KR101782768B1 - 신장질환 조기 진단용 바이오마커 sbp1 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명의 바이오마커 및 이의 활용 기술은 뇨중에서 당뇨 및 약물에 의한 신장기능 이상의 조기진단 및 질병의 정도를 예측 및 평가하는 데 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 높은 민감도와 특이성으로 당뇨 및 약물의 노출에 의한 신장기능 이상 여부를 정확하게 판별할 수 있으며, 신장의 이상 징후를 비교적 간편한 방법을 통해 조기에 효과적으로 진단할 수 있으므로, 임상적 치료과정에서 흔히 발생될 수 있는 약물로 인한 급/만성신부전증 진단뿐 아니라 신약개발에서 필수적으로 이뤄지는 임상실험 등의 여러 분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.

Description

신장질환 조기 진단용 바이오마커 SBP1 및 이의 이용 {Biomarker SBP1 for early diagnosis of Renal disorders and their use}

본 발명은 신장질환 조기 진단용 바이오마커 SBP1 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 신장 질환의 조기 진단을 위한 바이오마커 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트, 동물실험방법, 임상실험결과 및 이의 검출방법 등에 관한 것이다.

신장은 체내에서 대사되어 혈액 속에 존재하는 다양한 물질들을 배출하는 장기로서, 사구체 여과, 신세뇨관 흡수 및 재흡수 과정을 통하여 혈액을 여과함으로써, 체내에 불필요한 노폐물들을 뇨의 형태로 배출하는 장기이다. 신장 무게는 몸무게의 약 0.5%에 불과하지만, 신장으로 흐르는 혈액량은 총 심박출량의 20-25%에 달하므로 혈액에 포함되어 있는 각종 독성물질 (toxic xenobiotics)로 인해 손상을 받기 쉬운 장기중 하나이다. 예를 들어, 체내에 과다한 약물을 주사하거나, 심장질환, 당뇨 및 고혈압과 같은 각종 대사질환이 발생할 경우, 신장은 매우 서서히 손상될 수 있는데, 신장이 손상되면 체내에 존재하는 독성 물질들이 체외로 배출되지 않아, 그에 따라 추가적인 합병증을 유발 할 수 있다.

특히, 당뇨 및 약물에 의하여 유발되는 급·만성 신장 질환은 임상에서도 빈번하게 나타나는 사례로 급성 신기능 저하의 10-20%는 약물에 의한 것이며, 또한 심장이식 등과 같은 장기이식수술 환자에서도 빈번하게 급성 신부전증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 현재, 질병의 진단 및 치료 기술의 급속한 진보에도 불구하고, 집중 치료 영역 (ICU)에서의 중증급성 신부전증 환자의 사망률은 지난 50년간 크게 진전되지 않았으며 50% 전후에 머물러 있어, 여전히 극복해야할 과학계의 난제로 남아있다.

특히, 신장 손상이 3개월 이상 지속되는 병리 현상을 만성 신장질환 (chronic kidney disease; CKD)이라고 하며 노령사회 진입과 서구적 생활 방식 확산으로 만성 신장질환 발병율의 증가는 우리나라를 비롯하여 전 세계적으로 매년 10%이상씩 증가되고 있다. 특히, 만성 신장질환은 비가역적인 질환으로 신장기능이 60%이상 소실될 경우 대부분의 환자들에게서 투석이 없이는 정상적인 생활을 할 수 없는 말기 신부전증 (End stage renal disease; ESRD)으로 진행하며 더 나아가 심뇌혈관계 질환 등 합병증 발병과 관련성이 높아 이를 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다. 만성 신장질환 유병률은 전 세계적으로 약 10% 이상을 차지하고 있으며 당뇨병 및 고혈압과 같이 매우 흔한 질환으로, 만성 신장질환 및 말기 신부전증의 증가는 우리나라의 경우 10명중 1명이이라고 보고되고 있는 실정이다.

만성 신장질환 발생의 주요 질환으로는 당뇨병(약 70% 이상)이 가장 주요한 원인으로 알려져 있으나, 당뇨병성 신증으로 인해 말기 신부전증으로 진행되는 주요 기전은 명확하지 않다. 최근 서구화된 식습관의 유행과 고령화와 더불어, 당뇨병 유병율이 급속하게 증가하며, 당뇨병 증가에 따라 당뇨성 만성 신부전증 유병률도 전 세계적으로 기하급수적으로 증가하고 있는 실정이다.

현재 우리나라에서는 인구 10명 당 1명이 당뇨병을 앓고 있는 것으로 집계되며 60세 이상 노년층에서는 인구의 10명 당 2명이 당뇨병, 또 다른 2명이 당뇨병의 전단계인 내당능장애를 보이고 있다. 현재의 추세를 감안할 때 향후 10-20년 후에는 당뇨병 발생이 폭발적으로 증가할 것으로 예상되며, 미국의 경우 당뇨병 환자 치료에 소요되는 의료비가 연간 440억불에 달하여 단일 질환으로 가장 큰 비중을 차지하며 간접비용을 포함하면 연간 980억불 이상의 엄청난 경제적 손실이 발생되므로 당뇨병의 발생과 진행을 예방하는 것은 환자 유병율과 사망률의 감소뿐 아니라 의료비 지출의 감소라는 사회경제적 측면에서도 매우 중요한 과제이다.

당뇨병은 질환자체 보다는 혈관합병증이 문제가 되고, 당뇨병성 혈관합병증 중 하나인 당뇨병성 신증은 말기 신부전증을 유발하는 제1원인 질환이다. 우리나라에서 당뇨병으로 인한 말기 신부전증 환자는 지속적으로 증가하여, 당뇨병성 신증이 전체 말기 신부전증 원인 중 47.1%를 차지하고 있음이 확인됨. 당뇨병성 신증 증가로 인해 말기 신부전증 환자 및 투석, 신장질환으로 인한 사망률 증가가 우려되고 있다.

최근 미국의 경우 당뇨병성 신증 유병률이 2배 가까이 증가하여, 막대한 의료부담을 유발함이 보고됨에 따라서, 공중보건학적인 주목을 받고 있다.

당뇨병성 신증은 사구체여과율과 단백뇨에 따라서 4기로 나뉘는데, 당뇨병성 신증의 단계에서 사구체여과율의 감소 이전에 미세알부민뇨 발생이 선행함을 알 수 있다. 또한, 당뇨병성 2기 미세알부민뇨가 나타나기 시작하는 시점에도 이미 신장에는 해부학적 변화가 존재한다. 미국의 경우 7 백만 명의 당뇨병성 신증 환자 중 미세알부민뇨가 없는 환자가 무려 2 백만 명에 육박하여 미세알부민뇨를 통한 당뇨병성 신증 진단에 한계를 보이고 있다.

당뇨병성 신증의 지속적인 증가 현황을 감안할 때, 현재의 보편적 치료인 식사, 운동 및 약물요법이 적절하지 못함과 함께, 기존 당뇨병 및 당뇨병성 신증 치료법 이외에 병인에 대한 다양한 접근이 필요함을 파악할 수 있다. 현재 당뇨병으로 인한 신증 예방을 위하여 레닌-안지오텐신계(renin-angiotensin system: RAS) 억제제를 사용하고 있으나, RAS 억제제의 치료는 만성신부전으로의 진행 속도는 늦추나 완벽한 예방은 불가능한 상태이다. 따라서, 당뇨병성 신증의 조기 진단 및 진행, 치료 효과에 대한 판정에 대한 새로운 지표의 확립이 절실하다.

현재 알려진 당뇨병성 신증의 진행과 연관된 위험인자는 고령(increased age), 당뇨의 유병기간(long duration of diabetes), 사구체여과율의 빠른 감소속도(rapid decline of GFR), 사구체조직손상의 정도(pronounced glomerular damage), 높은 당화혈색소 수치(high HbA1c), 고지혈증(cholesterol, triglyceride), 고혈압(high blood pressure), 당뇨신경병증의 존재(diabetic neuropathy), 당뇨망막병증의 존재(diabetic retinopathy), 가족력(positive family history), 비만(increased body weight or waist-to-hip ratio), 흡연(smoking)으로써,상기 위험인자에 대한 관리와 함께, 당뇨병성 신증 진단을 위한 노력이 수반되는데, 당뇨병성 신장 질환이 진단되면 신기능 손상 진행을 평가하기 위해 GFR을 매년 정기적으로 추적 관찰하는 것이 중요하며 이와 동시에 미세알부민뇨의 변화에 대한 추적을 같이 시행한다.

