WO2012008807A2 - ＴＧａｓｅ２ 및 ＶＨＬ의 신장암 진단 마커로서의 용도 - Google Patents

ＴＧａｓｅ２ 및 ＶＨＬ의 신장암 진단 마커로서의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2012008807A2
WO2012008807A2 PCT/KR2011/005249 KR2011005249W WO2012008807A2 WO 2012008807 A2 WO2012008807 A2 WO 2012008807A2 KR 2011005249 W KR2011005249 W KR 2011005249W WO 2012008807 A2 WO2012008807 A2 WO 2012008807A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tgase2
vhl
level
protein
expression
Prior art date
Application number
PCT/KR2011/005249
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2012008807A3 (ko
Inventor
김수열
홍경만
Original Assignee
국립암센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립암센터 filed Critical 국립암센터
Publication of WO2012008807A2 publication Critical patent/WO2012008807A2/ko
Publication of WO2012008807A3 publication Critical patent/WO2012008807A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the use of TGase2 and VHL as a diagnostic marker for renal cancer, and more particularly, the present invention is for diagnosing renal cancer comprising an agent measuring the level of one or more of TGase2 (Transglutaminase 2) and VHL (Von Hippel-Lindau).
  • TGase2 Transglutaminase 2
  • VHL Von Hippel-Lindau
  • a composition, a kit for diagnosing kidney cancer comprising the composition, and a method for diagnosing kidney cancer using the composition or kit.
  • Kidney cancer is a renal cell carcinoma that occurs mostly in the parenchyma of the kidneys (the part of the kidney where the cells that make urine are composed of the medulla and the cortex).
  • Kidney cancer has little symptoms when the tumor is small, and symptoms do not appear until the tumor is large enough to push the organs. Therefore, the diagnosis is often delayed, so when the first diagnosis, about 30% of the patients are already metastasized. The most common symptom is hematuria, but this only occurs in 60% of patients. Rather, depending on the metastases, symptoms such as difficulty breathing, coughing, and headache appear, which causes kidney cancer to be diagnosed in 30% of patients. Kidney cancers can cause high blood pressure, hypercalcemia, and liver dysfunction, especially due to certain hormones produced by cancer cells. In recent years, however, many patients have been diagnosed without any symptoms and accidentally found on imaging tests. These cases are mainly found early, so the treatment results are relatively good.
  • Kidney cancer accounts for about 3% of adult cancers in the United States, with approximately 32,000 new cases per year. It is estimated that about 12,000 people die from kidney cancer, and the frequency is increasing every year worldwide.
  • Kidney cancer is common in people in their 40's and 60's, and according to the age-specific incidence (2002 Central Cancer Registration Data), 60's are the most common (479, 30.2%), 50's (412, 26.0%), 40's. (268 people, 16.9%).
  • It is a main object of the present invention to provide a composition for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the level of at least one of TGase2 and VHL.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing kidney cancer comprising the composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing kidney cancer using the composition or kit.
  • kidney cancer By using the composition and kit for diagnosing kidney cancer of the present invention, kidney cancer can be diagnosed early, and thus will be widely used for the prevention and treatment of safer and more effective kidney cancer.
  • FIG. 1 to 5 are photographs showing that HIF-1 ⁇ expression is reduced by TGase2 knockdown and VHL expression is inversely related to TGase2 expression in normal and cancer cell lines.
  • FIG. 1 HIF-1 ⁇ expression was inhibited by TGase2 knockdown in cancer cells.
  • TGase2 was inhibited by treatment with TGase2 specific siRNA, and then the level of HIF-1 ⁇ was analyzed by immunoblot.
  • VEGF expression in cancer cells was inhibited by TGase2 knockdown using TGase2-specific siRNA.
  • VEGF levels were analyzed by RT-PCR. GAPDH mRNA levels were measured as controls.
  • HEK293 and MCF7 cells were transfected stepwise for 24 hours with an expression vector of TGase2 or TGase2 C277S mutant and with or without cystamine for 24 hours (CTM; 0.5 mM). Cytoplasmic fractions of cells were recovered and analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies. (FIG. 4) Expression of ectopic VHL and TGase2 in HEK-293 and MCF7 cells. Cells were concurrently infected with the expression plasmids presented for 24 hours, and with or without cystamine for 24 hours (CTM; 0.5 mM).
  • TGase2 and VHL levels were analyzed via immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies.
  • FIG. 5 Ectopically expressed VHL was down regulated by dose dependent overexpression of ectopic TGase2. The cells were simultaneously infected with the VHL expression vector and the amount of TGase2 expression vector increased for 48 hours. Cell extracts were prepared and analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and VHL antibodies.
  • FIG. 6-8 are photographs showing that direct physical interaction of TGase2 and VHL results in TGase2-VHL polymer formation and proteasome-dependent degradation.
  • TGase2 induces the accumulation of degraded VHL monomers in the proteasome.
  • Cells were transfected with the plasmids presented for 24 hours, and various inhibitors (calpeptin, calpein inhibitor, 50 ⁇ M; leupeptin, lysosomal inhibitor, 50 ⁇ M; MG 132, proteasome inhibitor, 5 ⁇ M) for 12 hours before recovery. Treated and untreated.
  • TGase2 and VHL levels were analyzed by immunoblot using anti-TGase2 and anti-HA antibodies. (FIG.
  • VHL interacts with TGase2, and this interaction is further increased in the presence of proteasome inhibitors.
  • Cells were simultaneously infected with the indicated expression plasmids for 24 hours, followed by or without MG132 (5 mM) for 12 hours.
  • Whole cell extracts were analyzed by immunoprecipitation using anti-HA antibodies and then immunoblot using anti-TGase2 and anti-VHL antibodies.
  • Simultaneous immunoblot analysis of whole cell extracts with anti-TGase2 and anti-HA antibodies showed that TGase2 and VHL were stably expressed in a proteosome dependent method.
  • FIG. 8 TGase2-VHL complex undergoes proteosome-dependent degradation.
  • VHL was immunoprecipitated from whole cell extracts with anti-HA antibody (5 times more cell lysate than FIG. 7) and immune complexes were analyzed by immunoblot with anti-TGase2 and anti-VHL antibodies.
  • FIG. 9-12 are graphs and photographs showing that expression of ectopic VHL with inhibition of TGase2 inhibits NF- ⁇ B activity and reduces IGF1R- ⁇ levels.
  • FIG. 9 NF- ⁇ B activity was decreased by ectopic expression of VHL and inhibition of TGase2.
  • Cells were transfected with the indicated expression vectors for 24 hours and either with or without cystamine (CTM; 0.5 mM) (right panel) or TGase2-specific siRNA (left panel). The culture medium was recovered and NF- ⁇ B transcriptional activity was measured using SEAP reporter assay. Results are expressed as base error (SEM) of the mean ⁇ 3 sets of experimental means (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 10 Nuclear extracts of the cells described in FIG.
  • FIG. 11 Cell death was analyzed by annexin V / propidium iodide staining (PI) and immunoblot of cleaved caspase 3 and PARP. Cells were transfected with VHL expressing plasmids and TGase2-specific-siRNA. Annexin V / PI staining was determined by flow cytometry. The percentage of cells recovered in the quadrant corresponding to early and late cell death was shown (top panel). Whole cell extracts were analyzed by immunoblot using anti-cleaved caspase-3, anti-PARP and anti- ⁇ -actin antibodies. (FIG.
  • TGase2 restored VHL protein levels and downregulated endogenous IGF1R- ⁇ protein levels.
  • Cells were transfected with the indicated plasmids for 24 hours, and then treated or untreated with cystamine (CTM; 0.5 mM) for 24 hours before recovery (left panel).
  • CTM cystamine
  • TGase2-specific siRNA using reversible infection, followed by 24 hours transfection with the indicated expression plasmids (right panel).
  • Whole cell extracts were analyzed by immunoblot with anti-TGase2, anti-IGF1R- ⁇ and anti-VHL antibodies.
  • FIG. 13-16 are schematic diagrams, photos, and graphs showing that overexpression of TGase2 induces inhibition of VHL and activity of IGF1R- ⁇ and NF- ⁇ B in the body.
  • FIG. 13 Schematic diagram of the TGase2-pCAGGS genomic construct used to generate TGase2 transgenic mouse species.
  • FIG. 14 Potential founder mice to which the TGase2 transplant gene was introduced by PCR were identified.
  • FIG. 15 After perfusion, frozen tissues derived from wild-type and TGase2 transgenic mice were homogenized and TGase2, VHL and IGF1R- ⁇ levels were then used with anti-TGase2, anti-VHL and anti-IGF1R- ⁇ antibodies.
  • FIG. 16 Tissues were prepared as described in (FIG. 13) and nuclear extracts were analyzed by EMSA using a 32P-labeled NF- ⁇ B probe. NF- ⁇ B DNA binding activity was quantified using a density analyzer. Results are shown as SEM of mean ⁇ three set samples (p ⁇ 0.05).
  • FIG 17 is a photograph showing that TGase2 and VHL expression is inversely related in human RCC carcinoma samples.
  • TGase2 and VHL expression were inversely related.
  • VHL expression was low or absent (A and B).
  • C and D the expression of TGase2 was relatively high (C and D).
