WO2019235836A1 - 신장질환 조기 진단용 바이오마커 피루브산 키나아제 m2 (pkm2) 및 이의 이용 - Google Patents

신장질환 조기 진단용 바이오마커 피루브산 키나아제 m2 (pkm2) 및 이의 이용 Download PDF

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WO2019235836A1
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kidney disease
protein
pkm2
kidney
disease
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김형식
손지연
김경석
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성균관대학교산학협력단
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    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker PKM2 for early diagnosis of kidney disease and its use. More specifically, the present invention relates to a composition for detecting a biomarker for early diagnosis of kidney disease, a kit including the same, a method for detecting the biomarker, and the like.
  • the kidneys are organs that metabolize the body and excrete various substances present in the blood.
  • the kidneys filter the blood through glomerular filtration, renal tubular absorption, and resorption, thereby discharging unnecessary waste products in the form of urine.
  • Kidney weight is only about 0.5% of body weight, but the blood flow to the kidney is very high, 20-25% of the total cardiac output is one of the organs that are easily damaged by the toxic xenobiotics contained in the blood.
  • the kidneys may be gradually damaged. When the kidneys are damaged, the toxic substances present in the body may not be released into the body. Doing so may lead to additional complications.
  • chronic kidney disease the pathological phenomenon in which kidney damage lasts more than three months is called chronic kidney disease (CKD), and the incidence of chronic kidney disease due to entry into an aging society and Western lifestyle is more than 10% annually in Korea and around the world. It is increasing.
  • chronic kidney disease is an irreversible disease, and if more than 60% of kidney function is impaired, most patients progress to end stage renal disease (ESRD), which cannot lead to normal life without dialysis. And it is very important to early diagnosis of complications such as cardiovascular disease and the like.
  • ESRD end stage renal disease
  • the prevalence of chronic kidney disease is also increasing worldwide every year and is a representative disease of complications due to diabetes and hypertension. In Korea, the prevalence of chronic kidney disease and end stage renal failure is reported to be more than 10%.
  • Diabetes is the biggest problem than the disease itself, diabetic nephropathy, one of diabetic vascular complications is a disease that is the primary cause of end-stage renal failure.
  • diabetic nephropathy one of diabetic vascular complications is a disease that is the primary cause of end-stage renal failure.
  • the number of patients with end stage renal failure due to diabetes continues to increase, and it is reported that diabetic nephropathy accounts for 47.1% of the causes of end stage renal failure. It is occurring.
  • the increase in the mortality rate due to diabetic kidney disease is also increasing rapidly, and serious concerns are expected in the future.
  • Diabetic nephropathy is classified into four groups according to glomerular filtration rate and proteinuria, and it can be seen that microalbuminuria occurs before the decrease of glomerular filtration rate in the stage of diabetic nephropathy.
  • microalbuminuria occurs before the decrease of glomerular filtration rate in the stage of diabetic nephropathy.
  • the kidneys are beginning to show changes involving anatomical damage. Therefore, it can be said that microalbuminuria has a weak specificity for diagnosing diabetic chronic kidney failure. For example, in the United States, 7 million diabetic nephropathy patients without microalbuminuri have been reported, limiting the diagnosis of diabetic nephropathy through microalbuminuria.
  • Chronic kidney disease is difficult to diagnose because there are no specific symptoms, and if the disease progresses for a long time, it is often life-threatening. Therefore, chronic kidney disease is detected early and treatment is started at an appropriate time to prevent the progression of kidney damage. This is the most effective way to prevent chronic kidney disease and its many complications.
  • the diagnosis of chronic kidney disease is mostly through the function evaluation of the kidney.
  • it is diagnosed through general indicators such as the prediction of glomerular filtration rate (GFR) through serum creatinine (SCr) and quantitative proteinuria, but changes in these indicators only increase after renal damage has progressed significantly.
  • GFR glomerular filtration rate
  • SCr serum creatinine
  • creatinine the most important indicator, varies according to age, sex, muscle mass, thyroid function, dietary pattern, and medications, limiting accurate renal function measurement and predictors. There is.
  • kidney injury biomarkers include KIM-1 (kidney injury molecule-1), NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), ⁇ 2-microalbumin, etc. in various clinical studies, KIM-1, NGAL, NAG (N- Investigating whether acetyl-D-glucosaminidase (U-APP), urinary nonalbumin protein (uNAP), and heart-fatty acid binding protein (H-FABP) can be used as biomarkers for kidney disease.
  • Biomarker studies in diabetics have shown a significant association between NGAL and glomerular filtration rate, uNAP and albuminuria, and these new biomarkers have been shown to correlate with kidney damage. This small and cross-sectional study was done only.
  • kidney disease biomarkers have been developed and used (KR 10-1657881, KR 10-1594236) to cope with this, but all have to use blood.
  • diagnosis of renal failure is usually based on elevated serum creatinine. It is done. In practice, however, serum creatinine rises after a significant progression of renal dysfunction after renal failure, and at the time of diagnosing chronic kidney disease, it often misses the optimal timing to treat it. Therefore, serum creatinine is insufficient as a diagnostic marker for acute kidney injury, and urgent detection of early biomarkers using urine is urgent.
  • the present invention has been made to solve the above problems in the prior art, the present inventors have a higher sensitivity than the case of using serum creatinine and blood urea nitrogen (BUN) previously used as a marker for renal disease
  • BUN serum creatinine and blood urea nitrogen
  • diabetic renal failure can be easily measured by using an antibody-based technique to measure the concentration of pyruvate kinase M2 (PKM2) released into urine according to the disease state caused by diabetes. From the initial stage of the high specificity and sensitivity to determine whether diabetic kidney disease can be determined, the present invention was completed.
  • compositions for early diagnosis of kidney disease comprising an agent for detecting PKM2 (Pyruvate kinase M2) protein in urine.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing kidney disease comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting PKM2 protein from the urine of a subject in order to provide the information necessary for early diagnosis of kidney disease.
  • Another object of the present invention is to provide a method for early diagnosis of kidney disease, comprising detecting PKM2 (Pyruvate kinase M2) protein from the urine of a subject.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the early diagnosis of kidney disease of the composition for the early diagnosis of kidney disease.
  • the present invention provides a composition for the early diagnosis of kidney disease, comprising an agent for detecting PKM2 (Pyruvate kinase M2) protein in the urine (Urine).
  • the PKM2 protein may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the agent for measuring the expression level of the PKM2 protein may be an antibody specific for the PKM2 protein in urine.
  • the present invention also provides a kit for early diagnosis of kidney disease comprising the composition.
  • the kit may be a protein chip kit.
  • the present invention also provides a method for providing information necessary for early diagnosis of kidney disease, comprising detecting PKM2 (Pyruvate kinase M2) protein from a subject's urine.
  • the method may further include detecting the PKM2 protein and comparing the expression level of the normal control urine with that of the PKM2 protein.
  • the PKM2 protein may be rarely detected in the normal control group.
  • the detection of the protein may be performed by an antigen-antibody reaction using an antibody specific for the PKM2 protein.
  • the kidney disease is nephrotic syndrome, kidney cancer, chronic renal failure, diabetic kidney disease, acute pyelonephritis, acute renal failure, hypertensive kidney disease, Reye's syndrome, gout, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, lupus , Candidiasis, nephrotic hemorrhagic fever, leptospirosis, legionellosis, autosomal dominant polycystic neoplasia and hydronephrosis.
  • the kidney disease may be diabetic kidney disease.
  • the present invention also provides a method for early diagnosis of kidney disease, comprising detecting Pyruvate kinase M2 (PKM2) protein from the urine of an individual.
  • PLM2 Pyruvate kinase M2
  • the present invention provides a use for the early diagnosis of kidney disease of the composition for the early diagnosis of kidney disease.
  • the PKM2 protein and its utilization technology of the present invention can be usefully used for predicting and diagnosing the early diagnosis and disease of kidney function caused by diabetes mellitus or drugs in urine, and can occur frequently during clinical treatment.
  • it can be widely used in various fields such as preclinical toxicology test, which is essential in the development of new drugs, and early detection of diabetic renal failure.
