CN110333350B - 用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏fgf8诊断试剂盒 - Google Patents

用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏fgf8诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤的早期诊断以及疗效评估技术领域，提供了一种用于结肠癌早期诊断及其治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：1)用于对待测样品进行预处理获得样本的试剂；2)用于对样本中FGF8蛋白表达量进行检测的检测试剂；3)标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于诊断早期结肠癌或评价结肠癌治疗效果。本发明首次发现通过检测血液中FGF8蛋白的浓度可以用于结肠癌的早期诊断，本诊断试剂盒在区分健康人与结肠癌患者时具有较高的灵敏度，诊断结果准确有效；本诊断试剂盒还可以用于结肠癌患者的治疗后评价，为结肠癌的早期诊断及疗效监控检测提供了新的方法。

Description

用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤的早期诊断以及疗效评估技术领域，具体涉及一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒。
背景技术
癌症是世界严重的公共卫生问题，每年全球约800万人死于癌症，其中结肠癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。早期结肠癌患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。
人口老龄化以及饮食结构的改变，近十年来，中国结肠癌的发病率逐年攀升，现在每年新发约40万人，每年死亡率20万人，每年发病率增速约为4％，远超2％的国际水平，早期可以没有任何症状，中晚期可表现为腹胀、消化不良，而后出现排便习惯改变。结肠癌患者在诊断时，80％为中晚期，早期诊断的比例仅为11.8％，有效的早期筛查和干预治疗可以使癌的发生率下降60％，病死率下降80％，目前临床实践中，结肠癌的诊断通常包括观察排便习惯的改变、便血、腹痛等，直肠指症，实验室检查包括大便常规、大便潜血试验，影像检查、B超、CT扫描、结肠镜检查等等；常用标志物为癌胚抗原(CEA)、结直肠癌抗原(CCA)、CA19-9，但是这些抗原检测的临床效果差异比较大，且检测的灵敏度和特异性有待提高。从这个意义上说，发现新的同时具有高灵敏度、高特异性的标志物，并实际应用于诊断是一件非常紧迫的任务。
发明内容
针对上述现有技术问题，本发明在研究FGF8(fibroblast growth factor8)这个细胞因子的过程中发现，FGF8在早期结肠癌患者的外周血中也有较高表达，且其表达差异足以区分健康人群和早期结肠癌患者。本发明利用此特点研制出用于结肠癌早期诊断的检测试剂盒，不仅于此，还发现经过抗癌治疗后的结肠癌患者外周血中FGF8的表达量还和癌症的预后密切相关，而结肠癌患者的疾病进展和血液中FGF8蛋白的浓度正相关。
基于此，本发明提供了一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，采用以下的技术方案：
一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：
(1)用于对待测样品进行分离纯化获得样本的试剂；
(2)用于对样本中FGF8蛋白表达量进行检测的检测试剂；
(3)标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于诊断早期结肠癌或评价结肠癌治疗效果。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述FGF8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1＝MQVTVQSSPN FTQHVREQSL VTDQLSRRLIRTYQLYSRTS GKHVQVLANK RINAMAEDGD PFAKLIVETD TFGSRVRVRG AETGLYICMN KKGKLIAKSNGKGKDCVFTE IVLENNYTAL QNAKYEGWYM AFTRKGRPRK GSKTRQHQRE VHFMKRLPRG HHTTEQSLRFEFLNYPPFTR SLRGSQRTWA PEPR。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述待测样品为血液、血清或血浆样品。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述待测样品为人体外周血。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述检测试剂属于流式细胞仪检测的试剂。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述检测试剂包含FGF8抗体。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，所述检测试剂包含FGF8蛋白标准品。
