KR20110082669A - 대장암의 조기 진단을 위한 메틸화 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암의 조기 진단을 위한 메틸화 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트, 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 대장암 마커 CTHRC1를 검출하는 방법, 상기 유전자를 이용한 대장암 치료제의 스크리닝 방법, 상기 유전자를 이용한 대장암 진단 방법 및 상기 유전자의 메틸화 정도를 측정하여 대장암의 특정 단계를 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

대장암의 조기 진단을 위한 메틸화 바이오마커 및 이의 용도{METHYLATION BIOMARKER FOR EARLY DETECTION OF COLON CANCER AND USES THEREOF}

본 발명은 대장암의 조기 진단을 위한 메틸화 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 상기 바이오 마커를 이용한 대장암의 진단 및 예후 판정에 관한 것이다. 더 자세하게는 대장암 세포에서 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되는 대장암 특이적 마커 유전자의 스크리닝 방법, 나아가 본 발명은 초기 대장암의 탐지 또는 진단에 관한 것이다.

세계적으로 2003년 한해 암 발병 환자의 수는 300만명이 넘고, 국내에서의 발병율도 해마다 증가하여 2002년에는 한해 10만명에 이르고 있다. 그 중 폐암, 대장암, 유방암이 전체의 40%를 차지하고 있으며 식생활의 서구화로 국내 대장암, 유방암, 폐암의 발병율도 점차 증가하고 있는 추세이다.

지난 수년간 암에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고, 아직까지 암(특히 진행성 암)을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 없는 상태로, 암을 초기 단계에 발견하여 외과적 수술로 암세포를 제거하는 것이 장기 생존율을 높이는 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.

기존 항암제는 작용 기작에 따라 크게 항암치료보조제(Adjunct therapies)와, cytotoxics, 호르몬제로 나뉘어진다. 항암치료보조제는 암세포를 타겟하는 것이 아니라 항암 치료 중에 빈번하게 발생하는 부작용을 줄이기 위한 보조적인 치료 방법으로, Anti-emetics, 비스포스포네이트(bisphosphonates), 조혈성장인자(hematopoietic growth factors), 진통제(analgesics) 등을 포함한다.

사이토톡신 치료(Cytotoxic therapies)는 분열 속도가 빠른 세포에 작용하여 세포 사멸을 유도하는 것으로, 작용 기작에 따라 alkylating agents, 항대사 물질(antimetabolites), 비카알카로이드(vikaalkaloids), 엔트라사이클린/에토포시드(nthracyclines/etoposides) 등으로 구분된다. 사이토톡신 치료는 첫 항암 치료제로 사용된 이래 50여년 동안 여러 종류의 암 치료에 광범위하게 쓰여 왔다. 그러나, 비특이적인 작용 기작에 의해 암세포 외에 분열 속도가 비교적 빠른 다른 장기의 세포에 강한 독성을 나타내고, 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다.

호르몬제(Hormonal agent)는 유방, 전립선 등 호르몬에 민감한 조직 내 종양을 치료하기 위하여 개발되었다. 유방, 전립선 등의 조직 내 암세포들은 특정호르몬에 의해 분열이 촉진되는 경향을 보인다. 따라서 이러한 호르몬의 기작을 억제할 경우 암 진행을 억제할수 있다. 호르몬 치료는 사이토톡신 치료에 비해 낮은 독성을 가지나 호르몬 억제에 의한 부작용이 나타나고 장기 투여시 호르몬제에 대한 내성을 가지는 난치성 암이 발생하는 문제가 대두되고 있다.