  • FIG. 1A shows an experimental design for setting up a similar animal model for treating type 1 diabetes in humans by treating streptozocin (STZ).
  • 1B schematically shows that diabetes is induced upon treatment of STZ in rats.
  • Figure 1c shows the result of measuring the blood glucose concentration (glucose) according to the administration of the anti-diabetic drug to the diabetic animal.
  • Figure 1d shows the results of measuring the microalbumin (microalbumin) in urine (Urine) which is one of the most important factors of diabetic kidney disease.
  • Figure 2a shows the result of measuring the urine volume, creatinine and blood BUN in order to determine whether renal failure in the STZ-administered diabetic animal model.
  • Figure 2b shows the result of staining the kidney tissue with hematosilin-Eosine (H & E) to confirm the degree of histological damage of the kidney in a diabetic animal model.
  • Figure 2c shows the results of measuring the PKM2 and NGAL protein content in the control group, the experimental group administered STZ and the experimental group administered STZ and Drug X.
  • Figure 3a illustrates the design of the diabetic model using Zucker Diabetic Fatty (ZDF), a well-known type 2 diabetes-induced animal model.
  • ZDF Zucker Diabetic Fatty
  • Figure 3b shows the result of measuring the blood glucose concentration every month for 5 months by high fat diet in ZDF rats.
  • Figure 3c is a result of measuring the content of PKM2, NGAL, Vimentin, and KIM-1 in urine for 4 months in a high-fat diet ZDF rats.
  • Figure 3d shows the result of confirming the degree of histological damage of the kidney by hematoxylin-eosin staining after high fat diet for 5 months in ZDF rats.
  • Figure 3e shows the results of comparing the blood BUN concentration according to the high fat diet in ZDF rats and normal rats.
  • Figure 4 shows the results of measuring the protein content of PKM2, KIM-1 and NGAL in the urine of diabetic patients.
  • FIG. 5 illustrates how kidney function is impaired in chronic hyperglycemic diabetes patients, and thus shows biomarkers detected according to the progression of diabetes.
  • Figure 6 shows the types of biomarkers for the diagnosis of kidney function damage known to date.
  • the present inventors demonstrated that PKM2 protein is detected in the urine of an animal in which renal failure is induced by diabetes and that kidney failure is induced using an animal model, but PKM2 protein is not detected after the administration of antidiabetic drugs. As a result of measuring PKM2 in urine, it was observed that PKM2 in urine was detected as the diabetic period became longer. Thus, the present invention was completed.
  • diabetic rats induced by STZ were found to have high urine PKM2 but significantly decreased PKM2 after antidiabetic drug administration, and in the case of ZDF diabetic rats, high-fat diet 2 months From now on, it was confirmed that the PKM2 protein increased in time-dependent manner (see Example 3).
  • PKM2 protein according to the present invention as a biomarker through the results of the present invention can predict the risk of kidney dysfunction and its side effects due to diabetes as a biomarker in the urine instead of blood quickly and easily and early diagnosis is required It can be used for a variety of purposes and uses.
  • the present invention provides a composition for early diagnosis of kidney disease, comprising an agent for detecting PKM2 (Pyruvate kinase M2) protein in urine.
  • the term "agent for detecting a protein” refers to a molecule that can be used for detecting a marker by confirming the expression level of a biomarker whose expression changes due to renal dysfunction or confirming the activity of a protein.
  • the expression level of the biomarker can be known by confirming the expression level of the marker protein.
  • the agent that detects the protein level is an antibody.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the biomarker protein of the present invention, which is encoded by the marker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method.
  • Proteins can be obtained and prepared from conventional proteins by conventional methods. This includes partial peptides that can be made from the protein, and the partial peptide of the present invention includes at least 7 amino acids, 8 amino acids, preferably 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, more preferably Comprises 12 amino acids, more preferably 13 or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding. Furthermore, the antibody of this invention also contains special antibodies, such as a humanized antibody.
  • Antibodies used in the detection of renal function diagnostic markers of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • measure of expression level of protein refers to a process of confirming the presence and level of expression of renal dysfunction marker protein in a biological sample of an individual for diagnosing renal disease, for example, specific for the marker protein.
  • the amount of protein can be confirmed by detection of an antigen-antibody complex using an antibody that binds to the target.
  • specific analytical methods include Western blot, enzyme linked immunosorbent asay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket Immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, and the like, but are not limited thereto.
  • diagnosis means confirming the presence or characteristic of a pathological state.
  • the diagnosis can be interpreted as confirming the development of kidney disease.
  • the diagnosis means confirming the presence or absence of the expression of a kidney disease diagnostic marker, and predicting / confirming the progression or onset of a kidney disease.
  • the diagnosis in the present invention indicates the presence and expression of the kidney disease diagnostic marker. This may include determining the extent to which the kidney disease is developed, developing and reducing the disease.
  • a "diagnostic marker, a diagnostic marker, or a diagnostic marker” is a substance capable of distinguishing a cell or tissue from which a renal dysfunction has occurred or is likely to occur from a normal cell or tissue.
  • Organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA, etc.), proteins, lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.), which show an increase or decrease in dysfunctional cells or tissues.
  • the renal function diagnostic marker of the present invention is PKM2, which exhibits a particularly high level of expression in cells of tissues exposed to renal dysfunction agents, as compared to cells of normal renal tissue, causing renal dysfunction. It is characterized by a specific high level of expression in cells of tissues exposed to the substance.
  • Protein or gene information of the renal disease diagnostic biomarker provided in the present invention can be easily obtained through a known genetic database.
  • the amino acid sequence of the biomarker protein PKM2 is registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI), a known genetic database (NCBI Reference Sequence: NP — 002645.3).
  • the PKM2 protein of the present invention may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • Kidney disease of the present invention is nephrotic syndrome, kidney cancer, chronic renal failure, diabetic kidney disease, diabetic renal failure, acute pyelonephritis, acute renal failure, hypertensive kidney disease, Reye's syndrome, gout, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, lupus , Candidiasis, nephrotic hemorrhagic fever, leptospirosis, legionellosis, autosomal dominant polycystic neoplasia or hydronephrosis, but is not limited thereto.
  • Kidney disease of the present invention may be diabetic nephropathy.
  • Diabetic nephropathy refers to kidney disorders in patients with diabetes and is a representative complication of diabetes. The disease is caused by hyperglycemia caused by diabetes, which damages the glomeruli inside the kidney and decreases kidney function.
  • the present invention also provides a kit for early diagnosis of kidney disease, including an agent for measuring the expression level of urine PKM2 protein.
  • Kit of the present invention can detect the marker by confirming the expression level of the protein of the marker for diagnosing renal function.
  • the kit for diagnosing renal disease of the present invention may include one or more other component composition solutions or devices suitable for analytical methods as well as an antibody that selectively recognizes the marker to measure the expression level of the renal function diagnostic marker.
  • the kit for measuring the expression level of marker protein for diagnosing renal function in the present invention comprises a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, and a chromogenic substrate for immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like.
  • the chromophore may be a peroxidase or an alkaline force.
  • Fatase alkaline phosphatase
  • fluorescent material can be used FITC, RITC, etc.
  • the color substrate is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur) Phonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) and the like can be used.
  • the kit for early diagnosis of kidney disease is a protein chip kit.
  • the present invention provides a method for detecting Pyruvate kinase M2 (PKM2) protein from the urine of a subject in order to provide information necessary for early diagnosis of kidney disease.
  • PLM2 Pyruvate kinase M2
  • the present invention also provides a method for early diagnosis of kidney disease, comprising detecting Pyruvate kinase M2 (PKM2) protein from the urine of an individual.
  • PLM2 Pyruvate kinase M2
  • the present invention provides a use for the early diagnosis of kidney disease of the composition for the early diagnosis of kidney disease.
  • expression of genes can be detected at the protein level, and separation of proteins from biological samples can be performed using known processes.
  • the term "individual” refers to an animal having a height among body organs among living organisms existing in nature, preferably a mammal, and more preferably a human.
