CN105392797A - 二肽基肽酶-iv(dppiv)抑制性肽化合物，包含所述肽化合物的组合物，及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

通过使用已经被食用很久并且具有高安全性的水产品的鱼白作为原材料的简单的方法，本发明能够提供具有二肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制活性的肽化合物或包含能够促进糖尿病患者或具有糖尿病风险的患者中病理的发生或进展的预防的肽化合物的组合物。在本发明中，在获自水产品的鱼白蛋白源的水解产物中获得的具有肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制活性的肽化合物用作用于抑制DPPIV的组合物的活性成分。

Description

二肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制性肽化合物，包含所述肽化合物的组合物，及其制备方法
技术领域
本发明涉及具有二肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制活性的肽及其盐(作为肽化合物)，和包含其的组合物。所述组合物包含一种或多种在源自水产品如鱼和贝类的鱼白的蛋白源的水解产物中发现的具有DPPIV抑制活性的肽化合物作为活性成分。
背景技术
糖尿病包括一组具有基于不足的胰岛素作用的慢性高血糖的基本症状的代谢疾病。为了治疗进行的血糖控制，作为用于不仅抑制糖尿病的发病，而其抑制并发症如视网膜病，肾病，神经病，心肌梗死和脑梗死的发病和进展；和用于改善患者的生命质量(QOL)和预期寿命的方法，是非常有意义的。在日本，95％以上的糖尿病患者被认为是2型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)患者。近年来，二肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制剂已经被批准作为2型糖尿病的新型治疗剂，并且引起注意，因为其引起小的有害反应如低血糖并且可以以优异的机制进行血糖控制。DPPIV将肠促胰岛素(incretin)(胃抑制性多肽：GIP，胰高血糖素样肽-1：GLP-1)(其是通过作用在胰腺β细胞上刺激胰岛素分泌的胃肠激素)转变为其失活形式。因此，当DPPIV被抑制时，肠促胰岛素的作用可以被保留以促进胰岛素分泌。DPPIV是丝氨酸蛋白酶中的一种，并且是识别和切割距肽的N末端的第二位点处的脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的酶。已经报道，DPPIV强烈作用在具有距N末端第二个残基处的脯氨酸和丙氨酸，并且进一步具有赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)作为N末端残基的肽上(非专利文献1)。
已经报道了由蛋白水解产物导致的对血液葡萄糖水平的增加的抑制性作用。作为该作用的机制，已经报道了促进胰岛素分泌的作用(专利文献1)，葡萄糖吸收抑制活性(专利文献2)，和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌的促进(专利文献3)。在一些报道中，确认由紫菜的酶分解的产物(专利文献4)和通过分解蜂王浆获得的肽(专利文献5)导致对血液葡萄糖水平增加的抑制作用。还有一些报道，其中未标明机制。从作为起始材料的水产品的鱼白获得的产物，已知从鱼白提取的鱼精蛋白具有淀粉酶抑制活性(非专利文献2)和促进GLP-1分泌的作用(非专利文献3)。
已经报道很多通过化学合成获得的化合物具有DPPIV抑制活性(专利文献6)，但考虑到安全性问题和有害反应，应该小心使用这样的化学合成的产品。作为源自天然产物的DPPIV抑制剂，已经知道那些，如源自奶酪的水溶性级分的肽(专利文献7)，源自牛乳蛋白的肽(专利文献8)，小豆(azukibean)或菜豆(kidneybean)的酶分解产物(专利文献9)，源自明胶的肽(专利文献10)，和源自从鲑鱼皮提取的明胶的酶分解产物的肽(非专利文献4)，等。