  • E, arrow invasive progenitor cells
  • F, arrow the expression of VHL was relatively low or absent
  • TGase2 is an I- ⁇ B ⁇ (Kim, DS, Park, SS, Nam, BH, Kim, IH & Kim, SY Reversal of drug resistance in breast cancer cells by transglutaminase 2 inhibition and nuclear factor-kappaB inactivation. Cancer Res 66, 10936-43 (2006)) and reduction of VHL induce or expand the activity of NF- ⁇ B. It is a well known major inhibitor of NF- ⁇ B, and VHL is a tumor inhibitor that modulates HIF-1 ⁇ and IGF-1R. Reduction of I- ⁇ B ⁇ and VHL increases resistance to survival, growth, migration, drug resistance and apoptosis in cancer cells.
  • FIG. 19 is a photograph showing that the expression level of ectopic VHL is restored by suppressing TGase2 expression by cystamine or TGase2-specific siRNA in TGase2 overexpressed NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cells.
  • Cells were transfected with TGase-2 specific siRNA and the plasmid for 48 hours (A. right panel), or transfected with the plasmid with or without cystamine for 24 hours prior to cell recovery ( B. Left panel). Overexpression of VHL was confirmed by immunoblot analysis using anti-VHL antibodies.
  • FIGS. 20 and 21 are micrographs showing that localization of ectopic VHL is regulated by inhibition of expression of TGase2 gene in NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cancer cells.
  • Cells were transfected with TGase2-specific siRNA and the plasmid using reversible infection for 24 hours. The cells were harvested and then reinoculated on two chamber slides for 16 hours. The cells were immunochemically analyzed using anti-HA primary antibody and fluorescence coupled anti-mouse immunoglobulin secondary antibody to detect VHL. Staining pattern shows nuclear-cytoplasmic distribution of VHL. Cells were counterstained with 4 ', 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) to visualize nuclei. Scale bar represents 20 micrometers.
  • DAPI 6-diamino-2-phenylindole
  • FIG. 22 is an electrophoretic photograph showing that TGase2 induces polymerization of VHL in a dose dependent manner in vitro.
  • Purified recombinant VHL was polymerized in guinea pig liver TGase2 under in vitro conditions.
  • VHL polymers were separated by SDS-PAGE and visualized by Coomassie blue staining (left panel) or analyzed by immunoblot method with anti-VHL antibody (right panel).
  • Fig. 23 is a chart showing the mass spectrometry results of peptides obtained by sequential proteolysis of VHL monomers, dimers and polymers.
  • Purified recombinant VHL was polymerized in vitro using TGase2.
  • Multimeric VHL complexes were separated by SDS-PAGE and visualized by Coomassie Blue staining. Numbered bands were collected, reduced and digested with trypsin. The mass of peptides was determined using MALDI-TOF MS.
  • FIG. 24 shows the results of analyzing purified VHL monomers and polymers using MS to identify crosslinking sites in VHL, as amino acid sequences of VHL monomers and polymers, and red letters indicate residues identified by MS. Blue letters on the VHL polymer indicate residues blocked after polymerization.
  • the analytical results indicate that glutamines 164 and 203 are involved in TGase2-induced VHL polymerization.
  • 25 is a Western blot showing that TGase2 and VHL expression is inversely related in human RCC carcinoma samples.
  • the present invention provides a composition for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the level of one or more of TGase2 and VHL from a sample.
  • TGase2 Transglutaminse 2
  • TGase2 Transglutaminase 2
  • EC 2.3.2.13 protein-glutamine ⁇ rglutamyltransferase
  • N ⁇ - ( ⁇ -L-glutamyl) -L-lysine crosslinks are known to form protective barrier function, cell death, extracellular matrix in stabilizing epithelial cells and to stabilize proteins present in and outside of cells.
  • TGase2 is normally expressed at low levels in various tissues and is abnormally activated in various pathological conditions. In particular, levels of TGase2 are known to increase in inflammatory diseases.
  • VHL von Hippel-Lindau
  • TGase2 downregulates VHL.
  • the term "agent for measuring the level of TGase2" refers to an agent for directly or indirectly measuring the level of TGase2 in a sample for diagnosing renal cancer.
  • a primer capable of specifically binding to the TGase2 gene Probes or antisense oligonucleotides.
  • the agent may be an antibody that specifically binds to TGase2 protein.
  • the term "agent for measuring the level of VHL” refers to an agent for directly or indirectly measuring the level of VHL in a sample for diagnosing renal cancer.
  • the antibody specifically binds to VHL. to be.
  • the antibody can measure the level of a VHL or VHL-TGase2 polymer.
  • primer is a single chain oligonucleotide, generally consisting of 15 to 30 bases. Primers are commonly synthesized but can also be used on naturally occurring polynucletide.
  • the sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but only if it is sufficiently complementary to hybridize with the template.
  • the position or primer binding site of the primer refers to the target DNA fragment to which the primer hybridizes.
  • the primer used in the amplification step of the present invention is a primer for the TGase2 gene, can be easily designed by those skilled in the art by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases, which is capable of specific binding with mRNA. You can check the presence. Probes may be made in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. In the present invention, hybridization may be performed using a probe complementary to the marker polynucleotide of the present invention to diagnose kidney cancer through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
  • Antisense oligonucleotides, primers or probes of the invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoro Amidate, carbamate, and the like) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker of the present invention, and the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and has a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or an antigen binding property. If part of it is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included.
  • the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • Antibodies used in the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the functional fragment of an antibody molecule means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • the level of TGase2 is increased in the kidney cancer tissue and vice versa.
  • Western blot was performed in normal kidney cells and various kidney cancer cell lines, and unlike normal kidney cells, TGase2 was increased and VHL was decreased in all kidney cancer cells (FIG. 25). It was also confirmed that TGase2 mediates cross-linking between VHL, reducing monomers of VHL protein and forming polymers of VHL protein (FIGS. 6-8). Therefore, it can be seen that by measuring the level of TGase2 or VHL can be used to diagnose kidney cancer.
  • the present invention relates to a kit for diagnosing kidney cancer comprising an agent for measuring the level of one or more of TGase2 and VHL.
  • the kit of the present invention can confirm the mRNA level or protein level of the TGase2 gene, or diagnose the kidney cancer by checking the level of VHL.
  • the kit for diagnosing kidney cancer of the present invention is a primer, a probe, or an antibody that selectively recognizes a marker for measuring the level of TGase2 specifically expressed in the diagnosis of kidney cancer, as well as one or more other components suitable for analytical methods.
  • Compositions, solutions or devices can be included. It may also be a kit that additionally includes an antibody, composition, solution or device for measuring the level of the VHL protein.
  • the kit for measuring the mRNA level of the TGase2 gene in the present invention may be a kit containing an essential element for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, DNase, RNase inhibitors, in addition to each primer pair specific for the gene. , DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the kit of the present invention may be a kit for detecting a kidney cancer specific gene diagnosis including essential elements necessary for performing a microarray chip.
  • the microarray chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
  • the microarray chip of the present invention may be a kit for diagnosing kidney cancer comprising a DNA microarray chip for diagnosing kidney cancer, in which an oligonucleotide or a complementary strand molecule corresponding to 10 or more genes or fragments thereof selected from is integrated. have.
  • the oligonucleotide or complementary strand molecule thereof may comprise 18 to 30 nucleic acids of the gene, preferably 20 to 25 nucleic acids.
  • the microarray chip of the present invention can be easily produced by a manufacturing method commonly used in the art using the genes specifically expressed in the kidney cancer of the present invention.
  • a micropipetting method or a pin using a piezoelectric method is used to immobilize the detected marker gene as a probe DNA molecule on a substrate of a DNA chip. It is preferable to use a method using a spotter of the form, but is not limited thereto.
  • the substrate of the microarray chip is preferably coated with an active group selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine, and aldehyde, but is not limited thereto.
  • the substrate is preferably selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon film, and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto.
  • the kit for measuring protein levels in the present invention may include a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a coloring enzyme or a fluorescent substance, and a coloring substrate for the immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like.
  • the chromophore may be a peroxidase or an alkaline force.
  • Fatase alkaline phosphatase
  • the fluorescent material may be used FITC, RITC and the like
  • the colorant substrate is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur Phonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) can be used.
  • the present invention provides a method of preparing a test sample comprising (a) measuring and comparing one or more levels of TGase2 and VHL, respectively, from a test sample of a patient and a control sample of a normal; And (b) if the TGase2 level of the test group is significantly increased than that of the control group or if the VHL level of the test group is significantly lower than that of the control group, it is determined that kidney cancer is developed from the patient.
  • the present invention provides a method for diagnosing the onset of kidney cancer, including determining that kidney cancer does not develop from the patient.
  • Determination of the level of VHL includes determining the level of a monomer of the VHL protein or a polymer of the VHL protein.
  • the present invention can treat TGase2 and VHL antibodies in a sample and compare the degree of response to diagnose whether the individual with the target sample develops kidney cancer.
  • sample includes samples such as whole blood, plasma, blood, saliva, urine sputum, lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, and intercellular fluid having different levels of TGase2 and VHL in cancer tissues of an individual, and whether or not cells divide. It will not be restrict
  • the method for diagnosing the renal cancer of the present invention can compare the reaction level of the antigen-antibody reaction after treatment with the anti-TGase2 and VHL antibodies in the control group and the experimental group as described above. It refers to the amount of the protein antigen in combination with the antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention that recognizes it, and the amount of the antigen-antibody complex.
  • the response levels of these antigen-antibodies can be compared using, without limitation, measurement methods commonly used in the art.
  • the response levels of these antigen-antibodies can be compared using, without limitation, measurement methods commonly used in the art.
  • antigen-antibody response levels include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and Ouchterlony immunodiffusion.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • Rocket immunoelectrophoresis tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, aggregation and protein chip, but are not limited thereto.