进一步的，上述一种用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，当所测对象外周血FGF8蛋白表达量高于正常值42％时，则表明该对象患结肠癌风险高于正常人群或其癌症治疗效果不佳。
进一步的，使用上述高灵敏FGF8诊断试剂盒诊断早期结肠癌或评价结肠癌治疗效果中方法，包括以下步骤：
(1)采集待测样品；
(2)对待测样品进行预处理，得到样本，加入偶联剂与样本偶联；
(3)加入FGF8特异性抗体和抗体染色剂，得到待测样本；
(4)对待测样本进行分析，从而获得待测样本中FGF8蛋白含量；
(5)将测得的FGF8蛋白含量与正常含量进行比较。
优选的，步骤(1)中的样品为人体外周血；
优选的，步骤(2)中所述预处理方法包括离心；
优选的，步骤(2)中所述的偶联剂为Gibco生产的微球；
优选的，步骤(2)中所述的偶联剂为-CHO修饰微球
优选的，步骤(2)中所述预处理方法包括采用密度梯度离心和超速离心对样品进行分离纯化。
优选的，步骤(2)中在另一优选例中，所述密度梯度离心包括步骤：将血液样品加入到密度梯度介质中进行离心，所述的密度梯度介质通过以下方法制备：将密度梯度介质1加入到容器中，将密度梯度介质2从容器底部加入，托起介质1；将密度梯度介质3从容器底部加入，托起介质2和1；将密度梯度介质4从容器底部加入，托起介质3、2和1；其中：
a)密度梯度介质-1包括2-5％蔗糖溶液；
b)密度梯度介质-2包括7-11％蔗糖溶液；
c)密度梯度介质-3包括14-22％蔗糖溶液；
d)密度梯度介质-4包括33-50％蔗糖溶液；
本发明具有的有益效果是：
(1)本发明首次意外发现通过检测血液样品中FGF8含量能够用于结肠癌的早期诊断检测，血液样品中FGF8蛋白的表达量在区分健康人与结肠癌患者时具有较高的灵敏度和特异性，并且结肠癌患者的疾病进展和血液中FGF8蛋白的浓度正相关；诊断结果精准有效，为结肠癌的早期诊断及疗效监控检测提供了新方法，为实现结肠癌的早期诊断、早期治疗，提高诊疗效率，延长患者生存期及判断预后，改善预后奠定基础。
(2)外周血具有取材方便、无创伤性、可连续检测等优点，利用外周血检测结肠癌诊断生物标志物可以及早发现结肠癌的发生，将临床结肠癌早期诊断提高到了一个新的水平。
附图说明
图1为20例健康人、20例早期结肠癌患者和20例晚期结肠癌患者的外周血FGF8蛋白表达量对比的箱状图；
图2为20例健康人对比20例早期结肠癌和20例晚期结肠癌患者的外周血FGF8蛋白表达量进行的ROC曲线分析；
图3为20例早期结肠癌对比20例晚期结肠癌患者的外周血FGF8蛋白表达量进行的ROC曲线分析。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所述结肠癌早期，对应于结肠癌TNM分期中的Tis-T4期，所述结肠癌晚期对应结肠癌TNM分期中的Nx-M1期。
本发明所用术语“ROC曲线”为受试者工作特征曲线，是以假阳性概率(特异性)为横轴，真阳性概率(敏感度)为纵轴所组成的坐标图，和受试者在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线，选择最佳的诊断界限值。ROC曲线越靠近左上角,试验的准确性就越高。最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阈值，其假阳性和假阴性的总数最少。两种或两种以上不同诊断试验对疾病识别能力的比较。在对同一种疾病的两种或两种以上诊断方法进行比较时，可将各试验的ROC曲线绘制到同一坐标中，以直观地鉴别优劣，靠近左上角的ROC曲线所代表的受试者工作最准确。亦可通过分别计算各个试验的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较，哪一种试验的AUC最大，则哪一种试验的诊断价值最佳。
实施例
健康人、早期结肠癌患者，晚期结肠癌患者外周血FGF8含量的比较以及ROC分析
1：采集待测样品并预处理。
试剂配备：
1)密度梯度介质1：3％蔗糖溶液。
2)密度梯度介质2：8％蔗糖溶液。
3)密度梯度介质3：18％蔗糖溶液。
4)密度梯度介质4：35％蔗糖溶液。
5)PBS缓冲液。
6)BCA蛋白浓度测试试剂盒
(1)血液样本的收集：收集(20例健康志愿者、20例早期结肠癌患者、20例晚期结肠癌患者)每人5ml外周血放入真空促凝管中，颠倒数次以便充分结合，静置20min，2000g离心15min，上清转移到新管。上清二次进行14800g离心15min，取上清，加入新离心管中得到血清。收集4ml外周血放于专用的EDTA抗凝管(管盖为紫色)内，颠倒10次，防止凝块，得到无凝块、无溶血的全血，2h内3000g离心5分钟，上清血浆转移到新管。
(2)血液样品的分离纯化
①血浆差速离心：血浆样本于4℃条件下，12000g离心20min；用移液器将上层血浆转移到新离心管A中，另准备一个新的离心管B，将A管中血浆经0.22μm过滤器滤入B管。
②密度梯度介质制备：超速离心管C标记样本编号，用长细钢针头替换1ml注射器自带针头，将1ml密度梯度介质1缓慢注入离心管底；将1ml密度梯度介质2从离心管低缓慢注入，托起介质1；将1ml密度梯度介质3从离心管低缓慢注入，托起介质2和1；将1ml密度梯度介质4从离心管底缓慢注入，托起介质3、2和1。
③血浆样本加样：用5ml注射器将B管中的血浆缓慢加入超速离心管中C中，若样本量不足，用PBS补充剩余体积，将超速离心管体积充满。采用热塑封仪进行离心管封口。