与其卵相比，水产品的鱼白具有更低的使用价值，并且尚未有效使用。其使用限于肥料或饲料。甚至源自鲑鱼的鱼白(其相对良好地被使用)，用作鱼精蛋白或核酸的起始材料，每年鱼白以10,000吨或更多的量被作为工业废料处理。
参考文献列表
专利文献
专利文献1：JP4864064B
专利文献2：JP2009-235064A
专利文献3：JP4180645B
专利文献4：JP3585778B
专利文献5：JP3691685B
专利文献6：JP4357293B
专利文献7：JP4915833B
专利文献8：JP5068174B
专利文献9：WO2011/016220
专利文献10：JP5176964B
专利文献11：US2005/0053606A
非专利文献
非专利文献1：PlantPhysiol.，第122卷，425-432
非专利文献2：Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，第109卷，556-558
非专利文献3：Proceedingsofthe64thAnnualMeetingoftheJapanSocietyofNutritionandFoodScience，第188页
非专利文献4：J.Agric.FoodChem.，第60卷，973-978
非专利文献5：ProteinExpressionandPurification，第1卷，127-133
发明概述
本发明要解决的技术问题
本发明的目标是使用有长时间食用经验并且具有高安全性的水产品的鱼白作为原材料，通过简单方法，提供能够促进糖尿病患者或具有糖尿病风险的患者中病理的发病或进展的预防的具有DPPIV抑制活性的肽化合物或包含所述肽化合物的组合物。本发明的另一目标是使用有长时间食用经验并且具有高安全性的水产品的鱼白作为原材料，通过简单方法，提供具有对血液葡萄糖水平的增加的抑制作用的用于食品和饮料的DPPIV抑制性活性成分，所述食品和饮料如功能性食品，保健功能食品，用于特定膳食用途的食品，营养补品，健康辅助食品和补品。
解决所述问题的方式
本发明人已经对具有DPPIV抑制活性的源自天然的材料进行了认真研究，并且因此，本发明人已经发现，来自鱼白或水产品的鱼白或加工的鱼白的蛋白源的水解产物具有DPPIV抑制活性。随后，本发明人已经确定了包含在所述水解产物中的结构和/或具有DPPIV抑制活性的新型肽，并随后完成了本发明。
根据本发明的用于抑制DPPIV的组合物的第一实施方案，特征在于包含通过水解源自水产品的鱼白的蛋白源获得的具有DPPIV抑制活性的肽化合物。
根据本发明的用于抑制DPPIV的组合物的第二实施方案，特征在于包含选自Phe-Pro-Val-Gly或其盐，Ile-Pro-Leu或其盐，Leu-Pro-Val-Leu或其盐，和Val-Pro-Phe-Pro或其盐的至少一种作为DPPIV抑制成分。
这种用于抑制DPPIV的组合物或肽化合物可以用于制备用于抑制DPPIV的药物，食品和饮料，如功能性食品，保健功能食品，用于特定膳食用途的食品，营养补品，健康辅助食品和补品等，宠物食品等。
根据本发明的肽化合物是选自Phe-Pro-Val-Gly及其盐；Ile-Pro-Leu及其盐；Leu-Pro-Val-Leu及其盐的至少一种。这些肽化合物中的一种可以单独使用或以这些中的两种以上的混合物的形式使用，用于所需用途。
一种制备根据本发明的具有DPPIV抑制活性的水解产物的方法，所述方法包括水解源自水产品的鱼白的蛋白源以获得具有DPPIV抑制活性的水解产物的步骤。
一种制备根据本发明的具有DPPIV抑制活性的肽化合物的方法，所述方法包括水解源自水产品的鱼白的蛋白源以获得包含具有DPPIV抑制活性的肽化合物的水解产物的步骤；和从水解产物分离具有DPPIV抑制活性的肽化合物的步骤。
