WO2016140388A1 - 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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exosomes
toxicity
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protein
long
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백문창
조영은
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경북대학교 산학협력단
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing long-term toxicity comprising an exosome or a protein thereof and a diagnostic method using the same.
  • DILI Drug safety is an important factor in public health affecting the pharmaceutical industry, regulators, physicians and patients.
  • DILI is hepatotoxicity caused by drugs, and many approved drugs are withdrawn and banned by DILI.
  • acetaminophen APAP
  • APAP acetaminophen
  • liver damage limiting concentration.
  • Acetaminophen is one of the best-selling drugs in the world, causing problems due to side effects.
  • Liver toxicity caused by acetaminophen is mainly caused by overdose. At this time, the excess dose of acetaminophen is not supplied with sufficient glutathione (glutathione) and NAPQI accumulates, which eventually kills hepatocytes and causes liver toxicity.
  • glutathione glutathione
  • NAC is one of the most effective drugs to protect hepatocytes from toxicity and helps metabolize by recharging glutathione and binding directly to NAPQI. If NAPQI accumulates, treatment with NAC should be done as soon as possible (8-10 hours) after drug metabolism occurs. However, since there are no symptoms at first, it is difficult to deal with it quickly. Therefore, there is a need for a biomarker that can initially diagnose liver toxicity in the blood.
  • Exosomes are small vesicles (membrane vesicles) secreted by most cells. Exosomes have been reported to contain a variety of proteins, genetic material (DNA, mRNA, miRNA), lipids, etc. derived from the cell. In addition, since tissue-derived exosomes reflect the state of tissue secreting exosomes, it has been reported that they can be used for the diagnosis of diseases.
  • the present inventors have continued research to develop novel biomarker compositions for diagnosing long-term toxicity and diagnostic methods using the same.
  • the present inventors can accurately and quickly diagnose and predict long-term toxicity.
  • the present invention was completed by confirming that the exosome protein can be diagnosed for toxicity to each organ.
  • It is also an object of the present invention to provide a composition for diagnosing long-term toxicity comprising an agent for detecting an exosome or a protein thereof.
  • It is also an object of the present invention (a) separating the exosomes from the biological sample; And (b) to provide an information providing method for diagnosing long-term toxicity comprising the step of identifying the amount of the exo-bit or protein thereof.
  • It is also an object of the present invention (a) treating the candidate substance in the blood; (b) measuring the amount of exosomes or proteins thereof in the blood treated with the candidate substance; And (c) comparing the amount of the exosome or protein thereof with a control, to provide a method for screening for a long term toxic therapeutic substance.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing long-term toxicity comprising an exosome or a protein thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing long-term toxicity comprising an agent for detecting an exosome or a protein thereof.
  • the present invention provides a kit for diagnosing long-term toxicity comprising the composition.
  • the present invention also comprises the steps of (a) separating the exosomes from the biological sample; And (b) confirming the amount of the exosomes or proteins thereof; and providing information providing methods for diagnosing long-term toxicity.
  • the present invention also comprises the steps of (a) treating the candidate substance in the blood; (b) measuring the amount of exosomes in the blood treated with the candidate substance; And (c) comparing the amount of the exosome or the protein thereof with the control group.
  • Exosome according to the present invention can be used to quickly diagnose long-term toxicity, in particular, exosome protein or microRNA can be used to diagnose the toxicity of a particular organ, the present invention can be accurately and quickly various drugs It can be useful for diagnosing long-term toxicity and predicting prognosis.
  • Figure 1 is a diagram showing the results of liver toxicity measurement of hepatotoxic mouse model treated with acetaminophen.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of measuring the amount of exosomes in hepatotoxic mouse model treated with acetaminophen.
  • FIG. 4 is Figure shows the results of measuring the amount of exosomes in hepatotoxic cell model treated with acetaminophen.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of measuring the amount of exosomes in hepatotoxic mouse model and hepatotoxic cell model treated with DGAL and TAA.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of ELISA enzyme immunoassay of exosome protein in a long-term toxicity model.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of analyzing exosome microRNA expression in liver toxicity model.
  • Figure 8 is a diagram showing the results of measuring the amount of exosomes after NAC treatment in liver toxicity.
  • Figure 9 is a diagram showing the results of measuring the expression of liver specific exosome protein after NAC treatment in liver toxicity.
  • Figure 10 is a diagram showing the results of measuring the amount of exosomes after quercetin treatment in a renal toxicity state.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of analyzing exosome microRNA expression after NAC or quercetin treatment in a long-term toxicity state.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing long-term toxicity comprising exosomes, proteins or microRNAs thereof.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing long-term toxicity, including an agent for detecting an exosome, a protein or a microRNA thereof.
  • diagnosis in the present invention means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, it is to confirm the long-term toxicity. Since the amount of exosomes in the long-term toxicity state increases, it is possible to predict the long-term toxicity of the subject by confirming the amount of the exosomes of the present invention from the sample of the subject.
  • exosome refers to a small form of endoplasmic reticulum secreted from cells, preferably circulating exosomes present in the blood, such as whole blood, serum and plasma.
  • the present invention also provides a biomarker composition for diagnosing specific toxicity of liver, kidney, heart, muscle or brain of the subject.
  • organ-specific exosome proteins in exosomes is increased in the long-term toxic state, more specifically in the hepatotoxic state, the expression of albumin, haptoglobin or fibrinogen in exosomes is increased.
  • the expression of Kim-1 (kidney injury molecule 1) or neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in exosomes is increased, and in cardiac toxic state, heart tropo of exosomes is increased.
