KR20140037633A

KR20140037633A - 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 단백질 바이오마커 및 이를 이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법

Info

Publication number: KR20140037633A
Application number: KR1020120104016A
Authority: KR
Inventors: 문애리; 김선영; 손소정; 김형식; 천영진; 한순영; 정자영; 노항식; 석지현
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단; 대한민국 (식품의약품안전처장)
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2014-03-27
Also published as: KR101498481B1

Abstract

본 발명은 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 다양한 신장독성 유발 약물에 공통적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법에 관한 것이다. 약물에 의한 신장 독성이 유발된 인간 신장 상피 세포주의 배양액에서 PKM2(pyruvate kinase isozyme M2)와 EEF1G(eukaryotic elongation factor 1-gamma)가 유효하게 증가함을 확인하였으며, 이러한 결과는 인간 신장 정상 상피 세포주를 이용한 독성 평가에 유용하게 이용할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는 새로운 신장독성 및 부작용의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 신장독성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로이용될 수 있다.

Description

신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 단백질 바이오마커 및 이를 이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법{Biomaker protein and screening method of drug having nephyro toxicity and side effects using thereof}

본 발명은 신장독성 및 부작용을 유발할 수 있는 물질에 의해 세포내에서 발현하는 단백질 바이오마커 및 이를 이용하여 신장에 독성을 일으킬 수 있는 물질을 검색하는 방법에 관한 것이다.

신장은 외인성 독성 물질과 그로 인한 독성 대사체를 흡수-무독화-배설 과정을 통해 체외로 배출시킴으로써 체내의 항상성을 유지하는 데 기여하는 매우 중요한 기관이다. 따라서 신장은 항상 독성 물질에 노출되어 있으므로 약물이나 산화적 스트레스 등에 의한 독성이 발생하기 쉽다(Ichimura et al., 2008; Rached et al., 2008; Sieber et al., 2009; Ferguson et al., 2008). 신장 독성은 신약 개발과정에서 주요한 bottleneck이 되는데 비임상 독성 시험에서 실험동물의 organ toxicity의 약 20% 이상을 차지하고 있다(Kohli et al., 2000; Naughton et al., 2008; Nagai and Takano, 2010). 신장은 약한 손상 시에는 정상적으로 기능을 하기 때문에 상당한 손상을 받기 전에는 기능적인 변화를 관찰하기 어렵다. 현재의 신장 기능의 임상 독성학적 평가는 blood urea nitrogen (BUN)이나 serum creatinine(sCr)의 측정으로 이루어지고 있는 데 이러한 방법은 민감도가 낮아 신장 상피 세포의 70~80%가 손상되어야 검출이 되는 단점을 갖고 있다(Rached et al., 2008; Kirtane et al., 2005). 또한 손상된 신장 세포로부터 뇨로 방출되는 효소들(γ-glutamyl transferase(γ-GT), N-acetyl-β-D-glucosaminidase(NAG))은 뇨에서 안정하게 존재하지 못하고 빨리 분해된다(Ferguson et al., 2008; Han et al., 2008). 기존의 사용되어 온 혈액 또는 뇨 내에 존재하는 단백질을 활용하는 지표 물질들을 활용한 신장 독성 진단은 조기에 진단하기 어려우므로 보다 민감하고 정확한 신장 독성에 대한 바이오마커의 발굴이 요구되고 있다(Aicher et al., 1998,; Devarajan et al., 2008). 현재 신장독성을 확인하기 위한 여러가지 방법이 개발되고 있다. 특히 유전자의 발현 여부를 중심으로 신장독성 여부를 판단하려는 시도가 있었다.

신장독성과 관련된 유전자는 인간에서 보다는 동물에서 많이 알려져 있는데 MAPKK(mitogen-activated protein kinase kinase) 6의 경우, S.D. 랫트(rat)에서 세포 분열을 저해하여 세포성장을 억제해서 신장독성을 일으키는 표적 유전자로 알려져 있다(Yan et al., J. Ethnopharmacol. 2006 Apr15). Kidney injury molecule-1은 잘 알려진 신장독성 마커 유전자로 신장이 손상을 입으면 세포 밖 표면의 세포막에 존재하는 단백질을 제거하는 것으로 알려져 있다(Bailly et al., J. Biol. Chem. 277: 39739-39748,2002). Clusterin, EGF(Epidermal growth factor), TIMP-3(Tissue inhibitor of metalloproteinases-3), IGFBP-1(Insulin-like growth factor binding protein 1)은 급성 신장장애의 경우 신장을 재생하기위하여 발현되는 유전자들이다(Bohe et al.,, Kidney Int. 54:1070-1082, 1998; Gobe et al., Kidney Int. 4:411-420.1995; Lee et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 216:319-357, 1997; Leonard et al., Ren. Fail. 16:583-608., 1994; Silkensen et al., J. Am. Soc. Nephrol. 8:302-305, 1997). 그러나 이러한 유전자만으로 신장독성 물질을 검색하고 평가하기에는 아직 불충분하다.

따라서, 유전자뿐 아니라 다양한 종류의 바이오 마커의 개발이 요구되고 있다.