尚未公开在来自作为原材料的鱼白的加工的产物中确认DPPIV抑制的报道。在根据本发明确定的肽中，Phe-Pro-Val-Gly，Ile-Pro-Leu和Leu-Pro-Val-Leu的结构和活性尚未被报道。尽管已知Val-Pro-Phe-Pro抑制涉及癌细胞生长的泛上皮膜粘蛋白(MUC1)的作用(专利文献11)，其DPPIV抑制活性未知。
作为由源自鱼白的材料提供的对血液葡萄糖水平增加的抑制作用，从鱼白提取的鱼精蛋白的淀粉酶抑制活性是已知的(非专利文献2)。然而，当将具有Phe-Pro-Val-Gly，Ile-Pro-Leu，Leu-Pro-Val-Leu或Val-Pro-Phe-Pro的氨基酸序列的本发明的DPPIV抑制性肽与鱼精蛋白的氨基酸序列相比较时，显然，本发明的DPPIV抑制性肽不源自鱼精蛋白(非专利文献5)。
此外，报道了，当源自水产品的蛋白水解产物用作原材料时，源自从鲑鱼皮提取的明胶的酶分解产物的肽具有DPPIV抑制活性(非专利文献4)。然而，鱼白和皮胶原蛋白在氨基酸组成上大不相同。因此，显然，对于从它们水解获得的组合物的DPPIV抑制活性，各不相同的肽组是其活性中心。
从皮提取胶原蛋白的过程和将皮中包含的混有脂或来自其他组织的杂质去除的复杂过程是获得皮胶原蛋白的水解产物所必需的。因为皮和鱼白明显是不同的部分，在鱼白中不含有皮胶原蛋白。因为鱼白具有与其他部分明显不同的形状，认为分选各个鱼白作为原材料可以容易进行。因为鱼白具有小的脂含量，认为鱼白适于作为原材料。核酸通过水解鱼白等被释放并且其极好的味道变得明显。因此，认为鱼白可广泛应用于食品领域。
发明效果
具有DPPIV抑制活性的肽化合物和包含根据本发明的肽化合物的组合物具有高安全性，因为其原材料是水产品的鱼白，其已经被食用了很久。因此，它们可以被广泛用于药物，食品和饮料，(如功能性食品，保健功能食品，用于特定膳食用途的食品，营养补品，健康辅助食品和补品)，宠物食品，等。
此外，水产品的鱼白可以用作原材料以获得具有DPPIV抑制活性的肽化合物和包含根据本发明的肽化合物的组合物。
尤其是，优选使用鲑鱼鱼白，因为
-小量的鲑鱼鱼白用于食品；
-除了用于功能性食品的原材料如鱼精蛋白和/或DNA相比，鲑鱼鱼白具有很少的主要应用；并且
-每年鲑鱼鱼白以10,000吨以上的量作为工业废料被处理。
此外，具有低成熟度的鲑鱼鱼白(其甚至不用于生产鱼精蛋白和DNA)可以在本发明中用作原材料。作为其他原材料，可以使用提取鱼精蛋白和/或DNA后获得的副产物作为来自鲑鱼鱼白的功能性材料。以这样的方式，用于本发明的原材料可便宜和稳定地获得，并且因此，本发明可以促进有效利用未使用的资源并且减少工业废料。
附图简述
[图1]图1说明实施例1中获得的水解产物的DPPIV抑制活性的测量结果。
[图2]图2说明实施例1中获得的水解产物在SD大鼠上进行的淀粉耐受测试中的测量结果。
[图3]图3说明从鱼白的水解产物纯化肽的方法。
[图4]图4说明实施例9中获得的水解产物的DPPIV抑制活性的测量结果。
实施方案描述
本发明的具有DPPIV抑制活性的组合物包含获自水产品的鱼白(即，水产品精巢)中含有的蛋白源的水解产物的肽化合物作为具有DPPIV抑制活性的成分。水解产物可以在产生具有DPPIV抑制活性的肽化合物的条件下，通过水解源自水产品的鱼白的蛋白源来获得。
含有具有DPPIV抑制活性的肽化合物的组合物可以是以下任何形式：
(1)包含通过水解源自水产品如鱼和贝类的鱼白的蛋白源获得的具有DPPIV抑制活性的肽化合物的水解产物。
(2)具有DPPIV抑制活性的级分，粗制的产物或纯化的产物，并且包含从源自水产品如鱼和贝类的鱼白的蛋白源的水解产物获得的具有DPPIV抑制活性的肽化合物中的一种，或两种以上。
(3)通过将选自载体，赋形剂，稀释剂和各种添加剂中的至少一种加入如上文所述的水解产物，具有DPPIV抑制活性的级分，粗制的产物或纯化的产物中获得的组合物。
(4)包含从源自水产品如鱼和贝类的鱼白的蛋白源的水解产物分离的一种以上肽化合物的组合物。
(5)包含一种以上通过使用任意上述分离的肽化合物的氨基酸序列合成获得的具有DPPIV抑制活性的肽化合物的组合物
(6)作为两种以上DPPIV抑制活性的肽化合物的混合物获得的组合物。
