CN1455680A

CN1455680A - Muc1胞外域和癌症治疗组合物及方法

Info

Publication number: CN1455680A
Application number: CN01815471A
Authority: CN
Inventors: 唐纳德·W·库弗; 大野恒哉
Original assignee: Alex Oncology Co; Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Alex Oncology Co; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2003-11-12
Also published as: CA2421751A1; WO2002022685A3; US20090232812A1; AU9263101A; KR20030068536A; JP5165175B2; CA2421751C; US20050053606A1; ATE447965T1; US20050042209A1; EP1317278B1; JP2004515472A; EP1317278A2; WO2002022685A2; DE60140461D1

Abstract

本发明提供用配体与MUC1的胞外域结合的拮抗剂抑制癌细胞增殖和治疗肿瘤的组合物和方法，所述配体与MUC1的胞外域的结合与MUC1的致癌功能有关。

Description

MUC1胞外域和癌症治疗组合物及方法

本申请要求2000年9月11日提交的临时申请顺序号No.60/231841的优先权。依据健康和人员行政部，国家健康研究所，国家癌症研究中心(National Cancer Institute，National Institutes ofHealth，Department of Health and Human Services)授权号R21-CA87421，美国政府对本发明拥有权力。

发明领域

本发明一般涉及癌症治疗领域，更具体地涉及与作为癌症治疗介入点的MUC1相互作用的调制剂或试剂的用途。

发明背景

在大多数腺上皮的腔表面上的分泌上皮细胞的顶端边缘上表达人MUC1粘蛋白糖蛋白。在癌中，贯穿整个细胞膜和细胞质MUC1高度过量表达(Kufe等，1984；Perey等，1992)。因为这样，癌细胞中MUC1表达的异常模式可能为MUC1带来一般在顶端膜至整个细胞膜发现的一种功能。MUC1粘蛋白的标志是包括在各分子中串连重复25-100次的糖基化的20个氨基酸的胞外序列的胞外结构域(Sreouss&Decker，1992)。与导管上皮组织的正常细胞相比，粘蛋白糖基化水平显示在癌细胞中较低(Kufe，美国专利No.5506343)。这种低糖基化作用导致在完全糖基化的粘蛋白中隐藏的肿瘤特异性表位的暴露。

超过90％的乳腺癌表现出MUC1的增量表达(MUC1也已知为粘蛋白，上皮膜抗原，多态性上皮粘蛋白，人乳脂小体膜抗原，Episialin，DF-3等，参见Barry&Sharkey，1985)。几次临床研究提出肿瘤细胞的细胞表面上表达的粘蛋白肿瘤抗原与各种癌症类型的不良预后有关(Itzkowitz等，1990)。

MUC1以跨膜形式和分泌形式两者被表达(Finn等，1995)。MUC1的重复唾液酸表位(胞外结构域)释放到血清中(Reddish等，1996)。MUC1的N-末端胞外结构域(裂解的胞外域)由接受O-糖基化作用的不同数目的20个氨基酸的串连重复组成。这种粘蛋白伸出细胞表面以上很远并且超出糖萼使得其容易与其它细胞相互作用。MUC1的C-末端区包括一个37个氨基酸的跨膜结构域和一个72个氨基酸的包含酪氨酸磷酸化位点的胞质尾部。胞外结构域裂解之后保留一个大约45个氨基酸的胞外域。没有人知道什么酶负责这时的胞外结构域的裂解。胞外结构域裂解之后保留的胞外域(或“MUC1/ECD”)一般包括氨基酸序列：

TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG。

MUC1的胞质结构域(“MUC1/CD”)包括多个亚结构域，它们在癌细胞中胞内信号传递中是重要的。β-连环蛋白在SAGNGGSSL基序与MUC1/CD直接结合(Yamamoto等，1997)。β-连环蛋白，即一种哺乳动物上皮粘着连接的成分在质膜的胞内表面与连环蛋白结合，并且作为wnt信号传递途径的倒数第二个下游介质在胞质中起着信号传递作用(Takeichi，1990；Novak&Dedhar，1999)。wnt途径的最终介质是刺激各种靶基因转录的β-连环蛋白和淋巴增强子因子/T细胞因子(Lef/Tcf)的核复合体(参见例如，Molenaar等，1996；Brunner等，1997)。几种类型癌症的发展中涉及β-连环蛋白-Lef/Tcf途经缺陷。

糖原合成酶激酶3β(GSK3β)也直接结合MUC1/CD，并且使与β-连环蛋白结合基序邻接的DRSPY位点的丝氨酸磷酸化，从而减少MUC1和β-连环蛋白之间的缔合(Li等，1998)。另外，c-Src酪氨酸激酶也与MUC1/CD SPYEKV基序结合并且使其磷酸化，导致MUC1/CD和β-连环蛋白之间的相互作用加强并且MUC1/CD和GSK3β之间的相互作用减弱(Li等，2001)。

MUC1还与细胞膜处的上皮生长因子受体(EGF-R，HER1)组成型缔合，并且激活的EGF-R诱导MUC1/CD SPYKEV基序的磷酸化作用(Li等2001(a))。EGF-R介导的MUC1/CD的磷酸化作用表现出增强MUC1与c-Src和β-连环蛋白的相互作用，并且下调MUC1和GSK3β之间的相互作用。这些结果支持这样一个模式，其中MUC1整合c-Src，β-连环蛋白和GSK3β途经之间的信号传递，并且癌细胞中MUC1的异常过量表达对该整合的信号传递的调节异常可能促进转化的表型(Li等2001(a))。

犰狳蛋白p120^ctn还与MUC1/CD直接结合，导致p120的核定位(Li&Kufe，2001)。细胞转化中涉及p120，并且在癌中发现p120表达的改变模式(参见，例如Jawhari等，1999；Shimazui等，1996)。p120是v-Src酪氨酸激酶底物，与E-钙粘着蛋白结合，并且涉及作为转录辅激活物(Reynolds等，1989；Reynolds等，1994；Daniels和Reynolds等，1999)。有关p120定位于细胞连接和细胞核的发现支持p120的作用，象β-连环蛋白，在细胞粘附和基因转录的调节中的作用。MUC1-表达肿瘤细胞的增加的转移可能性中可能涉及由于MUC1和p120的缔合导致的减弱的细胞粘着。

这样，获得的证据证明，MUC1/CD有将信号从胞外域转移给细胞核的功能，并且利用粘附受体和生长因子信号传递和细胞转化中涉及的信号传递机理。期望鉴定与MUC1-介导的信号传递和推导它的在细胞转化中的作用的调节相关的组合物和方法。

发明概述

本发明包括涉及MUC1的胞外域为内源配体提供结合区并且这样的结合与MUC1的致癌功能和癌细胞的增殖有关这项发现的应用方法和药物组合物。

本发明广义上涉及包括或包含MUC1/ECD调节的细胞增殖的拮抗剂的癌症治疗组合物和应用这样的试剂和治疗方法的方法。优选的是包括与MUC1/ECD结合或者与激活MUC1的致癌功能的MUC1/ECD配体结合的物质的试剂和组合物。

因此，本发明的一个方面提供一种抑制癌细胞增殖的方法，包括施用有效量的MUC1/ECD拮抗剂。MUC1/ECD拮抗剂是下调或减少细胞表面上存在的MUC1/ECD的量，或者下调结合MUC1/ECD的野生型MUC1/ECD配体的水平的试剂，和/或MUC1/ECD结合抑制剂。“MUC1/ECD结合抑制剂”指抑制适当地包括神经调节蛋白2同种型5(SEQ IDNO：2)，神经调节蛋白2同种型6(SEQ ID NO：3)，和它们的合适的片段的MUC1野生型配体与MUC1/ECD结合的化合物，或者抑制与SEQ IDNO：4中的表位结合的抗体与MUC1/ECD结合的化合物。神经调节蛋白2同种型5(SEQ ID NO：2)，神经调节蛋白2同种型6(SEQ ID NO：3)的合适的片段是那些与MUC1/ECD结合的片段。“MUC1/ECD-P1结合抑制剂”指通过对MUC1/ECD与结合于SEQ ID NO：4中的表位的抗体结合的抑制作用鉴定的MUC1/ECD结合抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，MUC1/ECD抑制剂是SEQ ID NO：1的多肽，或者包括SEQ ID NO：1的至少四个连续氨基酸的片段，例如TINV，NVHD，VHDV，DVET，VETQ，ETQF，TQFN，QFNQ，FNQY，NQYK，QYKT，YKTE，KTEA，TEAA，EAAS，AASR，ASRY，SRYN，RYNL，YNLT，NLTI，LTIS，TISD，ISDV，SDVS，DVSV，VSVS，SVSD，VSDV，SDVP，DVPF，VPFP，PFPF，FPFS，PFSA，FSAQ，SAQS，AQSG，QSGA，和SGAG。在另外的实施方案中，MUC1/ECD抑制剂是上述肽的保守变体。在另一个实施方案中，MUC1/ECD结合抑制剂是SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5的多肽，或者其保守变体。

在本发明另一个实施方案中，MUC1/ECD抑制剂是与MUC1/ECD序列SEQ ID NO：1中的一个或多个表位结合的抗体。在本发明另外的实施方案中，MUC1/ECD抑制剂是与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的一个表位结合的抗体。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体可以是人源化的或人单克隆抗体。其也可以是双特异性抗体或者包括抗原结合区的片段。在一些实施方案中，抗体偶联于化学治疗药物，放射性同位素，毒素，或者诱导细胞溶解或细胞毒性免疫应答的效应物。这样的偶联物可以包括细胞因子，抗代谢物，anthracycline，长春花生物碱，抗生素，烷化剂，天然产生的毒素，或者IgG1免疫球蛋白的Fc区。