KR 10-2007-0120709A 초록 및 청구항 KR 10-0788789B 초록 및 청구항 1

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신장독성 및 부작용 유발 약물에 의해 자극받은 인간 신장세포에서 발현 변화를 일으키는 단백질 또는 유전자를 특징으로 하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오바커를 이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

바람직하게는, 신장독성 및 부작용 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 단백질 바이오마커는 PKM2 또는 EEF-1G인 것일 수 있다.

이때, 신장독성 및 부작용 유발 약물은 암포테리신 B (amphotericin B), 시스플라틴(cisplatin), 카드뮴(CdCl2), 시클로스포린 A(cyclosporin A) 및 젠타마이신(gentamicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또 다른 양상은 신장 독성과 관련된 바이오마커 단백질 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 검출할 수 있는 항체를 포함한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.

상기 항체는 상기 단백질 바이오마커와 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체 또는 다클론항체일 수 있으며, scFv(single-chain variable fragments), Fab 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 특정 단백질에 대한 항체를 얻는 것은 당업자에게 용이하므로, 상기 단백질을 식별할 수 있는 항체는 어떠한 종류든지 이용될 수 있다.

또 다른 양상은 하기의 군으로부터 선택되는 유전자를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커를 제공한다: COP9 complex subunit 4(gi|5410300), Unnamed protein product gi|34532097), Tumor rejection antigen 1(gp96) gi|61656607), KIAA0465 protein (gi|34328014), Transferrin (gi|553788), HPX protein (gi|13529281), Serotransferrin precursor (gi|4557871), Unnamed protein product (gi|1335098), Chain A, Human Platelet Profilin (gi|5542165), Unnamed protein product (gi|1335098), 78 kDa glucose-regulated protein (gi|16507237), Pyruvate kinase isozymes M1/M2 isoform M2 (gi|33286418), PRO1400 (gi|6650772), Hypothetical protein (gi|31873302), Keratin 1 (gi|11935049), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gi|31645), YWHAZ protein (gi|49119653), Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (gi|21361091), Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma (gi|4503481). 이때 바람직하게는 신경 독성 및 부작용 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 것은 PKM2(Pyruvate kinase isozymes M1/M2) 또는 EEF-1G(Eukaryotic translation elongation factor-1 gamma)인 것일 수 있다.

또 다른 양상은 하기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가집적된 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다: COP9 complex subunit 4(gi|5410300), Unnamed protein product gi|34532097), Tumor rejection antigen 1(gp96) gi|61656607), KIAA0465 protein (gi|34328014), Transferrin (gi|553788), HPX protein (gi|13529281), Serotransferrin precursor (gi|4557871), Unnamed protein product (gi|1335098), Chain A, Human Platelet Profilin (gi|5542165), Unnamed protein product (gi|1335098), 78 kDa glucose-regulated protein (gi|16507237), Pyruvate kinase isozymes M1/M2 isoform M2 (gi|33286418), PRO1400 (gi|6650772), Hypothetical protein (gi|31873302), Keratin 1 (gi|11935049), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gi|31645), YWHAZ protein (gi|49119653), Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (gi|21361091), Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma (gi|4503481).

본 발명의 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다.

상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또 다른 양상은, 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 인간 정상 세포인 HK2, 1차 인간 신장 세포, 및 신장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 정상 세포를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 검색 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Cy3과 Cy5 일 수 있다. 아울러, 상기 검색 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

또 다른 양상은 1) 인간 정상 신장세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는단계; 3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는단계; 4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 바이오마커 유전자가 식별된 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계; 5) 단계 4)에서 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 상기의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다.

이때, 단계 1)의 인간 신장세포는 HK-2 세포, 1차 인간 신장 세포, 및 신장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 36k 올리고마이크로어레이 Human V4.0 OpArray(Operon, Germany), Whole human genome oligo microarray (Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현되는 유전자가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(AxonInstruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또 다른 양상은 1) 인간 정상 신장 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 RNA를, PKM2 또는 EEF-1G 바이오마커 유전자에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법을 제공한다.

이때 바이오마커 유전자는 바람직하게는 PKM2 또는 EEF-1G일 수 있다. 또한, 프라이머는 서열번호 1 내지 4로 기재되는 서열로 구성된 것일 수 있다(표 3 참조).

본 발명의 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 새로운 신장독성 및부작용의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질의 모니터링 및 판정하는데 유용하며, 신장독성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