(7)将选自载体，赋形剂，稀释剂和各种添加剂中的至少一种加入上述(4)至(6)的组合物中的任一种中获得的组合物。
以上(2)中所述的具有DPPIV抑制活性的级分，粗制的产物或纯化的产物可以通过以下各项获得：
-通过在水解处理源自水产品如鱼和贝类的鱼白的蛋白源后进行分级等(通过超滤，膜处理，液相分离，用树脂分离)获得包括具有DPPIV抑制活性的肽化合物的级分的方法；或
-通过各种分离和/或纯化方法纯化上文所述级分的方法。
例如，将通过从源自鱼白的蛋白源的水解移除高分子化合物获得的含有具有DPPIV抑制活性的肽化合物的级分进行纯化处理(如果需要)，并且，然后通过冻干等进行干燥处理。这样，可以获得粉末形式的含有具有DPPIV抑制活性的肽化合物的组合物。可以进行高分子化合物的去除，致使具有至少5000或更高的分子量的高分子化合物被去除。
具有DPPIV抑制活性的肽化合物的实例包括各个肽及其盐，它们的DPPIV抑制活性在以下描述的实施例7和实施例9中确认，并且这些中的至少一种可以用作活性成分，用于提供本发明的抑制DPPIV的组合物。包含在本发明的组合物中的肽化合物的优选实例包括以下四种肽及其盐：
(A)具有FPVG(Phe-Pro-Val-Gly)的氨基酸序列的肽或其盐。
(B)具有IPL(Ile-Pro-Leu)的氨基酸序列的肽或其盐。
(C)具有LPVL(Leu-Pro-Val-Leu)的氨基酸序列的肽或其盐。
(D)具有VPFP(Val-Pro-Phe-Pro)的氨基酸序列的肽或其盐。
作为用作用于水解的原材料的源自水产品的鱼白的蛋白源，可以使用水产品的鱼白本身，从水产品的鱼白提取的蛋白源等。作为从水产品的鱼白提取的蛋白源，可以使用从水产品的鱼白生产鱼精蛋白和/或DNA期间获得的副产物。生产鱼精蛋白和/或DNA的方法不特别限制。关于鱼精蛋白生产，例如，将水产品的鱼白碾碎，并且可以将这样的成分从其中提取入无机酸水溶液中。关于DNA生产，将水产品的鱼白碾碎(如果需要)，并且可以通过用蛋白酶或核酸酶水解处理，或通过用盐水溶液，碱性水溶液，有机溶剂，表面活性剂等提取处理获得DNA。副产物是残留物(或残渣)，从水产品的鱼白提取或分离鱼精蛋白和/或DNA后获得，并且，作为水解的原材料，残留物本身，从残留物提取或浓缩的含有活性成分的提取物或浓缩物，或进一步从其中分离的蛋白源可以用作用于水解的原材料。
水产品是分类为脊索动物，软体动物，棘皮动物，节肢动物或刺胞动物的水生动物的通用名称。供给鱼白的水产品的实例包括鱼如属于鲑形目(Salmoniformes)鲑科(Salmonidae)的鲑鱼(salmon)，鳟鱼(trout)，等，属于鲈形目(Perciformes)鲭科(Scombridae)的金枪鱼(tuna)，鲣鱼(skipjack)等，属于鲈形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)的鱼(yellowtail)(幼鱼)，大琥珀鱼(greateramberjack)等，属于鲱形目(Clupeiformes)鲱科(Clupeidae)的鲱鱼(herring)等，和属于鳕形目(Gadiformes)鳕科(Gadidae)的鳕鱼(pacificcod)等，和头足纲(Cephalopoda)如鱿鱼(cuttlefish)和章鱼(octopus)。尤其是，“鲑鱼”的实例包括秋鲑(Oncorhynchusketa)，银鲑(Oncorhynchuskisutch)，红鲑(Oncorhynchusnerka)，大西洋鲑(Salmosalar)，帝王鲑(Oncorhynchustshawytscha)，粉鲑(Oncorhynchusgorbuscha)和虹鳟(rainbowtrout(Oncorhynchusmykiss))。
作为鱼白，从水产品中取出并且洗涤(如果需要)的鱼白，或洗涤(如果需要)或碾碎的鱼白可以用于水解。备选地，可以通过任意各种提取方法从鱼白提取蛋白源，以用于水解。例如，作为从鱼白提取鱼精蛋白和/或DNA后剩余的残留物产生的副产物中含有的蛋白源可以用于水解。