在另一个实施方案中，所述方法进一步包括与MUC1/ECD拮抗剂联合施用化学治疗药物或放射疗法。化学治疗药物一般包括烷化剂，拓扑异构酶抑制剂，抗代谢物，微管蛋白相互作用试剂，抗激素试剂，鸟氨酸脱羧酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。

在不同的实施方案中，癌细胞选自皮肤癌细胞，前列腺癌细胞，肺癌细胞，脑癌细胞，乳腺癌细胞，卵巢癌细胞，子宫颈癌细胞，肝癌细胞，胰腺癌细胞；结肠癌细胞，胃癌细胞和白血病细胞。

本发明的另一方面是减少哺乳动物肿瘤生长的方法，包括施用治疗量的化学治疗药物或放射疗法和有效量的MUC1/ECD拮抗剂。在优选的实施方案中，哺乳动物是人。在一个实施方案中，所述方法用于治疗顽固性肿瘤，包括在用一种或多种化学治疗药物治疗之后，施用治疗量的化学治疗药物或放射疗法和有效量的MUC1/ECD拮抗剂。在不同的实施方案中，所述肿瘤是皮肤，前列腺，肺，脑，乳腺，卵巢，子宫颈，肝，胰腺，结肠，胃或血液系统的肿瘤。

本发明的其它方面涉及含有MUC1/ECD拮抗剂和药学可接受载体的药物组合物。其中所述拮抗剂是MUC1/ECD结合抑制剂，其可以是SEQ ID NO：1的多肽或者包括至少四个连续的氨基酸的片段，或者其保守变体，和药学可接受载体。在一些实施方案中，MUC1/ECD抑制剂可以是SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5的多肽，或者其保守变体。在其它实施方案中，药物组合物含有是MUC1/ECD结合抑制剂并且与选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽序列中的表位结合的抗体和药学可接受载体。

本发明还涉及筛选MUC1/ECD结合抑制剂活性的方法。一个实施方案包括抑制配体与MIJC1/ECD结合的化合物的鉴定方法，该方法包括：(a)提供包括SEQ ID.NO：1或SEQ ID NO：5的多肽；(b)使所述多肽接触一种试验化合物和一种MUC1胞外域的配体，所述配体选自刺激MUC1介导的癌细胞增殖的MUC1/ECD的抗体和结合MUC1/ECD并且刺激癌细胞增殖的野生型配体；和(c)测定所述抗体与MUC1/ECD或野生型配体的结合相对于合适的对照是否有所降低。合适的对照包括，但不限于排除试验化合物的测试。在一个实施方案中，刺激MUC1介导的癌细胞增殖的MUC1/ECD抗体是与SEQ ID NO.4中的表位结合的抗体。在其它实施方案中，所述野生型配体可以合适地包括神经调节蛋白2同种型5(SEQ ID NO：2)和其合适的片段，和神经调节蛋白2同种型6(SEQ ID NO：3)，和它们的合适的片段，其中合适的片段是与SEQ ID NO：1结合并且具有合适的生长刺激活性的那些。

另一个实施方案是抑制MUC1表达癌细胞的增殖的化合物的鉴定方法，该方法包括：(a)提供MUC1表达癌细胞群；(b)使所述MUC1表达癌细胞群接触一种试验化合物和一种MUC1胞外域的配体，所述配体选自刺激MUC1介导的癌细胞增殖的MUC1/ECD的抗体和结合MUC1/ECD并且刺激癌细胞增殖的野生型配体；和(c)测定所述MUC1-表达癌细胞种群的增殖与合适的对照物相比较是否有所降低。合适的对照物包括但不限于其中排除试验化合物的增殖测试。在一个实施方案中，刺激MUC1介导的癌细胞增殖的MUC1/ECD抗体是与SEQ ID NO.4中的表位结合的抗体。在其它实施方案中，所述野生型配体可以合适地包括神经调节蛋白2同种型5(SEQ ID NO：2)和其合适的片段，和神经调节蛋白2同种型6(SEQ ID NO：3)，和其合适的片段，其中合适的片段是与SEQ ID NO：1结合并且具有合适的生长刺激活性的那些。

本发明还提供了鉴定下调MUC1/ECD表达的化合物的方法。该方法包括：(a)提供MUC1表达癌细胞群；(b)使所述MUC1表达癌细胞群接触一种试验化合物；(c)使用抗-MUC1/ECD抗体来鉴定MUC1表达癌细胞中包含MUC1/ECD的多肽；和(d)测定包含MUC1/ECD的多肽的表达与排除该试验化合物的对照相比较是否有所降低。

本发明还包括含有上述方法鉴定的化合物和药学可接受载体的药物组合物。

附图说明

下面的附图构成本发明说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步证明本发明的一些方面。通过参考这些附图中的一幅或几幅并且结合这里给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：抗-MUC1-P1抗体对ZR-75-1乳腺癌细胞增殖的作用。

图2：抗-MUC1-P1抗体对稳定表达空载体(SW480/V)或MUC1(SW480/MUC1)的SW480细胞增殖的作用。

图3：ZR-75-1条件培养基对稳定表达空载体(SW480/V)或MUC1(SW480/MUC1)的SW480细胞增殖的作用。

图4：MUC1对稳定表达空载体(HeLa/V)或MUC1(HeLa/Muc1)的HeLa细胞中H₂O₂和紫杉醇-诱导的细胞调亡的作用。结果以三个独立实验的细胞调亡百分数表示(平均值±SE)。

发明详述

I.多肽

通过合成技术或者利用基因组或cDNA克隆方法的重组技术能够制备本发明的多肽。常规情况下应用固相或溶液相肽合成能够合成多肽。通过化学合成制备相对短的多肽，例如P0(SEQ ID NO：9)，P1(SEQID NO：4)，P2(SEQ ID NO：6)和P3(SEQ ID NO：7)的方法是本领域公知的。例如，利用商业上可购得的设备和试剂例如从Milligen(Bedford，Mass.)或Applied Biosystems Perkin Elmer(FosterCity，CA)购得的那些，通过固相肽合成技术，可以制备这样的多肽。或者，通过固相合成可以制备这样的多肽的片段，并且利用例如Dawson等，(1994)描述的那些片段缩合方法连接在一起。这样的多肽的化学合成中，通过用不同的氨基酸单体置换要取代的残基就简单地实现了任何氨基酸的取代作用。

这里实施例3例示说明了鉴定野生型MUC1/ECD配体多肽。然后通过本领域公知的方法能够制备重组MUC1/ECD配体。

本发明的多肽包括多肽的变体。所谓″变体″多肽意指在序列的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸或者在序列的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸而修饰的多肽序列。本发明包括的变体多肽保留了它们所来源的多肽的期望的生物学活性。这样的变体与它们所来源的多肽的氨基酸序列具有至少40％，50％，60％，70％，一般至少75％，80％，85％，优选大约90％至95％或更多，更优选大约98％或更大序列同一性。通过应用使用Smith和Waterman，(1981)算法的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，MadisonWisconsin)比较两个序列，可以测定多肽的天然和变体序列之间的序列同一性百分比，也称为同源性。

本发明的多肽也包括带有一个或多个保守取代的变体多肽。为了将氨基酸取代分为保守型，将氨基酸如下分组：I组(疏水性侧链)：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；II组(中性亲水性侧链)：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸；III组(酸性侧链)：天冬氨酸，谷氨酸；IV组(碱性侧链)：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；V组(影响链取向的残基)：甘氨酸，脯氨酸；和VI组(芳香侧链)：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。保守型取代包括同组中的氨基酸之间的取代。

本发明还包括多肽的化学衍生物。″化学衍生物″指具有通过官能性侧基的反应化学衍生的一个或多个残基的多肽。这样的衍生化残基包括例如那些分子，其中游离氨基被衍生化生成胺的盐酸化物，对-甲苯磺酰基，苄酯基，叔丁氧羰基，氯代乙酰基或甲酰基。游离羰基可以被衍生化生成盐，甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以被衍生化生成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑基可以被衍生化生成N-im苄基组氨酸。

这里使用的术语″多肽″指氨基酸分子链而不是指该产物的特定长度。

II.抗体

术语″抗体″是广义使用的，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性。

制备多克隆抗体的方法是本领域公知的。简要地说，通过用抗原组合物免疫动物并且从接受免疫的动物收集血清来制备多克隆抗体。很多动物物种被用于制备抗血清，包括兔，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠和山羊。

本领域公知，给定的组合物其免疫原性可能不同。因此对宿主免疫系统的加强免疫经常是必需的，这可以通过使多肽免疫原与载体的偶联来实现。举例和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。象卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白这样的其它白蛋白也可以用作载体。多肽与载体蛋白质偶联的方法是本领域公知的并且包括戊二醛，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，碳化二亚胺和双-biazotized联苯胺。正如本领域也公知的，使用已知为佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂能够增强特定免疫原组合物的免疫原性。举例和优选的佐剂包括弗氏完全佐剂(含有杀死的结核分枝杆菌的免疫应答的非特异性刺激剂)，弗氏不完全佐剂和氢氧化铝佐剂。

