CN1849137A - 基于vefg,her－2,psa蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂 - Google Patents

基于vefg,her－2,psa蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN1849137A
CN1849137A CNA2004800257636A CN200480025763A CN1849137A CN 1849137 A CN1849137 A CN 1849137A CN A2004800257636 A CNA2004800257636 A CN A2004800257636A CN 200480025763 A CN200480025763 A CN 200480025763A CN 1849137 A CN1849137 A CN 1849137A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
protein
epi
isomer
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800257636A
Other languages
English (en)
Inventor
常小迦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ATTOGEN Inc
Original Assignee
ATTOGEN Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ATTOGEN Inc filed Critical ATTOGEN Inc
Publication of CN1849137A publication Critical patent/CN1849137A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic

Abstract

本发明提供制备和筛选抗体的方法。可以包括将许多抗原和编码抗原的核酸注射入宿主的方法。也可以包括对载体蛋白质使用抗原的融合蛋白质在制备和/或筛选抗体制剂的方法。可以是用于同时制备和/或筛选大量的不同的抗体的方法。本发明还提供用于治疗、防止或诊断与蛋白质的异构体相关的疾病或发展为疾病的可能的治疗和诊断的方法。

Description

基于VEFG，HER-2，PSA蛋白质异构体的用于诊断和 治疗的疾病的特效试剂
背景
自身的抗体是由称之为浆细胞的特殊淋巴细胞最初生成的。宿主动物体内产生的强烈的抗体反应，是通过介导和调整B细胞分化为浆细胞的过程来进行控制的。这种分化包括由原初B细胞(含有修饰的抗体作为细胞表面抗原受体，并不分泌抗体)转变为活跃B细胞(含有细胞表面抗体并且也分泌抗体)，然后转变为浆细胞(高度特异的抗体生产者，并不含表面抗原受体)。这种分化过程受抗原存在情况以及B细胞和T辅助细胞间通讯情况的影响。
由于抗体具有特异地结合抗原的能力，其已经被广泛地用于研究、诊断和治疗应用中。单克隆抗体的发展扩大了抗体潜在运用价值。与多克隆抗血清不同(其包含针对不同表位的抗体混合物)，单克隆抗体直接针对抗原上的单一的决定因子或表位，并且具有均一性。此外，单克隆抗体可以无限量地被生产。
抗体试剂在蛋白质体研究和药物应用中的使用已被极大地扩展和多样化。这些运用包括抗体治疗，免疫测定，亲和纯化，蛋白质表达，功能分析，组织和生物体成像。抗体微阵列技术目前正处于其初期，但在诊断和其他广泛的临床应用上具有极大的发展潜力。然而，在人类全基因组编码的总数大于100000种蛋白质中，目前只有少部分拥有其抗体配对物。这主要归因于目前抗体的生产在很小的范围基础上完成，并且其过程耗时费力。
例如，一种生产抗体的方法由Kohler和Milstein最初提出(Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495)，一种分泌抗体的免疫细胞先从被免疫的小鼠中分离，然后与B细胞肿瘤的一种骨髓瘤细胞进行融合。最终的杂交细胞(例如：杂交瘤细胞)能够在体外存活。一旦建立，这些杂交瘤细胞将不断分泌特定的抗体。
另一种生产单克隆抗体的方法是噬菌体展示库的构建。这种方法通过提取人全部外周血细胞的mRNA，随后构建cDNA文库，包含合适的所有免疫球蛋白可变区域的序列。这些cDNAs被插入噬菌体，将免疫球蛋白可变区表达为Fab片段。理论上，如果噬菌体库足够大，通过用感兴趣的抗原筛选噬菌体，可以分离出表达期望的Fab片段的特异噬菌体。然而，这种方法一般仅应用于充分纯化的抗原，而不能用于抗原混合物，如细胞表达的数千种表面抗原。
单克隆抗体目前应用于治疗急性和慢性人类疾病的临床试验，包括白血病，淋巴瘤，实体瘤(例如结肠，乳房，肝)，AIDS和自身免疫疾病。抗体治疗试剂作为商业应用的例子是抗-Her2(Trastuzumab或Herceptin)。抗-Her2是第一种人工抗体，用于治疗HER2的阳性转移乳房癌，其针对并阻止HER2蛋白的过量表达活动。虽然抗-Her2已经成功治疗乳房癌，然而这种药物的副作用导致27％的病人产生心肌症(Horton J.(2002)Cancer Control，9：499-507，Ewer et al.(2002)Proc Annu Meet Am Soc C1in Oncol.21：489)。这种药物的其他副作用也已有报道，包括一些超敏反应(包括过敏)，浸润反应，肺部病变。
对于Her2的鼠同源物erbB2的更多研究，解释了在防止扩大化的心肌症中Her2的作用(Crone et al.(2002)Nat Med 8(5)：459-465)。另一独立的临床研究报道，在20位运用抗-Her2的病人中，7位病人出现心肌摄取放射标记的抗-Her2现象(Behe etal.(2002)N Engl J Med.345：995-996)。这些研究让研究者得出结论：由于运用抗-Her2进行治疗的病人中，抗-Her2不能区分乳房和心肌中的Her2，从而导致心肌炎的产生。抗-Her2治疗性抗体的设计无法使抗体区分在疾病组织中过量表达的突变Her2和在心肌组织中表达的正常Her2。虽然抗-Her2对于其目标蛋白Her2具有高度的特异性，但是一个重要的问题是这个抗体无法区分疾病组织和正常、健康组织。综上所述，设计具备更好的特异性和有效性的抗体治疗方法十分必要。
这样，需要一种用于诊断和治疗应用的高产的抗体生产方法，以及药物发明。
摘要
这里提供了一些治疗性复合物，包含例如：一种表位的抑制物，该表位含有经证实为疾病相关表位的外显子结合点，和一个药物可接受载体。这种抑制物可以是一个抗体，如：一种单克隆抗体，可与SEQ ID NO序号为：2，4，6，8，10，11，13或15-25的任何一个表位特异结合。
另外，提供了包含核酸的治疗性复合物，此核酸包含疾病相关外显子结合点的表位和药物接受载体编码序列。这种核酸序列可以编码一种在SEQ ID NO序号为：2，4，6，8，10，11，13或15-25中与疾病相关的表位。包含编码疾病相关的包括在SEQ ID NO序号为：2，4，6，8，10，11，13或15-25中的表位序列的核酸的表达载体也被显示。表达载体另外可以包含编码载体蛋白序列的核酸。治疗性复合物也可包含一种多肽，该多肽包含疾病相关外显子结合点的表位和一个药物接受载体。这个多肽可以包含一种包括在SEQ ID NO序号为：2，4，6，8，10，11，13或15-25的疾病相关的表位。
此外，提供了一些siRNAs，针对编码表位的核酸序列，该表位包含从SEQ ID NO序号为：2，4，6，8，10，11，13或15-25中任一个挑选出来的氨基酸序列，还提供了编码siRNA的核酸。另外还包括了包含有这些核酸的载体，以及包含siRNA或编码此类的核酸的细胞。SiRNA或核酸可以以一种包含药物接受载体的治疗性复合物形式存在。
试剂盒也被提供。例如，治疗性试剂盒包含一种表位的抑制物，该表位包含一个外显子结合点，并被认为是一种疾病相关表位，试剂盒也可以包括治疗方案必需的第二种试剂或材料。试剂盒还包含使用说明书，以及施行抑制物的设备。诊断试剂盒包含一种表位的抑制物，该表位包含一个外显子结合点，并被认为是一种疾病相关表位，试剂盒也可以包括诊断方案必须的第二种试剂或材料。
此外显示了一些治疗方案。测定受试者是否患有VEGF异构体相关的疾病，包括(1)将来自受试者样本与特异结合表位(来自SEQ ID NO：2或4)的抗体相联，(2)测定抗体与样本的结合情况，若抗体与样本结合说明受试者患有VEGF异构体相关的疾病。测定受试者是否患有HER-2异构体相关的疾病，包括(1)将来自受试者样本与特异结合表位(来自SEQ ID NO：6或8)的抗体相联，(2)测定抗体与样本的结合情况，若抗体与样本结合说明受试者患有HER-2异构体相关的疾病。测定受试者是否患有PSA异构体相关的疾病，包括(1)将来自受试者样本与特异结合表位(来自SEQ ID NO：10，11或13)的抗体相联，(2)测定抗体与样本的结合情况，若抗体与样本结合说明受试者患有PSA异构体相关的疾病。测定受试者是否患有某蛋白异构体相关的疾病，包括(1)将来自受试者样本与特异结合蛋白质异构体疾病相关表位的抗体相联，该蛋白由这里所述的方法鉴定，(2)测定抗体与样本的结合情况，若抗体与样本结合说明受试者患有某蛋白异构体相关的疾病。
一种治疗性方法包括，例如，通过给予病人所需的治疗性有效剂量的试剂进行治疗，例如一种特异结合疾病相关的蛋白质异构体的抗体。这种试剂可以是之前所述的一种抗体。
一种治疗方案例子可以是这样一种方法：对于特异蛋白异构体相关疾病的病人的治疗，包括给予病人所需的疾病相关外显子-结合点表位的抑制物，例如：那些被认为是疾病相关外显子-结合点表位的抑制物。这种疾病可以是癌症，这些外显子结合点表位将在SEQ ID NO：2，4，6，8，10，11，13，或15-25中任一个中列出。病人也可被给予化疗治疗。这里还提供了一种疾病相关外显子结合点表位抑制物的使用方法，在疾病治疗的药剂的制备中有所运用，而该抑制物被认为是疾病相关外显子结合点表位抑制物。该疾病可以是癌症，该药剂可以和其他化疗药剂联用。在某方面，与从SEQ ID N0：2，4，SEQ ID NO：6，8，SEQ ID NO：10，11，13列出的表位分别特异结合的抗体，将分别用于治疗VEOF，HER-2，PSA异构体相关疾病药剂的制备。另一方面，某一抗体被用于制备治疗蛋白质异构体相关疾病的药物，该抗体可特异结合一种由这里所述方法鉴定的与疾病相关的蛋白异构体的外显子结合点表位。
另一方面，提供了一些疾病相关外显子结合点表位抑制子的应用方法，其被认为是一种疾病相关外显子结合点表位的抑制子，用于制备一种治疗疾病的药物。这些疾病可能是癌症。此方法可能额外包括给予病人其他化疗药剂治疗。
其他的方法包括与以下所列表位(SEQ ID NO：2或4；SEQID NO：6或8；SEQ ID NO：10，11或13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：20-21；SEQ ID NO：22-24；或SEQ ID NO：25)特异结合的抗体的应用，分别用于治疗VEGF，HER-2，PSA PDGFRβ，PSMA，CD86，催乳素，或胰岛素受体的异构体相关疾病药物的制备。另一方法包括与一种由这里所述方法鉴定的疾病相关蛋白质异构体外显子结合点表位特异结合的抗体的应用方法，用于治疗蛋白质异构体相关疾病的药物制备。
另外提供了一些从众多抗体中鉴定与目标蛋白结合的抗体的方法：(1)提供相互不同的连接有载体蛋白的众多抗体，其中至少有一种抗体可与包含目标蛋白部分结构的融合蛋白特异结合；(2)将部分或全部抗体连接到一个固相表面，从而得到覆盖有抗体的固相表面，不同的抗体连接在固相表面的不同部位；(3)将覆盖有抗体的固相与融合蛋白相连；(4)通过实验方法验证载体蛋白的存在与否，存在载体蛋白的表明存在针对目标蛋白的抗体。这些抗体可以是纯化或未纯化的抗体制备物。它们可以是免疫或未免疫动物的血清，或杂交瘤细胞培养上清。
目标蛋白可以是一种蛋白或配基的异构体，可有效引发针对它的抗体。某一方面，一种蛋白的异构体是与疾病相关的异构体，例如：VEGF异构体VEGF165和VEGF121，或一种可以有效引发针对其抗体的配基。连接了目标蛋白的载体蛋白可以包含分泌性碱性磷酸脂酶(SEAP)，辣根过氧化物酶，β-半乳糖酶，荧光素酶，或酶活性基团，以及IgG Fc(γ链)或其配基。提供的抗体可能与一固体表面相连，如蛋白质A，蛋白质A琼脂糖或其他蛋白质A偶联物；蛋白质G，蛋白质G琼脂糖或其他蛋白质G偶联物。分析载体蛋白存在情况的测定方法可以包括化学发光分析，荧光分析或比色分析。从众多抗体中鉴定目标蛋白抗体的方法需进一步在步骤3和4之间包含一洗脱步骤用于移去未绑定的目标蛋白。
目标蛋白可以是一种蛋白或配基的异构体，可有效引发针对它的抗体。某一方面，一种蛋白的异构体是与疾病相关的异构体，如病毒蛋白或可有效引发针对它的抗体的一种蛋白。连接了目标蛋白的载体蛋白可以包含分泌性碱性磷酸脂酶(SEAP)，辣根过氧化物酶，β-半乳糖酶，荧光素酶或酶活性基团以及IgG Fc(γ链)。融合蛋白或编码融合蛋白的核酸(例如：表达载体)的集合物，可以导入宿主体(例如：老鼠)。宿主能够同时接受至少310100种融合蛋白或100种编码蛋白的核酸。
另外提供了一种生产单克隆抗体集合物的方法，其中至少有一种单克隆抗体能够结合疾病相关蛋白质异构体，包括：(1)将融合蛋白或编码融合蛋白的核酸的集合物导入某一宿主，其中每一融合蛋白至少包含疾病相关蛋白异构体的配基和一个载体蛋白；(2)从宿主脾细胞中制备单克隆抗体分泌细胞的集合物；(3)由权利1所述方法筛选细胞，得到至少一种可以结合疾病相关蛋白异构体的单克隆抗体。
这些融合蛋白可以包括血管内皮生长因子异构体165(VEGF165)多肽DRARQENPCGPCSE(SEQ IN NO：2)；血管内皮生长因子异构体121(VEGF121)多肽DRARQEKCDKPRR(SEQ INNO：4)；HER-2接合异构体1多肽INCTHSPLTS(SEQ IN NO：6)；HER-2接合异构体2多肽CTHSCVASPLT(SEQ IN NO：8)或任何SEQ IN NOS：10，11，13或15-25。载体蛋白可包含分泌性碱性磷酸脂酶(SEAP)，辣根过氧化物酶，β-半乳糖酶，荧光素酶，或酶活性基团以及IgG Fc(γ链)。融合蛋白或编码融合蛋白的核酸(例如：表达载体)的集合物，可以导入宿主体(例如：老鼠)。宿主(例如：老鼠)能够同时接受至少310100种融合蛋白或100种编码蛋白的核酸。
这里提供了一些方法，从大量的抗体集合物中分离特异绑定目标蛋白的抗体，这些抗体与编码这些抗体的核酸相关，包括(1)将目标蛋白的至少一个配基与一个在固体表面的突起相连，(2)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下，将连接有蛋白的突起与编码这些抗体的核酸相关的抗体集合物相连；(3)分离与突起相连的抗体，即分离到针对目标蛋白的抗体。
在某一方面，与编码这些抗体的核酸相关的抗体是噬菌体。分离抗体的方法可额外包括将抗体从突起上分离下来的过程，并且/或者在步骤(2)和(3)之间加入一步洗脱过程。与不同的突起连接的不同蛋白可包含在与突起集合物连接的蛋白集合物中。固相表面可以包含至少10100或1000个突起。目标蛋白的配基可与钥孔嘁血蓝素(KLH)，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，IgG Fc(γ链)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，或多聚组氨酸标记尾巴。固相表面可包含生物素或链霉亲和素，镍，或谷胱甘肽。
这里还提供了一些测定在样本中抗原存在情况的方法，包括(1)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下，将样本与固相连接，该固相表面包含固定于特定位置的抗体集合物，(2)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下，将融合蛋白集合物与固相表面相连，每一个融合蛋白包含一个与固相表面的抗体特异接合的多聚肽，以及一个载体蛋白，(3)测定固相表面的每一个特定位置上载体蛋白的存在情况，若在某特定位置有载体蛋白的缺失或减少，则表明具有在特定位置与抗体接合的抗原，即表明样本中具有抗原。
固相表面可以包含至少100或1000个抗体。固相表面也可以是一种抗体阵列，每一个抗体固定于阵列的特定位置。载体蛋白可以是酶或具有酶活性的配基，则此方法还可进一步包括将固相表面与酶底物相连的过程。
在这里还提供了一种鉴定目标蛋白中的表位的方法，包括(1)提供编码融合蛋白聚合物的核酸，这里的每一个融合蛋白包含目标蛋白的6到15个或8到12个氨基酸多肽和一个载体蛋白，并且这些多肽包括了目标蛋白的不同序列，(2)将核酸集合物导入动物宿主；(3)从宿主细胞中制备单克隆抗体分泌细胞的集合物；(4)由前述方法筛选细胞，以鉴定针对目标蛋白的抗体，若存在针对某一多肽的抗体则表明该多肽对应于目标蛋白上的表位。蛋白可以是细胞表面受体，融合蛋白还可包含受体胞外部分上的氨基酸序列。
制备针对疾病的DNA疫苗的方法包括(1)鉴定疾病相关的蛋白上的一个或多个表位，例如，通过这里描述的鉴定目标蛋白上的表位的方法；(2)将编码一个或多个表位的核酸序列导入以个表达载体，即制备针对疾病的DNA疫苗。这里还提供了制备针对疾病的疫苗方法，包括(1)通过这里描述的鉴定目标蛋白上的表位的方法，鉴定疾病相关的蛋白上的一个或多个表位；(2)制备包含一个或多个表位的氨基酸序列的多肽，即制备了针对疾病的疫苗。
图表的简单描述
图1显示一种筛选噬菌体显示文库的示范方法。
图2显示一种筛选表位的示范方法。
图3显示一种筛选抗体阵列的示范方法。
图4显示一种VEGF异构体121，165，206的陈列。
图5显示一种针对疾病相关VEGF异构体的示范抗体的设计方法。
图6显示一种针对疾病相关CD44异构体的示范抗体的设计方法。
详细描述
定义
出于方便，在说明，例子和附加声明中使用的术语都在这里汇集。除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语拥有相同的含义，被具备这项发明所属领域通常技能的人所共识。
在说明和声明中使用的单数形式“一个”，“一个”，“这个”包括了复数情况，除非文中另有清楚说明。例如，术语“一个细胞”包括了细胞的集合物，包括它的混合物。
这里所用的术语“试剂”表示一种化学成分，一种化学成分混合物，一种生物大分子(如一种核酸，一种抗体，一种蛋白质或其配基，例如：一种多肽)，或一种来源于生物材料，如细菌，植物，真菌，或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织的提取物。这些药剂的活性将作为“治疗试剂”或“诊断试剂”有效地实施，“治疗试剂”或“诊断试剂”指局部或系统地作用于主体的具有生物学的，生理学的或药剂学的活性底物。
术语“氨基酸”是指包含所有分子，无论天然或人工合成的，其包括氨基活性和酸活性，并可以被包括在自然发生的氨基酸聚合体中。氨基酸的示范例子包括自然发生的氨基酸，类似物，派生物和其同源物；具有不同侧链的氨基酸类似物；以及所有前述的任何立体异构物。
这里所使用的术语：“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子上的抗原接合配基，例如：包含(“以免疫反应”)特异接合抗原的抗原接合位点的分子。在一个示范性的例子中，术语“抗体”特定地包括单克隆抗体(包括促效药，拮抗剂和抑制性或中和抗体)。从结构上看，最简单的自然发生的抗体(如IgG)包括四个多肽链，即以二硫键交联的两个重链(H)和两个轻链(L)。术语“VH”指抗体重链上的可变区域。术语“VL”指抗体轻链上的可变区域。天然的免疫球蛋白代表了包括数种分子，如IgD，IgG，IgA，IgM，IgE的分子大家族。该术语也包括杂交抗体，嵌合体抗体，人工化抗体，变更抗体，及其片段。包括但不仅限于Fab片段，和Fv片段。抗体可以用常规的技术片段化，并且用已述的完整抗体的筛选方法可筛选有效的片段。免疫球蛋白的Fab片段是一个多聚体蛋白，由免疫球蛋白的配基构成，包含了免疫球蛋白分子重链和轻链上的免疫活性部分，以共价键接合，并可以特异接合抗原。通过在此领域中所熟知的方法，可用木瓜蛋白酶将完整的免疫球蛋白分子水解成Fab片段。然而，Fab片段还可通过此领域中其他方法，在合适的宿主细胞中表达期望的免疫球蛋白重链和轻链配基而获得。
这里使用的“抗原”指可以激发一种或多种抗体的物质。抗原包括，但不仅限于多肽，蛋白，糖蛋白，多聚糖和脂类，其配基和其接合物。
在众多其他抗原中，如果一种抗体更适宜结合某一抗原，那么可称这种抗体“特异结合”该抗原或抗原上的表位。例如，抗体可能具有少于50％，20％，10％，5％，1％，0.1％的与其他一种或多种抗原的交叉反应。
这里使用的术语“载体蛋白”指一种蛋白或多肽，可以提高与某蛋白相关的针对此蛋白的抗体产生量，并且/或者能够用于测定与之相关的蛋白。出于免疫目的，许多不同的载体蛋白可以与多肽联用。选择使用何种载体蛋白取决于免疫原性，可溶性，(使之能获得与载体的最佳结合情况)，以及鉴定针对目标蛋白的抗体的筛选方法。两种最常用的载体是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)，和牛血清白蛋白(BSA)。其他例子包括碱性磷酸酶(SEAP)，辣根过氧化酶，荧光素酶，β-半乳糖甘酶，IgG Fc(γ链)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，多聚组氨酸标记和其他酶，如β-内酰胺酶，其他分泌蛋白或多肽。
这用到的术语“蛋白质异构体”指任何长度的氨基酸的聚合体，起源于选择性拼接结果。选择性拼接是一种过程(在转录阶段)，在以给定的RNA分子中，可选择的外显子(例如：编码某一蛋白上特定区域的基因的一部分)被合成(通过RNA聚合酶分子)，在同一基因中形成不同的mRNAs(信使RNA分子)。每一种这样的mRNA称为“基因转录子”。通常，通过不同外显子的细胞或组织特异性联合，一个单一的基因可以编码几种不同的mRNA转录。例如，VEGF165和VEGF121都源自VEGF基因。通过删除外显子6得到VEGF165(例：外显子5和外显子7接合)，通过删除外显子6和7得到VEGF121(例：外显子5和外显子8接合)。其他选择性拼接的产生原因/来源包括移码(例：mRNA/转录子中的不同的密码子被核糖体翻译)或翻译起始或终止位点的改变(在mRNA上，并在其翻译时)，作为结果，给定的内含子仍保留在mRNA转录子中。不同的身体组织以及一些疾病可以导致在给定的基因中产生选择性拼接(例：作为结果，在不同组织或疾病组织中产生不同的蛋白)。
“疾病相关的蛋白质异构体”或“疾病相关的蛋白质异构体”或“疾病相关的蛋白质异构体”指源自选择性拼接的任何蛋白质或多肽，其存在或异常的水平与疾病相关。例如，与非疾病影响的组织或细胞相比，可以发现其以异常水平或异常形式存在于受疾病影响的组织或细胞中。它可以是一种异常高表达的蛋白质异构体，或是一种异常低表达的蛋白质异构体，而其更改了的表达情况与疾病的发生和/发展相关。一种疾病相关蛋白质异构体也可以是一个突变或遗传变异过程中的基因翻译产物，其与其他与疾病起因有关的基因直接相关，或与之不均衡联接。
术语“表位”指抗原上一段与抗体适宜并特异接合的区域。一个单克隆抗体适宜结合某分子的单一特定表位，该分子可从分子特性上鉴定。一个特别的蛋白质或蛋白质异构体的表位可由有限的氨基酸残基构成，例如：5-15或8-12个残基，其在蛋白质或蛋白质异构体上以线性或非线性形式存在。被抗体识别的表位可以是，例如：5-15或8-12个残基构成的短肽，在疾病相关的(不以正常蛋白质异构体形式存在的)蛋白质异构体中，其跨越了两个区域，或两外显子，或两个多聚多肽片段的接合部位。疾病相关的蛋白质异构体可以是一种选择性拼接的RNA多变形式的翻译产物，其缺少一个或多个与编码正常蛋白的RNA相关的外显子。
ADAPI表位是一线性的或非线性的表位，如8-10个或10-15个能用于提升抗体识别蛋白质异构体能力的氨基酸。而这种蛋白质异构体起源于mRNA的选择性拼接或蛋白质的不同的翻译后修饰，正如蛋白质的水解。对于横跨两个外显子“联接区域”的线性表位而言，表位序列可能是在20个氨基酸残余区域之内的邻近序列，包含例如，外显子结合点两边的各10个氨基酸残余。
“疾病相关的蛋白质异构体的表位”指由外显子编码的表位，且由于例如拼接，在相同基因编码的正常蛋白质中并不表达。它也可以是由两个外显子结合点编码的表位，其外显子结合点在正常蛋白质中不表达。
这里使用的“表达”指多聚核苷酸转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随之被翻译成肽，多肽或蛋白质的过程。转录和编码的多肽正确地被称为“基因产品”。如果多肽来源于染色体DNA，表达可能包括在真核细胞中mRNA的拼接。
术语“免疫原”指在动物中引发免疫反应的化合物。这里使用的免疫原也指融合蛋白和编码这些融合蛋白的核酸。
“单克隆抗体”指在抗体制备中的抗体分子，所有抗体具有相同的特异性并且有相同的核酸产生。对于直接指向特异蛋白的单克隆抗体的制备来说，任何由细胞系连续培养提供的抗体分子产品的技术都可以利用。这种技术包括，但非限制于，杂肿瘤技术(见Kohler和Milstein(1975)Nature 256：496-497)；trioma技术；人B-细胞杂肿瘤技术(见Kozbor，等。(Immunol Today 4：72)，EBV杂交瘤技术(见Cole等，1985，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)和噬菌体显示来生产人单克隆抗体。人单克隆抗体可以被应用于这里所述的方法实践中，并可由人杂交瘤(见Cote等。(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：2026-2030)或EB病毒体外转化的人杂交瘤(见Cole等。(1985)：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)生产。
短语“非肠道给药”或“非肠道地给药”被熟知，并指区别于肠道内和局部给药的给药途径，通常通过注射方法，并包括但不限于：静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内的，囊内的，眶内的，心脏内，皮内，腹膜内，气管，皮下，表皮下，关节内，包囊下的，蛛网膜下的，脊髓内，胸骨内注射和输液。
“病人”，“主体”或“宿主”指人类或动物。
术语“多聚核酸”，“核酸”可替换使用。它们指任何长度的核酸聚合体，无论是脱氧核糖核酸还是核糖核酸或其类似物。多聚核酸可具有任何三级空间结构，具有任何功能，可以是已知也可是未知的。以下是未受限的多聚核酸例子：基因或基因片段上编码或非编码区域，由连接分析定义的位点，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酸酶，cDNA，重组多聚核酸，分支多聚核酸，质粒，载体，分离的DNA或任何序列，分离的RNA或任何序列，核酸探针，引物。多聚核酸可能包含修正的核酸，如甲基化核酸和核酸类似物。如果出现(修正的核酸)，核酸结构将在聚合物的装配之前或之后被给予修正。核酸序列可能被非核酸成分所中断。在聚合之后，多聚核酸能被进一步修正，例如结合一个标记成分。术语“重组”多聚核酸指在自然中不存在，或相连于其他多聚核酸以非自然形式排列的基因组，cDNA，源自半合成，或合成的核酸。“寡聚核酸”指少于100，75，50，25，或10个核苷酸的单链核酸。
术语“多聚肽”，“多肽”和“蛋白质”(单链)在这里可交替使用，指任何长度的氨基酸聚合体。聚合体可以是线性或环状，可能包含修正的氨基酸，并可能被非氨基酸所中断。该术语也包含被修正的，如：二硫化物结合形式，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化，或其他任何处理，如联接标记成分的氨基酸聚合物。这里使用的术语“氨基酸”指天然或非天然或合成的氨基酸，包括氨基乙酸和D或L型异构体，及氨基酸类似物和拟肽。
“预防性的”或“治疗性的”治疗此领域是熟知的，指给予宿主一种药物治疗。若在有害情况(如：疾病或其他对宿主动物有害的情况)的临床表现出现之前给予治疗，那么这种治疗是预防性的，例如，它保护宿主免受有害情况；而若在有害情况的临床表现出现之后给予治疗，那么这种治疗是治疗性的(例如：将减少，改良或改善现有的有害情况或其副作用)。
术语“药物可接受的载体”在此领域是熟知的，指药物可接受的材料，成分或媒介，如液体或固体填充物，稀释山梨(糖)醇液，赋形剂，溶剂或包装材料，起着将任何主体成分或组成，从一个器官，或身体部分，承载或转运到另一个器官，或身体部分的作用。每一个载体必须是可接受的，即与主体成分或组成具有同一性，并对病人无害。可作为药物可接受的载体的材料例子有：(1)糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖，(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，和其派生物，如羧甲基纤维素钠，乙烷基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)凝胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可油和蜡栓剂；(9)油，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油，大豆油；(10)乙二醇，如丙烯乙二醇；(11)多羟基化合物，如甘油，山梨(糖)醇，甘露醇和聚乙二醇；(12)硅脂，如乙烷油酸盐，乙烷十二酸酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)去除热源的水；(17)等渗盐溶液；(18)Ringer’s液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；(21)其他药物学使用的无毒可兼容物质。
短语“系统治疗”，“系统地治疗”，“外周治疗”，“外周地治疗”在此领域是熟知的，指某些成分，治疗剂或其他材料，不直接针对中枢神经系统，而是进入病人的其他系统，从而影响新陈代谢和其他类似的过程。
“目标蛋白”指一种蛋白质，例如：一种蛋白的异构体，其可以引发抗体增高。
“治疗”一种疾病指至少改善疾病的症状或至少阻止疾病的恶化。
“载体”是一种能转化并导入核酸分子进入宿主细胞，并且/或者在宿主细胞间，可自我复制的核酸分子。该术语包括了最初功能为将一种核酸分子导入细胞的载体，最初功能为核酸复制的载体，及表达载体，其功能为转录并/或翻译DNA或RNA。也可包括不只具有以上一种功能的载体。这里使用的“表达载体”被定义为多聚核酸，当导入合适的宿主细胞时可以被转录并翻译成多肽。“表达系统”通常指包含了表达载体的合适的宿主细胞，具有产生期望的表达产物的能力。
生产和筛选抗体的方法