  • Examples of the mammal include rats (rats, mice, etc.), rabbits, horses, cows, sheep, dogs, cats, monkeys, humans, etc., but the type of the subject of the present invention is not limited by the above examples.
  • PKM2 protein detection target includes, but is not limited to, samples such as tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, which differ in the expression level of marker protein for diagnosing kidney disease.
  • samples such as tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine, which differ in the expression level of marker protein for diagnosing kidney disease.
  • the urine of the subject Preferably, the urine of the subject.
  • the amount of antigen-antibody complex formation in the normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in a suspected kidney disease individual can be compared, and a significant expression level of the protein from the marker gene for diagnosing kidney disease can be compared. By determining whether the increase, the suspected kidney disease can predict or confirm the actual occurrence of kidney disease.
  • the antigen-antibody complex means a combination of a marker protein for diagnosing a kidney disease and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed can be quantitatively measured through the size of a signal of a detection label.
  • Protein expression level measurement is preferably by using the ELISA method.
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of an antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, a solid support
  • the direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the antibody and the antigen attached thereto, reacted with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen and the antibody attached to the solid support.
  • Various ELISA methods including indirect sandwich ELISA, using recognized labeled secondary antibodies.
  • the antibody is enzymatically developed by attaching the antibody to the solid support, reacting the sample, and then attaching a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, or to an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It is detected by the sandwich ELISA method by attaching a labeled secondary antibody to enzymatic color development. Renal disease diagnostic marker protein and antibody to determine the degree of complex formation, it is possible to determine whether renal dysfunction occurs.
  • Western blot using at least one antibody against the marker for diagnosing the kidney disease For example, whole proteins are isolated from a sample, electrophoresed to separate proteins according to size, and then transferred to nitrocellulose membranes to react with antibodies. By checking the amount of the generated antigen-antibody complexes using labeled antibodies, the amount of protein produced by the expression of genes can be checked to determine whether renal dysfunction occurs.
  • the detection method comprises a method for examining the expression level of the marker gene in the control group and the expression level of the marker gene in cells in which renal dysfunction has occurred. Protein levels can be expressed as absolute (eg ⁇ g / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the marker proteins described above.
  • immunohistostaining is performed using at least one antibody against the marker for diagnosing the kidney disease.
  • paraffin embedding blocks are prepared by methods well known in the art. These are cut into slices of several ⁇ m thickness, adhered to glass slides, and reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. The unreacted antibody can then be washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether or not the antibody is labeled on the microscope.
  • At least one antibody against the marker for diagnosing the kidney disease is arranged at a predetermined position on the substrate, and uses a protein chip immobilized at a high density.
  • a method of analyzing a sample using a protein chip may separate the protein from the sample and hybridize the separated protein with the protein chip to form an antigen-antibody complex, and then read the information to determine the presence or expression of the protein. By confirming, it is possible to check whether kidney function abnormality occurs.
  • the detection methods it is possible to confirm or predict whether or not the actual renal function abnormality of a suspected kidney disease patient is compared by comparing the protein expression level in a normal control group with the gene expression level in a suspected kidney disease individual. That is, the expression level of the marker of the present invention is measured from a sample of cells or urine, which are presumed to have renal dysfunction, and the expression level of the marker of the present invention is measured from a sample of normal cells or tissues, and the two are compared. Then, if the expression level of the marker of the present invention is found to be significantly increased in the cell derived from the presumed renal dysfunction than that of normal cells, the subject can be predicted as a kidney disease patient.
  • the term "combination of these" included in the expression of the mark of the form of the word means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the mark of the form of the mark, It means to include one or more selected from the group consisting of components.
  • the diabetes-induced animal model used in the present invention is a diabetes-induced animal model using STZ administration and a diabetes-induced model using Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat.
  • diabetes-induced diabetic animal model by STZ administration was performed once intraperitoneal (IP) administration of STZ (SD) to SD rats, and then measured daily blood glucose concentration, and then whether sufficient blood glucose concentration was increased. Diabetes was induced by evaluating (approximately 5 times increased). At this time, some experimental groups were administered anti-diabetic drugs for 4 weeks, and urine was collected weekly to confirm PKM2 protein levels.
  • ZDF Rat is a diabetes-induced model.
  • ZDF rat is a transgenic animal that gradually causes diabetes as it grows from birth, and is commonly used as a human type 2 diabetes model. Being an animal.
  • diabetes mellitus is gradually induced from 8 months after birth, and blood glucose concentration is increased, and diabetes is rapidly progressed in a high fat diet.
  • ZDF rats were fed a high fat diet to induce diabetes.
  • SDS Sodium dodecyl sulfate
  • the extracted protein was dissolved and transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • methanol was added to the transfer buffer, and the reaction was performed at 100 V for 1 hour.
  • stain with Ponceau S within 10 seconds-1 minutes, just enough to see the band
  • PBS phosphate buffer saline
  • Blocking the blocking buffer was used by dissolving 5% Skim milk in a solution containing Tween 20 in Tris-buffered saline (TBS).
  • TBS Tris-buffered saline
  • wash buffer TBS or PBS with surfactant
  • H & E staining was performed using Mayer's hematoxylin and eogene of DAKO, and each slide was stripped of paraffin using xylene, and then water was removed from xylene and tissue using ethanol. (100%-> 100%-> 95%-> 70%) Wash the remaining alcohol using Tepwater, dye hematoxylin at room temperature for 30 seconds, wash off extra hematoxylin, After staining for about 1 minute, the excess eojin was washed, and water was removed from the tissue using ethanol again. (70%-> 95%-> 100%) and ethanol was removed using xylene, and after blowing off the xylene, sprinkled with mounting solution and covered with cover glass and dried at room temperature.
  • Blocking the tissue was made by using a normal goat serum (Normal goat serum) to block the tissue and then diluted PKM2 antibody in the blocking solution and sprayed on the slide and reacted at 4 °C overnight. After the reaction was washed three times for 5 minutes using the washing solution, and attached a second anti-body (30 minutes to 1 hour at room temperature). After the reaction, the mixture was washed three times for 5 minutes using a washing solution, avidin-biotinylated horseradish peroxidase (HRP) was reacted for 30 minutes, and washed three times for 5 minutes using a washing solution. Then, the reaction was performed for about 1 minute using a DAKO DAB solution.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Example 1-1 In order to verify the diabetes-induced animal model by STZ administration prepared in Example 1-1 of the present invention, an experiment was performed by setting an experimental model as shown in FIGS. 1A and 1B.
  • control showed a normal blood glucose concentration
  • the blood glucose concentration in the animal group administered STZ about 6 times (600 mg / dL or more) than the control group was increased .
  • the blood glucose concentration gradually decreased to 7 days, 14 days and 21 days, it was confirmed that the last and 28 days to almost normal level.
  • microalbumin which is one of the most important factors of diabetic kidney disease
  • the kidney tissue was fixed in 10% neutral formalin, and then paraffin-treated and sliced to a thickness of 5 ⁇ m, followed by deparafiin. And stained with hematosilin-Eosine (H & E).
  • FIG. 2C shows that PKM2 was not detected in the control group, but PKM2 was detected in the experimental group in which diabetes was induced by STZ. Therefore, it was proved that PKM2 could be an indicator for early diagnosis of renal failure due to diabetes.
  • Example 1-1 of the present invention a Zucker Diabetic Fatty (ZDF) diabetes-induced model and a ZDF rat were set to an experimental model as shown in FIG. 3A. More specifically, ZDF rats were fed with a high fat diet for 6 months to 4 months of age to collect urine every month to evaluate whether PKM2 protein is detected in urine.
  • ZDF Diabetic Fatty
  • the blood glucose concentration was measured every month to determine whether diabetes was induced.
  • Figure 5 generally describes the mechanism of action on whether PKM2 is released in the urine in type 2 diabetic patients, oxidative damage increases in the kidney according to a high-fat diet, and various types of inflammatory triggers are activated to By damaging and confirming that PKM2 protein is highly expressed in renal cells, the inventors of the present invention first demonstrated that PKM2 protein liberated into urine when proximal tubule cells of the kidney were damaged.
  • FIG. 6 describes the mechanism of causing renal failure in diabetic patients and the types of biomarkers for diagnosing renal failure in each stage.