  • the biomarker composition of the present invention can be used for diagnosing liver toxicity by measuring the expression of one or more proteins selected from the group consisting of albumin, haptoglobin, and fibrinogen in exosomes.
  • biomarker composition of the present invention can be used for diagnosing renal toxicity by measuring protein expression of Kim-1 (kidney injury molecule 1) or neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in exosomes. have.
  • biomarker composition of the present invention can be used for diagnosing cardiac toxicity by measuring protein expression of cardiac troponin I (cTnI) in exosomes.
  • biomarker composition of the present invention can be used for diagnosing muscle toxicity by measuring protein expression of skeletal muscle troponin (sTnI) in exosomes.
  • sTnI skeletal muscle troponin
  • biomarker composition of the present invention can be used for diagnosing brain toxicity by measuring protein expression of S100 calcium binding protein (S100B) in exosomes.
  • S100B S100 calcium binding protein
  • organ-specific exosome microRNAs in exosomes is increased in the long-term toxicity state, more specifically in the liver toxicity state, the expression of miR-122, 192 or 155 of the exosomes is increased, in renal toxicity state Increased expression of miR-146a in exosomes, decreased expression of miR-208 in exosomes in cardiac toxic states, increased expression of miR-206 in exosomes in muscle toxic states, exosomes in brain toxic states Since miR-7 expression is reduced, it is possible to predict whether the organ-specific toxicity by measuring the expression of the organ-specific exosome microRNA.
  • the detection agent according to the present invention means that the amount of exosomes or the level of expression of proteins or microRNAs of exosomes can be measured.
  • measurement of expression level of protein is a process of confirming the presence and the level of expression of a marker protein in a biological sample for diagnosing long-term toxicity, by using an antibody that specifically binds to the exosome protein.
  • a commercially available kit is available.
  • an antibody refers to a protein molecule specific to an antigenic site as it is known in the art.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to an exosome protein, and such an antibody can be prepared by conventional methods, and any commercially available one can be used without limitation.
  • the antibody also includes a partial peptide that can be made from a protein, the partial peptide comprising at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids.
  • the form of the antibody in the present invention is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included.
  • antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • Antibodies used in the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • RNA expression level measurement is a process of confirming the presence and expression of RNA of a marker gene in a biological sample for diagnosis or prognosis of cancer, and antisense oligonucleotides capable of detecting microRNAs of the exosomes
  • the amount of primer pairs or probes can be measured and confirmed, and commercially available kits can be used.
  • the present invention provides a kit for diagnosing long-term toxicity comprising the composition.
  • kits include, but are not limited to, RT-PCR kits, microarray chip kits, DNA kits, or protein chip kits.
  • Kits of the invention can be used to predict long-term toxicity of drugs by identifying exosome amounts.
  • kit of the present invention albumin (albumin), haptoglobin, fibrinogen, Kim-1 (kidney injury molecule 1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin in exosomes NGAL), cardiac troponin I (cTnI), skeletal muscle troponin (sTnI), and S100 calcium binding protein (S100 calcium binding protein B; S100B) expression level of the protein selected from the group This can be used to predict the long term specific toxicity of a drug.
  • albumin albumin
  • haptoglobin fibrinogen
  • Kim-1 kidney injury molecule 1
  • neutrophil gelatinase-associated lipocalin in exosomes NGAL neutrophil gelatinase-associated lipocalin in exosomes NGAL
  • cardiac troponin I cTnI
  • skeletal muscle troponin skeletal muscle troponin
  • S100 calcium binding protein B S100 calcium binding protein B
  • the kit of the present invention confirms the expression level of microRNA selected from the group consisting of miR-122, miR-192, miR-155, miR-146a, miR-208, miR-206, and miR-7 in exosomes. This can be used to predict the long term specific toxicity of a drug.
  • Kits of the invention may include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods, as well as antibodies that selectively recognize markers for long-term toxicity prediction.
  • the kit for measuring the protein expression level in the present invention may include a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a coloring enzyme or a fluorescent material, and a coloring substrate for the immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like.
  • the chromophore may be a peroxidase or an alkaline force.
  • Alkaline phosphatase may be used, and the fluorescent material may be FITC, RITC, or the like, and the colorant substrate is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur). Phonic acid)) or OPD (O-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) can be used.
  • It provides a method for providing information for diagnosing long-term toxicity comprising the step (b) confirming the amount of the exosomes.
  • albumin albumin
  • haptoglobin fibrinogen
  • Kim-1 kidney injury molecule 1
  • neutrophil gelatinase-associated lipocalin NGAL
  • cTnI cardiac troponin I
  • sTnI skeletal muscle troponin
  • S100B S100 calcium binding protein B
  • (c ′) confirming the expression level of the microRNA selected from the group consisting of miR-122, miR-192, miR-155, miR-146a, miR-208, miR-206, and miR-7 in the exosome It provides a method for providing information for diagnosing long-term toxicity further comprising.
  • the biological sample of step (a) may be selected from the group consisting of whole blood, serum and plasma, but is not limited thereto.
  • the biological sample is plasma.
  • the method for confirming the amount of exosomes in step (b) and the expression level of exosome protein in step (c) is Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay, Radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Ouchterlony immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complete fixation assay, FACS (Flow Cytometry) )
  • a protein chip protein chip
  • a protein chip may be selected from one or more, but is not limited thereto.
  • the method for confirming the expression level of the exosome microRNA in the step (c ') is RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting, and DNA microarray chip, but may be selected from one or more.