这里提供了从众多的抗体中鉴定可以绑定目标蛋白的抗体的方法，包括(1)提供至少特定地绑定一种融合蛋白，至少包括连接载体蛋白的目标蛋白的部分的抗体。(2)至少某些抗体连接到一个固相表面，从而得到覆盖有抗体的固相表面，从而不同的抗体连接在不同的固相表面或在一个或更多个固相表面的不同位点。(3)将覆盖有抗体的固相与融合蛋白相连；(4)通过实验方法验证载体蛋白的存在与否，载体蛋白的存在表明存在针对目标蛋白的抗体。这些抗体可以是纯化的抗体制备物，如免疫球蛋白制备物(血清，免疫动物的多克隆抗血清)，单克隆抗体，细胞培养基(如杂交瘤细胞培养上清)，或是实验动物的腹水。相反的，抗体和融合蛋白连接后它们再与固相表面连接。这种方法也包括，首先生产结合融合蛋白的单克隆抗体，例如，给宿主注射融合蛋白并且从宿主得到的细胞中准备产生抗体的细胞。在某种情况下，生产单克隆抗体包括，(1)给宿主注射众多融合蛋白或融合蛋白编码的核酸，每种融合蛋白至少包含目标蛋白和载体蛋白的一部分。(2)准备产生大量单克隆抗体的细胞，如杂交瘤细胞，来源于宿主的细胞。(3)筛选产生单克隆抗体的细胞来分离那些希望得到的特征，例如通过检测载体蛋白。例如，至少310100300或1000种融合蛋白或编码融合蛋白的核酸被注射入宿主。通过使用这里描述的筛选分析方法可便利地筛选针对每种融合蛋白产生抗体的细胞，如通过检测抗体绑定到融合蛋白后的载体蛋白可以检测希望得到的抗体的存在。在有些情况下，对宿主注射的所有融合蛋白而言，载体蛋白是相同的或基本相同。在后者的情况下，筛选相当简单，因为相同的分析将允许鉴定产生大量不同抗体的细胞。
这里描述的任何方法将进一步包括决定是否鉴定的绑定蛋白异构体的抗体是与疾病无关的，例如鉴定特异地或优先地绑定疾病相关的蛋白异构体的抗体。例如，抗体绑定与疾病相关的蛋白异构体的Km值或亲和力至少高于与疾病无关的疾病蛋白异构体的Km值或亲和力的2，3，5，10，30或100倍。
这一领域的技术人员将认识到针对目标蛋白的抗体也许并不连接载体蛋白，用包含至少一部分目标蛋白和载体蛋白的融合蛋白筛选抗体产生的细胞。因此，在有些情况下，注射入宿主的蛋白质不同于用于筛选抗体产生细胞的蛋白质。当然，即使宿主注射的蛋白质不包含用于鉴定抗体的载体蛋白的氨基酸序列，但是此蛋白质必定包含提高宿主免疫反应的蛋白质或多肽的氨基酸序列。
在有些情况下，通过给宿主注射众多蛋白质来得到抗体，例如融合蛋白。在另一些情况下，通过给宿主注射一种或多种编码众多蛋白质的核酸来得到抗体，例如融合蛋白。例如，编码众多蛋白质的一种核酸被注射入宿主来准备众多蛋白质的抗体。相反，编码两种或更多蛋白质的两种或更多核酸被注射入宿主来准备两种或更多蛋白质的抗体。当一种核酸编码两种或更多蛋白时，核酸包含两种或更多启动子和/或其他调控元件。核酸也可能在编码两个或更多蛋白质的开放式阅读框之间包含数个核糖体结合位点。
在有些情况下，载体蛋白是便于从众多抗体中鉴定绑定目标蛋白抗体的蛋白质。载体蛋白可通过多种方法鉴定。适当的方法以载体蛋白的种类而定。例如，
载体蛋白可以用特定绑定载体蛋白的抗体来鉴定。因此，载体蛋白可以是获得或准备抗体的任何蛋白质或分子。例如，载体蛋白可以是一种标签，如组氨酸标签。载体蛋白可以是免疫球蛋白分子的不变区域，如IgG区域。载体蛋白也可以是被标记的蛋白质或其他分子，如荧光，磷光，放射性标记。其他载体蛋白可以是使酶活性增强的酶或酶的部分。例如，载体蛋白可以是分泌性的碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素酶，β-半乳糖甘酶或使酶活性增加的它们中的部分。酶可以是任何希望得到的种类，如人或非人的，如鼠。
这里也提供了制备绑定疾病相关蛋白或疾病相关蛋白异构体的抗体的方法，入疾病相关的外显子结合点蛋白。在某些情况下，与载体蛋白相同地，从数据库和编码包含在表达载体中的10-15或8-12个目标序列的寡核苷酸中选择人目标基因序列。然后，核苷酸被引入动物(如鼠)在体内引起抗原的表达并且促进免疫反应。从动物中分离B细胞并且产生杂交细胞。根据这里所述的方法筛选杂交细胞，如通过载体蛋白的鉴定。
可以根据这一领域的蛋白质合成的方法，通过化学合成制备蛋白质(如融合蛋白)。也可以通过重组获得蛋白质。尤其，可以通过融合编码目标蛋白或其一部分的核酸和编码载体蛋白或其一部分的核酸来制备融合蛋白。
编码目标蛋白和载体蛋白的核酸可以通过如聚合酶链反应(PCR)，从基因组DNA中扩增基因片段，cDNA，RNA(如通过RT-PCR)或克隆序列来获得。根据已知的基因或cDNA序列选择PCR初始序列，致使得到相对唯一的扩增片段。为了达到特异性和最佳扩增目的的需要，计算机程序可以用于初始序列的设计。参见如，Oligo version 5.0(National Biosciences)。用于设计和选择扩增初始序列的因素在例如bv Rylchik，W.(1993)“Selection of pimers for Polymerase Chain Reaction。”In Methods in Molecular Biology，vol.15，White B.ed.，Humans Press，N.J中被述及。可以从基因库或其他公共资源中得到序列。相反地，这项发明的核酸也可以通过这一领域的标准方法来合成，如通过使用DNA自动合成器。(这种合成器可以从Biosearch，Applied Biosystems，等购买)
在宿主或细胞中表达蛋白质的合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或从这一领域提供的大量的克隆载体中选择。尽管选择的克隆载体根据宿主细胞被用的意图而变，但是有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，拥有独特的核酸限制性内切酶单一位点或带有能用于选择包含载体的克隆的标记基因。合适地，但非限制性地例子有，质粒和细菌病毒，如PUC18，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌体DNAs和穿梭载体如pSA3和Pat28。这些和许多其他载体可以从商业卖主购买，如BioRad，Stratagene，和Invitrogen。
如果可适用，在这里描述的方法中使用的表达载体通常是包含编码目标蛋白或其一部分并且连接一种载体蛋白或其一部分的多聚核苷酸的可复制多聚核苷酸结构。这里描述的多聚核苷酸有效地连接合适的转录控制元件，例如启动子，增强子和终止子。对表达而言(如翻译)，一种或更多的翻译控制元件通常也是需要的，如核糖体结合位点，翻译起始位点和终止代码。这种转录和翻译的调控元件起源于目标蛋白或其同源序列(来源于其他基因或生物体)。编码信号肽的多聚核苷酸序列也能包括允许穿越或横跨细胞膜或从细胞分泌的多肽。大量的表达载体适合在真核细胞中表达，包括在这领域已知的酵母细胞，鸟类细胞，哺乳动物的细胞。表达载体的其中一个例子是pcDNA3(Invirogen，San Diego，Calif.)，其转录起始于细胞巨化病毒(CMV)早期启动子/增强子。这个载体也包含用于多聚核苷酸插入的多个核酸限制性内切酶识别位点。合适的克隆和表达载体包括任何这一领域已知的用于细菌，哺乳动物，酵母和昆虫的表达系统。特殊的表达载体和合适的宿主细胞已被这一领域所知并且无需在这里详细描述。可参见Gacesa and Ramji(1994)Vectors，John Wiley&Sons。
克隆和表达载体典型地包含一个可选择标记(如，与载体一起转化的编码宿主细胞存活或生长必需的蛋白质基因)，尽管这种标记基因可能携带其他多聚核苷酸序列共同转染入宿主细胞。只有选择性基因被转染进入宿主细胞的那些细胞才能在选择性条件培养下生长。典型的选择性基因有下列特点之一(a)对抗生素或其他毒性物质(如氨苄青霉素，新霉素，氨甲叶酸)有抗性作用；(b)补充营养缺陷形缺失物质；(c)提供从培养基中不能获得的必要营养。合适的标记基因的选择有宿主决定，不同宿主合适的基因已被这一领域所知。克隆和表达载体典型地包含被宿主识别的复制系统。
在宿主细胞中表达蛋白质的表达质粒可以是，例如：基于病毒的载体。
当给予宿主动物以蛋白治疗时，真核和原核宿主系统都可以用于生产重组蛋白质。聚合多肽可从细胞裂解物或培养基中分离，并按照其使用需要的程度进行纯化。这项发明中使用的合适的原核宿主细胞例子是埃希氏菌属大肠杆菌。真核宿主细胞的例子包括禽类，昆虫，植物，动物细胞如COS7，HeLa，CHO细胞。来源于真核生物的哺乳动物细胞系也经常作为表达聚合多肽的宿主细胞。培养的哺乳动物细胞的繁殖是众所周知的。见组织培养，学院出版社，Kruse和Patterson，eds.(1973)。
“转化”指通过已知的方法将带有期望的核酸的载体介导入宿主细胞。转化的方法，其依赖于宿主细胞的类型，包括电刺激转化；用于转化的氯化钙，氯酸铷磷酸钙，DEAE-右旋糖苷，或其他试剂；微注射轰击；脂质体；感染(载体是一种感染性的试剂)；及其他方法。一般地，见Sambrook等。(1989)和Ausubel等(ed)，(1987).上述核酸转入的参照细胞也包括这些细胞的子代细胞。
当转化入一个合适的宿主细胞，如，E.coli或COS-7，通过这里所述的方法可以检测到融合蛋白的表达。例如，基于鉴定连接了融合蛋白的载体蛋白，可以通过对培养上清或细胞裂解物进行化学发光，荧光，或比色分析来测定聚合多肽的存在情况。
通过酶切完整聚合多肽可以制备整个分子的特定聚合多肽片段。蛋白水解酶的例子包括，但不局限于，胰岛素，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，血纤维蛋白溶酶，凝血酶。完整聚合多肽可以同时，或分别与一种或多种蛋白酶反应。可选地，或另外，完整的聚合多肽还可被二硫化物去除试剂进行处理。通过此领域中所知的方法，多肽可以被相互分离，包括但不局限于，凝胶过滤色谱层析，凝胶电泳，和反相HPLC。
通过大量的熟知的生产抗体的方法，可以制备抗体，例如，多克隆抗体和单克隆抗体。抗体可从许多物种中被激发并分离，如鸡，老鼠(mouse)，老鼠(rat)，兔子，山羊，绵羊，马，骆驼，猴子和人类。生产单克隆抗体的典型的方法，包括，用设计好的免疫原注射宿主动物，通常是老鼠。在某一方面，蛋白的集合物被用于注射，如一些融合蛋白，另一方面，一些核酸的集合物被用于注射，这些核酸编码蛋白，例如融合蛋白，其每一个融合蛋白包括了目标蛋白的至少一部分及一个载体蛋白。在某一特别方面，宿主是一种啮齿动物，例如，老鼠。如在U.S.Pat.No.5721.122中所述，作为一种例子，用于免疫的老鼠可以是“零-抗原”。
在某一方面，宿主是一种转基因动物，其带有人类免疫球蛋白位点.例如，转基因动物可以是包含了人免疫球蛋白基因的老鼠，其内生免疫球蛋白基因已经被部分或完全地抑制活性。通过应答，在转基因宿主中观察到人类抗体的产生，其在所有方面与人类中观察到的(抗体)十分相似，包括了基因重排，装配，抗体库.这些方法在以下专利，例如，U.S.Pat.Nos.5545,807；5545,806；5569,825，5625,126；5633,425；5661,016，及下列发表刊物：Marks etal.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwildet al.，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14.826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)中有所阐述。
一种或多种抗原可以通过运用各种不同的方法免疫宿主动物。例如，通过皮下，肌肉内，皮内，静脉内，并且/或者腹膜内的注射。此外，淋巴器官，腿弯部的淋巴结，并且/或者脚垫内的注射也是可行的。分别地并且/或者同时地联合运用两种或更多不同的免疫途径，对于动物免疫可能是更适合的。
用于宿主动物免疫的融合蛋白的用量，例如，可以在0.01ug-250ug之间，1ug-100ug之间是比较合适的用量。可选地，用于宿主动物免疫的编码融合蛋白集合物的核酸的用量，例如，可以在0.01ug-100ug之间，1ug-25ug之间是比较合适的用量。例如，一只老鼠可注射10ug蛋白或10ug核酸。
在一特定方面，一只宿主动物可以注射三种或更多不同的蛋白，如融合蛋白，或其编码核酸，例如，至少3，10，30，100，300，或1000种不同蛋白或核酸或其联合物。在此项发明中的某一方面，一种宿主动物注射了包含2或更多不同蛋白或编码蛋白的核酸的混合物，可选地，还包含生理可接受的稀释液，如PBS或其他缓冲液。更适宜地，用于制备混合成分的融合蛋白已经至少经过一步的纯化过程。
这里所述的方法容许生产特异针对鉴定了的表位的抗体。更适宜地，被抗体识别的用于制备抗体的抗原，其氨基酸数量具有最少值，例如，至少具有6个氨基酸长度。抗原也可至少具有10，15，20，50，100个氨基酸长度。因此，抗原的氨基酸长度可以在6到15或8-12的范围。此外，针对线性表位(连续的氨基酸)的抗体，针对三维结构表位，例如，非线性表位，也可以通过例如，基于蛋白质结晶数据的方法进行制备。含有蛋白期望区域重叠序列的聚合多肽可以用于注射宿主。例如，短抗原(或多肽抗原)可以被设计成某蛋白质氨基酸线性序列的串联结构，或蛋白质氨基酸线性序列的交错形式。包含期望目标蛋白的不同长度的多肽，也可以用于注射宿主动物。在抗体集合物中，期望至少有一种抗体可以和自身抗原全长或部分区域相结合。具备生物抑制功能的抗体或中和抗体也可以期望通过这里所述的方法进行鉴定。
短抗原的集合物，例如，具备某一表位的长度，可以(基于一个目标蛋白)被设计并用于注射宿主。可选地，具备不同蛋白序列的短抗原的集合物也可注射入一个宿主。
某一方面，可以产生蛋白质异构体抗体，如外显子结合点特异抗体。这些抗体可以针对短肽序列，其存在于(1)一种特殊的蛋白质异构体外显子中，(2)跨越特殊蛋白质异构体的外显子-外显子区域(3)跨越一个外显子删除位点。由于其特异针对一种特殊的异构体，这些短序列称为“标记表位”。“标记表位”可由非线性氨基酸序列构成三维表位形式。它可以，例如，代表了一种三维表位，其代表目标蛋白质异构体的一种构象特征，而这种构象特征在目标蛋白质其他异构体中未有出现。
在抗体集合物中鉴定针对某一蛋白质异构体的抗体的示范方法包括(1)提供彼此不同的抗体集合物，其中至少有一种抗体可特异结合融合蛋白，该融合蛋白至少包含了蛋白质异构体的一部分区域，并连接了一个载体蛋白；(2)将抗体集合物与某一固相表面相连，得到覆盖了抗体集合物的固相表面，不同的抗体结合在此固相表面上的不同位置，(3)将覆盖了抗体集合物的固相表面与融合蛋白相连，(4)执行一项可鉴定载体蛋白存在情况的实验方法，若存在载体蛋白则表面存在有针对某一蛋白质异构体的抗体。
在注射了编码期望蛋白的核酸集合物后的不同时期，可以通过检测被注射动物的血清，判断源自这些核酸的蛋白质的产生情况。用于检测的方法将依赖于该蛋白是否连接有载体蛋白，以及载体蛋白的类型。在某一方面，载体蛋白是分泌性碱性磷酸酶(SEAP)。检测SEAP融合蛋白或其他产物的方法包括：从被注射动物静脉中抽取血液样本，血清经盐溶液稀释。SEAP融合蛋白的水平可以通过检测加入碱性磷酸酶底物后其激发的信号的方法进行检测。商业化的SEAP利用方法包括，但不仅限于Clontech’s Great EscAPcTM SEAP方法。其他融合蛋白的分析方法包括，但不仅限于一些商业化的方法，色度，半乳糖苷酶荧光或化学发光底物，HRP，内酰胺酶和lusiferase。这些方法擅长于抗体的高通量筛选。
当最初的反应较弱时，需要间隔性地加强免疫动物，直到抗体滴度升高或稳定。免疫后，(实验取血)获得样本血清，以检测特异抗体的产生。更适宜地，从宿主动物分离免疫细胞的前3-5天再给予最后一次免疫追加。
通过筛选，可以从被注射动物中得到针对一个目标蛋白的短抗原或针对各种目标蛋白的抗体。所制备的针对一个多肽的抗体可以测试其与多肽以及自身目标蛋白的活性。抗体与多肽和/或自身目标蛋白的亲和力可以至少为10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M。
单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，最初在Kohler et al.，Nature，256：495(1975)中阐述。如前所述，在杂交瘤方法中，生产抗体或具备抗体生产能力的脾细胞可以从被免疫的动物中获得。运用合适的“融合试剂”，如聚乙二醇或仙台病毒，这些细胞可以和骨髓瘤细胞融合，从而形成杂交瘤细胞。(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))
杂交瘤细胞在合适的培养基中生长，其中含有可地恰当地抑制未融合的父代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果父代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤细胞培养基中可特别包含次黄嘌呤，氨喋呤，和胸(腺嘧啶脱氧核)苷(HAT培养基)，这些物质可抑制HGPRT-缺失细胞的生长。
首选的骨髓瘤细胞是那些可高效地融合，为已选择的抗体生产细胞提供高水平的稳定的抗体生产能力，及对HAT等培养基敏感。在这之中，首选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞，如美国加利福尼亚州圣地亚哥Salk细胞分配中心提供的MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤，和美国弗吉尼亚洲马纳萨斯的American TypeCulture Collectailable提供的P3X63AgU.1，SP-2，X63-AG8-653细胞。210-RCY3.Ag1.2.3鼠骨髓瘤细胞系也是适用的。人骨髓瘤和鼠-人无限骨髓瘤细胞系在人单克隆抗体生产中已有叙述(Kozbor，j.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applicaations，pp.51-63(maredl Dekker，Inc.，New York，1987))
可选择地，可以通过其他方法从被免疫动物的免疫细胞中制备杂交瘤细胞系，例如，通过一种病毒(如，Epstein Barr病毒)或一种癌基因作用于免疫细胞使之无限生长，从而获得生产期望的单克隆抗体的无限生长细胞系。见Babcook et al.PNAS(USA)，93：7843-7848(1996)，涉及将来源于产生特异单克隆抗体细胞的免疫球蛋白cDNAs进行克隆，从而生产单克隆抗体，而其他生产单克隆抗体的策略为使用被免疫动物的免疫细胞。
产生抗体的细胞随之通过筛选，鉴定出那些产生针对期望蛋白的抗体的细胞。筛选那些与已经进行动物免疫的每一个抗原结合的抗体的工作，通常在培养上清和/或纯化抗体中进行，例如，从这里叙述的源自融合过程的杂交瘤细胞培养上清中。
在某一方面，将要测定的单克隆抗体可以于一个固相连接，例如，包含蛋白A，蛋白A琼脂糖(凝胶)，或其他蛋白A络合物，蛋白G，蛋白G琼脂糖(凝胶)，或其他蛋白G络合物。通常在多孔板中筛选生产抗体的细胞。固相表面与抗原连接。可选地，在测定的单克隆抗体与固相结合之前，抗体-抗原复合物可以通过免疫沉淀反应形成。当抗体-抗原复合物结合到固相表面是，未结合的抗原可以通过冲洗除去，从而可以通过测定抗原来鉴定阳性结果。
在某一方面，可以包含一个载体蛋白。在这种情况下，可以通过测定载体蛋白的试剂来测定与抗体结合的抗原的存在情况。例如，载体蛋白可以通过使用一种特异结合载体蛋白的试剂，如一种抗体来测定。如果这种载体蛋白是一种酶或其具备酶活性的配基，该载体蛋白的测定可以通过酶学方法进行。相应地，可以根据此领域中已知的方法，进行化学发光方法，荧光方法，或比色方法。
当生产抗体杂交瘤细胞期望的特异性，亲和力和/或活性经鉴定后，单细胞克隆可以通过有限稀释方法进行亚克隆(Goding，Monoclonal antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))；单细胞通过挑选进行克隆，或在软琼脂上生长进行克隆(Harlow and Lane，antibodies：A laboratory Manual ColdSpring harbor Laboratory(1988)；pps 224-227)。
杂交瘤克隆何以由标准方法进行培养。用于培养的适合的培养基包括，例如DMEM或RP-1640培养基，杂交瘤细胞可以作为动物腹水瘤进行体内培养。(Harlow and Lane，Antibodies：Alaboratory Manual Cold Spring harbor Laboratory(1988)；Chapter7)。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常用的方法从培养基，腹水，血清中分离，例如G蛋白或A琼脂糖凝胶，羟磷灰石色谱，凝胶电泳，透析，亲和色谱。
针对期望抗原的抗体分离过程之后，抗体可以进一步被利用或改良。在某一方面，嵌合体抗体被生产。“嵌合体”抗体是由经过遗传工程改造的基因编码的，这样其轻链和重链基因由不同物种的免疫球蛋白基因片段构成。例如，鼠单克隆抗体基因可变(V)片段，例如这里所述方法得到的，可以和人恒定(C)片段相连接。这样的嵌合体抗体对于人的抗原性可能比具有鼠恒定区和鼠可变区的抗体低。
这里使用的术语，人工化抗体(HuAB)指一种嵌合体抗体，其结构与人类结构具有充分的同一性(例如至少85％)，具有从非人源抗体中获得的CDRs，并其任何恒定区中至少85-90％，更适宜地，95％的多肽序列与人免疫球蛋白恒定区相一致。见示例，PCT出版WO90/07861和欧洲专利号0451216。因此，一个HuAb的所有部分，除了CDRs，都与一个或多个人免疫球蛋白序列对应部分具有充分的同一性。这里使用的术语“结构区域”，指免疫球蛋白轻链和重链上可变区域的部分，其(与CDR’s不同)在同一物种的不同免疫球蛋白中是相对保守的，见kabat，et al.(1987)Esequences of Proteins of Immunologic Interest，4th Ed.，USDept.Health and Human Servieds。
根据已知的方法，可从大量人细胞，但首选免疫B细胞中分离人类恒定区域的DNA序列。根据已知的方法，生产人类抗体的可变区域或CDRs可以从与此区域结合的单克隆抗体中分离，单克隆抗体可从任何方便的哺乳动物资源，包括老鼠，老鼠，兔子或其他可生产抗体的脊椎动物中产生。
用于DNA测序和表达并分泌抗体的细胞可以充许多地方得到，如American type culture collection(“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”5th edition(1985)Rodkville，Md.，USA)。在上述提到的获得抗体的方法(通过一种或多种抗原免疫动物)以外，还有其他合适的生产抗体的方法。Cole et al.和Boerner et al.提供的技术也可以用于制备人单克隆抗体。(Cole et al.，Monoclonal antibodies and Cancer therapy，Alan r.Liss，p.77(1985)andBoerner et al.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991))。
在某些方面，抗体文库，其中每一个抗体对应于编码其的核酸，如噬菌体显示系统，被用于高通量筛选对应一种或多种抗原的抗体。在某种特定情况下，一种或多种抗原，如目标蛋白的配基，与固相表面上的一个或多个突起或延伸相连接，其中不同的抗原与不同的突起相连。固相表面可以具有众多突起，例如，至少为2，5，10，25，50，100，300，1000，或3000个突起。带有突起集合物的固相表面称之为“多突起表面”。固相表面可以是具有大量突起的平板。连有突起的固相表面的一个示例是那些做成适合于承载的模式，如多孔板。商业性公司如Nelge NUNC或V&P Scientific，Inc.，可以提供或制造连有突起的固相表面。蛋白和融合蛋白可以通过合成或重组的方法进行制备，例如，在COS细胞中表达。根据此领域中已知的方法，可以将蛋白质与固相表面进行连接。例如，固相表面可以被抗生物素蛋白，链菌素抗体，镍，谷氨酸盐抗-标志抗体或抗-人Fc抗体覆盖。接着固相表面可以被抗体文库覆盖，例如，噬菌体显示文库，其中每一个抗体对应于编码该抗体的核酸。结合一段时间，有效形成或产生抗原-抗体复合物。接着冲洗以去除未连接的抗体，将置于一多孔容器上，使每一个突起或延伸都处于容器的不同孔中。根据此领域中已知的方法，通过酸溶液洗涤，抗原或抗原/抗体复合物可以从固相表面上分离下来，并进入的孔中。更多的抗体可以从对应该抗体的编码核酸中生产出来，例如噬菌体。这个方法可以重复多次。一个多孔容器可以含有12，24，48，96，384，1536个孔。其他可利用的固相表面包括多孔容器或珠子(例如Dynabeads)，其中，抗原存在于不同的孔或珠子上。这里包括了以此目的设计的，并可选择地连接抗原的固相表面。
用于此方法的抗原可以由连接或未连接载体蛋白的蛋白质构成。当载体蛋白与抗原相连时，抗原/抗体复合物的检测可以通过检测载体蛋白的存在情况进行。可选地，载体蛋白可以用于使抗原和固相表面相连。当使用载体蛋白时，应排除抗体仅和载体蛋白反应的情况，例如，将文库覆盖于已经予连接载体蛋白的固相表面。
一种包括了筛选噬菌体显示文库的方法的某一方面在图1中有所阐明。
抗体文库，例如，噬菌体显示文库，可以从自身的人源文库或疾病关联文库中分离的核酸中制备。Hoogenboom和Winter对噬菌体显示文库进行了进一步阐述，J.Mol.Biol.，227：381(1992)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。制备噬菌体文库的适合方法已经有所综述和阐明，见Wnter et al.，Annu.Rev.Immunol.，12：433-55(1994)；Soderlind et al.，Immunological Reviews，130：109-123(1992)；Hoogenboom.Tibtech February 1997，Vol.15；Neri et al.，Cell Biophysics，27：47-61(1995)。单链抗体文库的制备方法也有论述，见WO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93/11236，WO93/19172，WO95/01438，WO95/15388。抗体文库也有商业化的供应，例如，剑桥抗体技术(C.A.T)，英国剑桥。
抗体纯化的方法是此领域中所熟知的。见，Hriow和lane(1988)antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.纯化方法包括盐沉淀(例如，铵盐)，离子交换色谱(例如，在阳离子或阴离子交换色谱柱上，以中性PH开始并以离子强度逐渐加强的梯度洗脱)，凝胶过滤色谱(包括凝胶过滤HPLC)，和亲和树脂色谱，例如蛋白A，蛋白G，羟磷灰石，抗-抗体。抗体还可以通过此领域中熟知的方法进行亲和柱纯化。
这里叙述的方法也可以用于“表位筛选”(作为一种示范方法，见图2，)。在某一方面，生产蛋白，如融合蛋白的表达载体上包含的寡聚核酸，具有特异目标蛋白的短重叠和交错序列。表达载体可以导入宿主以产生抗体，则可以鉴定受限于生产的抗体的表位。例如，免疫宿主中得到的血清可与融合蛋白相作用，测定对应于每个融合蛋白的抗体的总量。在特定情况下，编码多肽的寡聚核酸或多肽可以用于免疫宿主，包含多肽和载体蛋白的融合蛋白被用于血清筛选。方法还包括从被免疫宿主中制备单克隆抗体，并用包含载体蛋白的融合蛋白筛选单克隆抗体。
短重叠氨基酸序列也可以通过化学合成，并与一个载体蛋白相连。这些融合蛋白可用于覆盖固相表面的多-突起板，随后用抗体文库，例如噬菌体显示文库，进行覆盖。扫描区域上每一个表位的抗体可以从抗体文库中被分离，并用于中和或“抑制功能”活性试验。
抗体可以作为，例如抑制抗体，被使用。此外，序列的混合物，根据分离出抗体或未分离出抗体的情况，可以表明表位在目标蛋白上的位置。蛋白质上的表位定位信息可以用于生产治疗剂，例如小分子。这也可以应用于，例如，测定受体胞外区域上的表位位置，例如G蛋白结合受体(GPCRs)。此方法也可用于制备GPCRs抑制抗体，包括趋化因子和激素受体。
在有些情况下，检测针对目标蛋白表位的方法包括：(1)提供编码众多融合蛋白的核酸，其中每种融合蛋白包含目标蛋白和载体蛋白的6-15或8-12个氨基酸多肽，而这些多肽又包含不同序列的目标蛋白。(2)给动物宿主注射众多融合蛋白。(3)从宿主动物中获得血清；筛选血清检测或确定目标蛋白表位的抗体数量，存在针对多肽的抗体表明此抗体对应于目标蛋白多肽。在另一些情况下，方法包含上面(1)、(2)，(3)从宿主细胞中制备产生众多单克隆抗体的细胞。(4)根据这里描述的方法筛选细胞来鉴定目标蛋白抗体，存在针对多肽的抗体表明此抗体对应于目标蛋白多肽。多肽可能包含目标蛋白的交错序列。
这些方法，如这里描述的对于抗原与抗体绑定的探测分析，能进一步用于筛选抗体组。在某些方面，抗体组与测试蛋白(如，血清，细胞或组织蛋白)一起在抗原/抗体复合物能够形成的条件下孵育。(见图3)没有绑定的蛋白质被洗去。然后，抗体组与包含多肽的融合蛋白接触，如绑定抗体组其中之一抗体并连接载体蛋白(如，SEAP)的多肽。在洗脱未绑定蛋白后，探测载体蛋白(如，通过增加碱性磷酸酶基质)，可读取抗体组。读取抗体组特定区域是阳性将表明无多肽-载体蛋白的抑制绑定蛋白质被加入，并且测试的样品不包含由特定抗体识别的蛋白质。因此，在样品中，越少的载体蛋白被特定抗体检测，则越多被抗体识别的蛋白质存在。
与靶标疾病相关的蛋白质异构体的成分
特定绑定与疾病相关的蛋白质异构体的药剂能用于治疗和诊断的目的。这种药剂可以绑定由外显子编码且仅存在于mRNA中编码疾病相关的蛋白质异构体的蛋白质的一个区域，如由相同基因编码，在正常蛋白质中并不存在。这种药剂可以绑定包含外显子结合点的且仅存在于mRNA中编码疾病相关的蛋白质异构体的蛋白质的一个区域。药剂可以是绑定与疾病相关的蛋白特定区域的任何分子或分子络合物(或化合物)。
药剂可以是与疾病相关的蛋白质异构体的拮抗物或抑制剂，如与疾病相关的结合表位的拼接变异体的拮抗物或抑制剂。抑制剂可能先前并不知道或先前以为是疾病特定表位拼接变异体的抑制剂。抑制剂可能已经被测定为疾病特定表位拼接变异体的抑制剂。这种拮抗物或抑制剂可以被用于治疗或阻止与特殊拼接变异体相关的疾病，将进一步在这里被描述。
判断药剂是拮抗物或抑制剂的方法，包括用疾病的细胞或动物模型的方法，如包括将癌细胞的移植入裸鼠。
药剂可能是一种先前不知道的绑定疾病相关表位的蛋白质。例如，它可以是一种先前未知的抗体或先前未知的绑定表位的抗体。药剂可以是已经被测定的绑定疾病相关蛋白表位的药剂。药剂可以是由这里描述的任何方法鉴定的药剂。
在某些方面，药剂是一种抗体，其中的片段或其中的派生物，如嵌合的或乳化的抗体。抗体可以根据这一领域已知的或这里描述的方法获得。绑定特定疾病相关的蛋白质异构体的抗体将进一步在这里被描述，如疾病相关的表位可能包含一个外显子结合点。
抗体可以绑定特定的疾病相关蛋白异构体，如在表1中描述的那些。抗体可以是绑定特定的疾病相关蛋白质异构体的表位，如在表1中描述的那些。
已经被证明与疾病相关的蛋白质异构体可以通过如下数据库确定：
PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/)，
PubMed Central(http：//www.pubmedcentral.nih.gov/about/intro.html)，
