KR20090111298A

KR20090111298A - 위암 또는 대장암 진단 마커 및 치료제로서의 ｃｄｃａ５

Info

Publication number: KR20090111298A
Application number: KR1020090034841A
Authority: KR
Inventors: 이희구; 염영일; 윤효란; 김재화; 송은영; 김종태; 김영호; 전호경; 정경숙; 원미선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-21
Publication date: 2009-10-26
Also published as: KR101166256B1

Abstract

본 발명은 위암 또는 대장암에 특이적인 바이오 마커 CDCA5(cell division cycle associated 5)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 CDCA5의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암을 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커의 검출 방법 및 상기 마커를 이용한 위암 또는 대장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CDCA5 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

위암, 대장암, 진단 바이오마커, CDCA5, 암 치료제

Description

위암 또는 대장암 진단 마커 및 치료제로서의 ＣＤＣＡ５{CDCA5 as a marker for the diagnosis of gastric cancer or colon cancer and as a therapeutic agent thereof}

2005년에 암으로 사망한 사람은 총 65,479명으로 전체 사망자의 26.7%가 암으로 사망하였다. 사망이 가장 많은 암종은 폐암으로 인구 10만명당 28.4명(21.1%)이었으며, 다음으로는 위암 22.6명(16.8%), 간암 22.5명(16.7%), 대장암 12.5 명(9.3%)의 순이었다. 1996년에서 2006년 위암 사망률의 추이를 분석한 결과, 지난 10년간 위암이 차지하는 암 사망률은 24%에서 16%로 점점 줄어들고 있으나 여전히 위암은 한국인의 대표적인 3대 암의 하나로서 이는 간과할 수는 없는 수치이다 (표 1 참고).

또한, 한국이나 일본 남성의 16% 이상이 위암으로 사망하고 있는 것으로 나타나고 있다. 한국, 일본 등 아시아에 위암이 많은 것은 민족이나 인종의 차이로 보기는 어렵고, 암 발생에 제일 중요한 생활환경의 차이, 특히 식생활의 차이에서 오는 것으로 보고되고 있다. 한국인의 경우 하루 소금 섭취량은 약 20 g으로 서양인보다 두 배 가까이 많이 섭취하고 있으며, 특히 소금에 절인 생선을 먹는 습관이 있는 한국, 일본, 핀란드, 아이슬란드 등에서 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되고 있다. 또한 위암의 발병원인으로 식습관만큼이나 유전적인 원인도 중요시 대두되고 있다. 위암 환자의 1세대 자손들에게 위암의 발생률이 높고 A형 혈액형을 가진 사람이 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되고 있다. 세 번째 원인으로는 위암 의 발생에 헬리코박터 파일로리(Helicobacter Pylory. H.P)의 감염 여부이다. 아직까지 헬리코박터 파일로리의 감염과 위암의 인과관계가 결정적인 것이라고 생각하기는 섣부른 판단일 수 있으나, 한국인의 소화기계 질환 및 위암 환자의 40~60 %에서 헬리코박터 파일로리가 검출되는 것으로 볼 때, 감염자는 비감염자와 비교할 때 상대적으로 위암에 걸릴 가능성이 높은 것만은 분명하다. 따라서 헬리코박터 파일로리의 제거는 위염 및 위암 예방의 한 방법으로 대두되고 있다.

암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨남으로써 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해다. 따라서 위암 의 경우 초기에는 암세포가 점막 내에 국한 되어있는 상태를 조기위암으로 분류하고 있는데, 조기위암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타났다. 따라서 위암의 조기 진단 및 치료는 위암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가되고 있다.

위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한 위암의 증상이, 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다는 것이다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.

현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 첫번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.

또한, 현재까지의 진행되고 있는 위암의 최선의 치료는 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 따라서 완치를 목표로 하는 치료로써는 외과적인 절제방법 밖에는 없다. 외과적인 절제방법에는 여러 가지 방법이 있겠으나 일단 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 이때는 위뿐만 아니라 주위 임파선을 포함한 여러 장기도 포함하게 되므로 상당히 큰 수술이 되기 때문에 환자의 예후를 장담하기 어려울 수도 있다. 또한 위암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는데 일시적 효과는 있지만, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.

위암의 발병여부 및 진행단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 위암의 진단제 및 외과적 절제술이나 항암제의 단점을 보완한 치료제의 개발을 위한 바이오 마커의 선별 및 진단 마커를 측정하는 제제의 개발은 난치병중의 하나인 위암을 정복하는 선두 과제라 할 수 있으며 본 연구의 수행 목적이라 하겠다.