임상적으로 미세알부민뇨의 변화보다는 GFR이 보다 정확한 신기능을 반영하므로 GFR의 변화 추이는 환자의 예후를 결정짓는 중요한 인자로서, 제1형 및 제2형 당뇨환자 모두에서 여러 임상결과에 의하면 특히 신장 기능이 3기 이상인 환자들의 경우 초기 치료 후에 감소되는 요단백양은 향후 신장의 예후를 반영하는 좋은 지표로 여겨지나, 신장질환 초기인 만성 신장질환 1, 2기의 환자들의 경우는 치료 후 초기 요단백감소가 신장의 장기적인 예후 인자는 아님이 알려져 있다.

당뇨환자의 경우 대부분 다량의 단백뇨를 동반할 것으로 추측되지만, 약 30-40% 환자에서는 미세알부민뇨 없이 신기능만 저하됨이 보고됨. 단백뇨가 없이 신기능이 저하된 환자의 유병률에 대한 최근 연구 결과에 의하면 제2형 당뇨환자 중에서 GFR이 60 ml/min/1.73m2 미만 환자 빈도는 23.1% 로서 일반 국민에 비해 약 1.3배 이상의 높은 빈도를 보였고, 신기능이 저하된 당뇨환자의 55% 환자에서 미세알부민뇨가 없는 특징을 보였다.

미세알부민뇨 없이 신기능이 저하된 당뇨환자의 원인으로는 몇 가지 가설이 제시되고 있다. 첫째로 대부분의 환자에서 사용 중인 레닌-안지오텐신(RAS) 차단제의 효과와 혈압 약제의 사용에 의한 혈압조절 및 고지혈증 약제의 효과 등에 의해 단백뇨가 소실되었을 가능성, 당뇨의 합병증이 세뇨관 간질 조직에서 주로 발생하는 경우와 당뇨와 같이 수반될 수 있는 비 당뇨병성 신장 질환이 동반되었을 가능성, 수입소동맥을 침범하는 신장혈관의 질환 및 신장의 노화과정의 급속한 진행 등이 서로 복합적으로 작용하여 나타나리라 추정되나, 현재 미세알부민뇨 없이 당뇨병성 신증을 가지고 있는 환자들에 대한 병태생리학적 기전에 대한 연구가 전무하여 단백뇨를 수반하지 않는 당뇨병성 만성 신장질환의 병태생리 및 치료에 대한 보다 적극적인 연구가 필요하며 당뇨로 진단된 환자에서는 미세알부민뇨가 없더라도 신기능이 감소할 수 있으므로, 이러한 신손상을 평가하기 위한 조기지표의 규명이 필요하다.

특히, 당뇨성 만성 신장질환으로 인해, 환자는 1.8배의 의료비 지출이 유발되며, 투석이 진행되는 경우에는 그 부담이 10.3배로 증가하여 당뇨성 질환 및 고령화 사회의 막대한 의료부담을 유발함 (Park et al., 2014). 2013년 말 기준으로 약 8만 명의 대한민국 국민이 신장 이식요법 (renal replacement therapy)을 받지 않고서는 건강한 생활을 할 수 없는 실정으로 개인과 사회에 커다란 부담을 초래하고 있다. 특히, 혈액투석은 최소 1주일에 3회에 걸쳐 행하여지며, 그에 따른 투석비용도 만만치 않다. 예컨대, 1회 투석을 받을 때마다 최소 16만원정도 비용이 소요되며, 1달에 약 250만원 이상의 의료비가 소요된다. 그 중 90%는 국민건강보험에서 지급하고 있어 앞으로 막대한 정부의료비 예산이 소요될 예정이다(년간 1조원).

만성 신장질환은 특이적인 증상이 없어 진단이 어려우며, 질환이 장기간 진행하여 생명에 위험을 주게 되는 경우가 많기 때문에 만성 신장질환을 조기에 발견하고 적절한 시기에 치료를 시작함으로써 신손상 진행을 예방하는 것이 만성 신장질환 및 이와 동반된 여러 합병증을 막을 수 있는 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.

한편, 만성 신장질환의 진단은 대부분 신장의 기능평가를 통해 이루어진다. 즉, 혈청 크레아티닌을 통한 사구체여과율 (GFR, glomerular filtration rate) 예측 및 단백뇨 정량검사와 같은 일반적인 지표를 통해 진단되고 있으나, 신장 손상이 상당히 진행된 후에야 이들 지표의 변화가 나타나기 때문에 진단 후 손상된 신장을 정상적으로 복구하기는 불가능할 뿐만 아니라, 가장 주요 지표로 활용되는 크레아티닌은 연령, 성별, 근육량, 갑상선 기능, 식사 패턴 및 투약에 따라 변동이 있어 정확한 신기능 측정 및 예측인자로써의 한계가 있다.

한편, 급성 신장손상 (AKI; acute kidney injury)이 GFR 저하 및 환자 사망률 등과 밀접한 관계가 있다고 보고되면서, 신장 손상을 평가하기 위한 지표를 개발하여 신장 손상을 예측하기 위한 움직임이 활발하게 진행되고 있다. 이들 마커가, 기존 신장 기능 저하로 인해 신손상의 end stage에서야 반영되는 신기능 지표 (serum creatinine 및 blood urea nitrogen)들을 대체할 수 있는지에 대한 연구가 확대되고 있다.

국제적으로 제안되고 있는 신규 신장손상 바이오마커는 KIM-1 (kidney injury molecule-1), NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), b2-microalbumin 등으로 다양한 임상 연구에서 KIM-1, NGAL, NAG (N-acetyl-D-glucosaminidase), uNAP (urinary nonalbumin protein) 및 H-FABP (heart?fatty acid binding protein) 등이 신장 질환 바이오마커로 사용 가능한지 검토되고 있다. 당뇨병 환자를 대상으로 바이오마커 연구에서 NGAL과 사구체여과율 간에, uNAP와 알부민뇨 간에 의미 있는 연관성이 있음이 밝혀졌으며, 이러한 새로운 바이오마커들의 신장 손상과의 연관성이 규명되고 있지만, 대부분 연구가 연구 대상 환자 집단이 작고 단면 연구로만 이루어졌다. 이로 인해, 신규 바이오마커들과 신장 손상과의 시간 변수에 따른 예측 변화를 정확히 반영하지 못하고 있으며, 더욱이 기존 바이오마커 들의 진단력이 미세알부민뇨보다 우월하지 못한 것으로 평가된다. 이러한 바이오마커들의 임상 적용 가능성에 관한 연구가 더욱 가속화되고 있으나, 질환별 신장손상 기전과의 연관성, 임상시료에서의 예측력 평가의 미비 등으로 아직 상용화되지 못하고 있는 실정임. 특히 당뇨병성 신장손상에는 아직 적용되지 못하고, 실제로는 비특이적인 단백뇨 혹은 알부민뇨와 혈청 크레아티닌 등이 활용되고 있어 조기 진단에 어려움이 있었다.

본 발명의 발명자들은 당뇨병성 신증의 단면연구/추적연구 환자군을 구축하여, 단백체 기반으로 신규 바이오마커를 도출하고, 임상 적용 가능성을 평가하고자 하였으며, 또한, 신규 발굴 신장손상 바이오마커의 유효성 및 예측력을 검증하고, 기 제안된 신손상 바이오마커들과의 비교를 통하여 타당성을 입증하고자 하였다.

급/만성 신부전증 경우에는 발증 후, 시간 단위로 병의 진행 상태를 파악하여야 하므로, 이의 조기 진단 및 조기 치료는 향후 생명 예후를 판정하는데 있어서 매우 중요하나 아직까지 이에 대한 진단 마커는 현재 없는 실정이다. 이에 대처하기 위해 최근에 다양한 종류의 신장질환 바이오마커들이 개발되어 이용되고 있으나 모두 혈액을 이용해야 하며, 전통적으로 신부전증의 진단은 통상 혈청 크레아티닌 (Cr) 상승을 지표로 행해지고 있다. 그러나, 실제로 신장 장해가 발생한 후 혈청 Cr은 이미 신장 기능 이상이 상당히 진행된 후에나 상승하기 때문에 AKI 진단 시점에서는 이미 이를 치료할 수 있는 최적의 타이밍을 놓친 경우가 많다. 따라서, 혈청 Cr은 AKI의 진단 마커로서는 불충분하여, 뇨를 이용한 조기 바이오마커의 발굴이 시급하다 (한국공개특허 10-2010-0035637호 참조).

