KR101834857B1 - 제2형 당뇨병의 조기 진단을 위한 단백질 바이오 마커 - Google Patents

제2형 당뇨병의 조기 진단을 위한 단백질 바이오 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체에서 분리한 단백질로부터 제2형 당뇨병의 초기 병인을 확인할 수 있는 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 초기 제2형 당뇨병과 관련된 단백질 마커에 관한 것으로서, 초기 제2형 당뇨병에 대한 바이오마커 또는 진단키트로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한, 치료제 발굴을 위한 스크리닝 표적으로 사용될 수 있다. 이러한 개발에 의하여 나아가 심혈관계 합병증 및 미세혈관합병증 등의 만성 대사 합병증을 예방하는 효과를 기대할 수 있다.

Description

제2형 당뇨병의 조기 진단을 위한 단백질 바이오 마커{A protein biomarker for early diagnosis of type 2 diabetes mellitus}
본 발명은 인체에서 분리한 단백질로부터 제2형 당뇨병의 초기 병인을 확인할 수 있는 진단용 바이오 마커에 관한 것이다.
지방 조직은 비만, 심혈관계 질환 및 제2형 당뇨병 등 대사 이상에 중요한 병태생리학적인 역할을 하는 내분비 기관이라 할 수 있다. 지방 조직은 그 분포에 따라 내장지방조직과 피하지방조직 등으로 나뉘고 각기 다른 종류의 아디포카인 (adipokine)이라 불리는 활성물질이 분비된다. 특히 내장지방조직은 복강에 위치하며 내장기관으로 둘러싸여 있는데 아디포카인과 유리지방산을 분비함으로써 간, 췌장, 뇌, 또는 근육 등의 생리 작용에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 내장지방조직에서 분비되는 아디포카인은 간에서의 지방 대사를 조절한다. 내장지방조직의 이상은 동맥 경화증, 비만, 고지혈증, 심혈관계 질환, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 고혈압을 포함하는 전신적인 만성 염증과 더불어 대사 질환을 초래하게 된다.
제2형 당뇨병 환자는 내장 지방이 축적된다고 보고되고 있으며, 이는 말초의 인슐린 저항성, 특히 간의 인슐린 저항성과 높은 연관성을 보인다. 또한 대사 질환 환자에서는 상당한 양의 내장지방조직 축적이 흔히 관찰된다. 인슐린 저항성을 보이거나 제2형 당뇨병 환자는 건강 대조군과는 달리 체내 대사가 일어나는 환경의 변화와 내장지방조직에서 분비되는 아디포카인의 변화가 보이는데, 이는 향후 제2형 당뇨병과 심혈관계 질환으로 발전하는 중요한 병태생리학적인 특징으로 여겨진다. 따라서 내장지방조직은 제2형 당뇨병, 심혈관계 질환, 또는 비만의 병인을 밝힐 수 있는 새로운 분자 또는 기전의 중요한 표적기관이라 할 수 있겠다.
복잡한 인체의 질환과 관련된 새로운 바이오마커(단백질 또는 기전)을 개발하기 위하여 프로테오믹스 (proteomics, 단백질체학) 기술이 이용되고 있고, 제2형 당뇨병의 병태생리를 확인하고자 환자나 동물 모델로부터 얻어진 조직과 혈청 샘플으로 몇몇 프로테오믹스 연구가 시행되고 있다. 예를 들면, Li 등이 제2형 당뇨병 환자의 혈청으로부터 얻어진 68개의 단백질을 이용하여 Ficolin-3 라는 보체의 상위 활성체가 제2형 당뇨병과 관련성이 있음을 밝혀냈다. 지방 세포나 지방 조직의 경우, Adachi 등이 mouse 3T3-L1 비방세포로부터 3,287 개의 단백질을 식별하였고, Xie 등은 3명의 건강한 사람의 복부 피하지방조직으로부터 1,493 개의 단백질을 발견하였다. 이러한 연구들로서 프로테옴(proteome)이 여러 가지 지방 관련 질환과 관련된 기능을 확인하는데 유용한 자원이 될 수 있음을 보여준다. 그러나 이러한 프로테옴들은 비병원성의 지방세포나 피하지방조직에서 측정된 것들로서 제2형 당뇨병 환자들의 내장지방세포의 포괄적인 프로테옴 연구는 이뤄진 바가 없다. 특히 제2형 당뇨병 환자의 내방지방조직에 대한 전체적인 프로테옴 연구뿐 아니라 제2형 당뇨병과 정상 혈당군에서 제2형 당뇨병의 병인과 관련된 분자적인 측면으로 프로테옴을 체계적으로 비교 분석한 연구는 없었다.
본 발명의 목적은 제2형 당뇨병의 초기 병인을 밝혀낼 수 있는 바이오 마커를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 초기 제2형 당뇨병 환자 및 정상 혈당 대조군으로부터 획득한 내장지방조직의 광범위한 프로테옴 프로파일링(proteome profiling)에 의한 분석을 통하여 제2형 당뇨병의 병인과 관련된 단백질 마커를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태로서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 제2형 당뇨병의 조기 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 검출시약을 포함하는, 검체의 제2형 당뇨병의 조기 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 검체로부터 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4 및 ACADL 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 양을 검출하는 단계; 및
상기 검출된 마커의 양을 검사 대상자의 제2형 당뇨병의 조기 진단에 연관시키는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검사 대상자의 검체로부터 상기 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, FABP4, S100A8, SORBS1, 또는 C1QA의 억제제; 또는 PLIN4 또는 ACADL의 증진제 중 하나 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태로서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 단백질을 제공하는 단계; 상기 단백질을 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 상기 단백질의 발현을 비교하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
제2형 당뇨병의 정보를 제공하기 위해, 환자의 시료로부터 얻은 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 단백질의 레벨을 측정하는 방법을 제공한다.
상기에서 단백질의 상대적인 레벨이 측정되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 FABP4, S100A8, SORBS1 또는 C1QA 단백질은 정상군의 단백질보다 레벨이 높으면 제2형 당뇨로 진단된다.
상기에서 PLIN4 및 ACADL 단백질은 정상군의 단백질보라 레벨이 낮으면 제2형 당뇨로 진단된다.
본 발명의 내장지방조직에서 초기 제2형 당뇨병과 관련된 단백질 마커를 이용하여 제2형 당뇨병의 조기진단을 위한 바이오마커, 진단키트로서 유용하게 사용될 수 있으며, 또한, 치료제 발굴을 위한 스크리닝 표적으로 사용될 수 있다. 이러한 개발에 의하여 나아가 심혈관계 합병증 및 미세혈관합병증 등의 만성 대사 합병증을 예방하는 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 VAT 단백질체에 대한 마스터 AMT DB를 나타내는 도식이다. 도 A는 AMT DB 구축의 전체 순서도이다. LC-MS/MS 분석으로부터 총 59개의 데이터 세트를 만들었다. 59개 데이터 세트 각각을 iPE-MMR에 의해 처리한 후, SEQUEST 검색을 수행하였다. 데이터 세트에 대해 표적-데코이(TD) 분석을 수행한 다음, 이 둘로부터 얻어진 펩티드(또는 확인된 UMC)를 이용하여 AMT DB를 구축하였다. 도 B는 펩티드 I.D.를 미확인 UMC로 할당하기 위한 AMT DB의 활용. AMT DB에 있는 25,418개의 AMT(주홍색 점들)를 2차원(NET와 분자량) 산포도(좌측)에서 가시화하였다. LC-MS/MS 데이터 세트에 대해, 확인된 UMC(청색 점들)를 우측상단의 산포도에 나타내었다. 이 데이터 세트에 있는 미확인 UMC를 소정의 질량과 NET 허용 오차를 이용하여 AMT와 매칭함으로써, 본 저자들은 이들과 매칭된 AMT의 펩티드 I.D와 함께 미확인 UMC의 서브 세트를 할당하였다. 이들 매칭된 UMC는 우측하단 산포도에 나타내었다.
도 2는 59개의 LC-MS/MS 분석으로부터 VAT의 포괄적 단백질체에 관한 정보를 나타낸다. 도 A는 VAT 단백질체와 지방조직 또는 세포로부터 종래 측정한 단백질체의 비교를 보여준다. 각 연구에서 단백질의 수와 검출된 단백질을 코딩하는 유전자의 수가 나타나 있다. 도 B는 VAT 단백질체와 각 연구에서 검출된 단백질을 코딩하는 유전자를 토대로 종래 보고된 지방 단백질체의 관계를 보여주는 벤다이어그램이고, 도 C는 동정된 VAT 단백질이 주로 관여된 세포과정(GOBP)이다. 막대는 -log10(P)를 나타내는 것으로, P는 VAT 단백질에 의해 농축된 GOBP 각각의 유의성을 나타낸다. p값은 DAVID 소프트웨어에 의해 산출하였다. 도 D는 측정된 VAT 단백질이 주로 편재화되어 있는 Gene Ontology 세포 성분의 상대적 비율을 보여주는 그래프이다.