도 1은 HK-2 세포에서 시스플라틴의 세포독성을 나타내는 것이다. 상기 결과는 세번 실험한 값의 평균±SE를 나타낸다. *, **은 통계학적으로 대조군과 상이한 것을 나타내며, 각각 p<0.05 및 p<0.01이다.
도 2는 시스플라틴 처리된 HK-2 조성 배지에서 분비된 단백질의 2-D 겔 일렉트로포레이션 결과를 나타낸 것이다.
10 μM 또는 25 μM 의 시스플라틴을 24시간동안 처리후에, 조건 배지를 수거하고, 초미세여과로 농축하였다. 등전점전기영동(isoelectric focusing ) 및 겔 일렉트로포레이션으로 샘플당 1 mg 단백질을 분리하였다. A: 0 μM 시스플라틴; B: 10 μM 시스플라틴; C: 25 μM 시스프라틴
도 3은 시스플라틴 처리된 신장 세포주에서 웨스턴 블랏 분석 및 RT-PCR을 통하여 PKM2 및 EEF-1G의 단백질 분비량 및 mRNA 발현량 측정한 것을 나타낸다.
세포는 시스플라틴으로 웨스턴 블럿 분석을 위해 24시간동안 처리되었고, RT-PCR을 위해 1시간 처리되었다. A: HK-2 세포주에서 시스플라틴의 농도에 따른 PKM2 및 EEF-1G 분비를 나타냄; B: HK-2 세포로부터 시간에 따른 PKM2 및 EEF-1G 분비량을 나타냄; C: NRK-52E 세포에 의해 시스플라틴의 농도에 의존적인 PKM2 및 EEF-1 분비를 나타냄; D: 시스플라틴 처리된 다른 기관 세포주에서 PKM2 및 EEF-1G 분비를 나타냄; E: CdCl₂ 및 시스플라틴 A로 처리된 HK-2 세포에 의해 분비된 PKM2 및 EEF-1G를 나타냄. *, **은 통계학적으로 대조군과 상이한 것을 나타내며, 각각 p<0.05 및 p<0.01이다.
도 4는 바이오마커 후보로서 PKM2 및 EEF-1G의 In vivo 실험 결과를 나타낸 것으로,
A: 시스플라틴 처리된 래트(20mg/kg/day) 오줌에서 웨스턴 블랏 분석값을 나타냄;
B: 시스플라틴 처리된 래트(20 mg/kg, i.p.)의 신장에서 피루베이트 키나아제 이소엔자임 타입 M2(pyruvate kinase isoenzyme type M2, PKM2)를 위한 면역 조직 화학적 염색을 나타낸다. *, **은 통계학적으로 대조군과 상이한 것을 나타내며, 각각 p<0.05 및 p<0.01이다.
도 5는 시스플라틴으로 처리된 HK-2 세포로부터 분비된 단백질의 프로테옴 프로파일에 대한 검증한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1> 신장 독성 물질 준비 - Cisplatin (anticancer agent)

고형암의 항암제로 오랜 기간 동안 널리 사용되었으나 부작용으로 신장 독성을 유발하는 것으로 알려진 cisplatin을 구입(Sigma, Cat No. P4394), 3.3 mM의 stock solution(in 0.9 % NaCl solution)을 준비하여 실험에 사용하였다.

<실시예 2> 세포 배양

① HK-2 세포(Human normal kidney epithelial cells, ATCC CRL-2190)

ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여 0.05 mg/mL Bovine pituitary extract, 5 ng/mL Recombinant epidermal growth factor를 포함한 Serum-free keratinocyte medium(Gibco, Cat. No. 17005)으로 37℃, 5 % CO₂ 항온 배양기에서 배양하였다.

② NRK-52E 세포(Rat normal kidney epithelial cells, ATCC CRL-1571)

ATCC로부터 구입하여 10 % Fetal bovine serum 및 1 % Pen Strep을 첨가한 DMEM medium(4 mM L-glutamate, 4.5g/L glucose, 1.5 g/L sodium bicarbonate)으로 37℃, 5 % CO₂ 항온 배양기에서 배양하였다.

③ MCF10A 세포(Human normal breast epithelial cells)

본 연구실에서 다년 간 사용해 와서 세포주에 대한 정보와 기술이 잘 축적된 세포이다(Moon et al., 2000). 세포는 5 % horse serum, 0.5 μg/ml hydrocortisone, 10 μg/ml insulin, 20 ng/ml EGF, 0.1 μg/ml cholera enterotoxin, 100 unit/ml penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamine 과 0.5 μg/ml amphotericin B solution을 DMEM/F12 배지에 첨가하여 사용하며, 37℃, 5 % CO₂ 항온 배양기에서 배양하였다.

④ Primary Hepatocyte 세포(Human liver primary cell lines)

서울대학교 약학과 김상건 교수님 연구실에서 제공받아 사용하였다.

<실시예 3> 세포 독성 유발 농도 결정(MTT assay)

<3-1> 실험방법

선정된 독성 유발 물질에 의해 유도되는 세포 독성으로 발현이 증가되는 분비 단백질을 규명하기 위하여 cisplatin에 의한 세포 독성 유발 농도를 결정하였다. 96-well plate에 HK-2 세포를 seeding하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, cisplatin을 실험 농도 별로 포함한 serum-free media로 교환해주고 24 시간 추가 배양한다. 그 후 MTT solution(0.5 mg/ml) 25 μl를 첨가하고 4 시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨다. 살아 있는 세포와 MTT 시약이 37℃에서 반응하면 보라색의 formazan이 형성되는데, 이를 DMSO를 가하여 용해시키고, micro-ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 세포의 생존율(cell viability)은 cisplatin을 처리하지 않은 세포를 control로 하여 그에 대한 생존 퍼센트로 나타내었으며, 동일 실험을 3번 수행하여 정확도를 측정하였다.