OMIM(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)，
PROW(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PROW/)。
一旦被鉴定，疾病相关异构体的序列可以从基因库得到( htt p：//www.ncbi.nlm.nih.gov/GenbankSearch.html)。表1列出了与疾病相关蛋白异构体的例子和异构体的基因库编号。
                 表1：疾病相关的异构体蛋白示例
  基因   编号   Spliced variant/蛋白质异构体   关联疾病
  P53   NM_000546NP_000537.2   许多Spliced variant和突变体   许多类型的肿瘤
  Fas   M67454AAA63174.1   跨膜区域缺失，溶于血清   硅肺病
  FactorH   M17517AAA52016.1   Spliced short variant   卵巢癌，拼接因子H在肿瘤中比正常组织高5.5倍
  CD86   BC040261AAH40261.1   CD86(deltaTM)   白血病，AML
  erb-B2/Her2   M11730AAA75493.1   HER-2(缺失胞外区域，因此提高了激酶活性和转化活性)   乳腺等；在转移性乳腺癌中HER2-splice表达量有4.4倍升高
  VEGF   P15692GI：17380528   VEGF165(缺失外显子6)   肺，结肠和胶质母细胞瘤中的肿瘤转移；黄斑恶化
  VEGF121(缺失外显子6&7)   乳腺癌，肺，胰腺beta细胞癌变，黑素瘤
  MDM2   BT007258AAP35922.1   缺失外显子造成的7个短异构体，与恶化高度相关   乳腺癌
  FGF-8   D38752BAA22527.1   异构体FGF-8a，-8b，-8c，-8f，肿瘤相关的FGF-8b异构体过量表达   乳腺癌
  FGFR2-IIIb   NM_022975NP_0752642   缺失外显子7-10   软骨肉瘤
  PSM   NM_004476NP_004467.1   PSM”(226核酸缺失)   前列腺癌-癌细胞中高表达，正常细胞中基础表达
  PSA   BC005307AAH05307.1   缺失氨基酸45-88，在肿瘤中发现其他拼接变异体
  KLK2   BC005196AAH05196.1   缺失外显子4   前列腺癌
  InsulinR   NM_000208NP_0001999.1   缺失外显子17(删除IR，无酪氨酸激酶区域)   糖尿病
  Enovin(PDNFO   AJ245628CAB52396.1   组织特异拼接，疾病/拼接形式   神经元不发生
  (TCR)-zeta   J04032AAA60394.1   外显子IV/V间插入密码子，缺失外显子II，VI，VII，(V+VI)，(VI+VII)，(II+III+IV)，(V+VI+VII)   红斑狼疮和其他疾病
  KST1(钠/葡萄糖转运子)   NM_062944NP_443176.2  外显子6缺失   BFIC，ICCA综合症
  Dystrophin   S73125AAB20696.1  外显子缺失造成的几种异构体   肌营养不良症
  IL-6受体   NM_000565NP_000556.1  可溶的IL6R   RA
  CD44   NM_000610  CD44R1(V8-10)   结肠，肺
 CD44v7/8   风湿性关节炎(仅见于疾病连接)
 CD44v6   乳腺癌
 CD44v5   Wilms癌；其高表达与肿瘤关联
 CD44v7   自体免疫，肠
 CD44v3   自体免疫，皮肤
  TGF-alpha   NM_003236  变异体I(Va I)   在数种肿瘤系中提高转化活性
 变异体II(Va II)   在数种肿瘤系中提高转化活性
  Tenascin-C   NM_002160  缺失FN III区域   大泡性角膜病变，人角膜
  肌钙蛋白T2   NM_000364.1  缺失外显子7(12个氨基酸)   原发性心肌炎
  肌钙蛋   NM_000363  血清可溶形式   原发性心肌炎
  白I
  PRL-3   NM_032611NM_007079   异构体I异构体II   结肠直肠癌转移，心肌肥大
  EGFR-1210a.a618a.a405a.a705a.a934a.a   NM_005228.3NM_201282.1NM_201283.1NM_201284.1   异构体a异构体b异构体c(可溶的)异构体dEGFRvIII(缺失外显子2-7)   黑色素瘤，粘液瘤乳腺，胰腺癌，肝转移；NSCLC，鳞片细胞瘤，肾细胞瘤；胶质母细胞瘤
  雌激素受体-alpha   缺失外显子5缺失外显子6缺失外显子7   乳腺癌增长乳腺转移性癌/tomaxifen抗性雌激素-敏感和tomaxifen抗性
  雌激素受体-beta2beta-delta3   I在外显子5和6间缺失一部分(54核酸，18a.a)缺失外显子3(117核酸，39a.a)   在卵巢和肿瘤位点异常表达；对促效剂Estrogm，和拮抗剂Tomaxifen响应
  GPCR：   BC069611   第一个胞内环具   骨瘤
  降血钙素R1674bp；474a.a   AAH69611.1   有16个a.a
  GPCR：多巴胺R(D2)   第三个胞内环具有29个a.a   调整激素转录和分泌
  GPCR：OPRM1   NM_000914NP_000905.1   插入外显子10(58个a.a)   与阿片样物质高度亲和
  Ca-感知受体   D50855BAA09453   前列腺转移
  原肌球蛋白3-异构体5   NM_152263NP_689476   TM5异构体   膀胱癌
  PDGFA   NM_002607NP_002598   外显子6   许多生长调节恶性因子
  PDGFB(通过染色体转移融合)   NM_002608NP_002599   COL1A1-PDGFB融合体(der922)t(17；22))   表皮纤维肉瘤，纤维胚细胞癌
  PDGFβ受体(通过染色体转移   NM_002609NP_002600.1   CEV14-PDGFRbeta(q33；q32)；NIN-PDGFRB(q33；q24)   AML；慢性骨髓及外骨髓增殖失调；
  形成几个融合蛋白) tel-PDGFR beta融合体(q33；p11.2)；RABPT5/PDGFRB融合体(q33；p13)；   AML；CMML
  泌乳刺激素受体   BC059392AAH59392.1   许多异构体，例如外显子6缺失和外显子11缺失   乳腺癌
         表2：疾病相关的病毒蛋白示例
  病毒疾病   病毒蛋白   基因库编号
  SARS   铆钉表面蛋白   GI：30027620
  HIV   HIV-1(env)   AY223790AAP57385.1
  HCV，C肝炎病毒   聚合蛋白   NC_004102NP_67149.1
  Mycoplasma hyorhihis   P37   X14140CAA32357.1
于不同蛋白质异构体相关的疾病的示例包括，但不仅限于：风湿性关节炎，糖尿病，急性骨髓白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，卵巢癌，前列腺癌，乳腺癌，结肠癌，胶质母细胞瘤，黑色素瘤，肺癌，肾癌，肌肉萎缩症，神经精神异常，常染色体多囊肾病(ADPKD)，心血管疾病，阿尔茨海默氏病。与肺癌和结肠癌相关的蛋白质异构体包括血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF121(见示例和图5)。膀胱，乳腺，卵巢和肺癌相关的蛋白质异构体包括HER2异构体1和HER异构体2(见示例)。与许多癌症和自身免疫疾病相关的蛋白质异构体包括CD44异构体CD44R1，CD44v5，CD44v7，CD44v3(见示例和图6)。
疾病相关的表位可以包含仅在疾病相关蛋白质异构体中表达的，该外显子不在正常蛋白质中，例如不与疾病相关的蛋白质中表达。这些多肽的氨基酸序列包含了疾病相关外显子结合点，并在表3中列出。
            表3：疾病相关多肽的氨基酸序列
  多肽氨基酸序列   疾病相关异构体
  DRARQE/NPCGPCSE(SEQ ID NO；2)DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO；4)INCTHS/PLTS(SEQ ID NO；6)CTHSCV/ASPLT(SEQ ID NO；8)AHCIR/KPGDD(SEQ ID NO；10)HCIR/KPGDDS(SEQ ID NO；11)PQWVLTAAHCIR/KPGDDSSH(SEQ ID NO；13)EQIEELKRQT/LPFKVVVIS(SEQ ID NO；15)QVTVQSSPNF/TQHVREQSLV(SEQ ID NO；16)SERLQDFDKS/NPIVLRMMND(SEQ ID NO；17)(a.a646-666)GLPDRPFYR/HVIYAPSSHN(SEQ ID NO；18)(a.a.680-700)NEATNITPKHN(SEQ ID NO；19)(a.a.47-57；在PSMA中序列缺失)TRLLSSPFSI/VLPTVIICV(SEQ ID NO；20)(a.a235-251)   VEGF-165VEGF-121HER-2结合异构体1HER-2结合异构体2PSA-delta44PSA-delta44PSA-delta44CEV14-PDGFRβFGF-8bPSMA异构体-2PSMA异构体-2PSMA异构体-1CD86(delta TM)
  ACTCTTATAAATGTG/AGAAAAAATCCATAT(SEQ ID NO；21)LLFLNTCLLN/VQPDPPLELAVE(SEQ ID NO；22)APVLVALALIESGMKYEDAIQFIRQ(SEQ IDNO；23)(a.a 111-135)AVHCVAGLGR/KRRGAINSKQ(SEQ ID NO；24)CGGCCAGAGGCTGAG/ACTTTGGAATGACCA(SEQ ID NO；25)   CD86(delta TM)泌乳刺激素受体，异构体-2，(缺失a.a 24-124，101个氨基酸)PRL-3异构体-1PRL-3异构体-2胰岛素受体(IR，CD220)，糖尿病中缺失外显子17(160bp)
“/”指外显子结合点处。
试剂也可以是一种蛋白质(除了抗体以外)，一个多肽或其派生物或类似物，如拟肽。鉴定例如蛋白质，多肽或其他分子或重组分子等试剂的方法在此领域中是熟知的。
其他针对疾病相关蛋白质异构体的试剂包括那些抑制疾病相关蛋白质异构体的生产的物质。例证性的试剂包括小干扰RNAs(siRNAs)或核酸，反义核酸，核酸酶，三重核酸密码子，显性负性突变，小干扰RNAs(siRNAs)或核酸，反义核酸，核酸酶，三重核酸密码子可以针对那些编码只存在于疾病相关蛋白质中的配基的核酸序列，该配基在同样基因编码的正常蛋白质中不存在。例如，这些试剂可以针对一种核酸序列，其中的外显子只存在于疾病相关蛋白质异构体中，而不存在于正常蛋白中。它们也可以针对那些跨越了外显子-外显子结合点区域，并特异对应于疾病相关蛋白质异构体的核酸序列。
siRNA分子可以包含一种核酸序列，本质上由存在于与疾病相关的拼接变异体中的一个序列组成，但不存在于相同基因的与疾病无关的拼接变异体中。例如，siRNA分子可以包含一种核酸序列包含或本质上由列出的SEQ ID NOs：1(VEGF 165特定核酸序列)，SEQ ID NOs：3(VEGF 121特定核酸序列)，SEQ ID NOs：5或7(Her2拼接变异体特定核酸序列)序列组成。或任何编码多肽的核酸序列：SEQ ID NOs：2，4，6，8，10，11，13，或15-25。
siRNA分子可能包含两条链，每条链原则上包含至少相互互补的核酸序列。这种序列原则上对应于疾病相关的拼接变异体序列，作为siRNA“正义序列”或更常见地作为“正义目标序列”被提及并且这种序列原则上作为补充序列，作为siRNA“反义序列”或“反义目标序列”被提及。正义和反义目标序列可以是15-30左右的连续分子长；19-25左右的连续分子长；19-23左右的连续分子长或大约19，20，21，22或23左右分子长。正义和反义序列的长度由这种情况决定，具有上述长度的正义和反义靶标序列的siRNA能抑制目标基因的表达，更适宜地，并不显著引发宿主的干扰反应。
siRNA的正链目标序列可以是至少与目标基因部分“本质上相同”或“充分地相同”，如至少有95％，98或99％相同，提供的siRNA包含的序列可以干扰基因序列的表达。
正链目标序列的核酸碱基构成可以是约50％的腺腺嘌呤(As)和胸腺嘧啶脱氧核苷(Ts)和50％的胞嘧啶(Cs)和鸟嘌呤(Gs)。可选地，碱基的构成中Cs/Gs的含量也可以至少为50％，例如含60％，70％，80％的Cs/Gs。相应地，正链目标序列的选择将基于核酸的碱基构成。关于siRNA对于目标核酸的可及性，以下的方面是应考虑的，例如Lee等在Nature Biotech.(2002)19：500中描述的。此项应用包括寡核酸链的使用，其作为探针可与目标蛋白互补，以测定底物的可及性，例如在细胞提取物中。当与寡聚核酸探针形成二聚体后，该底物对于RNase H敏感。因此，通过(例如PCR)测定RNase H对于给定探针的敏感性，反映了选择位点的可及性，并可能体现相应的siRNA对于抑制目标基因转录能力的预测值。可以通过算法来鉴定引物，用于聚合酶链反应(PCR)方法或者用于鉴定反义寡聚核酸以鉴定首个目标序列。
正链和反链目标序列是合适地、高效互补的，siRNA包含的两条序列可以抑制目标基因的表达，例如，可介导RNA干扰。作为示例，该序列在期望的条件下可以高效地互补从而形成杂交链，例如在一种细胞中。相应地，正义链和反义链目标序列可以至少为95％，97％，98％，99％或100％同一性，例如，至少有5，4，3，2，1，或0个核酸的不同。
正义链和反义链靶序列是一些合适的序列，除了目标核酸或其互补链，它们可能不与其他序列相互作用。这一点可以通过以下例子证实，将选择的序列和其他目标细胞基因组的序列进行比较。序列比较可以通过此领域中的方法进行，例如运用BLAST运算方法，在此将进一步阐述。当然，还可以进行小范围的试验，以验证特异的首个目标序列可以特异抑制目标核酸，而非其他基因的表达。
除了正义链和反义链以外，siRNA还可以包含其他序列。例如，siRNA可以由两股RNA构成的RNA双链，其中至少一股链具有3’突出端。另一股链可以是平末端或具有突出端。当RNA分子由双链构成，并且每条链都包含突出端的情况下，两条链的突出端可以是同样长度或不同长度。在一特别情况下，siRNA包含正义链和反义链序列，其每一条序列存在于一条RNA链上，并由约15-30，例如19-25个成对核酸构成，并在RNA3’端具有1-3个，更常见为2个核酸构成的突出端。为了进一步提高此发明涉及的RNA的稳定性，3’突出端可以增加抵抗降解的能力。在某一方面，加入嘌呤核苷酸，例如腺嘌呤或鸟嘌呤，可以加强RNA的稳定性。可选地，通过嘧啶替换形成改良的类似物，例如将2个尿嘧啶核酸形成的3’突出端替换成2’胸腺嘧啶，可以增强siRNA的稳定性，并不会影响其效力。在组织培养液中，2’羟基的缺失可以增强核酸突出端的稳定性。SiRNA的RNA链拥有5’磷酸基和3’羟基。
在某一方面，siRNA分子包含两条RNA链，形成双链结构。在另一情况，siRNA分子由一条RNA链构成，形成发卡环，其中正义链和反义链靶序列进行杂交，并且在两个序列间是一段空间结构，有效地形成发卡结构环。空间序列可以包含任何长度的任何核酸聚合物，具有此序列的空间结构连接的两条互补寡聚核酸可以形成发卡结构，其中至少空间结构的一部分可在发卡的近端形成环结构。例如，空间序列可以是3到30个核酸，或3到20个核酸，或5到15个核酸，或5到10个核酸，或3到9个核酸。该序列可以包含任何序列，只要不干扰发卡结构的形成。特别地，空间序列最好不应包含第一或第二靶序列的重要同源物，因其可以干扰发卡结构的形成。空间序列也不宜于其他序列相似，例如将要引入核酸的细胞基因组序列，因这将在细胞中造成不良情况。
具备此领域中一般技术的人可以理解，当特指一个核酸时，例如RNA，此RNA可以包含自然发生的核酸或其派生物，只要该派生物可以增强核酸的稳定性。任何派生物都是可接受的，只要该核酸能够具备所期望的功能。例如，siRNA可以包含核酸派生物，只要该siRNA仍能够抑制靶基因的表达。
例如，siRNA可以包含一个或多个改良的碱基，和/或一个为了增强稳定性或其他原因而改良的主链。例如，自然RNA的磷酸二酯键可以被改良，从而至少包含氮或硫原子中的一种。此外，磷酸二酯包含不常见的碱基，如次黄(嘌呤核)苷，或改良碱基如三苯甲基化碱基，作为两个例子，在此发明中也可以被使用。对RNA的大量的改良提供了许多有用的效果，并作为此领域中的技术被熟知。这里使用的术语“siRNA”包含了如化学的，酶的或代谢的siRNA的改良形式，它们是从内源模板演化而来。
合成和纯化siRNA的方法是此领域中所熟知的。介导siRNA进入细胞的方法也是此领域中所熟知的。SiRNA可以通过细胞外的介导进入体腔，空隙，哺乳动物循环系统，或通过口服。口服介入的方法包括直接将RNA和哺乳动物的食物混合，或通过工程技术，将经工程改造后可表达RNA的物种作为食物，然后喂食给实验动物。例如，食用细菌，如乳酸乳球菌，可以通过转化生产dsRNA(间WO93/17117，WO97/14806)。血管或血管外环境，血液或淋巴系统即脑髓液也是注射RNA的位点。
siRNA也可以在细胞内生产，例如来源于编码siRNAs的载体。此类载体在以下有所论述，例如，Paul et al(2002)NatureBiotechnology 29：505；Xia et al.(2002)Nature Biotechnology 20：1006；aeng et al.(2002)Mol.Cell 9：1327，thijn et al.(2002)Science 296：550；BMCBiotechnol.2002 Aug 28；2(1)：15；Lee et al.92002)Nature Biotechnology 19：500；mmccmcanus et al.92002)RNA 8：842；Miyagishi et al.(2002)Nature Biotechnology 19：497；Sui et al.(2002)PNAS 99：5515；Yu et al.(20020PNAS 99：6047；Shi et al.(2003)Trends Genet.19()：9；Gaudilliere et al.(2002)J Biol Chem.277(48)：45442；US2002/0182223；US 2003/0027783；WO 01/36646；WO03/006477。也有商业化的载体供应。例如，pSilencer可从Gene Therayp Systems，Inc.获得，pSUPERRNAi系统可从Oligoengine获得。
反义链核酸，核酸酶，及三重核苷酸可以作为siRNAs作用于基因上的同样区域。制备，纯化或介导这些核酸进入细胞或物体的方法是此领域所熟知的。
在某一方面，一种试剂，如一个小分子，是通过合理的药物设计而被鉴定的。该方法使用三维坐标资料库，其中包含蛋白质疾病相关异构体的至少一个配基，如蛋白质疾病相关异构体特异的表位。合理的药物设计方案包括计算机相关的方法，来鉴定结合蛋白质表位的试剂，包括(1)提供一个计算机模型应用软件，一套分子或分子复合物的结构坐标，分子或分子复合物包含表位上的至少一个配基；(2)提供一个计算机模型应用软件，一套试剂或化学物的结构坐标；(3)测定化学物是否可以结合分子或分子复合物。测定是否结合分子或分子复合物的更适宜的方法，包括在化学物和分子或分子复合物之间提供一个合适的操作，通过计算机分析合适的操作的结构，以量化化学物和分子或分子复合物之间的关联程度。该方法包括对化学物文库的筛选。该方法还包括提供和合成化学物，并分析其与表位的结合能力。也包括测定化学物是否是表位的抑制物或对抗物，例如，通过测定化学物能否治疗或预防表位相关的疾病。可选地，该方法进一步包括了测定化学物是否适合用于诊断方法。
这里还提供了一种方法，制备结合蛋白质的疾病相关表位的试剂，例如，通过计算机相关方法设计，并通过化学或酶合成该化学物，如上所述。
此发明还提供了一种设备，其包含了分子或分子复合物和化学物间形成的复合物的表现情况，如结合了的抗体。其中一种设备是在其记忆中包括了复合物表现情况的计算机。在某一方面，计算机包含一个可机器识别的记忆存储介质，其包含的数据存储材料，是由机器识别的包含复合物的原子坐标的数据编码的。计算机可能还包括一个贮存处理机器可识别的数据指令的工作记忆，其主要处理设备连接工作记忆和用于处理代表复合物三维空间的机器可识别数据的机器可识别数据贮存介质。计算机也可以包含连接显示三维空间表示的中央处理设备的显示。
治疗的效用
那些这里描述的或这里描述得到的药剂，如抗体，可以用于疾病的治疗或防治，其中该试剂，例如抗体的存在对于一个特异分子是收益的。在有些情况下，抗体用来做目标药剂，如作为特殊细胞的毒素。例如，可以用特定绑定癌细胞表面的蛋白质的抗体释放的一种癌细胞毒素杀死癌细胞。在另外情况下，这种目标抗体不绑定存在于正常细胞的蛋白质。如，我们可以用绑定特定的疾病相关的蛋白质的异构体或拼接变异体的抗体，如在癌细胞中本质上仅存在于疾病的蛋白异构体。当然，如果异构体出现在位于身体不同部位的正常组织，抗体可能会绑定该异构体，假设目标抗体并不杀死所有正常组织的细胞。
除了在外显子中的疾病相关异构体的目标序列，药剂(如抗体)也可以绑定并不于疾病相关的在蛋白异构体中未发现的外显子-外显子结合点。药剂还可以绑定并不在正常的蛋白质异构体中发现的与疾病相关的三维表位。除了绑定线性表位的药剂之外(continguous氨基酸)，基于蛋白质异构体的结晶数据，绑定三维空间表位不绑定线性表位的药剂也能被制备。
在某些情况下，单一的药剂如抗体，被注射入病人体。在另些情况下，众多的抗体被注射入病人体。抗体可以是针对相同抗原的不同抗体，如抗原的不同的表位，或抗体可以是针对不同抗原的抗体。特定的治疗可以包括两种计划的结合。不同的抗体可以根据这里描述的方法来制备。如，与特定的疾病相关的蛋白质或编码蛋白质的核酸的众多多肽，能被注射入宿主动物来制备单克隆抗体。
这里也提供包含编码疾病相关蛋白质异构体的表位的核酸序列的DNA疫苗，这种疫苗可用于防治或治疗如癌的疾病。表位可以是10-15或8-12个来源于疾病相关蛋白质异构体的线性或非线性序列的短小多肽的氨基酸残余。表位可以横跨两个外显子的连接位点，这种连接点对与疾病相关的特殊蛋白质异构体是唯一的，并且不存在于正常主体或疾病主体的正常组织中发现的蛋白质异构体中。在某种特定情况下，DNA疫苗编码两个或更多来源于单一蛋白质异构体的或多个蛋白质异构体的表位并且可以用于这样如特定的疾病指示的结合。DNA疫苗也可以是与载体蛋白(如血清蛋白，SEAP或其他分泌多肽或蛋白质)融合，编码特殊序列的表位，如编码10-15个氨基酸。DNA疫苗可用于在这里进一步描述的疾病的防治与治疗。可仿效地，DNA疫苗包括编码或鉴定这里描述的多肽的核酸序列。
被绑定的蛋白质异构体和相关的疾病在这里进一步被描述，如表1，2和3。
治疗性的抗体也可以绑定与蛋白质G连接的受体(GPCRS)。事实上，目前被标记的药物有60％绑定不同GPCRS，并且目前没有有效的方法用于提高针对这些受体的抗体。因此，如这里所述，可制备位于那些受体胞外区域的短小序列抗体。
能被抗体绑定的致病的疾病和蛋白质的例子包括细菌，病毒，微等离子和寄生虫的感染。病毒包括流行性感冒病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，肝炎病毒(如肝炎病毒C)和冠状病毒(如严重急性呼吸道综合症(SARS-CoV))，引起肺结核的结核菌和引起疟疾的疟原虫。
抗体可以是多克隆的或单克隆的，整个分子或分子片段。许多保留整个抗体绑定活性的抗体片段被典型地使用。这种抗体片段非限制性的包括Fab，Fab2，
Fab’，Fab’2和单链Fv(scFv)。
裸露的或非络合的，单克隆抗体能用于治疗。一种可能的机制是宿主效应机制的补充，如抗体覆盖的肿瘤细胞单克隆抗体上具有的抗体依赖的细胞细胞毒性，和噬菌作用/白细胞郁滞。多项在动物和病人中的研究表明了当单克隆抗体与白介素2结合并补充其功能效应时的抗肿瘤效应。一个示例是针对非何杰金淋巴瘤的抗CD-20抗体retuximab。
通常，另一种利用裸露单克隆抗体的机制策略是其对于恶性细胞生长和分化的抑制。这可以通过阻止肿瘤生长和分化刺激分子的通路而完成。示例包括herceptin(赫赛汀)和抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体C-225。
抗体或其片段可以和一种检测标签相联合，连接，匹配，结合，或其他任何连接。与测定标签间的连接可以是共价或非共价的；牢固的连接是较适宜的。检测标签可以直接与特异针对目标的抗体相连接，或可以通过一个第二部分进行连接，如通过特异针对一抗的二抗，通过蛋白A或通过生物素/抗生物素蛋白或生物素/链酶亲和素型连接。在抗体特异结合目标的同时或随后，检测标签可以被释放。这些检测标签包括放射同位素或放射核酸，荧光基团，化学发光染料，生物发光复合物，磁性微粒，酶标，底物，辅助因子，抑制子和其他类似物。见，指，导这些标签使用的专利，U.S.Pat.Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；4,366,241。标签可以在物体中对细胞进行追踪和放射。可以使用非侵入技术进行检测的标签是更适宜的，虽然内窥镜也可以用来测定被检测的标签的位置。
抗体可与其他功能部分结合。当与毒素，药物或前药物如化学治疗试剂或放射核酸结合时，该抗体可被称为“免疫毒素”。适合与抗体结合的试剂包括capecitabine，mitoxantrone(米托蒽醌)，aflotoxin，阿霉素，环磷酰胺，5-氟尿嘧啶，irinotecan，丝裂霉素，紫杉醇，cisplatinum，假单胞菌毒素，金环蛇毒素，篦麻毒素。正如这里进一步阐述的，这些试剂可以共价结合抗体，或通过带有特异结合配对成分的连接基团进行连接，如生物素/抗生物素，生物素/链霉亲和素，抗体/抗原。出于这些治疗目的，多肽和其他试剂，也可以和细胞毒素试剂和化学治疗试剂相结合，而该多肽可与已经鉴定的目标物质之一，如与一种疾病相关蛋白质异构体特异结合。
抗体与细胞毒素或标签之间的连接可以通过许多异种双功能交叉连接无物完成，如双功能蛋白结合试剂，如N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)丙酸盐(SPDP)，碳化二亚胺戊二醛，巯醇亚胺(TT)，imidoesters双功能派生物(如二甲基adipimidate HCL)，活性脂(如二琥珀酰亚胺底物)，醛(如戊二醛)，叠氮复合物(如叠(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，叠-重氮派生物(如叠-(p-diazoniumbenzoyl)-ehtylenediamine)，二异氰酸化物(如2，6-二异氰酸甲苯)，和双-活性氟复合物(如1，5-双氟-2，4-二硝基苯)。例如，篦麻毒素抗毒素可以通过以下方法制备，Vitetta etal.Science，238：1098(1987).Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methylaiethylene triaminepentaacetic acid(MX-DTPA)是一种螯合试剂，可以将放射核酸与抗体相连接。见WO94/11026。它们可以通过合成或重组制备。
抗毒素，包括单链分子，可以通过重组方法制备。许多生产抗毒素的方法是该领域中所熟知的，并且可以在“单克隆抗体-毒素结合：瞄准魔力子弹，”Thorpe et al.(1982)Monoclonal Antibodies in Clinical Medinine，Academic Press，pp.168-190；vitatta，Science(1987)238：1098-1104；和Winter，Milstein(1991)，Nature 349：293-299。
许多细胞毒素试剂都适宜作为抗毒素被使用。毒素试剂包括，但不仅限于，放射核酸，如碘-131，钇-90，铼-188，铋-212；许多化学治疗试剂，如长春地辛，氨甲蝶呤，阿霉素，cisplatinum；细胞毒素蛋白如核糖体抑制蛋白，如美洲商陆抗病毒蛋白，假单胞菌外毒素A，篦麻毒素，白喉毒素，篦麻毒素A链，等，或在细胞表面具备活性的试剂，如磷脂酶(例如，磷脂酶C)。通常见，“Chimeric Toxins，”Olsnes和Phil Pharmac.ther.，15：355-381(1981)；和“Monoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy，”等。Baldwin和Byers，pp.159-179，224-266，AcademicPress(1985)。
另一方面，抗体可以和一个受体连接(如链霉亲和素)，形成抗体-受体联合物并施用于病人作为肿瘤预定位运用，随后用洗涤试剂从循环系统中除去未结合的联合物，然后施用与细胞毒素试剂(如放射核酸)结合的“配基”(如抗生物素蛋白)。抗体也可以与前药物激活酶连接，该酶可以使前药物(如肽基化学治疗试剂，间WO81/01145)转变为具活性的抗肿瘤药物。见，例如，WO88/07378和U.S.Pat.No.4,975,278。相应地，免疫联合物的镁成分可以包括一种酶，其能以上述过程作用于一种前药物，是其转变成更具活性的，细胞毒性的形式。此发明中的方法使用的酶包括，但不仅限于，可将包含磷酸的前药物转变为自由药物的碱性磷酸酶；可将包含硫酸盐的前药物转变为自由药物的arylsulfatase；可将非-毒性5-氟胞嘧啶转变为抗肿瘤药物，5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨(基)酶；可将含多肽的前药物转变为自由药物的蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧基肽酶，组织蛋白酶(如B和L)；丙氨酰羧基肽酶，具有转变含有D-氨基酸替代物前药物的功能；碳水化合物-裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经氨(糖)酸苷酶，可将含糖基化前药物转变为自由药物；β-内酰胺酶，可以将来源于β-内酰胺的药物转变为自由药物；青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可以将药物的胺氮替换为苯氧乙酰或苯乙酰，从而转变为自由药物。可选地，具备酶活性的抗体，在此领域中称为“抗体酶”，可以用于将前药物转变为自由活性药物(见，例，Massey，Nature328：457-458(1987))。抗体-抗体酶联合物可以如此所述被制备，并用于将抗体酶介导入肿瘤细胞中。