  • it affects the ATP synthesis stage using glucose metabolism, and as it progresses further, oxidative damage of kidney tissues occurs, and it causes cell death by inflammatory reactions. It was found that the kidney function is impaired.
  • Example 2 it was confirmed whether diabetic renal failure-induced animal models and clinical renal failure were induced by diabetes, and as a result, it was proved that renal dysfunction appeared in both (type 1 and type 2) diabetes models. It was. In addition, it has been demonstrated that renal function diagnostic markers BUN, creatinine and microalbumin are highly detected in diabetic rats.
  • the urinary renal dysfunction biomarkers are also clinically used, such as KIM-1, NGAL (FIG. 5), but because they are expensive to use these biomarkers clinically, they are generally not easily utilized. . Nevertheless, many researchers use KIM-1 and NGAL as biomarkers for renal failure screening.
  • urine content of PKM2, KIM-1, NGAL, and TIMP-1 was analyzed according to the method of Example 1-3 using antibodies that specifically reacted with these proteins.
  • the amount of PKM2 protein detected in urine when renal toxicity was induced in a diabetic animal model by STZ administration was measured using Western blot (antigen-antibody response).
  • the PKM2 protein and its utilization technology of the present invention can be usefully used for predicting and diagnosing the early diagnosis and disease of kidney function caused by diabetes mellitus or drugs in urine, and can occur frequently in clinical treatment.
  • diagnosis of acute renal failure due to the existing drug, as well as the preclinical toxicity test that is essential in the development of new drugs, and early detection of diabetic renal failure can be widely used in various fields, there is industrial availability.

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Abstract

본 발명은 뇨(Urine)중 PKM2(Pyruvate kinase M2) 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장질환 조기 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 PKM2 단백질 및 이의 활용 기술은 뇨중에서 당뇨 및 약물에 의한 신장기능 이상의 조기진단 및 질병의 정도를 예측 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 높은 민감도와 특이성으로 신장기능 이상 여부를 정확하게 판별할 수 있으며, 신장의 이상 징후를 비교적 간편한 방법을 통해 조기에 효과적으로 진단할 수 있으므로, 임상적 치료과정에서 흔히 발생될 수 있는 약물로 인한 급성신부전증 진단뿐 아니라 신약개발에서 필수적으로 이뤄지는 전임상독성실험, 및 당뇨병성 신부전증의 조기발견 등의 여러 분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 05.07.2019] 신장질환 조기 진단용 바이오마커 피루브산 키나아제 M2 (PKM2) 및 이의 이용
본 발명은 신장질환 조기 진단용 바이오마커 PKM2 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 신장 질환의 조기 진단을 위한 바이오마커 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 상기 바이오마커의 검출방법 등에 관한 것이다.
본 출원은 2018년 6월 7일에 출원된 한국특허출원 제10-2018-0065640호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
신장은 체내에서 대사되어 혈액 속에 존재하는 다양한 물질들을 배출하는 장기로서, 사구체 여과, 신세뇨관 흡수 및 재흡수 과정을 통하여 혈액을 여과함으로써, 체내에 불필요한 노폐물들을 뇨의 형태로 배출하는 장기이다. 신장 무게는 몸무게의 약 0.5%에 불과하지만, 신장으로 흐르는 혈액량은 총 심박출량의 20-25%로 매우 높아서 혈액에 포함되어 있는 각종 독성물질(toxic xenobiotics)로 부터 손상을 받기 쉬운 장기중 하나이다. 예를 들어, 체내에 과다한 약물이 투여되거나, 심장질환, 당뇨 및 고혈압과 같은 각종 대사성질환이 발생할 경우, 신장은 서서히 손상될 수 있는데, 신장이 손상되면 체내에 존재하는 독성 물질들이 체외로 배출되지 않아, 그에 따라 추가적인 합병증을 유발 할 수 있다.
특히, 신장 손상이 3개월 이상 지속되는 병리 현상을 만성신장질환 (chronic kidney disease; CKD)이라고 하며 노령화사회 진입과 서구적 생활 습관으로 만성신장질환 발병율은 우리나라를 비롯하여 전 세계적으로 매년 10%이상씩 증가되고 있다. 특히, 만성신장질환은 비가역적인 질환으로 신장기능이 60%이상 손상될 경우 대부분의 환자들에게서 투석이 없이는 정상적인 생활을 할 수 없는 말기신부전증 (End stage renal disease; ESRD)으로 진행하며 더 나아가 뇌혈관 및 심혈관계 질환 등과 같은 합병증 발병과 관련성이 높아 이를 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다. 만성 신장질환 유병률 또한 전 세계적으로 매년 증가추세에 있으며 당뇨병 및 고혈압에 따른 합병증의 대표적인 질환으로, 우리나라의 경우 만성신장질환 및 말기신부전증의 유병율은 10%이상으로 보고되고 있는 실정이다.
당뇨병은 질환자체 보다는 혈관합병증이 가장 큰 문제가 되며, 당뇨병성 혈관합병증 중 하나인 당뇨병성 신증은 말기신부전증을 유발하는 제1원인 질환이다. 우리나라에서 당뇨병으로 인한 말기신부전증 환자는 지속적으로 증가하여, 당뇨병성 신증이 전체 말기 신부전증 원인 중 47.1%를 차지하는 것으로 보고되고 있으며, 당뇨병성 신증 증가로 인해 말기 신부전증 환자에 대한 투석치료에 막대한 의료비 손실이 발생되고 있다. 특히, 당뇨성 신장질환으로 인한 사망률 증가도 급격하게 증가되는 추세에 있어 향후 심각한 우려가 예상되고 있다.
당뇨병성 신증은 사구체여과율과 단백뇨에 따라서 4기로 분류되며, 당뇨병성 신증의 단계에서 사구체여과율의 감소 이전에 미세알부민뇨 발생이 선행함을 알 수 있다. 또한, 당뇨병성 2기 미세알부민뇨가 나타나기 시작하는 시점에도 이미 신장에는 해부학적 손상을 수반하는 변화가 보이기 시작한다. 따라서 미세알부민뇨는 당뇨성 만성신부전증 진단을 위한 특이성이 약하다고 할 수 있다. 예를들면, 미국의 경우 7백만 명의 당뇨병성 신증 환자 중 미세알부민뇨가 없는 환자가 무려 2백만 명이나 되는 것으로 보고되어 있어 미세알부민뇨를 통한 당뇨병성 신증 진단에 한계를 보이고 있다.
당뇨환자의 경우 대부분 다량의 단백뇨가 동반되는 것으로 추정되지만, 약 30-40% 환자에서는 미세알부민뇨 변화없이 신기능이 저하되는 경우가 있다. 최근의 연구결과에 의하면 제2형 당뇨환자 중에서 단백뇨가 없이 신기능이 저하된 환자에서 GFR이 60 ml/min/1.73m2 미만 환자 빈도는 23.1% 로서 일반 국민에 비해 약 1.3배 이상의 높은 빈도를 보였고, 신기능이 저하된 당뇨환자의 55% 환자에서 미세알부민뇨가 없는 특징을 보였다.
만성신장질환은 특이적인 증상이 없어 진단이 매우 어려우며, 질환이 장기간 진행될 경우 생명에 위험을 주게 되는 경우가 많기 때문에 만성신장질환을 조기에 발견하고 적절한 시기에 치료를 시작함으로써 신장 손상의 진행을 예방하는 것이 만성 신장질환 및 이와 동반된 여러 합병증을 막을 수 있는 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.
한편, 만성신장질환의 진단은 대부분 신장의 기능평가를 통해 이루어진다. 즉, 혈청 크레아티닌(serum creatinine, SCr)을 통한 사구체여과율 (glomerular filtration rate, GFR) 예측 및 단백뇨 정량검사와 같은 일반적인 지표를 통해 진단되고 있으나, 신장 손상이 상당히 진행된 후에야 이들 지표의 변화가 증가되기 때문에 진단 후 손상된 신장을 정상 상태로 복구하기는 불가능할 뿐만 아니라, 가장 주요 지표로 활용되는 크레아티닌은 연령, 성별, 근육량, 갑상선기능, 식사 패턴 및 약물에 따라 변동이 있어 정확한 신기능 측정 및 예측인자로써의 한계가 있다.