도3은 제2형 당뇨병-관련 VAT 단백질(DEP)에 의해 나타나는 세포과정을 기술하는 네트워크 모델을 나타낸다. 도 3A 및 B는 상향-조절된 단백질(A)과 하향-조절된(B) 단백질에 의해 나타나는 세포과정(GOBP)을 나타내는 것으로, 막대는 -log10(P)를 나타내고, P는 VAT 단백질에 의해 농축된 GOBP 각각의 유의성을 나타낸다. 도 3C 및 D는 상향-조절된(C) 단백질과 하향-조절된(D) 단백질에 의해 나타나는 GOBP를 기술하는 네트워크 모델을 나타낸다. 노드(node) 색깔은 정상 대조군에 비해 T2DM 시료에서 VAT 단백질의 발현양 증가(적색)와 감소(녹색)를 나타낸다. 컬러 막대는 log2-배수 변화의 구배를 표시한다. 에지(edge)는 5개의 상호작용체 데이터베이스로부터 수집한 단백질-단백질 상호작용(회색)과 KEGG 경로 데이터베이스로부터 얻은 대사반응(화살표)을 나타낸다.
도 4는 선택된 VAT 단백질의 입증에 관한 그래프이다. 도 4A 및 B는 T2DM 환자와 NGT가 있는 피험자로부터 얻은 VAT 시료의 독립 세트에서 분비된 VAT 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석의 결과이다. T2DM 환자의 VAT 시료에서 FABP4, C1QA, S100A8과 SORBS1의 상향-조절 및 ACADL과 PLIN4의 하향 조절을 확인하였다. 도 4C의 데이터는 Student’s t 검정법에 의해 평균±S.D. *p < 0.05, **p < 0.01로서 나타내었고, 부분 최소 제곱 판별 분석은 확인된 6개의 VAT 단백질이 T2DM과 NGT 시료 사이를 명확하게 분리할 수 있음을 보여준다. 녹색선은 T2DM과 NGT 시료 사이의 판단 함수를 의미한다. LV1과 LV2는 부분 최소 제곱 판별 분석에 의해 확인된 제1 및 제2 잠재 변수를 나타낸다. LV1-LV2 공간에서 각 시료의 좌표는 LV1과 LV2에 6개의 VAT 단백질의 양을 투영하여 산출하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 제2형 당뇨병 환자의 조기 진단을 위한 바이오마커를 확인하기 위하여 내장 지방 세포의 단백질을 프로파일링하였다.
구체적으로, 본 발명은 (i) 용해물로부터 응혈과 지질층이 제거된 전체 VAT의 포괄적인 단백질체 프로파일링, 마스터 AMT DB의 생성과 초고압 나노-LC-MS/MS 분석; (ii) T2DM과 NGT가 있는 피험자로부터 수집한 VAT에서 DEP의 동정; (iii) VAT의 T2DM-관련 네트워크 모델과 VAT로부터 분비된 단백질체의 기능을 통합하여 VAT의 T2DM-관련 병리생리학을 나타낼 수 있는 단백질 프로파일의 선택; 및 (iv) 웨스턴 블롯팅을 이용한 독립적인 T2DM에서 선택된 단백질체 프로파일의 입증과 부분 최소 제곱 판별 분석에 의해 NGT 대조군으로부터 T2DM 시료를 식별할 수 있는 입증된 단백질체 프로파일의 확인;을 포함하는 기법을 개발하였다. 이와 같은 방법을 통해, 본 발명자들은 6개의 VAT 단백질(3개는 상향-조절된 염증-관련 단백질(S100A8, C1QA와 SORBS1)이고, 1개는 하향-조절된 대사-관련 단백질(ACADL)이고, 2개는 아디포킨(FABP4와 PLIN4))로 구성된 단백질 프로파일을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 제2형 당뇨병의 조기 진단용 마커 또는 이것의 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 “FABP4”는 지방세포와 대식세포에 주로 발현하며1 지방산의 이동, 대사 및 저장을 조절하는 역할을 하며 더 높은 혈청 FABP4 농도는 비만, 인슐린 저항성과 T2DM과 연관되었다. 또한 FABP4는 MAPK 의존적 경로를 통해 혈관 평활근 세포의 증식 및 이동을 유도하여 혈관 리모델링에 중요한 역할을 함으로써 동맥경화성 병변을 진행시키는 것으로도 알려져 있다.
본 발명에서 상기 “S100A8/9”는 S100A8 (calgranulin A or migration inhibitory factor-related protein 8; MRP-8)과 결합되는 S100A9 (calgranulin B, or MRP-14)으로 S100 calcium-binding family에 속한다. S100A8/A9는 heterocomplex로서 calprotectin으로 부르며, 항염증 반응 및 면역 조절 작용을 보이는 것으로 알려져 있다. 소변과 혈장 모두에서 S100A8/9(칼프로텍틴)의 양은 악성도가 낮은 만성 염증과 인슐린 저항성과 관련이 있었고 S100A8의 mRNA 수준은 비만 마우스의 지방세포 분획물에서 상승하였다.
본 발명에서 상기 “SORBS1”은 SORBS1(CAP)은 3T3-L1 지방세포에서 인슐린에 의한 포도당 수송의 자극을 차단하고, SORBS1의 T228A 다형성은 비만과 당뇨병 모두에 연관되었다.
S100A8/9의 mRNA 수준은 마우스 지방세포 분획물에서 상승하였음을 명심해야 한다. 이들 데이터는 6-단백질 패널의 다음과 같은 2가지 양상을 암시한다: (i) 다른 계에서 이들 단백질의 mRNA 또는 단백질 수준의 변화는 T2DM VAT의 병리생리학을 나타낼 수 있는 단백질 프로파일로서 6개의 단백질의 유효성을 시사하고; (ii) 이들 단백질의 단백질 수준에서 어떠한 변화도 인간 지방조직 또는 VAT에서 종래 제시된 바 없다는 사실은 6-단백질 패널의 신규함을 시사하는 것이다.
본 발명에서 상기 “C1QA”는 아디포넥틴과 C1q 단백질 복합체로서, 정상인에서 혈청 아디포넥틴의 농도는 4-30 μg/mL 인데 반해 내장 지방이 많은 사람에서는 낮은 농도로 측정된다. 이전 임상 연구에서 아디포넥틴이 동맥경화진행 혹은 당뇨병 진행의 억제하며 낮은 아디포넥틴의 농도는 대사 증후군 및 동맥경화성 심혈관 질환의 위험을 높이는 것으로 보고된 바 있다. 보체 C1q는 아디포넥틴과 시퀀스 (sequence)의 유사성이 있어 보체 C1q 수용체를 통해 아디포넥틴의 식세포작용 (phagocytosis)가 억제된다고 알려져 있다. 혈청 C1q-아디포넥틴 복합체의 양은 일본 T2DM 피험자들에게서 관상동맥 질환과의 상당한 상관관계를 보였다.
본 발명에서 “PLIN1/4”는 PLIN1 는 지방세포에 주로 발현하는 지방 소립 외피 단백질 (lipid droplet coat protein)을 합성하는 유전자로 이 유전자의 불활성화 돌연변이 (loss-of-function mutation)가 일어날 경우 최근 보고된 가족성 부분 지방이영양증 (familial partial lipodystrophy)의 아형을 일으키는 것으로 알려졌다. PLIN4 유전자의 11482G→A 다형성은 비만과 대사 증후군의 위험 증가와 관련이 있었다. 그러나 이들 단백질 중 어느 것도 정상 대조군에 비해 초기 T2DM의 인간 지방조직 또는 VAT에서 이들의 단백질 수준이 변한다고 종래 보고된 바 없다.