利用此领域中熟知的技术，如使用异相双功能交联试剂，可以将酶共价地和抗体结合。可选地，可以通过此领域中熟知的重组DNA技术构建酶/抗体融合物，此发明中，该融合物至少包括抗体的抗原-结合区域及其连接的酶活性功能配基。(见，例，Neuberger et al.，nature，312：604-608(1984))。
这里论述的抗体和其他试剂可以用于病人的治疗，当其与化学治疗试剂或方法(如手术)联用时。“联用”并不需要同时使用。例如，绑定了疾病相关蛋白质表位的试剂可以同时或连续地与化学治疗试剂联用。在某一方面，每一试剂在任何一天都可以用于病人治疗。
肿瘤的化学治疗可以通过抑制DNA合成来完成，或直接地，或非直接地抑制三磷酸脱氧核糖核酸前体的生物合成，以阻止DNA复制和随后的细胞裂解。(见，例如，Gilman et al.，Goodman and Gilman’s：The Pharmacological Basis of Therapeutics，Eighth Ed.(Pergamom Press，New York，1990))。这些包含烷[烃]化剂的试剂，如亚硝基脲，抗-代谢物，氨甲蝶呤和羟基脲，和其他试剂，如etoposides，campathecins，bieomycin，doxorubicin，daunorubicin，等，虽然不特异针对细胞周期，但由于其对于DNA复制的影响，都在S阶段杀死细胞。其他试剂，特别是秋水仙素和长春藤碱，如长春碱和长春新碱，影响微管的装配，并导致有丝分裂的停滞。化学治疗方案通常包括运用化学治疗试剂来提高治疗的效果。
在某种特定情况下，这里叙述的试剂将用于那些对于先前的治疗无反应或仅有有限反应的病人的治疗。例如，一种试剂可以用于一位肿瘤病人，化学治疗对于他没有产生有效的效果。这样，作为已经接受了化学治疗的病人，他可以应用这里论述的方法。
用此领域中的任何方法，可以将抗体介导入病人体内。通常包括静脉内，肌肉内，皮下的，肿瘤内的注射或灌输。抗体被特异设计成水溶形式，使其保持正常结构和抗体结合能力，并对于病人是药物可接受的。期望的形式是无菌的并无热源的。
抗体能以药物复合物形式施用于病人，其包含了一些具治疗效果的抗体和一个药物可接受的载体(附加的)和/或稀释液。例如，对于固体肿瘤，包含抗体的复合物可以注射入肿瘤、或肿瘤的周围。对于血液肿瘤，如白血病，复合物可以输入血液或骨髓。作为治疗的抗体的起效量依赖于作治疗的疾病的类型，疾病的发展阶段和病人的年龄。
适合注射治疗的药物成分可以包含一种或多种抗体，其可与一种或多种药物可接受的成分相结合，如无菌等渗水或非水溶液，分散剂，悬浮剂，或乳化剂，或在使用前能溶解入无菌注射剂或分散剂的注射无菌粉末，它们可以包含糖，乙醇，抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，溶质，提供与血液等渗的环境期望所易接受的，或混悬或增稠剂。这些成分也包括佐剂，如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。为防止复合物受微生物影响，可以加入许多抗细菌和抗真菌试剂，如paraben，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸，和类似物。在复合物中加入等渗试剂如糖，氯化钠，和类似物也是合适的。另外，通过加入可延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和凝胶，来延长注射药物制剂的吸收时间。
在一些情况下，为了延长药物的作用时间，在皮下或肌肉内注射时，通过设计来减缓抗体的吸收。这可以通过使用具备低水溶性的结晶悬浮液体或无定形材料实现。随之，抗体的吸收速度依赖于分解速度，而其依赖于结晶的大小和结晶的形态。可选地，可以通过将抗体溶解或悬浮在油相中，来减缓注射-治疗抗体的吸收。
抗体的微囊形式包含于可生物降解的聚合物，如聚交酯-聚糖脂之中，可以制备出注射存储库形式。依赖于抗体结合聚合体的速度和使用的聚合体的自然特异性，抗体释放的速度可以被控制。其他生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚合(酐)。也可以通过将人体组织可接受的脂质体或微乳液包裹抗体，可以制备注射存储库形式。
作为预防应用，包含抗体或其鸡尾酒的成分可以给予受到疾病发展阶段的病人的治疗，以提高病人的抵抗力。其使用量定义为“疾病预防起效量”。在使用中，精确的用量依赖于病人的健康程度和综合免疫水平，通常在每剂量0.1到100mg的范围内，特别是每人1到10mg。
在一些治疗方法中，与单独使用抗体相比，第二种试剂(例如，白介素)以可以激活细胞效应的用量，与抗体联合使用作为治疗，可增强对于恶性细胞的细胞毒作用。白介素-2作为治疗的剂量可以是约500000U/kg。
除了使用抗体之外，其他治疗方法包括给予病人一种试剂。至少使用这些试剂的意义与使用抗体相同。例如，和抗体结合表位的过程向类似，一条多肽可以被设计并结合于一个表位。结合疾病相关蛋白质的异构体或表位的多肽或其他分子，siRNA，反义链，核酸酶，或三重核酸或特异针对疾病相关蛋白质异构体的显性阴性突变，都可以给予患有疾病的病人治疗。包含这些试剂的药物复合物的治疗方法，包括了这里叙述的抗体的，和其他在此领域所熟知的方法。
这里叙述的方法，特别是表位的筛选方法，也可以被用于鉴定用于疫苗使用的多肽和其编码核酸。在某一方面，针对疾病如癌症或一种病源疾病的DNA疫苗，通常基于对目标疾病蛋白编码基因上表位筛选的结果。例如，大量覆盖了整个目标蛋白的多肽，或其编码的核酸，与载体相融合，给予宿主动物治疗后以激发其体内的免疫反应。通过测定被免疫动物的抗血清，可以鉴定表位多肽的免疫原性。装载表位多肽的融合蛋白，或目标异构体全长蛋白的一个片段，可以通过上述的方法用于检测抗血清的滴度。基于这些结果可以设计疫苗。特别地，疫苗可以包含多肽或其编码核酸，它们在宿主动物中已经生产出抗体。特别地，针对某多肽的高滴度血清表明此多肽具有特别好的免疫原性。几种高免疫原性的表位，无论其来源于单一目标蛋白异构体或几种蛋白异构体，都可以被联合选择并应用，作为针对一种给定疾病的联合疫苗。
为了测定DNA疫苗的效力，该疫苗可以对实验动物模型进行免疫。在此领域中，针对许多疾病，例如针对人类肿瘤的动物模型是熟知的。在一个例证中，无论在接受DNA疫苗免疫之前或之后，该动物将被接种人肿瘤。通过实验动物中肿瘤的减小情况可以反映该疫苗的保护性或积极效果。不受特异过程的限制，肿瘤-特异的DNA疫苗可以激发任一或全部身体的免疫反应，例如，细胞免疫和体液免疫。
这里也提供了一种制备疫苗，如DNA疫苗的方法，以应对某疾病，包括(1)鉴定疾病相关蛋白的一个或多个表位，(2)制备包含一个或多个表位的氨基酸序列的多肽，或将编码一个或多个表位的核酸序列插入一个表达载体。在目标蛋白中鉴定表位的放债将在此进一步叙述。“疾病相关蛋白”或“与疾病相关的蛋白”指某些蛋白，通过作用其本身可以进行疾病治疗或预防。
包含至少一个疾病相关蛋白表位，如一个外显子结合点表位的多肽，及其编码的核酸，也可以被用于治疗的目的。多肽本质上也可以由疾病相关蛋白表位构成。该表位可以是已经鉴定为疾病相关的表位。多肽可以用于，例如，疫苗应用，来保护病人，以使特异表位相关的疾病不再发展。多肽也可以用于疾病患者的治疗，例如，癌症。这样，如上所述，多肽可以和DNA疫苗以类似的方法使用。
多肽可以是5到30，5到20，5到15，或5到10个氨基酸长度。多肽也可以是50个氨基酸长度，或至少40，30，20，10个氨基酸长度。多肽可以包含单个或多个表位，如2，3，5个表位。
示范的多肽包含一个表位，如疾病相关表位，其包含在SEQID Nos：2，4，6，8，10，11，13，或15-25中的任一个。表位可以包含SEQ ID Nos：2，4，6，8，10，11，13，或15-25中任何一个中的外显子结合点区。多肽可以由，或本质上由一个表位或一个外显子-连接构成。多肽可以包含或本质上由蛋白质上的表位或外显子-连接构成，此多肽不包含全长蛋白质。
多肽可以有自然-发生的氨基酸，或非-自然发生的氨基酸构成。可以是D-或L-型氨基酸。多肽的虚拟缩氨酸也可以被使用。例如，多肽可以包含反相氨基酸。反相氨基酸可以是D镜像体。不同的氨基酸可以是一个内在多肽，一个附属多肽或一个转运基团。一个内在的多肽可以包含果蝇触角足蛋白(ant)的42-58位氨基酸。
多肽可以包含在治疗或药物成分中，包括，例如，治疗性的可接受载体。一个或多个多肽，或其派生物或类似物可包括在内。其他分子或试剂也可以包含在复合物中，如提高免疫应答的试剂。
其他成分，例如，治疗成分，可以包含至少一条核酸，其编码疾病相关蛋白质异构体，例如，一个疾病相关的外显子结合点表位。一个核酸的例证是这里所叙述的编码一条多肽的核酸。
一条核酸可以是15到120，或15到90，或15到60，15到45个核苷酸长度。一条核酸也可以至多为120，90，60，45核苷酸长度，核酸可以是DNA或修改的DNA。核酸的例证包括，由SEQ IN Nos：1，3，5，7，9，12所列出的核酸序列本质上构成或构成的。在特定情况下，核酸可以包含或本质上由SEQ IND Nos：1，3，5，7，9，12中列出的核酸序列构成，附带条件为这些核酸不包含SEQ IND Nos：1，3，5，7，9，12中自然-发生的全长蛋白质。
核酸可以进一步包含一个或多个转录控制元素，如启动子和终止子。核酸可以是载体，如表达载体。载体可以是病毒载体，如腺病毒或腺病毒相关病毒(AAV)载体。这里还包括了含有所述核酸的细胞。
根据标准药物操作，在药物成分中，单独或和药物可接受载体，赋形剂或稀释液联合使用的治疗方法，可以对哺乳动物，尤其是人类进行治疗。可以直接对组织，如肿瘤组织进行治疗。可选地，治疗方法可以通过口服或注射进行，包括静脉内，肌肉内，腹膜内，皮下，直肠和局部。
治疗方法的毒性和治疗性效果可以通过在细胞培养或实验动物中进行标准药物程序来测定，例如，测定LD50(50％数量死亡的剂量)和ED50(50％产生疗效的剂量)。毒性和疗效剂量间的比例作为治疗指标，可以表示为LD50/ED50的比值。治疗指标较大的试剂是跟合适的。当具有毒副作用的试剂被使用时，应当注意设计一种药物传输系统，使试剂准确针对所影响的组织位置，例如，使对于正常细胞的潜在的损害最小化，从而减少副作用。
在细胞培养方法和动物研究中得到的数据可以用于人的剂量范围。治疗的剂量最好处在包括ED50并毒性较少或无毒性的循环浓度范围之内。在此范围内，依赖于剂量形式和治疗的路径，用药剂量可以有交大变动。
对于任何治疗而言，治疗的有效剂量可以通过最初的细胞培养实验进行评估。如同在细胞培养中测定，通过动物实验可以得到剂量，将反映包括IC50的循环血浆浓度范围(例如，获得半数最高抑制症状的实验治疗浓度)。这些信息可以用于测定人类精确的起效剂量。
治疗所用的剂量将依赖于所治疗的疾病的程度或情况和其他临床因素，例如人类或动物的重量和情况及药物治疗的路径。当对人类和动物进行治疗时，治疗用量可以从0.5mg/千克到500mg/千克之间。其他的用量范围可以是从1mg/千克到100mg/千克之间；2mg/千克到50mg/千克之间；2mg/千克到10mg/千克之间。依赖于治疗药物在特殊动物和人类中的半衰期，治疗的频率可以是每天数次或每周一次。应用于人类和动物的治疗方法也将需要了解。单独或联合进行治疗的方法，可以同时地或长时期地进行。
包含药剂的药物成分可以制成适合口服的形式，例如，药片，片剂，止咳糖，水或油溶液，分散粉末或颗粒，乳剂，硬或软胶囊，糖浆或西也剂。药物生产商可以通过此领域中熟知的技术制备用于口服的药物成分，该药物成分可以选择包含以下试剂：甜味剂，调味剂，增色剂，保存剂，以使药物更优化及具备良好口感。无毒的适合于药物制备的药物可接受赋形剂，可与活性成分(例如治疗剂)联合包含在药片中。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释液，如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，如微结晶纤维素，交联羧甲基纤维素钠，玉米淀粉，或褐藻酸；结合剂，如淀粉，凝胶，聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯树胶，和润滑剂，例如，硬脂酸酶，硬脂酸和云母。药片可以是裸露的或用此领域中熟知的技术进行包裹，以避免药物的不好的口感，或减缓其在肠胃中的分解和吸收速度，使其发挥长期的稳定效力。例如，水溶性的味道屏蔽材料如hydroxypropylmethl-纤维素或羟丙基纤维素或缓释试剂如乙基纤维素，乙酸丁酸纤维素都可以被使用。
为制备药剂的口服形式，可以将药物活性成分与固体稀释剂混合并包裹在硬凝胶胶囊中，固体稀释剂的例子有，碳酸钙，磷酸钙或瓷土，或将活性成分与水溶性载体混合并包裹在软凝胶胶囊，水溶性载体的例子有聚乙二醇或油介质，例如花生油，石蜡油，或橄榄油。
水悬液中可以包含与赋形剂混合的活性材料，使之适合于水悬液的生产。这些赋形剂是悬浮试剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟基甲基纤维素-纤维素，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄芪树胶，阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂事业是自然发生的磷脂，例如卵磷脂，或氧杂环烷脂肪酸的浓缩产物，例如聚氧乙烯硬脂酸盐，或带有长链脂肪乙醇的环氧乙烷浓缩产物，例如heptadecaethylene-oxycetanol，或来源于脂肪酸的部分醇化的环氧乙烷浓缩产物，及己糖醇，例如聚氧乙烯山梨醇油基化合物，或来源于脂肪酸和己糖醇酐的部分醇化的环氧乙烷浓缩产物，例如聚乙烯山梨聚糖油酸基化合物。水悬液还可以包含一种或多种防腐剂，如乙烷基，或n-苯基p-羟基安息香酸盐，一种或多种增色剂，一种或多种调味剂，及一种或多种甜味剂，如蔗糖，糖精或天(门)冬氨酰苯丙氨酸甲酯。
油悬液可以通过将活性药物成分悬浮在植物油中制成，例如花生油，橄榄油，芝麻油或椰子油，或在矿物油如液体石蜡中制成。油悬液可以包含增稠剂，如蜂蜡，硬石蜡或十六(烷)醇，。上述的甜味剂，及调味剂也可以加入其中使其具备较好的口感。这些成分可以通过加入抗-氧化剂，如丁基化羟基苯甲醚或α-维生素E。
分散粉末和颗粒通过水的加入，使之适合于水悬液的制备，并提供了与分散剂或湿润剂，悬浮剂和一种或多种防腐剂相混合的活性成分。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂的例子在前面已经叙述了。更多的赋形剂，如甜味剂，调味剂和着色剂，也可以使用。这些成分可以通过加入抗-氧化剂如抗坏血酸维生素C进行储存
药物成分可以以水包油乳剂的形式存在，油相可以是植物油，如橄榄油或落花生油，也可以是矿物油，如液体石蜡或其混合物。合适的乳化剂可以是自然-产生的磷脂，如大豆卵磷脂，从脂肪酸或己糖醇酐中提取的脂或偏脂，如山梨聚糖油酸基化合物，和上述的偏脂与环氧乙烷的浓缩产物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂也可以包含甜味剂，调味剂，防腐剂和抗氧化剂。
糖浆和西也剂可以制成甜味剂，例如丙三醇，丙烯丙三醇，山梨(糖)醇或蔗糖。这些配方也可以包含缓和剂，防腐剂，调味剂和着色剂，抗氧化剂。
药物成分可以是注射的无菌水溶液形式。可接受的介质和溶剂是水，Ringer’s液，等渗氯化钠溶液。
无菌的注射制备物也可以是水包油微乳液，其中活性药物成分溶解在油相中。例如，活性药物成分首先溶解在大豆油和卵磷脂混合物中。油相被加入水和甘油混合物，并被制成微乳化剂。
注射溶液或微乳化剂可以通过局部注射进入病人的血液。可选地，通过某种方法给予病人溶液或微乳化剂的治疗，使其混合物保持一个恒定的循环浓度，将是更适合的。为了维持这一恒定浓度，可以使用一种连续的静脉内输送装置。示例是Deltec CADD-PLUSTM 5400型静脉内泵。
药物成分可以制成注射水剂或油悬液用于肌肉内或皮下注射。这种悬液可以通过此领域中熟知的方法，利用上述合适的分散剂或湿润剂，悬浮剂，进行配制。这种无菌的注射制备物可以是一种含有无菌注射溶液或悬液的无-毒素、注射-可接受的稀释液或溶剂，例如含有溶液的1，3-丁烷二醇。此外，无菌，不易发挥的油通常作为溶剂或悬液被使用。基于此目的，任何柔和的不挥发油都可以被利用，包括合成的单一或二倍甘油酯。此外，脂肪酸乳油酸也可用于注射剂的制备。
治疗剂也可以药栓形式在直肠内给予药物治疗。这些成分可以通过将药物和合适的非-刺激性赋形物混合制备，该赋形物在通常温度下是固态，而在直肠内的温度下是液态，从而在直肠内可融化并释放药物。这些材料包括可可油，甘油凝胶，氢化蔬菜油，大量不同分子量的聚乙二醇和聚乙二醇脂肪酸脂混合物。
基于局部应用，包含治疗剂的奶油，油膏，凝胶剂，溶剂或悬浮剂等都可以被使用。对于此应用的目的，局部应用包括口腔洗剂和含漱剂。
治疗剂可以鼻内吸收的形式给予治疗，通过合适的鼻内介质或输送装置在鼻内使用，或通过使用这些此领域熟知的透皮小片进行透皮吸收。为了以这种透皮输送系统形式进行治疗，治疗的剂量，当然，在剂量控制过程中其持续性要强于间歇性。
这里使用的术语“成分”规定为包括一种产物，其包含了特定有效成分的特定数量，如同任何产品，其源于特定量的特定的有效成分相结合的，直接或非直接的结果。
一种试剂或成分，例如，一种治疗成分，可以被包含在一种装置中，使试剂可以用于病人的治疗，例如，注射器，支架或管子。
治疗方法可以包括给予病人注射药剂，该病人被检测为患有特殊的疾病相关蛋白质异构体引起的疾病。此方法包括首先对病人进行诊断，确定其是否患有可用这里所述方法进行治疗的疾病，例如，癌症。包括这里所述的诊断方法都可以被使用。
诊断应用
抗体可以应用于诊断方法，以测定例如，在特定细胞，组织，或体液如血清中的抗原。在某一方面，一份生物学样本从患有或怀疑患有疾病(例如癌症)的病人身上获得，并且测定一种或多种癌症相关蛋白质异构体的含量。癌症相关的异构体的含量可以表明病人患有或容易患有癌症。相似地，抗体可以用于测定在病人中或体内任何组织或细胞或样本中病原体的含量。
诊断方法包括使用两中或更多抗体，其中，例如，仅有一种抗体特异针对疾病-相关蛋白，对于特异地清楚第诊断是不充足的。可选地，一种抗体可以是特异针对疾病相关蛋白质异构体的，第二种抗体是特异针对蛋白质正常形态的，其由编码疾病相关蛋白质异构体的同一基因编码。在样本测定中，两种或更多抗体可以同时或分别使用。
在“治疗剂”章节中叙述的同样的抗体和其他试剂可以用于诊断实验。
此领域中许多熟知的诊断实验技术都可以使用，如在异源或同源情况下操作的竞争结合实验，直接或非直接三明治实验和免疫沉淀反应。(Zola，Monoclonal AntibodiesL a Manual of techniques，CRC Press，Inc.91987)pp.147-158)。免疫组化测定，例如，对于外科手术样本或活组织的检查也可以进行。此外，在体外实验中，如MRI，CAT扫描，PET扫描，电子束CT扫描，SPECT成像，γ成像，血管造影术，血管内超声，正电子放射X线断层摄影术(Renee M Moadel，et al.，Breast Cancer Res 2003，5：R199-R205)，放射性或荧光检测也可以是诊断方法的一部分。
                                      「以用检测基团
如上所述，用于诊断实验的抗体或其他试剂可，可检测的信标记。该检测基团应该能够产生，无论直接或间接性同位素，如号。例如，检测基团可以是上述的一种，一种放射物，如异硫氰3H，14C，32P，35S，125I，一种荧光或化学发光复合性磷酸酶，β酸荧光素，若丹明，或虫萤光素，或一种酶，如碱抗体于检测基-半乳糖苷酶或辣根过氧(化)物酶。此领域中任何以及Hunter et团连接的方法都可以应用，包括这里叙述的方法nistry，13：1014al.，Nature，144：945(1962)；David et al.，Biochegnl)；Nygren，J.(1974)；Pain et al.，J.immunol.Meth.，40：219(1981)。Histochem.and Cytochem.，30：407(1982)中所论述的
诊断方法包括将病人的生物样品与一种试剂向连接，该试剂可以特异结合疾病相关蛋白质异构体，随后测定该试剂和生物样品的结合情况，当结合发生时则表明存在疾病相关蛋白质异构体，因此病人患有或容易患有该疾病。
测定样品(例如，一种生物样品如体液或细胞或组织)中抗原的存在情况的方法，包括(1)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下，将样本与固相连接，该固相表面包含固定于特定位置的抗体集合物，(2)在适合抗原/抗体复合物形成的条件下，将融合蛋白集合物与固相表面相连，每一个融合蛋白包含一个与固相表面的抗体特异接合的多聚肽，以及一个载体蛋白，(3)测定固相表面的每一个特定位置上载体蛋白的存在情况，若在某特定位置有载体蛋白的缺失或减少，则表明具有在特定位置与抗体接合的抗原，即表明样本中具有抗原。该固相表明可以是抗体阵列，其已有商业化供给或通过此领域中的方法制备。固相表明可以包含至少10，100，1000，10000，100000个抗体。具备该领域技术的人员可以识别其他与抗体相似的可以使用的分于，假若该分子可特异结合蛋白质。图3显示了一个示范性的方法。固相表明可以包含特异结合一种抗原，或不同抗原的抗体的集合物。抗原可以是疾病-相关抗原，如癌-相关或病原体相关抗原。
除抗体之外，其他分子或分子复合物或试剂，只要其特异识别疾病相关蛋白质异构体，都可以用于诊断实验。示例的试剂，如多肽或其派生物，例如，虚拟缩肽，在这里将进一步叙述。
抗体也可以用于从重组细胞培养物中或自然源中亲和纯化抗原。此过程中，运用此领域中熟知的方法，抗体将被固定在合适的支持物上，如交联葡聚糖树脂或滤纸。固定的抗体接着与含有将纯化抗原的样品接触，接着该支持物用合适的溶液冲洗，去除样品中除抗原外的其他与固定抗体结合的物质。最后，该支持物用另一种冲洗，使抗原从抗体上释放出来。
Kits
目前的发明提供了试剂盒，如诊断和治疗试剂盒，以及制备和/或筛选抗体的试剂盒。例如，一种试剂盒可以包含一种或多种成分，例：一种药物成分，如这里所述以及可选地说明其用途。试剂盒还可以包含一种或多种装置来完成这些成分的治疗过程。例如，一种试剂盒主体可以包含一种药物成分和注射器或导管，以完成药物对于肿瘤的动脉直接注射。在另一方面，试剂盒主体可以包含预-灌装安瓿瓶，其中含有蛋白异构体的特异抗体结构，可选地做成药物或冻干形式，并通过输送装置使用。
试剂盒可以包含带有标签的容器。合适的容器包括，瓶子，小瓶，和试管。容器可以由多种材料制备成，如玻璃或塑料。容器可以装有一种药物成分，包括有效进行治疗或非-治疗应用的抗体，如上所述。容器上的标签能表明药物成分的特殊治疗或非-治疗应用，也可以表明其体内或体外的应用方法，如上所述。试剂盒可以包含一种上述的容器，和一种或多种其他容器，其含有适合于商业或使用者的标准的材料，如缓冲液，稀释液，滤器，针，注射器，和含有说明书的包装盒。
一个示范性的试剂盒是治疗或诊断试剂盒，其包含一种包括了外显子结合点的的表位的抑制子，例如，该表位被鉴定为疾病相关的表位。
该发明已经进行了概括性的描述，参考下列的例子将加深对此发明的理解，这些例子仅出于说明此发明的某一特定方面和情况的目的，并非意图限定该发明。
范例
例1：制备特异结合VEGF的疾病相关异构体的单克隆抗体
血管内皮生长因子(VEGF)已经被鉴定为在生理和病理情况下介导血管生成的一种重要的因素。人VEGF基因由8个外显子构成，对应于下列cDNA的核酸序列，其来源于GenBank Accession Number P15692和NM_003376，及专利SEQ ID NO：14.。SEQ ID NO：14编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：15列出。
人VEGF编码序列
                 NT
外显子1：        1-66           23aa
外显子2：        67-108         14aa
外显子3：        109-315        69aa
外显子4：        316-392        25aa
外显子5：        393-42         10aa
外显子6：        423-542        40aa
外显子7：        543-674        44aa
外显子8：        675-69         24aa
总和                            231aa
信号肽                          26aa
通过选择性拼接，至少4中VEGF的异构体被发现，分别包含206，189，165，121氨基酸，表示为VEGF206，VEGF189，VEGF165，VEGF121。形态206，165，121的阵列在图4中表示。4种异构体共享VEGF同样的155个N末端氨基酸残基。在生物药效率上不同于VEGF165和VEGF121，较长的形态(VEGF206和VEGF189)是矩阵绑定，较短的形态是可自由扩散的。这些形态表达的位置是多变的：VEGF165和VEGF121在肺癌和结肠中表达量显著提高；VEGF189在正常肺中表达；VEGF206作为precursor，在任何组织中都难以检测到(Houck K A，Ferrara N，Winer j，Cachianes G，Li B，Leung DW.，Mol Endocrinol.1991Dec；5(12)L1806-14))。VEGF165和121的核酸序列由基因库提供，编号为AAM0318/AF486837-1和AAF19659/AF214570-1。
绑定在癌组织中表达的两种异构体的单克隆抗体的制备见下面(图5)。两种异构体的每种核酸核酸序列将与编码鼠SEAP的核酸序列一起插入表达载体。对VEGF-165特异抗体而言，5’cta tct cgt tct gtt ctt tta ggg aca ccc gga acg agt ctc 3’(SEQ ID NO：1)编码下列的氨基酸序列：DRARQE/NPCGPCSE(SEQ ID NO：2)；对VEGF-121特异抗体而言，5’cta tct cgt tct gttctt ttt aca ttc ggc tcc gcc 3’(SEQ ID NO：3)编码下列氨基酸序列：DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO：4)。/代表2个外显子之间的连接位点。融合蛋白或是SEAP多肽或是多肽SEAP。这些序列的变异体也能被使用，如环绕外显子结合点的但是与所列序列有一或更多个氨基酸不同的序列，尤其是在N和C末端。异构体的氨基酸序列在图4列出，任何环绕在外显子结合点的序列能被使用，如包括在连接处末端或其他位置的3，5，7，10或15个氨基酸序列。
根据标准步骤载体被转染入鼠。选则性地，包括连接SEAP的VEGF多肽的蛋白质能在COS细胞中合成并注射入老鼠。抗-血清滴度在免疫后一到两周时被测定。具有高滴度的动物被用于分离脾细胞。用脾细胞和骨髓瘤细胞纸币肿瘤细胞将根据标准操作程序进行。
利用高通量ELISA方案，存在于杂交瘤细胞培养上清的抗体将被测定其抗原结合情况。相应地，96孔培养板中杂交瘤的培养上清被转移至96-孔或384-孔化验板，其中预先-包含了羊抗-鼠IgG(或兔抗-鼠)。在384-孔规格下，每次实验可使用5到10微升的培养基。在室温下孵育30分钟后，化验板将被冲洗去除未结合的抗体。SEAP-表位融合蛋白将被加入孔中并在室温下孵育30分钟。未结合的SEAP-表位融合将被清洗。抗原-抗体结合情况将通过加入碱性磷酸酶底物并在检测器上测量进行测定。高SEAP活性表明存在识别VEGF表位的抗体。
抗-VEGF165和-121抗体将通过标准免疫化学方法证实，如利用重组VEGF-165和VEGF-121蛋白进行的Western blotting。抗VEGF-165预期将特异结合VEGF-165，但不与其他VEGF异构体结合，如VEGF-121和全长VEGF206。抗VEGF-121预期将特异结合VEGF-121，但不与其他VEGF异构体结合。
这些抗体可用于测定从培养的肿瘤细胞系中，如非-小细胞肺癌，和冰冻肿瘤组织切片中制备的蛋白质样品，例如，通过肿瘤组织冰冻切片上的免疫-组化实验。根据先前叙述的程序，抗体的生物学活性可以通过内皮细胞中有丝分裂发生实验测定(Hiratska et al.Proc Natl.acad.Sci.WSA.95：9349-54(1998)，Shibuya et al.Curr Top In Micro & Immu.237：59-83(1999))。具有中和活性的抗-VEGF165或-121抗体可以抑制内皮细胞中VEGF介导的功能。
例2：制备包含VEGF疾病相关异构体的DNA疫苗
带有上述的特异表位序列的针对VEGF165和VEGF121的DNA疫苗可以在实验动物中开展。原则上，编码特异表位的寡聚核酸将被插入表达载体，并在体内产生分泌多肽。表达载体可以包含一个编码序列，其编码的分泌蛋白作为一种载体蛋白可以促进表位多肽的表达和/或分泌。载体蛋白的选择可以是血清白蛋白或其他分泌多肽，或细胞因子。针对给定疾病的DNA疫苗，例如结肠癌，其构成的表位序列可以来源于VEGF-165，寡聚核酸：5’gat aga gca aga caa gaa aat ccc tgt gg cct tgc tca gag 3’(SEQ IN NO：1)编码以下氨基酸序列：DRARQE/NPCGPCSE(SEQID NO：2)；以及来源于VEGF-121，寡聚核酸：5’gat aga gcaaga caa gaa aaa tgt gac aag ccg agg cgg3’(SEQ ID NO：3)编码以下氨基酸序列：DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO：4)，“/”表示两个外显子之间的结合位点。这些不同的序列也可以被使用，例如：编码连续氨基酸的序列形成的外显子结合点，但与这里所列的序列有一个或多个核酸的不同，特别是在5’和3’末端。人VEGF的核酸序列见SEQ ID NO：14(GenBank AccessionNo.NM_003376)，及任何编码包含外显子结合点连续氨基酸的序列都可以使用，例如，在连接的一端或另一端包含10，20，30，或50个核苷酸的序列。
如前所述，针对癌症相关VEGF异构体的DNA疫苗作为血管生成抑制子可以在动物模型中进行试验。特别地，这些抗-VEGF异构体疫苗将用于给定的人肿瘤转移试验，针对VEGF165和121异构体中的任一种或两种进行治疗。理想地，这些抗-VEGF异构体疫苗可以用于早期诊断肿瘤病人的治疗，通过抑制血管生成因子如VEGF165和/或VEGF121的活性，而阻止肿瘤的扩散。
例3：特异结合ErbB-2疾病相关异构体的单克隆抗体的制备
大量的抗-ErbB-2(鼠蛋白)或抗-Her2(人蛋白)抗体已经被分离，其中一种抗体，4D5，是一种鼠科抗体，其用于产生治疗性的人源化形式抗体herceptin。这中人源化的抗体已经证明其在治疗转移性乳腺癌中的效果(Schaller et al.J.Cancer Res.Clin.Oncol.125：520(1999)和Shak et al.Herceptin MultinationalInvestigator Group.Semin Oncol.26：71(1999))。然而，既然c-erbB-2也显示了在其他组织中的生理功能，针对HER2抗体的副作用包括心力衰竭，其是许多死亡的起因(Horton et al.CancerControl.9(6)：499-507(2002)。具报道，4D5的表位存在于胞外区域(ECD)529-627氨基酸之间(Sliwkowski et al.Semin Oncol.26：60(1999)。Her2(或HER2)的核酸序列在GenBank编号PO4626和NM_004448及有提供。SEQ IN NO：16编码的氨基酸序列罗列于SEQ IN NO：17。