  • antigen-antibody complex means a combination of a marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formed can be measured quantitatively through the size of a signal of a detection label. Do.
  • ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support
  • Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies.
  • a labeled antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex is enzymatically developed or labeled for an antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex. It can be detected by the sandwich ELISA method which attaches the secondary antibody thus enzymatically and colors it. By confirming the degree of complexation of the marker protein with the antibody, it is possible to diagnose the presence of renal cancer.
  • Western blot using one or more antibodies to the marker can be used.
  • the whole protein is isolated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody.
  • the amount of the generated antigen-antibody complex can be confirmed by using a labeled antibody to confirm the amount of the protein produced by the expression of the gene, thereby confirming the presence of kidney cancer.
  • the detection method consists of comparing the expression levels of the TGase2 and VHL proteins in the kidney cancer patients with the expression levels of the protein in the normal control group. Protein levels can be expressed as absolute (eg ⁇ g / ml) or relative (eg relative intensity of signals) differences of the marker proteins described above.
  • immunohistostaining with one or more antibodies to the marker can be performed.
  • paraffin embedding blocks are prepared by methods well known in the art. These are cut into slices of several ⁇ m thickness, adhered to glass slides, and reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. The unreacted antibody is then washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels to read whether or not the antibody is labeled on a microscope.
  • a protein chip in which one or more antibodies against the marker are arranged at a predetermined position on the substrate and immobilized at high density may be used.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, Diagnose the development of kidney cancer.
  • Lipofectamine RNAiMAX including Lipofectamine 2000, Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent, and Stealth Negative Control, was purchased from Invitrogen, Calpeptin (Calbiochem), Leupeptin (USA, MO, St. Louis, Sigma-Aldrich). Co), MG132 (Calbiochem) and FITC-hybrid anti-mouse immunoglobulin (US, Pennsylvania, West Grove, Jackson Immunology Laboratory) were purchased commercially.
  • SiRNA double strands targeting human TGase2 (5′-AAGAGCGAGAUGAUCUGGAACTT-3 ′: SEQ ID NO: 1) were introduced into cells using lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Cells were harvested 48 hours post infection and cytoplasmic fractions or whole cell extracts were prepared for immunoblot analysis. As a negative control, cells were incubated with lipofectamine RNAiMAX alone and with a universal negative siRNA (Invitrogen).
  • Immunoblot analysis was performed according to standardized methods (Kim, DS, Park, SS, Nam, BH, Kim, IH & Kim, SY Cancer Res 66 , 10936-43 (2006)).
  • a double stranded oligonucleotide probe (5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 ': SEQ ID NO: 2) containing an NF-kB DNA binding site was purchased from Santa Cruz Biotech. EMSA analysis was performed according to the manufacturer's protocol.
  • Annexin V binding was performed using the Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (CA, Mountain View, BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions.
  • the mouse transglutaminase 2 gene was inserted into the native EcoRI-BglII site of pCAGGS comprising human CMV enhancer, chicken ⁇ -actin promoter-intron and rabbit ⁇ -globin polyadenylation sequence.
  • the 5.8 kb DNA fragment product was cut and prepared following the basic method for pronuclei DNA injection.
  • TGase2 transgene was selected by PCR analysis of genomic DNA extracted from a 1 cm tail clip. PCR was performed using the following primers.
  • Transglutaminase 2 transgene and wild type allele were obtained with 334 basepairs (pb) and 3,056 bp, respectively. In this way, we identified four founder mice with gene copies of the TGase2 transgene.
  • Sections were reacted for 1 hour at room temperature with anti-TGase2 and anti-VHL primary antibodies in 0.05% TBS-T with 20% FBS. After washing TBS-T, the sections were sequentially reacted with a primary antibody amplifier and then reacted with horseradish peroxidase (HRP) polymers for 30 minutes each. After TBS-T washing, slides were counterstained using DAB and Mayer's hematoxylin (DakoCytomation).
  • HRP horseradish peroxidase
  • HA-VHL was visualized by immunochemistry and phase contrast microscopy.
  • Cells were seeded in a 2-well slide chamber in the presence of TGase2 specific siRNA, or in the presence of universal negative siRNA the day before transfection as a control.
  • Cells were transfected with a control empty vector (mock) or HA-VHL expression vector for 24 hours and then washed with PBS (Phosphate buffered saline). Immunchemistry was performed according to standard protocols.
  • VHL cDNA was subcloned into modified pET32 (Novagen) using BamHI / XhoI restriction enzymes, 23-residue polyhistidine tag (MHHHHHHGSLVPRSENLYFQGS, 6xHis) at the amino terminus of VHL, and 10-residue polyhistidine tag at the carboxy terminus (LEHHHHHH, 8 ⁇ His) was added.
  • Recombinant VHL was purified by established protocol after overexpression in E. coli strain Rosetta 2 (DE3) (Novagen).
  • guinea pig liver TGase2 (5 ⁇ l, U / mL) to 30 ⁇ l of reaction buffer (50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 15 mM CaCl 2 ) containing purified human VHL (5 ⁇ g). It reacted at 2 degreeC. Proteins were separated by SDS-PAGE and visualized by Coomassie Blue staining or analyzed by immunoblot.
  • TGase2 expression plays a key role in obtaining drug resistance of cancer cells.
  • HIF-1 ⁇ was increased in drug-resistant cancer cells under normal oxygen conditions (FIG. 1).
  • Knockdown of the TGase2 gene reduced the expression level of endogenous HIF-1 ⁇ protein in dose dependently in NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cells (FIG. 1).
  • Expression levels of VHL in NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 breast cancer cells were lower than in HEK-293 and MCF7 cells (FIG. 2), and endogenous VHL levels in cancer cell lines were inversely related to TGase2 (FIG. 2). ).
  • Endogenous VHL was inhibited by ectopic TGase2 expression in HEK293 and MCF7 breast cancer cells, and this reduction was either by inhibition of TGase2 with cystamine or by expression of catalytically inactivated TGase2 variant (C277S). It was reversed by inhibition of TGAse2 (FIG. 3). Levels of ectopic VHL were reduced by co-expression of TGase2, and this effect was lost by inhibition of TGase2 using expression of cystamine or catalytically inactivated TGase2 C277S (FIG. 4). These results indicate that cross-linking catalytic activity of TGase2 is a major cause of VHL reduction.
  • the present invention confirmed the inhibitory effect of endogenous TGase2 activity on VHL protein levels.
  • NCI / ADR-RES and MDA-MB-231 cells expressing high levels of TGase2 were transiently transfected with HA-VHL expression vectors with TGase2-specific siRNA or cystamine.
  • Levels of ectopic HA-VHL increased in response to TGase2 inhibition by cystamine or gene knockdown, compared to control cells expressing only HA-VHL without treatment with TGase2-specific siRNA or cystamine (FIG. 19). It is consistent with the result of FIG. 6.
  • proteolytic inhibitors proteasome inhibitors, lysosomes
  • Inhibitors calpine inhibitors
  • Decreased VHL monomer by TGase2 was inhibited by proteasome inhibitor MG132 treatment, but not by calpain or lysosomal inhibitors (FIG. 6).
  • VHL-TGase2 polymer was easily detected and the expression level of the polymer was increased in the cells treated with MG132.
  • TGase2 included in the polymer was also detected in anti-HA precipitation, indicating that TGase2 acts as a substrate for polymerization with the ability to catalyze polymerization with VHL (FIG. 8).
  • VHL is a substrate of TGase2
  • purified recombinant human VHL was reacted in vitro with purified guinea pig liver TGase.
  • TGase2 induced the polymerization of VHL in a dose dependent manner (FIG. 22). Recovery by high molecular weight gel fraction (arrow head in FIG.
  • FIG. 24 shows amino acid sequences of VHL monomers and polymers, red letters represent residues identified by MS and blue letters (in VHL polymer) represent residues blocked after polymerization.
  • NF- ⁇ B activity has been reported to be downregulated by VHL.
  • NF- ⁇ B activity was reduced by Tgase2 inhibition in VHL expressed cells.
  • NF- ⁇ B activity in HA-VHL expressing cells treated with TGase2-specific siRNA or Tgase2 inhibitor cystamine was lower than in HA-VHL-only untreated cells (respectively, 2 times and 2.5 times) (FIG. 9).
  • SEAP reporter assay we performed an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) to assess NF- ⁇ B DNA binding activity.
  • ESA electrophoretic mobility shift assay
  • Apoptosis was induced more efficiently in HA-VHL expressing cells treated with TGase2-specific siRNA compared to cells treated with siRNA alone, measured by relative levels of annexin-V positive staining and cleaved PARP (FIG. 9).
  • VHL inhibits the expression of IGF-1R.
  • TGase2 inhibition by cystamine or gene knockdown results in the stability of ectopic VHL, which is associated with reduced IGF-1R levels in drug resistant cancer cell lines (FIG. 12). Indicates that IGF-1R protein expression is essential.
  • TGase2 + transgenic mice into which the mouse TGase2 + transplant gene was introduced (FIGS. 13 and 14).
  • the kidneys of TGase2 + transgenic mice showed no histological abnormalities and the appearance was normal.
  • Analysis of VHL protein levels in the kidneys of three different wild-type and TGase2 + transgenic mice by immunoblot showed lower levels of VHL expression in TGase2 + transgenic mice than wild type mice (FIG. 15).