본 발명에서 “ACADL”은 ACADL 녹아웃(knockout) 마우스는 근육과 간 모두에서 트리글리세리드 저장이 증가하였고 중증의 간 인슐린 저항성을 보였다. PLIN4 유전자의 11482G→A 다형성은 비만과 대사 증후군의 위험 증가와 관련이 있었다. 그러나 이들 단백질 중 어느 것도 정상 대조군에 비해 초기 T2DM의 인간 지방조직 또는 VAT에서 이들의 단백질 수준이 변한다고 종래 보고된 바 없다
종래 Xie 등과 Adachi 등은 각각 건강한 개체와 마우스 3T3-L1 지방세포의 복부 SAT의 단백질체를 제공하였다. 이들 데이터 세트가 지방-관련 질환의 다양한 연구를 위한 유용한 자원으로서 역할을 하였지만, 어느 연구도 상기 단백질체를 T2DM에서의 단백질체와 비교하고 있지 않아 정상 대조군에 비해 T2DM에서의 DEP의 리스트를 제공하고 있지 않다. 이들 연구 중 어느 하나에서 상기 6개의 단백질 중 4개의 단백질이 검출되었지만, T2DM에서 이들의 발현양 변화는 밝혀지지 않았다. 또한 몇몇 연구는 근육, 타액, 혈청과 췌장 섬(islet) 조직에서 상대적 단백질체 분석을 포함하여 대조군에 비해 T2DM 환자 또는 마우스로부터 채취된 이들 조직 중 단백질체와 DEP의 리스트를 제공하였다. 상기 6개의 단백질 중에서 3개의 단백질(S100A8, C1QA와 FABP4)은 이들 조직 중 하나에서 검출되었지만, C1QA만이 T2DM 혈청 중 그의 단백질 발현양 변화를 보였다. 그렇더라도, 본 연구에서 선택된 6개의 단백질 중 어느 것도 초기 T2DM에서 인간 지방조직 또는 VAT 중 단백질 수준이 변화된다고 종래에 보고되지 않았다.
전체적으로 볼 때, 본 연구는 다른 계에서 T2DM 발병과 이미 연관된 6개의 선택된 단백질이 초기 T2DM 환자의 VAT에서 차등 발현한다는 것을 최초로 밝힘으로써 T2DM의 초기 발병의 지표로서 상기 단백질의 잠재적인 용도를 뒷받침한다. 상기 6개의 선택된 단백질의 임상적 의의는 더 많은 초기 T2DM 환자수를 이용하여 추가 시험할 수 있다. 또한 T2DM 발병의 진행 중에 제시된 단백질 프로파일의 동적 변화의 속성을 더욱 입증하기 위한 장기적인 연구를 설계할 수도 있다. 또한 초기 미투약 T2DM 환자의 신규한 하위 유형(subtype)은 지방조직의 염증의 크기와 제시된 단백질 프로파일에 의해 나타나는 VAT에서의 대사 변화를 토대로 더욱 특성화될 수 있다.
상기 6개의 선택된 VAT 단백질은 T2DM 환자 중 90%를 NGT가 있는 피험자로부터 정확하게 식별하였는바, 이는 T2DM의 병리생리학적 상태를 이해하는데 있어 선택된 단백질체 프로파일의 잠재적인 용도를 시사한다(도 4C). 하나의 T2DM 시료가 NGT로 분류되었다. 본 저자들은 이 환자의 임상적인 특성을 면밀히 조사하고 다른 T2DM 환자의 임상적 특성과 비교하였다. 이 영외 환자의 당뇨병 기간, 당뇨병 상태와 관리는 다른 T2DM 환자들과 유사하였다. 그러나 이 환자는 본 저자들의 시험 세트에서 가장 나이가 많은 남성이었고 4년 넘게 항고혈압약을 복용하였다. 환자 나이 75세(시험 세트의 평균 연령 66.8세), 생존자 편차(survivor deviation)와 고혈압 병력은 이 환자와 다른 T2DM환자 사이의 차이를 유도하였고/또는 항고혈압약 투약은 이 환자에게서 6개의 선택된 DEP의 프로파일을 NGT 피험자의 프로파일과 유사하게 만들 수 있었다. 그러나 더욱 상세한 기능 연구를 실시하여 이 환자와 NGT 피험자 간 6개의 선택된 DEP의 프로파일 유사성에 바탕이 되는 메커니즘을 명확하게 밝혀야 한다.
본 연구에서 선택된 6개의 단백질 이외에, 본 발명자들의 기법은 초기 T2DM 발병에 있어서 VAT에서 DEP 또는 분비 단백질의 포괄적인 리스트를 제공하여 종래의 소규모 실험 또는 기법에 의해 확인된 현재의 리스트를 폭넓게 확장하였다. 이 단백질 리스트는 DEP와 분비 단백질을 토대로 각각 지방조직 및 VAT를 구성하는 세포간 상호관계를 연구하는 생물학자를 위한 포괄적인 자원으로서 역할을 할 수 있다. 더 나아가, 상기 네트워크 모델은 지방조직의 염증(도 3C)과 T2DM의 초기 발병 중에 VAT에서 대사 변조(도 3D)를 이해하기 위한 근거를 제공할 수 있다. 상기 네트워크 모델은 또한 지방산 산화, 인슐린 신호전달, 지방조직 염증과 DEP 관련 PPARγ 경로가 T2DM에서 VAT의 초기 병리생리학 변화에 관여되어야 함을 시사하였다. 이러한 이해는 또한 T2DM의 초기 발병 중에 항당뇨병 치료를 수반하는 적극적인 치료 선택권을 제시할 수 있다. 요약하면, 본 저자들의 기법은 T2DM의 분류, 치료 및 발병에 대해 T2DM을 나타내는 신규한 차원의 정보를 제공할 수 있는 단백질 프로파일을 성공적으로 확인하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “제2형 당뇨병”은 인슐린 비의존성 당뇨병을 의미하는 것으로서, 인슐린의 기능이 떨어져 혈당이 높아지는 경우를 의미하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “단백질 프로파일”이란 단백질을 분리 동정하고 그 구조나 기능을 해석하여 그 특징을 기록하는 작업을 의미하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “시료”는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 양태로서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4 또는 ACADL 단백질의 발현 또는 활성을 억제/증진하는 다양한 조절물질들이 치료제로서 사용될 수 있다. 여기에서 발현은 mRNA로의 전사 및 단백질로의 번역 수준에서의 억제/조절을 포함하는 것이며, 활성의 억제는 생성된 단백질의 정상적인 기능의 감소, 억제, 방해, 그리고 활성의 증진은 생성된 단백질의 정상적인 기능의 증가 또는 향상을 의미하는 것이다. 상기 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, ACADL 단백질의 발현 또는 활성을 억제/증진하는 다양한 조절물질로는 저분자 화합물, 항체, 안티센스올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 및 폴리펩타이드를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "치료" 란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.
본원은 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 단백질의 발현 또는 활성을 억제/증진과 관련된 것으로, 이러한 기능을 갖는 공지의 다양한 물질의 본원에 포함된다. 본원에서 억제제는 상기 단백질 또는 이의 mRNA를 포함하는 핵산과 결합 또는 상호작용하여 이들 단백질의 발현 (전사 및 번역) 및/또는 활성을 억제/조절할 수 있는 물질이다. 이러한 물질은 예를 들면 저분자 화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 및 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자 또는 이들의 임의의 조합을 모두 포함하는 것이다. 본원에서 발현이란 유전자의 전사 및 전사체의 단백질로의 발현을 의미하며, 활성이란 발현된 단백질이 세포내에서 제 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.
본원에서 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 조절제란 예를 들면 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 에 결합하거나 또는 이와 상호작용하여 이의 적어도 한가지의 생물학적 특징 및/또는 활성을 변경하는 물질을 의미한다.
본원의 일 구현예에서, 억제제 또는 조절제는 이를 코딩하는 유전자의 전사 및/또는 전사체의 단백질 합성을 특이적으로 조절할 수 있는 안티센스 올리고뉴큐클레오타이드, siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA)이다. siRNA, shRNA 및 miRNA는 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC(RNA Induced
Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록 (silencing) 한다. 이러한 단백질 발현의 억제에 의해 상기 단백질에 의해 영향을 받는 다른 단백질의 발현이 증가할 수 있다. 예를 들면 특정 단백질의 발현을 억제하는 내인성 간섭 RNA에 결합하는 RNA는 상기 단백질의 발현을 상향 조절 할 수 있다. 이러한 siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들면 표적 단백질의 임의의 코딩서열에 결합하여, 표적 단백질의 발현을 억제/감소시키는 짧은 합성 핵산이다. 안티센스 RNA는 표적 유전자 및 전달 방법에 따라 적절한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들면 약 6, 8 또는 10 내지 40, 60 또는 100 뉴클레오타이드이다.
본원의 다른 일 구현예에서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 조절제는 이를 특이적으로 인식할 수 있는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편을 포함하는 것이다.
본원의 다른 구현예에서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 조절제는 그 활성 및/또는 작용/기전을 조절, 간섭, 방해 및/또는 억제할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 천연 또는 합성의 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니며, 펩타이드, 올리고펩타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 정상적 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 과 경쟁하여 이의 작용을 방해하는 역할을 하는 경쟁적 억제자로서 기능할 수 있다. 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.