이러한 기존 항암제의 부작용 및 내성을 극복하기 위한 대안으로 암 특이적인 타겟을 대상으로 하는 새로운 기작의 치료제들이 개발되고 있다. Innovative therapies의 작용 기작은 매우 다양하지만, 정상세포가 암화되어가는 과정에 나타나는 암 특이적 마커(cancer specific marker)나 유전적 이상(genetic abnormality)을 이용하여 종양 세포에만 특이적으로 작용하는 치료제라는 공통점을 가진다. 현재 개발 중인 치료제들은 암치료 기작에 따라 크게 혈관 신생 억제제(angiogenesis inhibitors), 면역증강제(immunostimulators), 종양-타겟제제(tumor-targeted agents)로 나눌 수 있다. 항암제에 의한 독성을 최소화하기 위한 방안으로 떠오르는 암 타겟팅 치료(cancer targeted therapy)의 가장 중요한 포인트는 암세포 특이적인 유전자를 찾아내는 것이다. 이를 위하여 세계 유수의 바이오텍 회사들은 유전자 발현 프로파일(gene expression profiling), 유전자 매핑(gene mapping), 프로테오믹스(proteomics), 인실리코 분석(in silico analysis) 등을 통하여 새로운 타겟 유전자를 찾는 작업을 진행 중이다. 일례로, 선두 바이오텍 중의 하나인 Genentech은 지난 27년간 genomics를 이용한 신규 타겟 발견(novel target discovery)을 위한 프로젝트를 진행하여 1,200여 개의 질병 관련 유전자 특허를 보유하고 있다. 최근에는 SPDI(Secreted Protein Discovery Initiative) 프로젝트를 진행하여(1996년-2001년) 250여개의 신규 단백질을 포함하여 1,000개 이상의 분비 단백질을 확보하였다.

또한, 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있는데, DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG섬(CpG island)의 사이토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 종양억제 유전자의 프로모터 CpG섬의 메틸화를 검색하는 것이 암 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하, MSP라고함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

프로모터 CpG섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 발암에 2차적인 변화인지에 대한 논란이 있으나, 여러 암에서 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), DNA 수선 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등의 과메틸화(hyper-methylation)되어 있어 이들 유전자의 발현이 차단되어 있다는 것이 확인되었으며, 특히 암 발생의 초기 단계에서 특정 유전자의 프로모터 부위에 과메틸화가 일어난다는 것은 주지의 사실이다. 따라서, 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 이는 암의 진단 및 조기진단, 발암 위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될수 있다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

한국공개특허 제2009-0043851호에는 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2009-0105394호에는 대장암 진단용 마커와 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 대장암 진단 키트가 개시되어 있으나, 본 발명의 마커와는 상이하다.

이런 배경하에, 본 발명자는 신규 암 진단 및 치료제 개발을 위한 타겟으로 작용하는 유전자를 발굴하고자, 유방암, 대장암, 폐암 조직과 정상 조직 간에 발현 차이를 스크리닝하여 최종적으로 유방암 또는 대장암 환자의 암 조직에서만 특이적으로 과발현되어 암세포의 생존 및 증식에 중요한 기능을 하고 메틸화 관련 유전자 프로모터 마커로 신규 암 마커 유전자 CTHRC1을 확보하였다. 상기 유전자를 대장암 진단 마커 뿐만 아니라 대장암 치료를 위한 타겟으로 사용할 수 있다는 것을 밝히고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서, 용어 “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 대장암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 대장암 진단 마커는 정상 대장 조직의 세포에 비하여, 대장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1)의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있으나(NM_138455), CTHRC1의 기능 및 대장암과의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 CTHRC1가 대장암 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.

구체적으로, DNA 칩을 이용하여 2,230개의 유전자의 발현도를 조사하여 정상 대장 상피세포에 비하여 대장암 세포에만 특이적으로 과발현하는 유전자 1,601 개를 1차적으로 추출하였고, 군집화 분석을 이용하여 두 개의 군집으로 나눈 후(도 1), 60% 이상의 환자에 2배 이상의 발현 차이를 나타내는 유전자를 선별하고 (도 2), 이 중 대장암, 유방암 및 췌장암과 비교했을 때 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자인 CTHRC1를 최종 선별하였다 (도 3 및 도 4).

이와 같이 선별한 CTHRC1 유전자를 본 발명자들이 고안한 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소반응을 실시한 결과, 정상 대장 조직과 대장암 조직 간의 CTHRC1 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었고(도 5), 또한 정상 세포와 대장암 세포주 간에도 CTHRC1 의 발현이 뚜렷하게 구별됨을 확인할 수 있었다(도 6).

본 발명에서, 용어 “CTHRC1(Collagen Triple Helix Repeat Containing 1)의 발현 수준을 측정하는 제제”란 상기와 같이 대장암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 CTHRC1의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.