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 기존에 신장질환 판별 마커로 사용된 혈청 Cr 및 혈중요소질소 (BUN)를 사용한 경우보다 높은 민감도와 특이성을 가지는 당뇨성 신장질환 조기 판별 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 질병상태에 따라 뇨로 유리되어 나오는 Selenium-Binding Protein 1 (SBP1)의 농도를 항체를 이용한 기술을 이용하여 측정하여 신부전증의 초기단계에서부터 높은 특이성과 민감도로 신장질환 여부를 판별할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 뇨중(Urine) SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질을 측정하는 제제를 포함하는, 신장질환 조기 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 신장질환 조기 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신장질환을 진단하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료(뇨)로부터 SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장질환 조기진단 평가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 SBP1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 SBP1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 뇨중 SBP1 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신장질환 조기 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 키트는 단백질 칩 키트일 수 있다.

또한 본 발명은 신장질환을 진단하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 방법은, 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하여 그 발현수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 의 발현수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단백질의 검출은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 반응에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 신장질환은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 또는 수신증일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 신장질환은 당뇨병성 신장 질환일 수 있으며, 이 때, 당뇨병성 신장 질환에 당뇨병성 신부전증이 포함되는 것은 당업계에서는 자명한 것이다.

본 발명의 SBP1 단백질 및 이의 활용 기술은 뇨중에서 당뇨 및 약물에 의한 신장기능 이상의 조기진단 및 질병의 정도를 예측 및 평가하는 데 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 높은 민감도와 특이성으로 약물의 노출에 의한 신장기능 이상 여부를 정확하게 판별할 수 있으며, 신장의 이상 징후를 비교적 간편한 방법을 통해 조기에 효과적으로 진단할 수 있으므로, 임상적 치료과정에서 흔히 발생될 수 있는 약물로 인한 급성신부전증 진단뿐 아니라 신약개발에서 필수적으로 이뤄지는 전임상독성실험 등의 여러 분야에서 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 및 도 1b는 streptozocin (STZ)를 처리하여 사람에서 당뇨병을 유발하는 유사한 동물모델을 설정하기 위한 실험 디자인을 나타낸 것이며, 도 1c는 당뇨유발 동물에 항당뇨약물을 투여함에 따른 혈중 glucose농도를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 1d는 당뇨성 신장 질환의 가장 중요한 인자 중 하나인 뇨중 microalbumin을 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 도 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이, 랫드에 STZ를 투여한 후 당뇨가 유발되어 당뇨 유발에 의한 신장기능 이상의 대표적인 지표인자중 하나인 뇨중 microalbumin의 농도가 증가되는 것을 확인하여 본 실험동물모델이 당뇨성 신부전증을 예측하기 위해 잘 제시되었음을 확인할 수 있었다.
도 2a는 항당뇨 약물의 효과를 보기위한 중요한 실험방법으로 도 2a는 glucose tolerance test 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 insulin sensitization test 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 STZ-투여 당뇨유발 동물모델에서 신부전증이 나타나는지를 확인하기 위해서, 소변량, 혈중 BUN 및 creatinine을 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 3b는 STZ 당뇨유발 동물모델에서 신장의 조직학적 손상 정도를 hematosilin & Eosine (H&E) 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3a에서 보는 바와 같이 당뇨가 유발된 동물에서 뇨량이 증가하였으며, 그에 따라 신장독성 지표인자인 혈중 BUN 및 Creatinine이 증가된다는 것을 증명하였다. 또한, 신장의 조직학적 소견에서도 당뇨유발동물에서 신장의 사구체 및 세뇨관에 심각한 세포사가 나타나는 것을 확인 할 수 있었으며, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 항당뇨 약물을 투여한 실험군에서는 신장 조직이 대조군과 유사하게 손상을 받지 않았다는 것을 알 수 있었다. 도 3c는 이들 당뇨성 신부저증 유발동물 모델의 뇨중에서 SBP1 단백질이 증가되는 지를 검토한 결과를 나타낸 것으로서, 당뇨 유발동물에서 SBP1 및 NGAL이 유의하게 증가하는 것을 확인하여 뇨중 SBP1이 당뇨성 신장손상에 의해 매우 민감하게 증가한다는 것을 증명할 수 있었다.
도 4a는 제2형 당뇨유발 동물 모델로 잘 알려진 Zucker Diabetic Fatty (ZDF)를 이용하여 당뇨모델 제작 디자인을 나타낸 것이며, 도 4b는 ZDF 랫드에 고지방 식이를 한 후 매달마다 혈중 glucose 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 4c는 ZDF 랫드에 고지방 식이를 5 개월간 실시한 후 부검하여 신장의 조직학적 손상 정도를 H&E 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 4d는 ZDF 랫드에 고지방 식이에 따른 혈중 BUN 농도도 정상 랫드에 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 4e는 ZDF 랫드에 고지방 식이를 4주간 실시한 후, 뇨중에서 SBP1, NGAL, vimentin, 및 KIM-1의 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 당뇨환자의 뇨중에서 SBP1, Kim-1 및 NGAL의 단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 만성적인 고혈당 (당뇨)환자의 경우 어떻게 신장기능이 손상이 오는지를 설명한 것이며, 그에 따라 당뇨의 진행단계에 따라 검출되는 지표인자 (즉, 바이오마커)를 설명한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 대표적인 신장독성 물질인 중금속 (수은, HgCl₂)을 1개월간 경구 (0.1, 1 mg/kg 및 5 mg/kg)로 투여한 후 만성적으로 신장기능 손상을 유도하여 그 결과를 나타낸 것으로, 신장 조직을 H&E 염색에 의해 병리학적 소견을 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 도 7b는 신장독성 물질인 중금속 (수은, HgCl₂)의 처리에 따른 신장조직에서 SBP1 단백질의 발현을 나타낸 것이고, 도 7c는 수은 소량(0.1 mg/kg)을 1개월간 투여시 조직학적 손상의 평가지표 및 BUN, 크레아티닌 농도를 나타낸 것이다.
도 8a는 쥐에 대표적인 신장독성 물질인 항암제 시스플라틴 (CDDP)을 투여 후 1일 (Day1) 및 3일 (Day3) 및 5일 (Day5)에 신장의 조직학적 손상 유무를 나타내었으며, 그에 따라 신장조직에서 발현되는 SBP1 단백질을 조직염색을 통하여 증명한 결과를 나타낸 것이고, 도 8b는 약물을 투여하지 않은 대조군 및 약물 투여 시험군을 대상으로 기존 신장기능 이상 마커인 혈청 크레아티닌 (Serum Creatinine), 혈청 요소 질소 (BUN), 및 뇨에 함유된 SBP1 단백질을 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 8c는 CDDP 투여에 따른 신장 및 뇨중 SBP1의 함량을 western blot을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 씨스플라틴 및 사염화탄소를 투여한 쥐의 간을 H&E염색하여 조직학적 병리소견을 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 도 9b는 사염화탄소 투여 1일 후, 간독성 지표인자인 AST 및 ALT 값을 1일, 3일 및 5일 시간별로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 9c는 뇨중에서 간독성물질 투여에 의해 SBP1이 나오는지를 western blot을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 것이며, 도 9d는 간독성물질 투여에 의한 신장독성 지표인자인 BUN 및 creatinine도 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 급성 신부전증 유발을 유도하기 위한 시험 모델로서 허혈성 신장질환 (Ischemia/Reperfusion) 모델의 제작 디자인을 나타낸 것이며, 도 10b는 허혈성 신부전증의 전형적인 기전을 나타낸 것이다.
도 11a는 허혈성 신부전증을 유도한 후 9시간, 24시간 및 48시간에 혈액를 채취하여 신장독성의 지표인자를 평가한 결과를 나타낸 것이며, 도 11b는 Sham (가성 수술군)군과 비교하여 뇨중 SBP1 및 기존의 신장기능 이상 바이오마커를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a는 정상인과 신부전증 환자에서 각각 혈중 BUN 및 크레아티닌 함량을 비교한값은 나타낸 것이며, 도 12b는 뇨중에서 SBP1, NGAL, TIMP1 및 KIM-1의 함량을 western blot assay를 이용하여 측정한 값을 나타낸 결과이다.
도 13은 중환자실에 입원한 환자 20명을 대상으로 혈중 BUN 및 creatinine 및 뇨중 SBP1을 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 뇨중 각 마커의 약물 신장기능 이상에 대한 ROC (receiver operating characteristic curve)-AUC (area under curve) 파라미터 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 현재까지 알려진 신장기능 손상의 진단을 위한 바이오마커의 종류에 대한 설명을 나타낸 것이다.