현재 국제적으로 제시된 신규 신장손상 바이오마커로는 KIM-1 (kidney injury molecule-1), NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), β2-microalbumin 등으로 다양한 임상연구에서 KIM-1, NGAL, NAG (N-acetyl-D-glucosaminidase), uNAP (urinary nonalbumin protein) 및 H-FABP (heart-fatty acid binding protein) 등이 신장질환 바이오마커로 사용 가능한지에 대한 검토가 이루어지고 있다. 당뇨병 환자를 대상으로 바이오마커 연구에서 NGAL과 사구체여과율 간에, uNAP와 알부민뇨 간에 의미 있는 연관성이 있음이 밝혀졌으며, 이러한 새로운 바이오마커들의 신장 손상과의 연관성이 규명되고 있지만, 대부분 연구가 연구 대상 환자 집단이 작고 단면 연구로만 이루어졌다. 이로 인해, 신규 바이오마커들과 신장 손상과의 시간 변수에 따른 예측 변화를 정확히 반영하지 못하고 있으며, 더욱이 신장기능 평가를 위한 기존의 바이오마커 들 (BUN, 크레아티닌)의 진단력이 미세알부민뇨 보다도 우월하지 못한 것으로 평가된다. 이러한 바이오마커들의 임상적용 가능성에 관한 연구가 더욱 가속화되고 있으나, 질환별 신장손상 기전과의 연관성, 임상시료에서의 예측력 평가의 미비 등으로 아직 상용화되지 못하고 있는 실정이다. 특히 당뇨병성 신장손상에는 아직 적용되지 못하고, 실제로는 비특이적인 단백뇨 혹은 알부민뇨와 혈청 크레아티닌 등이 활용되고 있어 조기 진단에 어려움이 있다.
급/만성 신부전증 경우에는 발증 후, 시간 단위로 병의 진행 상태를 파악하는 것이 중요하므로, 이의 조기 진단 및 조기 치료는 향후 생명 예후를 판정하는데 있어서도 매우 중요하나 아직까지 이에 대한 진단 마커는 현재 없는 실정이다. 이에 대처하기 위해 최근에 다양한 종류의 신장질환 바이오마커들이 개발되어 이용되고 있으나(KR 10-1657881, KR 10-1594236) 모두 혈액을 이용해야 하며, 전통적으로 신부전증의 진단은 통상 혈청 크레아티닌 상승을 지표로 행해지고 있다. 그러나 실제로 신장 장해가 발생한 후 혈청 크레아티닌은 이미 신장 기능 이상이 상당히 진행된 후에나 상승하기 때문에 만성신장 질환 진단 시점에서는 이미 이를 치료할 수 있는 최적의 타이밍을 놓친 경우가 많다. 따라서, 혈청 크레아티닌은 급성 신장손상의 진단 마커로서는 불충분하여, 뇨를 이용한 조기 바이오마커의 발굴이 시급하다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 기존에 신장질환 판별 마커로 사용된 혈청 크레아티닌 및 혈중요소질소(BUN, blood urea nitrogen)를 사용한 경우보다 높은 민감도와 특이성을 가지는 당뇨성 신장질환 조기 진단 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 당뇨에 의한 질병상태에 따라 뇨로 유리되어 나오는 pyruvate kinase M2 (PKM2)의 농도를 항체를 이용한 기술을 이용하여 간편하게 측정하여 당뇨성 신부전증의 초기단계에서부터 높은 특이성과 민감도로 당뇨성 신장질환 여부를 판별할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 뇨(Urine)중 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 신장질환 조기 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 신장질환 조기 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장질환을 조기 진단하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 뇨로부터 PKM2 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 신장질환을 조기 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신장질환 조기 진단용 조성물의 신장질환을 조기 진단하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뇨(Urine)중 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 신장질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 PKM2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 PKM2 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 뇨중 PKM2 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신장질환 조기 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 키트는 단백질 칩 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 신장질환을 조기 진단하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 방법은 상기 PKM2 단백질을 검출하여 그 발현 수준을 정상 대조군 뇨와 PKM2 단백질의 발현수준을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 PKM2 단백질은 정상대조군에서는 거의 검출이 안되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로 상기 단백질의 검출은 PKM2 단백질에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 반응에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 신장질환은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 신장질환은 당뇨병성 신장 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 신장질환을 조기 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신장질환 조기 진단용 조성물의 신장질환을 조기 진단하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 PKM2 단백질 및 이의 활용 기술은 뇨(Urine)중에서 당뇨 또는 약물에 의한 신장기능 이상의 조기진단 및 질병의 정도를 예측 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있으며, 임상적 치료과정에서 흔히 발생될 수 있는 약물로 인한 급성신부전증 진단뿐 아니라 신약개발에서 필수적으로 이뤄지는 전임상 독성실험, 및 당뇨병성 신부전증의 조기발견 등의 여러 분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.
도 1a은 스트렙토조신(streptozocin, STZ)을 처리하여 사람에서 1형 당뇨병을 유발하는 유사한 동물모델을 설정하기 위한 실험 디자인을 나타낸 것이다.
도 1b는 랫트(rats)에 STZ 처리시 당뇨병이 유발된다는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1c는 당뇨유발 동물에 항당뇨 약물을 투여함에 따른 혈중 글루코스(glucose)농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1d는 당뇨성 신장 질환의 가장 중요한 인자 중 하나인 뇨(Urine)중 미세알부민(microalbumin)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 STZ-투여 당뇨유발 동물모델에서 신부전증이 나타나는지를 확인하기 위해서, 소변량, 크레아티닌 및 혈중 BUN을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 당뇨유발 동물 모델에서 신장의 조직학적 손상 정도를 확인하기 위해서 신장 조직을 헤마톡실린-에오진(Hematosilin-Eosine, H&E)으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 대조군, STZ를 투여한 실험군 및 STZ와 Drug X를 투여한 실험군에서 PKM2과 NGAL 단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 결과이다.
도 3a는 제2형 당뇨유발 동물 모델로 잘 알려진 Zucker Diabetic Fatty (ZDF)를 이용하여 당뇨모델 제작 디자인을 나타낸 것이다.
도 3b는 ZDF 랫트에 고지방 식이를 실시하여 5개월간 매달마다 혈중 글루코스 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 ZDF 랫트에 고지방 식이를 실시하여 4개월간 뇨중에서 PKM2, NGAL, 비멘틴(Vimentin), 및 KIM-1의 함량을 측정한 결과이다.
도 3d는 ZDF 랫트에 고지방 식이를 5개월간 실시한 후 부검하여 신장의 조직학적 손상 정도를 헤마톡실린-에오진 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 ZDF 랫트에 고지방 식이에 따른 혈중 BUN 농도를 정상 랫트와 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 당뇨환자의 뇨중에서 PKM2, KIM-1 및 NGAL의 단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 만성적인 고혈당 당뇨환자의 경우 어떻게 신장기능이 손상이 오는지를 설명한 것이며, 그에 따라 당뇨의 진행단계에 따라 검출되는 바이오마커를 나타낸 것이다.
도 6는 현재까지 알려진 신장기능 손상의 진단을 위한 바이오마커의 종류를 나타낸 것이다.