  • control means a group not treated with the candidate substance.
  • the candidate for long-term toxicity treatment after specifying the amount of the exosomes disclosed in the present invention in the absence of a candidate for long-term toxicity treatment, and comparing the two by specifying the amount of the exosomes of the present invention in the presence of the candidate for long-term toxicity treatment, the candidate for long-term toxicity treatment.
  • Substances that reduce the amount of exosomes in the presence of a substance to the amount of exosomes in the absence of candidates for long-term toxicity treatment can be predicted by the long-term toxicity therapeutics disclosed herein.
  • albumin hapbu
  • haptoglobin fibrinogen
  • kim-1 kidney injury molecule 1
  • neutrophil gelatinase binding lipocalin in exosomes isolated from blood treated with the candidate substance Neurotrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)
  • cardiac troponin I cTnI
  • skeletal muscle troponin sTnI
  • S100B S100 calcium binding protein Measuring the expression level of the protein
  • a method of comparing the increase or decrease in the amount of exosome protein in the presence and absence of long-term specific toxicity treatment candidates it can be usefully used for screening long-term specific toxicity therapeutics.
  • a candidate substance hepatotoxicity therapeutic agent, Kim-1 (kidney injury molecule 1) or neutrophil gel of exosomes when the expression of albumin, haptoglobin or fibrinogen in exosomes is reduced
  • NGAL Neutrophil gelatinase-associated lipocalin
  • cTnI cardiac troponin I
  • sTnI skeletal muscle troponin
  • S100B S100 calcium binding protein
  • mice used a 6 week old Balb / C model.
  • APAP acetaminophen
  • DGAL 1,000 mg / kg
  • TAA 200 mg / kg
  • control group MTX Metalhotrexate
  • FLX Fluoxetine
  • PRX peroxiredoxin
  • each mouse was treated with acetaminophen first, followed by N-acetyl cysteine (NAC) (100 mg / kg) for 12 days every 72 hours to make a mouse model treated with hepatotoxicity.
  • NAC N-acetyl cysteine
  • cisplatin (20 mg / kg) to create a renal toxicity model
  • 0.5% BPVC 0.5% BPVC
  • cyclophosphamide 200 mg / kg
  • brain toxicity model MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine
  • ALT / AST enzyme activity was increased in plasma of acetaminophen-treated mice, and as shown in FIG. 1C, TNF-a mRNA expression associated with liver damage was increased to acet. It was confirmed that liver damage occurred by treatment with aminophene.
  • HepG2, Hep3B, and Hepa1-6 cells were cultured in Eagle's minimal essential medium (DMEM) / concentrated glucose medium to which 10% FBS was added. Treated with an amount of IC 50 for 24 hours.
  • DMEM Eagle's minimal essential medium
  • ExoQuick exosome precipitation solution (SBI System Biosciences cat.no.EXOQ50A-) in order to isolate circulating exosomes from the medium isolated from the long-term toxic mouse model of Example 1-1 and the cells cultured in Example 1-2. 1) was used to obtain the circulating exosomes according to the method suggested by the manufacturer. The obtained exosomes were washed twice with PBS (phosphate buffered saline) to obtain yellow exosome pellets. The miRNA was isolated from the circulating exosomes using QIAzole (Qiagen). The isolated circulating exosomes were observed in the long-term toxic mouse model of Example 1-1, and the results are shown in FIG.
  • TEM images and size analysis confirmed that the circulating exosomes of about 100 nm in size were well separated from both the control and acetaminophen treatment groups.
  • Example 1-1 and the cells of Example 1-2 were treated with each drug by concentration and time, and then circulating exosomes were isolated in the same manner as in Example 2-2 The amount of circulating exosomes was confirmed.
  • the isolated circulating exosomes were radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (10 mM TrisHCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100 and 1%). After dissolving in sodium deoxycholate containing a decomposition enzyme inhibitor mixture (Complete Protease Inhibitor Mixture tablets) was stored at -80 °C.
  • RIPA radioimmunoprecipitation assay
  • the amount of circulating exosomes increased in the 150 and 300 mg / kg treatment groups when acetaminophen was treated at various concentrations for 1 hour, especially in the blood in the 300 mg / kg treatment group. ALT was increased, histopathological changes were observed, and liver toxicity was observed.
  • Figures 3C and 3D when acetaminophen was treated at various concentrations for 3 hours, the amount of circulating exosomes was increased in the low concentration 75 mg / kg treated group, and 75 mg / kg treated with ALT. There was no significant change in the group, but significantly increased in the 150 and 300 mg / kg treatment group. Through this, it was confirmed that early diagnosis of liver toxicity was possible by measuring the amount of circulating exosomes.
  • HepG2, Hep3B, Hepa1-6 hepatocytes treated with acetaminophen increased the amount of circulating exosomes when hepatotoxic, and the number of circulating exosomes also increased.
  • 4C and 4D HepG2 hepatocytes were confirmed to increase the amount of circulating exosomes when acetaminophen treatment. Through this, it was confirmed that hepatic toxicity can be diagnosed through the increase in the amount of circulating exosomes in the cell model.
  • Each mouse was treated with DGAL (1,000 mg / kg) or TAA (200 mg / kg) as in Example 1-1 to determine whether circulating exosomes were increased in other liver toxicity mouse models and liver toxicity cell models.
  • Each cell was treated with DGAL or TAA as in Example 1-2.
  • the control group was treated with MTX, FLX or PRX, a safe drug with no liver toxicity.