한편, 대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간). 대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관, 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자에게서, 직장암은 남자에게서 다소 높게 나타난다. 대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행하여 수행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술 시점을 놓친 경우에는 사망률이 매우 높다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하이지만, 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율은 현저히 증가하는 것으로 나타났다(2004 암정보, 국립암센터 발간). 따라서, 대장암을 효과적으로 조기에 진단하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

인체의 종양은 일종의 암표지 항원이라 일컬어지는 다양한 분자들을 발현시켜 분비한다. 현재 다양한 종류의 암환자들의 혈청을 분석하여 암의 발병과 전이의 진단 및 치료에 사용될 수 있는 항원들이 제시되고 있다. 지금까지 발견된 종양 마커는 약 60여종에 이르는데, 현재 상용화되고 있는 종양 마커로는 AFP(간 암), CEA(대장암, 위암, 췌장암, 유방암), HCG(융모상피암), PAP(전립선암), NSE(폐암), C15-3(유방암), CA19-9(대장암, 췌암)등을 들 수 있다. 그러나, 안타깝게도 위암 또는 대장암에 진단 및 치료에 대한 탁월한 효과가 있는 진단마커나 항암제는 개발되어 있지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 위암 또는 대장암과 관련이 있다고 예상되는 유전자들을 대상으로 DNA 칩을 제작하여 위암은 물론 대장암, 유방암, 췌장암 등에서의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 위암 또는 대장암 조직에서만 특이적으로 과발현되는 유전자들을 선별할 수 있었고, 이러한 위암 또는 대장암 진단마커로서의 가능성 있는 CDCA5 유전자를 최종 선별하고, 이들을 통하여 위암 또는 대장암을 조기에 정확하게 진단할 수 있음은 물론 상기 유전자의 생성이나 분비를 억제하는 물질이 위암 또는 대장암의 치료에 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 CDCA5 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 위암 또는 대장암 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 대장암 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 이용하여 위암 또는 대장암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CDCA5 의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 암의 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 CDCA5(cell division cycle associated 5)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 위암 또는 대장암 발병 여부를 확인하는 것이 다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 위암 또는 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 위암 또는 대장암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 위암 또는 대장암 진단 마커는 정상 위 또는 대장 조직의 세포에 비하여, 위암 또는 대장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 CDCA5(cell division cycle associated 5) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

CDCA5(cell division cycle associated 5)는 염색체의 부착과 S기 혹은 G2기를 조절하는 인자로서, 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(NM_080668, NP_542399). CDCA5 는 염색체 간의 부착에 관여하는 것으로 알려져 있으나, CDCA5 의 기능 및 위암 또는 대장암과의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 CDCA5 가 위암 또는 대장암 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.

구체적으로, DNA 칩을 이용하여 2,230개의 유전자의 발현도를 조사하여 정상 위 상피세포에 비하여 위암 세포에만 특이적으로 과발현하는 유전자 1,601 개를 1 차적으로 추출하였고, 군집화 분석을 이용하여 두 개의 군집으로 나눈 후(도 1) 60% 이상의 환자에 2배 이상의 발현 차이를 나타내는 유전자를 선별하고 (도 2), 이 중 대장암, 유방암 및 췌장암과 비교했을 때 위암 또는 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자인 CDCA5를 최종 선별하였다 (도 3 내지 도 5). 또한, 면역조직 화학염색법을 통하여 대장암 환자로부터 얻은 위암 조직 또는 대장암 조직에서 CDCA5 의 과발현을 확인할 수 있었다(도 12).

이와 같이 선별한 CDCA5 유전자를 본 발명자들이 고안한 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소반응을 실시한 결과, 정상 조직과 위암 또는 대장암 조직 간의 CDCA5 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었고(도 6 및 도 8), 또한 정상 세포와 위암 세포주 또는 대장암 세포주 간에도 CDCA5 의 발현이 뚜렷하게 구별됨을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 11). 또한, 실시간 중합효소반응 결과에서도 정상 조직과 위암 조직 또는 대장암 조직 간의 CDCA5 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었다 (도 9).

본 발명에서 용어, "CDCA5(cell division cycle associated 5)의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 위암 또는 대장암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 CDCA5의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.