본원의 치료제는 상기 언급한 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 의 억제제/조절제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원의 치료제는 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형,
환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
본 발명에서는 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 단백질이 제2형 당뇨병이 발생한 대조군과 비교하여 차별적으로 발현된다. 따라서, 본 발명의 다른 양태로서 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커 또는 이들 각각을 코딩하는 핵산의 검출시약을 포함하는, 검체의 제2형 당뇨병의 조기 진단용 키트에 관한 것이다.
본원의 제2형 당뇨병 진단용 마커의 검출은 정량적 검출을 포함하는 것으로, 본 질환의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 본 질환의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 마커 단백질은 제2형 당뇨병 치료용 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 제2형 당뇨병 진단에 필요한 정보 제공 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에서 용어 "진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 제2형 당뇨병 질환이 발생한 조직 또는 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 단백질 및 그 핵산 서열은 공지된 것이며, 또한 앞서 언급한 바와 같으나, 이로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.
본원에서 용어 검출시약은 본원의 마커를 단백질 또는 핵산 예를 들면 mRNA 수준에서 정량적으로 또는 존재여부의 판단을 위해 검출할 수 있는 물질이다. 단백질의 양, 존재여부 발현패턴의 분석을 위한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테를로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다. 단백질 또는 핵산 수준검출을 위한 시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다.
즉 본원에 따른 키트는 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 마커를 단백질 또는 핵산 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다. 단백질은 또한 질량분광분석기를 이용하여 검출될 수 있다.
RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR RNase 보호 분석법, 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프라이머를 포함한다. 프라이머는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다.
본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 형광물질과 같은 발색물질과 컨쥬게이션 된 것일 수 있다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 이용될 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.
본원의 다른 구현예에 따르면 검출시약은 RNA 분석용 시약으로, 본원의 바이오마커 검출은 mRNA 수준에서 실시된다. mRNA 검출은 통상 노던블랏이나 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)을 통해 수행된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성 한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle,R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6)에 기재되어 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 검체로부터 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 마커 중 하나 이상의 마커의 양을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 양을 검사 대상자의 제2형 당뇨병의 조기 진단에 연관시키는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨병의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검사 대상자의 검체로부터 상기 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 ex vivo에서 수행되며, 검체는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장에서 유래된 것을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 제2형 당뇨병의 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 마커의 검출 결과를 제2형 당뇨병의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 단백질 양을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커의 검출결과와 비교, 예를 들면 그 증감을 비교한 후, 이를 근거로 진단하는 것이다. 예를 들면 대조군의 값과 비교하여 예를 들면 FABP4, S100A8, SORBS1, 또는 C1QA 이 유의하게 증가된 경우, 대상체에서 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다. 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상체의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상체의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다. 임계값 설정은 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
또다른 양태로서, 본 발명은 제2형 당뇨병에서 차별적으로 발현되는 단백질 마커에 근거한 것으로서, FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 마커를 표적으로 하는 제2형 당뇨병 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 단백질을 제공하는 단계; 상기 단백질을 시험물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 FABP4, S100A8, SORBS1, C1QA, PLIN4, 또는 ACADL 단백질의 발현을 비교하는 단계를 포함한다.
또한, 이런 치료제를 스크리닝 하는 방법으로서, 본원의 마커를 친화성 칼럼에 고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법 [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투-하이브리드 방법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245-246, 1989], 웨스턴블랏 ("MolecularCloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al.(1982) section18.30-18.74], 대용량스크리닝 방법 [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시양태에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험물질을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 합성화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명의 범주가 이로 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 시료 채취
본 저자들은 서울국립대학 분당병원(SNUBH)에서 선택적 복강 수술을 한 T2DM과 건강한 피험자로부터 전체 VAT를 2개 독립 세트로 채취하였다. 5명의 T2DM 환자와 6명의 건강한 피험자의 첫 번째 세트를 단백질체 프로파일링을 위해 이용하였다. 본 저자들은 미국 당뇨병 협회 기준에 의거하여 지난 5년 내 당뇨병이 진단되고 항당뇨병약을 복용하지 않으면서(미투약) 생활방식만을 바꾼 T2DM 환자를 등록하였다. 이들은 정상 체질량 지수값(<25 kg/m2)을 나타내었고 주요 심혈관 부작용, 급성 염증질환 또는 암의 과거 병력이 없었다. 본 저자들은 헤모글로빈 A1c > 8%를 보이는 통제할 수 없는 미투약 당뇨병 피험자는 제외하였다. 동일한 미국 당뇨병 협회 기준에 의거하여 NGT을 가진 대조군을 등록하였다. 이들은 또한 75-g 구강 내당능 시험에 의해 확인하였고 연령과 성별에 따라 조정하였다. 선택된 단백질의 유효성을 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하기 위해서 본 저자들은 10명의 T2DM 환자와 SNUBH에서 선택적 담낭절제술과 흉부수술을 한 NGT가 있는 10명의 개체를 포함한 두 번째 시험 세트를 구성하였다. 모든 피험자들로부터 사전 동의를 얻었다. 본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행하였고 SNUBH의 윤리위원회에 의해 승인되었다(SNUBH IRB#B-1203/147-006, #A111218-CP02). 단백질체 프로파일링과 후보 단백질 확인을 위해 모든 등록 환자의 임상적 특성을 다음 표 1에 기재하였다.
[표 1]
Figure 112015000443360-pat00001

실시예 2: 균질화와 단백질 추출
수술로부터 얻은 지방 시료를 본 저자들의 실험실로 즉시 보내 인산 완충 생리식염수(PBS) 용액에서 3번 세척하여 응혈을 제거하고 -80℃ 냉장고에 보관하였다. 외과의는 가능한 한 동일한 영역으로부터 VAT를 채취하고자 하였고 이들 시료는 대부분 횡행 결장에 가까이에 있는 대망 지방이었다. 다음 단계를 위해 동결한 VAT를 얼음에서 서서히 해동한 다음, 얼음-저온의 PBS에서 매우 조심스럽고 부드럽게 세척하여 혈액이 과도하게 오염되지 않도록 하였다. 지방조직을 가위로 잘게 썰고, 시험관에 모은 후, 미니 비드가 들어있는 FastPrep 튜브로 옮겨 조각난 조직들이 없어질 때까지 0.1 M Tris-HCl(pH 7.6)에서 FastPrep 비터(Bio101Savant, Carlsbad, CA)에 의해 균질화하였다. 이 용해물을 새로운 튜브로 옮겨 15분간 4℃에서 14,000g으로 원심분리하였고, 상부의 지질 부분을 제외한 나머지(부유 성숙 지방세포와 기질 혈관 분획 세포 펠렛)를 조심스럽게 회수하였다. 지질층은 단백질 가용화와 지질로부터 단백질의 후속 분리를 방해하기 때문에 지질층 제거는 매우 중요하다. 용해물을 새로운 튜브로 옮기고 BCA 단백질 분석법(Pierce, Rockford, IL)과 상기 분석법을 위한 표준 단백질로서 우혈청 알부민(Pierce)을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 풍부한 단백질의 고갈은 시도하지 않았다.
실시예 3: 효소 분해
단백질 추출을 개선하기 위해 몇몇 단계를 약간 변형시킨 필터-기반 시료 준비법을 통해 펩티드 시료를 준비하였다. 간단히, 100 μg의 단백질 용해물을 37℃에서 45분 동안 100 μl의 SDT(0.1 M Tris-HCl 중 4% SDS와 0.1 M DTT, pH 7.6)에서 환원시킨 다음, 10분 동안 끓여 변성을 증가시켰다. 100 μl의 SDT 중 단백질 용해물을 Microcon 필터(YM-30, Millipore Corporation, Bedford, MA)에서 200 μl의 8 M 요소와 혼합한 후, 상기 필터를 20℃에서 60분 동안 14,000g으로 원심분리하였다. 모든 원심분리 단계는 20℃에서 수행하였다. 잔류 SDS를 제거하기 위해서 필터를 14,000g(×2)에서 원심분리하기 전에 0.1 M Tris-HCl(pH 8.5) 중 200 μl의 8M 요소를 필터에 첨가하였다(2). 이어서, 상기 농축액에 0.1 M Tris-HCl에 있는 8 M 요소 중 100 μl의 50 mM 요오도아세트아미드를 빛이 없는 상태에서 25분 동안 25℃에서 알킬화 반응을 위해 첨가한 후, 30분 동안 14,000g에서 원심분리하여 알킬화 시약을 제거하였다. 얻어진 시료를 다시 0.1 M Tris-HCl 중 200 μl의 8 M 요소로 헹구었다. 마지막으로, 100 μl의 50 mM NH4HCO3을 첨가하고 14,000g에서 40분 동안 원심분리하여 요소 완충액을 바꿔주었다. 단백질 시료를 50 mM NH4HCO3 중 트립신(1:50 효소-대-단백질 비율(w/w), Promega, Madison, WI)과 0.1%(w/v) RapiGest(Waters, Milford, MA)(28, 31)을 이용하여 단백질 분해 처리하는데, 초기에는 1분 동안 37℃의 열혼합기(Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 600 rpm으로 혼합하고 밤새 교반하지 않은 상태에서 분해하였다. 첫 번째 분해 후에 두 번째 트립신 분해(1:100 효소-대-단백질 비율)를 6시간 동안 실시하였다. 분해된 펩티드를 14,000g으로 30분 동안 원심분리를 통해 필터로부터 용출하였고, 60 μl의 50 mM NH4HCO3으로 헹구고 14,000g으로 20분 동안 원심분리하였고, 통과액을 첫 번째 용출액과 혼합하였다. 상기 용출액을 5 μl의 포름산으로 처리하고, 37℃에서 45분 동안 배양한 다음, 14,000g으로 10분 동안 원심분리하여 RapiGest 시약을 제거하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 SpeedVac 원심분리기(Thermo, San Jose, CA)를 이용하여 완전 건조시켰다. 건조된 펩티드를 -80℃에 저장하였다.