본 발명자들은, 실시예에서 당뇨성 신부전증을 유발하는 동물 모델을 이용하여 당뇨에 의한 신부전증을 유발한다는 것을 충분히 입증한 후 뇨중에서 SBP1 단백질이 뇨중에서 검출된다는 것을 확인하였으며, 항 당뇨약물 투약 후에는 SBP1이 검출되지 않는다는 것을 증명하는 결과로부터 본 발명을 완성하였다. 또한, 당뇨환자를 대상으로 뇨중에서 SBP1을 측정한 결과 당뇨 기간이 길어짐에 따라 뇨중 SBP1이 높게 검출된다는 것을 증명하여 SBP1이 당뇨성 신부전증의 조기진단 마커로서의 가치가 있다는 것을 입증하였다.

그 외에도 급성신장독성 유발모델에서도 신장기능 이상을 유발하는 것으로 잘 알려진 약물인 시스플라틴 (cisplatin, CDDP)을 쥐에 주사한 후, 시험군 및 투여하지 않은 대조군 쥐을 대상으로 24시간 동안 받은 뇨 또는 해부 후에 회수한 혈청에 함유된 SBP의 수준변화를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 신장질환 조기 진단을 위한 바이오마커로서 SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질 이용 가능성을 확인하기 위해, 시스플라틴/HgCl2 에 의한 신장기능 이상을 유도하여 평가를 수행한 결과, 상기 시스플라틴/HgCl2 투여 실험군에서 혈청 크레아티닌 (serum creatinine, SCr), 혈청 요소 질소 (blood urea nitrogen, BUN), 뇨에 함유된 당분 (glucose), LDH, AST (aspartate Aminotransferase) 및 총 단백질 (total protein) 등의 수치가 증가하는 것을 알 수 있었다 (실시예 2 참조).

따라서, 본 발명에 따른 SBP1 단백질은 신규 바이오마커로서 당뇨, 환경오염물질 또는 약물에 의한 신장기능 이상 및 그 부작용의 위험을 혈액을 대신하여 뇨중에서 빠르고 간편하게 조기에 예측하거나 진단하는 기술이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장질환 조기 진단용 조성물을 제공함에 특징이 있으며, 상기 SBP1 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다.

본 발명에서 약물은, 개체의 신장에 기능 이상을 유발하는 자연계에 존재하는 모든 물질을 의미한다. 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 4-아미노페놀(4-aminophenol, PAP), 아리스토로크산(aristolochic acid), 2-브로모에틸아민(2-bromoethylamine, BEA), DCVC, 카드뮴(cadmium), 카드뮴클로라이드(cadmium chloride), 세포페라존(cefoperazone), 세팔로틴(cephalothin), 세륨나이트레이트(cerium nitrate), 진사(cinnabar), 사이클로스포틴(cyclospotine), 시롤리무스(sirolimus), 독소루비신(doxorubicin), 육종용 (herba cistanches), 헥사클로로부타디엔(hexachlorobutadiene), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 겐타마이신(gentamicin), 리튬클로라이드(lithium chloride), 란탄나이트레이트(lanthanum nitrate), 나노 구리(nanocopper), 머큐릭클로라이드(mercuric chloride), 멜라민(melamine), 시아눌릭산(cyanuric acid), 오크라톡신에이(ochratoxin A), 프로필렌이민(propyleneimine), 푸로마이신(puromycin), 디-세린(D-serine), 크로뮴산나트륨(sodium chromate), 타크로리무스(tacrolimus), TCTFP, 토브라마이신(tobramycin), 질산우라닐(uranylnitrate), 반코마이신(vancomycin) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 중금속은 수은(Hg), 카드뮴(Cd), 백금(Pt), 납(Pb) 또는 크롬(Cr) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

기타, 신장기능 이상을 유발하는 물질로 할로겐화 탄화수소 (예를 들어, 사염화탄소, 클로로포름 등)나 각종 환경오염물질(2,4,5-Trichlorophenacetic acid, 제초제 Paraquat, polychlorobiphenyl, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-ρ-dioxin 등) 을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, "평가" 는 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 평가는 신장기능 이상의 발생 여부 및 발생 가능성 여부를 진단, 예측, 검색 또는 확인하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서, "평가용 마커, 평가하기 위한 마커, 또는 평가 마커"란 신장기능 이상이 발생한 또는 발생 가능성이 있는 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분할 수 있는 물질로, 정상 세포 또는 조직에 비하여 신장기능 이상 세포 또는 조직에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 단백질, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 신장기능 평가 마커는 정상 신장 조직의 세포에 비하여, 신장기능 이상 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 SBP1으로, 신장기능 이상 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내는 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 신장질환 평가용 바이오마커의 단백질 또는 유전자 정보는 공지된 유전자데이터베이스를 통하여 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오마커 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 mRNA의 염기 서열은 공지된 유전자데이터베이스인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있다.

본 발명에서 용어, "단백질의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 신장기능 이상에 의해 발현이 변화하는 바이오마커의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.

해당 바이오마커의 발현수준은 마커 단백질의 발현수준 또는 이를 코딩하는 유전자 mRNA 의 발현수준을 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명에서 "단백질의 발현수준 측정"이란 신장기능을 평가하기 위하여 개체의 생물학적 시료에서 신장기능 이상 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, 상기 해당 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 복합체의 검출에 의하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 구체적인 분석 방법의 예시로는, 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게, 단백질 수준을 측정하는 제제는 항체이다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 신장기능 평가용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 "mRNA의 발현수준 측정"이란 신장기능을 평가하기 위하여 개체의 생물학적 시료에서 신장기능 이상 마커 단백질을 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 구체적인 분석 방법의 예시로는, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명 바이오마커의 핵산 서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 디자인 할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4기지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서는 마커 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드이 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 신장기능 이상을 평가할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRAN와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 마커 mRNA 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장기능 이상을 평가할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는 타겟으로 하는 바이오마커 유전자의 mRNA 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 마커 유전자의 mRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미한다.

이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RORC 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 SBP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는, 신장질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 신장기능 평가용 마커의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 신장질환 진단용 키트에는 신장기능 평가용 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 신장기능 평가용 마커 단백질 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이사용 될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 해당 마커의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대하여 당업자가 디자인한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (DEPC-water), 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군에 대한 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 신장기능 평가용 마커 검출용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 신장질환을 진단하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 시료로부터 SBP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어, "개체" 란 자연계에 존재하는 생명체들 중에서 신체 장기 중 신장을 갖고 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 포유류를 의미한고, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다. 상기 포유류의 예로는 쥐(랫트, 마우스 등), 토끼, 말, 소, 양, 개, 고양이, 원숭이 및 인간 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 개체의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "개체의 시료"란 신장기능 평가용 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 신장 조직 또는 이를 구성하는 세포일 수 있다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현수준을 신장질환 의심 개체에서의 유전자 발현수준과 비교함으로써 신장질환 의심 환자의 실제 신장기능 이상 여부를 확인 또는 예측할 수 있다. 즉, 신장기능 이상이 일어난 것으로 추정되는 세포 또는 조직 등의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하고, 정상 세포 또는 조직 등의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현수준이 정상 세포의 것보다 신장기능 이상이 일어난 것으로 추정되는 세포 유래에서 유의적인 발현 증가가 확인될 경우, 해당 개체를 신장질환 환자로 예측할 수 있는 것이다.

마커 단백질을 검출하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 신장질환 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 신장기능 평가용 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 신장질환 의심 개체의 실제 신장질환 발생 여부를 예측 또는 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 신장기능 평가용 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 신장기능 평가용 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 신장기능 평가용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 예를 들어, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다.　생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 신장기능 이상이 발생한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 신장기능 평가용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 예를 들어, 정상 신장 조직 또는 세포, 및 신장기능 이상으로 의심되는 세포 또는 조직 등의 시료를 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 신장기능 평가용 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다.　예를 들어, 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장기능 이상 발생 여부를 확인할 수 있다.

마커의 mRNA 를 검출하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 신장질환 의심 개체에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 신장기능 평가 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 신장질환 의심 개체의 실제 신장질환 발생 여부를 평가할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 신장기능 평가용 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다. 상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 신장기능 평가용 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 신장질환 발생 여부를 간편하게 확인 또는 예측할 수 있다.

한편, DNA 칩은 상기 신장기능 평가용 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 신장질환의 발생 여부를 판독할 수 있다.

상기와 같은 검출 방법을 통하여, 바이오마커의 발현 패턴을 분석함으로써 중금속이나 약물 등 신장기능 이상 유발 물질에 노출된 환자의 신장기능 이상 여부를 정확하고 간단하게 확인 또는 예측할 수 있으며, 이를 바탕으로 신장질환 환자의 치료 및 신약 개발에 활용할 수 있을 것이다.