针对Her2疾病相关异构体单克隆抗体的制备方法如下。为了针对特殊的在其ECD缺少16个氨基酸的HER2-拼接异构体(氨基酸634到649)(“拼接”或“HER2拼接异构体1”)，下列序列将被作为多肽使用：INCTHS/PLTS(SEQ ID NO：6)(”/”表示外显子结合点)。为了针对特异的在ECD缺失12个氨基酸的HER2(ECD DEL)异构体(氨基酸636到647)(“ECD DEL”或“HER2拼接异构体2”)，下列序列将被作为多肽使用：CTHSCV/ASPLT(SEQ ID NO：8)(“/”表示外显子结合点)。这些序列的变异体也能被使用，如包含一个外显子结合点，但与这里所列的序列，特别是在N-和C-末端有一个或多个氨基酸不同的序列。人HER2的氨基酸序列罗列于SEQ ID NO：17并在图8中表示，并且包含一个外显子结合点的序列都可以被使用，例如，包含结合点的某端或另一端的3，5，7，10，或15个氨基酸的序列。
如上所述，单克隆抗体可以按照VEGF抗体的方法得到，无论通过杂交瘤技术或噬菌体显示技术。
HER2多肽的抗体将被测试其针对HER2异构体的特异性：抗体将预期结合两种表达两升高的异构体，而不结合野生型或其他HER2异构体。抗-HER2(拼接)和抗-HER2(ECD DEL)将在来源于乳腺癌的肿瘤组织芯片和非-小细胞肺癌细胞上进行试验。这些肿瘤细胞表达HER2(拼接)和/或HER2(EDC DEL)，通过免疫-组化试验测定抗体的正信号。正常组织入心脏组织应该不表达这些HER2的变异的异构体。HER2异构体的特异抗体的中和活性可以根据先前所述的测序，在动物模型中进行检测。(Schalleret al.J.Cancer Res.Clin.Oncol.125：520(1999))。
例4：ErbB-2疾病相关异构体DNA疫苗的制备
针对HER2(拼接)和/或HER2(EDC DEL)的DNA疫苗可以用于乳腺癌和卵巢癌的治疗和预防，如同上述的抗-VEGF异构体疫苗。包含以下核酸序列的DNA载体将被制备：5’atc aac tgc acc cac tcc/cct ctg acg tcc3’(SEQ IN NO：5)(HER2拼接)和5’tgc acc cac tcc tgt gtg/gcc agc cct ctg acg3’(SEQ ID NO：7)(HER2 ECD DEL)。这些序列的变体也可以使用，例如，编码连续氨基酸的一个外显子结合点的序列，但与这里所列的序列有一个或多个核苷酸的不同，特别在5’和3’端。人HER2核酸序列罗列于SEQ ID NO：14(GenBank编码NM_004448)，任何包含一个外显子结合点的编码连续氨基酸的序列都可以使用，例如，在junction某端或另一端包含1O，20，30，50个核苷酸的序列。
此疫苗可以在抑制的动物模型中试验。
例5：特异结合前列腺特异抗原(PSA)的前列腺癌相关异
            构体的单克隆抗体的制备
PSA，其由hKLK3基因编码，是用于针对和监控前列腺癌病人最有力的工具。然而，它的弱点在大量报道中已有体现(见，例如，Stamey.T.A.N Eng.J.Med，317：909-917(1987)；Arai)；Arai，.，J.Urol.，144：1415-1419(1990)；Catalona，W.J.，Eng.J.med，324：1156-1161(1987)；Heuze-Vourc’h，N，Eur J Biochem 268(16)；4408-13(2001)；tanaka，T，Cancer Res.60(1)：56-9(2000)；Heuze Vourc’h，N，Eur J Biochem 270(4)：706-14(2003))。作为差别抗原最佳特点，PSA不是一种肿瘤-特异蛋白。PSA作为与几种分子混合的形式存在于血清中。hKLK3基因的选择性拼接导致在良性和恶性前列腺肿瘤中自由-PSA的分子异质性。特定的拼接形式显示了其于前列腺癌的密切相关性。(见Tanaka.T，Cancer Res.610(1)：56-9(2000)；Heuze-Vourc’h，N，Eur J Biochem 270(4)：706-14(2003))。这些PSA的分子类型可用于更好的诊断产品和治疗药物。
特异识别一种特殊的PSA异构体的单克隆抗体可通过下列方法制备。该PSA异构体是选择性拼接的结果，其从成熟PSA上缺失了44个氨基酸(氨基酸45-88)。异构体PSA-delta44的表位设计如下所示。为了绑定PSA-delta44的异构体，缺失的结合点生成序列作为多肽AHCIR/KPGDD(SEQ ID NO：10)或HCIR/KPGDDS(SEQ ID NO：11)被使用(“/”代表结合点)。多肽与载体蛋白结合。结合的多肽通过杂交瘤技术或抗菌素显示技术作为免疫原产生单克隆抗体。
此外，编码上述氨基酸序列的核酸将合成：5’gcc cac tgcatc agg/agg cca ggt gat gac 3’(SEQ ID NO：9)。合成的寡核酸链被绑入表达载体产生带有PSA-delta44的表位的融合蛋白和载体蛋白。这样的表达载体表达的融合蛋白，如多肽(HCIR/KPGDDS)-SEAP能用于免疫老鼠产生杂交瘤。特异识别PSA-delta44的单克隆抗体根据阳性绑定免疫原多肽(HCIR/KPGDDS)-SEAP被筛选。SEAP读出器提供被抗原绑定的PSA-delta44表位的阳性测定。
这一领域的技术人员认可这些序列的变异体能被使用，如基于人PSA的核酸和氨基酸序列，其PSA的人mRNA的原始序列的基因库的编码为X05332和蛋白质的原始序列为CAA28947。这些序列分别列在SEQ ID NO：18和19中。
绑定PSA的特异抗体的异构体由前列腺癌病人的血清样本被确认。从健康组获得的血清样本用于作为阴性对照。
正常的PSA(划线部分表示在PSA-delta44中缺失的范围。)
PSA-delta44(黑体字母表示绑定PSA-delta44的抗体的表位。字母间的“/”表示缺失后的间接位点。)
例6：特异绑定PDGFRβ融合蛋白的单克隆抗体的制备
这个例子描述了另一种ADAPI抗体，其作为一种治疗性的试剂能用于绑定引起恶性疾病的蛋白质突变体，这些恶性疾病与编码血小板起源生长因子β受体，PDGFRβ的基因中染色体的移位有关。染色体移位，包括band 5q31-35(其属于PDGFRβ基因定位处)出现某些血液类疾病。如PDGFRβ/HCMOGT-1t(5；17)(q33；p11.2)的移位被发现出现在青少年脊髓(炎)白血病中(Morerio C.等人，2004 Cancer Research 64：2649-51)。在急性骨髓性的白血病(AML)中，作为染色体移位(q33；q32)的结果，PDGFRβ与CEV14形成融合蛋白(Abe A等人，1997 Blood 90：4271-77)。
CEV14-PDGFRβ融合基因被发现与攻击性白血病进程相关，这就表明这种融合蛋白有致瘤的潜能。
CEV14-PDGFRβ，t(5；14)(q33；q32)融合基因在AML病人的复发阶段出现，这种病人在起始的诊断中只有单独的染色体移位，t(7；11)。在CEV14-PDGFRβ，t(5；14)(q33；q32)融合基因出现后，标记嗜曙红血球增多的白血病进程，结合染色体治疗是无效的。DNA分析显示，在5q33位置PDGFRβ基因的重组并不出现在初始诊断中。这种移位导致异常的转录，使在5q33的PDGFRβ基因与位于14q32的新基因CEV14融合。
用于治疗和诊断的ADAPI抗体，能基于围绕在融合基因CEV14-PDGFRβ，t(5；14)(q33；q32)的断裂点的编码序列生长。这种抗体特异识别融合蛋白CEV14-PDGFRβ能对AML有特异的治疗作用。针对CEV14-PDGFRβ抗体的抗原决定簇序列可以用30个邻近的核酸序列或10个包括下列融合蛋白CEV14-PDGFRβ区域的断裂点序列的氨基酸序列构建。(融合蛋白的断裂点用“/”表示)：
在CEV14和PDGFRβ融合蛋白之间的核酸序列(CEV14在左或上游或5’末端；PDGFRβ在右或下游或3’末端)：
AGA AGA AAT TGA AGA ACT TAA AAG ACA AA/CCTT GCC CTT TAA GGT GGT GGT GAT CTC(SEQ ID NO：14)
在CEV14和PDGFRβ融合蛋白之间的氨基酸序列：EQIEELKR QT/LPFKVVVIS(SEQ ID NO：15)
目前的发明将需要试验，除非有细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，DNA重组和免疫学的常用技术指导并且在这一领域的技术之内。这些技术都在文献有所描述。见如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No：4683195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture OfAnimal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，inc.，N.Y.)；Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enaymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，VolumeI-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Antibodies：ALaboratory Manual，and Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.(1987)，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
参考整合
所有这里涉及的出版物，基因库编码和专利作为整体被参考整合，正如通过参考整合每一单独的出版物或专利被特定地和单独地阐明。以免争议，目前的应用，包括定义都受控制。
等效性
尽管主体发明的特定方面已经被讨论，但是上述特例只具阐述性并无限制性。发明的许多变更将明显变为这一领域的技术，通过上面说明的评论和下面的声明。发明的整个范围和整个等效性的范围和说明书及变异体将通过参考声明被定义。
                                 序列表
<110>常小迦
<120>基于VEFG，HER-2，PSA蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂
<130>IGA-003.25
<160>6
<170>PatentIn version 3.0
<210>14
<211>1723
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1039)..(1686)
<400>14
tcgcggaggc ttggggcagc cgggtagctc ggaggtcgtg gcgctggggg ctagcaccag     60
cgctctgtcg ggaggcgcag cggttaggtg gaccggtcag cggactcacc ggccagggcg    120
ctcggtgctg gaatttgata ttcattgatc cgggttttat ccctcttctt ttttcttaaa    180
catttttttt taaaactgta ttgtttctcg ttttaattta tttttgcttg ccattcccca    240
cttgaatcgg gccgacggct tggggagatt gctctacttc cccaaatcac tgtggatttt    300
ggaaaccagc agaaagagga aagaggtagc aagagctcca gagagaagtc gaggaagaga    360
gagacggggt cagagagagc gcgcgggcgt gcgagcagcg aaagcgacag gggcaaagtg    420
agtgacctgc ttttgggggt gaccgccgga gcgcggcgtg agccctcccc cttgggatcc    480
cgcagctgac cagtcgcgct gacggacaga cagacagaca ccgccccaag ccccaagctac   540
cacctcctcc ccggccggcg gcggacagtg gacgcggcgg cgagccgcgg gcaggggccg    600
gagcccgcgc ccggaggcgg ggtggagggg gtcggggctc gcggcgtcgc actgaaactt    660
ttcgtccaac ttctgggctg ttctcgcttc ggaggagccg tggtccgcgc gggggaagcc    720
gagccgagcg gagccgcgag aagtgctagc tcgggccggg aggagccgca gccggaggag    780
ggggaggagg aagaagagaa ggaagaggag agggggccgc agtggcgact cggcgctcgg    840
aagccgggct catggacggg tgaggcggcg gtgtgcgcag acagtgctcc agccgcgcgc    900
gctccccagg ccctggcccg ggcctcgggc cggggaggaa gagtagctcg ccgaggcgcc    960
gaggagagcg ggccgcccca cagcccgagc cggagaggga gcgcgagccg cgccggcccc   1020
ggtcgggcct ccgaaacc atg aac ttt ctg ctg tct tgg gtg cat tgg agc    1071
                    Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser
                    1               5                   10
ctt gcc ttg ctg ctc tac ctc cac cat gcc aag tgg tcc cag gct gca    1119
Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala
            15                  20                  25
ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc    1167
Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe
        30                  35                  40
atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg    1215
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val
    45                  50                  55
gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac atc ttc aag cca    1263
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
60                  65                  70                  75
tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag ggc    1311
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly
                80                  85                  90
ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg    1359
Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met
            95                 100                 105
cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta    1407
Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu
        110                 115                 120
cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca aag aaa gat aga gca aga caa    1455
Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln
    125                 130                 135
gaa aaa aaa tca gtt cga gga aag gga aag ggg caa aaa cga aag cgc    1503
Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg
140                 145                 150                 155
aag aaa tcc cgg tat aag tcc tgg agc gtt ccc tgt ggg cct tgc tca    1551
Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser
                160                 165                 170
gag cgg aga aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt    1599
Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys
            175                 180                 185
tcc tgc aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg cag ctt gag tta    1647
Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu
        190                 195                 200
aac gaa cgt act  tgc aga tgt gac aag ccg agg cgg tga gccgggcagg    1696
Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
    205                 210                 215
aggaaggagc ctccctcagg gtttcgg                                      1723
<210>15
<211>215
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>15
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
            20                  25                  30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
        35                  40                  45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
    50                  55                  60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65                  70                  75                  80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
                85                  90                  95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
            100                 105                 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
        115                 120                 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
    130                 135                 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His
                165                 170                 175
Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr
            180                 185                 190
Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys
        195                 200                 205
Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
    210                 215
<210>16
<211>4530
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(151)..(3918)
<400>16
aattctcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg agggcgcgcg     60
cccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccgg    120
agccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc     174
                                 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg
                                 1               5
tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa      222
Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln
    10                  15                  20
gtg tgc acc ggc aca gac atg aag ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag      270
Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu
25                  30                  35                  40
acc cac ctg gac atg ctc cgc cac ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg      318
Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val
                45                  50                  55
cag gga aac ctg gaa ctc acc tac ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc      366
Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser
            60                  65                  70
ttc ctg cag gat atc cag gag gtg cag ggc tac gtg ctc atc gct cac      414
Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His
        75                  80                  85
aac caa gtg agg cag gtc cca ctg cag agg ctg cgg att gtg cga ggc    462
Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly
    90                  95                  100
acc cag ctc ttt gag gac aac tat gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga    510
Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly
105                 110                 115                 120
gac ccg ctg aac aat acc acc cct gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc    558
Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly
                125                 130                 135
ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg    606
Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly
            140                 145                 150
gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag ctc tgc tac cag gac acg att ttg    654
Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu
        155                 160                 165
tgg aag gac atc ttc cac aag aac aac cag ctg gct ctc aca ctg ata    702
Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile
    170                 175                 180
gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag    750
Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys
185                 190                 195                 200
ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt tct gag gat tgt cag agc ctg acg    798
Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr
                205                 210                 215
cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc    846
Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro
            220                 225                 230
act gac tgc tgc cat gag cag tgt gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag    894
Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys
        235                 240                 245
cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc cac ttc aac cac agt ggc atc tgt    942