④分离纯化：根据采用的超速离心机转子设定转子参数，采用100,000g在4℃条件下离心15min。离心结束后弃上清，用4ml PBS悬浮沉淀，将悬液用5mL注射器转移至新的超速离心管D中，2ml PBS洗涤超速离心管C，洗涤液一并转移入D管中，剩余体积用PBS充满，热塑封仪进行封口。100,000g在4℃条件下离心10min，离心结束后弃上清，得到沉淀，根据沉淀量加入适量PBS悬浮(100-400μL)，并转移到新的1.5ml离心管E中，得到样本溶液。
⑤测定样本溶液中的FGF8总蛋白：根据BCA kit说明书配制蛋白浓度梯度标准液(0,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0mg/ml)。根据A液：B液＝1ml：20μL的比例配置适量的染色液(现用现配，避光存放)。将20μL蛋白标准液加入到酶标板中(A1-A6)，添加平行样(B1-B6)，20μLFGF8样本溶液加入到酶标板中(A7)，添加平行样(B7)。每孔加入200μL染色液。37℃恒温箱内避光孵育30min，使用酶标仪读取562nm下的吸光度。根据蛋白标准液计算标准曲线方程，将样本管OD值代入标准曲线方程计算出含10μgFGF蛋白的样本溶液的体积。
2.将CHO-微球与样本偶联
试剂配备
1)反应终止液：含100mM Gly(甘氨酸)、2％BSA的PBS溶液：3ml
2)洗涤液：含2％BSA的PBS溶液：3ml
3)封闭液：含10％BSA的PBS溶液：1ml
4)偶联剂：Gibcon微球(Gibco 4um–CHO修饰的微球)
操作步骤如下：
取2个1.5ml离心管标记为0、1(分别计为0号管和1号管)；Gibcon微球超声10s，涡旋混匀。0，1管各添加10μl微球，0号管加入90μlPBS，使得终体积为100μl；1号管加入含10μgFGF8样本蛋白的样本溶液，添加PBS至总体积为100μl。室温旋转混匀15min；用PBS将上述溶液稀释至400μl，涡旋混匀，室温旋转孵育20min；14,500g离心10min，取出上清保留做BCA检测(参考BCA检测试剂盒)；沉淀用1mL反应终止液悬浮，涡旋混匀，室温旋转孵育20min；用400μL洗涤液洗涤微球1次(14800g，10min)；用400μL封闭液悬浮微球沉淀，混匀，室温旋转孵育20min；14800g离心10min,弃上清；用400μL洗涤液洗微球1次(14800g，10min)；沉淀用100μL洗涤液悬浮后4℃保存或直接进行后续实验。
FGF8偶联量分析：
根据标准品的蛋白浓度及OD绘制标准曲线，列出标准曲线方程及R2值(y＝1.1584x+0.0757，R2＝0.9963)；根据标准曲线方程计算微球上FGF8蛋白偶联量(见表1)。
表1微球上FGF8偶联量检测结果示例(来源于一个早期结肠癌患者的样本)
Figure BDA0002142108810000061
偶联后上清浓度＝(样本OD-背景管OD)/1.1584(即偶联后上清浓度＝(1号管OD-0号管OD)/1.1584)。
偶联上量＝原液添加量-偶联后上清浓度*400(偶联时反应体系为400uL)。
偶联效率＝偶联上量/原液添加量。上述实验研究表明，FGF8蛋白的偶联效率≥45％，可进行下一步实验操作。
3.加入FGF8特异性抗体和抗体染色剂
试剂配备：
(1)洗涤液：(含2％BSA的PBS溶液)100mgBSA+5mLPBS FGF8一抗溶液：(1.0μl：20μl)1μl FGF8抗体原液+20μl洗涤液；
(2)二抗溶液：(2.0μl：20μl)山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa
Figure BDA0002142108810000062
488)预吸附二抗(ab150117)(原液稀释至100μg/mL)30μl+300μl洗涤液，充分混匀，避光保存；
(3)取2个1.5ml离心管，标记为0，FGF8；将样本(每管约100μl)用洗涤液稀释至500μl，混匀；14800g离心10min；0号管添加20μl洗涤液；FGF8管添加20uL FGF8一抗溶液；瞬离30s，转速达14800g；然后充分涡旋混匀，37℃恒温箱中静置孵育20min，每10min混匀一次；14800g离心10min弃上清；洗涤液洗1次；各管加入20μl二抗溶液，瞬离20s，转速达14800g；充分混匀，37℃恒温箱中静置避光孵育20min，每10min混匀1次；14800g离心5min弃上清，洗涤液洗1次，PBS洗1次。用100μl PBS悬浮沉淀，涡旋混匀，进入下一步流式细胞仪进行检测。
4.流式细胞仪检测与分析
使用BD FACSCalibur流式细胞仪，选择R1门区内10000个颗粒数，观察FL1通道荧光强度；用流式分析软件分析得到样本管阳性率数值，对处理后的流式结果进行整理分析。以实验组M1区间内FGF8微球个数占实验组总微球个数的百分比表示FGF8蛋白的表达量。
收集20例健康人、20例早期结肠癌和20例晚期结肠癌患者外周血，用上述方法检测血浆FGF8表达量，FGF8表达量的结果如下表2所示，20例健康人、20例早期结肠癌和20例晚期结肠癌患的FGF8表达量结果的箱型图如图1所示。
表2 20例健康人、20例早期结肠癌和20例晚期结肠癌患者血浆FGF8表达量(％)
Figure BDA0002142108810000071
5.ROC曲线分析
利用上述检测数据对健康人、早期结肠癌、晚期结肠癌患者外周血中的FGF8表达量进行ROC曲线分析比较。
本发明检测了20例健康人、20例早期结肠癌和20例晚期结肠癌患者血浆FGF8表达量，ROC分析结果如表3所示。
表3健康人与早期结肠癌患者、结肠癌患者FGF8检测诊断的ROC分析