본 발명에서 상기 신장질환은 신증후군, 신장암, 만성 신부전, 당뇨병성 신장 질환, 당뇨병성 신부전, 급성 신우신염, 급성 신부전, 고혈압성 신장 질환, 라이 증후군, 통풍, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 루푸스, 칸디다증, 신증후성 출혈열, 렙토스피라증, 레지오넬라증, 상염색체 우성 다낭성신종 또는 수신증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험동물 및 실험 방법

본 발명의 일실시예에 사용된 수컷 SD 쥐 (6주령, male Sprague-Dawley rats)를 Charles River Laboratories (Orient, Seoul, Korea)로부터 공급받아 성균관대학교 동물실험 윤리위원회의 규칙에 의거하여 실험을 진행하였다.

1-1. 당뇨유발 동물 모델 준비

본 발명의 일실시예에서는 당뇨유발 동물 모델은 STZ 투여를 이용한 당뇨동물 모델 및 Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat를 이용한 당뇨유발 모델을 각각 확보하고자 하였다.

먼저, STZ투여에 의한 당뇨유발 동물 모델은 Sprague-Dawley 흰쥐에 STZ (50mg/kg)을 1회 복강(I.P.)투여한 후 혈중 glucose 농도를 매일 측정한 후, 충분한 혈중 glucose 농도가 증가되었는지를 평가하여 당뇨가 유발됨(약 5배 정도 증가)을 확인하였으며, 이 때, 일부 실험군에는 항당뇨 약물을 4주간 투여하여, 매주 뇨를 채취하여 SBP1 단백질 수준을 확인하였다.

다음으로 Zucker Diabetic Fatty (ZDF) Rat를 이용한 당뇨유발 모델로서, ZDF 랫트는 태어난 후부터 성장함에 따라 점차적으로 당뇨가 유발되는 유전자 이식 (transgenic) 동물로서, 사람의 제2형 당뇨 모델로 일반적으로 널리 사용되는 동물이다. 특히, 생후 8개월부터 점차 당뇨가 유발되기 시작하여 혈중 glucose농도가 증가되며, 고지방 식이를 할 경우 당뇨는 급속하게 진행된다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서도 ZDF 쥐에 고지방 식이를 공급하여 당뇨를 유발시켰다.

1-2. 중금속에 의한 만성 신부전증 유발 동물 모델 준비

중금속 (수은)에 의한 신부전증 유발 동물 모델은 중금속 투여용량을 매우 저용량 (0.1mg/kg), 저용량 (1 mg/kg) 및 중용량 (5 mg/kg)으로 설정한 후 30 일간 경구로 섭취시켜 매일 요량을 측정하였으며, 시험물질을 마지막 투여한 후 24 시간 동안 받은 뇨에 함유된 단백질의 함량을 측정하였다. 또한, 혈액을 채취한 후 각 시험군 및 대조군의 쥐들을 해부하여 혈청, 신장 조직에 함유된 단백질 수준을 확인하였다.

1-3. 약물에 의한 신부전증 유발 동물 모델 준비

약물에 의한 신부전증 유발 동물 모델은 각 day 별로 대조군 (control) 및 실험군 각각 6 마리씩에 신장기능 이상을 유발하는 약물로 알려진 시스플라틴 (cisplatin, CDDP)(농도: 10 mg/kg, 용매: 생리식염액, i.p.)을 주사한 후 1일 (Day 1), 3일 (Day 3) 및 5 (Day 5)일에 시스플라틴 투여 시험군 및 투여하지 않은 대조군 쥐를 대상으로 24 시간 동안 받은 뇨에 함유된 단백질 함량을 측정하였다. 또한, 뇨를 회수한 후 각 시험군 및 대조군의 쥐들을 해부하여 혈청, 신장 조직에 함유된 단백질 수준을 확인하였다.

1-4. 전기영동 (SDS-PAGE)

뇨, 또는 조직에서 버퍼 (buffer)를 이용하여 단백질을 추출한 뒤 단백질 정량을 통해 샘플을 준비하고, 이를 프로테아제 또는 인산가수분해효소 (phosphatase) 억제제를 첨가한 SDS 샘플 버퍼와 섞어준 뒤, 95 ℃에서 5 분간 가열한 후, 전기영동하였다.

1-5. 웨스턴 블롯 (Western blot)

추출된 단백질을 용해시키고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달하였다. 이때, 전달 버퍼 (Trasnfer buffer)에는 메탄올을 첨가하였으며, 80 V에서 1 시간 진행하였다. 단백질의 전달이 끝난 후, Ponceau S로 염색한 후 (10초-1분 이내, band가 보일 정도로만 살짝) DW나 PBS로 충분히 세척하여 블로킹 (Blocking)하였다. 이때, 블로킹 버퍼 (Blocking buffer)는 3-5% bovine serum albumin (BSA)를 Tris-bufferd saline (TBS)에 Tween 20이 포함된 용액에 녹여 사용하였다. 1차 항체를 4 ℃에서 밤새 반응시키고, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼 (wash buffer, 계면활성제가 포함된 TBS 또는 PBS)로 헹구어 낸 후 2차 항체를 반응시켰다. 2차 항체 반응 후, 다시 세척 버퍼로 결합되지 않은 2차 항체를 씻어낸 뒤 루미놀을 이용하여 밴드를 확인하였다.

1-6. 신장 및 간의 조직학적 소견 (H&E 염색)

각 조직을 Autolysis가 일어나기 전에 빠르게 적출하여, PBS 혹은 Normal saline 을 이용하여 조직 주변부에 묻은 혈액을 제거한 다음, 신장의 경우 외피를 벗겨낸 후 오른쪽 신장을 이등분하여 고정액(10% neutral buffered formalin) 에 담아두고, 간의 경우 가장 큰옆의 일부를 잘라 고정액에 즉시 담아 보관하였다. 다음으로 상기 고정액의 양은 조직 용적의 10~20배 정도가 되게 넣어주었으며, 약 3일간 고정시켜준 후에 고정액을 씻어주고, 에탄올을 이용하여 탈수화 과정을 진행하였다 (70%-> 90% -> 95% -> 100%). 알콜을 제거시킨 다음, 파라핀 침투를 하여 각 slide를 5 ㎛두께로 만들어 DAKO사의 Mayer's hematoxylin과 Eosin을 이용하여 H&E 염색을 진행하였다. 다음으로 각 슬라이드를 Xylene을 이용하여 파라핀을 벗겨낸 후, 에탄올을 이용하여 Xylene과 조직 내의 수분을 제거하고 (100%-> 100%-> 95%-> 70%), 텝워터를 이용하여 남은 알코올들을 씻어내고 Hematoxylin을 상온에서 30초간 염색을 한 뒤, 여분의 Hematoxylin을 씻겨주고, Eosin을 약 1분간 염색한 다음, 여분의 eosin을 씻겨주고, 다시 에탄올을 이용하여 조직 내의 수분을 제거시킨 후 (70%-> 95%-> 100%), Xylene을 이용하여 에탄올을 제거하고, Xylene을 날려 보낸 뒤, Mounting solution을 뿌리고 cover glass를 덮어 상온에서 건조하였다.

1-7. SBP1의 신장조직에서 면역학적염색

상기 실시예 1-6의 각 슬라이드를 Xylene을 이용하여 파라핀을 벗겨낸 후, 에탄올을 이용하여 Xylene 과 조직내의 수분을 제거한 뒤 (100%-> 100%-> 95%-> 70%), 텝워터로 씻겨준 후, 슬라이드에 박리된 조직의 항원부활 (Antigen retrieval)을 위해 Sodium citrate 버퍼를 이용하여 20 분간 전자렌지에 넣어 가열시킨 후, 텝워터를 이용하여 슬라이드를 냉각시켜주고, PBS에 5 분간 상온에 담군 다음, endogenous peroxidase (메탄올:과산화수소 = 3:1)를 이용하여 조직의 불필요한 항원들을 제거하였다 (상온에서 3~5분). 반응이 끝난 후, PBS를 이용하여 5분간 2번 씻어주고, Normal goat serum을 이용하여 Blocking 용액을 만들어 조직을 blocking을 한 뒤, SBP1 항체를 blocking solution에 희석하여 슬라이드에 분주한 뒤, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 워싱 용액을 이용하여 5 분간 3 번 씻겨주고, 2 차 안티 바디를 붙여준다 (상온에서 30분~1시간). 반응이 끝난 후, 워싱 용액을 이용하여 5 분간 3 번 씻겨주고, Avidin-biotinylated HRP을 30 분간 반응시킨 뒤, 워싱 용액을 이용하여 5 분간 3 번 씻겨준다. 이 후, DAKO DAB 용액을 이용하여 약 1분간 반응을 시켜주고, 반응이 끝나고 남은 용액을 제거시킨 다음, Hematoxylin 용액을 상온에서 약 30 초 ~ 1 분간 염색을 하고나서 남은 용액 제거 한 뒤, Blueing solution (Ammonium hydroxide 0.5%)을 분주하여 약 30 초간 반응을 시킨 뒤, 남은 용액을 제거하고, 에탄올을 이용하여 조직내의 수분을 제거하여 준다 (에탄올 70%-> 95% -> 100%). 다음으로 Xylene을 이용하여 조직 내의 에탄올을 제거 후, Xylene을 날리고 Mounting solution을 분주한 뒤, cover glass를 덮어 상온에서 건조시킨다.