실시예 4: 펩티드의 등전점 전기영동법
10개의 지방 펩티드 시료(5개의 NGT 시료와 5개의 T2DM 시료) 각각 10 μg을 채취한 다음, 합쳤다(총 = 100 μg). 합친 시료를 3100 OFFGEL 분획기(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 26개의 분획물로 나누었다. 간단히, 24-웰 트레이의 각 웰에 25 μl의 재수화 용액을 첨가하여 24 cm 길이의 고정된 pH 구배 겔 스트립(pH 3.10, GE Healthcare Life Sciences)을 15분 동안 재수화하였다. 100 μg의 합친 펩티드를 0.72 ml의 증류수에 용해시켰다. 이 펩티드 용액을 2.88 ml의 OFFGEL 모액과 혼합하고 총 3.6 ml 중 150 μl를 24 웰 각각에 로딩하였다. 이 펩티드 시료를 최대 전류 50 μA으로 20℃에서 포커싱하였고, 50 kVh에 도달하기까지 전압 범위는 500 내지 8,000 V이었다. 포커싱 후, 펩티드를 24웰로부터 회수하였다. 또한 본 저자들은 애노드 단부(pI 값이 3미만인 펩티드로 이루어짐)와 캐소드 단부(pI 값이 10을 초과하는 펩티드로 이루어짐)로부터 펩티드를 채취하였다. 이에 따라, 총 26개의 분획물을 제조하였다. 분획된 펩티드 각각을 진공-건조하기 전에 스핀 칼럼(Harvard Apparatus, Holliston, MA)에서 탈염하여 글리세롤을 제거하였다. 건조된 펩티드를 -80℃에 보관하였다.
실시예 5: LC - MS / MS 실험
nanoACQUITY UPLC(NanoA, Waters, Milford, MA) 장치의 변형 형태를 이용하여 정상, 당뇨병 및 합친 시료의 OFFGEL 분획물로부터 총 59개의 LC-MS/MS 데이터 세트를 분리하였다(33). C18 물질(3 μm 직경, 300 Å 기공 크기; Jupiter, Phenomenex, Torrance, CA)로 용융-실리카 모세관(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)을 아세토니트릴 슬러리 패킹하여 분석 칼럼(75 μm 내경 × 360 μm 외경 × 70 cm 길이)을 실험실에서 제작하였다. 동일한 C18 물질을 내부 환원제(internal reducer)(1/16 인치 내지 1/32 인치, VICI, Houston, TX)의 1 cm 길이의 라이너(250 μm 내경)에 패킹하여 고상 추출칼럼을 준비하였다. 반-강체의 가스관 히터(1/4 인치 내경, 60 cm 길이, WATLOW, St. Louis, MO.)를 이용하여 칼럼 온도를 50℃로 설정하였다(34). 26개 OFFGEL 분획 시료에 대해 LC 분리 구배는 5분 동안 98% 용매 A(H2O 중 0.1% 포름산), 115분 안에 2% 내지 50% 용매 B(99.9% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산), 10분 안에 50% 내지 80% 용매 B와 10분 안에 80% 용매 B이었다. 미분획 개별 시료에 대한 3번의 반복 LC-MS/MS 실험의 경우에 LC 구배는 5분 동안 98% 용매 A(H2O 중 0.1% 포름산), 235분 안에 2% 내지 50% 용매 B(99.9% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산), 10분 안에 50% 내지 80% 용매 B와 10분 안에 80% 용매 B이었다. 이동상의 유속은 400 nl/min로 설정하였다. 7-테슬라 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석계(LTQ-FT, Thermo Electron, San Jose, CA)를 이용하여 질량 스펙트럼을 수집하였다. LC로부터 용출된 펩티드를 전기분무 전위 2.0 kV에서 이온화하였다. 전기분무 이온화 이미터는 용융-실리카 모세관 이미터(20 μm 내경 × 150 μm 외경)를 화학적 에칭하여 제작하였다. 탈용매화 모세관의 온도는 250℃로 설정하였다. 자동 이득 제어 표적치 1 × 106, 질량 분해능 1 × 105와 최대 이온 축적 시간 500 ms인 전체-프로파일(full-profile) 모드에서 MS 전구 이온(precursor ion) 스캔(m/z 500-2,000)을 취득하였다. 질량 분석기는 데이터-의존 직렬 MS 모드로 작동시켰고; 프리커서 MS 스캔에서 검출된 가장 풍부한 7개의 이온을 동적 배제 옵션을 포함한 MS/MS 실험에 대해 동적으로 선택하여(배제 질량 폭 하한, 1.10 Th; 배제 질량 폭 상한, 2.10 Th; 배제 리스트 크기, 120; 배제 시간, 30초) 동일한 펩티드의 MS/MS 스펙트럼이 다시 얻어지지 않도록 하였다. 35%와 3 Th로 각각 설정된 충돌 에너지와 분리 폭을 가진 이온 트랩(LTQ)에서 전구 이온의 충돌-유기 해리를 수행하였다. Xcalibur 소프트웨어 패키지(v. 2.0 SR2, Thermo Electron)를 이용하여 실험방법을 구성하였다.
실시예 6: 펩티드 동정을 위한 데이터베이스 검색
통합 실험후 단동위 질량 분석(iPE-MMR)법을 이용하여 LC-MS/MS 데이터를 처리하였고 후속 단백질 데이터베이스 검색 전에 프리커서 질량을 직렬 질량 분석 데이터에 정확하게 할당하기 위해 미리 시연하였다. 간단히, DeconMSn을 이용하여 프리커서 질량이 PE-MMR을 통해 더욱 보정(corrected) 및 개량된(refined) MS/MS 데이터(DTA 파일)를 만들었다. 얻어진 질량-개량된 DTA 파일을 DtaRefinery를 이용하여 다변량 질량 오류 보정 처리하였다. iPE-MMR 과정 후 얻어진 MS/MS 데이터를 인간 데이터(IPI v. 3.86, 91,550 엔트리)와 그의 역 보체(reversed complement)를 포함한 복합 표적-데코이(decoy) 데이터베이스에 대해 SORCERERTM-SEQUEST(v. 3.5) 검색 알고리즘(Sage-N Research, Milpitas, CA)을 이용하여 검색하였다. 반-트립신 분해 펩티드를 허용하는 검색을 수행하고 미절단(missed cleavage)의 최대 허용 가능한 수는 3이었다. 질량 허용오차는 전구 이온에 대해서는 10 ppm이었고 단편 이온에 대해서는 1 Da이었다. 시스테인(57.021460 Da)의 카르바미도메틸화를 정적 수정(static modification)으로서 이용하였다. 가변 수정 옵션은 메티오닌(15.994920 Da)의 산화와 N-말단 부위(43.005810 Da)의 카르밤화를 위해 이용하였다. 추정 오류 발견율(FDR)을 이용하여 검색 결과를 필터링하였다. 펩티드 할당의 FDR은 복합 표적-데코이 데이터베이스 검색을 통해 추정하였다. 1% FDR에 대한 Xcorr의 값과 ΔCn 임계값을 이용하여 펩티드 I.D.를 얻었다.