CDCA5 의 발현 수준은 CDCA5 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 위암 또는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 위암 또는 대장암 마 커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, CDCA5 유전자의 핵산 서열이 NM_080668 (NCBI) 에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 CDCA5 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암 또는 대장암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염 기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CDCA5 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 위암 또는 대장암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 위암 또는 대장암 진단 마커 검출용 조성물은 CDCA5 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 위암 또는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 위암 또는 대장암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 CDCA5에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 위암 또는 대장암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 위암 또는 대장암 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 위암 또는 대장암 진단 마커인 CDCA5 의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 위암 또는 대장암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 CDCA5의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정 량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 CDCA5 의 단밸질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 위암 또는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 CDCA5 의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 환자의 시료란 위암 또는 대장암 마커 유전자인 CDCA5 의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 위암 또는 대장암 의심환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 위암 또는 대장암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 위암 또는 대장암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 위암 또는 대장암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 위암 또는 대장암으로 추정되는 세포를 위암 또는 대장암으로 예측할 수 있는 것이다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 위암 또는 대장암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 위암 또는 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의 한 발현량의 증가여부를 판단하여 위암 또는 대장암 의심 환자의 실제 위암 또는 대장암발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 위암 또는 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 위암 또는 대장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 위암 또는 대장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

한편, DNA 칩은 상기 위암 또는 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 위암 또는 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 위암 또는 대장암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형 성량을 비교할 수 있고, 위암 또는 대장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 위암 또는 대장암 의심 환자의 실제 위암 또는 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 위암 또는 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로 젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy) ₃ ] ²⁺ ,[RU(bpy) ₃] ²⁺, [MO(CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 위암 또는 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 위암 또는 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 또는 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용 한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 위암 또는 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 위암 또는 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 또는 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장 상피 조직 및 위암 또는 대장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 위암 또는 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 위암 또는 대장 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 위암 또는 대장암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 CDCA5 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 위암 또는 대장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 CDCA5의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 위암 또는 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. CDCA5의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 위암 또는 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에 위암 또는 대장암 세포에서의 본 발명의 마커 CDCA5의 발현 수준을 측정하고, 또한 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 CDCA5의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 위암 또는 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 위암 또는 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 위암 또는 대장암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 CDCA5 의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 암은, 바람직하게는 대장암, 폐암, 간암 또는 위암이다. 또한, 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 CDCA5의 mRNA에 대한 siRNA, shRNA 또는 CDCA5 의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요 는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다. 일양태로서, 본 발명에서는 siRNA로서 5'-GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT-3' 또는 5'-GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT-3'을 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, "shRNA" 는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 CDCA5 mRNA에 상보적이고 CDCA5 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, CDCA5 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 CDCA5의 siRNA 또는 CDCA5 안티센스 올리고뉴클레오티드의 1종 이상을 포함하는 외에, 환자의 암 세포의 증식을 억제시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또는 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀(미국 특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,23,871 호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.

구체적인 실시예에서, 본원 발명에서는 CDCA5 에 대한 siRNA 를 각종 암세포에 형질감염하여 세포 성장 억제 정도를 분석한 결과, 대장암 세포주 Colo205, HCT116, 폐암 세포주 A549, 간암세포주 Huh7, Snu387, 위암세포주 Snu638 의 성장 억제를 유발할 수 있으므로 CDCA5 유전자가 암 치료 타겟으로 활용 가능함을 제시하였다 (도 10).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 CDCA5 의 활성을 억제하는 CDCA5 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 암은, 바람직하게는 대장암, 폐암, 간암 또는 위암이다.

이러한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다.

상기 항체는 CDCA5 을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기 능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학 요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 위암 또는 대장암의 전이 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커를 발굴하고 제공함으로써, 위암 또는 대장암의 치료 및 예후관리에 유용한 자료의 지표로 사용될 수 있는 효과를 기대한다. 본 발명에 따른 위암 또는 대장암 마커 CDCA5를 사용하면 위암 또는 대장암의 유무를 정확하고 손쉽게 측정할 수 있으며, 위암 또는 대장암 특이적 항암제 개발연구에 있어 특정 타겟으로 활용할 수 있고, 나아가 위암 또는 대장암의 종양 형성의 연구에 활용될 수 있고, 간암의 조기 진단에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 따른 CDCA5의 발현 또 는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 조성물은 CDCA5의 발현 또는 활성을 억제함으로써 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DNA 칩을 이용한 위암 과발현 유전자 발굴

정정상 위 상피세포 또는 정상 대장 상피세포에 비하여 위암 또는 대장암 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하고자 DNA 칩(일루미나에서 판매하는 48K 사람 마이크로어레이)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다.