  • VHL and TGase2 protein in HEK293 cell line which is normal kidney cell
  • 786-O, A498, ACHN, CAKI-1, SN12C, TK10, and U031 cell lines which were normal kidney cells
  • TGase2 was increased and VHL was decreased in all kidney cancer cells (FIG. 25).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 TGase2(Transglutaminase 2) 및 VHL(Von Hippel-Lindau) 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 신장암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신장암 진단용 조성물 및 키트를 이용하면, 신장암을 조기에 진단할 수 있으므로, 보다 안전하고 효과적인 신장암의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＴＧａｓｅ２ 및 ＶＨＬ의 신장암 진단 마커로서의 용도
본 발명은 TGase2 및 VHL의 신장암 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 TGase2(Transglutaminase 2) 및 VHL(Von Hippel-Lindau) 중 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 신장암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
신장암은 대부분 신장의 실질(신장에서 소변을 만드는 세포들이 모여 있는 부분으로 수질과 피질로 구성됨)에서 발생하는 신장세포 암을 말한다.
신장암은 종양의 크기가 작을 때는 증상이 거의 없으며, 종양이 어느 정도 커져서 장기를 밀어낼 정도가 되어야 비로소 증상이 나타난다. 따라서 진단이 늦어지는 경우가 많아 처음 진단될 때 환자의 30% 정도는 이미 전이된 상태로 나타나게 된다. 가장 흔한 증상은 혈뇨(hematuria)이지만 이것도 환자의 60%에서만 나타난다. 오히려 전이된 부위에 따라 호흡곤란, 기침, 두통 등의 증상이 나타나 이러한 전이 증상 때문에 신장암을 진단하게 되는 경우도 전체 환자의 30%에 이른다. 신장암은 특별히 암세포가 생산하는 특정 호르몬 때문에 고혈압, 고칼슘혈증, 간기능 이상 등을 일으킬 수 있기 때문에 이런 다른 증상을 검사하던 중 종양이 발견되는 경우도 있다. 그러나 최근에는 아무 증상 없이 건강진단을 받던 중 우연히 영상검사상에서 발견되는 경우가 많은데, 이런 경우는 주로 초기에 발견되기 때문에 치료 결과가 비교적 좋다.
신장암은 미국에서는 성인암의 약 3%를 차지하여, 연간 약 32,000명 정도의 새로운 환자가 발생하고 있다. 또한 약 12,000명 정도가 신장암으로 인해 사망하는 것으로 추정되고 있으며 전 세계적으로 매년 그 발생빈도가 증가하고 있다.
우리나라에서는 이보다는 발생 빈도가 낮아 2002년 중앙암등록 자료에 따르면 1,578명의 환자가 새로 등록되어 전체 암 발생의 1.6%를 차지하고 있다. 특히 남성이 여성에 비해 2배 정도 많이 발생하는데, 2002년의 경우 남성에게서 1,104명의 환자가 발생하여 남성암의 장기별 등록분율 2.0%를 나타내며, 발생빈도에 있어서 열번째로 많이 발생하는 암으로 기록되어 있다.
신장암은 40대~60대에서 흔히 발생하여, 연령별 발생현황(2002년 중앙암등록자료)을 보면 60대가 가장 흔하며(479명, 30.2%), 50대(412명, 26.0%), 40대(268명, 16.9%)의 순으로 많이 발생한다.
따라서 신장암의 조기 진단을 위한 마커의 개발은 중요한 과제라고 할 수 있다.
이러한 배경하에서 본 발명자들은 신장암에서 TGase2 가 과발현되고, 과발현된 TGase2가 VHL의 중합체 형성을 매개함으로써 VHL을 하향조절한다는 것을 발견하였으므로, 이로부터 시료로에서 TGase2와 VHL의 수준을 확인함으로써 신장암의 발병여부를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 신장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 신장암 진단용 조성물 및 키트를 이용하면, 신장암을 조기에 진단할 수 있으므로, 보다 안전하고 효과적인 신장암의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1 내지 5는 정상 및 암세포주에서, HIF-1α 발현이 TGase2 녹다운에 의해 감소하고, VHL의 발현이 TGase2 발현과 반비례 관계에 있음을 나타내는 사진이다. (도 1) HIF-1α 발현은 암세포에서 TGase2 녹다운에 의해 억제되었다. TGase2를 TGase2 특이적 siRNA의 처리에 의하여 억제시킨 다음, HIF-1α의 수준을 면역블롯으로 분석하였다. 암세포에서 VEGF 발현을 TGase2-특이적 siRNA를 이용한 TGase2 녹다운에 의해 억제하였다. VEGF 수준을 RT-PCR로 분석하였다. GAPDH mRNA 수준을 대조군으로 측정하였다. (도 2) 내생적 VHL의 발현은 TGase2가 과발현된 난소 암종 및 유방암세포에서 감소하였다. HEK293, MCF7, NCI/ADR-RES, 및 MDA-MB-231 세포의 세포질 분획을 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 사용하여 면역블롯으로 분석하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 분석하였다. (도 3) 내생적 VHL 단백질 수준은 TGase2의 과발현에 의해 하향 조절되었고, TGase2 억제제 처리 또는 TGase2 돌연변이체(C277S)의 발현에 의해 회복되었다. HEK293 및 MCF7 세포를 TGase2의 발현 벡터 또는 TGase2 C277S 돌연변이체로 24시간 동안 단계적으로 형질감염 시켰고, 시스타민을 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다(CTM; 0.5mM). 세포의 세포질 분획을 회수하고 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. (도 4) HEK-293 및 MCF7 세포에서 이소성 VHL 및 TGase2의 발현을 나타낸다. 세포를 24시간 동안 제시한 발현 플라스미드로 동시 감염시키고, 시스타민을 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다(CTM; 0.5mM). TGase2 및 VHL수준을 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 사용한 면역블롯을 통해 분석하였다. (도 5) 이소성으로 발현된 VHL은 이소성 TGase2의 용량 의존적 과발현에 의해 하향 조절되었다. 세포를 VHL발현 벡터로 동시 감염시켰고, TGase2 발현 벡터의 양은 48시간 동안 증가하였다. 세포 추출물을 준비하였고, 항-TGase2 및 VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 6 내지 8은 TGase2 및 VHL의 직접적인 물리적 상호작용이 TGase2-VHL 중합체 형성 및 프로테아좀-의존적 분해를 일으킴을 나타내는 사진이다. (도 6)TGase2는 프로테아좀 내에서 분해된 VHL 단량체의 집적을 유도한다. 세포를 24시간 동안 제시한 플라스미드로 형질감염 시키고, 회수하기 전에 12시간 동안 다양한 억제제(칼펩틴, 칼페인 억제제, 50μM; 류펩틴, 리소좀 억제제, 50μM; MG 132, 프로테아좀 억제제, 5μM)를 처리한 것과 처리하지 않은 것으로 구분하였다. TGase2 및 VHL수준을 항-TGase2 및 항-HA 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다. (도 7) VHL은 TGase2와 상호작용하고, 이러한 상호작용은 프로테아좀 억제제의 존재시 더욱 증가하였다. 세포를 지시한 발현 플라스미드로 24시간 동시 감염시켰고, 그 후 12시간 동안 MG132(5mM)를 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포 추출물을 항-HA 항체를 이용하여 면역 침전으로 분석하였고, 그 후 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다. 항-TGase2 및 항-HA 항체를 이용한 전체 세포 추출물의 동시적 면역 블롯 분석은 TGase2 및 VHL이 프로테오좀 의존적인 방법으로 안정적으로 발현되는 것을 나타내었다. (도 8) TGase2-VHL 복합체는 프로테오좀-의존적인 분해가 일어난다. 세포를 지시한 발현벡터로 24시간 동시 감염시키고, MG132(5mM)를 12시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포추출물로부터 VHL을 항-HA 항체(도 7보다 5배 더 많은 세포 용해물) 이용하여 면역 침전하였고, 면역 복합체를 항-TGase2 및 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 9 내지 12는 TGase2의 억제와 함께 이소성 VHL의 발현이 NF-κB 활성을 억제시키고 IGF1R-β 수준을 감소시킨다는 것을 나타내는 그래프 및 사진이다. (도 9)NF-κB 활성은 VHL의 이소성 발현 및 TGase2의 억제에 의해 감소하였다. 세포를 지시된 발현벡터로 24시간 형질 감염시킨 후 24시간 동안 시스타민(CTM; 0.5mM)을(오른쪽 패널) 또는 TGase2-특이적 siRNA를(왼쪽 패널) 처리하거나 처리하지 않았다. 배양 배지를 회수하고, NF-κB 전사활성을 SEAP 리포터 분석을 이용하여 측정하였다. 결과는 평균 ± 3 세트 실험 평균의 기본 오차(SEM)로 나타내었다(p<0.05). (도 10) (도 9)에서 설명한 세포의 핵 추출물을 32P-표지된 NF-kB 프로브를 이용한 EMSA방법으로 분석하였다. (도 11) annexin V/프로피디움 아이오다이드 염색(PI) 및 절단된 카스파아제 3 및 PARP의 면역 블롯에 의해 세포 사멸을 분석하였다. 세포를 VHL 발현 플라스미드 및 TGase2-특이적-siRNA로 형질감염시켰다. Annexin Ⅴ/PI 염색을 유세포 분석으로 측정하였다. 초기 및 후기 세포사멸과 대응하여 사분면 내의 회수된 세포의 백분율을 나타내었다(위쪽 패널). 전체 세포 추출물을 항-절단 카스파아제-3, 항-PARP 및 항-β-액틴 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다. (도 12) TGase2의 억제는 VHL 단백질 수준을 회복시켰고, 내생적 IGF1R-β 단백질 수준을 하향조절하였다. 세포를 지시한 플라스미드로 24시간 형질감염 하였고, 그 후 회수하기 전에 24시간 동안 시스타민(CTM; 0.5 mM)을 처리하거나 처리하지 않았다(왼쪽 패널). 대안적으로, 세포를 가역적 감염을 이용하여 TGase2-특이적 siRNA로 24시간 형질감염시켰고, 그 후 지시한 발현 플라스미드로 24시간 형질감염시켰다(오른쪽 패널). 전체 세포 추출물을 항-TGase2, 항-IGF1R-β 및 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯으로 분석하였다.