실시예 7: 펩티드 동정에 MS 세기 할당
MS 세기-기반 무-표지 정량화 방법을 이미 기재된 대로 지방조직 LC-MS/MS 데이터(33 LC-MS/MS 데이터)에 적용하였다. 간단히, PE-MMR 분석 중에 LC-MS/MS 실험에서 LC 용출기간에 걸쳐 나타난 펩티드의 MS 특징을 고유 질량 등급(UMC)으로 나누었다(38). 각각의 UMC는 전하 상태, 발현양(세기), 스캔수와 측정된 단동위 질량과 같은 펩티드의 모든 질량 스펙트럼 특징을 포함하였다. 이상적으로, 펩티드는 UMC에 의해 표시된다. UMC 각각에 대해, UMC 질량은 모든 UMC 성분의 단동위 질량의 세기-가중 평균으로서 계산하고, UMC의 모든 질량 스펙트럼 성분의 발현양(abundance) 합계(UMC 세기)를 계산하여 실험 펩티드 발현양을 나타내었다. PE-MMR 분석 중에, UMC질량과 매칭시키기 위해 MS/MS 스펙트럼의 전구(precursor) 질량(또는 DTA 파일)을 검색하고 매칭이 발견될 때 UMC 질량으로 대체하였다. 이 과정에서, DTA 정보를 매칭된 UMC에 연관시켰다. 연관된 DTA 파일에 의해 SEQUEST 검색과 표적-데코이 분석 후 위양성율(false positive rate)이 1%인 펩티드 서열이 나타났을 때, 펩티드 I.D를 UMC에 기록하고 UMC 세기를 펩티드 I.D에 할당하였다. 본 연구에서, 서로 다른 LC/MS 실험을 통해 동일한 펩티드의 LC 용출시간 분산을 최소화하기 위해 표준화된 용출시간(NET) 예측을 이용하여 확인된 UMC의 NET를 계산하였다.
실시예 8: VAT 마스터( Master ) 정확한 질량 및 시간 태그 데이터베이스의 구축
59개의 LC-MS/MS 데이터(11개 시료의 3번 반복 LC-MS/MS 실험과 OFFGEL 분획화의 26개 LC-MS/MS 실험)으로부터 펩티드 I.D를 가진 UMC에 대한 정보를 마스터 정확한 질량 및 시간 태그(AMT) 데이터베이스(DB)로 컴파일링하였다(Oracle Database 10g Enterprise Edition, Release 10.2.0.1.0; 도 1A).
이는 단동위 질량과 NGT가 실험적으로 결정되는 특정 펩티드 서열인 AMT를 모은 것이다. 펩티드를 여러 번 측정하였을 때, AMT 각각에 대해 평균 질량과 중간 NET를 기록하였다.
현재 단백질체 분석 플랫폼의 과소표집에 의해, LC-MS/MS 실험으로부터 대부분의 UMC는 MS/MS 실험과 단백질 데이터베이스 검색에서 확인되지 않았다. 예를 들면, 개개의 LC-MS/MS 데이터 세트로부터 87,937개의 UMC가 MS 스펙트럼에서 측정되었고 이들 중 4,618개(약 5.3%)가 단백질 데이터베이스 검색에 의해 확인되었다(확인된 UMC; 그림 1B, 우측상단). MS 스캔에서 검출되었지만 MS/MS 분석 기회가 없는 펩티드 이온 또는 분획화를 거쳤지만 질이 낮은 이온이 이러한 미확인 UMC의 주요 원인이다. 펩티드 I.D를 미확인 UMC에 할당하기 위해서 이들을 질량과 NET 허용 오차 내에서 마스터 AMT DB에 매칭시켰다(즉, 각각 ±10 ppm, ±0.025 NET; 그림 1B, 우측하단). 펩티드 I.D를 미확인 UMC에 할당하는 이러한 과정의 결과로 마스터 AMT DB 정보에 의해 확인된 6,182개의 추가 UMC가 나타나 펩티드 I.D가 할당된 UMC의 전체 수는 10,800(할당 UMC)가 된다.
실시예 9: 동정된 펩티드 할당
미확인 UMC를 마스터 AMT DB로부터의 정보와 함께 할당한 후, 33개 LC-MS/MS 데이터 세트(즉, 11개의 개별 VAT 펩티드 시료의 3번 반복된 LC-MS/MS 데이터 세트)로부터 얻어진 할당 UMC를 각각의 열이 각각의 LC-MS/MS 실험으로부터 해당 UMC 합계 세기를 가진 펩티드 I.D를 포함한 할당 표에 조합하였다. 할당된 데이터의 변위치 표준화를 수행하여 주입량 변화에 의해 펩티드 발현양 변화를 보정하고 3회 반복하여 중간 발현양을 얻었다. 데이터 재현성을 평가하기 위해, 이미 기재된 바대로 2개의 LC-MS/MS 실험의 유사성 점수를 검출된 펩티드와 이들의 세기 값의 오버랩을 토대로 측정하였다. 정량화한 펩티드를 2분(bipartite) 그래프 분석에 의해 단백질 추론(protein inference)까지 올렸다(rolled up). 2분 그래프 분석 후에 단백질 그룹 각각의 대표 단백질을 최대 수의 특정 펩티드가 단일 단백질로 사상된(mapped) 단백질로서 설정하였다. 하나의 그룹 내 2개 이상의 단백질이 동일한 수의 특정 펩티드를 가진 경우에는 더 높은 서열 포함범위를 가진 단백질을 대표 단백질로서 간주하였다.
실시예 10: 차등 발현된 단백질 동정
22,250개의 정렬된 펩티드의 세기를 변위치 표준화 방법을 이용하여 표준화였다(43). 펩티드 세기로부터, 해당 단백질의 상대적 발현양을 Dost 등이 기재한 선형-프로그래밍 공식을 이용하여 산출하였다. 정량화된 단백질 중에서 본 저자들은 검출된 적어도 2개의 비-중복된 펩티드를 가진 단백질을 선택하였다. 차등 발현된 단백질(DEP)을 동정하기 위해서 log2 중간 비율(median ratio) 시험을 수행하여 모든 단백질에 대한 log2 중간 비율의 유의성을 산출하였다. 시료를 수백 번 무작위 치환(random permutation)을 수행한 다음, 가우시안 커널(kernel) 밀도 추정법을 무작위 치환에 기인한 log2 중간 비율에 적용하여 귀무가설(즉, 단백질이 차등 발현되지 않음)의 경험 분포를 추정하였다. 다음, Storey 방법을 이용하여 FDR을 산출하였다(49). DEP는 FDR이 ≤ 0.05인 것들로서 확인하였다(1.16보다 큰 절대 log2 배수 변화, 귀무분포의 0.25와 97.5번째 백분위수의 평균).
실시예 11: GO 생물학적 과정의 농축 분석과 네트워크 모델의 재구성
DAVID 소프트웨어를 이용하여 DEP의 기능적 농축 분석을 수행하였다. DEP에 의해 농축된 GO 생물학적 과정을 p가 < 0.05인 것들로서 확인하였다. 본 저자들은 DAVID에서 제공된 p 값을 이용하였다.
DEP용 네트워크 모델을 재구성하기 위해서 본 저자들은 먼저 DEP에 의해 농축된 GO 생물학적 과정 항(process term)에 속하는 DEP의 서브 세트를 선택하고 이들의 단백질-단백질 상호작용을 MetaCore™과 4개의 단백질-단백질 상호작용체 데이터베이스: BIND(Biomolecular Interaction Network Database), HPRD(Human Protein Reference Database)(52), BioGRID(Biological General Repository for Interaction Datasets)(53)과 MINT(Molecular INTeraction Database)로부터 수집하였다. 선택된 DEP와 이들의 상호작용을 가진 초기 네트워크 모델을 Cytoscape를 이용하여 구성하였다. 현 지식을 네트워크에 도입하기 위해서, 본 저자들은 면역계와 대사계에 관여되고 지방조직에서 대사질환의 발병에 기여하는 것으로 알려진 단백질을 초기 네트워크에 추가하였다. 다음, 본 저자들은 노드를 이들의 관련 GO 생물학적 과정과 경로에 따라 배치하여 유사한 기능을 가진 노드를 밀접하게 위치시켰다. 동일한 GO 과정에 관여된 일군의 노드를 해당 GO 항으로 표지하였다.
실시예 12: 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯에 의해 단백질을 확인하기 위해, 인간 내장 지방조직을 프로테아제 저해제(1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드; 100 mM 2 g/ml 아프로티닌, 2 g/ml 류펩틴)가 첨가된 용해용 완충액(Cell Signaling #9803, Danvers, MA)에서 균질화하였다. 가용화된 시료를 13,000 rpm로 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 지질을 제거하였다. 상청액을 모아 Bradford 분석에 의해 595 nm에서 단백질 농도를 조사하였다. 세포 용해물(50 g)을 10% SDSPAGE 처리하고 니트로셀룰로오스 막 위로 옮겼다. 상기 막을 1차 항체와 함께 배양하였다. 세척 후, 블롯(blot)을 HRP-접합 2차 항체와 함께 배양하였다. 블롯을 Amersham Biosciences 용액 #RPN2232으로 현상하고 암실에서 노출하였다. 다음, 블롯을 Fujifilm Multi Gauge 버전 3.0으로 정량화하였다. 선택된 분비 단백질에 대한 1차 항체 리스트를 표 2에 요약하였다.