含有大量鱼精蛋白和DNA，但含有小量水的高度性成熟的鱼白，以及因为小的鱼精蛋白和DNA含量和大的水含量而不适于产生鱼精蛋白和DNA的低性成熟的鱼白可以用作用于水解的原材料。一般鲑鱼的鱼白的水含量为大约70至85％，并且根据目的，鱼白的性成熟程度可以就其中的水含量而定义。根据本发明，宽范围的鱼白(包括例如，具有小于75％的水含量的高度性成熟的鱼白和具有75％以上的水含量的低性成熟的鱼白)可以用作原材料。
来自不同水产品的一种以上鱼白可以混合使用。除鱼白之外的蛋白源可以与要用作用于水解的原材料的鱼白的蛋白源混合。作为鱼白之外的蛋白源，可以根据本发明的目的使用微生物、植物、动物、这些的发酵产物，和从其中提取的蛋白源等中的至少一种。
源自水产品的鱼白的蛋白源的水解可以通过相关领域中已知的方式进行。例如，可以使用酸、酶等，但方法不限。水解蛋白源的酶的实例包括肽链内切酶和肽链外切酶，并且其中之一可以单独使用或这些可以联合使用。优选地，使用主要含有肽链内切酶的酶。肽链内切酶的实例包括丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶，并且优选使用主要含有丝氨酸蛋白酶的酶。两种以上这样的水解蛋白源的酶可以联合使用。优选地，将水解蛋白源的酶以0.001至5％(w/w)的浓度加至鱼精蛋白源的原材料中并在适于其水解活性的温度和pH反应1至48小室。备选地，可以使用纯化的酶制剂和粗制酶制剂，以及可以利用源自作为原材料的鱼白的酶活性。
水解反应在可以在得到的水解产物中获得具有DPPIV抑制活性的水溶性肽化合物的反应条件下进行。反应条件可以例如通过以下方法获得：
第一，进行原材料的蛋白源的分解反应，并且根据反应过程以指定的时间间隔对反应产物进行取样。测量因此获得的各个反应产物的DPPIV抑制活性，并且指定具有所需DPPIV抑制活性的反应产物的反应条件。将这样指定的反应条用作用于产生水解产物的反应条件。作为反应条件，优选选择IP(Ile-Pro)和VPL(Val-Pro-Leu)二者都包含在水解产物中的反应条件。此外，更优选在水解产物中获得也可以除了以上两种肽之外的上述肽化合物(A)至(D)中的至少一种的反应条件。
本文使用的术语″肽″是指具有肽键，并且肽中含有的氨基酸残基数不限(只要其是2或更多)的氨基酸聚合物，并且甚至蛋白也包括在该术语中。在下文描述的实施例等中，含有两种以上肽的组合物定名为″肽组合物″。此外，″蛋白源″包括蛋白本身和由蛋白和脂和/或糖等形成的蛋白复合体。
在源自水产品的鱼白的蛋白源的水解产物中，可以获得混合状态的具有不同长度(分子量)和氨基酸序列的肽化合物，这取决于蛋白源的类型和水解反应的条件。另一方面，通过水解水产品的鱼白，将核酸等释放到水解产物中，并且因此，水解产物呈现极好的味道。因此，水解产物可以广泛用于食品领域。
具有DPPIV抑制活性的肽化合物自水解产物的分离可以通过已知分离方法进行，并且，例如，可以适当地使用以下实施例5中描述的分离柱的方法。
DPPIV抑制剂可以使用选自以下各项中的一种或多种作为活性成分来制备：含有未改变形式的本发明的具有DPPIV抑制活性的水解产物的组合物和从水解产物提取的肽化合物，或如果需要，连同载体，赋形剂，稀释剂等。备选地，选自本发明的含有具有DPPIV抑制活性的水解产物的组合物和从水解产物提取的肽化合物中的一种或多种可以包含在药物，食品和饮料(如如功能性食品，保健功能食品，用于特定膳食用途的食品，营养补品，健康辅助食品和补品)，宠物食品等中，从而向其中提供DPPIV抑制活性。
源自水产品的鱼白的蛋白源的水解产物的实例包括含有至少IP(Ile-Pro)和VPL(Val-Pro-Leu)的水解产物，并且除了这两种肽之外，水解产物优选含有选自FPVG(Phe-Pro-Val-Gly)，IPL(Ile-Pro-Leu)，LPVL(Leu-Pro-Val-Leu)和VPFP(Val-Pro-Phe-Pro)的至少一种。这些肽各自可以是盐的形式。
形成盐的酸不特别限制，并且就用于药物、食品和饮料、宠物食品等的用途而言，优选以下药用盐：