도 13 내지 16은 TGase2의 과발현이 체내 VHL의 억제 및 IGF1R-β 및 NF-κB의 활성을 유도하는 것을 나타내는 개략도, 사진 및 그래프이다. (도 13) TGase2 형질전환 마우스종을 생성하는데 사용한 TGase2-pCAGGS 게놈 구조체의 모식도를 나타낸다. (도 14) PCR에 의하여 TGase2 이식 유전자가 도입된 잠재적인 파운더 마우스를 확인하였다. (도 15) 관류 후에, 야생형 및 TGase2 형질전환 마우마우스로부터 유래한 동결 조직을 균질화하였고, 그 후 TGase2, VHL 및 IGF1R-β 수준을 항-TGase2, 항-VHL 및 항-IGF1R-β 항체를 이용한 면역블롯으로 상대적으로 검출하였다. (도 16) 조직은 (도 13)에서 설명한 바와 같이 준비하였고, 핵 추출물을 32P-표지된 NF-κB 프로브를 이용한 EMSA로 분석하였다. NF-κB DNA결합 활성을 밀도계측기를 이용하여 정량화하였다. 결과는 평균 ± 세 세트 샘플의 SEM으로 나타내었다(p<0.05).
도 17은 TGase2 및 VHL발현이 인간 RCC암종 시료에서 반비례 관계에 있음을 나타내는 사진이다. 11개의 RCC 세포 암종 샘플 중 9개에서 TGase2 및 VHL 발현이 반비례 관계에 있었다. TGase2의 발현이 높은 샘플의 경우, VHL 발현은 낮거나 없었다(A 및 B). TGase2의 발현이 낮은 샘플의 경우, VHL의 발현은 상대적으로 높았다(C 및 D). 침습성 전반 세포(E, 화살표)에서 TGase2의 발현은 높은 반면, VHL의 발현은 상대적으로 낮거나 없었으며(F, 화살표), 이는 TGase2 및 VHL발현의 반비례 관계를 나타내는 추가적인 증거로 제공된다. 모든 이미지 증폭 비율은 100X이다.
도 18은 NF-κB 활성에서 VHL 및 TGase2의 역할을 위해 제시된 모델을 나타내는 개략도이다. TGase2는 중합 및 단백질 분해에 의한 I-κBα(Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Reversal of drug resistance in breast cancer cells by transglutaminase 2 inhibition and nuclear factor-kappaB inactivation. Cancer Res 66, 10936-43 (2006)) 및 VHL의 감소를 통해 NF-κB의 활성을 유도되거나 확장한다. NF-κB의 잘 알려진 주요 억제제이며, VHL은 HIF-1α 및 IGF-1R을 조절하는 종양 억제제이다. I-κBα 및 VHL의 감소는 암세포에서 생존, 성장, 이동, 약물 내성 및 세포사멸의 저항을 증가시킨다.
도 19는 TGase2가 과발현된 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에서 시스타민 또는 TGase2-특이적 siRNA에 의한 TGase2 발현억제에 의하여 이소성 VHL의 발현 수준이 회복됨을 나타내는 사진이다. 세포를 48시간동안 TGase-2 특이적 siRNA 및 상기 플라스미드로 형질감염시키거나(A. 오른쪽 패널), 또는 세포회수 이전에 24시간 동안 시스타민을 처리하거나 처리하지 않고, 상기 플라스미드로 형질감염시켰다(B. 왼쪽 패널). VHL의 과발현을 항-VHL 항체를 이용한 면역 블롯 분석법으로 확인하였다.
도 20 및 21은 이소성 VHL의 국소화는 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 암세포에서 TGase2 유전자의 발현억제에 의해 조절됨을 나타내는 현미경사진이다. 세포를 24시간 동안 가역적 감염을 이용한 TGase2-특이적 siRNA 및 상기 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 회수한 다음, 이를 2개의 챔버 슬라이드에 16시간동안 재접종 하였다. 세포를 항-HA 일차항체 및 형광이 결합된 항-마우스 면역글로불린 이차 항체를 이용하여 면역화학적으로 분석함으로써, VHL를 검출하였다. 염색패턴은 VHL의 핵-세포질 분포를 나타낸다. 세포는 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 대비염색하여 핵을 가시화하였다. 스케일바는 20㎛를 나타낸다.
도 22는 TGase2가 in vitro 조건에서 용량 의존적으로 VHL의 중합을 유도함을 나타내는 전기영동사진이다. 정제된 재조합 VHL을 기니아 피그 간 TGase2를 이용하여 in vitro 조건에서 중합하였다. VHL 중합체를 SDS-PAGE로 분리하고, 쿠마시 블루 염색으로 가시화하거나(왼쪽 패널), 또는 항-VHL 항체를 이용한 면역블롯방법으로 분석하였다(오른쪽 패널).
도 23은 VHL의 단량체, 이량체 및 중합체의 순차적인 단백질분해에 의해 얻어진 펩타이드의 질량분석결과를 나타내는 도표이다. 정제된 재조합 VHL을 TGase2를 이용하여 in vitro 조건에서 중합하였다. 다중체성 VHL 복합체를 SDS-PAGE로 분리하고, 쿠마시 블루 염색으로 가시화하였다. 번호가 할당된 밴드를 수집하고, 환원시킨 다음, 트립신을 이용하여 분해하였다. 펩타이드의 질량은 MALDI-TOF MS를 사용하여 결정하였다.
도 24는 VHL에서 교차결합 부위를 규명하기 위해, 정제된 VHL 단량체 및 중합체를 MS를 이용하여 분석한 결과를 VHL 단량체 및 중합체의 아미노산 서열로서 나타낸 것으로서, 붉은색 문자는 MS에 의해 확인된 잔기를 나타내며, VHL 중합체에 표시된 파란색 문자는 중합 후 차단된 잔기를 나타낸다. 상기 분석결과는 164 및 203번 글루타민이 TGase2-유도 VHL 중합에 관여함을 나타낸다.
도 25는 TGase2 및 VHL발현이 인간 RCC 암종 시료에서 반비례 관계에 있음을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 시료로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "TGase2(Transglutaminse 2)"는 트란스글루타미나제 2(E.C. 2.3.2.13, protein-glutamine γrglutamyltransferase)로서 라이신과 글루타민 사이에서 Nε-(γ-L-glutamyl)-L-lysine 아이소펩타이드 결합 형성을 촉진하는 Ca2+ 의존성 효소를 의미한다. Nε-(γ-L-glutamyl)-L-lysine 교차결합은 상피세포에서의 방어벽 기능, 세포 소멸, 세포외기질을 형성하며 세포 내 및 세포 외에 존재하는 단백질을 안정화시키는 것으로 알려져 있다. TGase2는 다양한 조직에서 정상적으로 낮은 수치로 발현되며 여러 가지 병리적인 상태에서 비정상적으로 활성화된다. 특히, TGase2의 수준은 염증질환에서 증가하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "VHL(von Hippel-Lindau)"는 종양 억제 단백질로 유비퀴틴-리가제 복합체의 일부이며, 폴리-유비퀴틴화 및 단백질 분해(proteosomal degradation)를 통해 HIF-1α를 하향조절하는 단백질을 의미한다. 상기 VHL은 p53의 전사활성을 통하여 세포사멸을 증대시키고, 세포 주기를 억제함으로써, 암억제자로서의 기능을 수행한다. 아울러, 신장암 세포에서 VHL은 c-FLIP, 서바이빈, c-IAP-1, c-IAP-2와 같은 NF-κB 타겟 항-세포사멸 유전자를 억제함으로써 NF-κB를 하향조절한다. 또한, 본 발명에서는 TGase2가 VHL을 하향조절한다는 것을 최초로 규명하였다.
본 발명의 용어, "TGase2의 수준을 측정하는 제제"는 신장암을 진단하기 위하여 시료에서의 TGase2의 수준을 직접 또는 간접적으로 측정하는 제제를 의미하는데, TGase2 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물일 수 있다. 또한, 상기 제제는 TGase2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명의 용어, "VHL의 수준을 측정하는 제제"는 신장암을 진단하기 위하여 시료에서의 VHL의 수준을 직접 또는 간접적으로 측정하는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 VHL에 특이적으로 결합하는 항체이다. 상기 항체는 VHL 또는 VHL-TGase2 중합체의 수준을 측정 할 수 있다.