  • the amount of circulating exosomes, ALT, and AST levels were measured, and liver tissues were observed.
  • ELISA enzyme immunoassay was used.
  • CD63 polyclonal antibody (O / N) was coated on a 96 well plate by O / N, and each well was blocked using a blocking solution.
  • Example 1 1 ul of the exosomes isolated from the long-term toxic mouse blood of Example 1 was reacted for 2 hours and washed well after the detection antibody (albumin), haptoglobin (haptoglobin), Fibrinogen, Kim-1 (kidney injury molecule 1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), cardiac troponin I (cTnI), skeletal muscle troponin sTnI) and S100 calcium binding protein B (S100B) were measured. The results are shown in FIG. 6.
  • the amount of circulating exosomes was increased in several long-term toxicity models, and the expression of albumin, haptoglobin, and fibrinogen was increased in circulating exosomes in a hepatotoxic mouse model.
  • Kidney injury molecule 1 Kim-1
  • neutrophil gelatinase-associated lipocalin NGAL
  • cTnI cardiac troponin I
  • sTnI skeletal muscle troponin
  • the experiment was performed according to the miRNeasy protocol (Qiagen), and synthetic Caenorhabditis elegans (cel) -miR-39 was added thereto.
  • Expression of miR-122, miR-192, miR-155, miR-7, miR-146a, miR-208, miR-206 was confirmed using miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen), and Cel-miR-39 was expressed. Standardized. The results are shown in FIG.
  • miR-122 and miR-192 were significantly recovered from circulating exosomes after NAC treatment, and miR-155 and miR-146a were significantly recovered from circulating exosomes after quercetin treatment. It was confirmed that the recovery.

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Abstract

본 발명은 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물, 엑소좀 또는 이의 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 장기 독성 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 장기 독성 진단용 키트, 상기 조성물을 이용한 장기 독성 진단을 위한 정보 제공방법 및 상기 조성물을 포함하는 장기 독성 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑소좀을 이용하여 장기 독성을 신속하게 진단할 수 있고, 특히, 장기 특이적 엑소좀 단백질을 이용하여 특정 장기의 독성 여부를 진단할 수 있으므로, 본 발명은 정확하고 신속하게 여러 약물에 의한 장기 독성을 진단하거나 예후를 예측하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법
본 발명은 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
약물의 안전성은 의약품 산업, 규제기관, 의사 및 환자에 영향을 주는 공중 보건에 있어 중요한 요소이다. DILI란 약물에 의해서 일어나는 간 독성으로, 승인을 받은 많은 약들이 DILI로 인해 승인 철회 및 금지된다. 특히, 많은 약들 중 아세트아미노펜(Acetaminophen, APAP)은 잠재적으로 간 손상을 일으킬 수 있어 농도에 제한이 있다. 아세트아미노펜은 세계에서 가장 많이 팔리는 약 중에 하나로 부작용 때문에 문제를 일으킨다. 아세트아미노펜에 의해서 일어나는 간 독성은 주로 과용량의 복용에 의해서 일어난다. 이때, 과용량의 아세트아미노펜은 글루타치온(glutathione)이 충분히 공급이 되지 않아 NAPQI가 축적이 되고 이것이 결국에 간세포를 사멸시켜서 간 독성을 일으키게 된다. NAC는 독성으로부터 간세포를 보호하는 가장 효과적인 약물 중 하나로서 글루타치온의 재충전 및 NAPQI에 직접 바인딩 하여 대사를 돕는다. NAPQI가 축적되는 경우, 약물의 대사가 일어난 후 빠른 시간(8-10시간) 내에 NAC 등의 처리를 해야 한다. 그러나 초기엔 아무런 증상이 없기 때문에 빠른 시간 내에 처리하기가 어렵다. 따라서 초기에 혈액에서 간 독성을 진단할 수 있는 바이오마커가 필요성이 요구되고 있다.
한편, 엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)이다. 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것으로 보고되었다. 또한, 조직 유래 엑소좀은 엑소좀을 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.
이에 본 발명자는 신규한 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 엑소좀을 이용할 경우, 장기의 독성을 정확하고 신속하게 진단 및 예측할 수 있으며, 장기 특이적인 엑소좀 단백질을 분석하여 각각의 장기에 대한 독성을 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 엑소좀 또는 이의 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 장기 독성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 장기 독성 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 또는 이의 단백질의 양을 확인하는 단계;를 포함하는 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 (a) 혈액에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 혈액에서 엑소좀 또는 이의 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 또는 이의 단백질의 양을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 장기 독성 치료물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 엑소좀 또는 이의 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 장기 독성 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 장기 독성 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 또는 이의 단백질의 양을 확인하는 단계;를 포함하는 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 혈액에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 혈액에서 엑소좀의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 또는 이의 단백질의 양을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 장기 독성 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 엑소좀을 이용하여 장기 독성을 신속하게 진단할 수 있고, 특히, 엑소좀 단백질 또는 마이크로RNA를 이용하여 특정 장기의 독성 여부를 진단할 수 있으므로, 본 발명은 정확하고 신속하게 여러 약물에 의한 장기 독성을 진단하거나 예후를 예측하는데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 아세트아미노펜을 처리한 간 독성 마우스 모델의 간 독성 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 간 독성 마우스 모델에서 분리된 엑소좀을 나타낸 도이다.