<3-2> 세포 독성 유발 농도(IC ₅₀ ) 결정

신약 개발에 있어 약물의 안전성 평가는 매우 중요하다. 신약 개발의 전임상 단계에서 실시하는 약물의 안전성 평가는 실험 동물을 이용한 in vivo 실험이 주로 진행되어져 왔으나 많은 연구가 진행되면서 in vivo 실험의 한계에 따른 반론 또한 대두되고 있는 상황이다. 본 연구는 효율적인 약물의 안전성 평가를 위해 세포주를 이용하는 in vitro 독성 평가 시스템의 개발을 타겟으로 하여 진행되었다. 신장 독성을 유발하는 대표적인 약물로 고형암의 항암제로 널리 사용되어 온 cisplatin을 선정하여 세포주를 이용한 신장 독성 평가의 바이오마커 발굴을 수행하였다.

선행 연구로 cisplatin이 인간 정상 신장 세뇨관 상피세포인 HK-2 세포주에 독성을 일으키는 농도와 시간을 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 농도 별로 24 시간과 48 시간 동안 처리하여 HK-2 세포의 성장과 생존을 50 % 수준으로 저해하는 cisplatin의 유효 농도(IC₅₀)를 측정하였고, HK-2세포에 대한 cisplatin의 IC₅₀은 24 시간 처리시 28.6 mM, 48 시간 처리시 17.0 mM로 결정하였다 (도 1).

<실시예 4> 분비 단백질(secretome) 시료 준비

15cm plate에 HK-2 5 x 10⁶ cells/plate를 seeding 하고 5% CO₂, 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 후 실험 농도의 cisplatin을 포함하는 serum-free media로 교환하여 24 시간 추가 배양 후 conditioned media을 수집하여 3200 rpm, 10분간 원심 분리하여 dead cell debris를 제거하였다. 상층액을 취하여 amicon ultra centrifugal filters-3K(Millipore)를 사용, 5,000 rpm에서 원심 분리하여 secretome을 포함하는 농축액을 수합하였다. 준비한 농축액을 2-DE clean-up kit(GE healthcare)로 secretome sample을 pellet down하고 Bradford assay로 정량하여 1.0 mg protein/150 mL 의 sample이 되도록 destreak rehydration buffer로 용해시켜 준비하였다.

<실시예 5> 2-Dimensional Gel Electrophoresis (2-DE)

Cisplatin에 의한 독성 유발 후 분비되는 단백질을 규명하고자 단백질의 등전점(pI)으로 나타내는 net charge로써 pH에 따라 제 1차 분리 후(1-D, isoelectric focusing), 이어서 분자량에 따라 분리하는(2-D, gel electrophoresis) 2- dimensional gel electrophoresis(2-DE)를 수행하였다. 2-DE 과정은 2D electrophoresis user guide(copyright by GE Healthcare Korea)에 따라 수행하였다. 1.0 mg/150 mL의 secretome sample을 immobilized pH 3-10 nonlinear gradient strip(GE healthcare)에 loading하고 8 단계의 isoelectric focusing(IEF) 과정을 수행하였다. 등전점에 따라 단백질이 분리되어 있는 strips을 12.5 % polyacrylamide gels(25.5 cmⅩ18.5 cmⅩ1.0 mm)에 loading하고, 40 mA per gel의 균일 전류 하에서 약 5 시간 동안 제 2차 전기 영동을 수행하였다. 단백질이 분리되어 있는 gel을 40 % methanol과 10 % acetic acid 수용액으로 1시간 동안 고정시키고, coomassie blue R-350(Amersham Biosciences)의 staining solution으로 염색하였다 (overnight). 다음 날 10 % acetic acid 수용액으로 destaining하였다.

<실시예 6> Gel Image Analysis and MALDI-TOF-MS Analysis

Gel Image Analysis와 MALDI-TOF mass spectrometry Analysis는 연세대학교 프로테옴 연구센터에 의뢰, 분석하였다.

<6-1> 2-Dimensional Electrophoresis와 MALDI-TOF/MS Analysis에 의한 신장 독성 바이오 마커 후보물질 도출

측정된 HK-2세포주에 대한 cisplatin의 독성 유발 농도를 바탕으로 하여, HK-2세포주에 급성으로 신장 독성을 유발시키도록 최종 농도가 IC₅₀보다 작은 10 mM과 25 mM이 되도록 cisplatin(in 0.9% NaCl solution)을 처리하고 24 시간 동안 약물에 노출시켰다. 이 때 세포주로부터 분비된 단백질을 수합, 농축하여 1.0 mg/gel의 농도로 2-DE를 수행하였다 (도 2).

2-DE를 통한 분비 단백질의 분리 후 gel image analysis를 이용, 비교한 결과 처리한 cisplatin의 농도가 증가할수록 세포주로부터 분비되는 단백질이 급격히 증가함을 알 수 있었다(표 1). 그리고 각기 다르게 발현, 분비된 단백질의 정보를 규명하기 위해 그 발현 차가 큰 분비 단백질 20 개를 선정, MALDI-TOF/MS analysis를 연세대학교 프로테옴 연구센터에 의뢰하였다(표 2).

<표 1> MALDI-TOF 분석

시스플라틴 처리된 HK-2 조성 배지에서 시스플라틴의 농도에 따라 스팟은 다르게 나타났다.