본 발명의 용어, "프라이머"는 일반적으로 15개에서 30개의 염기로 구성된 단일 사슬의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)이다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 폴리뉴클레오티드(polynucletide)에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다. 바람직하게 본 발명의 증폭단계에서 사용되는 프라이머는 TGase2 유전자에 대한 프라이머로서, 공지된 방법에 의해 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 면역조직화학 염색법에 의하여 정상 신장 조직과 신장암 조직에서 TGase2 및VHL의 수준을 확인해 본 결과 신장암 조직에서 TGase2의 수준이 증가되어 있으며 역으로 VHL의 수준이 감소되어 있음을 확인하였으며(도 17), 정상 신장 세포 및 다양한 신장암 세포주에서 웨스턴 블랏을 실시한 결과 정상 신장 세포와는 달리 신장암 세포에서는 모두 TGase2 가 증가하고 VHL 이 감소한 것을 확인하였다 (도 25). 또한 TGase2가 VHL간의 교차 결합을 매개하여, VHL 단백질의 단량체를 감소시키고 VHL 단백질의 중합체를 형성시킴을 확인하였다(도 6 내지 도 8). 따라서 TGase2 또는 VHL의 수준을 측정함으로써 신장암 진단에 활용할 수 있음을 알 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 TGase2 유전자의 mRNA 수준 또는 단백질의 수준을 확인하거나, VHL의 수준을 확인하여 신장암을 진단할 수 있다. 본 발명의 신장암 진단용 키트는 신장암 진단에 특이적으로 발현되는 TGase2의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 또한 VHL 단백질의 수준을 측정하기 위한 항체, 조성물, 용액 또는 장치가 추가적으로 포함된 키트일 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 TGase2 유전자의 mRNA 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필수한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오디트(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 신장암 특이적 유전자 진단 검출용 키트일 수 있다. 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이 칩은 에서 선택된 10개 이상의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 신장암 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 신장암 진단용 키트일 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이 칩은 본 발명의 신장암 특이적으로 발현되는 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 표지 유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 단백질 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 환자의 시료인 실험군 및 정상인의 시료인 대조군으로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 수준을 각각 측정하고, 상호 비교하는 단계; 및 (b) 상기 실험군의 TGase2 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소할 경우에는 상기 환자로부터 신장암이 발병된 것으로 판정하고, 그렇지 않은 경우에는 상기 환자로부터 신장암이 발병하지 않은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 신장암의 발병여부를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 VHL의 수준의 측정은 VHL 단백질의 단량체 또는 VHL 단백질의 중합체의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 바람직하게 본 발명은 TGase2 및 VHL 항체를 시료에 처리하여, 그 반응 정도를 비교 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체의 신장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료'란 개체의 암 조직에서 TGase2 및 VHL의 수준이 차이가 나는 전혈, 혈장, 혈액, 타액, 뇨 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료등을 포함하며, 세포 분열 여부를 검출할 수 있는 세포를 포함하는 시료이면 제한되지 않는다.
본 발명의 신장암의 발병여부를 진단하는 방법은 상기와 같은 대조군 및 실험군에 항 TGase2 및 VHL 항체를 처리한 후 항원-항체 반응의 반응 수준을 비교할 수 있는데 본 발명에서 항원-항체 반응 수준이란 시료 중의 상기 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하며, 항원-항체 복합체의 양이다. 이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있다. 항원-항체 반응수준 측정방법의 예로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
단백질 수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장암의 발병 유무를 진단할 수 있다.
또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장암 발병 유무를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 신장암 발병 환자에서 TGase2 및 VHL 단백질의 발현량과 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현량을 비교하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도)차이로 나타낼 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시할 수 있다. 신장암 발병 의심 개체의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장암의 발병 유무를 진단할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
실시예 1: 항체 및 시약
항-VHL 항체는 BD Pharmingen(미국, CA, 산디에고)에서, 항-TGase2 항체는 NeoMarkers(미국, CA, 프레몬트, 클론 CUB 7402)에서, 항-β-액틴은 Abcam(영국, 캠브리지, 헤드쿼터)에서, 항-IGF1R-β 및 항-HA-프로브(F7) 항체는 Santa cruz Biotechnology(미국, CA, 산타크루즈)에서, 항-PARP 및 항-절단 카스파아제-3(Asp175) 항체는 Cell Signaling Technologies(미국, MA, Beverly)에서 각각 구입하였다. 리포펙타민 2000, 리포펙타민 RNAiMAX 트랜스펙션 시약 및 Stealth Negative 대조군을 포함한 리포펙타민 RNAiMAX를 Invitrogen에서 구입하였고, 칼펩틴(칼바이오켐), 류펩틴(미국, MO, 성 루이스, Sigma-Aldrich Co), MG132(칼바이오켐) 및 FITC-혼성 항-마우스 면역글로불린(미국, 펜실베니아, 웨스트 그로브, 잭슨 면역 연구실)을 상업적으로 구입하였다.
실시예 2: siRNA(small interfering RNA) 처리에 의한 TGase2의 억제(silencing)
인간 TGase2를 타겟팅하는 siRNA 이중가닥(5'-AAGAGCGAGAUGAUCUGGAACTT-3':서열번호 1)을 리포펙타민 RNAiMAX(인비트로젠)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포에 도입하였다. 세포를 감염 후 48시간 째 회수하고, 세포질 분획 또는 전체 세포 추출물을 면역블롯 분석을 위해 준비하였다. 음성 대조군으로, 세포를 리포펙타민 RNAiMAX 단독 및 일반적(universal)인 음성 siRNA(인비트로젠)와 함께 배양하였다.
실시예 3: 면역블롯팅(Immunoblotting)
표준적으로 정립된 방법(Kim, D.S., Park, S.S., Nam, B.H., Kim, I.H. & Kim, S.Y. Cancer Res 66, 10936-43 (2006))에 따라 면역블롯 분석을 수행하였다.
실시예 4: 전기영동상 변화 분석법(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)
NF-kB DNA 결합 사이트를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오디드 프로브(5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3':서열번호 2)를 Santa Cruz 생명공학사로부터 구입하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 EMSA 분석을 수행하였다.
실시예 5: 세포사멸 분석
Annexin V결합에 의한 세포사멸 분석을 Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트(미국, CA, Mountain View, BD Biosciences)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
실시예 6: TGase2+ 형질전환 마우스의 제조
인간 CMV 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터-인트론 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열을 포함하는 pCAGGS의 고유의 EcoRI-BglII 부위에 마우스 트랜스글루타미나아제 2 유전자를 삽입하였다. 5.8 kb의 DNA 단편 산물을 절단하고, 전핵(pronuclei) DNA 주입을 위한 기본적인 방법을 따라 준비하였다. 1 ㎝ 테일 클립(tail clip)으로부터 추출한 게놈 DNA의 PCR 분석을 통해 TGase2 이식 유전자(transgene)를 선별하였다. PCR은 하기의 프라이머를 이용하여 수행하였다.
5'-CAC CCT TCG TGT TTG CCG AGG TCA-3'(서열번호 3)
5'-TCT CCG AGG TGT CGT TGC CGA TGT-3'(서열번호 4)
트란스글루타미나아제 2 이식유전자 및 야생형 대립유전자를 각각 334 염기쌍(basepair, pb) 및 3,056bp로 얻었다. 이러한 방식으로, 본 발명자는 TGase2 이식유전자의 유전자 카피를 가지는 네 가지 파운더 마우스를 확인하였다.
실시예 7: 인간 RCC 시료에서 TGase2 및 VHL의 면역화학염색
일산 백병원(대한민국, 고양)에서 외과적 수술에 의해 얻은 11개의 신장 암 시료를 병리학과 기록으로부터 선별하였다. 기록된 조직의 이용은 윤리협회 및 임상시험심사위원회의 승인받았다(IRB number: 1B-2-1003-010). 면역화학염색을 Ultravision LP 검출 키트 및 DAB를 이용하여 수행하였다(미국, CA, Lab Vision Corporation Fremont). 파라핀화된 인간 RCC 조직을 염색하였다. 조직 섹션을 자일렌에 디파라핀화하였고, 항원회복을 1mM EDTA가 포함된 pH 9.0의 10mM 트리스 버퍼에서 샘플을 121℃에서 15분간 열처리하였다. 섹션을 95% 에탄올에서 고정하였고, 0.3% 과산화수소를 처리하고 울트라 V를 15분간 조사하여 고정하였다. 섹션을 20% FBS 가 포함된 0.05% TBS-T에서 항-TGase2 및 항-VHL 일차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 반응하였다. TBS-T를 세척 후, 섹션을 일차항체 증폭자로 순차적으로 반응 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase;HRP) 고분자로 각각 30분 반응하였다. TBS-T 세척 후, 슬라이드를 DAB 및 Mayer's 헤마톡실린를 이용하여 대조염색하였다(덴마크, DakoCytomation).
실시예 8: 면역화학
HA-VHL은 면역화학 및 위상차 현미경에 의해 가시화하였다. 세포를 TGase2 특이적 siRNA의 존재하에, 또는 대조군으로서 형질감염 하루 전날 일반적인(universal) 음성 siRNA 존재하에 2-웰 슬라이드 챔버에 접종하였다. 세포를 대조군 빈 벡터(mock) 또는 HA-VHL 발현 벡터로 24시간 동안 형질감염 시킨 후 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척하였다. 면역화학을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예 9: 인간 VHL의 발현 및 정제
인간 VHL cDNA를 BamHⅠ/XhoⅠ제한효소를 이용하여 변형된 pET32(Novagen)내로 서브클로닝하고, VHL의 아미노 말단에 23-잔기 폴리히스티딘 태그(MHHHHHHGSLVPRSENLYFQGS, 6xHis)를, 카복시말단에 10-잔기 폴리히스티딘 태그(LEHHHHHHHH, 8xHis)를 첨가하였다. 재조합 VHL을 대장균 균주 Rosetta 2 (DE3)(Novagen)에서 과발현 후 확립된 프로토콜에 의해 정제하였다.
실시예 10: 기니아 피그 간 TGase2에 의한 VHL의 중합
기니아 피그 간 TGase2(5㎕, U/㎖)를 정제된 인간 VHL(5 ㎍)이 포함된 반응 버퍼(50 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl, 15 mM CaCl2) 30㎕에 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화하거나 면역블롯으로 분석하였다.