接受免疫的动物的血清可以用于各种应用，或者通过公知的方法可以纯化期望的抗体级分，例如使用与固体基质结合的另一种抗体或肽的亲和色谱。

利用公知技术可以容易制备单克隆抗体(MAbs)，例如美国专利4,196,265中举例的那些方法，该专利文献在此引作参考。一般地，该项技术包括用选择的免疫原成分例如纯化的或部分纯化的表达多肽免疫合适的动物。以有效刺激产生抗体的细胞的方式施用免疫成分。

制备单克隆抗体(MAbs)的方法一般与用于制备多克隆抗体的那些细胞系相同的细胞系开始。使用大鼠可以提供一些好处(Goding，1986)，但是小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最常使用的，并且通常给出更高百分比的稳定的融合。

免疫之后，筛选有可能产生抗体的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，在制备Mab的方案中使用。这些细胞可以获自活检的牌，扁桃体或淋巴结样品，或者获自外周血样品。脾细胞和外周血细胞是优选的。经常地，对一组动物进行免疫，并且取出具有最高抗体效价的动物的脾，并且从脾中获得淋巴细胞。

然后将从免疫动物获得的产生抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，一般情况下，相同物种中的一个作为接受免疫的动物。适合在产生杂交瘤的融合程序中使用的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，具有高融合效率，并且酶不足，使得它们不能在只支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。将选择的杂交瘤系列稀释并且克隆到各个产生抗体的细胞系，其然后可以无期限地繁殖，提供Mabs。

根据本发明，通过包括用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化和/或通过化学还原裂解二硫键的方法，能够从如上所述制备的单克隆抗体获得本发明的单克隆抗体的片段。或者，使用自动合成仪，或者通过在大肠杆菌或其它重组微生物和细胞系中表达全长基因或基因片段，能够合成本发明包括的单克隆抗体的片段。

本发明还包括各种抗体偶联物。通过本领域公知的方法制备带有荧光素标记的偶联物，例如通过在偶联剂存在下的偶联作用或者通过与异硫代氰酸酯的反应。类似地制备带有金属螯合物的偶联物。抗体可以偶联的其它部分包括放射性核素，例如¹³¹I，⁹⁰Y，¹⁰⁵Rh，⁴⁷Sc，⁶⁷Cu，²¹²Bi，²¹¹At，¹⁸⁸Re，¹⁰⁹Pd，⁴⁷Sc，²¹²Pb，和¹⁵³Sm等，如Gansow，1991所述，该文献在这里引作参考。

本发明的单克隆抗体也可以偶联于常用的化学治疗药物，例如抗代谢物，anthracycline，长春花生物碱，抗生素或烷化剂。可以偶联目标抗体的药物包括下面的化合物，例如阿霉素(doxorubicin)，环磷酰胺，顺铂，阿霉素(adriamycin)，雌莫司汀，氟尿嘧啶，乙炔雌二醇，米托恩醌，甲氨喋呤，非那甾胺，紫杉醇和甲地孕酮。可以直接通过共价键或者间接通过连接分子实施偶联方法，并且针对选择的特定的药物的偶联方法一般是本领域已知的，并且使用各种双功能蛋白质偶联剂进行。这样的试剂的例子是SPDP，IT，亚氨酸酯的双功能衍生物，例如二甲基己二酰亚胺酯HCl的双功能衍生物，活性酯类，例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯，醛类，例如戊二醛，二叠氮基化合物，例如双(R-叠氮基苯甲酰基)己二胺，双重氮鎓衍生物，例如双-(R-重氮鎓苯甲酰基)乙二胺，二异氰酸酯类，例如甲代亚苯基2，6-二异氰酸酯，和双活性氟化合物，例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯(参见，例如，Thorpe等，1982，这里引作参考)。

本发明的抗体还可以偶联各种毒素分子或者效应物，例如IgG1免疫球蛋白，其诱导细胞溶解或细胞毒性免疫应答。因此，通过各种公知的化学方法可以将两个成分化学键合在一起。例如，利用杂双功能交联剂，键可以是例如SPDP，碳化二亚胺，戊二醛，等。通过重组方法也可以使毒素分子与抗体或其结合区融合，例如通过单链抗体的制备。通过本领域技术人员公知的任何克隆方法可以以cDNA或基因组形式克隆编码蛋白质链的基因(参见，例如Sambrook等，1989)。各种免疫毒素的重组制备是本领域公知的，并且可以例如从Thorpe等，1982(a)，Waldmann，1991，和Pastan等，1992中得知，这两篇文献在此引作参考。很多种毒素分子适合用作这里描述的抗体偶联物或融合蛋白中的细胞毒性结构域。可以使用已知用作免疫毒素的毒性成分的任何毒素，优选可以重组表达的蛋白质毒素。特别可用作细胞毒性结构域的是细菌毒素，例如假单胞菌外毒素A(PE)，白喉毒素，志贺菌毒素和志贺样毒素，和来自植物和真菌的核糖体灭活毒素，包括蓖麻毒，α-次黄嘌呤，局限曲菌素，mitogellin，tricanthosin，saporin-G，saporin-1，木鳖子苷，gelonin，美洲商陆抗病毒蛋白，红豆毒素，modeccin和在遗传工程毒素(Genetically Engineered Toxins)，A.Frankel编著，Marcel Dekker，Inc.，1992中描述的其它毒素，该文献在此引作参考，和那些蛋白质的任何重组衍生物(参见Olsnes 1981；美国专利No.4,675,382；和美国专利No.4,894,443，这里引作参考)。

所述抗体也可以是即识别MUC1/ECD又识别促进细胞因子释放的抗原的双特异性抗体，所述细胞因子是例如IL-1，TNFα和CD16，CD2，CD3 L.C.CD28，其接着分别激活IFNγ或TNFα的释放。

本发明的MAbs包括嵌合Mabs，包括非人(例如鼠)Mabs的″人源化″形式。人源化Mabs是嵌合抗体，其包含从非人免疫球蛋白来源的最小序列。对于大多部分来说，人源化抗体是具有期望的特异性，亲和性和能力的人免疫球蛋白(受体)，其中来自非人物种(供体抗体)例如小鼠，大鼠，兔或非人灵长类的高变区的残基取代受体高变区的残基。在某些情况下，相应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架残基。此外，人源化抗体可以包括受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。一般情况下，人源化抗体包括基本上全部的至少一个，一般两个可变区，其中全部或基本上全部的高变区相应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的那些。任选地，所述人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。(参见Jones等，1986；Riechmann等，1988；和Presta，1992)。在本发明的治疗方法中全人Mabs是优选的。

本发明的″单链FV″或″sFv″抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般情况下，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv形成抗原结合所期望的结构(参见Pluckthun，1994)。

III.筛选和诊断分析

本发明提供抑制各种配体与MUC1/ECD结合的化合物的鉴定方法。所述结合配体包括与MUC1/ECD结合的神经调节蛋白2同种型5(SEQ ID NO：2)，神经调节蛋白2同种型6(SEQ ID NO：3)及任一种同种型的片段，在优选的实施方案中，包括结合SEQ ID NO：4中的表位的抗体。

在一个实施方案中，所述筛选方法应用体外竞争结合测试，其中评价一种试验化合物抑制上述配体与包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO：5的多肽的结合的能力。在这样的测试中，包括MUC1/ECD来源的序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO：5的多肽可以与另一种蛋白质偶联，或作为融合蛋白产生，例如，实施例3中举例的GST-MUC1/ECD融合蛋白。本领域技术人员应用本领域公知的方法可以制备其它合适的偶联物和融合蛋白。所述多肽或MUC1/ECD配体可以标记有放射性同位素或荧光标记(例如，藻胆蛋白质，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白，荧光素和德克萨斯红)。或者可以使用一种酶，例如过氧化物酶，并且通过生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白系统直接或间接偶联。导入试验化合物时结合减弱是竞争结合的指征。

抑制配体与NMC1/ECD结合的化合物可以是一种调制剂，它是由神经调节蛋白2同种型5或6结合MUC1/ECD所起始的生物活性的拮抗剂或激动剂。例如，预期抗多肽P1(SEQ ID.NO 4)的抗体抑制野生型配体的结合，但是作为MUC1/ECD结合位点的激动剂起作用，即，它刺激癌细胞的增殖。相反，合适的化合物，例如MUC1/ECD多肽SEQ ID NO.1，会结合内源野生型配体，从而阻止结合MUC1/ECD，并且接着作为拮抗剂起作用，即，阻止或减少癌细胞的增殖，这种增殖在MUC1/ECD配体结合时可以观察到。

另一种筛选测试能够区分MUC1/ECD结合抑制剂对MUC1表达癌细胞的增殖表现出的拮抗性和激动剂活性。该方法需要MUC1阳性癌细胞群，优选人癌细胞群。这是组成型表达MUC1的细胞群，但是所述细胞群优选是经基因工程处理表达MUC1的细胞群。对于提供用于合适的对照的细胞，例如用空载体经基因工程处理的细胞，或者对于构建表达MUC1突变体的细胞，后一种细胞群更灵活。基因工程处理的MUC1癌细胞的例子包括但不限于，这里的实施例2和4中例示的SW480和HCT116结肠癌细胞。MUC1/ECD配体诱导的细胞增殖的抑制指示具有拮抗剂活性的试验化合物。对照可以包括空载体(即MUC1阴性)基因工程处理的癌细胞的温育或者没有试验化合物或MUC1/ECD配体的存在下MUC1阳性细胞的温育。后一种情况下的对照之一鉴定激动剂，即，在存在试验化合物和不存在MUC1/ECD配体的温育中发现癌细胞增殖的刺激作用。通过使用基因工程处理的MUC1-阴性细胞确定激动剂活性的特异性。