His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys
    250                 255                 260
gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc acc tac aac aca gac acg ttt gag    990
Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu
265                 270                 275                 280
tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg   1038
Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val
                285                 290                 295
act gcc tgt ccc tac aac tac ctt tct acg gac gtg gga tcc tgc acc    1086
Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr
            300                 305                 310
ctc gtc tgc ccc ctg cac aac caa gag gtg aca gca gag gat gga aca    1134
Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr
        315                 320                 325
cag cgg tgt gag aag tgc agc aag ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt    1182
Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly
    330                 335                 340
ctg ggc atg gag cac ttg cga gag gtg agg gca gtt acc agt gcc aat    1230
Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn
345                 350                 355                 360
atc cag gag ttt gct ggc tgc aag aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt    1278
Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe
                365                 370                 375
ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc    1326
Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu
            380                 385                 390
cag cca gag cag ctc caa gtg ttt gag act ctg gaa gag atc aca ggt    1374
Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly
        395                 400                 405
tac cta tac atc tca gca tgg ccg gac agc ctg cct gac ctc agc gtc    1422
Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val
    410                 415                 420
ttc cag aac ctg caa gta atc cgg gga cga att ctg cac aat ggc gcc    1470
Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala
425                 430                 435                 440
tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc    1518
Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg
                445                 450                 455
tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga ctg gcc ctc atc cac cat aac acc    1566
Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr
            460                 465                 470
cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac    1614
His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn
        475                 480                 485
ccg cac caa gct ctg ctc cac act gcc aac cgg cca gag gac gag tgt    1662
Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys
    490                 495                 500
gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc    1710
Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys
505                 510                 515                 520
tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg    1758
Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg
                525                 530                 535
ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg    1806
Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg
            540                 545                 550
gag tat gtg aat gcc agg cac tgt ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag    1854
Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln
        555                 560                 565
ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt ttt gga ccg gag gct gac cag tgt    1902
Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys
    570                 575                 580
gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc    1950
Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys
585                 590                 595                 600
ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt    1998
Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe
                605                 610                 615
cca gat gag gag ggc gca tgc cag cct tgc ccc atc aac tgc acc cac    2046
Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His
            620                 625                 630
tcc tgt gtg gac ctg gat gac aag ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc    2094
Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala
        635                 640                 645
agc cct ctg acg tcc atc gtc tct gcg gtg gtt ggc att ctg ctg gtc    2142
Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val
    650                 655                 660
gtg gtc ttg ggg gtg gtc ttt ggg atc ctc atc aag cga cgg cag cag    2190
Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln
665                 670                 675                 680
aag atc cgg aag tac acg atg cgg aga ctg ctg cag gaa acg gag ctg    2238
Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu
                685                 690                 695
gtg gag ccg ctg aca cct agc gga gcg atg ccc aac cag gcg cag atg    2286
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met
            700                 705                 710
cgg atc ctg aaa gag acg gag ctg agg aag gtg aag gtg ctt gga tct    2334
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser
        715                 720                 725
ggc gct ttt ggc aca gtc tac aag ggc atc tgg atc cct gat ggg gag    2382
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu
    730                 735                 740
aat gtg aaa att cca gtg gcc atc aaa gtg ttg agg gaa aac aca tcc    2430
Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser
745                 750                 755                 760
ccc aaa gcc aac aaa gaa atc tta gac gaa gca tac gtg atg gct ggt    2478
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly
                765                 770                 775
gtg ggc tcc cca tat gtc tcc cgc ctt ctg ggc atc tgc ctg aca tcc    2526
Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
            780                 785                 790
acg gtg cag ctg gtg aca cag ctt atg ccc tat ggc tgc ctc tta gac    2574
Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp
        795                 800                 805
cat gtc cgg gaa aac cgc gga cgc ctg ggc tcc cag gac ctg ctg aac    2622
His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn
    810                 815                 820
tgg tgt atg cag att gcc aag ggg atg agc tac ctg gag gat gtg cgg    2670
Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg
825                 830                 835                 840
ctc gta cac agg gac ttg gcc gct cgg aac gtg ctg gtc aag agt ccc    2718
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro
                845                 850                 855
aac cat gtc aaa att aca gac ttc ggg ctg gct cgg ctg ctg gac att    2766
Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile
            860                 865                 870
gac gag aca gag tac cat gca gat ggg ggc aag gtg ccc atc aag tgg    2814
Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
        875                 880                 885
atg gcg ctg gag tcc att ctc cgc cgg cgg ttc acc cac cag agt gat    2862
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp
    890                 895                 900
gtg tgg agt tat ggt gtg act gtg tgg gag ctg atg act ttt ggg gcc    2910
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala
905                 910                 915                 920
aaa cct tac gat ggg atc cca gcc cgg gag atc cct gac ctg ctg gaa    2958
Iys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu
                925                 930                 935
aag ggg gag cgg ctg ccc cag ccc ccc atc tgc acc att gat gtc tac    3006
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
            940                 945                 950
atg atc atg gtc aaa tgt tgg atg att gac tct gaa tgt cgg cca aga    3054
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg
        955                 960                 965
ttc cgg gag ttg gtg tct gaa ttc tcc cgc atg gcc agg gac ccc cag  3102
Phe Arg Glu Leu Val ger Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln
    970                 975                 980
cgc ttt gtg gtc atc cag aat gag gac ttg ggc cca gcc agt ccc ttg  3150
Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu
985                 990                 995                 1000
gac agc acc ttc tac  cgc tca ctg ctg gag  gac gat gac atg ggg    3195
Asp Ser Thr Phe Tyr  Arg Ser Leu Leu Glu  Asp Asp Asp Met Gly
                1005                 1010                 1015
gac ctg gtg gat gct  gag gag tat ctg gta  ccc cag cag ggc ttc    3240
Asp Leu Val Asp Ala  Glu Glu Tyr Leu Val  Pro Gln Gln Gly Phe
                1020                 1025                 1030
ttc tgt cca gac cct  gcc ccg ggc gct ggg  ggc atg gtc cac cac    3285
Phe Cys Pro Asp Pro  Ala Pro Gly Ala Gly  Gly Met Val His His
                1035                 1040                 1045
agg cac cgc agc tca  tct acc agg agt ggc  ggt ggg gac ctg aca    3330
Arg His Arg Ser Ser  Ser Thr Arg Ser Gly  Gly Gly Asp Leu Thr
                1050                 1055                 1060
cta ggg ctg gag ccc  tct gaa gag gag gcc  ccc agg tct cca ctg    3375
Leu Gly Leu Glu Pro  Ser Glu Glu Glu Ala  Pro Arg Ser Pro Leu
                1065                 1070                 1075
gca ccc tcc gaa ggg  gct ggc tcc gat gta  ttt gat ggt gac ctg    3420
Ala Pro Ser Glu Gly  Ala Gly Ser Asp Val  Phe Asp Gly Asp Leu
                1080                 1085                 1090
gga atg ggg gca gcc  aag ggg ctg caa agc  ctc ccc aca cat gac    3465
Gly Met Gly Ala Ala  Lys Gly Leu Gln Ser  Leu Pro Thr His Asp
                1095                 1100                 1105
ccc agc cct cta cag  cgg tac agt gag gac  ccc aca gta ccc ctg    3510
Pro Ser Pro Leu Gln  Arg Tyr Ser Glu Asp  Pro Thr Val Pro Leu
                1110                 1115                 1120
ccc tct gag act gat  ggc tac gtt gcc ccc  ctg acc tgc agc ccc    3555
Pro Ser Glu Thr Asp  Gly Tyr Val Ala Pro  Leu Thr Cys Ser Pro
                1125                 1130                 1135
cag cct gaa tat gtg  aac cag cca gat gtt  cgg ccc cag ccc cct    3600
Gln Pro Glu Tyr Val  Asn Gln Pro Asp Val  Arg Pro Gln Pro Pro
                1140                 1145                 1150
tcg ccc cga gag ggc  cct ctg cct gct gcc  cga cct gct ggt gcc    3645
Ser Pro Arg Glu Gly  Pro Leu Pro Ala Ala  Arg Pro Ala Gly Ala
                1155                 1160                 1165
act ctg gaa agg gcc  aag act ctc tcc cca  ggg aag aat ggg gtc    3690
Thr Leu Glu Arg Ala  Lys Thr Leu Ser Pro  Gly Lys Asn Gly Val
                1170                 1175                 1180
gtc aaa gac gtt ttt  gcc ttt ggg ggt gcc  gtg gag aac ccc gag      3735
Val Lys Asp Val Phe  Ala Phe Gly Gly Ala  Val Glu Asn Pro Glu
1185                 1190                 1195
tac ttg aca ccc cag  gga gga gct gcc cct  cag ccc cac cct cct      3780
Tyr Leu Thr Pro Gln  Gly Gly Ala Ala Pro  Gln Pro His Pro Pro
1200                 1205                 1210
cct gcc ttc agc cca  gcc ttc gac aac ctc  tat tac tgg gac cag      3825
Pro Ala Phe Ser Pro  Ala Phe Asp Asn Leu  Tyr Tyr Trp Asp Gln
1215                 1220                 1225
gac cca cca gag cgg  ggg gct cca ccc agc  acc ttc aaa ggg aca      3870
Asp Pro Pro Glu Arg  Gly Ala Pro Pro Ser  Thr Phe Lys Gly Thr
1230                 1235                 1240
cct acg gca gag aac  cca gag tac ctg ggt  ctg gac gtg cca gtg      3915
Pro Thr Ala Glu Asn  Pro Glu Tyr Leu Gly  Leu Asp Val Pro Val
1245                 1250                 1255
tga accagaaggc caagtccgca gaagccctga tgtgtcctca gggagcaggg         3968
aaggcctgac ttctgctggc atcaagaggt gggagggccc tccgaccact tccaggggaa  4028
cctgccatgc caggaacctg tcctaaggaa ccttccttcc tgcttgagtt cccagatggc  4088
tggaaggggt ccagcctcgt tggaagagga acagcactgg ggagtctttg tggattctga  4148
ggccctgccc aatgagactc tagggtccag tggatgccac agcccagctt ggccctttcc  4208
ttccagatcc tgggtactga aagccttagg gaagctggcc tgagagggga agcggcccta  4268
agggagtgtc taagaacaaa agcgacccat tcagagactg tccctgaaac ctagtactgc  4328
cccccatgag gaaggaacag caatggtgtc agtatccagg ctttgtacag agtgcttttc  4388
tgtttagttt ttactttttt tgttttgttt ttttaaagac gaaataaaga cccaggggag  4448
aatgggtgtt gtatggggag gcaagtgtgg ggggtccttc tccacaccca ctttgtccat  4508
ttgcaaatat attttggaaa ac                                           4530
<210>17
<211>1255
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>17
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
            20                  25                  30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
        35                  40                  45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
    50                  55                  60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65                  70                  75                  80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
                85                  90                  95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
            100                 105                 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
        115                 120                 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