<표 2> MALDI-TOF-MS 분석에 의해 시스플라틴으로 처리된 HK-2 세포로부터 분비된 단백질의 프로테옴 프로파일

<6-2> 도출한 분비 단백질 프로파일의 검증

2-DE와 MALDI-TOF/MS analysis를 통하여 cisplatin에 의한 독성 유발로 분비가 증가된 단백질 20개의 정보를 알 수 있었다. 이들 중 cisplatin의 농도 의존적으로 분비가 증가된 단백질을 5개 선택하여 신장 독성 평가를 위한 in vitro 바이오바커 후보 물질로서의 가능성을 검증하였다.

<실시예 7> Western Blot Analysis

6-well plate 에 HK-2 4 x 10⁵ cells/well을 seeding 하고 5 % CO₂, 37℃에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 후 실험 농도의 cisplatin을 포함하는 serum-free media로 교환하여 24 시간 추가 배양 후 실험을 준비한다. conditioned media sample은 수합하여 3200 rpm, 10 분간 원심 분리하여 dead cell debris를 제거하고 speed vaccum을 이용하여 conditioned media를 5 배 정도 농축한 다음 BCA assay를 통하여 정량, 동량의 단백질을 포함하는 sample을 준비하였다. Whole cell lysate는 배양된 세포를 PBS로 씻어준 다음, lysis buffer(50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 % SDS, 1 mM EDTA, 100 mM DTT, containing protease inhibitor cocktail) 150 mL를 넣고 세포를 떼어내고 1 mL 주사기를 사용하여 protein extracts 를 만든다. Bradford assay로 정량 하여 동량의 단백질을 포함하는 sample을 준비하였다. 위 과정으로 준비한 sample을 95℃ 이상에서 5 분간 끓인 후 냉각하여 12 % SDS-PAGE gel 에 전기 영동(Mini PROTEAN^®System, Bio Rad)하고, 전개된 protein 을 Mini Trans-Blot^®System(Bio Rad)을 사용하여 PVDF membrane 으로 옮긴다. Membrane 을 5 % skim milk로 blocking하고, 1차 항체를 부착시키고(overnight, 4℃), 2차 항체로 붙여준 후(1.5 시간, 실온) ECL reaction solution 으로 1 분 동안 반응시킨다. X-ray film 에 노출시켜 단백질의 발현 정도를 관찰한다.

<실시예 8> Reverse Transcription (RT)-PCR

세포를 6-well plate에 동일한 방법으로 배양, 약물 처리한 뒤 배지를 제거하고 RNA를 추출한다. Superscript™ first-strand synthesis system(Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성하고, 생성된 cDNA와 PCR 반응 완충액(EmeraldAmp^®GT PCR Master Mix, Takara)과 sense oligonucleotide primer, antisense oligonucleotide primer를 첨가하여 증폭시켰다. PCR은 DNA thermal cycler 에서 25 cycle 반응시키고, 각 cycle 은 95℃에서 30 초간 denaturation, 56℃에서 30 초간 annealing, 72℃에서 1 분간 polymerization 시키는 과정으로 이루어지며, 반응 후 72℃에서 10분간 방치하였다. 반응물은 agarose gel을 이용하여 band의 크기를 확인하고 mRNA의 발현을 비교하였다.

<표 3>

<실시예 9> 도출한 분비 단백질 프로파일의 검증

Western blot analysis를 이용한 검증을 수행하고자 선택한 분비 단백질은 GRP 94(tumor rejection antigen 1(gp96)), transferrin, PKM2(pyruvate kinase isozymes M1/M2, isoform M2), YWHAZ protein, EEF-1G(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma) 이었다 (도 5).

이들 5개의 단백질 중 cisplatin을 처리한 HK-2 세포의 conditioned media에서 cisplatin 농도 의존적으로 발현이 증가된 분비 단백질은 PKM2(서열번호 5)와 EEF-1G(서열번호 6), 두 가지였다. HK-2 세포주로부터 이 두 단백질의 분비에 미치는 cisplatin의 영향을 살펴보기 위하여, cisplatin의 처리 농도와 시간을 다르게 하여 실험을 진행하였다. 조건의 변화에 따라 단백질의 분비가 어떻게 달라지는지, PKM2에 특이적인 항체(sc-100538, Santa cruz biotechnology, Inc 에서 구입)와 EEF-1G에 특이적인 항체(sc-101035, Santa cruz biotechnology, Inc 에서 구입)를 이용하여 Western blot analysis를 수행하였으며, 그러한 단백질의 분비 증가가 관련 유전자의 전사 활성 증가와 어떤 연관성이 있는 지 RT-PCR을 수행하여 각 단백질의 mRNA level 변화를 관찰하였다.

Western blot analysis결과, PKM2와 EEF-1G 모두 HK-2세포에 대하여 cisplatin의 처리 농도와 시간에 따라 분비가 증가되었음을 보였고, 이러한 증가가 whole cell lysate에서는 나타나지 않았음을 관찰할 수 있었다(data not shown). 그리고 RT-PCR 수행 결과, PKM2와 EEF-1G의 분비 증가가 유전자의 전사 활성 증가에 의한 것이라는 것도 관찰할 수 있었다(도 3A, B).