酸加成盐的实例包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、磷酸盐、三羧酸如柠檬酸的盐、二羧酸如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸或富马酸的盐，和一羧酸如乙酸、丙酸、丁酸或乳酸的盐。接着，形成碱的盐不特别限制，并且就用于药物、食品和饮料、宠物食品等的用途而言，优选形成以下药用盐的碱：
实例包括无机盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、锂盐、铝盐和锶盐，和有机盐如一-、二-、和三-烷基胺盐如甲胺盐，二甲胺盐和三甲胺盐，一-、二-、和三-羟基烷基胺盐，胍盐和N-甲基葡糖胺盐。
水解产物中(固体内容物中)含有的IP，VPL，IPL，和LPVL的比例优选在以下范围内：
Ile-Pro(IP)：0.001至10重量％
Val-Pro-Leu(VPL)：0.001至5重量％
Ile-Pro-Leu(IPL)：0.001至1重量％
Leu-Pro-Val-Leu(LPVL)：0.001至1重量％
含有上文描述的两种以上肽的水解产物可以通过设置用于水解源自水产品的鱼白的蛋白源的条件，致使这些肽或其盐可以以上述范围包含在水解产物中来获得。当使用鱿鱼鱼白时，IP的含量优选为0.005至5重量％。
优选的水解产物的实例包括通过与实施例1中使用鲑鱼鱼白作为肽组合物的水解产物的处理相同的处理获得的具有如下表1中显示的组合物的那些：
[表1]
表1
可以将肽组合物以其原样加入药物、食品和饮料(如功能性食品，保健功能食品，用于特定膳食用途的食品，营养补品，健康辅助食品和补品等)，宠物食品等，从而获得本发明所希望的DPPIV抑制作用。肽组合物的纯度可以通过超滤，膜处理，液相分离操作或利用树脂分级处理等通过分级处理来增加。还可以使用合成的肽化合物。肽化合物可以在增加活性肽的纯度之后通过冻干或喷雾干燥等以粉末形式形成。本发明的具有DPPIV抑制活性的肽化合物或组合物可以口服施用以在活体内抑制DPPIV，从而降低血液葡萄糖水平。
关于根据本发明的用于DPPIV抑制的组合物的制剂，当可以直接配制肽或其盐时，具有DPPIV抑制活性的肽及其盐中的至少一种可以以原样用于制剂。另一方面，当通过使用载体，赋形剂和稀释剂中的至少一种进行配制时，可以通过使用药用或作为食品添加剂的载体，赋形剂和稀释剂中的至少一种；和具有DPPIV抑制活性的肽及其盐中的至少一种，或包含具有DPPIV抑制活性的肽及其盐的至少一种的组合物；以及，如果需要，添加的各种添加剂如维生素，着色剂，调味剂，甜味剂和抗氧化剂进行配制。包含在所述制剂中的具有DPPIV抑制活性的肽及其盐中的至少一种的组合比例可以选自0.0001至100重量％的范围。
为了测量DPPIV抑制活性，可以使用可市购的试剂盒或其它方法。例如，可以使用DPPIVDrugDiscovery测定试剂盒(由EnzoLifeSciences，Inc.制造)。
现在，将通过在下文显示实施例来更详细解释本发明，但注意，实施例仅仅是实施方案并且不限制本发明。
实施例
(实施例1)
(从鲑鱼鱼白生产DPPIV抑制性肽组合物)
将秋鲑(Oncorhynchusketa)的鱼白碾碎，将水加至8g的碾碎产物(77.0％的水含量)，并且将得到的混合物调节至各个酶的最佳pH。作为水解蛋白源的酶，分别使用蛋白酶P″Amano″3SD(源自蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)，由AmanoEnzymeInc.制造)和BiopraseOP(源自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)，由NagaseChemtexCorporation制造)作为丝氨酸蛋白酶，蛋白酶M″Amano″SD(源自米曲霉(Aspergillusoryzae)，由AmanoEnzymeInc.制造)和OrientaseA20(源自黑曲霉(Aspergillusniger)，由HBIEnzymesInc.