还有另一种筛选测试监测MUC1/ECD配体诱导的MUC1胞内域的磷酸化作用。另一种筛选方法利用对MUC1/ECD诱导的MUC1与EGF-R，s-Src，β-连环蛋白，GSK3β或p120的缔合配体的监测。监测这样的磷酸化作用和蛋白质缔合的方法描述于Li等，(1998)，Li等，(2001)，Li等，(2001(a))和Li & Kufe，(2001)，这些文献都在此引作参考。

本发明还提供了下调MUC1/ECD表达的化合物的鉴定方法。在本发明的一些实施方案中，通过流式细胞术或者通过免疫组织化学，应用本领域公知的方法，使用标记的MUC1/ECD的抗体观察MUC/ECD在合适的细胞系中的表达。或者，通过免疫印迹或通过用标记的DNA探针探测总细胞RNA，能判断MUC1的表达，例如，如这里的实施例7所述。

对MUC1/ECD表达的判断也可以用于诊断方法，其中MUC1/ECD的抗体可以被用来研究来自受试者的细胞上或细胞中的MUC1/ECD表达。这样的抗体也可以用于对受试者体内癌细胞的成像。通过例如用放射性标记物标记抗-MUC1/ECD抗体，并且将该抗体注射给受试者，进行成像并且监测该抗体在所述受试者体内的位置。

IV.与化学治疗药物联合

本发明涉及与化学治疗药物联合使用MUC1/ECD拮抗剂。不受任何特定理论的局限，MUC1抑制某些化学治疗药物诱导的对基因毒物应激的细胞调亡反应，并且从而诱导对这样的药物的抗性。MUC1/ECD拮抗剂可以被用来减轻这种MUC1介导的对化学治疗药物的反应，从而增强这样的药物的效力。就这方面来说，MUC1/ECD拮抗剂用于治疗癌症细胞对化学治疗药物的耐药性，包括癌症化学治疗之后的剩下的或复发的残留癌。上述合理性方法还涉及MUC1/ECD拮抗剂和电离辐射的联合。

本发明方法中使用的化学治疗药物包括已知在杀灭和/或抑制癌细胞生长中有活性的所有的组合物和化合物。以作用机理分组，化学治疗药物包括DNA-相互作用试剂，抗代谢物，微管蛋白相互作用试剂，抗激素药，抗病毒药，ODC抑制剂和其它细胞毒性物质例如羟基脲。所有的这些试剂适合在本发明方法中使用。

DNA-相互作用物质包括烷化剂，例如，顺铂，环磷酰胺，六甲密胺；DNA链断裂试剂，例如博莱霉素；嵌入性拓扑异构酶II抑制剂，例如，放线菌素D和阿霉素)；非嵌入性拓扑异构酶II抑制剂，例如，依托泊苷和替尼泊苷；和DNA小沟结合剂plicamycin。

烷化剂与细胞DNA，RNA和蛋白质分子和与较小的氨基酸，谷胱甘肽和类似的化合物形成共价化学加成物。一般情况下，这些烷化剂与细胞成分中的亲核原子反应，例如核酸，蛋白质，氨基酸或谷胱甘肽中的氨基，羧基，磷酸酯，巯基。这些烷化剂在癌症治疗中的机理和作用还没有被完全认清。典型的烷化剂包括：氮芥类，例如苯丁基氮芥，环磷酰胺，异环磷酰胺，双氯乙基甲胺，苯丙氨酸氮芥，尿嘧啶氮芥；环乙亚胺例如塞替派；甲磺酸酯类，例如二甲磺酸丁酯；亚硝基脲类，例如双氯乙亚硝脲，环己亚硝脲，链脲霉素；铂络合物，例如顺铂，卡铂；生物还原性烷化剂，例如丝裂霉素和甲苄肼，达卡巴嗪和六甲密胺；DNA链断裂试剂，包括博莱霉素。

拓扑异构酶是普遍存在的细胞酶，其在复制过程中起始瞬时DNA链断裂，使得链自由转动。这些酶的功能性对于DNA的复制过程是决定性的。没有它们，DNA螺旋中的扭转张力阻止自由旋转，DNA链不能适当分开，细胞最终没有分裂就死亡。Topo I连接DNA单链断裂的3′末端，而Topo II连接双链DNA断裂的5′末端。DNA拓扑异构酶II抑制剂包括下面的物质：嵌入剂，例如安吖啶，放线菌素D，柔红霉素，阿霉素，去甲氧柔红霉素和米托恩醌；非嵌入剂，例如依托泊苷和替尼泊苷；camtothecins，包括irinotecan(CPT-II)和托泊替堪。代表性DNA小沟结合剂是plicamycin。

抗代谢物一般通过两种主要机理中的一种或另一种干扰核酸的产生而表现出细胞毒性活性。一些药物抑制脱氧核糖核苷三磷酸酯的产生，后者是DNA合成的中间前体体，这样抑制DNA复制。一些化合物足够类似于嘌呤或嘧啶，能在合成代谢的核苷酸途经中替代它们。然后这些类似物能够取代到DNA和RNA中代替它们正常的对应物。这里使用的抗代谢物包括：叶酸盐拮抗剂，例如甲氨喋呤和曲美沙特；嘧啶拮抗剂，例如氟尿嘧啶，氟脱氧尿苷，氮胞苷，阿糖孢苷，和氟尿苷；嘌呤拮抗剂，包括巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，氟达拉滨；糖修饰类似物，包括阿糖孢苷，氟达拉滨；核糖核苷酸还原酶抑制剂，包括羟基脲。

微管蛋白相互作用试剂通过结合微管蛋白上特定位点而干扰细胞分裂，微管蛋白是聚合生成细胞微管的蛋白质。微管是重要的细胞结构单位。当相互作用试剂在蛋白质上结合时，细胞不能正常形成微管。微管蛋白相互作用试剂包括长春新碱和长春花碱，生物碱和紫杉烷类(紫杉醇和docetaxel)。

尽管它们的作用机理不同，紫杉烷类和长春花生物碱对细胞微管都表现出生物学作用。紫杉烷类促进微管蛋白的聚合作用，微管蛋白是纺锤体微管的蛋白质亚基。最终结果是微管的解聚作用的抑制，它引起稳定的和非功能性微管的形成。这破坏了微管系统的动态平衡，并且在晚G2和M期使细胞周期停止，这抑制细胞复制。

和紫杉烷类一样，长春花生物碱还影响细胞中的微管系统。与紫杉烷类相反，长春花生物碱结合微管蛋白并且抑制或阻止微管蛋白亚基聚合成微管。长春花生物碱还诱导微管的解聚作用，这抑制微管装配并且介导细胞中期停止。长春花生物碱还影响核酸和蛋白质合成；氨基酸，环AMP，和谷胱甘肽合成；细胞呼吸；并且在更高浓度表现出免疫抑制活性。

抗激素试剂通过在终端受体器官阻断激素作用而表现出细胞毒性活性。几种不同类型的肿瘤要求激素刺激来延续细胞繁殖。抗激素试剂通过阻断激素作用对肿瘤细胞剥夺复制必需的刺激。细胞达到它们的生命周期终点时，它们正常死亡，没有分裂和产生另外的恶性细胞。抗激素试剂一般源于天然来源并且包括：雌激素，结合雌激素和乙炔基雌二醇和乙烯雌酚，氯烯雌醚和idenestrol；孕激素，例如己酸羟基孕甾酮，甲羟孕酮，和甲地孕酮；雄激素，例如睾酮，丙酸睾酮；氟甲睾酮，甲睾酮。

肾上腺皮质类固醇从天然肾上腺可的松或氢化可的松衍生。使用它们是因为它们的抗炎优点及其中一些抑制有丝分裂和停止DNA合成的能力。这些化合物包括强的松，地塞米松，甲基强的松龙和强的松龙。在前列腺癌的治疗中主要使用促黄体素释放激素试剂或促性腺释放激素拮抗剂。这些包括利普安和醋酸性瑞林。它们防止甾族化合物在睾丸中的生物合成。

抗激素试剂包括抗雌激素试剂，例如他莫昔芬，抗雄激素试剂，例如氟他胺，和抗肾上腺试剂，例如米托坦和氨鲁米特。

ODC(或鸟氨酸脱羧酶)抑制剂通过排除或者干扰ODC的活性而抑制癌和癌前细胞增殖，ODC是对肿瘤细胞生长重要的聚胺生物合成的速度限制酶。特别地，鸟氨酸被转化为聚胺，腐胺(腐胺随后转化为亚精胺)和精胺的聚胺生物合成似乎是各种癌和癌细胞系中肿瘤生长增殖作用中关键的生物化学作用，并且已经证明这样的肿瘤细胞中ODC活性的抑制作用或ODC的排除减少这样的细胞中聚胺的水平，导致细胞生长停止；更分化的细胞形态以及甚至细胞衰老和死亡。就这一点来说，ODC或聚胺合成抑制剂被认为是比细胞毒性或细胞杀灭试剂更有细胞毒性的试剂，其功能是防止癌症复发或者防止前癌细胞转化为癌细胞。合适的ODC抑制剂是艾氟尿氨酸或α-二氟甲基-鸟氨酸，即一种口服有效的不可逆的ODC抑制剂，以及各种聚胺类似物，它们处于临床前和临床研究的各个阶段。