CTHRC1 의 발현 수준은 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 “mRNA 발현 수준 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, CTHRC1 유전자의 핵산 서열이 NM_138455 (NCBI) 에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 CTHRC1 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 대장암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CTHRC1 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 대장암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 대장암 진단 마커 검출용 조성물은 CTHRC1 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, 염기서열 목록으로 표시되는 프라이머들이다.

본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정"이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 대장암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서, 용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 CTHRC1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 대장암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 대장암 진단 마커인 CTHRC1의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 대장암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 CTHRC1의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 CTHRC1 의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CTHRC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및

상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 마커 CTHRC1를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 대장암 마커 유전자인 CTHRC1의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 대장암 의심 환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 대장암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 대장암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 대장암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 대장암으로 추정되는 세포를 대장암으로 예측할 수 있는 것이다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암 의심 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현 수준 측정은 바람직하게는, 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 대장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 대장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

한편, DNA 칩은 상기 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-락타마제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy)3 ]2+, [RU(bpy)3 ]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다.

단백질 발현 수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장 상피 조직 및 대장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 CTHRC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 CTHRC1의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. CTHRC1의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에 대장암 세포에서의 본 발명의 마커 CTHRC1의 발현 수준을 측정하고, 또한 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 CTHRC1의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CTHRC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및

상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 대장암 진단 방법은 일 양태로서, CTHRC1 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 대장암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 대장암 발병에 의해 대장암 마커의 유전자 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암 의심 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

한편, DNA 칩은 상기 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

본 발명의 대장암 진단 방법은 일 양태로서, CTHRC1 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CTHRC1 유전자의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및

상기 유전자의 메틸화 정도를 정상 대조구 시료의 CTHRC1 유전자의 메틸화 정도와 비교하는 단계를 포함하는 대장암의 특정 단계를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 상기 유전자의 메틸화는 CTHRC1 유전자 프로모터의 메틸화일 수 있다.

본 발명에서는 대장암 세포가 메틸화에 의해 조절하는 CTHRC1 유전자를 선별하였다. 메틸화 마커 유전자는 대장암 세포주 SNU C1에 메틸화 저해제를 처리하고, 처리하지 않은 세포와 비교하여 CTHRC1이 더 많이 발현되는 것을 확인하는 것이다.

추가적인 방법으로, 상기 유전자의 서열을 결정하여, CpG 서열이 존재하는지를 확인할 수 있고, 상기 유전자가 실질적으로 메틸화되어 있는지를 생화학적 분석을 수행하여 확인할 수 있다.

상기 선별방법으로는 대장암뿐만 아니라, 대장암으로 진행 중인 여러 이형증 단계에서 다양하게 메틸화되는 유전자를 찾아낼 수 있으며, 선별된 유전자는 대장암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

대장암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 대장암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이터는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 대장암 진단시스템을 확립할 수 있다.

본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오 마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 대장암 진행을 진단할 수 있다. 대장암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 대장 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 대장암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.

본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 대장암을 조기 진단할 수 있다.

상기에서 기술한 바와 같이, CTHRC1 유전자의 발현을 검출하여 대장암을 유의적으로 진단할 수 있을 뿐만 아니라 상기 유전자의 발현과 활성을 저해하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명은 대장암 특이적인 마커 유전자의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝 대장암 특이적 마커 유전자의 CpG섬의 메틸화를 진단할 수 있는 대장암 진단용 키트를 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 진단용 키트를 이용하면, 대장암을 진단할 수 있어, 조기진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 대장암을 진단할 수 있다.