실시예 2. 당뇨병 및 신부전증 유발 동물 모델 검증

2-1. STZ 투여에 의한 당뇨병유발 모델 검증

본 발명의 상기 실시예 1-1을 통해서, STZ 투여에 의한 당뇨유발 동물 모델을 검증하기 위해서, 도 1a에 나타낸 바와 같이 실험 모델을 설정하여 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 대조군 (control)에서는 정상적인 혈중 glucose 농도를 나타내었으나, STZ를 투여한 동물군에서는 혈중 glucose 농도가 대조군에 비해 약 6배 (600 mg/dL이상)이상 증가되었다. 그러나 당뇨유발 동물에 항당뇨약물을 투여한 실험군에서는 혈중 glucose 농도가 7일, 14일 및 21일 점차 감소하여, 마지막 및 28일에는 거의 정상군 수준으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 당뇨성 신장 질환의 가장 중요한 인자 중 하나인 뇨중 microalbumin을 측정한 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, STZ 투여군에서 대조군에 비해 약 10배 이상 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 항당뇨 약물을 투여한 실험군에서는 대조군 수준으로 감소한다는 것을 알 수 있었다.

아울러, 항당뇨 약물의 효과를 확인하기 위해서, glucose tolerance test 및 insulin sensitization test를 진행하였다. 그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 항당뇨 약물을 투여한 실험군에서 당뇨를 유발한 실험군에 비해 모두 혈중 glucose에 대한 반응에 민감하게 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, STZ 투여에 따른 당뇨유발 동물모델에서 신부전증이 발생하는지를 확인하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 당뇨유발 동물에서 소변 양 (ml)을 측정한 결과 대조군에 비해 3 배 이상 증가하였고(당뇨의 대표적인 임상증상 중 하나임), 항 당뇨약물 투약에 의해서는 소변 양이 감소하는 것을 확인하였으며, 신장독성의 주요한 지표인자인 혈중 BUN 및 creatinine을 측정한 결과 대조군에 비해 STZ 투여군에서 약 2배 정도 증가하는 것을 확인하였다. 항당뇨 약물 투여군에서는 정상인 범위내로 낮아진다는 것을 알 수 있었다.

상기 결과로부터 당뇨유발 동물 모델에서 신부전증이 유발되었다는 것을 확인할 수 있었으며, 반면에 항당뇨 약물 투여군에서는 BUN 및 creatinine이 감소하여 신부전증이 보호되었다는 것을 알 수 있었다.

또한, 당뇨유발 동물 모델에서 신장의 조직학적 손상 정도를 확인하기 위해서, 신장 조직을 10 % 중성 포르말린에 고정시킨 후, 파라핀 처리를 진행하여 두께 5 ㎛로 슬라이스하여 제작한 후, deparafiin화 시켜 Hematosilin & Eosine (H&E)으로 염색하였다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 당뇨유발 동물 모델에서는 사구체 및 세뇨관에서의 손상이 명확하게 나타난다는 것을 확인한 반면, 항당뇨 약물을 투여한 실험군에서는 정상군(대조군)과 유사한 조직학적 소견을 나타내었다.

상기 결과에 따라, 당뇨가 유발될 경우 만성 신부전증이 나타난다는 것을 유추할 수 있었다. 또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 당뇨유발 실험동물의 뇨에서 SBP1이 높은 농도로 검출되었으며, 항당뇨 약물 투여에 의해서는 SBP1 검출이 유의하게 감소되었다.

따라서, 본 연구결과는 SBP1이 당뇨에 의한 신부전증 조기 진단을 위한 지표인자가 될 수 있다는 것을 증명하였다.

2-2. Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 당뇨병유발 모델 검증

본 발명의 상기 실시예 1-1을 통해서, Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 당뇨유발 모델, ZDF 랫트를 도 4a에 나타낸 바와 같이 실험 모델을 설정하여 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로, ZDF 랫드에 생후 6개월부터 4개월간 고지방 식이를 섭취시켜 매달마다 뇨를 체취하여 뇨중에서 SBP1 단백질이 검출되는지를 평가하고자 하였다.

또한, 상기 ZDF 랫드에 고지방 식이를 섭취시킨 뒤 매달마다 혈중 glucose 농도를 측정하여 당뇨가 유발되는지를 확인하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취시킨 시험군에서는 혈중 glucose 농도가 600 mg/dL이상으로 시간에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

Zucker Diabetic Fatty (ZDF) 당뇨병유발 모델에서 신장의 조직학적 손상 정도를 Hematosilin & Eosine (H&E)으로 염색하여 확인하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의해 신장의 사구체가 모두 손상되었으며, 세뇨과의 경우에도 세포의 손상정도가 심하게 나타나는 것을 구체적으로 확인할 수 있었으며, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 정상 랫드에 비해서, 고지방 식이 ZDF 랫드에서 혈중 BUN 농도가 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4e에서 나타낸 바와 같이 고지방식이에 의해 고혈당이 유발될 때 시간-의존적으로 뇨중 SBP1 농도가 점차 증가한다는 것을 확인하였다. 특히, SBP1이 기존의 신장독성 지표인자인 NGAL, KIM-1보다도 고지방식이 2주부터 증가하여 신부전증의 조기진단에 매우 민감하다는 것을 증명하였다.

2-3. 당뇨환자에서 검증연구

상기 결과들로부터, 이의 임상적인 결과에서도 일치하는지에 대한 연구를 위하여 당뇨환자의 뇨를 고려대학교 의과대학 병원에서 제공받아 western blot를 이용하여 환자의 뇨에서 SBP1이 검출되는지를 조사하였다.

보다 구체적으로, 36명의 당뇨환자 시료를 대상으로 SBP1의 뇨중 단백질을 검사한 결과, 대부분의 환자군에서 SBP1단백질이 검출되었으며, 특히 당뇨기간이 길어짐에 따라 환자에서 뇨중 SBP1이 높게 검출되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 참조).

도 6은 일반적으로 제2형 당뇨환자에서 뇨중으로 SBP1이 나오는지에 대한 작용기전을 설명하는 도면으로, 고지방 식이에 따라 신장에서 산화적 손상이 증가하며, 이때 다양한 종류의 염증유발인자가 활성화되어 신장을 손상시키고, SBP1 단백질이 신장 세포에서 높게 발현된다는 사실을 확인하여, 본 발명의 발명자는 신장의 proximal tubule cells이 손상되면 SBP1 단백질이 뇨중으로 유리되어 나온다는 것을 처음으로 증명하였다.

이들 결과에 기초하여 도 6은 당뇨환자에서 신부전증을 유발하는 기전 및 각 단계별 신부전증 진단을 위한 바이오마커의 종류에 대하여 설명하였다. 당뇨의 초기단계에서는 glucose 대사를 이용한 ATP합성단계에 영향을 미치며, 좀 더 진행됨에 따라 신장 조직의 산화적 손상이 나타나며, 염증반응에 의한 세포사를 유발한다는 것을 알 수 있었으며, 최종적으로는 신 섬유화를 유도하여 신장 기능이 손상된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 기존 마커를 활용한 신장기능 이상의 문제점

본 발명의 상기 실시예 2형 당뇨성 신부전증 유발 동물 모델에서 임상에서와 같이 당뇨에 의해 신부전증이 유발되는지를 확인하였으며, 그 결과 두 가지 (제1형 및 제2형) 당뇨 모델에서 모두 신장 기능 이상이 나타난다는 것을 증명하였다. 이에, 신장기능 진단 마커인 BUN, 크레아티닌 및 microalbumin이 당뇨유발 쥐에서 높게 검출된다는 것을 증명하였다.

또한, 기존 신장기능 이상을 진단하기 위한 시험에서 대표적인 마커인 혈청 크레아티닌 (serum creatinine, SCr), 혈청 요소 질소 (blood urea nitrogen, BUN), 및 뇨에 함유된 당분 (glucose), LDH, AST (aspartate Aminotransferase) 및 총 단백질 (total protein)을 하기와 같이 통상적인 방법에 따라 측정하여 시스플라틴/HgCl₂ 에 의한 신장기능 이상 유도 진단을 수행하였다.