    130                 135                 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145                 150                 155                 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
                165                 170                 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
            180                 185                 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
        195                 200                 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
    210                 215                 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225                 230                 235                 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
                245                 250                 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
            260                 265                 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
        275                 280                 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
    290                 295                 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305                 310                 315                 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
                325                 330                 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
            340                 345                 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
        355                 360                 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
    370                 375                 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385                 390                 395                 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
                405                 410                 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
            420                 425                 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
        435                 440                 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
    450                 455                 460
Leu Ala Leu Ile His His Asr Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465                 470                 475                 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
                485                 490                 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
            500                 505                 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
        515                 520                 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
    530                 535                 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545                 550                 555                 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
                565                 570                 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
            580                 585                 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
        595                 600                 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
    610                 615                 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625                 630                 635                 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser
                645                 650                 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
            660                 665                 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
        675                 680                 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
    690                 695                 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705                 710                 715                 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
                725                 730                 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
            740                 745                 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
        755                 760                 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
    770                 775                 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785                 790                 795                 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
                805                 810                 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
            820                 825                 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
        835                 840                 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
    850                 855                 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865                 870                 875                 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
                885                 890                 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
            900                 905                 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
        915                 920                 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
    930                 935                 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945                 950                 955                 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
                965                 970                 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
            980                 985                 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu  Asp Ser Thr Phe Tyr  Arg Ser Leu
        995                 1000                 1005
Leu Glu  Asp Asp Asp Met Gly  Asp Leu Val Asp Ala  Glu Glu Tyr
    1010                 1015                 1020
Leu Val  Pro Gln Gln Gly Phe  Phe Cys Pro Asp Pro  Ala Pro Gly
    1025                 1030                 1035
Ala Gly  Gly Met Val His His  Arg His Arg Ser Ser  Ser Thr Arg
    1040                 1045                 1050
Ser Gly  Gly Gly Asp Leu Thr  Leu Gly Leu Glu Pro  Ser Glu Glu
    1055                 1060                 1065
Glu Ala  Pro Arg Ser Pro Leu  Ala Pro Ser Glu Gly  Ala Gly Ser
    1070                 1075                 1080
Asp Val  Phe Asp Gly Asp Leu  Gly Met Gly Ala Ala  Lys Gly Leu
    1085                 1090                 1095
Gln Ser  Leu Pro Thr His Asp  Pro Ser Pro Leu Gln  Arg Tyr Ser
    1100                 1105                 1110
Glu Asp  Pro Thr Val Pro Leu  Pro Ser Glu Thr Asp  Gly Tyr Val
    1115                 1120                 1125
Ala Pro  Leu Thr Cys Ser Pro  Gln Pro Glu Tyr Val  Asn Gln Pro
    1130                 1135                 1140
Asp Val  Arg Pro Gln Pro Pro  Ser Pro Arg Glu Gly  Pro Leu Pro
    1145                 1150                 1155
Ala Ala  Arg Pro Ala Gly Ala  Thr Leu Glu Arg Ala  Lys Thr Leu
    1160                 1165                 1170
Ser Pro  Gly Lys Asn Gly Val  Val Lys Asp Val Phe  Ala Phe Gly
    1175                 1180                 1185
Gly Ala  Val Glu Asn Pro Glu  Tyr Leu Thr Pro Gln  Gly Gly Ala
    1190                 1195                 1200
Ala Pro  Gln Pro His Pro Pro  Pro Ala Phe Ser Pro  Ala Phe Asp
    1205                 1210                 1215
Asn Leu  Tyr Tyr Trp Asp Gln  Asp Pro Pro Glu Arg  Gly Ala Pro
    1220                 1225                 1230
Pro Ser  Thr Phe Lys Gly Thr  Pro Thr Ala Glu Asn  Pro Glu Tyr
    1235                 1240                 1245
Leu Gly  Leu Asp Val Pro Val
    1250                 1255
<210>18
<211>1466
<212>DNA
<213>homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(44)..(829)
<400>18
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtgtc acc atg tgg gtc ccg    55
                                                Met Trp Val Pro
                                                1
gtt gtc ttc ctc acc ctg tcc gtg acg tgg att ggt gct gca ccc ctc    103
Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu
5                   10                  15                  20
atc ctg tct cgg att gtg gga ggc tgg gag tgc gag aag cat tcc caa    151
Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln
                25                  30                  35
ccc tgg cag gtg ctt gtg gcc tct cgt ggc agg gca gtc tgc ggc ggt    199
Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly
            40                  45                  50
gtt ctg gtg cac ccc cag tgg gtc ctc aca gct gcc cac tgc atc agg    247
Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg
        55                  60                  65
aac aaa agc gtg atc ttg ctg ggt cgg cac agc ctg ttt cat cct gaa    295
Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu
    70                  75                  80
gac aca ggc cag gta ttt cag gtc agc cac agc ttc cca cac ccg ctc    343
Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu
85                  90                  95                  100
tac gat atg agc ctc ctg aag aat cga ttc ctc agg cca ggt gat gac    391
Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp
                105                 110                 115
tcc agc cac gac ctc atg ctg ctc cgc ctg tca gag cct gcc gag ctc    439
Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu
            120                 125                 130
acg gat gct gtg aag gtc atg gac ctg ccc acc cag gag cca gca ctg    487
Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu
        135                 140                 145
ggg acc acc tgc tac gcc tca ggc tgg ggc agc att gaa cca gag gag    535
Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu
    150                 155                 160
ttc ttg acc cca aag aaa ctt cag tgt gtg gsc ctc cat gtt att tcc    583
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser
165                 170                 175                 180
aat gac gtg tgt gcg caa gtt cac cct cag aag gtg acc aag ttc atg    631
Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met
                185                 190                 195
ctg tgt gct gga cgc tgg aca ggg ggc aaa agc acc tgc tcg ggt gat    679
Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp
            200                 205                 210
tct ggg ggc cca ctt gtc tgt aat ggt gtg ctt caa ggt atc acg tca    727
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser
        215                 220                 225
tgg ggc agt gaa cca tgt gcc ctg ccc gaa agg cct tcc ctg tac acc     775
Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr
    230                 235                 240
aag gtg gtg cat tac cgg aag tgg atc aag gac acc atc gtg gcc aac     823
Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn
245                 250                 255                 260
ccc tga gcacccctatcaacccccta ttgtagtaaa cttggaacct tggaaatgac       879
Pro
caggccaaga ctcaagcctc cccagttcta ctgacctttg tccttaggtg tgaggtccag   939
ggttgctagg aaaagaaatc agcagacaca ggtgtagacc agagtgtttc ttaaatggtg   999
taattttgtc ctctctgtgt cctggggaat actggccatg cctggagaca tatcactcaa  1059
tttctctgag gacacagata ggatggggtg tctgtgttat ttgtggggta cagagatgaa  1119
agaggggtgg gatccacact gagagagtgg agagtgacat gtgctggaca ctgtccatga  1179
agcactgagc agaagctgga ggcacaacgc accagacact cacagcaagg atggagctga  1239
aaacataacc cactctgtcc tggaggcact gggaagccta gagaaggctg tgagccaagg  1299
agggagggtc ttcctttggc atgggatggg gatgaagtaa ggagagggac tggaccccct  1359
ggaagctgat tcactatggg gggaggtgta ttgaagtcct ccagacaacc ctcagatttg  1419
atgatttcct agtagaactc acagaaataa agagctgtta tactgtg                1466
<210>19
<211>261
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>19
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
            20                  25                  30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
        35                  40                  45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
    50                  55                  60
His Cys Ile Arg Asn Lys ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
                85                  90                  95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
            100                 105                 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
        115                 120                 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
    130                 135                 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145                 150                 155                 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
                165                 170                 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
            180                 185                 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
        195                 200                 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
    210                 215                 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225                 230                 235                 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
                245                 250                 255
Ile Val Ala Asn Pro
            260

Claims (105)

1.一种治疗性的组合物，其包括表位抑制子和药物可接受的载体，该表位包含一个经测定是一种疾病相关的表位的外显子结合点。
2.根据权利要求1中的治疗性的组合物，其中抑制子是特定绑定表位的抗体，该表位在SEQ ID NO：2，4，6，8，10，11，13或15-25之一列出。
3.根据权利要求2中的治疗性的组合物，其中抗体是单克隆抗体。
4.一种治疗性的组合物，其包括核酸和药物可接受的载体，该核酸包括编码与疾病相关的外显子结合点表位。