도 3은 아세트아미노펜을 처리한 간 독성 마우스 모델에서 엑소좀의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 아세트아미노펜을 처리한 간 독성 세포 모델에서 엑소좀의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 DGAL 및 TAA를 처리한 간 독성 마우스 모델 및 간 독성 세포 모델에서 엑소좀의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 장기 독성 모델에서 엑소좀 단백질의 ELISA 효소면역분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 간 독성 모델에서 엑소좀 마이크로RNA 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 간 독성 상태에서 NAC 처리 후 엑소좀의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 간 독성 상태에서 NAC 처리 후 간 특이적 엑소좀 단백질의 발현을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 신장 독성 상태에서 퀘세틴 처리 후 엑소좀의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 장기 독성 상태에서 NAC 또는 퀘세틴 처리 후 엑소좀 마이크로RNA 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 엑소좀, 이의 단백질 또는 마이크로RNA를 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 엑소좀, 이의 단백질 또는 마이크로RNA를 검출하는 제제를 포함하는 장기 독성 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 장기 독성 여부를 확인하는 것이다. 장기 독성 상태에서 엑소좀의 양이 증가하므로, 개체의 시료로부터 본 발명의 엑소좀의 양을 확인함으로써 해당 개체의 장기 독성 여부에 대해서 예측이 가능하다.
본 발명에서 "엑소좀"은 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체를 의미하는 것으로, 바람직하게는 전혈, 혈청 및 혈장 등 혈액 내에 존재하는 Circulating 엑소좀이다.
또한 본 발명은 해당 개체의 간, 신장, 심장, 근육 또는 뇌의 특이적 독성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
엑소좀에서 장기 특이적 엑소좀 단백질의 발현은 장기 독성 상태에서 증가하게 되는데, 보다 구체적으로 간 독성 상태에서는 엑소좀의 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin) 또는 피브리노겐(fibrinogen)의 발현이 증가하며, 신장 독성 상태에서는 엑소좀의 Kim-1(kidney injury molecule 1) 또는 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL)의 발현이 증가하고, 심장 독성 상태에서는 엑소좀의 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI)의 발현이 증가하고, 근육 독성 상태에서는 엑소좀의 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI)의 발현이 증가하고, 뇌 독성 상태에서는 엑소좀의 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)의 발현이 증가하므로, 상기 장기 특이적 엑소좀 단백질의 발현을 측정함으로써 장기 특이적 독성 여부에 대해서 예측이 가능하다.
따라서, 본 발명의 바이오마커 조성물은 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin) 및 피브리노겐(fibrinogen)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질 발현을 측정하여 간 독성 진단에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커 조성물은 엑소좀에서 Kim-1(kidney injury molecule 1) 또는 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL)의 단백질 발현을 측정하여 신장 독성 진단에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커 조성물은 엑소좀에서 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI)의 단백질 발현을 측정하여 심장 독성 진단에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커 조성물은 엑소좀에서 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI)의 단백질 발현을 측정하여 근육 독성 진단에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커 조성물은 엑소좀에서 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)의 단백질 발현을 측정하여 뇌 독성 진단에 사용될 수 있다.
또한, 엑소좀에서 장기 특이적 엑소좀 마이크로RNA의 발현은 장기 독성 상태에서 증가하게 되는데, 보다 구체적으로 간 독성 상태에서는 엑소좀의 miR-122, 192 또는 155의 발현이 증가하며, 신장 독성 상태에서는 엑소좀의 miR-146a의 발현이 증가하고, 심장 독성 상태에서는 엑소좀의 miR-208의 발현이 감소하고, 근육 독성 상태에서는 엑소좀의 miR-206의 발현이 증가하고, 뇌 독성 상태에서는 엑소좀의 miR-7의 발현이 감소하므로, 상기 장기 특이적 엑소좀 마이크로RNA의 발현을 측정함으로써 장기 특이적 독성 여부에 대해서 예측이 가능하다.
본 발명에 따른 검출 제제는 엑소좀의 양 또는 엑소좀의 단백질 또는 마이크로RNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 "단백질의 발현 수준 측정"은 장기 독성 진단을 위하여 생물학적 시료에서 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 엑소좀 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 상업적으로 판매되는 키트를 이용할 수 있다.
상기 "항체"란 당업계에 공지된 용어로서 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 엑소좀 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있고, 시판되는 것을 제한없이 이용할 수 있다. 상기 항체에는 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 상기 부분 펩티드는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명에서 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에서 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 "RNA 발현 수준 측정"은 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 RNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 엑소좀의 마이크로RNA를 검출할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브의 양 등을 측정해 확인할 수 있으며, 상업적으로 판매되는 키트를 이용할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 장기 독성 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 또는 단백질 칩 키트를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 엑소좀 양을 확인함으로써 약물의 장기 독성을 예측하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐(fibrinogen), Kim-1(kidney injury molecule 1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL), 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI), 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI) 및 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 약물의 장기 특이적인 독성을 예측하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 엑소좀에서 miR-122, miR-192, miR-155, miR-146a, miR-208, miR-206, 및 miR-7로 이루어진 군으로부터 선택된 마이크로RNA의 발현 수준을 확인함으로써 약물의 장기 특이적인 독성을 예측하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 키트에는 장기 독성 예측을 위해 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
일례로, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또한 본 발명은,
(a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 엑소좀의 양을 확인하는 단계;를 포함하는 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
(c) 상기 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐(fibrinogen), Kim-1(kidney injury molecule 1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL), 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI), 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI) 및 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 더 포함하는 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
(c') 상기 엑소좀에서 miR-122, miR-192, miR-155, miR-146a, miR-208, miR-206, 및 miR-7로 이루어진 군으로부터 선택된 마이크로RNA의 발현 수준을 확인하는 단계;를 더 포함하는 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 1종 이상을 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 혈장이다.