도 1은 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사)을 사용하여 정상 대장 조직과 대장암 조직에서의 유전자 발현을 비교한 결과이다.
도 2는 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사) 분석 결과를 토대로 (a)는 정상조직에 비해 대장암 조직에서 CTHRC1이 과발현한다는것을 보여주며, (b)는 대장암이 재발한 조직과 재발하지 않은 조직에서의 비교한 결과 재발한 조직에서의 근소한 차이로 CTHRC1이 발현하는것을 확인하였다. 또한, (c)는 대장암의 stage별로 CTHRC1의 발현을 확인해본 것으로 stageⅡ보다는 stageⅢ에서 CTHRC1이 많이 발현하는것을 확인하였다.
도 3은 CTHRC1 유전자의 데이터 마이닝(data mining) 결과이다.
도 4는 위암, 대장암, 유방암, 전립선암 및 간암에서 동일한 유전자를 대상으로 DNA 칩 결과를 가지고, 데이터 마이닝을 하여 그 발현을 비교한 결과이다.
도 5는 CTHRC1 유전자의 실시간 PCR법인 RT-PCR을 이용한 cDNA의 제작을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의 진단 마커의 발현 정도를 확인한 것로서, Normal은 정상조직에서의 각 유전자의 발현 수준을, Tumor에서는 암 조직에서의 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
Lane 1, 1 Normal tissue; Lane 2, 1 Cancer tissue; Lane 3, 14 Normal tissue; Lane 4, 14 Cancer tissue; Lane 5, 17 Normal tissue; Lane 6, 17 Cancer tissue; Lane 7, 32 Normal tissue; Lane 8, 32 Cancer tissue; Lane 9, 53 Normal tissue; Lane 10, 53 Cancer tissue.
도 6은 CTHRC1 유전자의 Real time PCR을 이용한 cDNA의 제작을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의 진단 마커의 발현 정도를 확인한 것으로서, Normal은 정상조직에서의 각 유전자의 발현 수준을, Tumor에서는 암 조직에서의 각 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 7은 CTHRC1 유전자의 10종의 대장암 세포주(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9, KM 12C; Lane 10, KM 12SM)에서 본 발명의 대장암 진단 마커의 발현 정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.
도 8은 대장암 조직과 정상조직에서의 면역조직염색법을 이용한 대장암 진단마커인 CTHRC1 단백질의 발현 정도를 나타낸 그림이다.
도 9는 정상환자와 대장암환자의 혈청으로 웨스턴 블랏팅을 이용한 대장암 진단마커인 CTHRC1 단백질의 발현 정도를 나타낸 그림이다.
도 10은 대장암 세포주에서의 웨스턴 블랏팅을 이용한 대장암 진단마커인 CTHRC1 단백질의 발현 정도를 나타낸 그림이다.
도 11은 대장암 세포주 SNU-C1의 메틸화 저해제인 5 아자 2'-디옥시시티딘(DAC, 5 aza 2'-deoxycytidine)을 처리하여 RT-PCR을 이용한 cDNA의 제작을 이용하여 처리하지 않은 것과 비교한 그림이다.
도 12는 대장암 세포주 SNU-C1의 메틸화 저해제인 5 아자 2'-디옥시시티딘(DAC, 5 aza 2'-deoxycytidine)을 처리하여 메틸화 특이 PCR(MSP)를 실시한 그림이다.
도 13은 대장암 과발현 유전자로 선별된 CTHRC1에서의 과메틸화되어 있는 부분을 확인한 그림이다.
도 14는 대장암 세포주 중에서 메칠화 저해제를 처리한 것과 처리하지 않은 것의 과메틸화를 비교한 그림이다. 또한, 정상 조직과 대장암 조직에서 과메틸화를 비교하여 보여주는 그림이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DNA 칩을 이용한 대장암 과발현 유전자 발굴

정상 대장 상피세포에 비하여 대장암 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하고자 DNA 칩(일루미나에서 판매하는 48K 사람 마이크로어레이)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다.

우선, 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 total RNA를 추출하였다. total RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사)를 이용하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 하이브리드화를 위해 상기 추출된 total RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion사)을 이용하였다. T7 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, 비오틴-UTP를 이용하여 인비트로 전사(in vitro transcription)를 실시하여 비오틴-표지된 cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 나노드롭을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2 (Illumina사) 칩에 하이브리드화하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System Wash Buffer (Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 스트렙타비딘-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)으로 정량하여 각 스팟의 형광 값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.

상기의 과정으로 얻어진 1,601개의 유전자 발현 정도 분석을 통하여 정상 대장 상피세포와 대장암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하였다. 이때 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)를 이용하였으며, 그 결과, 정상 대장 상피세포와 대장암 세포는 크게 두 개의 군집으로 나누어지는 것을 알 수 있었다(도 1).