5.根据权利要求4中的治疗性的组合物，其中核酸序列编码与疾病相关的外显子结合点表位，该表位包含在SEQ ID NO：2，4，6，8，10，11，13或15-25之一中。
6.一种表达载体，其包括编码与疾病相关的表位的核酸序列，该表位包含在SEQ ID NO：2，4，6，8，10，11，13或15-25之一中。
7.根据权利要求6中的表达载体，所述表达载体进一步包含编码载体蛋白的核酸序列。
8.一种治疗性的组合物，其包括多肽和药物可接受的载体，所述多肽包括编码与疾病相关的外显子结合点表位多肽。
9.根据权利要求8中的治疗性的组合物，其中的多肽包含编码与疾病相关的表位，该表位包含在SEQ ID NO：2，4，6，8，10，11，13或15-25之一中。
10.一种siRNA绑定编码表位的核酸序列，该表位是从SEQ IDNO：2，4，6，8，10，11，13或15-25组中选择的氨基酸序列。
11.一种核酸序列，其编码权利要求10中的siRNA。
12.一种载体，其包含权利要求11中的核酸。
13.一种细胞，其包含权利要求11中的siRNA。
14.一种治疗性的组合物，其包含权利要求10中的siRNA或编码这种siRNA的核酸和药物可接受载体。
15.一种治疗性的试剂盒，其包括表位抑制子和第二种药剂或用于治疗性方式的必须装置，该表位被测定是与疾病相关的表位的外显子结合点。
16.根据权利要求15的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用说明书或注射抑制子的设备。
17.一种诊断试剂盒，其包含表位抑制子和第二种药剂或用于治疗性方式的必须装置，该表位被测定是与疾病相关的表位的外显子结合点。
18.一种测定主体是否有可能在主体中形成与的疾病相关的异构体VEGF的方法，包括：
(i)来源于主体的样本与特定绑定表位的抗体相互作用，该表位在SEQ ID NO：2或4列出；
(ii)测定与样本绑定的抗体，若抗体绑定样本表明主体有与疾病相关的异构体VEGF。
19.一种测定主体是否有或可能产生与疾病相关的异构体HER-2的方法，包括：
(i)来源于主体的样本与特定绑定表位的抗体相互作用，该表位在SEQ ID NO：6或8列出；
(ii)测定与样本绑定的抗体，若抗体绑定样本表明主体有与疾病相关的异构体HER-2。
20.一种测定主体是否有或可能产生与疾病相关的异构体PSA的方法，包括：
(i)来源于主体的样本与特定绑定表位的抗体相互作用，该表位在SEQ ID NO：10、11或13列出；
(ii)测定与样本绑定的抗体，若抗体绑定样本表明主体有与疾病相关的异构体PSA。
21.一种测定主体是否有或可能产生与疾病相关的蛋白质异构体的方法，包括：
(i)来源于主体的样本与，根据声明29的方法鉴定的，特定绑定与疾病相关的表位的蛋白质异构体的抗体相互作用；
(ii)测定与样本绑定的抗体，若抗体绑定样本表明主体有与疾病相关的蛋白质异构体。
22.已经被鉴定与疾病相关的外显子结合点表位的抑制子在制备治疗该疾病的药物中的应用。
23.根据权利要求22的应用，制备癌症药物。
24.根据权利要求23的应用，进一步包含给患者注射另一种化学治疗的药剂。
25.特定绑定在SEQ ID NO：2或4，SEQ ID NO：6或8，SEQ ID NO：10、11或13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQID NO：20-21，SEQ ID NO：22-24，或SEQ ID NO：25所列表位的抗体在制备治疗VEGF，HER-2，PSA，PDGFR β；PSMA；CD86；泌乳刺激素或胰岛素受体的异构体相关的疾病的药物中的应用。
26.与根据权利要求29的方法鉴定的疾病相关的蛋白质异构体的外显子结合点表位特定结合的抗体在制备用于治疗蛋白质异构体相关的疾病的药物中的应用。
27.一种从众多抗体中，鉴定目标蛋白的抗体的方法，包括：
i.提供互不相同的众多抗体，其中至少有一种抗体特定绑定的融合蛋白至少包含连接载体蛋白的目标蛋白的一部分；
ii.众多抗体与固相表面相连，用以得到覆盖抗体的固相表面，即不同抗体位于不同的固相表面；
iii.覆盖抗体的固相表面与融合蛋白连接；
iv.分析测定载体蛋白的存在性研究，若存在载体蛋白表明有目标蛋白的抗体存在。
28.根据权利要求27的方法，目标蛋白包括蛋白质异构体或足以引发抗体对它的反应的其中一部分。
29.根据权利要求28的方法，蛋白质异构体是与疾病相关的蛋白质异构体。
30.根据权利要求27的方法，融合蛋白由哺乳动物的表达系统产生。
31.根据权利要求29的方法，目标蛋白包括滤过性毒菌引起的蛋白。
32.根据权利要求29的方法，载体蛋白包括分泌的碱性磷酸酶或足以保证酶活性的其中一部分。
33.根据权利要求29的方法，载体蛋白包括辣根过氧化物酶或足以保证酶活性的其中一部分。
34.根据权利要求29的方法，载体蛋白包括β-半乳糖苷酶或足以保证酶活性的其中一部分。
35.根据权利要求29的方法，载体蛋白包括荧光素酶或足以保证酶活性的其中一部分。
36.根据权利要求29的方法，载体蛋白包括IgG-Fc(γ链)。
37.根据权利要求29的方法，抗体连接的固相表面包含蛋白质A琼脂糖。
38.根据权利要求29的方法，抗体连接的固相表面包含蛋白质G琼脂糖。
39.根据权利要求29的方法，用于测定载体蛋白存在的分析属化学发光分析。
40.根据权利要求29的方法，用于测定载体蛋白存在的分析属荧光分析。
41.根据权利要求29的方法，用于测定载体蛋白存在的分析属比色分析。
42.根据权利要求29的方法，在(iii)和(iv)之间进一步包括洗脱步骤，用于移去未绑定的融合蛋白。
43.一种从众多抗体中鉴定绑定蛋白异构体的抗体的方法，包括：
i.提供互不相同的众多抗体，其中至少有一种抗体特定绑定的融合蛋白至少包含连接载体蛋白的蛋白异构体的一部分；
ii.众多抗体与固相表面相连，用以得到覆盖抗体的固相表面，即不同抗体位于不同的固相表面；
iii.覆盖抗体的固相表面与融合蛋白连接；
iv.分析测定载体蛋白的存在性研究，若存在载体蛋白表明有绑定蛋白异构体的抗体存在。
44.一种产生众多绑定目标蛋白的单克隆抗体的方法，包括：
i.给宿主注射众多融合蛋白或编码融合蛋白的核酸，每一融合蛋白至少包含目标蛋白和载体蛋白的一部分；
ii.从宿主细胞中获得产生众多单克隆抗体的细胞；
iii.根据声明1的方法筛选细胞，获得绑定目标蛋白的众多单克隆抗体。
45.根据权利要求44的方法，目标蛋白包括蛋白质异构体或足以引起抗体对其产生反应的其中一部分蛋白质异构体。
46.根据权利要求45的方法，蛋白质异构体是与疾病相关的。
47.根据权利要求44的方法，目标蛋白包括滤过性毒菌引起的蛋白或足以引起抗体对其产生反应的其中一部分。
48.根据权利要求44的方法，载体蛋白包括分泌的碱性磷酸酶或足以保证酶活性的其中一部分。
49.根据权利要求44的方法，载体蛋白包括辣根过氧化物酶或足以保证酶活性的其中一部分。
50.根据权利要求44的方法，载体蛋白包括β-半乳糖苷酶或足以保证酶活性的其中一部分。
51.根据权利要求44的方法，载体蛋白包括荧光素酶或足以保证酶活性的其中一部分。
52.根据权利要求44的方法，载体蛋白包括IgG Fc(γ链)。
53.根据权利要求44的方法，宿主是老鼠，鸡，兔子，山羊，绵羊，马，骆驼，猴子和人。
54.根据权利要求44的方法，众多指至少3种。
55.根据权利要求44的方法，众多指至少10种。
56.根据权利要求44的方法，众多指至少100种。
57.根据权利要求44的方法，众多指至少1000种。
58.根据权利要求44的方法，核酸是一表达载体。
59.一种产生众多绑的单克隆抗体的方法，其中至少一种单克隆抗体绑定与疾病相关的蛋白异构体，包括：
i.给宿主注射众多融合蛋白或编码融合蛋白的核酸，每一融合蛋白至少包含与疾病相关的蛋白异构体和载体蛋白的一部分；
ii.从宿主脾细胞中获得产生众多单克隆抗体的细胞；
iii.根据声明1的方法筛选细胞，获得绑定与疾病相关的蛋白异构体的一种单克隆抗体。
60.根据权利要求59的方法，至少有一种融合蛋白包括血管的内皮生长因子(VEGF)异构体165多肽DRARQENPCGPCSE(SEQ ID NO：2)或VEGF121多肽DRARQEDCDKPRR(SEQ ID NO：4)。
61.根据权利要求59的方法，至少有一种融合蛋白包括HER-2结合异构体1多肽INCTHSPLTS(SEQ ID NO：6)或HER-2结合异构体2多肽CTHSCVASPLT(SEQ ID NO：8)。
62.根据权利要求59的方法，至少有一种融合蛋白包括SEQ ID NOs：16，16或17-19之一。
63.根据权利要求59的方法，至少有一种融合蛋白包括SEQ ID NOs：20-25之一。
64.根据权利要求59的方法，载体蛋白包括分泌的碱性磷酸酶或足以保证酶活性的其中一部分。
65.根据权利要求59的方法，载体蛋白包括辣根过氧化物酶或足以保证酶活性的其中一部分。
66.根据权利要求59的方法，载体蛋白包括β-半乳糖苷酶或足以保证酶活性的其中一部分。
67.根据权利要求59的方法，载体蛋白包括荧光素酶或足以保证酶活性的其中一部分。
68.根据权利要求59的方法，载体蛋白包括IgG Fc(γ链)。
69.根据权利要求59的方法，宿主是老鼠，鸡，兔子，山羊，绵羊，马，骆驼，猴子和人。
70.根据权利要求59的方法，众多指至少3种。
71.根据权利要求59的方法，众多指至少10种。
72.根据权利要求59的方法，众多指至少100种。
73.根据权利要求59的方法，众多指至少1000种。
74.根据权利要求59的方法，核酸是一表达载体。
75.一种从众多抗体中，分离特异绑定与编码抗体的核酸相关的目标蛋白的抗体的方法，包括
i.至少部分目标蛋白连接到固相表面的突起，获得覆盖蛋白的突起；
ii.在形成抗原/抗体复合物的适当条件下，覆盖蛋白的突起与编码抗体的核酸相关的众多抗体相连；
iii.分离与突起相连的抗体，于是分离了针对目标蛋白的抗体。
76.根据权利要求75的方法，与编码抗体的核酸相关的抗体是抗菌素。
77.根据权利要求75的方法，进一步包括从突起中分离抗体的方法。
78.根据权利要求75的方法，进一步包括在步骤(ii)和(iii)之间的洗脱步骤。
79.根据权利要求75的方法，众多的蛋白质与众多的突起相连，不同的蛋白质与不同的突起相连。
80.根据权利要求75的方法，固相表面至少包含10突起。
81.根据权利要求75的方法，固相表面至少包含100突起。
82.根据权利要求75的方法，固相表面至少包含1000突起。
83.根据权利要求75的方法，至少部分目标蛋白与钥孔嘁血蓝素(KLH)相关。
84.根据权利要求75的方法，至少部分目标蛋白与分泌的碱性磷酸酶(SEAP)相关。
85.根据权利要求75的方法，至少部分目标蛋白与IgG Fc(γ链)相关。
86.根据权利要求75的方法，至少部分目标蛋白与谷光甘肽S转移酶(GST)相关。
87.根据权利要求75的方法，至少部分目标蛋白与多聚组氨酸标签相关。
88.根据权利要求75的方法，固相表面包括生物素或链霉亲和素。
89.根据权利要求75的方法，固相表面包括镍。
90.根据权利要求75的方法，固相表面包括谷胱甘肽。
91.一种在样品中测定抗原存在的方法，包括：
(i)在形成特异抗原/抗体复合物的条件下，样品与在其表面特定位置上包含多种抗体的固相表面相连；
(ii)在形成特异抗原/抗体复合物的条件下，进一步固相表面与众多融合蛋白相连，每一融合蛋白包括特异绑定位于固相表面上的抗体的多肽和载体蛋白；
(iii)在固相表面每一特定位置测定载体蛋白的存在性，若在特定位置无载体蛋白表明在特定位置有抗原特异绑定抗体，也就是在样本中存在抗原。
92.根据权利要求91的方法，固相表面至少包括100种抗体。
93.根据权利要求91的方法，固相表面至少包括1000种抗体。
94.根据权利要求91的方法，固相表面是一抗体组，每一抗体位于抗体组的特定位置。
95.根据权利要求91的方法，载体蛋白是酶或足以保证酶活性的其中一部分并且此方法进一步包括与固相表面连接的酶的底物。
96.一种鉴定目标蛋白表位的方法，包括：
i.提供编码众多融合蛋白的众多核酸，每一融合蛋白包括目标蛋白的6-15个氨基酸多肽和载体蛋白，这些多肽包括不同的目标蛋白序列；
ii.给宿主动物注射众多的核酸；
iii.从宿主获得血清；
iv.根据声明1的方法测定在血清中存在的绑定目标蛋白多肽的抗体数量。
97.根据权利要求96的方法，多肽包括目标蛋白的交错序列。
98.根据权利要求96的方法，蛋白质是细胞的表面受体并且融合蛋白包括位于受体胞外领域的氨基酸序列。
99.根据权利要求96的方法，目标蛋白包括与疾病相关的蛋白质异构体。
100.根据权利要求96的方法，多肽有8-12个氨基酸组成。
101.一种鉴定目标蛋白表位的方法，包括：
i.提供编码众多融合蛋白的众多核酸，每一融合蛋白包括目标蛋白的6-15个氨基酸多肽和载体蛋白，这些多肽包括不同的目标蛋白序列；
ii.给宿主动物注射众多的核酸；
iii.从宿主细胞制备大量产生单克隆抗体的细胞；
iv.根据声明1的方法扫描细胞，鉴定绑定目标蛋白的抗体，若存在绑定多肽的抗体，表明此多肽对应于目标蛋白的表位。
102.根据权利要求96的方法，目标蛋白包括与疾病相关的蛋白质异构体。
103.根据权利要求96的方法，多肽有8-12个氨基酸组成。
104.一种制备治疗疾病的DNA疫苗的方法，包括：
i.根据声明96的方法鉴定一种或更多与疾病相关的蛋白质表位；
ii.转染编码一种或更多表位的核酸序列进入表达载体，以此来制备治疗疾病的DNA疫苗。
105.一种制备治疗疾病的DNA疫苗的方法，包括：
i.根据声明96的方法鉴定一种或更多与疾病相关的蛋白质表位；
制备包括一种或更多表位的氨基酸序列的多肽，以此来制备治疗疾病的DNA疫苗。
CNA2004800257636A 2003-07-08 2004-07-08 基于vefg,her－2,psa蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂 Pending CN1849137A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/615,343 US20050009110A1 (en) 2003-07-08 2003-07-08 Methods of producing antibodies for diagnostics and therapeutics
US10/615,343 2003-07-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1849137A true CN1849137A (zh) 2006-10-18

Family

ID=33564541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800257636A Pending CN1849137A (zh) 2003-07-08 2004-07-08 基于vefg,her－2,psa蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20050009110A1 (zh)
EP (1) EP1651268A2 (zh)
CN (1) CN1849137A (zh)
WO (1) WO2005007198A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107884371A (zh) * 2017-04-28 2018-04-06 南方医科大学 用于高通量抗体快速检测的荧光素酶免疫吸附方法
CN110333350A (zh) * 2019-07-24 2019-10-15 成都和同易创生物科技有限公司 用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏fgf8诊断试剂盒

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CN101506236B (zh) 2005-11-30 2012-12-12 雅培制药有限公司 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途
BRPI0619249A2 (pt) 2005-11-30 2011-09-20 Abbott Lab anticorpos anti-globulÈmeros-aß, frações que se ligam a antìgeno destes, hibridomas correspondentes, ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras, métodos de produzir os ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos de usar os ditos anticorpos
US20070218503A1 (en) 2006-02-13 2007-09-20 Mitra Robi D Methods of polypeptide identification, and compositions therefor
DK2081950T3 (da) * 2006-09-21 2013-06-03 Nuclea Biomarkers Llc Med irinotecanbehandling forbundne ekspressionsprofiler
US8455626B2 (en) * 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2486928A1 (en) * 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
EP2203480A1 (en) 2007-10-25 2010-07-07 University Of Bristol Antibodies specific to pro-angiogenic isoforms of vascular endothelial growth factor (vegf)
WO2009097425A2 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Spring Bioscience Corporation Method for detecting truncated molecules
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
AU2010215761B2 (en) 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
WO2012010551A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
KR20130126576A (ko) * 2010-07-19 2013-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
JP6147665B2 (ja) 2010-08-14 2017-06-14 アッヴィ・インコーポレイテッド アミロイドベータ結合タンパク質
WO2012075333A2 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Prometheus Laboratories Inc. Her2delta16 peptides
US9721429B2 (en) * 2014-11-11 2017-08-01 Patent Investment & Licensing Company Optimizing drawing prize awards
US11199536B2 (en) 2016-06-03 2021-12-14 Aimed Bio Inc. Method for screening antibody using patient-derived tumor spheroids
US20210346484A1 (en) * 2017-12-11 2021-11-11 Medizinische Universitaet Wien Method of producing a vaccine composition and uses thereof

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217896A (en) * 1988-12-30 1993-06-08 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein
AU9028791A (en) * 1990-10-05 1992-04-28 President And Fellows Of Harvard College Detection and isolation of ligands
DE69233774D1 (de) * 1991-01-21 2009-12-10 Elan Pharm Inc Prüfung und Modell für Alzheimers-Krankheit
JPH05271294A (ja) * 1992-01-24 1993-10-19 Japan Found Cancer Res ヒトプロヒビチンおよびそれをコードするｄｎａ
TW327194B (en) * 1992-05-01 1998-02-21 American Cyanamid Co Novel amyloid precursor proteins and methods of using same
CA2131003A1 (en) * 1992-05-26 1993-12-09 Raymond G. Goodwin Novel cytokine that binds cd30
EP0633268B1 (en) * 1993-05-14 2004-07-28 Cancer Institute MDC proteins and DNAs encoding the same
EP0705436A1 (de) * 1993-06-22 1996-04-10 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Verfahren zur diagnose und analyse von mammakarzinomen
US6407215B1 (en) * 1995-05-18 2002-06-18 Thomas Jefferson University Antibodies to Mch2, an apoptotic cysteine protease
DE19653607A1 (de) * 1996-12-20 1998-06-25 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Diagnose und Therapie von Hodgkin-Lymphomen
DK1052292T3 (da) * 1997-12-22 2003-07-28 Genset Sa Prostatacancer-gen
US6252050B1 (en) * 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
US6703020B1 (en) * 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US6421613B1 (en) * 1999-07-09 2002-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Data processing of the maize prolifera genetic sequence
US7390632B2 (en) * 1999-09-30 2008-06-24 Tumor Biology Investment Group, Inc. Soluble ErbB3 receptor isoforms
ATE315789T1 (de) * 1999-11-16 2006-02-15 Genentech Inc Elisa für vegf
WO2001058485A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Prophylactic and therapeutic antibodies against vaccina virus antigens
US20020061571A1 (en) * 2000-03-20 2002-05-23 Mahadevan Mani S. Novel isoform of myotonic dystrophy associated protein kinase and uses thereof
JP2004536555A (ja) * 2000-11-03 2004-12-09 ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート 癌感受性の診断のための方法及び組成物並びに欠損ｄｎａ修復メカニズム及びその処置
CA2438832A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-06 Elan Pharmaceuticals, Inc. Transgenic knockouts of bace-1
WO2003003904A2 (en) * 2001-07-05 2003-01-16 Georgetown University Medical Center Coactivators in the diagnosis and treatment of breast cancer
ATE462006T1 (de) * 2001-08-01 2010-04-15 Univ Bristol Isoform des vegfs
US20030224393A1 (en) * 2002-01-30 2003-12-04 Decode Genetics Ehf. Gene for peripheral arterial occlusive disease
US20030157599A1 (en) * 2002-01-30 2003-08-21 Decode Genetics Ehf Gene for peripheral arterial occlusive disease
US20040120949A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
US20040214238A1 (en) * 2003-01-29 2004-10-28 Brown University Research Foundation Nociceptive neuron specific calcium channel isoform and uses thereof
PL2457929T3 (pl) * 2006-10-04 2016-12-30 Test ELISA dla VEGF

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107884371A (zh) * 2017-04-28 2018-04-06 南方医科大学 用于高通量抗体快速检测的荧光素酶免疫吸附方法
CN110333350A (zh) * 2019-07-24 2019-10-15 成都和同易创生物科技有限公司 用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏fgf8诊断试剂盒
CN110333350B (zh) * 2019-07-24 2022-06-10 成都和同易创生物科技有限公司 用于结肠癌早期诊断及治疗后评价的高灵敏fgf8诊断试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005007198A2 (en) 2005-01-27
US20070172817A1 (en) 2007-07-26
WO2005007198A3 (en) 2005-10-20
US20050009110A1 (en) 2005-01-13
EP1651268A2 (en) 2006-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1849137A (zh) 基于vefg,her－2,psa蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂
CN1214044C (zh) ErbB3抗体
CN100344970C (zh) 结合前列腺特异性膜抗原胞外域的抗体或其抗原结合部分、包含它们的试剂盒及其用途
KR101855381B1 (ko) 면역 관련 질병의 치료를 위한 신규한 조성물 및 방법
CN1787837A (zh) 防止和治疗癌转移以及与癌转移相关的骨质损失的方法
KR20210060530A (ko) 펩티드가 없는 안정화된 mhc 복합체에 의한 tcr 리간드에 대한 고효율 펩티드-mhc 친화도 스크리닝의 방법
CN1455680A (zh) Muc1胞外域和癌症治疗组合物及方法
CN1345331A (zh) 抑制血管发生的组合物和方法
CN1575303A (zh) 人cdr－移植抗体及其抗体片段
CN101039951A (zh) 肝癌生物标志物
CN1630529A (zh) 用于诊断和治疗b细胞恶性肿瘤的b细胞淋巴瘤特异性抗原
CN1946423A (zh) 诊断和治疗先兆子痫或子痫的方法
CN1768076A (zh) 淀粉样β(1－42)蛋白寡聚体、其衍生物及抗体、其制备方法和用途
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN1678633A (zh) 抗igf－i受体抗体
CN1547617A (zh) 肿瘤学药物革新
TW200918558A (en) Humanized anti-CXCR5 antibodies, derivatives thereof and their use
CN1430728A (zh) T细胞受体交互作用的调节
CN101074261A (zh) Trail受体1和/或trail受体2特异性抗体及其应用
CN102762221A (zh) 受体酪氨酸激酶(rtk)的抑制剂及其使用方法
US20100145030A1 (en) Gene encoding a multidrug resistance human p-glycoprotein homologue on chromosome 7p15-21 and uses thereof
CN1695059A (zh) 诊断结肠癌和胃癌的方法
CN1646692A (zh) 在肿瘤中差异表达的基因产物及其用途
CN1533435A (zh) 用于诊断及治疗胰岛素抗性及相关病症之方法和试剂
CN1701078A (zh) 前列腺癌相关基因和多肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20061018