본 발명자는 동물 모델을 이용하여 당뇨에 의해 신부전증이 유발되고 신부전증이 유발된 동물의 뇨중에는 PKM2 단백질이 검출되지만, 항 당뇨약물 투약 후에는 PKM2 단백질이 검출되지 않는다는 것을 증명하였으며 또한 당뇨환자를 대상으로 뇨중에서 PKM2을 측정한 결과 당뇨 기간이 길어짐에 따라 뇨중 PKM2이 높게 검출된다는 것을 관찰하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일실시예에서는, STZ 투여에 의한 당뇨병 유발 랫트와 ZDF 당뇨병 유발 랫트에서 신부전증이 발생하는 것을 확인하였으며(실시예 2-1 및 2-2 참조), 당뇨환자의 뇨중 단백질을 검사한 결과 대부분의 환자군에서 PKM2 단백질이 검출되었으며, 특히 당뇨기간이 길어짐에 따라 뇨중 PKM2가 높게 검출되는 것을 확인하였다(실시예 2-3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, STZ 투여에 의한 당뇨병 유발 랫트의 경우 뇨중 PKM2가 높게 검출되나 항당뇨 약물 투여후에는 PKM2가 현저히 감소되는 것을 확인하였으며, ZDF 당뇨병 유발 랫트의 경우 고지방식이 투여 2개월 후부터 PKM2 단백질이 시간의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
따라서, 본 발명의 실시예 결과를 통해 본 발명에 따른 PKM2 단백질은 바이오마커로서 당뇨에 의한 신장기능 이상 및 그 부작용의 위험을 혈액을 대신하여 뇨중에서 빠르고 간편하게 조기에 예측할 수 있고 진단기술이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명은 뇨(Urine)중 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 신장질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "단백질을 검출하는 제제" 란 신장기능 이상에 의해 발현이 변화하는 바이오마커의 발현수준을 확인하거나, 단백질의 활성을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 해당 바이오마커의 발현수준은 마커 단백질의 발현수준을 확인함으로써 알 수 있다.
바람직하게, 상기 단백질 수준을 검출하는 제제는 항체이다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 8개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 10개의 아미노산, 11개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 13개 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 신장기능 진단용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 "단백질의 발현수준 측정"이란 신장질환을 진단하기 위하여 개체의 생물학적 시료에서 신장기능 이상 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, 상기 해당 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 복합체의 검출에 의하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 구체적인 분석 방법의 예시로는, 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 신장질환의 발병여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 진단은 신장질환 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 신장질환의 진행 또는 발병을 예측/확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 신장질환 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 신장질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
본 발명에서, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커, 또는 진단 마커"란 신장기능 이상이 발생한 또는 발생 가능성이 있는 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분할 수 있는 물질로, 정상 세포 또는 조직에 비하여 신장기능 이상 세포 또는 조직에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 단백질, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 신장기능 진단 마커는 정상 신장 조직의 세포에 비하여, 신장기능 이상 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 PKM2로, 신장기능 이상 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내는 특징이 있다.
본 발명에서 제공하는 신장질환 진단용 바이오마커의 단백질 또는 유전자 정보는 공지된 유전자데이터베이스를 통하여 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오마커 단백질 PKM2의 아미노산 서열은 공지된 유전자데이터베이스인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있다(NCBI Reference Sequence: NP_002645.3).
본 발명의 PKM2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "신장질환"은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 당뇨병성 신부전, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 또는 수신증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 “신장질환”은 당뇨병성 신장 질환(diabetic nephropathy)일 수 있다. 당뇨병성 신장 질환(diabetic nephropathy)이란 당뇨병이 발병한 환자에게서 나타나는 신장 장애를 지칭하는 것으로, 당뇨병에 의해 나타나는 대표적인 합병증이다. 상기 질환은 당뇨병에 의한 고혈당으로 인해 신장 내부의 사구체가 손상되어 신장 기능이 저하되면서 발병하게 된다.
또한, 본 발명은 뇨중 PKM2 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장질환 조기진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 신장기능 진단용 마커의 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 신장질환 진단용 키트에는 신장기능 진단용 마커의 발현수준을 측정하기 위해 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 신장기능 진단용 마커 단백질 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이사용 될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
바람직하게, 상기 신장질환 조기진단용 키트는 단백질 칩 키트이다.
또한, 본 발명은 신장질환을 조기 진단하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 신장질환을 조기 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신장질환 조기 진단용 조성물의 신장질환을 조기 진단하기 위한 용도를 제공한다.
보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체" 란 자연계에 존재하는 생명체들 중에서 신체 장기 중 신장을 갖고 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 포유류를 의미하고, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다. 상기 포유류의 예로는 쥐(랫트, 마우스 등), 토끼, 말, 소, 양, 개, 고양이, 원숭이 및 인간 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 개체의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, PKM2 단백질 검출 대상은 신장질환 진단용 마커 단백질 발현수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 개체의 뇨 이다.
본 발명에서, 마커 단백질을 검출하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 신장질환 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 신장질환 진단용 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 신장질환 의심 개체의 실제 신장질환 발생 여부를 예측 또는 확인할 수 있다. 상기 항원-항체 복합체란 신장질환 진단용 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, 엘라이자(ELISA)법을 이용하는 것이다. 엘라이자는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 엘라이자, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 엘라이자, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 엘라이자, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 엘라이자 등 다양한 엘라이자 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 엘라이자 방법에 의해서 검출한다. 신장질환 진단용 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 신장질환 진단용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하는 것이다. 예를 들어, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 신장기능 이상이 발생한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 신장질환 진단용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 예를 들어, 정상 신장조직 또는 세포, 및 신장기능 이상으로 의심되는 세포 또는 조직 등의 시료를 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 신장질환 진단용 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 예를 들어, 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현수준을 신장질환 의심 개체에서의 유전자 발현수준과 비교함으로써 신장질환 의심 환자의 실제 신장기능 이상 여부를 확인 또는 예측할 수 있다. 즉, 신장기능 이상이 일어난 것으로 추정되는 세포 또는 뇨 등의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하고, 정상 세포 또는 조직 등의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현수준이 정상 세포의 것보다 신장기능 이상이 일어난 것으로 추정되는 세포 유래에서 유의적인 발현 증가가 확인될 경우, 해당 개체를 신장질환 환자로 예측할 수 있는 것이다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험동물 및 실험 방법
본 발명에 사용된 수컷 SD 랫트 (6주령, male Sprague-Dawley rats)는 Charles River Laboratories (Orient, Seoul, Korea)로부터 공급받았으며 성균관대학교 동물실험 윤리위원회의 규칙에 의거하여 실험을 진행하였다.
1-1. 당뇨유발 동물 모델 준비
본 발명에 사용된 당뇨유발 동물 모델은 STZ 투여를 이용한 당뇨동물 모델 및 Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat를 이용한 당뇨유발 모델이며 이를 각각 확보하고자 하였다.
먼저, STZ투여에 의한 당뇨유발 동물 모델은 SD 랫트에 STZ (50 mg/kg)을 1회 복강(I.P.)투여한 후 혈중 글루코스(glucose) 농도를 매일 측정한 후, 충분한 혈중 글루코스 농도가 증가되었는지를 평가하여 당뇨가 유발됨(약 5배 정도 증가)을 확인하였으며, 이 때, 일부 실험군에는 항당뇨 약물을 4주간 투여하여, 매주 뇨를 채취하여 PKM2 단백질 수준을 확인하였다.
다음으로 Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat를 이용한 당뇨유발 모델로서, ZDF 랫트는 태어난 후부터 성장함에 따라 점차적으로 당뇨가 유발되는 유전자 이식 (transgenic) 동물로서, 사람의 제2형 당뇨 모델로 일반적으로 널리 사용되는 동물이다. 특히, 생후 8개월부터 점차 당뇨가 유발되기 시작하여 혈중 글루코스 농도가 증가되며, 고지방 식이를 할 경우 당뇨는 급속하게 진행된다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서도 ZDF 랫트에 고지방 식이를 공급하여 당뇨를 유발시켰다.
1-2. 전기영동 (SDS-PAGE)
뇨 또는 조직에서 버퍼 (buffer)를 이용하여 단백질을 추출한 뒤 단백질 정량을 통해 샘플을 준비하고, 이를 프로테아제 또는 인산가수분해효소 (phosphatase) 억제제를 첨가한 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 샘플 버퍼와 섞어준 뒤, 95 ℃에서 5 분간 가열한 후, 전기영동하였다.