또한, 정상 및 대장 상피세포와 비교하여 60% 이상의 환자에서 2배 이상의 발현 차이를 나타내는 유전자들을 발견할 수 있었는데(도 2), 이중 과발현과 저발현이 각각 281개 및 605개였으며, 대장암, 유방암, 췌장암에서도 동일한 유전자들의 발현을 비교한 결과(도 4), 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자들을 최종 선발할 수 있었다(도 3). 도 3은 마이크로어레이 결과를 가지고 공개되어있는 여러 데이터 셋트를 비교분석(data mining)한 결과이다.

실시예 2. 대장암 조직 및 세포에서의 mRNA 분리

역전사 중합효소 반응을 위하여 5명의 대장암 환자로부터 대장 정상 상피세포 조직과 대장암 세포조직을 적출하여 총 10개의 조직에서 mRNA를 분리하였다. 우선, 외과적 절제술로 적출된 조직들은 적출 즉시 멸균된 인산완충 식염수에서 혈액을 제거한 후, 액화질소로 동결하였다. 이후, 구아니디움 법(Guanidinium Method)에 의하여 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리(Single-Step RNA Isolation)를 수행하였다. 상기와 같이 분리한 총 RNA는 스팩트로포토메터를 사용하여 정량한 후, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

대장암 세포주 10개(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9, KM 12C; Lane 10, KM 12SM)를 선정하여 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받았다. 각각의 최적 배양 배지인 DMEM(Invitrogen 사) 또는 RPMI1640(Invitrogen 사) 배지에 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon사) 및 페니실린/스트렙토마이신(1mg/ml Penicillin/Streptomycin, Sigma사) 5-6 일간 배양시킨 후, 상기의 조직에서와 동일한 방법으로 구아니디움(Guanidinium Method)에 의해 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리를 수행하였다. 분리된 RNA는 상기와 같이 스팩트로포토메터를 사용하여 정량하였고, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.

실시예 3. 역전사 중합효소반응을 이용한 유전자 발현 비교

상기 실시예 1의 결과 선발된 대장암 특이 과발현 유전자들 중에서 1개를 선정하여(데이터 마이닝) 중합효소 반응을 실시하였다.

프라이머의 제작을 위하여 각 유전자들의 전체 DNA 염기 서열을 NCBI의 CoreNucleotide(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었으며, Primer3 프로그램을 통하여 이들 유전자들의 프라이머 서열을 디자인하였다. 상기와 같이 디자인된 프라이머를 이용하여, 중합효소 반응을 실시하여 각각의 유전자들의 발현 정도를 확인하였다(도 5). 각각의 프라이머 서열은 표 1과 같다.

역전사 효소반응을 위하여 상기 실시예 2의 조직 및 세포주에서 추출한 mRNA로부터 역전사 반응을 통해 만든 cDNA를 제작하였다. cDNA 제작은 AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)를 이용하여 수행하였고, 상기의 반응 결과로 얻은 cDNA와 표 1의 프라이머들을 사용하여 역전사효소 반응을 사용하였다. 그 결과 도 5와 같이 정상 대장 조직과 대장암 조직 간의 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 도 7에서와 같이 대장암 세포주에서의 발현도 확인할 수 있었다.

실시예 4. 면역조직화학염색법을 통한 CTHRC1 발현 확인

대장암 조직에서의 CTHRC1의 발현정도를 조사하기 위하여 면역조직화학염색법을 실시하였다. 환자로부터 얻은 대장암 조직의 파라핀 절편에서 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 수화시킨 후 10 mM 시트르산염 완충액 (pH 6.0)에 넣어 5 분씩 3 회에 걸쳐 극초단파를 투사하였다. 다음으로 3% 과산화수소가 들어있는 메탄올을 6분 동안 처리하여 내부에서 발생되는 퍼옥시다제 활성을 억제한 후에 비특이적인 단백질의 결합을 방지하기 위하여 Vector kit (Cat No. PK 6102)에 있는 작업(working) 용액을 30 분 동안 처리하여 차단하였다. 1X PBS에 희석된 CTHRC1 IgG 항체를 상온에서 2시간동안 반응시킨 후 바이오티닐화된 항-마우스 Ig Ab (Vector kit)를 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 다음으로 ABC Elite kit (Vector kit)을 상온에서 30 분 동안 반응시킨 후 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 기질 (Vector kit)을 2분 동안 반응시켜 대장암 조직에서 CTHRC1의 발현정도를 확인하였다 (도 8). 그 결과, 정상조직에 비해 대장암조직에서의 CTHRC1의 발현이 높았다.