또한 cisplatin에 의한 독성 유발로 PKM2와 EEF-1G의 분비 변화가 다른 종의 신장 세포에서도 나타나는 지 확인하고자, 쥐의 정상 신장 상피 세포주인 NRK-52E세포주에 cisplatin을 농도 별로 처리하여 conditioned media에서 두 단백질의 분비 증가를 관찰하였다. 그 결과 NRK-52E세포주의 conditioned media에서 분비가 증가되었으나 HK-2 세포주보다 고농도의 cisplatin 처리시에 관찰되었다 (도 3C).

<실시예 10> In vivo Sample 준비 및 immunohistochemistry

Cisplatin을 처리한(20mg/kg, i.p. single injection) 쥐의 뇨와 혈청 sample은 부산대학교 김형식 교수님 연구실에서 제공받아 실험하였고 쥐의 신장 조직에서의 PKM2발현은 anti-PKM2 antibody(Cell Signaling, Technology, Inc)를 사용하여 Immunohistochemistry 를 수행, 관찰하였다.

<10-1> 도출한 분비 단백질의 in vitro 신장 독성 바이오마커로서의 가능성 검증 : 장기 특이성

프로테옴 분석을 통하여 도출한 분비 단백질 중 PKM2와 EEF-1G가 cisplatin 처리 농도와 시간에 의존적으로 발현이 증가하는 것을 Western blot analysis와 RT-PCR을 통해 검증하였다. 이 분비 단백질이 in vitro 신장 독성 바이오마커 후보 물질로서의 민감성과 선택성을 검증하기 위하여 다른 장기 세포에서의 분비를 실험, 관찰하였다. 인간 정상 유방 상피 세포주인 MCF 10A 세포주와 인간 정상 간 세포주인 primary hepatocyte 세포주를 사용하여, HK-2세포에서와 동일한 조건으로 cisplatin을 처리하고 conditioned media에서 PKM2와 EEF-1G의 분비를 확인하였다. 그 결과 두 세포주에서 모두 cisplatin의 농도와는 무관하게 분비되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 3D).

그리고 PKM2와 EEF-1G가 신장의 독성 여부를 평가할 수 있는 바이오마커로서의 가능성을 시험하기 위하여 cisplatin외 다른 신장 독성 유발 물질 처리시에도 분비가 되는 지 실험하였다. 신장 독성 유발 물질로 알려진 카드뮴(CdCl₂)과 cyclosporin A을 처리하여 두 단백질이 분비되는 것을 Western blot analysis로 관찰하였다. 그 결과 두 독성 물질 모두 HK-2 세포주에 처리했을 때 conditioned media에서 분비되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 분비되어 검출되는 농도가 카드뮴의 경우는 25 mM에서부터, cyclosporin A의 경우는 10 mM에서부터 검출되었으며, 검출되는 정도는 cyclosporine A의 경우는 상대적으로 약하게 됨을 볼 수 있었다 (도 3E).

<10-2> 도출한 분비 단백질의 in vitro 신장 독성 바이오마커로서의 가능성 검증 : in vivo sample에서의 발현

프로테옴 분석을 통하여 도출한 in vitro 신장 독성 바이오마커 후보물질의 가능성을 검증하기 위하여 cisplatin을 주사한 쥐(rat)의 뇨(urine)와 혈장(plasma)을 이용하여 Western blot analysis를 수행하였다. Cisplatin을 처리한 쥐의 정상 신장 상피 세포주(NRK-52E)에서 PKM2와 EEF-1G의 분비 증가를 Western blot analysis로 관찰하였기에(도 3C) in vivo sample에서의 발현도 관찰하고자 하였다. 부산대학교 김형식 교수님 연구실로부터 20mg/kg/day로 cisplatin을 주사한 쥐의 뇨와 혈장을 제공받아 Western blot analysis를 수행하였다. 그 결과 혈장에서는 발현 증가를 관찰할 수 없었으나 cisplatin을 1일과 3일 간 처리한 쥐의 뇨에서는 PKM2와 EEF-1G의 발현을 관찰할 수 있었다 (도 4A).

Cisplatin을 주사한 쥐의 뇨에서 PKM2와 EEF-1G의 발현 증가를 관찰하고, cisplatin에 의한 신장 독성의 유발과 PKM2와 EEF-1G의 발현 증가의 상관 관계를 더 정확히 밝히고자 부산대학교 김형식 교수님 연구실에 의뢰하여 cisplatin을 주사한 쥐(rat)의 신장 조직에서의 발현 변화를 immunohistochemistry로 관찰하였다. Cisplatin을 주사한 쥐의 신장 조직(cortex, medulla)에서 PKM2의 발현은 눈에 띄게 증가하는 것이 나타났으나 EEF-1G의 발현은 적합한 antibody가 확보되지 않아 관찰할 수 없었다 (도 4B).