우선, 정상 위 상피세포, 정상 대장 상피세포 및 위암 세포, 대장암 세포에서 total RNA를 추출하였다. total RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사)를 이용하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 하이브리드화를 위해 상기 추출된 total RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion사)을 이용하였다. T7 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, 비오틴-UTP를 이용하여 인비트로 전사(in vitro transcription)를 실시하여 비오틴-표지된 cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 나노드롭을 이용하여 정량하였다. 정상 위 상피세포 및 위암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2 (Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System Wash Buffer (Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 스트렙타비딘-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 quantile 기능을 이용하여 보정하였다.

상기의 과정으로 얻어진 1,601개의 유전자 발현 정도 분석을 통하여 정상 위 상피세포와 위암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하였다. 이 때 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)를 이용하였으며, 그 결과, 정상 위 상피세포(또는 정상 대장 상피세포)와 위암 세포(또는 대장암 세포)는 크게 두 개의 군집으로 나누어지는 것을 알 수 있었다(도 1).

또한, 정상 및 위 상피세포, 대장암 상피세포와 비교하여 60% 이상의 환자에서 2배 이상의 발현차이를 나타내는 유전자들을 발견할 수 있었는데(도 2), 이중 과발현과 저발현이 각각 281개 및 605개였으며, 대장암, 유방암, 췌장암에서도 동일한 유전자들의 발현을 비교한 결과, 위암 또는 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자들을 최종 선발할 수 있었다(도 3 내지 도 5). 도 3 및 도 4는 마이크로 어레이 결과를 가지고 공개되어있는 여러 데이터 셋트를 비교분석(data mining)한 결과이다.

실시예 2. 조직 및 세포에서의 mRNA 분리

역전사 중합효소 반응을 위하여 5명의 위암 또는 20명의 대장암 환자로부터 위 정상 상피세포 조직과 위암 또는 대장암 세포조직을 적출하여 총 10개의 조직 및 총 40개의 대장암 조직에서 mRNA를 분리하였다. 우선, 외과적 절제술로 적출된 조직들은 적출 즉시 멸균된 인산완충 식염수에서 혈액을 제거한후, 액화질소로 동결하였다. 이후, 구아니디움 법(Guanidinium Method)에 의하여 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리(Single-Step RNA Isolation)를 수행하였다. 상기와 같이 분리한 총 RNA는 스팩트로포토메터를 사용하여 정량한 후, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

위암 세포 7개 (SNU1, SNU16, SNU216, SNU484, SNU620, SNU638, AGS), 대장암 세포주 10개(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9,KM 12C Lane 10, KM 12SM;) 및 정상세포인 (Lane 11, HS 683st.)를 선정하여 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받았다. 각각의 최적 배양배지인 DMEM(Invitrogen 사) 또는 RPMI1640(Invitrogen 사) 배지에 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon사) 및 페니실린/스트렙토마이신(1mg/ml Penicillin/ Streptomycin, Sigma 사) 5-6 일간 배양시킨 후, 상기의 조직에서와 동일한 방법으로 구아니디움(Guanidinium Method)에 의해 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리를 수행하였다. 분리된 RNA는 상기와 같이 스팩트로포토메터를 사용하여 정량하였고, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.

실시예 3. 역전사 중합효소반응 및 실시간 중합효소반응을 이용한 유전자 발현 비교

상기 실시예 1의 결과 선발된 위암 또는 대장암 특이 과발현 유전자들 중에서 1개를 선정하여(데이터 마이닝) 중합효소 반응을 실시하였다.

프라이머의 제작을 위하여 각 유전자들의 전체 DNA 염기 서열을 NCBI의 CoreNucleotide(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었으며, Primer3 프로그램을 통하여 이들 유전자들의 프라이머 서열을 디자인하였다. 상기와 같이 디자인된 프라이머를 이용하여, 중합효소 반응을 실시하여 각각의 유전자들의 발현 정도를 확인하였다(도 6 내지 도 9, 및 도 11). 각각의 프라이머 서열은 표 2와 같다.