실시예 5. 대장암 혈청 및 대장암 세포에서의 CTHRC1 발현 확인

대장암 환자와 정상인의 혈청 내 발현되는 CTHRC1의 발현 정도를 웨스턴블럿 방법으로 비교하였다. 정상인의 경우에서는 CTHRC1 단백질이 검출되지 않았으나, 대장암 환자의 경우에는 CTHRC1이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9). 또한, 대장암 세포에서도 웨스턴블럿 방법을 실시하였다. 세포들마다 발현양이 다르긴했지만, CTHRC1이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).

실시예 6. 메틸화 조절 유전자 발현의 확인

상기 실시예 1에서 확인된 유전자의 발현이 프로모터 메틸화에 의하여 조절되는 지를 확인하기 위하여, 대장암 세포주 SNU-C1에 메틸화 저해제인 5 아자 2'-데옥시시티딘(DAC, sigma, USA)을 200nM 농도로 3일간 처리하였다.처리하지 않은 세포주와 처리한 세포주를 Tri reagent로 처리하여 전체 RNA를 분리하였다. DAC 처리에 의한 유전자 발현변화를 결정하기 위하여, 비처리 세포주 및 처리 세포주간의 전사수준을 직접적으로 비교하였다. 그 결과, DAC 처리하지 않는 대조군과 비교하여, DAC를 처리하였을 때 발현이 상승한 것을 도 11에서 확인하였다.

도 13은 CTHRC1 유전자의 프로모터 부분의 구조를 보여주는데, 두 개의 CpG islands (CpG58과 CpG21)가 존재함을 볼 수 있다. 이들 염기서열 중 Methylation-specific PCR을 위한 프라이머는 Region 2를 기준으로 선정하였고, bisulfite sequencing은 Region 1 과 Region 2 모두에서 시행하였다.

도 14는 여러 대장암 세포주와 환자 조직에서 CTHRC1 유전자 프로모터 주위의 메틸화 변화를 bisulfite 염기서열 결정법으로 조사한 결과이다. Bisulfite 염기 서열 결정을 위해서는 먼저 genomic DNA (1 ㎍)을 sodium bisulfite 처리를 통해 변형시키고, 해당 부위를 PCR로 증폭하고 클로닝한 후 시료당 10개 이상의 클론에 대해 염기서열을 결정하였다. DNA 메틸화 저해제인 5 아자 2'-데옥시시티딘(DAC, sigma, USA)를 처리했을 때, HT29, SNUC1, SW480 세포주 모두에서 Region 2 부위의 CpG 메틸화가 감소하는 것을 볼 수 있어서, 대장암 세포주에서 CTHRC1의 메틸화가 DNA 메틸화 효소에 의해 조절되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 두 명의 환자 조직에서, 정상 조직에서 비해 암 조직에서 CTHRC1의 Region 2에서 CpG 메틸화가 감소하고 있는 것을 볼 수 있는데, 이러한 메틸화 감소가 CTHRC1 유전자의 발현 증가와 연관이 있는 것으로 여겨진다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> METHYLATION BIOMARKER FOR EARLY DETECTION OF COLON CANCER AND USES THEREOF <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1 forward primer <400> 1 tggacaccca actacaagca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1 reverse primer <400> 2 gaacaagtgc caacccagat 20

Claims (11)

1. CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CTHRC1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CTHRC1 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
   
4. 제1항에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 CTHRC1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트.
   
7. 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CTHRC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 마커 CTHRC1를 검출하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것인 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.
   
10. 대장암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 CTHRC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
    
11. 대장암이 의심되는 환자의 시료로부터 CTHRC1 유전자의 메틸화 정도를 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 메틸화 정도를 정상 대조구 시료의 CTHRC1 유전자의 메틸화 정도와 비교하는 단계를 포함하는 대장암의 특정 단계를 확인하는 방법.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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