상기 (b) 단계의 엑소좀의 양 및 (c) 단계의 엑소좀 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴블랏, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 1종 이상을 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c') 단계의 엑소좀 마이크로RNA의 발현 수준을 확인하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏(northern blotting), 및 DNA 마이크로어레이 칩으로 이루어진 군에서 1종 이상을 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은,
(a) 혈액에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 혈액에서 엑소좀의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 엑소좀의 양을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 장기 독성 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "대조구"란 후보물질을 처리하지 않은 군을 의미한다.
구체적으로, 장기 독성 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 엑소좀 양의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 장기 독성 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 엑소좀의 양을 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 장기 독성 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 장기 독성 치료 후보 물질의 부재하에 본 발명에서 개시된 엑소좀의 양을 특정하고, 장기 독성 치료 후보 물질의 존재하에서 본 발명의 엑소좀의 양을 특정하여 양자를 비교한 후, 장기 독성 치료 후보 물질이 존재할 때의 엑소좀의 양을 장기 독성 치료 후보 물질의 부재 하에서의 엑소좀의 양보다 감소시키는 물질을 본 발명에서 개시된 장기 독성 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은
(a) 혈액에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 혈액으로부터 분리된 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐(fibrinogen), Kim-1(kidney injury molecule 1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL), 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI), 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI) 및 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 장기 특이적 독성 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 장기 특이적 독성 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 엑소좀 단백질 양의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로, 장기 특이적 독성 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 후보 물질의 존재하에서, 엑소좀의 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin) 또는 피브리노겐(fibrinogen)의 발현이 감소하는 경우 간 독성 치료제, 엑소좀의 Kim-1(kidney injury molecule 1) 또는 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL)의 발현이 감소하는 경우 신장 독성 치료제, 엑소좀의 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI)의 발현이 감소하는 경우 심장 독성 치료제, 엑소좀의 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI)의 발현이 감소하는 경우 근육 독성 치료제이며, 엑소좀의 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)의 발현이 감소하는 경우 뇌 독성 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 장기 독성 모델의 제조
1-1. 장기 독성 마우스 모델의 제조
마우스 실험은 모두 경북대학교의 승인을 받아 실험에 사용 하였다. 마우스는 6주령 Balb/C 모델을 이용하였다. 여러 가지 약물을 이용한 간 독성 마우스 모델을 만들기 위해, 각 마우스에 아세트아미노펜(APAP) (300 mg/kg, LD50 단일 투여), DGAL (1,000 mg/kg); 또는 TAA (200 mg/kg)를 처리하였으며, 대조군으로는 간 독성이 없는 안전한 약물인 MTX(Methotrexate)(0.5 mg/kg), FLX(Fluoxetine)(20 mg/kg) 또는 PRX(peroxiredoxin)(20 mg/kg)를 복강내 주사하여 24시간 동안 처리하였다. 또한, 간 독성이 치료된 마우스 모델을 만들기 위해 각 마우스에 아세트아미노펜을 먼저 처리한 다음 N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine; NAC)(100 mg/kg)을 12시간 마다 72일 동안 처리하였다. 또한 신장 독성 모델을 만들기 위해 시스플라틴(cisplatin)(20mg/kg), 근육 독성 모델을 만들기 위해 0.5% BPVC, 심장 독성 모델을 만들기 위해 시클로포스파미드(cyclophosphamide) (200 mg/kg), 뇌 독성 모델(파킨스 질병모델)을 만들기 위해 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) (30 mg/kg)를 24시간 동안 처리하였다.
상기 방법으로 제조된 아세트아미노펜을 처리한 간 독성 마우스 모델의 간 독성을 측정하였으며, 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, 아세트아미노펜을 처리한 마우스에 간 손상이 일어난 것을 확인하였다.
또한, 도 1B에 나타낸 바와 같이, ALT/AST 효소 활성이 아세트아미노펜을 처리한 마우스의 플라즈마(plasma)에서 증가하였으며, 도 1C에 나타낸 바와 같이, 간 손상과 관련한 TNF-a mRNA 발현이 증가하여 아세트아미노펜의 처리에 의해 간 손상이 일어난 것을 확인하였다.
1-2. 장기 독성 세포 모델의 제조
HepG2, Hep3B, Hepa1-6 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM(Eagle's minimal essential medium)/고농도 포도당 배지에서 배양하였고, 상기 세포에 아세트아미노펜(APAP), DGAL, TAA, MTX, FLX 또는 PRX를 공지된 IC50의 양으로 24 시간 동안 처리하였다.
실시예 2. 엑소좀 분리
상기 실시예 1-1의 장기 독성 마우스 모델에서 분리한 혈액 및 상기 실시예 1-2에서 배양한 세포의 배지에서 circulating 엑소좀을 분리하기 위하여 ExoQuick exosome precipitation solution (SBI System Biosciences cat. no. EXOQ50A-1)을 이용하여 제조사에서 제시한 방법대로 circulating 엑소좀을 수득하였다. 수득한 엑소좀을 PBS(phosphate buffered saline)로 2번 세척하여 노란색을 띄는 엑소좀 펠릿(pellet)을 얻었다. 상기 circulating 엑소좀에서 QIAzole (Qiagen)을 이용하여 miRNA를 분리하였다. 상기 실시예 1-1의 장기 독성 마우스 모델에서 분리된 circulating 엑소좀을 관찰하였으며, 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, TEM 이미지와 사이즈 분석을 통해서 대조군과 아세트아미노펜 처리군 모두 100 nm 전후 크기의 circulating 엑소좀이 잘 분리되었음을 확인하였다.