其它细胞毒素包括干扰或阻断对于保持细胞功能或细胞有丝分裂是必需的各种细胞过程的试剂，以及促进细胞调亡的试剂。就这一点来说，羟基脲表现出通过核糖核苷酸还原酶的抑制剂而起作用，而天冬酰胺酶将天冬酰胺酶促转化为没有功能的天冬氨酸，从而阻断肿瘤中蛋白质的合成。

本发明的MUC1/ECD拮抗剂成分也可以与HER-2的抗体例如Trastuzumab(Herceptin(H))联合使用。另外，本发明还涉及与表皮生长因子受体-相互作用试剂例如酪氨酸激酶抑制剂联合使用MUC1结构域拮抗剂。酪氨酸激酶抑制剂适当地包括imatinib(Norvartis)，OSI774(OSI Pharmaceuticals)，ZD-1839(AstraZeneca)，SU-101(Sugen)和CP-701(Cephalon)。

当在本发明的治疗方法中使用时，注意选择化学治疗药物，使其方便在任何目前可购得的配方中以低于经批准的对于单一药物标明的剂量或者在该剂量之内的剂量使用。

V.电离辐射

在本发明中，术语″电离辐射″指包括粒子或光子的辐射，具有足够的能量或通过核相互作用能够产生足够的能量，来产生电离作用(得到或失去电子)。一种例示的并且优选的电离辐射是x-射线。将x-射线送递到靶组织或细胞的方法是本领域公知的。给定细胞中需要的电离辐射量一般取决于那种细胞的性质。测定射线有效量的方法是本领域公知的。这里使用的术语电离辐射的″有效剂量″指当与本发明的MUC1/ECD拮抗剂联合施用，任选地进一步与化学治疗药物联合时，产生细胞损伤或死亡的电离辐射的剂量。

x-射线的剂量范围是从对于延续时段(3-4周)日剂量是50-200伦琴，至2000-6000伦琴的单一剂量。放射性同位素的剂量范围非常宽，并且取决于同位素的半衰期，发射的射线的强度和类型，以及肿瘤细胞的摄入。

除了外部手段之外，可以使用任何将射线送递给组织的合适的方法。例如，通过首先提供与肿瘤抗原免疫反应的放射性标记抗体，接着将有效量的放射性标记抗体送递给肿瘤，可以送递射线。另外，可以使用放射性同位素将电离射线送递给组织或细胞。

VI.MUC1/ECD表达的下调

本发明还涉及下调MUC1/ECD表达的化合物。一种这样的化合物是异香豆素NM-3(2-(8-羟基-6-甲氧基-1-氧代-1H-2-苯并吡喃-3-基)丙酸)。适合下调MUC1/ECD表达的NM-3和其它异香豆素公开于美国专利No.6,020,363，该专利文献在此全文引作参考。其它合适的化合物包括2-取代的雌二醇化合物，例如2-甲氧基雌二醇和2-羟基雌二醇。这些和其它合适的雌二醇衍生物公开于美国专利No.6,239,123，该专利文献在此全文引作参考。适合下调MUC1/ECD表达的其它化合物包括反义寡核苷酸，如下所述，它靶向编码MUC1的核酸分子。

VII.反义寡核苷酸

本发明还应用反义化合物，特别是反义寡核苷酸，用于调控编码MUC1和MUC1/ECD野生型配体例如神经调节蛋白2同种型5和6的核酸分子的功能。MUC1表达的抑制将减少可用于结合MUC1/ECD配体的MUC1/ECD的水平。MUC1/ECD内源配体表达的抑制作用防止或减弱对与这样的配体与MUC1/ECD的结合相关的癌细胞的增殖作用。反义方法有这样的好处，即核酸趋向于与“互补序列” 配对。所谓互补，指所述多核苷酸是能够根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对的那些多核苷酸。本发明的寡核苷酸可以完全或部分定向于信息序列，即，编码蛋白质的那些，和其它相关的核糖核苷酸，如5′-非翻译区，3′-非翻译区，5′-封端区和内含子/外显子接合处。因此，本发明提供寡核苷酸，其与编码MUC1和/或MUC1/ECD野生型配体例如神经调节蛋白2同种型5和6的核酸分子，优选mRNA特异性杂交。干扰mRNA的总效果是调控神经调节蛋白2同种型5和/或6的表达。可以用本领域常规的方法测定这样的调控作用。另外，可以评定对癌细胞增殖或肿瘤生长的作用。

人们明白寡核苷酸不一定要与要特异性杂交的靶核酸序列100％互补。当寡核苷酸与靶物的结合干扰靶分子的正常功能引起功效损失时，寡核苷酸是可特异性杂交的，并且有足够程度的互补性来避免在期望特异性结合的条件下，即在体内测试或治疗性处理情况下的生理条件下，寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合。

根据本发明的反义化合物优选包括大约4至大约50个核碱基。特别优选的是包括大约8至大约30个连接的核碱基的反义寡核苷酸。根据本发明使用的寡核苷酸可以通过固相合成公知技术方便并且常规地制备。在本发明上下文中，术语″寡核苷酸″指核糖核酸或脱氧核糖核酸的寡聚物或多聚物。该术语包括由天然存在的核碱基，糖和(主链)糖间共价键和具有功能相似的非天然存在部分的寡核苷酸组成。这样的修饰的或取代的寡核苷酸经常比天然形式优选，因为有期望的性质，例如增强的细胞摄入，增强的与靶物的结合和提高的在核酸酶存在下的稳定性。一些优选的修饰的寡核苷酸的例子包括含有硫代磷酸酯，磷酸三酯，甲基磷酸酯，短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键的那些。

本发明的寡核苷酸的另外的或其它的修饰作用包括使寡核苷酸化学连接一个或多个亲脂部分，其增强寡核苷酸的细胞摄入。这样的亲脂部分可以在寡核苷酸上几个不同的位置处与寡核苷酸连接。一些优选的位置包括3′末端核苷酸的糖的3′位置，5′末端核苷酸的糖的5′位置，和任何核苷酸的糖的2′位置。本发明的反义化合物还包括生物等价化合物，包括药学可接受盐和前体药物。

术语″可特异性杂交″和″互补″被用来指足以导致反义寡核苷酸和靶核酸序列之间稳定的特异性结合的互补度。寡核苷酸不一定要与要特异性杂交的靶核酸序列100％互补。当寡核苷酸与靶物的结合干扰靶分子的正常功能引起功效损失并且减少产物蛋白质表达时，寡核苷酸是“可特异性杂交的”，并且有足够程度的互补度来避免寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合。

神经调节蛋白2蛋白质家族包括大量可选择的剪接同种型(Ring等，1999)。神经调节蛋白2同种型5和6的编码序列都具有编码各蛋白质的前416个氨基酸的神经调节蛋白2基因的从外显子1至6的相同的核苷酸序列，但是不同之处是编码同种型5的羧基末端10个氨基酸的序列和编码同种型6的羧基末端6个氨基酸的序列。外显子1至6的编码DNA序列分别掺入到SEQ ID NO：10至SED ID.NO：15中。同种型5和6的前416个氨基酸的编码序列是SEQ ID.NO 10的核苷酸31-1012，SEQ ID.NO 11的核苷酸51-222，SEQ ID.NO 12的核苷酸230-348，SEQ ID.NO 13的核苷酸100-220，SEQ ID.NO 14的核苷酸111-187和SEQ ID.NO 15的核苷酸123-181。同种型5和6的羧基末端的编码序列分别是SEQ ID.NO 16的核苷酸132-164和SEQ ID.NO 17的核苷酸30-50。

因为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17明显不与其它神经调节蛋白基因产物共享有序列，在优选的实施方案中，反义寡核苷酸包括至少四个核苷酸的序列，其与SEQ ID.NO 16的核苷酸132-164或SEQ ID.NO 17的核苷酸30-50之间的区互补。在更优选的实施方案中，反义寡核苷酸包括至少八个核苷酸的序列，其与SEQ ID.NO 16的核苷酸132-164或SEQ ID.NO 17的核苷酸30-50之间的区互补。

在其它实施方案中，反义寡核苷酸包括至少四个核苷酸的序列，其与SEQ ID.NO 10的核苷酸313-1012之间的区，或SEQ ID.NO 11的核苷酸51-222之间的区，或SEQ ID NO：12的核苷酸230-348之间的区，或SEQ ID NO：13的核苷酸100-220之间的区，或SEQ ID NO：14的核苷酸111-187之间的区，或SEQ ID NO：15的核苷酸123-181之间的区互补。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸是至少八个核苷酸的序列，其与一个上述核苷酸序列的区互补。

在其它实施方案中，反义寡核苷酸包括至少四个核苷酸的序列，优选八个核苷酸的序列，其与SEQ ID.NO 10-17的非编码区互补。

在本发明其它实施方案中，定向于MUC1的反义寡核苷酸包括至少四个核苷酸的序列，其与SEQ ID NO：18互补。在优选的实施方案中，反义寡核苷酸包括至少八个核苷酸的序列，其与SEQ ID NO：18互补。

本发明还涉及包括直接产生上述反义寡核苷酸的转录物的表达控制系统的表达载体。另外，本发明提供杂交方法，包括提供一种上述反义寡核苷酸，并且使这样的寡核苷酸与包括靶序列的核酸在允许寡核苷酸与核酸杂交的条件下接触。还包括抑制mRNA翻译的方法，包括提供一种上述反义寡核苷酸，并且提供包括靶序列的mRNA的细胞，并且将所述寡核苷酸导入所述细胞，其中所述寡核苷酸抑制mRNA在该细胞中翻译。

