KR20220105382A

KR20220105382A - 급성 췌장염 중증도 진단용 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR20220105382A
Application number: KR1020210007995A
Authority: KR
Inventors: 홍순선; 정경희
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2022-07-27
Also published as: KR102453551B1

Abstract

본 발명은 급성 췌장염 중증도 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 바이오마커는 급성 췌장염 중증도, 특히, 경도에 대한 진단 효과가 우수하므로, 급성 췌장염의 발병 유무 뿐만 아니라 병증 수준을 정확하고 빠르게 파악함으로써 경증 급성 췌장염 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

급성 췌장염 중증도 진단용 정보 제공 방법{Method of Providing Information for Diagnosing Acute Pancreatitis Severity}

본 발명은 급성 췌장염 중증도 진단용 정보 제공 방법에 관한 것이다.

췌장의 염증성 질환은 크게 2 가지인데, 급성 췌장염 (acute pancreatitis, AP)과 만성 췌장염(CP)로 분류할 수 있다.

급성 췌장염 (acute pancreatitis)은 증상의 정도가 다양하며 생명을 위협할 수 있는 질병이다. 급성 췌장염 발병의 80% 이상이 경미하고 자체 제한적이며 심각한 합병증없이 해결되는 경증(mild)이나, 20%의 경우 심각한 이환율이나 사망률을 보이며 추후 일시적인 장기 부전 또는 국소/전신 합병증이 발생하는 중증(severe)인 것으로 알려져 있다. 지속적인 장기 부전은 사망률이 높은 심각한 급성 췌장염으로 이어지며, 급성 췌장염의 전체 사망률은 약 10-15%이지만 중증 질환이 있는 환자의 경우 최대 30%-40%에 이른다. 다기관 부전으로 이어지는 췌장 괴사와 관련된 패혈증 합병증은 질병 후반에 사망의 주요 원인이 되고 급성 췌장염의 심각도는 예측할 수 없이 빠르게 변동될 수 있다.

급성 췌장염 환자에서 전체 사망의 약 50%가 발병 2주 이내 발생하므로, 진단과 동시에 중증도를 평가하여 경증 또는 중증의 경과를 보일 것으로 예측되는 환자를 선별하여 초기부터 집중치료를 제공하는 것이 중요하다. 또한, 경증의 췌장염이라고 하더라도 중증으로 진행할 수 있기 때문에 초기 치료와 지속 평가가 매우 중요하다.

그러나, 급성 췌장염은 대부분 초기에는 증상이 없거나 애매한 경우가 많아서 조기에 췌장 질환을 진단하기가 쉽지 않으며 조기진단을 위해서는 다양한 영상검사, 혈액검사, 췌장 기능검사를 적절하게 이용해야 한다. 그럼에도 불구하고 현재까지 이런 여러 가지 진단 방법을 이용하여도 췌장염의 조기 진단율의 향상을 기대할 수가 없다. 특이 증상이 없는 췌장염은 이미 발병하고 난 후에는 치료법이 거의 없기 때문에 췌장염에 대한 조기 진단 및 치료를 위한 연구가 더욱 필요한 상황이다.

또한, 현재 연구 기법의 발전에도 불구하고, 췌장염의 정확한 병인은 아직 명확하지 않고, 진단 및 치료를 타겟으로 하는 바이오 마커는 거의 전무한 상태이다. 게다가 이미 공지된 마커들도 대부분 일반적인 위험인자의 역할만이 알려져 있기 때문에, 췌장염 심각도와 관련된 유전자에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

따라서, 조기 진단에 따라 치료의 효과가 크게 영향을 받는 급성 췌장염을 타겟할 수 있는 새로운 위험인자 및 치료 인자 마커로서 급성 췌장염의 병태 생리학, 심각도의 진단 및 예측을 확립할 수 있는 진단 마커의 발굴, 즉, 급성 췌장염에 특이적인 혈청 마커를 검출하고 급성 췌장염에서의 진단을 당업계에서 사용되는 검사와 비교하여 보다 정확하게 수행할 수 있는 개선된 기술적 수단을 확립할 필요가 있다. 특히, 초기 병기 단계인 경증의 AP를 구별하는 방법이 시급히 필요하다.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 급성 췌장염을 중증도에 따라 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 급성 췌장염 환자를 대상으로 연구하던 중 급성 췌장염의 진행 정도에 따라 C5a 및 ANGPTL-4의 발현 수준에 차이가 있음을 발견하였다. 이에, 급성 췌장염, 특히, 초기의 경증 급성 췌장염을 타겟으로 하는 바이오 마커로서 C5a 및 ANGPTL-4 발현을 분석하여 경증 급성 췌장염과의 상관성을 규명하였고, 급성 췌장염의 발병 여부 뿐만 아니라 중증도, 즉, 경증을 정확하게 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 급성 췌장염의 중증도 진단에 대한 정보를 제공하는 키트를 제공하는 데 있다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:

(a) 생물학적 시료 내 ANGPTL-4(angiopoietin like 4) 단백질의 발현 수준; 및 C5a(complement component 5a) 단백질의 발현 수준;을 측정하는 단계;

(b) 상기 각 단백질의 발현 수준을, 정상군 시료의 각 단백질의 발현 수준과 비교하여 산출된 값으로 급성 췌장염 중증도를 예측 또는 진단하는 단계.

상기 ANGPTL-4(angiopoietin like 4) 단백질 및 C5a(complement component 5a) 단백질의 발현 수준은 급성 췌장염의 중증도 진단용 바이오마커로서, 이의 측정은, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 실시된다.

본 발명에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 목적상, 진단은 급성췌장염의 발병 여부, 발병 가능성 여부 및 중증도, 예컨대, 경도(mild) 또는 중증도(severe)로 구별되는 급성췌장염의 중증도 중 경도, 즉, 경증 상태를 판정하는 것이다.

본 발명에서 급성 췌장염(acute pancreatitis)은 크게 두 가지 유형으로 나누어 볼 수 있는데, 간질성 부종(interstitial edema)과 췌장 주변의 지방성 괴사(peripancreatic fat necrosis)가 발견되는 경증(mild type) 급성 췌장염과, 췌장 주변(peripancreatic) 및 췌장 내부(intrapancreatic)의 광범위한 지방성 괴사, 췌장의 유조직 궤사(pancreatic parenchymal necrosis), 출혈을 동반하는 중증(severe type)의 췌장염이 있다(Bank PA, Am J gastroenterol, 89, pp151-152, 1994; Bradley EL, Arch Surg, 128, pp586-590, 1993; 김창덕, 대한소화기학회지, 46, pp321-332, 2005).

본 발명에서 "마커"란 급성 췌장염의 중증도 중 경증을 진단할 수 있는 물질로, 급성 췌장염과 관련된 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 마커는 ANGPTL-4(angiopoietin like 4) 및 C5a(complement component 5a)로, 경증 급성 췌장염 환자를 진단할 수 있는, 현저한 발현 수준이 나타나는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "생물학적 시료"는 대상 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 췌장 조직이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정"이란 급성 췌장염의 중증도, 특히, 경증 상태를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 급성 췌장염과 관련된 ANGPTL-4 및 C5a 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다.

본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서는 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)를 이용하였다.

본 발명의 마커는 급성 췌장염 환자에서 대조군에 비해 현저하게 발현이 증가하기 때문에, 대조구 시료와의 비교를 통해, 급성 췌장염의 발병 유무 뿐만 아니라 중증도 상태를 정확하고 빠르게 진단할 수 있다.

따라서, ANGPTL-4 및 C5a의 발현 수준 측정에 의해 산출된 수치는 경증 급성 췌장염 진단을 위한 정보를 제공하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 경증 급성 췌장염 환자의 혈청에서의 ANGPTL-4 및 C5a 단백질의 수준이 대조군과 비교하여 유의적으로 증가함을 확인하였다.

즉, 중증 급성 췌장염에서의 ANGPTL-4 및 C5a 함량에 대한 비율은 경증 급성 췌장염 대비 상당히 증가함을 확인하였다.

따라서, 상기 ANGPTL-4 및 C5a의 발현 수준을 측정함으로써 급성 췌장염 발병을 기반으로 경증 상태를 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명의 상기 (b) 단계에서 산출된 값은 ELISA에서 나온 결과의 로지스틱 회귀 분석 결과 컷-오프(cut-off) 값이, ANGPTL-4의 경우 40.98 ng/ml 및 C5a의 경우 5.4 ng/ml이면, 상기 대상체의 경증 급성 췌장염인 것으로 결정한다.