<110> Industry-Academic cooperation of Duksung women's university <120> Biomaker protein and screening method of drug having nephyrotoxicity and side effects using thereof <130> P-2012-05-29 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of PKM2 <400> 1 gagtaccatg cggagaccat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of PKM2 <400> 2 gcgttatcca gcgtgatttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of EEF-1G <400> 3 tcagaccttc atgagctgca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of EEF-1G <400> 4 tactctcgaa ccagcgtctg 20 <210> 5 <211> 531 <212> PRT <213> PKM2(Pyruvate kinase isozyme M1/M2, human) <400> 5 Met Ser Lys Pro His Ser Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Gln Thr Gln 1 5 10 15 Gln Leu His Ala Ala Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Met Cys Arg 20 25 30 Leu Asp Ile Asp Ser Pro Pro Ile Thr Ala Arg Asn Thr Gly Ile Ile 35 40 45 Cys Thr Ile Gly Pro Ala Ser Arg Ser Val Glu Thr Leu Lys Glu Met 50 55 60 Ile Lys Ser Gly Met Asn Val Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Thr 65 70 75 80 His Glu Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Thr Ala Thr Glu 85 90 95 Ser Phe Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu 100 105 110 Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Leu Ile Lys Gly Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Glu Val Glu Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Lys Ile Thr Leu 130 135 140 Asp Asn Ala Tyr Met Glu Lys Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp 145 150 155 160 Tyr Lys Asn Ile Cys Lys Val Val Glu Val Gly Ser Lys Ile Tyr Val 165 170 175 Asp Asp Gly Leu Ile Ser Leu Gln Val Lys Gln Lys Gly Ala Asp Phe 180 185 190 Leu Val Thr Glu Val Glu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ser Lys Lys Gly 195 200 205 Val Asn Leu Pro Gly Ala Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Ser Glu Lys 210 215 220 Asp Ile Gln Asp Leu Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Val Asp Met Val 225 230 235 240 Phe Ala Ser Phe Ile Arg Lys Ala Ser Asp Val His Glu Val Arg Lys 245 250 255 Val Leu Gly Glu Lys Gly Lys Asn Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu 260 265 270 Asn His Glu Gly Val Arg Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp 275 280 285 Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu 290 295 300 Lys Val Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Arg Ala 305 310 315 320 Gly Lys Pro Val Ile Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Lys 325 330 335 Lys Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Gly Ser Asp Val Ala Asn Ala Val 340 345 350 Leu Asp Gly Ala Asp Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly 355 360 365 Asp Tyr Pro Leu Glu Ala Val Arg Met Gln His Leu Ile Ala Arg Glu 370 375 380 Ala Glu Ala Ala Ile Tyr His Leu Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg Arg 385 390 395 400 Leu Ala Pro Ile Thr Ser Asp Pro Thr Glu Ala Thr Ala Val Gly Ala 405 410 415 Val Glu Ala Ser Phe Lys Cys Cys Ser Gly Ala Ile Ile Val Leu Thr 420 425 430 Lys Ser Gly Arg Ser Ala His Gln Val Ala Arg Tyr Arg Pro Arg Ala 435 440 445 Pro Ile Ile Ala Val Thr Arg Asn Pro Gln Thr Ala Arg Gln Ala His 450 455 460 Leu Tyr Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Cys Lys Asp Pro Val Gln Glu 465 470 475 480 Ala Trp Ala Glu Asp Val Asp Leu Arg Val Asn Phe Ala Met Asn Val 485 490 495 Gly Lys Ala Arg Gly Phe Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Ile Val Leu 500 505 510 Thr Gly Trp Arg Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asn Thr Met Arg Val Val 515 520 525 Pro Val Pro 530 <210> 6 <211> 437 <212> PRT <213> EEG1G(Elongation factor 1-gamma, Human) <400> 6 Met Ala Ala Gly Thr Leu Tyr Thr Tyr Pro Glu Asn Trp Arg Ala Phe 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ile Ala Ala Gln Tyr Ser Gly Ala Gln Val Arg Val Leu 20 25 30 Ser Ala Pro Pro His Phe His Phe Gly Gln Thr Asn Arg Thr Pro Glu 35 40 45 Phe Leu Arg Lys Phe Pro Ala Gly Lys Val Pro Ala Phe Glu Gly Asp 50 55 60 Asp Gly Phe Cys Val Phe Glu Ser Asn Ala Ile Ala Tyr Tyr Val Ser 65 70 75 80 Asn Glu Glu Leu Arg Gly Ser Thr Pro Glu Ala Ala Ala Gln Val Val 85 90 95 Gln Trp Val Ser Phe Ala Asp Ser Asp Ile Val Pro Pro Ala Ser Thr 100 105 110 Trp Val Phe Pro Thr Leu Gly Ile Met His His Asn Lys Gln Ala Thr 115 120 125 Glu Asn Ala Lys Glu Glu Val Arg Arg Ile Leu Gly Leu Leu Asp Ala 130 135 140 Tyr Leu Lys Thr Arg Thr Phe Leu Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ala 145 150 155 160 Asp Ile Thr Val Val Cys Thr Leu Leu Trp Leu Tyr Lys Gln Val Leu 165 170 175 Glu Pro Ser Phe Arg Gln Ala Phe Pro Asn Thr Asn Arg Trp Phe Leu 180 185 190 Thr Cys Ile Asn Gln Pro Gln Phe Arg Ala Val Leu Gly Glu Val Lys 195 200 205 Leu Cys Glu Lys Met Ala Gln Phe Asp Ala Lys Lys Phe Ala Glu Thr 210 215 220 Gln Pro Lys Lys Asp Thr Pro Arg Lys Glu Lys Gly Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Lys Gln Lys Pro Gln Ala Glu Arg Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ala Ala 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Glu Glu Met Asp Glu Cys Glu Gln Ala Leu Ala Ala 260 265 270 Glu Pro Lys Ala Lys Asp Pro Phe Ala His Leu Pro Lys Ser Thr Phe 275 280 285 Val Leu Asp Glu Phe Lys Arg Lys Tyr Ser Asn Glu Asp Thr Leu Ser 290 295 300 Val Ala Leu Pro Tyr Phe Trp Glu His Phe Asp Lys Asp Gly Trp Ser 305 310 315 320 Leu Trp Tyr Ser Glu Tyr Arg Phe Pro Glu Glu Leu Thr Gln Thr Phe 325 330 335 Met Ser Cys Asn Leu Ile Thr Gly Met Phe Gln Arg Leu Asp Lys Leu 340 345 350 Arg Lys Asn Ala Phe Ala Ser Val Ile Leu Phe Gly Thr Asn Asn Ser 355 360 365 Ser Ser Ile Ser Gly Val Trp Val Phe Arg Gly Gln Glu Leu Ala Phe 370 375 380 Pro Leu Ser Pro Asp Trp Gln Val Asp Tyr Glu Ser Tyr Thr Trp Arg 385 390 395 400 Lys Leu Asp Pro Gly Ser Glu Glu Thr Gln Thr Leu Val Arg Glu Tyr 405 410 415 Phe Ser Trp Glu Gly Ala Phe Gln His Val Gly Lys Ala Phe Asn Gln 420 425 430 Gly Lys Ile Phe Lys 435