本发明的另一方面提供含有本发明的反义寡核苷酸和药学可接受载体的药物组合物。

VIII.疫苗

本发明还涉及MUC1/ECD肽，例如SEQ ID NO：1或者其片段，其中所述片段包括SEQ ID NO.1的四个或多个连续的氨基酸，在疫苗中的应用，其中宿主哺乳动物产生抗这种多肽的抗体，其还起作用抗宿主自身的MUC1/ECD。根据Duffy(1980)所述，疫苗制备技术是本领域一般公知的，这里引述的所有的参考文献全部在此引入作为参考。

MUC1/ECD可以与象蛋白质或Ficoll这样的载体分子偶联。载体蛋白质优选是具有至少大约40,000道尔顿并且更优选大约60,000道尔顿分子量的载体。疫苗制剂可以含有药学可接受载体并且还可以包括佐剂体系以增强制剂的免疫原性，例如水包油体系和其它本领域公知的体系。因为所述肽或偶联物可以在胃中分解，优选肠胃外施用疫苗(例如，皮下，肌内，静脉内或真皮内注射)。剂量取决于疫苗的比活性，并且通过常规实验容易确定。制剂可以存在于例如密封的安瓿和小瓶的单位剂量或多剂量容器中，并且可以保存在冻干条件下，在使用之前只需要加入无菌液体载体。

IX.制剂

可以将本发明的组合物和方法中使用的MUC1/ECD拮抗剂，包括结合抑制剂或寡核苷酸配制成多种常规药物制剂，并且通过常规使用的任何给药途经，包括口服，静脉内，动脉内，肠胃外或腹膜内对需要治疗的癌症患者给药。

对于口服给药，可以用例如惰性稀释剂或者用可吸收的食用载体配制本发明的组合物，或者包封在硬或软外壳明胶胶囊中，或者压制成片，或者直接掺入饮食食品中。对于口服治疗给药，活性化合物可以与赋形剂相混合并且用于可吸收片剂，颊片剂，糖剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，薄片等形式。当然，这样的组合物和制剂可以不同，并且一般是大约2％至单位重量的大约60％。这样的治疗用组合物中活性化合物的量是获得合适剂量的量。

片剂，锭剂，丸剂，胶囊剂等可以含有下面的成分：可以加入粘合剂，黄芪胶，阿拉伯胶，玉米淀粉，或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖，乳糖或糖精或者矫味剂，例如薄荷油，冬绿树油，或樱桃调味料。当剂量单位是胶囊时，其除了上述类型材料之外可以含有液体载体。可以存在各种各样的其它材料作为包衣或者另外修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用虫胶，糖或者两者对片剂，丸剂或胶囊包衣。糖浆或酏剂可以含有作为甜味剂的活性化合物蔗糖，作为保鲜剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯，颜料和矫味剂，例如樱桃或橙味矫味剂。当然，在制备剂量单位形式中使用的任何材料都应该是药学纯的并且使用的量基本上没有毒性。另外，持续释放制剂和配方中可以掺入其它化学治疗化合物。

关于含有寡核苷酸的制剂，可以使用胶体分散系统作为运输赋形剂来增强寡核苷酸体内稳定性和/或使寡核苷酸定位于特定器官，组织或细胞类型。胶体分散系统包括但不限于大分子复合物，纳米胶囊，微球体，小球和以脂质为基础的系统，包括水包油乳液，胶束，混合胶束，脂质体和没有鉴定结构的脂质：寡核苷酸复合物。

适合注射使用的本发明的组合物的药物制剂包括灭菌水溶液或分散液，和用于临时制备灭菌注射溶液或分散液的灭菌粉末剂。在所有的情况下，形式上必须是灭菌的并且流体流动程度一定要达到可用针头注射。其在制备和贮存条件下一定要稳定并且一定要保持不受到微生物例如细菌和真菌作用的污染。载体可以是含有溶剂或分散介质的，例如通过使用包衣，例如卵磷脂，通过在分散情况下保持要求的颗粒大小和通过使用表面活性剂。通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，乙汞硫代水杨酸钠等能够防止微生物的作用。在很多情况下，其优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂例如一硬脂酸铝和明胶，能够实现可注射组合物的延时吸收。

通过以要求的量将本发明的组合物和上述各种其它成分掺入合适的溶剂，根据需要，接着无菌过滤，来制备无菌可注射溶液。一般情况下，通过将各种灭菌的活性成分掺入到含有基本分散介质和要求的选自上述的其它成分的无菌赋形剂中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，从预先无菌过滤的溶液得到活性成分加所有附加的期望的成分。

如这里使用的，″药学可接受载体″包括任何和所有的溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和延迟吸收剂等。对于药学活性物质所使用的这样的介质和试剂的应用是本领域公知的。除了迄今为止与该活性成分不相容的常规介质或试剂之外，包括在治疗组合物中使用的所有的常规介质或试剂。也可以在组合物中掺入补充的活性成分。

X.治疗方法

可以应用本发明的方法适当治疗的肿瘤包括但不限于，脑(恶性胶质瘤，成神经管细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，室管膜瘤)，肺，肝，脾，肾，淋巴结，小肠，胰腺，血细胞，结肠，胃，乳腺，子宫内膜，前列腺，睾丸，卵巢，皮肤，头颈，食道，骨髓，血液和其它组织的肿瘤。肿瘤可以分为转移性和非转移性。在恶性病变之前也可以适当地用本发明的方法治疗。

在放射治疗和/或化学治疗之前或之后可以用本发明的MUC1/ECD拮抗剂治疗，间隔期可以是几秒钟或者数周和/或与这样的治疗同时给药。对细胞分开施用MUC1/ECD拮抗剂和放射治疗和/或化学治疗的实施方案中，应该采取保证在各次送递药物之间没有间隔很长时间，使得两次或三次治疗的结合仍然能够对细胞发挥有利的组合效果。在这样的情况下，考虑在每次间隔0.1-25小时之内，每次间隔大约1-4小时之内，使细胞接触治疗药物或者实施给药方案，只有大约1小时至大约2小时的延迟时间是最优选的。在某些情况下，期望显著延长治疗时间，各次给药之间间隔几天(2，3，4，5，6或7)或几周(1，2，3，4，5，6，7或8)。在任何情况下，本发明考虑在电离照射和/或化学治疗物质之前，之后或者甚至同时可以给与MUC1/ECD拮抗剂。

癌细胞和化学治疗药物接触之后0.5-12小时，一些化学治疗药物瞬时诱导癌细胞上MUC1表达。因此，在一些实施方案中，施用MUC1/ECD结合抑制剂，特别是任选地与毒素或放射性核苷酸偶联的MUC/ECD序列SEQ ID NO.1的抗体，伴随有癌细胞上增强的MUC1表达，在其它实施方案中，在用MUC1结合抑制剂，特别是任选地与毒素或放射性核苷酸偶联的MUC/ECD序列SEQ ID NO.1的抗体治疗之前，化学治疗药物之外的试剂也可以被用来提高MUC1表达。

在本发明的方法中，使用的MUC1/ECD拮抗剂的实际剂量取决于很多因素，包括要治疗的癌症类型和严重程度，和选择的MUC1/ECD拮抗剂和其它治疗方案的加和或协同治疗效果。

实施例

实施例1：肽

SEQ ID NO：1提供了典型地在MUC1表达细胞中发现的MUC1/ECD多肽序列。通过标准技术合成了很多种多肽序列。这些包括肽P1(SEQID NO：4)，P2(SEQ ID NO：5)和P3(SEQ ID NO：6)，它们是MUC1/ECD的多肽片段。P1(SEQ ID NO：4)代表在羧基末端加入一个半胱氨酸的MUC1/ECD(SEQ ID NO：1)的氨基酸5-20。P2(SEQ IDNO：5)代表在羧基末端加入一个半胱氨酸的MUC1/ECD(SEQ ID NO：1)的氨基酸13-28。P3(SEQ ID NO：6)代表在羧基末端加入一个半胱氨酸的MUC1/ECD(SEQ ID NO：1)的氨基酸27-44。另外，合成的多肽序列SEQ ID NO：7掺入了在羧基末端加入一个半胱氨酸的MUC1/ECD(SEQ ID NO：1)的氨基酸6-24。合成的多肽P0(SEQ ID NO：8)插入仅在MUC1/ECD的氨基末端之前存在的MUC1蛋白质中存在的19氨基酸序列，并且代表潜在的裂解位点。在MUC1序列中存在的序列羧基末端也加入一个半胱氨酸。

实施例2：抗-MUC1-P1抗体

A.抗体的制备

多肽P1(SEQ.ID NO：4)，含有QYK基序和与细胞因子受体的配体结合结构域同源的其它序列(Zrihan-Licht，等，1994)。在兔体内产生抗与KLH偶联的多肽P1(SEQ ID NO.4)的多克隆抗体，通过标准方法制备血清。

也制备了抗多肽SEQ ID NO：7的多克隆抗体，通过使多肽SEQ IDNO：7与KLH偶联生成免疫原。从两只兔子获得抗体，记为3402-1和3402-2。通过标准方法制备血清和亲和纯化的抗体制剂。

B.抗-MUC1-P1-抗体对人癌细胞的刺激作用

在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中人ZR-75-1癌细胞生长至80％汇合，然后以每孔1×10⁴个细胞接种到6孔板上。在含有0.1％FBS的培养基中饥饿培养过夜之后，向每个孔加入抗MUC1-P1抗体，加入量如图1所示，并且温育48小时。在0.1％FBS存在下又温育3天之后定量测定细胞数目。如图1所示，抗-MUC1-P1以剂量依赖方式刺激ZR-75-1细胞的生长。