	올리고 명	결과물의 크기(bp)	서열
1	CDCA5-<L>	375 bp	ACG CCA GAG ACT TGG AAA TG
1	CDCA5-<R>	375 bp	TGC ATC TCA TTC AAC CAG GA

역전사 효소반응을 위하여 상기 실시예 2의 조직 및 세포주에서 추출한 mRNA로부터 역전사 반응을 통해 만든 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)를 이용하여 수행하였고, 상기의 반응 결과로 얻은 cDNA와 표 2의 프라이머들을 사용하여 역전사효소 반응 및 실시간 중합효소반응을 사용하였다.

역전사 중합효소반응 결과, 도 6과 같이 정상 위 조직와 위암 조직 간의 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 도 7 에서와 같이 위암 세포주에서의 발현도 확인할 수 있었다. 또한, 도 8에서와 같이 정상 조직와 대장암 조직 간의 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 도 11에서와 같이 대장암 세포주에서의 발현도 확인할 수 있었다. 또한, 실시간 중합효소반응 결과 도 9에서와 같이 정상 조직에 비하여 위암 및 대장암 조직에서 CDCA5 가 뚜렷하게 높게 발현함을 알 수 있었다.

실시예 4. 암세포주로의 CDCA5 의 siRNA 도입에 따른 암세포주의 성장 억제 확인

암세포 조직 또는 암세포주에서 다량 발현되는 유전자의 경우 siRNA 기법을 통해 유전자 발현을 억제하여 세포의 증식 속도에 변화가 있는지를 관찰할 수 있다. 이에 본 발명에서는 CDCA5에 대한 siRNA를 디자인하여 각종 암세포에 도입한 후 해당유전자 mRNA 발현 저하에 따른 암세포주의 성장 속도의 변화를 관찰하였다.

먼저 CDCA5 및 scrambled의 siRNA를 삼천리 제약에서 2종류를 디자인하여 합성하였다 (1: GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT, 2: GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT). 합성된 siRNA는 유전자 염기서열을 바탕으로 디자인된 19개 올리고뉴클레오타이드의 이중 리보핵산쇄에 단쇄의 2 염기가 매달린 구조로 이루어져 있다. scrambled siRNA는 세포의 증식에 아무 영향을 미치지 않는 siRNA 실험의 음성 대조군으로 사용되었다.

각종 암세포를 70% 컨플루언시로 배양 후 K-Max 방법으로 상기 siRNA 및 대조군 scrambled siRNA를 세포 내에 도입하여 72시간 동안 배양하며 형질 전환하였다. 각 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하여 해당 유전자 mRNA가 감소되었음을 확인하고 siRNA에 의한 유전자 발현 억제가 이루어졌음을 확인하였다. NT는 siRNA를 처리하지 않은 세포에서의 유전자 발현양을 나타내고, scrambled는 타겟하는 부분이 없는 것을 보여준다.

대장암 세포주 Colo205 (서울대 세포주은행), HCT116 (서울대 세포주은행), 폐암 세포주 A549, 간암세포주 Huh7(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), Snu387(서울대 세포주은행), 위암세포주 Snu638, 자궁경부암 Hela를 70% 컨플루언시로 배양 후 K-Max 방법으로 상기 siRNA 및 대조군 scrambled siRNA를 세포 내에 도입하여 72시간 동안 배양하며 siRNA에 의한 세포의 성장 억제 정도도 조사하였다. 각 세포를 SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.)로 염색하고 현미경을 통해 세포 성장에 큰 변화가 없는 콘트롤인 scrambled siRNA를 처리한 세포주를 기준으로, SRB 분석하여 해당 유전자 siRNA를 도입한 세포의 성장 억제 정도를 비교하였다. 대부분의 암 세포주에서 CDCA5의 유전자 발현 억제가 세포 성장 억제를 유도하였다. 위 실험 결과, CDCA5유전자의 siRNA 처리를 통해 대장암 세포주 및 폐암, 간암 세포주의 성장 억제를 유발할 수 있으므로 CDCA5 유전자가 암 치료 타겟으로 활용 가능함을 제시하였다 (도 10).

실시예 5. 면역조직 화학염색법을 통한 CDCA5 단백질의 검출

대장암 조직에서의 CDCA5 의 발현정도를 조사하기 위하여 면역조직 화학염색법을 실시하였다. 환자로부터 얻은 대장암 조직의 파라핀 절편에서 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 수화시킨 후 10 mM 시트르산염 완충액 (pH 6.0)에 넣어 5 분씩 3 회에 걸쳐 극초단파를 투사하였다.