실시예 3. Circulating 엑소좀의 양 측정
상기 실시예 1-1의 간 독성 마우스 모델 및 상기 실시예 1-2의 세포에 각각의 약물을 농도별, 시간별로 처리한 후, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 circulating 엑소좀을 분리하여 circulating 엑소좀의 양의 변화를 확인하였다. 분리된 circulating 엑소좀은 방사선 면역 촉진 분석(radioimmunoprecipitation assay)(RIPA) 완충용액(10 mM Tris·HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100 및 1% 분해효소 저해제 혼합물(Complete Protease Inhibitor Mixture tablets)을 넣은 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate))에 넣어 용해시킨 후 -80℃에 저장하였다. circulating 엑소좀의 양을 측정 하기 위해서, BCA(bicinchoninic acid)법에 의하여 단백질의 양을 분석하였다. 상기 방법으로 측정한 대조군 및 아세트아미노펜 처리군의 circulating 엑소좀의 양 측정 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 아세트아미노펜을 1시간 동안 다양한 농도로 처리했을 때 150 및 300 mg/kg 처리군에서 circulating 엑소좀의 양이 증가하였으며, 특히, 300 mg/kg 처리군에서 혈액 내 ALT가 증가하고 조직병리학적 변화가 나타났으며 간 독성 상태를 보임을 확인하였다. 또한, 도 3C 및 3D에 나타낸 바와 같이, 아세트아미노펜을 3시간 동안 여러 가지 농도로 처리했을 때 저농도인 75 mg/kg 처리군에서 circulating 엑소좀의 양이 증가하였으며, ALT의 경우 75 mg/kg 처리군에서는 크게 변화가 없었으나, 150 및 300 mg/kg 처리군에서는 유의하게 증가함을 확인하였다. 이를 통해 circulating 엑소좀 양을 측정함으로써 간 독성의 초기 진단이 가능함을 확인하였다.
또한, 도 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, HepG2, Hep3B, Hepa1-6 간세포에 아세트아미노펜을 처리하여 간 독성 상태일 때 circulating 엑소좀의 양이 증가하였고, circulating 엑소좀의 개수 또한 증가함을 확인하였으며, 도 4C 및 4D에 나타낸 바와 같이, HepG2 간세포에 아세트아미노펜 처리시 circulating 엑소좀 양이 증가함을 확인하였다. 이를 통해서 세포 모델에서도 circulating 엑소좀 양의 증가 확인을 통해 간 독성의 진단이 가능함을 확인하였다.
다른 간 독성 마우스 모델 및 간 독성 세포 모델에서도 circulating 엑소좀 증가 여부를 확인하기 위해 상기 실시예 1-1에서와 같이 각 마우스에 DGAL (1,000 mg/kg) 또는 TAA (200 mg/kg)를 처리하였으며, 상기 실시예 1-2에서와 같이 각 세포에 DGAL 또는 TAA를 처리하였다. 대조군으로는 간 독성이 없는 안전한 약물인 MTX, FLX 또는 PRX를 처리하였다. 상기 마우스 모델 및 세포 모델에서 circulating 엑소좀의 양, ALT, AST의 수치를 측정하고, 간 조직을 관찰하였으며, 이를 도 5에 나타내었다,
도 5에 나타낸 바와 같이, 간 독성 마우스 모델에서 DGAL 또는 TAA를 처리한 경우 circulating 엑소좀의 양이 증가 하였으며, 혈액 내 ALT 및 AST 또한 증가함을 확인하였다. 또한, 간 독성 세포 모델에서, HepG2, Hep3B 및 Hepa1-6 세포에 DGAL 및 TAA를 처리하여 간 독성 상태일 때 circulating 엑소좀의 양이 증가함을 확인하였다. 반면에, 간 독성 마우스 모델에 간 독성을 일으키지 않는 안전한 약물인 MTX, FLX 및 PRX를 처리한 경우 circulating 엑소좀의 양과 혈액 내 ALT 및 AST 모두 변화가 없었으며, 간 독성 세포 모델에서, HepG2, Hep3B 및 Hepa1-6 세포에 MTX, FLX 및 PRX를 처리한 경우 circulating 엑소좀의 양이 변화하지 않았다. 따라서, circulating 엑소좀의 양이 간 독성 유무를 진단 할 수 있는 마커로 이용 가능함을 확인하였다.
실시예 4. ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 이용한 장기 특이적 독성과 관련된 엑소좀의 단백질 분석
circulating 엑소좀의 장기 특이적 독성과 관련된 단백질을 확인하기 위하여, ELISA 효소면역분석법을 이용하였다. 96 웰 플레이트에 CD63 다클론성항체(polyclonal antibody)를 O/N 으로 방치하여 코팅한 후 각각의 웰을 blocking 용액을 이용하여 blocking 하였다. 여기에 상기 실시예 1의 장기 독성 마우스 혈액에서 분리한 엑소좀을 1ul 넣어 2시간동안 반응시키고 충분히 세척한 후 검출 항체(detection antibody)로 엑소좀의 알부민(Albumin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐(fibrinogen), Kim-1(kidney injury molecule 1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL), 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI), 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI) 및 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)의 양을 측정하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 여러 장기 독성 모델에서 circulating 엑소좀의 양이 증가하였으며, 간 독성 마우스 모델의 circulating 엑소좀에서 알부민(Albumin), 합토글로빈(haptoglobin) 및 피브리노겐(fibrinogen)의 발현이 증가하였고, 신장 독성 마우스 모델의 circulating 엑소좀에서 Kidney injury molecule 1 (Kim-1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL)의 발현이 증가하였고, 심장 독성 마우스 모델의 circulating 엑소좀에서 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI)의 발현이 증가하였고, 근육 독성 마우스 모델의 circulating 엑소좀에서 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI)의 발현이 증가하였으며, 뇌 독성 (파킨스 질병)을 일으킨 모델의 엑소좀에서 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)의 발현이 증가함을 확인하였다.