为了评定抗-MUC1-P1抗体刺激的特异性，稳定转染人MUC1-阴性SW480结肠癌细胞，表达空载体(SW480/V)或MUC1(SW480/MUC1)。利用lipofectamide(Ligtenburget等，1992)，用pCMV-IE-akl-dhfr载体或pCMV-IE-akl-dhfr-MUC1转染SW80结肠癌细胞。细胞在800g/ml G418(新霉素)的存在下生长，并且系列稀释，得到单一细胞群。筛选表达MUC1(SW480/MUC1)的单一细胞克隆。两者类型的SW480细胞在含有10％FBS的DMEM中生长至80％汇合，然后以每孔5×10⁴个细胞辅于6孔板。在含有0.1％FBS的培养基中饥饿培养过夜之后，加入指定浓度的抗MUC1-P1抗体，并且温育48小时。又温育一天之后(共计三天)定量测定细胞数。如图2所示，抗MUC1-P1刺激SW480/MUC1细胞的生长但是不刺激SW48-0/V细胞生长。这些发现证实抗-MUC1-P1抗体通过与MUC1特异性相互作用而刺激人癌细胞的生长。

实施例3：内源MUC1 ECD配体s

抗-MUC1-P1刺激人癌细胞的生长的发现提示可能存在天然MUC1ECD配体。为了研究这种可能性，筛选作为MUC1配体可能来源的ZR-75-1细胞。通过在含有0.1％FBS的RPMI 1640培养基中培养ZR-75-1细胞72小时后制备上清液来制备条件培养基。将这种条件培养基加给如前所述在含有0.1％FBS的DME中生长停滞的SW480/V和SW480/MUC1细胞。以图3指明的浓度加入条件培养基，并且在定量测定细胞数之前将细胞维持3天。如图3所示，ZR-75-1细胞表达通过与MUC1结合而刺激癌细胞生长的可溶性配体。

为了鉴定可溶性MUC1配体，制备包括MUC1/ECD(SEQ ID.No：1)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。使用如下一套引物通过PCR扩增GST：

5′-ATTAGGCTAGCCTGGTTCCGCGTGGTTCTATGTCCCCTATACTAGGTTA-3′，和5′-CAAGGGGATCCCTACGGAACCAGATCCGATTTTGG-3′，并且插入pET-11d的Nhe1和BamH1位点之间(″pET-11d-GST载体″)。使用如下一套引物通过PCR扩增MUC1/ECD：

5′-TCTGGCCATGGGAGAAGGTACCATCAAT-3′，和5′-AGCGCGCTAGCCCAGCCTGGCACCCCAGC-3′，并且插入pET11d-GST载体的Nco1和Nhe1位点之间(″pET11d-GST-MLTC1/ECD″载体)。

通过在25℃下将用pET11d-GST-MUC1/ECD或pET11d-GST转化的对数生长的大肠杆菌BL21(D3)pLysS细胞与0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷温育6小时来制备GST融合蛋白。使细胞沉淀并且重新悬浮于含有20％蔗糖，5mM MgCl₂，0.5％NP-40的PBS中，然后超声处理。4℃下以10,000xg离心30分钟去除碎屑。将上清液施加到大量谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B上并且4℃下温育4小时，然后洗涤并且装到柱子中。用含10mM谷胱甘肽的50mM Tris-HCl，pH9.5溶液洗脱融合蛋白。用PBS透析纯化的融合蛋白。

通过收集含有40mM EDTA的PBS中的ZR75-1细胞来制备培养的细胞的细胞溶解级分。用PBS洗涤之后，用冰冷却的匀化缓冲液(20mMHepes-KOH，pH7.5，10mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，1mM EGTA，1mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物(Roche))重新悬浮细胞，并且在冰上放置15分钟。用Dounce匀化器匀化悬浮液。4℃下以1,00xg将匀浆离心。收集上清液作为胞质溶胶级分并且在0℃下贮存。

GST-MUC1/ECD融合蛋白(1.8mg)固定在400微升谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上，将其装到柱子中并且用缓冲液A(30mM Tris-HCl，pH7.5，5mM MgCl₂，1mM EDTA，和1mM二硫苏糖醇)平衡。通过使其通过谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B柱首先将胞质溶胶级分预澄清，然后加载到GST-MUC1/ECD亲和柱上，然后用2×10ml缓冲液A洗涤两次。通过加入2ml缓冲液B(含有0.15M NaCl的缓冲液A)洗脱与柱子结合的蛋白质，并且收集每份0.4ml的级分。将第二和第三级分混合，并且加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上。作为对照，GST蛋白质(1.5mg)固定到400微升谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上，并且如上所述进行实验。结果证明MUC1/ECD与45kDa蛋白质结合。使用人MCF-7乳腺癌细胞的溶胞产物进行相似实验，证明MUC1/ECD与45kDa蛋白质结合。

从凝胶上切下45kDa GST-MUC1/ECD吸附物，用乙腈脱水，然后用100mM碳酸氢铵重新脱水。然后将凝胶切片悬浮于12.5ng/微升胰蛋白酶/50mM碳酸氢铵中。在37℃下进行消化10-12小时。使用VoyagerDE-PRO(Perceptive Biosystem Inc.，Framingham，MA)通过辅助基质的激光解吸/飞行质谱电离时间(MALDI-TOF-MS)分析胰蛋白酶消化肽的质量。通过质量指纹法鉴定两种相关的蛋白质，指定为ML-1和ML-2。ML-1(SEQ ID NO：3)和ML-2(SEQ ID NO：4)的序列和先前分别对于两种神经调节蛋白同种型，NRG2剪接同种型5和NRG2剪接同种型6公开的那些一样。

实施例4：作为致癌基因的MUC1

A.MUC1支持在软琼脂中生长

证明MUC1的表达就恶性表型的展现来说是功能显著的。制备稳定表达MUC1的细胞系。通过脂质转染胺试剂用pIRES-puro2载体或pIRES-puro2-MUC1转染HCT116结肠癌细胞，并且筛选嘌呤霉素抗性。使用稳定表达空载体(VCT116/V)或MUC1(HCT116/MUC1)的单一克隆人MUC1-阴性HCT116结肠癌细胞进行研究。对HCT 116/V和HCT116/MIJC1细胞测试在软琼脂中无贴壁依赖性生长。将细胞(1×10⁵/60mm培养皿)悬浮于含有补加有10％FBS的DMEM培养基的0.33％琼脂糖中，并且辅于琼脂糖栓上(加有10％FBS的DMEM中的0.5％琼脂糖)。将细胞温育4星期，期间每周向平板加入新鲜培养基。4星期之后计数直径大于70微米的集落。与用HCT/116/V细胞获得的相比，野生型MUC1的表达与集落大小和数目显著增加有关。使用SW480/V和SW480/MUC1细胞进行的相似研究证实了这些发现，其中MUC1表达再次证明支持SW480细胞无贴壁依赖性生长。

B.MUC1支持裸鼠中人肿瘤形成

为了评价MUC1对人体内肿瘤生长的作用，对5-6周龄无胸腺Balbc/nu/nu小鼠(Taconic，Germantown，NY)右胁腹皮下注射1×10⁶HCT116/V或HCT 116/MUC1细胞。一星期对肿瘤测量两次(4只小鼠/组)。通过下面的式子计算肿瘤体积：1/2(长×宽²)。当肿瘤体积超过2cm³时终止实验。随时间对肿瘤体积的测量证明很少的HCT116/V细胞生长。通过比较，HCT116/MUC1肿瘤生长显著加大。

实施例5：氧化和基因毒性应激诱导MUC1表达

为了确定MUC1是否反应氧化应激被诱导，用过氧化氢处理MCF-7细胞。使用抗-DF3/MUC1抗体通过免疫印迹分析细胞溶胞产物。通过将MCF-7细胞悬浮于冰上的溶胞缓冲液(50mM Tris，pH7.6，150mMNaCl，1mM PMSF，3mM NaF，1mM钒酸钠，1mM DTT加蛋白酶抑制剂和1％NP-40或1％Brij-96)中30分钟来制备溶胞产物。通过离心澄清溶胞产物，并且通过SDS-PAGE分析等量的蛋白质。然后将蛋白质转移到硝基纤维素滤纸上，通过在含有0.05％Tween-20的5％脱脂奶粉PBS溶液中温育而封闭，并且用抗-MUC1抗体(Pandey等，1995)探测。使用抗肌动蛋白作为对照。结果证明反应于氧化应激，MUC1快速而瞬时被诱导，而同时过氧化氢对肌动蛋白表达水平没有影响。

使用基因毒性剂进行相似研究。结果证明用柔红霉素处理MCF-7细胞与MUC1快速而瞬时诱导有关，但是与肌动蛋白，表达无关。有效证据证实不同的细胞毒性剂包括紫杉醇，顺铂和电离辐射诱导MUC1。

实施例6：MUC1抑制对氧化和基因毒性应激的细胞调亡反应

为了确定MUC1是否抑制对氧化应激的细胞调亡反应，用1mM过氧化氢处理稳定表达空载体或MUC1的HeLa细胞1小时。通过用碘化丙锭对乙醇固定的细胞染色并且通过FACScan(Beckton Dickerson)监测来评定DNA含量。用MODFIT LT程序(VeritySoftware House，Topsham，ME)(Yuan等，1997)确定细胞数和sub-G1 DNA含量。通过流式细胞仪对细胞分析sub-G1 DNA的诱导作为细胞调亡的标记。如图4所示，结果证明MUC1抑制对氧化应激的细胞调亡反应。