[표 2]
Figure 112015000443360-pat00002

분석 결과
VAT 단백질체의 포괄적인 전체 프로파일링: 본 저자들은 먼저 당뇨병에 걸린 지 짧은 기간의(5년) 미투약 T2DM 환자(n = 5)와 대조군으로서 NGT이 있는 피험자를 연령과 성별에 따라 조정하여 면밀히 선택하였다. 본 연구에 등록된 피험자는 모두 암이 없었다. 연령, 성, 체질량지수, 질병 기간과 다른 실험실 조치와 같은 T2DM 환자와 NGT가 있는 피험자의 기준 특성을 요약하였다. 본 저자들은 T2DM 환자와 정상 대조군에 대한 선택적 복부 수술로부터 VAT를 분리하였다. 응혈을 제거한 후에, 본 저자들은 VAT의 용해물을 얻고, 이 용해물로부터 지질층을 제거한 다음, 필터-기반 시료 준비법을 이용하여 단백질을 분해하였다.
VAT 단백질체를 광범위하게 프로파일링하기 위해, 본 저자들은 마스터 AMT DB을 만들었다(그림 1). 이를 위해, 먼저 본 저자들은 5개의 정상 시료와 5개의 T2DM 시료를 모으고, 모은 단백질체를 26개의 분획물로 오프-겔 분획화하고, 초고압 나노-LC-MS/MS를 이용하여 분획물을 분석하였다(그림 1A). 그 결과, 26개의 LC-MS/MS 데이터 세트가 얻어졌다. 또한 본 저자들은 5명의 T2DM 환자와 NGT가 있는 6명의 피험자로부터 얻은 VAT 각각에 대해 3번의 반복 실험을 수행하여 33개의 LC-MS/MS 데이터 세트를 얻었다. 총 59회의 LC-MS/MS 실험을 이용하여 VAT 단백질체의 마스터 AMT DB를 구축하였다. 간단히, 본 저자들은 iPE-MMR 분석을 이용하여 개개의 데이터 세트로부터 펩티드 MS 특징의 UMC를 만들고, 펩티드 I.D.와 NET를 각각 표적-데코이 SEQUEST 검색(FDR < 0.01)과 NET 계산 후 UMC에 할당한 다음, 확인된 모든 UMC를 59개의 데이터 세트로부터 AMT DB로 컴파일링하였다(상세한 내용은 “실험절차”를 참조할 것). 그 결과, 25,418개의 펩티드(또는 AMT; 그림 1B에서 점들)를 포함한 마스터 AMT DB가 얻어졌다. 이후, 각 데이터 세트에 대해 본 저자들은 마스터 AMT DB를 이용하여 펩티드 I.D를 미확인 UMC에, 펩티드 I.D와 미확인 UMC를 질량과 NET 허용 오차(각각 10 ppm과 0.025 NET; 그림 1B)를 이용하여 AMT와 매칭하여 할당하였다. 마스터 AMT DB에 있는 25,418 펩티드 중에서 본 저자들은 2개 이상의 혈족(sibling) 펩티드를 가진 4,707개의 VAT 단백질을 포함한 22,250개의 펩티드를 선택한 다음, 이들을 이용하여 단백질을 정량화하였다.
T2DM 관련 VAT 단백질체 프로파일 : 본 저자들의 VAT 단백질체의 포괄성을 평가하기 위해 본 저자들은 VAT에서 검출된 4,707개의 단백질체(보충자료 표 S4)을 2개의 종래 연구에서 보고된 지방 단백질체와 비교하였다(그림 2A). Xie 등(24)은 LC-MS/MS 분석을 이용하여 지방조직의 또 다른 분류로서 3명의 건강한 개체의 SAT의 단백질체를 프로파일링한 다음, 1,493개의 단백질을 동정하였다. Adachi 등은 3T3-L1 지방세포의 단백질체를 프로파일링한 다음, 3,287개의 단백질을 동정하였는데; 이는 현재 가장 포괄적인 지방세포 단백질체이다. 비교를 통해 1,089개(1,476의 73.8%)와 1,330개(2,997의 44.4%)의 유전자 산물도 VAT에서 검출되었음이 밝혀졌다(그림 2B). 2,323개 유전자 중에서, 1,542(66.4%)개를 상기 2개의 연구 중 적어도 하나에서 검출하였고 781개는 검출되지 않았다. 이들 데이터는 본 저자들의 VAT 단백질체가 지방조직의 포괄적인 단백질체 중 하나로서 역할을 할 수 있음을 암시한다.
다음, 본 저자들은 DAVID 소프트웨어를 이용하여 Gene Ontology 생물학적 과정(GOBP)의 농축 분석을 수행함으로써 4,707개의 VAT 단백질에 의해 나타나는 세포 과정을 조사하였다. VAT 단백질체에 의해 크게 나타나는 세포과정은 산화환원, 항상성 과정, 염증/면역 반응 및 포도당과 지질 대사과정과 같은 지방조직의 주요 기능에 관한 과정들을 포함한다(그림 2C). 또한 GO 세포 성분의 농축 분석을 통해 VAT 단백질의 대다수는 (i) 원형질막(21.1%), (ii) 시토졸(20.1%), (iii) 미토콘드리아(15.8%), (iv) 세포외 영역(14.6%), (v) 세포골격(11.2%), (vi) 소포체(8.0%), (vii) 소낭(7.8%)과 (viii) 골지체(5.7%)에 주로 편재화되어 있음을 알 수 있었다(그림 2D). 이들 데이터는 본 저자들의 VAT 단백질체가 다양한 세포 구간에서 일어나는 지방조직의 다양한 기능에 관한 정보를 제공할 수 있음을 암시하고 있다.
T2DM에서 변형된 VAT 단백질의 동정
NGT에 비해 T2DM에서 발현양이 변화된 VAT 단백질을 동정하기 위해서 먼저 본 저자들은 33개의 LC-MS/MS 데이터 세트(5명의 T2DM 환자에 대한 15개와 NGT가 있는 6명의 피험자에 대한 18개)에서 22,250개의 펩티드 각각을 정렬시킨 다음, 종래 보고된 선형 프로그래밍 방법을 이용하여 T2DM과 NGT 시료 간 4,707개의 VAT 단백질의 발현양 비율을 결정하였다. 이후, 단백질 비율을 토대로 본 저자들은 NGT와 T2DM를 가진 피험자의 VAT 간 772개의 DEP(FDR ≤ 0.05)를 동정하였다. 772개의 DEP 중에서, 444개의 단백질은 NGT에 비해 T2DM에서 발현양이 증가한 반면에, 328개는 T2DM에서 감소하였다.
T2DM과 DEP의 기능적 관련성을 이해하기 위해서, 본 저자들은 DAVID 소프트웨어를 이용하여 772개의 DEP에 의해 나타나는 세포과정을 확인하였다. 이 분석을 통해 444개의 상향-조절된 DEP는 염증/면역 반응, 세포골격 구성-관련 과정(세포이동과 세포부착) 및 반응성 산소종과 산화적 스트레스에 대한 반응에 주로 관여되는 것으로 드러났는데(도 3A), 이는 T2DM 발병을 일으키는 주요 원인으로서 면역반응과 산화적 스트레스를 인정하고 있는 종래 발견에 부합하는 것이다. 328개의 하향-조절된 DEP는 T2DM 발병에 기여하는 포도당과 지방산 대사과정에 주로 관여되었다(도 3B). 많은 연구를 통해 염증/면역계와 물질대사가 상당 정도 함께 일어난다는 것이 입증된바, 상향- 및 하향-조절된 DEP가 VAT에서 T2DM-관련 병리생리학을 종합적으로 정의하는 역할을 한다는 것을 의미한다.
이들 T2DM-관련 과정의 종합적인 기능을 검토하기 위해서 본 저자들은 444개의 상향-조절된 DEP(그림 3C)와 328개의 하향-조절된 DEP(도 3D)에 의해 나타나는 과정에 관여된 DEP 간 상호작용을 기술하는 네트워크 모델을 재구성하였다. 이들 네트워크 모델에서 DEP는 기능적 모듈로 분류되었고, 각각의 모듈은 그림 3A와 3B에 나타낸 상응하는 GOBP에 관여된 DEP를 포함하였다. 보체 연쇄반응, 염증/면역반응과 ECM 수용체 상호작용을 포함하는 몇몇 모듈은 전사 인자(NFKB1/RELA, STAT3과 STAT5B)를 통해 자체 내에서 또한 상호간 밀접한 상호작용을 나타내었다(도 3C). 또한 T2DM에서는 대사 경로(피루베이트 물질대사, 트리카르복실산 사이클, OXPHOS와 지방산 β-산화)에 관여된 상당수의 분자가 감소하였다(도 3D).