制造)用作天冬氨酸蛋白酶，AroaseAP-10(源自枯草杆菌(Bacillussubtilis)，由YakultPharmaceuticalIndustryCo.，Ltd.制造)和UmamizymeG(源自米曲霉(Aspergillusoryzae)，由AmanoEnzymeInc.制造)用作金属蛋白酶，并且PapainDF用作半胱氨酸蛋白酶。在将各个得到的混合物加热各个酶的最佳温度后，向其中加入0.02g的酶，接着搅拌4小时，从而进行各个酶分解反应。将这样获得的反应加热至90℃以将酶失活。冷却后，将得到的溶液经Celite过滤。将滤液通过用于去除5,000以上分子量的级分的超滤膜，并且将得到的滤液冷冻干燥，获得DPPIV抑制剂性肽组合物的粉末。因为鱼白中含有的DNA的分子量为好几万或更大，推定可以将高分子量DNA提取出并且通过这些处理去除。
(实施例2)
(DPPIV活性的测量)
对实施例1中获得的各个DPPIV抑制性肽化合物测量DPPIV抑制活性。测量通过使用部分改进的DPPIVDrugDiscovery测定试剂盒(由EnzoLifeSciences，Inc制造)进行。作为DPPIV酶的底物，使用AMC底物(H-Gly-Pro-氨基-4-甲基香豆素，BML-P189-9090；由Biomol制造)，作为酶，使用DPPIV(人的，重组的；由Biomol制造)，并且作为对照抑制剂，使用DiprotinA(由PeptideInstituteInc.制造)。具体地，在96-孔板中，加入25μL的50mMTris缓冲液(pH7.5)，10μL的实施例1中去除高分子化合物级分后获得的水解产物水溶液(3mg/mL)，和15μL的DPPIV(0.002mU/μL)溶液并混合，并且将得到的溶液在37℃预孵育。向得到的溶液中加入50μL的在37℃预孵育的AMC底物溶液(0.01mM)，并且通过使用微板读数器(GENioPro，由TECAN制造)在340nm的激发波和460nm的测量波长每5分钟测量荧光强度达30分钟。在没有样品的情况下的活性设为100％，并且计算各个样品的相对活性。对于各个样品，将测量重复进行三次，获得平均值。
结果在图1中说明。因为难以收集具有通过PapainDF得到的高粘性的鲑鱼鱼白水解产物，未测量其抑制活性。当使用丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶时，在任何情况下，都显示DPPIV抑制活性，并且尤其是通过丝氨酸蛋白酶的分解产物中显示高的抑制活性。
(实施例3)
(SD大鼠上的淀粉耐受测试)
在该测试中，使用适应于12小时亮暗循环(从上午7时至下午7时亮)，20至24℃的室温，43至61％的湿度，自由喂料(以CRF-1，由OrientalYeastCo.，Ltd.制造)和饮用水(自来水)的环境达1周的SD大鼠(Slc：SD，7周龄)。从适应的最后一天晚上开始，将大鼠禁食过夜达16小时以上，并且随后通过基于重量分等级随机取样分组，每组5只大鼠。
将实施例1中获得的源自鲑鱼鱼白的肽组合物(粉末)溶解在蒸馏水中，以制备100mg/mL溶液。将该溶液100mg/kg各个SD大鼠的剂量强行口服施用。备选地，以相同剂量施用蒸馏水(对照组中)。施用测试物质后，将淀粉(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)溶解于蒸馏水以获得20％水溶液，从而用于以2g/kg大鼠的量加载各个大鼠。在不麻醉的情况下，在淀粉加载前和加载后30，60和120分钟四个时间点收集血液。注意，通过使用用于测量全血中血液葡萄糖浓度(mg/dL)的血液葡萄糖自监控装置(NiproFreestyleFreedom，由NiproCorporation制造)测量血液葡萄糖水平。
测量结果显示在图2中。作为结果，与对照组相比，在向其中施用源自鱼白的肽组合物的组中，血液葡萄糖水平的增加被显著抑制。因此，表明源自鱼白的肽组合物具有由于DPPIV抑制导致的抑制血液葡萄糖水平增加的效果。
(实施例4)
(肽组合物活性的测量)