1-3. 웨스턴 블롯 (Western blot)
추출된 단백질을 용해시키고, 폴리비닐리덴 플로라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인으로 전달하였다. 이때, 전달 버퍼 (Trasnfer buffer)에는 메탄올을 첨가하였으며, 100 V에서 1 시간 진행하였다. 단백질의 전달이 끝난 후, 폰소 S(Ponceau S)로 염색한 후 (10초-1분 이내, 밴드가 보일 정도로만 살짝) 증류수(DW, Distilled Water)나 PBS(phosphate buffer saline)로 충분히 세척하여 블로킹 (Blocking)하였다. 이때, 블로킹 버퍼 (Blocking buffer)는 5% Skim milk를 트리스완충액(Tris-bufferd saline, TBS)에 Tween 20이 포함된 용액에 녹여 사용하였다. 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시키고, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼 (wash buffer, 계면활성제가 포함된 TBS 또는 PBS)로 헹구어 낸 후 2차 항체를 반응시켰다. 2차 항체 반응 후, 다시 세척 버퍼로 결합되지 않은 2차 항체를 씻어낸 뒤 루미놀을 이용하여 밴드를 확인하였다.
1-4. 신장 및 간의 조직학적 소견 (헤마톡실린-에오진 염색)
각 조직을 자기소화(Autolysis) 가 일어나기 전에 빠르게 적출하여, PBS 혹은 생리식염수(Normal saline)를 이용하여 조직 주변부에 묻은 혈액을 제거하였다. 그리고 신장의 경우 외피를 벗겨낸 후 오른쪽 신장을 이등분 하여 고정액(10% neutral buffered formalin) 에 담아두고, 간의 경우 가장 큰 엽의 일부를 잘라 고정액에 즉시 담아 보관하였다. 고정액의 양은 조직 용적의 10~20배 정도가 되게 넣어주었다. 약 3일간 고정 시켜준 후에 고정액을 씻어주고, 에탄올을 이용하여 탈수화 과정을 진행하였다 (70%-> 90% -> 95% -> 100%). 알콜을 제거 후, 파라핀 침투를 하고 각 슬라이드(slide)를 5㎛두께로 하여 만들었다. DAKO사의 Mayer's 헤마톡실린과 에오진을 이용하여 H&E 염색을 진행하였으며 각 슬라이드를 자일렌(Xylene)을 이용하여 파라핀을 벗겨낸 후, 에탄올을 이용하여 자일렌과 조직내의 수분을 제거하였다. (100%->100%->95%->70%) 텝워터를 이용하여 남은 알코올들을 씻어내고 헤마톡실린을 상온에서 30초간 염색을하고, 여분의 헤마톡실린을 씻겨주고, 에오진을 약 1분간 염색한 후, 여분의 에오진을 씻겨주고, 다시 에탄올을 이용하여 조직내의 수분을 제거하였다. (70%->95%->100%) 그리고 자일렌을 이용하여 에탄올을 제거한 후, 자일렌을 날리고나서 마운팅용액(Mounting solution)을 뿌리고 커버글라스를 덮어 상온에서 건조시켰다.
1-5. PKM2의 신장조직에서 면역학적염색
각 슬라이드를 자일렌을 이용하여 파라핀을 벗겨낸 후, 에탄올을 이용하여 자일렌과 조직내의 수분을 제거하였다. (100%->100%->95%->70%). 텝워터로 씻겨준 후, 슬라이드에 박리된 조직의 항원부활(Antigen retrieval) 을 위해 소듐시트레이트(Sodium citrate)버퍼를 이용하여 20분간 전자렌지에 넣어 같이 가열한 후, 텝워터를 이용하여 슬라이드를 식혀주고, PBS에 5분간 상온에 담궈두었다. 그리고 내재성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase, 메탄올:과산화수소 3:1)을 이용하여 조직의 불필요한 항원들을 제거하였으며 (상온에서 3~5분), 반응이 끝난 후 PBS를 이용하여 5분간 2번 씻어주었다. 정상염소혈청(Normal goat serum)을 이용하여 블로킹 용액을 만들어 조직을 블로킹한 다음 PKM2 항체를 블로킹 용액에 희석하여 슬라이드에 뿌려주고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 워싱용액을 이용하여 5분간 3번 씻겨주고, 2차 안티바디를 붙여주었다(상온에서 30분~1시간). 반응이 끝난 후 워싱용액을 이용하여 5분간 3번 씻겨주고, 아비딘-비오티닐레이티드 HRP(Avidin-biotinylated horseradish peroxidase)을 30분간 반응시켜주고, 워싱용액을 이용하여 5분간 3번 씻겨주었다. 그리고, DAKO DAB 용액을 이용하여 약 1분간 반응을 시켜주고, 반응이 끝나고 남은 용액을 제거한 뒤 헤마톡실린 용액을 상온에서 약 30초~ 1분간 염색을 하고 나서 남은 용액 제거하였다. 그리고 블루잉 용액(Blueing solution, Ammonium hydroxide 0.5%)을 뿌려 약 30초간 반응을 하고 남은 용액을 제거 후에 에탄올을 이용하여 조직내의 수분을 제거하였으며 (에탄올 70%-> 95% -> 100%), 자일렌을 이용하여 조직내의 에탄올을 제거 후 자일렌을 날리고 나서 마운팅용액을 뿌리고 커버글라스를 덮어 상온에서 건조시켰다.
실시예 2. 당뇨병 및 신부전증 유발 동물 모델 검증
2-1. STZ 투여에 의한 당뇨병 및 신부전증 유발 동물 모델 검증
본 발명의 상기 실시예 1-1을 통해서 제조된, STZ 투여에 의한 당뇨유발 동물 모델을 검증하기 위해서, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이 실험 모델을 설정하여 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 대조군 (control)에서는 정상적인 혈중 글루코스 농도를 나타내었으나, STZ를 투여한 동물군에서는 혈중 글루코스 농도가 대조군에 비해 약 6배 (600 mg/dL이상)이상 증가되었다. 그러나 당뇨유발 동물에 항당뇨약물을 투여한 실험군에서는 혈중 글루코스 농도가 7일, 14일 및 21일 점차 감소하여, 마지막 및 28일에는 거의 정상군 수준으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 당뇨성 신장 질환의 가장 중요한 인자 중 하나인 뇨중 미세알부민(microalbumin)을 측정한 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, STZ 투여군에서 대조군에 비해 약 10배 이상 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 항당뇨 약물을 투여한 실험군에서는 대조군 수준으로 감소한다는 것을 알 수 있었다.
다음으로, STZ 투여에 따른 당뇨유발 동물모델에서 신부전증이 발생하는지를 확인하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 당뇨유발 동물에서 소변 양 (ml)을 측정한 결과 대조군에 비해 3배 이상 증가하였고(당뇨의 대표적인 임상증상 중 하나), 항 당뇨약물 투약에 의해서는 소변 양이 감소하는 것을 확인하였으며, 신장독성의 주요한 지표인자인 혈중 BUN 및 크레아티닌을 측정한 결과 대조군에 비해 STZ 투여군에서 약 2배 정도 증가하였으나 항당뇨 약물 투여군에서는 정상인 범위내로 낮아진다는 것을 확인하였다.
상기 결과는 당뇨유발 동물 모델에서 신부전증이 유발되었다는 것을 의미하며, 반면에 항당뇨 약물 투여군에서는 BUN 및 크레아티닌이 감소하여 신부전증이 보호되었다는 것을 알 수 있었다.
또한, 당뇨유발 동물 모델에서 신장의 조직학적 손상 정도를 확인하기 위해서, 신장 조직을 10 % 중성 포르말린에 고정시킨 후, 파라핀 처리를 진행하여 두께 5 ㎛로 슬라이스하여 제작한 후, 탈파라핀(deparafiin)화 시켜 헤마톡실린-에오진(Hematosilin-Eosine, H&E)으로 염색하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 당뇨유발 동물 모델에서는 사구체 및 세뇨관에서의 손상이 명확하게 나타난다는 것을 확인한 반면, 항당뇨 약물을 투여한 실험군에서는 정상군(대조군)과 유사한 조직학적 소견을 나타내었다.
상기 결과는, 당뇨가 유발될 경우 만성 신부전증이 나타난다는 것을 의미한다. 특히, 도 2c는 본 연구진이 발굴한 뇨중 신부전증 바이오마커의 함량을 측정한 결과 대조군에서는 PKM2이 검의 검출되지 않았으나 STZ투여에 의해 당뇨가 유발된 실험군에서는 뇨중 PKM2이 매우 높게 검출되었다. 따라서 PKM2이 당뇨에 의한 신부전증 조기 진단을 위한 지표인자가 될 수 있다는 것을 증명하였다.