Figure BDA0002142108810000072
通过表3和图2的ROC曲线结果分析发现，FGF8用于诊断早期结肠癌癌效果显著，AUCFGF8＝0.796(图2)，P＜0.01，其灵敏度和特异性明显高于常规指标CA19-9(0.7)；表明外周血FGF8蛋白检测对结肠癌早期诊断具有积极作用。
通过表3和图3的ROC曲线结果分析发现FGF8用于区分早期结肠癌与晚期结肠癌效果显著，AUC FGF8＝0.744，P＜0.01(图3)。表明外周血FGF8蛋白含量与结肠癌的疾病进展正相关。
ROC分析测定表明：根据“尤登指数”即敏感性-(1-特异性)，该指数值取最大值处就是最佳的界值，可得到健康人与结肠癌患者的最佳界值为42％，即所述样本中FGF8蛋白表达量高于42％时，则表明该对象患结肠癌风险高于正常人群或其癌症治疗效果不佳。
综合上述实验：本发明首次发现血液中的FGF8含量可作为结肠癌早期诊断的生物标志物，FGF8检测对结肠癌早期诊断具有积极作用，同时FGF8蛋白含量与结肠癌的疾病进展正相关，可用于评价癌症治疗的效果，根据上述实验内容本发明公开的用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒，在结肠癌的早期诊断和疗效评价等方面具有较好的应用前景。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都和同易创生物科技有限公司
<120> 用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏FGF8诊断试剂盒
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 194
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Met Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe Thr Gln His Val Arg
1 5 10 15
Glu Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Ser Arg Arg Leu Ile Arg Thr
20 25 30
Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Leu Ala
35 40 45
Asn Lys Arg Ile Asn Ala Met Ala Glu Asp Gly Asp Pro Phe Ala Lys
50 55 60
Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Val Arg Gly
65 70 75 80
Ala Glu Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Ile
85 90 95
Ala Lys Ser Asn Gly Lys Gly Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val
100 105 110
Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Gln Asn Ala Lys Tyr Glu Gly Trp
115 120 125
Tyr Met Ala Phe Thr Arg Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Ser Lys Thr
130 135 140
Arg Gln His Gln Arg Glu Val His Phe Met Lys Arg Leu Pro Arg Gly
145 150 155 160
His His Thr Thr Glu Gln Ser Leu Arg Phe Glu Phe Leu Asn Tyr Pro
165 170 175
Pro Phe Thr Arg Ser Leu Arg Gly Ser Gln Arg Thr Trp Ala Pro Glu
180 185 190
Pro Arg

Claims (1)

1.检测FGF8蛋白的试剂在制备用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：
（1）用于对待测样品进行预处理获得样本的试剂，
（2）用于对样本中FGF8蛋白表达量进行检测的检测试剂，
（3）标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于诊断早期结肠癌或评价结肠癌治疗效果；
其中：
所述待测样品为人体外周血，
所述检测试剂包含FGF8抗体和FGF8蛋白标准品，
所述FGF8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
上述应用包括以下步骤：
1）采集待测样品；
2）对待测样品进行分离纯化，得到样本，加入偶联剂微球与样本偶联；
3）加入FGF8抗体和抗体染色剂，得到待测样本；
4）对待测样本进行分析，从而获得待测样本中FGF8蛋白含量；
5）将测得的FGF8蛋白含量与正常含量进行比较，当所测对象外周血中FGF8蛋白表达量高于正常值42%时，则表明该对象患结肠癌风险高于正常人群或其癌症治疗效果不佳。
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