Claims

하기의 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커 단백질:
COP9 complex subunit 4(gi|5410300), Unnamed protein product gi|34532097), Tumor rejection antigen 1(gp96) gi|61656607), KIAA0465 protein (gi|34328014), Transferrin (gi|553788), HPX protein (gi|13529281), Serotransferrin precursor (gi|4557871), Unnamed protein product (gi|1335098), Chain A, Human Platelet Profilin (gi|5542165), Unnamed protein product (gi|1335098), 78 kDa glucose-regulated protein (gi|16507237), Pyruvate kinase isozymes M1/M2 isoform M2 (gi|33286418), PRO1400 (gi|6650772), Hypothetical protein (gi|31873302), Keratin 1 (gi|11935049), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gi|31645), YWHAZ protein (gi|49119653), Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (gi|21361091), Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma (gi|4503481).
제1항에 있어서, 신장독성 및 부작용 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 것은 PKM2 또는 EEF-1G인 것을 특징으로 하는 바이오마커 단백질.
제1항에 있어서, 신장독성 및 부작용 유발 약물은 암포테리신 B B(amphotericin B), 시스플라틴(cisplatin), 카드뮴(CdCl2), 시클로스포린 A(cyclosporin A) 및 젠타마이신(gentamicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 단백질.
제1항의 바이오마커 단백질 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 검출할 수 있는 항체를 포함한 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트.
하기의 군으로부터 선택되는 유전자를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 바이오마커:
COP9 complex subunit 4(gi|5410300), Unnamed protein product gi|34532097), Tumor rejection antigen 1(gp96) gi|61656607), KIAA0465 protein (gi|34328014), Transferrin (gi|553788), HPX protein (gi|13529281), Serotransferrin precursor (gi|4557871), Unnamed protein product (gi|1335098), Chain A, Human Platelet Profilin (gi|5542165), Unnamed protein product (gi|1335098), 78 kDa glucose-regulated protein (gi|16507237), Pyruvate kinase isozymes M1/M2 isoform M2 (gi|33286418), PRO1400 (gi|6650772), Hypothetical protein (gi|31873302), Keratin 1 (gi|11935049), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Phosphoglycerate kinase 1 (gi|4505763), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gi|31645), YWHAZ protein (gi|49119653), Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (gi|21361091), Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma (gi|4503481).
제 5항에 있어서, 신경 독성 및 부작용 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 것은 PKM2 또는 EEF-1G인 것을 특징으로 하는 바이오마커.
제 5항의 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가집적된 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩.
1) 인간 정상 신장세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제7항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법.
제8항에 있어서, 단계 1)의 인간 신장세포는 HK-2 세포, 1차 인간 신장 세포, 및 신장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
제 8항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
1) 인간 정상 신장 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는단계;
3) 단계 2)의 RNA를, PKM2 또는 EEF-1G 바이오마커 유전자에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 방법.
제11항에 있어서, 단계 1)의 인간 신장세포는 HK-2 세포, 1차 인간 신장 세포, 및 신장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
제7항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트.
제13항에 있어서, 인간 정상 세포인 HK2, 1차 인간 신장 세포, 및 신장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된인간 정상 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색용 키트.
제5항의 바이오마커에 상보적이고 마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 키트.
제15항에 있어서, 프라이머는 서열번호 1 내지 4로 기재되는 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 신장독성 및 부작용 유발 약물 검색 키트.