다음으로 3% 과산화수소가 들어있는 메탄올을 6분 동안 처리하여 내부에서 발생되는 퍼옥시다제 활성을 억제한 후에 비특이적인 단백질의 결합을 방지하기 위하여 Vector kit (Cat No. PK 6102)에 있는 작업(working) 용액을 30 분 동안 처리하여 차단하였다. 1X PBS에 희석된 CDCA5 IgG 항체를 상온에서 2시간동안 반응시킨 후 바이오티닐화된 항-마우스 Ig Ab (Vector kit)를 상온에서 30 분 동안 반응시켰다.

다음으로 ABC Elite kit (Vector kit)을 상온에서 30 분 동안 반응시킨 후 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 기질 (Vector kit)을 2분 동안 반응시켜 대장암 조직에서 CDCA5의 발현정도를 확인결과, 대장암 조직에서 CDCA5 의 발현이 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 12).

도 1은 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사)을 사용하여 정상 위 조직과 위암 또는 대장암 조직에서의 유전자 발현을 비교한 결과이다.

도 2는 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사) 분석 결과를 토대로 (a) 위암 또는 (b) 대장암 세포에서 특이적으로 과발현되는 유전자를 도표화한 것이다.

도 3은 위암과 관련한 CDCA5 유전자의 데이터 마이닝(data mining) 결과이다.

도 4는 대장암과 관련한 CDCA5 유전자의 데이터 마이닝(data mining) 결과이다.

도 5는 위암, 대장암, 유방암, 전립선암 및 간암에서 동일한 유전자를 대상으로 DNA 칩 결과를 가지고, 데이터 마이닝을 하여 그 발현을 비교한 결과이다.

도 6은 CDCA5 유전자의 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 위암 조직에서의 CDCA5 의 발현 정도를 확인한 전기영동 사진으로서, 홀수 레인은 정상조직에서의 각 유전자의 발현 수준을, 짝수 레인에서는 암 조직에서의 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다.

도 7은 7종의 위암 세포주(Lane 1, SNU1; Lane 2, SNU16; Lane 3, SNU216; Lane 4, SNU484; Lane 5, SNU620; Lane 6, SNU638; Lane 7, AGS) 및 정상세포(Lane 8, Hs.683)에서 본 발명의 위암 진단 마커의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.

도 8은 CDCA5 유전자의 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 대장암 조 직에서의 CDCA5 의 발현 정도를 확인한 전기영동 사진으로서, 홀수 레인은 정상조직에서의 각 유전자의 발현 수준을, 짝수 레인에서는 암 조직에서의 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다.

도 9는 CDCA5 유전자의 실시간 중합효소반응을 이용한 정상조직과 (a) 위암 조직 및 (b) 대장암 조직에서의 CDCA5 의 발현 정도를 상대적으로 비교한 그래프이다.

도 10은 암세포주로의 CDCA5의 siRNA 도입에 따른 암세포주의 성장 억제 확인한 결과이다.

도 11은 10종의 대장암 세포주(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9,KM 12C Lane 10, KM 12SM) 및 정상세포(Lane 11, Hs.683.st)에서 본 발명의 대장암 진단 마커의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.

도 12는 CDCA5 에 특이적인 항체를 이용하여 대장암 조직과 정상조직에서의 면역조직염색법을 이용하여 대장암 조직에서 CDCA5 가 특이적으로 많이 발현하고 있음을 나타낸 그림이다.

Claims

CDCA5(cell division cycle associated 5) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CDCA5 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 위암 또는 대장암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CDCA5 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것인 위암 또는 대장암 진단용 조성물.
제1항에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 CDCA5 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 위암 또는 대장암 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 위암 또는 대장암 진단용 키트.
제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 위암 또는 대장암 진단용 키트.
위암 또는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 위암 또는 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CDCA5 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 위암 또는 대장암 마커 CDCA5 를 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 프라이머를 이용한 역전사효소 중합반응에 의한 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
위암 또는 대장암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 CDCA5 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 위암 또는 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
CDCA5 의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, CDCA5의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 CDCA5을 암호하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제14항에 있어서, 상기 siRNA는 5'-GAC AUG ACU CUC CCU GGA ATT-3' 또는 5'-GCA GGG AGC UUA CUA AGG ATT-3'의 서열을 가진 조성물.
CDCA5의 활성을 억제하는 CDCA5 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는, 암 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐암, 간암 또는 위암인 조성물.