通过测定表达空载体或MUC1的HeLa细胞的sub-G1 DNA含量评定用0.01mM紫杉醇处理20小时的细胞中细胞调亡的诱导。如图4所示，具有氧化应激时，MUC1表达抑制紫杉醇诱导的细胞调亡。

实施例7：NM-3对MUC1表达的影响

用100-400微克/毫升的NM-3(2-(8-羟基-6-甲氧基-1-氧代-1H-2-苯并吡喃-3-基)丙酸)将MCF-7细胞处理48小时。使用DF3MAb(Kufe，美国专利5,506,343，这里引作参考)通过免疫印迹分析显现DF3抗原水平。

观察到相对于没有处理的细胞来说，NM-3处理过的细胞的DF3抗原的胞内水平降低。对于ZR-75-1和BT-20细胞系发现相似结果。证明NM-3介导的胞内DF3抗原减少既是剂量依赖性的又是时间依赖性的。为了确定NM-3是否破坏MUC1 DF3抗原的胞外定位，研究了细胞培养基上清液中抗原水平和NM-3处理之后的MCF-7细胞上的抗原水平。两个位置DF3抗原水平都减少。这些发现提示NM-3抑制MUC1蛋白质表达。

进行杂交研究来确定NM-3对MUC1-表达的影响在转录水平上是否是可测的。在NM-3处理MCF-7细胞48小时之后，³²P-标记的DF3 DNA探针与总细胞RNA中4.5和7.0kb两个转录物杂交。与不存在NM-3下温育的MCF-7细胞对照物相比，mRNA水平都降低。使用ZR-75-1和BT-20细胞系观察到相同的结果。这些发现提示对那些细胞系进行NM-3处理之后，DF3表达在转录水平上被调节。

为了确定NM-3是否也抑制细胞表面蛋白质的表达，对MCF-7，ZR-75-1和BT-20细胞系试验NM-3处理之后表皮生长因子(EGF-R)表达的水平。与不存在NM-3下温育的细胞对照物相比，NM-3处理之后EGF-R表达没有可检测的变化。这些结果表明NM-3对MUC1表达的选择性作用，它不抑制表面分子表达。

说明书和实施例证实了本发明。实施例只是为了举例说明而不是限制本发明的范围。本领域技术人员能想象出在要求的发明的范围和精神之内的后面的权利要求书中描述的本发明方法的等价物。

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下面的参考文献，其程度相当于它们提供的例示方法或者对提出的那些的补充的其它详细描述，具体在这里引作参考。

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序列表

序列表<110>唐纳德W.库弗.

大野<120>MUC1胞外域和癌症治疗组合物及方法<130>ILEX：061JP<150>60/231,841<151>2000-09-11<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>45<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr1 5 10 15Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser

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50 55 60Pro Arg Pro Gln Gln Gln Pro Gln Pro Arg Ser Pro Ala Ala Arg Arg65 70 75 80Ala Ala Ala Arg Ser Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Met Arg Arg Asp

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210 215 220Val Gly Lys Ile Leu Cys Thr Asp Cys Ala Thr Arg Pro Lys Leu Lys225 230 235 240Lys Met Lys Ser Gln Thr Gly Gln Val Gly Glu Lys Gln Ser Leu Lys

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Claims

1.MUC1胞外域拮抗剂用于制备抑制MUC1-表达癌细胞增殖的药物的用途。

2.权利要求1的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域拮抗剂下调MUC1胞外域的表达。

3.权利要求1的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域拮抗剂是MUC1胞外域结合抑制剂。

4.权利要求3的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是SEQ ID NO：1的多肽，或者包括SEQ ID NO：1的至少四个连续氨基酸的片段，或者其保守变体。

5.权利要求3的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的多肽，或者其保守变体。

6.权利要求3的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是与选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽的序列中的表位结合的抗体或者其片段。

7.权利要求3的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是与SEQ ID NO：1的序列中的表位结合的抗体或者其片段。

8.权利要求6的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。

9.权利要求8的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述单克隆抗体是人源化的。

10.权利要求8的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述单克隆抗体是人抗体。

11.权利要求6的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体是双特异性抗体。

12.权利要求6的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述片段包括抗原结合区。

13.权利要求6的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体或其片段与化学治疗药物，放射性同位素，毒素，或者诱导细胞溶解或细胞毒性免疫应答的效应物偶联。

14.权利要求13的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体或其片段与细胞因子，抗代谢物，anthracycline，长春花生物碱，抗生素，烷化剂，天然来源的毒素，或者IgG1免疫球蛋白的Fc区偶联。

15.权利要求1的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中以含有所述MUC1胞外域拮抗剂和药学可接受载体的组合物形式施用所述有效量的MUC1胞外域拮抗剂。

16.权利要求1的MUC1胞外域拮抗剂的用途，进一步包括施用化学治疗药物或放射疗法。

17.MUC1胞外域拮抗剂用于制备与化学治疗药物或放射疗法联合治疗癌症的药物的用途。

18.权利要求17的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域拮抗剂下调MUC1胞外域的表达。

19.权利要求17的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域拮抗剂是MUC1胞外域结合抑制剂。

20.权利要求19的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是SEQ ID NO：1的多肽，或者包括SEQ ID NO：1的至少四个连续氨基酸的片段，或者其保守变体。

21.权利要求19的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合拮抗剂是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的多肽，或者其保守变体。

22.权利要求19的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是与选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽的序列中的表位结合的抗体或者其片段。

23.权利要求19的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述MUC1胞外域结合抑制剂是与SEQ ID NO：1的序列中的表位结合的抗体或者其片段。

24.权利要求22的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。

25.权利要求24的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述单克隆抗体是人源化的。

26.权利要求24的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述单克隆抗体是人抗体。

27.权利要求22的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体是双特异性抗体。

28.权利要求22的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述片段包括抗原结合区。

29.权利要求22的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体或其片段与化学治疗药物，放射性同位素，毒素，或者诱导细胞溶解或细胞毒性免疫应答的效应物偶联。

30.权利要求29的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述抗体或其片段与细胞因子，抗代谢物，anthracycline，长春花生物碱，抗生素，烷化剂，天然来源的毒素，或者IgG1免疫球蛋白的Fc区偶联。

31.权利要求17的MUC1胞外域拮抗剂的用途，其中所述化学治疗药物选自烷化剂，拓扑异构酶抑制剂，抗代谢物，微管蛋白相互作用试剂，抗激素试剂，鸟氨酸脱羧酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。

32.一种含有SEQ ID NO：1的多肽，或者包括SEQ ID NO：1的至少四个连续氨基酸的片段，或者其保守变体，和药学可接受载体的药物组合物。

33.权利要求32的组合物，其中所述多肽是SEQ ID NO：5的多肽，或者其保守变体。

34.一种含有SEQ ID NO：4的多肽，或者其保守变体，和药学可接受载体的药物组合物。

35.一种含有与选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽的序列中的表位结合的抗体或者其片段和药学可接受载体的药物组合物。

36.权利要求35的组合物，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO：1的序列中的表位结合。

37.权利要求36的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。

38.权利要求37的组合物，其中所述单克隆抗体是人源化的

39.权利要求37的组合物，其中所述单克隆抗体是人抗体。

40.权利要求35的组合物，其中所述抗体是双特异性抗体。

41.权利要求35的组合物，其中所述片段包括抗原结合区。

42.权利要求35的组合物，其中所述抗体或其片段与化学治疗药物，放射性同位素，毒素，或者诱导细胞溶解或细胞毒性免疫应答的效应物偶联。

43.权利要求42的组合物，其中所述抗体或其片段与细胞因子，抗代谢物，anthracycline，长春花生物碱，抗生素，烷化剂，天然来源的毒素，或者IgG1免疫球蛋白的Fc区偶联。

44.一种抑制配体与MUC1的胞外域结合的化合物的鉴定方法，该方法包括：

(a)提供一种多肽，包括SEQ ID.NO：1的多肽或SEQ ID NO：5的多肽；

(b)使所述多肽接触试验化合物和与SEQ ID NO：4中的表位结合的抗体；

(c)测定与SEQ ID NO：4中的表位的抗体结合的所述抗体与SEQID.NO：1的多肽或SEQ ID NO：5的多肽的结合相对于合适的对照是否有所降低。

45.一种含有通过权利要求44的方法鉴定的化合物和药学可接受载体的药物组合物。

46.一种抑制MUC1表达癌细胞的增殖的化合物的鉴定方法，该方法包括：

(a)提供一种MUC1表达癌细胞群；

(b)使所述MUC1阳性癌细胞群接触一种试验化合物和与SEQ IDNO：5中的表位结合的抗体；

(c)测定所述MUC1表达癌细胞群的增殖与合适的对照相比较是否有所降低。

47.一种含有通过权利要求46的方法鉴定的化合物和药学可接受载体的药物组合物。

48.一种下调MUC1的胞外域表达的化合物的鉴定方法，该方法包括：

(a)提供一种MUC1表达癌细胞群；

(b)使所述MUC1表达癌细胞群接触一种试验化合物；

(c)使用抗-MUC1/ECD抗体来鉴定MUC1/ECD表达癌细胞中包含MUC1/ECD的多肽；和

(d)测定包括MUC1/ECD的多肽的表达与排除该试验化合物的对照相比较是否有所降低。

49.NM-3用于制备下调MUC1/ECD的胞外域在癌中的表达的药物的用途。