실험결과
실험예 1: VHL 및 TGase2의 반비례 관계
본 발명자는 이전의 연구에서, TGase2 발현의 증가가 암세포의 약물 내성 획득에 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. 특히 HIF-1α는 정상 산소조건에서 약물 내성 암 세포에서 증가하였다(도 1). TGase2 유전자의 녹다운은 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에서 용량 의존적으로 내생적 HIF-1α 단백질의 발현 수준을 감소시켰다(도 1). NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서 VHL의 발현수준은 HEK-293 및 MCF7 세포에서보다 낮았고(도 2), 암세포주에서 내생적 VHL 수준은 TGase2와 반비례 관계에 있었다(도 2). 내생적 VHL은 HEK293 및 MCF7 유방암세포에서 이소성(ectopic) TGase2 발현에 의해 억제되었으며, 이러한 감소는 시스타민을 이용한 TGase2의 억제에 의해, 또는 촉매적으로 불활성화된 TGase2 변이체(C277S)의 발현을 이용한 TGAse2의 억제에 의해 역전되었다(도 3). 이소성 VHL의 수준은 TGase2의 동시발현에 의하여 감소하였으며, 이러한 효과는 시스타민 또는 촉매적으로 불활성화된 TGase2 C277S의 발현을 이용한 TGase2의 억제에 의해 사라졌다(도 4). 이러한 결과는 TGase2의 교차 연결 촉매 활성이 VHL 감소의 주요한 원인이 됨을 나타낸다.
실험예 2: 암세포에서 TGase 억제에 의한 VHL의 안정성 증가
TGase2 억제제가 VHL 안정성 조절에 의해 VHL의 수준을 증가시키는지 알아보기 위해, 본 발명에서는 VHL 단백질 수준에서 내생적 TGase2 활성의 억제 효과를 확인하였다. TGase2가 높은 수준으로 발현된 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포에 TGase2-특이적인 siRNA 또는 시스타민과 함께 HA-VHL 발현 벡터를 일과적으로(transiently) 형질 감염시켰다. 이소성 HA-VHL 의 수준은 TGase2 특이적 siRNA 또는 시스타민으로 처리되지 않고 HA-VHL 만 발현된 대조군 세포와 비교하여, 시스타민 또는 유전자 녹다운에 의한 TGase2 억제에 반응하여 증가하였다(도 19), 이는 도 6의 결과와 일치한다. 항-HA 단클론 항체를 이용하여 HA-VHL-형질감염 NCI/ADR-RES 및 MDA-MB-231 세포의 면역세포화학 염색을 수행한 결과, VHL이 핵에 편재되어 있는 것으로 나타났다. 이와 비교하여, TGase2-특이적 siRNA 로 동시-형질감염된 세포는 HA-VHL의 세포질 및 핵 부위에 나타났다(도 20 및 21). 따라서, TGase2는 TGase2가 가장 많은 세포질 내에서 VHL를 표적으로 하는 것으로 븐석되었다.
실험예 3: VHL 중합체의 프로테아좀 의존적 분해(proteasome-dependent degradation)
TGase2-촉매화된 교차 연결을 통해 생성된 VHL 중합체가 대사적으로 분해되는 지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 VHL 분해를 억제하는 능력을 위한 세 가지 서로 다른 단백질 가수분해 억제제(프로테아좀 억제제, 리소좀 억제제, 칼페인 억제제)를 실험하였다. TGase2에 의한 VHL단량체의 감소는 프로테아좀 억제제 MG132 처리에 의해 억제되었으나, 칼페인(calpain) 또는 리소좀(lysosomal) 억제제에 의해서는 억제되지 않았다(도 6). TGase2 와 VHL이 직접적으로 상호작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 MG132와 함께 또는 MG132없이, HA-VHL 및 TGase2 의 발현 벡터와 공동 형질감염시켰으며, 면역블롯 분석을 위한 항-HA 항체를 이용하여 면역침전시켰다(도 7). TGase2를 VHL 침전물 내에서 검출하였고, 침전된 VHL의 양은 MG132 처리에 의해 증가하였다(도 7). 이러한 결과는 VHL이 TGase2와 상호작용하며 형성된 VHL-TGase2 중합체가 프로테아좀-의존적 기전을 통해 분해된다는 것을 의미하는 것으로 분석되었다(도 6).
상기 VHL-TGase2 중합체는 쉽게 검출되었으며, MG132 를 처리한 세포에서 중합체의 발현 수준이 증가하였다. 또한, 상기 중합체에 포함된 TGase2 역시 항-HA 침전내에서 검출되었으며, 이는 TGase2가 VHL과의 중합을 촉매하는 기능과 더불어 중합의 기질로서 작용함을 나타낸다(도 8). VHL이 TGase2의 기질임을 확인하기 위하여, 정제된 재조합 인간 VHL을 정제된 기니아 피그 간 TGase와 함께 체외에서(in vitro) 반응시켰다. TGase2는 용량 의존적으로 VHL의 중합을 유도하였다(도 22). 고 분자량 겔 분획(도 22의 화살표 머리)회수 및 MS/MS에 의한 분석으로 VHL이 중합된 단백질 복합체의 주요 구성요소임을 확인하였다(도 23). VHL의 교차연결 부위를 규명하기 위해, 분석된 겔을 MS에 의해 VHL 단량체 및 중합체로 정제하였다. 도 24은 VHL 단량체 및 중합체의 아미노산 서열을 나타내며, 붉은색 문자는 MS에 의해 확인된 잔기를 나타내고, 파란색 문자는(VHL 중합체 내) 중합 후 차단되는 잔기를 나타낸다. 이러한 결과는 164 및 203번 글루타민이 TGase2-유도 VHL 중합화와 관련있다는 것을 나타낸다(도 24).
실험예 4: TGase 억제에 의한 VHL 발현 회복이 NF-κB 활성 억제를 유도함
NF-κB의 활성은 VHL에 의해 하향조절되는 것으로 보고되었다. NF-κB 활성은 VHL이 발현된 세포내에서 Tgase2 억제에 의해 감소하였다. 도 9 내지 도 12에서 보는 바와 같이, TGase2-특이적 siRNA 또는 Tgase2 억제자 시스타민을 처리한 HA-VHL 발현 세포에서 NF-κB 활성은 HA-VHL 만 발현된 비처치 세포에서보다 낮았다(각각, 2배 및 2.5배)(도 9). SEAP 리포터 분석과 동시에, 본 발명자들은 NF-κB DNA 결합 활성을 평가하기 위하여 전기 동력 이동 측정(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)을 수행하였다. 이소성 VHL 단독 발현 또는 TGase2 억제와 함께 발현된 NF-κB DNA 결합 활성을 감소시켰다(도 10). 세포사멸은 siRNA 단독으로 처리한 세포와 비교하여 TGase2-특이적 siRNA와 함께 처리된 HA-VHL 발현 세포에서 보다 효율적으로 유도되었으며, annexin-Ⅴ 양성 염색 및 절단된 PARP의 상대적 수준으로 측정하였다(도 9).
기존 보고에서 VHL은 IGF-1R의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 시스타민 또는 유전자 녹다운에 의한 TGase2 억제는 이소성 VHL의 안정성을 가져오고, 이는 약물 내성 암 세포주에서 감소된 IGF-1R 수준과 관련되어 있다(도 12).이러한 결과는 TGase2에 의한 VHL의 하향 조절이 IGF-1R단백질 발현의 필수적임을 나타낸다.
실험예 5: TGase2+ 형질전환 마우스에서 VHL의 하향조절
생체 내에서 VHL 및 TGase2 와의 관계를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 TGase2+ 이식 유전자가 도입된 TGase2+ 형질전환 마우스를 제조하였다(도 13 및 14). TGase2+ 형질전환 마우스의 신장은 어떠한 조직학적 이상도 보이지 않았으며, 외형도 정상이었다. 면역블롯을 통하여 서로 다른 세가지 야생형 및 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장에서 VHL 단백질 수준을 분석한 결과 야생형 마우스보다 TGase2+ 형질전환 마우스에서 VHL 발현 수준이 더 낮은 것으로 나타났다(도 15). TGase2+ 과발현에 의한 VHL감소가 IGF-1R 단백질 수준에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항-IGF-1R 항체를 이용한 면역블롯을 통하여 야생형 및 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장 샘플을 분석하였다. IGF-1R 단백질 수준은 예상대로 야생형 마우스보다 TGase2+ 형질전환 마우스에서 더 높게 발현되었다(도 15). EMSA에 의한 NF-κB DNA 결합 활성의 분석결과, NF-κB 활성이 야생형 마우스와 비교하여 TGase2+ 형질전환 마우스에서 거의 3배 증가하였다(도 16). 그러므로, VHL 수준은 야생형 마우스와 비교하여 TGase2+ 형질전환 마우스의 신장에서 감소하였으며, 이것은 IGF-1R의 높은 발현수준과 관련이 있다. 이러한 결과는 TGase2+는 VHL을 억제하며, 이로써 생체내에서 NF-κB 활성 및 IGF-1R의 발현이 유도됨을 나타낸다.