또한, 상기 (b) 단계에서 상기 산출된 대상체 및 정상 대조군의 ROC 곡선에서 나타나는 컷-오프 값이 ANGPTL-4의 경우 40.98 ng/ml 및 C5a의 경우 5.4 ng/ml일 때, 대상체를 민감도(sensitivity)가 97 내지 100% 및 특이도(specificity)가 96 내지 98%로 경증 급성 췌장염인 것으로 결정한다.

상기 (b) 단계에서 산출된 값은 ELISA에서 나온 결과의 로지스틱 회귀 분석 결과 컷-오프(cut-off) 값이 ANGPTL-4의 경우 40.98 ng/ml 미만 및 C5a의 경우 5.4 ng/ml 미만이면, 상기 대상체는 정상이거나, 경증 급성 췌장염이 아닌 것으로 결정한다.

또한, 다른 양태에 따르면, 본 발명은 급성 췌장염 중증도 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 ANGPTL-4 및 C5a 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 급성 췌장염의 중증도를 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 예컨대, 급성 췌장염 중증도 판단을 위한 ANGPTL-4 및 C5a 항체 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, 바람직하게는 단백질 칩 키트의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 키트는 대상이 급성 췌장염인지 아닌지를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 급성 췌장염을 진단하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 급성 췌장염 중증도의 진행 정도, 즉, 경증 상태를 판별 또는 진단할 수 있도록 하고, 치료에 대한 대상의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료 방법을 변경할 수 있게 한다.

또한, 마우스 및 래트 등을 포함하는 급성 췌장염 동물모델의 생체 내외에서 ANGPTL-4 및 C5a 단백질의 발현을 조절하는 물질을 동정하는데도 사용될 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 마커를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 바이오마커는 급성 췌장염 중증도, 특히, 경도에 대한 진단 효과가 우수하므로, 급성 췌장염의 발병 유무 뿐만 아니라 병증 수준을 정확하고 빠르게 파악함으로써 경증 급성 췌장염 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 대상 환자로부터 분리된 혈청 시료 내 ANGPTL-4에 대한 ROC (Receiver Operating Characteristic) 커브를 도시한 결과를 보여준다.
도 2는 대상 환자로부터 분리된 혈청 시료 내 C5a에 대한 ROC (Receiver Operating Characteristic) 커브를 도시한 결과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 시료 내 ANGPTL-4 및 C5a 발현 수준 확인

본 발명자들은 인간을 대상으로 한 중증도에 따른 급성 췌장염 진단용 바이오 마커를 개발하고자, 먼저 실제 췌장염 환자 혈액 혈청에서의 ANGPTL-4 및 C5a 수준을 확인하였다.

전북대병원, 경북대병원 및 인하대병원으로부터 정상인 98명 및 급성 췌장염 90명의 혈액 시료를 제공받였다.

모든 혈액 시료 채취는 서면 동의하에 각 의과대학의 임상시험심사위원회(IRB)의 승인된 절차에 따라 이루어졌다. 급성 췌장염 환자의 시료는 영상학적 진단 방법과 세포병리학적 방법을 통해 경증 환자로서 진단된 90명으로부터 얻었다.

상기 혈액 시료를 4℃에서 12000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 수득하였고, ELISA 방법을 이용하여 상기 혈청 시료 내 ANGPTL-4 및 C5a 수준을 측정하였다.

간략하게, ELISA 방법은 다음과 같다: 인간 ANGPTL4와 C5a는 R&D (ELISA kit)에서 구입하여 사용하였다. ANGPTL4와 C5a는 1차 항체가 코팅(1 ug)된 96-웰 플레이트에 혈액에서 분리한 혈청은 50ul로 1/2 희석하여 기준 단백질과 함께 100 μl씩 넣어주고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 시료와 기준 용액은 버리고 100 μl 검출 항체(100 ng)를 넣은 후 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 용액을 버리고 세척 완충액으로 3회 세척 후 100 μl HRP 용액을 넣고 실온에서 30분 반응시켰다. 반응 용액을 버리고 세척 완충액으로 3회 세척 후 100 μl TMB 기질을 첨가하고 빛 차단 후 10-30 min 반응시켰다. 노란색으로 변하기 시작하면 종료 시약(stop solution) 50ul를 첨가하여 반응을 멈춘 후 분광기(spectrometer)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 2. 급성 췌장염 환자에서의 ANGPTL-4 및 C5a 발현 수준 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1의 측정 결과를 기반으로, ANGPTL-4 및 C5a의 경증 급성 췌장염 진단 마커로써의 가능성과 타당성을 검증하기 위해, 로지스틱 회귀 분석을 수행하여 각 마커의 진단력을 분석하였다.