2-2. Zucker Diabetic Fatty(ZDF) 당뇨병 및 신부전증 유발 동물 모델 검증
본 발명의 상기 실시예 1-1을 통해서, Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 당뇨유발 모델, ZDF 랫트를 도 3a에 나타낸 바와 같이 실험 모델을 설정하여 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로, ZDF 랫트에 생후 6개월부터 4개월간 고지방 식이를 섭취시켜 매달마다 뇨를 체취하여 뇨중에서 PKM2 단백질이 검출되는지를 평가하고자 하였다.
또한, 상기 ZDF 랫트에 고지방 식이를 섭취시킨 뒤 매달마다 혈중 글루코스 농도를 측정하여 당뇨가 유발되는지를 확인하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취시킨 시험군에서는 혈중 글루코스 농도가 600 mg/dL이상으로 시간에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 도 3c에 나타낸바와 같이 이들 동물에서 뇨중에서 검출되는 단백질들(PKM2, NGAL, Vimentin 및 KIM-1)의 함량을 측정한 결과 PKM2이 당뇨 유발 후 1개월부터 검출되었으며, 다른 단백질은 약 4개월후부터 검출되었다.
또한, Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 당뇨병유발 모델에서 신장의 조직학적 손상 정도를 헤마톡실린-에오진(Hematosilin-Eosine, H&E)으로 염색하여 확인하였다. 그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의해 신장의 사구체가 모두 손상되었으며, 세뇨관의 경우에도 세포의 손상정도가 심하게 나타나는 것을 구체적으로 확인할 수 있었으며, 도 3e에 나타낸 바와 같이, 정상 랫트에 비해서, 고지방 식이 ZDF 랫트에서 혈중 BUN 농도가 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는, 당뇨가 유발될 경우 만성 신부전증이 나타난다는 것을 의미한다.
2-3. 당뇨환자에서 검증연구
상기 결과들로부터, 이의 임상적인 결과에서도 일치하는지에 대한 연구를 위하여 당뇨환자의 뇨를 고려대학교 의과대학 병원에서 제공받아 웨스턴 블롯을 이용하여 환자의 뇨에서 PKM2가 검출되는지를 조사하였다.
보다 구체적으로, 36명의 당뇨환자 시료를 대상으로 PKM2의 뇨중 단백질을 검사한 결과, 대부분의 환자군에서 PKM2 단백질이 검출되었으며, 특히 당뇨기간이 길어짐에 따라 환자에서 뇨중 PKM2이 높게 검출되는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
도 5는 일반적으로 제2형 당뇨환자에서 뇨중으로 PKM2이 나오는지에 대한 작용기전을 설명하는 것으로, 고지방 식이에 따라 신장에서 산화적 손상이 증가하며, 이때 다양한 종류의 염증유발인자가 활성화되어 신장을 손상시키고, PKM2 단백질이 신장 세포에서 높게 발현된다는 사실을 확인하여, 본 발명의 발명자는 신장의 근위세뇨관세포(proximal tubule cells)가 손상되면 PKM2 단백질이 뇨중으로 유리되어 나온다는 것을 처음으로 증명하였다.
이들 결과에 기초하여 도 6에서는 당뇨환자에서 신부전증을 유발하는 기전 및 각 단계별 신부전증 진단을 위한 바이오마커의 종류에 대하여 설명하였다. 당뇨의 초기단계에서는 글루코스 대사를 이용한 ATP합성단계에 영향을 미치며, 좀더 진행됨에 따라 신장 조직의 산화적 손상이 나타나며, 염증반응에 의한 세포사를 유발한다는 것을 알 수 있었으며, 최종적으로는 신 섬유화를 유도하여 신장 기능이 손상된다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 기존 마커를 활용한 신장기능 이상의 문제점 및 뇨중 신장질환 관련 단백질 함량 측정
상기 실시예 2 에서는 당뇨성 신부전증 유발 동물 모델 및 임상에서 당뇨에 의해 신부전증이 유발되는지를 확인하였으며, 그 결과 두 가지 (제1형 및 제2형) 당뇨 모델에서 모두 신장 기능 이상이 나타난다는 것을 증명하였다. 또한, 신장기능 진단 마커인 BUN, 크레아티닌 및 미세알부민이 당뇨유발 랫트에서 높게 검출된다는 것을 증명하였다.
한편, 현재 임상적으로도 이용되는 뇨중 신장기능 이상 바이오마커로는 KIM-1, NGAL 등이 있으나(도 5), 이들 바이오마커를 임상적으로 이용하기에는 단가가 비싸기 때문에 일반적으로 쉽게 활용되지 못하고 있다. 그럼에도 불구하고 많은 연구자들이 KIM-1 및 NGAL을 신부전증 검색을 위한 바이오마커로 활용하고 있다.
이에, 본 연구에서도 PKM2, KIM-1, NGAL 및 TIMP-1등의 뇨중 함량을 이들 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 실시예 1-3의 방법에 따라 분석하였다.
보다 구체적으로, STZ 투여에 의한 당뇨유발 동물 모델에서 신장독성이 유발될 경우의 뇨중에서 검출되는 PKM2 단백질 양을 웨스턴 블롯 (항원-항체 반응)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, STZ 투여군(당뇨유발동물)에서 뇨중 PKM2이 높게 검출된다는 것을 확인하였으며, 또한 당뇨 유발동물에 항당뇨 약물을 투여한 후 뇨중에서 PKM2을 검출한 결과 정상인 대조군과 유사하게 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
마찬가지로 고지방 식이로 당뇨를 유발한 동물모델, ZDF 랫트의 PKM2 단백질 양을 웨스턴 블롯 (항원-항체 반응)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 정상군에서는 PKM2 단백질이 전혀 검출되지 않았으나 고지방 식이 투여 후 2개월부터 시간-의존적으로 PKM2 단백질이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
반면에, 최근에 보고된 신부전증의 진단 바이오마커인 NGAL 및 KIM-1은 고지방 식이섭취를 시작한 후 4개월에서만 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 당뇨성 신부전증에 있어서 PKM2이 다른 종류의 진단 마커보다도 감도가 우수하여, 조기진단용 바이오마커로서 그 가치가 우수하다는 것을 의미한다.
본 발명의 PKM2 단백질 및 이의 활용 기술은 뇨(Urine)중에서 당뇨 또는 약물에 의한 신장기능 이상의 조기진단 및 질병의 정도를 예측 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있으며, 임상적 치료과정에서 흔히 발생될 수 있는 약물로 인한 급성신부전증 진단뿐 아니라 신약개발에서 필수적으로 이뤄지는 전임상 독성실험, 및 당뇨병성 신부전증의 조기발견 등의 여러 분야에서 광범위하게 활용될 수 있어, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (16)

  1. 뇨(Urine)중 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 신장질환 조기 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PKM2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 신장질환 조기 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PKM2 단백질을 검출하는 제제는 뇨중 PKM2 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 신장질환 조기 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신장질환은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 신장질환 조기 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서
    상기 신장질환은 당뇨병성 신장 질환인 것을 특징으로 하는, 신장질환 조기 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 신장질환 조기 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 신장질환 조기 진단용 키트.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 신장질환은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 신장질환 조기 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 신장질환은 당뇨병성 신장 질환인 것을 특징으로 하는, 신장질환 조기 진단용 키트.
  10. 신장질환을 조기 진단하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법으로,
    상기 방법은 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 방법은 상기 PKM2 단백질을 검출하여 그 발현수준을 정상 대조군 뇨의 PKM2 단백질의 발현수준과 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 단백질의 검출은 PKM2 단백질에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 신장질환은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 및 수신증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 신장질환은 당뇨병성 신장 질환인 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 개체의 뇨(Urine)로부터 PKM2 (Pyruvate kinase M2) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 신장질환을 조기 진단하는 방법.
  16. 제1항 조성물의 신장질환을 조기 진단하기 위한 용도.
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