3-1. 중금속 (수은, HgCl ₂ )에 의한 만성 신장기능 이상 유도 확인

다음으로 대표적인 신장독성 물질인 중금속 (수은, HgCl₂)을 1개월간 경구 (1 mg/kg 및 5 mg/kg)로 투여한 후, 신장 조직을 H&E 염색에 의해 병리학적 소견을 관찰하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 저용량(0.1mg/kg)의 수은을 만성적으로 투여에 의해서 신부전증이 유발된다는 것을 확인하였으며, 그에 따라 신장조직에서 SBP1 단백질의 발현도 저용량의 수은을 경구 투여시 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 7b 및 도 7c에 나타낸 바와 같이, 수은을 매우 소량 (0.1 mg/kg)으로 1개월간 투여시 조직학적 손상 및 BUN, 크레아티닌 농도는 증가되지 않았으나, SBP1이 뇨중에서 검출된다는 것을 확인하였다. 따라서, 뇨중 SBP1 단백질은 중금속 등 독성물질의 만성적인 노출에 의해 신장의 기능이 손상되기 이전에 먼저 뇨에서 검출된다는 것을 유추할 수 있었다.

3-2. 시스플라틴 ( CDDP )에 의한 신장기능 이상 유도 확인

본 발명의 상기 실시예 1-2에 나타낸 바와 같이, 쥐에 대표적인 신장독성물질 약물 (시스플라틴)투여 (10mg/kg, I.p.) 후 각각 1일 (Day 1), 3일 (Day 3) 및 5 (Day 5)일째가 되는 날 24 시간 동안 metabolic cage (대사체 분석을 위한 우리)를 이용하여 뇨를 받았고, 받은 뇨 시료는 3000 g의 원심분리기를 이용해 15 분 동안 분리하여 상등액만 취해서 -80 ℃ 냉장고에 보관하였다. 뇨를 받은 후 실험동물은 이산화탄소로 마취하여 복대동맥에서 혈액을 뽑았고, 출혈에 의한 자연사 후 신장과 간을 적출하였다. 얻어진 혈액 시료 역시 1500 g로 15 분 원심분리하여 상등액만 취해서 -80 ℃ 냉장고에 보관하였다. 이렇게 얻어진 뇨와 혈액 시료는 각 파라미터에 해당하는 실험 키트를 이용하여 기존의 마커를 측정하였다.

그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 시스플라틴 투여 후 1 일에 신장조직이 마일드 (mild)하게 손상되기 시작하였으며, 5 일에는 대부분의 세뇨관이 심각하게 손상된 것을 확인하였으며, 그에 따라 손상된 신장 조직 부위에서 SBP1이 강하게 염색된다는 것을 증명하였다.

상기의 결과에 따라 도 8b에 나타낸 바와 같이, 신장독성 지표인자인 혈청 크레아티닌 (Serum Creatinine), 혈청 요소 질소 (BUN)는 1 일에는 대조군과 차이가 없었으나 CDDP 투여 후 3일에는 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며, 투여 후 5 일에는 약 3-5 배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 신장독성 지표인자인 뇨중 SBP1의 함량을 western blot을 이용하여 정량한 결과 CDDP 투여 후 1일부터 증가하여 5일에는 매우 높은 농도로 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 내용을 종합한 결과, SBP1이 기존의 신장독성 지표인자인 혈청 크레아티닌 (Serum Creatinine), 혈청 요소 질소 (BUN)보다 조기에 뇨중으로 나온다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 혈액을 이용하지 않아도 쉽게 뇨만으로도 신부전증의 조기진단이 가능하다는 것을 유추할 수 있었으며, 또한, 기존 지표 물질을 사용한 약물 투여에 의한 신장기능 이상 진단 분석의 경우 어느 정도 예측이 가능하기는 하나, 공지된 바와 같이 신장조직이 상당히 손상을 받은 후에나 나타나기 시작하여 이들 마커(BUN, 크레아티닌)들은 신장 기능 이상에 대한 민감성 및 특이성이 매우 낮아 조기에 민감하게 예측하는 것이 어려움을 알 수 있는 바, SBP1을 신장질환 진단을 위한 지표물질, 즉 마커로 사용하는 경우 우수한 민감성 및 특이성을 통해 약물의 신장기능 이상을 조기에 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 간독성 모델에서의 뇨중 SBP1의 단백질 함량 측정

간독성 모델에서의 뇨중 SBP1의 단백질이 유리되는지 확인하기 위해서, 간독성 물질인 사염화탄소 (CCl₄)를 쥐에 투여한 후 간독성을 유발시킨 뒤, 뇨중에서 SBP1의 단백질 함량을 측정하였다.

그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소를 투여한 쥐의 간을 H&E 염색하여 조직학적 병리소견을 관찰한 결과, 시스플라틴 투여군에서는 간독성이 유발되지 않았으나, 사염화탄소 투여군에서는 투여 후 1 일부터 심각한 간 손상을 나타내었으며, 시간이 지날수록 점차 회복되는 경향을 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 간독성 지표인자인 AST 및 ALT 값이 투여 1일 후, 대조군에 비해서, 사염화탄소 투여군에서 높게 증가한 뒤, 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

더욱이, 도 9c에 나타낸 바와 같이, 뇨중에서 간독성물질 투여에 의해 SBP1이 나오는지를 western blot을 이용하여 정량한 결과 전혀 검출되지 않았으며, 도 9d에 나타낸 바와 같이, 신장독성 지표인자인 BUN 및 creatinine도 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 SBP1은 신장독성 특이적으로 뇨중에서 검출된다는 것을 유추할 수 있었다. 즉, SBP1이 신장질환 관련 특이성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 허혈성 신장질환 ( Ischemia / Reperfusion ) 모델의 뇨중 SBP1의 단백질 함량 측정

5-1. 허혈성 신장질환 ( Ischemia / Reperfusion ) 모델 준비

먼저, 신장의 위치를 정확하게 표시하면, 절개시 용이하다. 절개할 때는 되도록 여러 번에 나눠서 가위질을 하는 것 최소한의 가위질로 절제하는 해야한다. 이유는 절개면이 매끄럽게 잘려 이후에 봉합하기 편하고, 시간도 단축할 수 있기 때문이다. 외피를 절개선에 따라서 자르고, 외피와 내피 사이에 있는 중간막도 잘 제거한 뒤, 내피마저 절제한다. 포셉 (Forcep)을 이용하여 조심스럽게 신장을 꺼낸다. 이 때, 신장이 손상되지 않도록 주의가 필요하며, 신장을 잡기가 어려울 때는 지방층을 당겨서 꺼내는 것도 도움이 된다. 주위의 지방층을 최대한 제거하여 신장의 hillum (신장 혈관이 모이는 곳)이 잘 보이도록 하고, 나일론 줄로 강하게 여러 번 매듭을 묶는다. 이후, 매듭 윗부분을 잘라 신장을 제거한다(도 10a 참조). 이 때, 무리하게 지방을 제거하다 혈관에서 출혈이 생길 수 있으므로 주의가 필요하다.

따라서, 미리 조립해둔 metabolic cages (대사체 분석을 위한 우리)에 수술이 끝난 쥐를 넣어주고, 수술이 끝난 후, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 그룹에 따라 시간대에 맞는 뇨를 모았다. 이후, Metabolic cage에서 수집한 뇨를 3000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 불순물을 가라앉히고, 상등액만 취해서 미리 네이밍 (naming) 해 놓은 튜브에 분주하여 냉동실에 보관하였다. 이 때, 허혈성 신장질환의 전형적인 기전을 도 10b에 나타내었다.

희생 시점 pretreatment & IR	9hr	24hr	48hr
Group1 (Sham)	9hr후 수집	24hr후 수집	24hr후 수집
Group2 (IR)	9hr후 수집	24hr후 수집	24hr후 수집

5-2. 뇨중 SBP1 단백질 함량 측정

도 11a에 나타낸 바와 같이, 허혈성 신부전증을 유도한 후 9시간, 24시간 및 48시간에 혈액을 채취하여 신장독성의 지표인자를 평가한 결과, 모든 시간에서 혈중 BUN 및 크레아틴 농도가 증가하는 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며,

Sham (가성 수술군)군과 비교하여 뇨중 SBP1 및 기존의 신장기능 이상 바이오마커를 비교하였으며, 그 결과, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 뇨중에서 유리되어 나오는 SBP1을 western blot을 이용하여 정량한 결과, IR에 의해 뇨에서 검출된 SBP1 단백질이 유의하게 증가한다는 것을 알 수 있었다.