이들 데이터는 T2DM 발병에 대한 이들 모듈과 경로의 종합적 기여를 보여준다.
VAT의 병리생리학을 나타내는 단백질체 프로파일: T2DM에서 VAT는 만성적인 염증과 대사 변조를 특징으로 한다. 일관되게 상기 네트워크 모델은 T2DM VAT에서 염증(그림 3C)과 대사(그림 3D) 관련 과정의 변화를 보여 주었다. 이에 따라, T2DM에서 VAT의 종합적인 병리생리학을 나타낼 수 있는 단백질체 프로파일을 선택하기 위해서 본 저자들은 이들 과정에 관여된 DEP에 초점을 맞췄다. 게다가 VAT는 광범위한 분자를 분비하는 내분비 기관이다. VAT로부터 분비되는 DEP는 염증과 대사 관련 과정을 변화시킬 수 있다. 이에 따라, 772개 DEP 중에서 본 저자들은 GO 세포 성분 정보(즉, 세포외 영역)와 Human Plasma Proteome Project 데이터를 이용하여 VAT로부터 분비될 수 있는 320개의 단백질(163개의 유전자)을 동정하였다. 네트워크 모델 및/또는 분비 단백질을 이용하여 본 저자들은 보충자료 그림 S7에 기재된 바와 같이 염증과 대사 관련 과정에서 변화를 나타낼 수 있는 단백질체 프로파일을 선택하였다. 먼저, 네트워크 모델에서 염증-관련 과정에 대해 본 저자들은 네트워크 모델에서 염증/면역 반응, 보체 연쇄반응과 세포부착의 3개의 염증-관련 모듈에 관여된 21개의 분비 DEP에 주목하였다(도 3C). 이들 중에서 본 저자들은 네트워크 모듈에 해당하는 과정의 변화를 나타낼 수 있는 다음과 같은 5개의 단백질을 선택하였다: 염증/면역 반응 모듈에 대해 α-2-HS-당단백질과 S100 칼슘 결합 단백질 A8/9(S100A8/9; 칼프로텍틴); 보체 연쇄반응 모듈에 대해 보체 성분 1, q 하위 성분, A 사슬(C1QA); 및 세포부착 모듈에 대해 1을 함유하는 소르빈과 SH3 도메인(SORBS1). 두 번째로, 네트워크 모델에서 대사-관련 과정에 대해 본 저자들은 네트워크 모델에서 당분해 경로보다 지방조직에 더 관련이 있는 지방산 β-산화의 경로에 관여된 7개의 DEP에 주목하였다(도 3D). 이들 중에서, 본 저자들은 3개의 대사 효소로서 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 2, 아실-CoA 탈수소효소, 장쇄(ACADL), 및 아실-CoA 탈수소효소, C-4 내지 C-12 직쇄(ACADM)를 선택하였다. 세 번째로, 아디포킨은 지방조직으로부터 분비된 가장 잘 알려진 단백질류로서, T2DM VAT에서 염증과 대사 변조 모두에 영향을 줄 수 있다. 흥미로운 것은, 320개의 분비 DEP는 3개의 아디포킨 지방산 결합 단백질 4(FABP4)와 페릴리핀 1과 4(PLIN1과 PLIN4)를 포함하였다. 이에 따라, 본 저자들은 이들 3개의 아디포킨을 추가로 선택하였다. 총 11개의 단백질을 T2DM의 초기 발병에서 VAT의 병리생리학을 나타낼 수 있는 단백질 프로파일로서 선택되었다.
선택된 단백질 프로파일의 입증
11개의 선택된 단백질의 유효성을 시험하기 위해서 본 저자들은 LC-MS/MS 분석을 이용한 발견 단계에서 시료 채취를 위해 이용한 동일한 기준에 입각하여 10명의 초기 T2DM 환자와 NGT가 있는 10명의 피험자의 독립 세트로부터 VAT를 채취하였다. 다음, 이들 새로운 시료에서, 웨스턴 블롯팅을 이용하여 본 저자들은 LC-MS/MS 분석에 의해 측정한 11개의 선택된 단백질의 차등 발현을 시험하였다(즉, NGT에 비해 T2DM에서 FABP4, S100A8/9, SORBS1, α-2-HS-당단백질과 C1QA의 상향-조절 및 PLIN1/4, 카르니틴, 팔미토일트랜스퍼 2, ACADL과 ACADM의 하향-조절; 보충자료 그림 S7에 적색으로 표시된 11개의 단백질). 11개의 선택된 단백질들로부터 본 저자들은 마지막으로 LC-MS/MS 데이터에 나타낸 것들과 일치하는 독립적인 시료에서 유의적인 변화를 보인 6개의 단백질을 선택하였다(도 4A 및 4B). 마지막으로, 본 저자들은 이들 6개의 단백질을 T2DM에서 VAT의 병리생리학을 관측하기 위해 이용할 수 있는지 평가하였다. 이를 위해, 본 저자들은 웨스턴 블롯팅의 결과로부터 6개 단백질의 발현양을 정량화한 다음 이들의 발현양이 부분 최소 제곱 판별 분석을 이용하여 T2DM 환자를 NGT가 있는 피험자로부터 식별할 수 있는지 평가하였다(도 4C). 10개의 T2DM 시료 중 9개를 10개의 NGT 대조군으로부터 정확하게 분리하였다. 종합하면, 이들 데이터를 통해 T2DM의 초기 발병에서 VAT의 병리생리학을 나타내는 단백질 프로파일로서 상기 6개의 단백질을 이용할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. S100A8, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이고,
    상기 S100A8 및 C1QA에서 선택되는 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 높은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되고,
    상기 PLIN4 또는 ACADL 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 낮은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되는, 제2형 당뇨병 조기 진단용 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마커는 단백질 또는 핵산 수준, 또는 단백질 및 핵산 수준에서 검출되는 것인, 제2형 당뇨병 조기 진단용 마커.
  3. S100A8, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 검출시약을 포함하고,
    상기 S100A8 및 C1QA에서 선택되는 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 높은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되고,
    상기 PLIN4 또는 ACADL 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 낮은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되는, 검체의 제2형 당뇨병 조기 진단용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 검체는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장에서 유래된 시료인 것인 제2형 당뇨병 조기진단용 키트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 제2형 당뇨병 조기 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드, 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약인, 제2형 당뇨병 조기 진단용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR, RNase 보호분석법, DNA 칩 또는 노던블랏에서 사용되는 시약인, 검체의 제2형 당뇨병의 조기 진단용 키트.
  8. 검체로부터 S100A8, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 마커의 양을 검출하는 단계; 및
    상기 검출된 마커의 양을 검사 대상자의 제2형 당뇨병의 조기 진단에 연관시키는 단계를 포함하고,
    상기 S100A8 및 C1QA에서 선택되는 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 높은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되고,
    상기 PLIN4 또는 ACADL 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 낮은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되는,
    제2형 당뇨병의 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검사 대상자의 검체로부터 상기 마커를 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 마커의 양은 단백질 또는 mRNA 발현 수준에서 결정되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 연관시키는 단계는 상기 결정된 마커의 양을 정상 대조군에서 결정된 상기 마커에 대한 검출결과와 비교하는 것인 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. S100A8 또는 C1QA의 억제제; 또는 PLIN4 또는 ACADL의 증진제 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 S100A8 및 C1QA에서 선택되는 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 높은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되고,
    상기 PLIN4 또는 ACADL 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 낮은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되는, 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 억제제 또는 증진제는 저분자 화합물, 항체, 안티센스올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 및 폴리펩타이드를 포함하는, 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물.
  15. S100A8, C1QA, PLIN4 및 ACADL로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 단백질을 제공하는 단계;
    상기 단백질을 시험물질과 접촉시키는 단계; 및
    상기 시험물질과 접촉된 단백질과 접촉되지 않은 대조군에서의 상기 단백질의 발현을 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 S100A8 및 C1QA에서 선택되는 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 높은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되고,
    상기 PLIN4 또는 ACADL 마커의 양은 정상 대조군에서 결정된 마커의 양보다 낮은 경우 제2형 당뇨병으로 진단되는, 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 동물모델의 형태로 제공되는 것인 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.

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