실시예 5. 엑소좀 마이크로RNA 분석
상기 실시예 1-1의 장기 독성 마우스의 혈액과 circulating 엑소좀에 QIAzole(Qiagen)을 첨가하여 총 RNA을 분리하였다. miRNeasy 프로토콜(Qiagen)에 따라서 실험을 하였으며, 이에 합성 Caenorhabditis elegans(cel)-miR-39를 첨가하였다. miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)를 사용하여 miR-122, miR-192, miR-155, miR-7, miR-146a, miR-208, miR-206의 발현을 확인하였으며, Cel-miR-39를 사용하여 표준화시켰다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 간 독성 모델의 circulating 엑소좀에서 miR-122, 192, 155가 모두 증가함을 확인하였다. 또한, 뇌 독성 모델(파킨스 모델)의 엑소좀에서 miR-7이 감소하였고, 신장 독성 모델의 엑소좀에서 miR-146a이 증가하였고, 심장 독성 모델의 엑소좀에서 miR-208이 감소하였고, 근육 독성 상태의 엑소좀에서 miR-206이 증가함을 확인하였다. 이를 통해 여러 장기 특이적 독성 상태에서 유래된 엑소좀이 장기 특이적 엑소좀 단백질 뿐만 아니라 circulating 엑소좀 miRNA 발현에 영향을 준다는 것을 예측할 수 있었다.
실시예 6. NAC 처리에 의한 간 독성 측정 실험
아세트아미노펜에 의한 간 독성 상태에 NAC를 처리하여 독성을 치료하는 경우 circulating 엑소좀 양의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 간 독성 상태에 NAC 처리시 circulating 엑소좀 양이 감소함을 확인하였다.
또한 아세트아미노펜에 의한 간 독성 상태에 NAC를 처리하여 간 독성을 치료하는 경우 간 특이적 엑소좀 단백질인 알부민, 합토글로빈 및 피브리노겐의 발현 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 간 독성 상태에 NAC 처리시 알부민, 합토글로빈 및 피브리노겐의 발현이 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 간 독성이 치료되는 경우 circulating 엑소좀의 양 뿐만 아니라 간 특이적 엑소좀 단백질 또한 회복됨을 확인하였다.
실시예 7. Quercetin 처리에 의한 신장 독성 측정 실험
시스플라틴(cisplatin)에 의한 신장 독성 상태에 퀘세틴(Quercetin)을 처리하여 독성을 치료하는 경우 circulating 엑소좀 양의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 신장 독성 상태에 퀘세틴 처리시 circulating 엑소좀 양이 감소함을 확인하였다.
또한 아세트아미노펜 및 시스플라틴에 의한 장기 독성 상태에 NAC 및 퀘세틴을 처리하여 장기 독성을 치료하는 경우 circulating 엑소좀의 miR-122, miR-192, miR-155 및 miR-146a의 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, NAC를 처리한 후 circulating 엑소좀에서 miR-122 및 miR-192가 유의적으로 회복되었으며, 퀘세틴을 처리한 후 circulating 엑소좀에서 miR-155 및 miR-146a가 유의적으로 회복됨을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 엑소좀 또는 이의 단백질을 포함하는 장기 독성 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 엑소좀 또는 이의 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 장기 독성 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin) 및 피브리노겐(fibrinogen)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질 발현을 측정하여 간 독성 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 장기 독성 진단용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀에서 Kim-1(kidney injury molecule 1) 또는 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL)의 단백질 발현을 측정하여 신장 독성 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 장기 독성 진단용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀에서 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI)의 단백질 발현을 측정하여 심장 독성 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 장기 독성 진단용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀에서 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI)의 단백질 발현을 측정하여 근육 독성 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 장기 독성 진단용 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀에서 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)의 단백질 발현을 측정하여 뇌 독성 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 장기 독성 진단용 조성물.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 장기 독성 진단용 키트.
  9. (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 엑소좀의 양을 확인하는 단계;를 포함하는 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 정보 제공 방법은
    (c) 상기 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐(fibrinogen), Kim-1(kidney injury molecule 1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL), 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI), 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI) 및 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 엑소좀의 양을 확인하는 방법은 웨스턴블롯팅, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 장기 독성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. (a) 혈액에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 혈액에서 엑소좀의 양을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 엑소좀의 양을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 장기 독성 치료물질의 스크리닝 방법.
  14. (a) 혈액에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 혈액으로부터 분리된 엑소좀에서 알부민(albumin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐(fibrinogen), Kim-1(kidney injury molecule 1), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; NGAL), 심장 트로포닌(Cardiac troponin I; cTnI), 골격근 트로포닌(Skeletal muscle troponin; sTnI) 및 S100 칼슘 결합 단백질(S100 calcium binding protein B; S100B)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 장기 특이적 독성 치료물질의 스크리닝 방법.
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