실험예 6: 인간 신장 세포 암종 시료에서 TGase2+ 및 VHL 단백질 수준의 반비례 관계
암세포주와 형질전환 TGase2+ 마우스모델에서의 실험결과의 유효성을 확인하기 위해, 즉 TGase2+ 및 VHL 발현의 반비례 관계를 확인하기 위해, 본 발명자들은 면역화학분석으로 인간신장세포 암종(Renal clear cell carcinoma) 조직시료에서 VHL 및 TGase2의 발현 수준을 확인하였다(도 17). 정상 신장 조직에서는, TGase2가 사구체 세포에 존재하였고, 세뇨관 세포에 상대적으로 낮게 존재한 반면 VHL은 신세뇨관 세포에서 발현이 제한되었다. RCC 암종 조직에서, TGase2의 발현 수준은 일반적으로 증가하였고, VHL 의 발현은 감소하였다. 11개의 인간 RCC 암종 중 9개에서 TGase2 및 VHL 수준간에 반비례 관계를 나타내었다. 도 17의 A-D에서 보는 바와 같이, 6번 암에서 거의 완전한 역관계를 나타내었고, 3번 암에서는 TGase2 및 VHL의 양성 발현 영역에서 군데군데 나타났다. 일반적으로, TGase2의 발현이 높은 샘플의 경우, VHL의 발현은 낮거나 없었다(도 17의 A 및 B). TGase2의 발현이 낮은 샘플의 경우, VHL의 발현수준은 높았다(도 17의 C 및 D). 침습성 전반 세포(invasive front cell)에서, TGase2 발현은 암의 잔여 부분보다 높았으며(도 17의 E), VHL의 발현은 낮거나 없었다(도 17의 F).
또한, 정상 신장세포인 HEK293 세포주, 그리고 신장암 세포인 786-O, A498, ACHN, CAKI-1, SN12C, TK10 및 U031 세포주에서 VHL 및 TGase2 단백질의 발현 여부를 웨스턴 블랏을 통해 측정한 결과, 정상 신장 세포와는 달리 신장암 세포에서는 모두 TGase2 가 증가하고 VHL 이 감소한 것을 확인하였다 (도 25).
이러한 결과는 TGase2 및 VHL 발현 간의 역관계를 추가적으로 증명하는 것이다.

Claims (12)

  1. 시료로부터 TGase2(Transglutaminase 2) 및 VHL(Von Hippel-Lindau) 중 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TGase2의 수준을 측정하는 제제는 TGase2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TGase2의 수준을 측정하는 제제는 TGase2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 VHL의 수준을 측정하는 제제는 VHL 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 신장암 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 단백질 칩을 포함하는 것인 키트.
  7. (a) 환자의 시료인 실험군 및 정상인의 시료인 대조군으로부터 TGase2 및 VHL 중 하나 이상의 수준을 각각 측정하고, 상호 비교하는 단계; 및
    (b) 상기 실험군의 TGase2 수준이 대조군의 것보다 유의하게 증가하거나 또는 상기 실험군의 VHL 수준이 대조군의 것보다 유의하게 감소할 경우에는 상기 환자로부터 신장암이 발병된 것으로 판정하고, 그렇지 않은 경우에는 상기 환자로부터 신장암이 발병하지 않은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 신장암의 발병여부를 진단하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 TGase2의 수준 측정은 TGase2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 TGase2의 수준 측정은 TGase2 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 TGase2의 수준 측정은 TGase2에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 수행되는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 VHL의 수준 측정은 VHL 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 VHL의 수준 측정은 VHL에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 수행되는 것인 방법.
PCT/KR2011/005249 2010-07-15 2011-07-15 ＴＧａｓｅ２ 및 ＶＨＬ의 신장암 진단 마커로서의 용도 WO2012008807A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2010-0068558 2010-07-15
KR1020100068558A KR101267580B1 (ko) 2010-07-15 2010-07-15 신장암 진단 마커로서의 트란스글루타미나제2 및 이를 이용한 신장암 진단 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2012008807A2 true WO2012008807A2 (ko) 2012-01-19
WO2012008807A3 WO2012008807A3 (ko) 2012-05-18

Family

ID=45469964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2011/005249 WO2012008807A2 (ko) 2010-07-15 2011-07-15 ＴＧａｓｅ２ 및 ＶＨＬ의 신장암 진단 마커로서의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101267580B1 (ko)
WO (1) WO2012008807A2 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101456696B1 (ko) * 2012-11-02 2014-11-04 국립암센터 ＴＧａｓｅ2 및 ｐ53을 이용한 신장암 항암제 스크리닝 방법
US11243206B2 (en) 2016-09-28 2022-02-08 The Catholic University Of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation Gender-specific markers for diagnosing prognosis and determining treatment strategy for renal cancer patients
KR102061814B1 (ko) 2016-09-28 2020-01-03 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 성별 특이적 마커
KR20190017465A (ko) 2017-08-11 2019-02-20 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 예후 진단용 마커
KR20190030833A (ko) 2017-09-15 2019-03-25 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 연령 특이적 마커
KR20190067570A (ko) 2017-12-07 2019-06-17 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 병리등급 특이적 마커
KR102084658B1 (ko) 2018-06-27 2020-03-05 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 전이 특이적 마커
KR20200104106A (ko) 2019-02-26 2020-09-03 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 치료 전략 결정 및 예후 진단용 재발 특이적 마커
KR20210096799A (ko) 2020-01-29 2021-08-06 가톨릭대학교 산학협력단 연령에 따른 신장암의 예후 진단용 조성물 및 키트
KR20210096801A (ko) 2020-01-29 2021-08-06 가톨릭대학교 산학협력단 종양형태에 따른 신장암의 예후 진단용 조성물 및 키트
KR20210096800A (ko) 2020-01-29 2021-08-06 가톨릭대학교 산학협력단 성별에 따른 신장암의 예후 진단용 조성물 및 키트
KR20210096798A (ko) 2020-01-29 2021-08-06 가톨릭대학교 산학협력단 신장암의 예후 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
KR20210105134A (ko) 2020-02-18 2021-08-26 가톨릭대학교 산학협력단 유두형 신장암의 재발 및 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도
KR20210107561A (ko) 2020-02-24 2021-09-01 가톨릭대학교 산학협력단 유두형 신장암의 병리학적 병기 진단용 바이오 마커 및 이의 용도
KR102674212B1 (ko) 2021-03-16 2024-06-11 (주)엠디바이오팜 트랜스글루타미나제-2 활성 억제용 신규 화합물 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR20210040921A (ko) 2021-04-06 2021-04-14 가톨릭대학교 산학협력단 신장암 환자의 치료 전략 결정 및 예후 진단용 재발 특이적 마커

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANG, J. H. ET AL.: 'Transglutaminase 2 expression levels regulate sensitivity to cystamine plus TRAIL-mediated apoptosis' CANCER LETT. vol. 287, no. 2., 28 January 2010, pages 224 - 230 *
LINEHAN, W. M. ET AL.: 'Molecular diagnosis and therapy of kidney cancer' ANNU. REV. MED. vol. 61, February 2010, pages 329 - 343 *
NICKERSON, M. L. ET AL.: 'Improved identification ofvon Hippel-Lindau gene alterations in clear cell renal tumors' CLIN. CANCER RES. vol. 14, no. 15, 01 August 2008, pages 4726 - 4734 *
WYKOFF, C. C. ET AL.: 'Identification of novel hypoxia dependent and independent target genes of the von Hippel-Lindau (VHL) tumour suppressor by mRNA differential expression profiling' ONCOGENE vol. 19, no. 54, 14 December 2000, pages 6297 - 6305 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012008807A3 (ko) 2012-05-18
KR20120007826A (ko) 2012-01-25
KR101267580B1 (ko) 2013-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2012008807A2 (ko) ＴＧａｓｅ２ 및 ＶＨＬ의 신장암 진단 마커로서의 용도
WO2017222221A1 (ko) 포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물
KR20150001287A (ko) 췌장염 진단용 바이오 마커 조성물
US9102706B2 (en) Newly identified colon cancer marker and diagnostic kit using the same
US9075066B2 (en) CST1, DCC1, IFITM1 or MELK as markers for diagnosing stomach cancer
KR101333207B1 (ko) 자궁내막증과 연관된 유전자 마커 및 이의 용도
WO2011081421A9 (en) Complement c9 as markers for the diagnosis of cancer
US8206896B2 (en) Detection of uterine leiomyosarcoma using LMP2
WO2022250465A1 (ko) 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도
KR101270761B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 트랜스알돌라아제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
KR101358810B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 ｉｇｆｂｐ-5, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
WO2021025412A1 (ko) 보체 성분 c8 감마를 이용한 알츠하이머병의 진단방법
WO2009131366A2 (ko) 위암 또는 대장암 진단 마커 및 치료제로서의 ｃdca5
WO2013096852A1 (en) Biomarkers of cancer
WO2023177206A1 (ko) 췌장암의 진단용 조성물
KR20120028748A (ko) Ｍｃｍ７ 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커
KR102416607B1 (ko) 방사선 저항성 지표 단백질 및 이의 검출방법
WO2024117803A1 (ko) 췌장암의 예후 예측을 위한 새로운 바이오 마커
KR101232228B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 포스포글리세레이트 키나제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
KR20090111298A (ko) 위암 또는 대장암 진단 마커 및 치료제로서의 ｃｄｃａ５
KR101245110B1 (ko) Ｈｍｇ１７ 유전자 또는 그 발현 단백질, 또는 상기 유전자 발현 감소에 의해 조절되는 단백질을 포함하는 세포증식 감수성 마커
WO2012144871A2 (ko) 단백질의 위치 변화 확인을 통한 신경교종의 진단 및 치료 방법
WO2012011778A2 (ko) 암 진단 키트 및 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2012008806A2 (ko) ＴＧａｓｅ２와 ＶＨＬ을 이용한 ＴＧａｓｅ２ 억제제 또는 촉진제를 스크리닝하는 방법
KR101179651B1 (ko) 피부 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 ｎｑｏ-1 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11807092

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11807092

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2