상기로부터, SBP1이 허혈성 급성 신부전증의 뇨중 진단 마커로서도 우수한 감도를 나태낼 수 있음을 유추할 수 있었다.

실시예 6. 급성신부전증 환자에서의 뇨중 SBP1의 함량 측정

6-1. 시료(뇨) 수집 및 분석 방법

다음으로, 급성 신부전증 환자군 (P1~P7)의 뇨와 정상인 (C1~C5)의 뇨에서 각각 SBP1 단백질의 함량을 측정하였다. 급성신부전증 환자로부터의 뇨 시료는 고려대학교 의과대학 (IRB승인 이전의 뇨 시료)으로부터 제공 받아 실험에 이용하였으며, 뇨중에서 SBP1, KMI-1, NGAL 및 TIMP-1 등의 뇨중 함량을 이들 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 실시예 1-3의 방법에 따라 분석하였다.

6-2. 뇨중 단백질 함량 측정

그 결과, 도 12a에 나타낸 바와 같이, 먼저 급성 신부전증 환자와 정상인에서 혈중 BUN 및 크레아틴 농도를 측정한 결과, 신부전증 환자의 경우 신장독성 지표인자가 모두 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 12b에 나타낸 바와 같이, SBP1이 급성 신부전증 환자의 뇨중에서 매우 높게 나타난다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 동물실험 결과와 유사하게 임상시료에서도 뇨중 SBP1이 정상인에서는 전혀 검출되지 않았으며, 신부전증 환자에서만 뇨중에서 검출된다는 것을 입증하는 결과이다.

또한, 중환자실에 입원한 환자 20 명을 대상으로 혈중 BUN 및 creatinine 및 뇨중 SBP1을 각각 측정하였다.

보다 구체적으로, 상기 환자군에서는 어떤 환자가 신부전증을 유발하는지에 대한 정보는 없으며, 일반적으로 중환자실에 입원한 환자의 약 50%이상이 신부전증을 나타낸다는 것이 보고되어 있어 본 발명에서도 신부전증의 유무를 평가하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 대부분의 환자에서 크레아티닌 농도가 입원전에 비해 높게 검출되었으며, 입원후에는 일부 환자가 개선된 효과를 나타내었음. 그에 따라 뇨중에서 SBP1을 측정한 결과 약 70 %이상의 환자에서 SBP1이 높게 검출되었음. 특히 262번 환자의 경우는 혈중 크레아티닌 농도가 매우 높게 나타났으며, SBP1의 농도도 높게 검출되는 것을 확인하였다.

6-3. ROC (receiver operating characteristic curve)- AUC (area under curve) 분석

상기의 결과를 바탕으로, SBP1을 사용하여 신장기능 이상을 진단하는 방법의 민감성 및 특이성을 판별하기 위해, 통상적인 방법에 따라 각 마커의 약물 신장기능 이상에 대한 ROC (receiver operating characteristic curve)-AUC (area under curve) 파라미터 분석을 수행하였다 (ROC-AUC 분석에서는 통상적으로 AUC 값이 0.7 이상인 경우 마커로서 유의성을 갖는 것으로 판단하며, 1에 가까울수록 우수한 마커인 것을 의미한다.).

도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 SBP1을 표지물질로 사용하여 임상시료에서의 신장기능 이상을 진단하는 방법을 분석한 결과, 1에 가까운 AUC 값 (0.98)을 갖는 우수한 파라미터를 나타내는 것을 확인하였으며, 이에 따라 본 발명의 SBP1이 기존 신장기능 이상 마커들과 비교하여도 신장기능 이상에 대한 민감성 및 특이성이 현저히 우수한 것을 확인하였다.

실시예 7. 뇨중 신장질환 관련 단백질 함량 측정

현재 임상적으로도 이용되는 뇨중 신장기능 이상 바이오마커로는 KIM-1, NGAL 등이 있으나 (도 15 참조), 이들 바이오마커를 임상적으로 이용하기에는 단가가 비싸기 때문에 일반적으로 쉽게 활용되지 못하고 있다. 그럼에도 불구하고 많은 연구자들이 KIM-1 및 NGAL을 신부전증 검색을 위한 바이오마커로 활용하고 있다.

이에, 본 발명에서도 SBP1, KMI-1, NGAL 및 TIMP-1등의 뇨중 함량을 이들 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 실시예 1-3의 방법에 따라 분석하였다.

보다 구체적으로, STZ 투여에 의한 당뇨유발 동물 모델에서 신장독성이 유발될 경우의 뇨중에서 검출되는 SBP1 단백질 양을 Western blot (항원-항체 반응)을 이용하여 측정하였다. 마찬가지로 고지방 식이로 당뇨를 유발한 동물모델, ZDF 랫드의 SBP1 단백질 양을 Western blot (항원-항체 반응)을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4e에 나타낸 바와 같이, 정상군에서는 SBP1 단백질이 전혀 검출되지 않았으나 SBP1 단백질은 투여 후 2개월 부터 시간-의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이 때, 최근에 보고된 신부전증의 진단 바이오마커인 NGAL 및 KIM-1은 투여후 4개월에서만 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 당뇨성 신부전증에 SBP1이 다른 종류의 진단 마커보다도 감도가 우수하다는 것을 알 수 있었으며, 조기진단용 바이오마커로서 그 가치가 우수하다는 것을 증명하는 결과이다.

또한, 전술한 도 8c에 나타낸 바와 같이, 시스플라틴을 투여한 시험군 및 비투여 대조군을 대상으로 뇨에 함유된 SBP1 단백질의 수준을 비교 확인한 결과, 신장기능 이상이 유도된 시험군의 3일째 뇨에서 SBP1의 수준이 대조군에 비해 크게 증가한 것을 확인하였으며, 특히 이러한 수준 감소는 약물 투여 후 첫날인 3일부터 현저하게 나타난 것을 확인하였다.

상기 내용을 종합한 결과, SBP1은 정상뇨에서는 전혀 검출되지 않아 신장기능 이상의 초기단계에서 신장의 tubular cells이 손상을 받아 뇨중으로 검출된다는 것을 예측할 수 있었으며, 일반적으로 SBP1은 신장세포에서 조직의 산화적 손상이 유발될 경우 초기단계에 방어기전으로 증가되며, 이들 산화적 손상이 심할 경우 세포가 파괴되어 세포 밖으로 유리되어 뇨중으로 나온다는 것을 알 수 있었다. SBP1을 신장질환 진단을 위한 지표물질, 즉 뇨중 마커로 사용하는 경우 우수한 민감성 및 특이성을 통해 약물의 신장기능 이상을 조기에 매우 빠르고 간단하게 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Biomarker SBP1 for early diagnosis of Renal disorders and their use <130> MP17-108 <150> KR 10-2016-0109119 <151> 2016-08-26 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 664 <212> PRT <213> Selenium-Binding Protein 1 <400> 1 Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Thr Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys 20 25 30 Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly 35 40 45 Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly 50 55 60 Cys Ala Cys Cys Cys Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Thr Gly 65 70 75 80 Thr Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Thr Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Thr Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala Gly Gly Ala Thr Gly Thr Cys 130 135 140 Gly Ala Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys 145 150 155 160 Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly 165 170 175 Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly 180 185 190 Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Ala Ala 210 215 220 Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys 225 230 235 240 Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys 245 250 255 Cys Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala 260 265 270 Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly 275 280 285 Cys Cys Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly 290 295 300 Cys Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr 305 310 315 320 Cys Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala 325 330 335 Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Ala 340 345 350 Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala 355 360 365 Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys 370 375 380 Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Cys 385 390 395 400 Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr Thr 405 410 415 Thr Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Gly 420 425 430 Gly Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly 435 440 445 Thr Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Cys Ala 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Thr Gly 465 470 475 480 Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr 485 490 495 Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly 500 505 510 Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala 515 520 525 Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala Asn Gly Ala Ala Ala 530 535 540 Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Asn Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly 545 550 555 560 Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr 565 570 575 Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Cys 580 585 590 Cys Thr Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly 595 600 605 Gly Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Thr 610 615 620 Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Ala 625 630 635 640 Ala Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Asn 645 650 655 Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Thr 660

Claims (13)

1. 뇨중(Urine) SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨병성 신장질환 조기 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 SBP1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 뇨중 SBP1 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는, 당뇨병성 신장질환 조기 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 키트.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 당뇨병성 신장질환을 조기 진단하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법으로,
   상기 방법은 개체의 뇨로부터 SBP1 (Selenium-Binding Protein 1) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 상기 SBP 1 단백질을 검출하여 그 발현수준을 정상 대조군 시료의 SBP1 단백질의 발현수준과 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 단백질의 검출은 SBP1 단백질에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 반응에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
12. 삭제
13. 삭제

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