또한, 각각의 단백질에 대해 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석을 수행하여 특이도, 민감도 및 정확도(AUC)를 산출하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, ANGPTL-4의 AUC 값은 0.998로 나타냈으며; 도 2에 나타낸 바와 같이, C5a의 AUC 값 역시 0.998로 나타나 이들 모두 유의성이 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 로지스틱 회귀 분석 모델을 적용하여 단백질 정량 분석 데이터 및 환자 임상 정보를 컷-오프(cut-off) 값과 연결시켜, 경증 급성 췌장염 진단 가능성을 조사하였다.

이때, ANGPTL-4 및 C5a 수준이 연속형인 측정값이므로, 경증 급성 췌장염일 가능성이 높은 것으로 판단되는 최적의 기준 컷-오프 값 (optimal cut-off value)을 구하기 위해서 Youden's J statistic (Youden's index = 민감도+특이도-1)을 이용하였다.

그 결과, ANGPTL-4의 경우, Youden index에 의한 최적의 컷-오프 값은 40.98 ng/ml이었고, 이때 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)는 각각 97% 및 97%였으며; C5a의 경우, Youden index에 의한 최적의 컷-오프 값은 5.44 ng/ml이었고, 이때 민감도 및 특이도는 각각 100% 및 96%였다.

즉, 정확도(AUC)와 특이도, 민감도가 모두 상승하였음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

이러한 결과는 ANGPTL-4 및 C5a를 함께 조합하여 사용할 경우, 급성 췌장염의 경증의 진단과 조기 진단에 특히 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.

따라서, 경증 급성 췌장염 환자를 진단하기 위한 cut-off 값이 ANGPTL-4 40.98 ng/ml 및 C5a 5.44 ng/ml이면 경증 급성 췌장염 환자로 진단하는 것이 가능하다.

Claims

다음 단계를 포함하는, 급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법:
(a) 생물학적 시료 내 ANGPTL-4(angiopoietin like 4) 단백질의 발현 수준; 및 C5a(complement component 5a) 단백질의 발현 수준;을 측정하는 단계;
(b) 상기 각 단백질의 발현 수준을, 정상군 시료의 각 단백질의 발현 수준과 비교하여 산출된 값으로 급성 췌장염 중증도를 예측 또는 진단하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 산출된 값은 ELISA에서 나온 결과의 로지스틱 회귀 분석 결과 컷-오프(cut-off) 값이 ANGPTL-4의 경우 40.98 ng/ml 및 C5a의 경우 5.4 ng/ml이면, 상기 대상체의 경증 급성 췌장염인 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는,
급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법.
제2항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 산출된 대상체 및 정상 대조군의 ROC 곡선에서 나타나는 컷-오프 값이 ANGPTL-4의 경우 40.98 ng/ml 및 C5a의 경우 5.4 ng/ml일 때, 대상체를 민감도(sensitivity)가 97 내지 100% 및 특이도(specificity)가 96 내지 98%로 경증 급성 췌장염인 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는,
급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 산출된 값은 ELISA에서 나온 결과의 로지스틱 회귀 분석 결과 컷-오프(cut-off) 값이 ANGPTL-4의 경우 40.98 ng/ml 미만 및 C5a의 경우 5.4 ng/ml 미만이면, 상기 대상체는 정상이거나, 경증 급성 췌장염이 아닌 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는,
급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 대상체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 시료인 것을 특징으로 하는,
급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는,
급성 췌장염의 중증도 진단을 위한 정보 제공 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 급성 췌장염의 중증도에 대한 정보를 제공하는 진단 키트.