 Ala Thr Tyr Pro Val Arg Leu Thr Asn Pro Val Ser Arg Phe Met Gln 485 490 495 Val Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Cys Arg Phe Val Ile Arg Gln Tyr Thr 500 505 510 Arg Ile Asp Leu Ile Gln Lys Leu Pro Leu Pro Asn Lys Met Lys Asp 515 520 525 Tyr Leu Gln Glu Lys His Tyr 530 535

Claims (10)

1. SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 SOCS6 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커.
2. 제1항에 있어서,
   상기 SOCS6 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 마커.
3. SOCS6 (suppressors of cytokine signaling 6) 유전자의 수준 또는 SOCS6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 SOCS6 유전자의 수준을 측정하는 물질은 SOCS6 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 SOCS6 단백질의 수준을 측정하는 물질은 SOCS6 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
6. (a) 생물학적 시료에 존재하는 SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 SOCS6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 예측 및 진단 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단 방법.
8. 제6항에 있어서,
   상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단 방법.
9. 제6항에 있어서,
   상기 생물학적 시료에서 존재하는 SOCS6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우, 간암이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 및 진단 방법.
10. SOCS6(suppressors of cytokine signaling 6)를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물.

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