为了检查原材料，向各个用于水解的秋鲑的鱼白(鲑鱼鱼白)，鱼精蛋白，源自鲑鱼皮的胶原蛋白(鲑鱼皮胶原蛋白)，和Humboldt鱿鱼的鱼白(鱿鱼鱼白)加入HCl，并且通过使用氨基酸分析仪JLC-500/V2(由JEOLLtd.制造)测量氨基酸组成(mol％)。测量结果显示在表2中。
[表2]
表2
分别使用秋鲑的鱼白，鱿鱼鱼白和源自鲑鱼皮的胶原蛋白肽作为用于水解的材料，并且分别与以下水解酶组合，以与实施例1中相同的方式获得源自相应材料的肽组合物(粉末)。
-水解酶A
AroaseAP-10(金属蛋白酶)：秋鲑鱼白，鱿鱼鱼白
-水解酶B
Alcalase2.4LFG(丝氨酸蛋白酶)：秋鲑鱼白，鱿鱼鱼白
-水解酶C
蛋白酶P″Amano″3SD(丝氨酸蛋白酶)：秋鲑鱼白
-水解酶D
Papain(半胱氨酸蛋白酶)：鲑鱼皮
将因此获得的各个肽组合物以3mg/mL的浓度溶解在蒸馏水中，将所得物进行0.45μm膜过滤处理，并且以与实施例2中相同的方式进行DPPIV抑制活性测试。结果显示在表3中。
[表3]
表3
(实施例5)
(活性肽的浓缩方法)
将100mg的源自实施例4中获得的各个材料的各个肽组合物样品分别溶解于蒸馏水，将得到的溶液应用于用蒸馏水平衡的Sep-Pak(注册商标)柱(C186cc：由Waters制造)。然后将柱用蒸馏水洗涤，并且用水分乙醇洗脱吸附的级分。将因此获得的各个洗脱物用蒸发仪干燥，获得浓缩的肽组合物级分。因此获得的洗脱物级分可以直接用作DPPIV抑制性活性肽组合物。
(实施例6)
(寻找活性肽)
分离包含在实施例5中获得的源自鲑鱼鱼白的肽组合物的浓缩的级分中的各个强DPPIV抑制性肽。
首先，根据图3所述方法，将各个肽级分从作为实施例1中所述的源自鲑鱼鱼白的水解产物的肽组合物分离。通过使用LC-MS(LCMS-IT-TOF，由ShimadzuCorporation制造)，将因此分离的各个肽级分在下文所述用于进行质谱(MS)分析的条件下分析。通过肽合成仪(SyroI，由BiotageAB制造)合成具有通过MS分析推测的结构的候选肽。通过使用LC-MS比较它们确定各个肽结构。
(通过LCMS-IT-TOF确定结构)
＜用于HPLC分析的条件＞
-HPLC系统：由ShimadzuCorporation制造的Prominence系列(系统控制器：CBM-20A，自动上样器：SIL-20A，溶剂输送泵：LC-20ABBinary泵，柱式加热炉：CTO-20A，PDA检测器：SPD-M20A(测量波长：190至700nm))
-柱：XterraMSC183.5μm，2.1x100mm(由Waters制造)
-柱温：40℃
-流动相A：H2O(含有0.1体积％的TFA，由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-流动相B：甲醇(由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-梯度：在0至15分钟的时期内保持的3体积％的溶液B，15至45分钟的时期内3体积％的溶液B至60体积％的溶液B的线性梯度，和45至50分钟的时期内保持的60体积％的溶液B。
-分析时间：50min
-流速：0.1mL/min
-注射量：1μL
＜IT-TOFMS的检测条件＞
-系统：由ShimadzuCorporation制造的LCMS-IT-TOF(电离模式：ESI+，雾化气体流速：1.5L/min，外施电压：1.7kV，CDL温度：200℃，BH温度：200℃，测量范围MS：m/z100-1500，MS/MS：50-1000)
(实施例7)
(鉴定的肽的活性测量)
合成实施例6的LC-MS分析鉴定的各个肽并且溶解在蒸馏水中，以与实施例2相同的方式发现DPPIV抑制活性。首先，将各个肽溶液系列稀释，获得各个水平的抑制活性，并且基于抑制活性(％)和样品浓度的对数(Log10)的相关表达回溯计算各个样品的50％抑制浓度(IC50值)。合成的肽中的DPPIV抑制剂活性的比较结果显示在表4中。在因此确定的18种肽中，10种肽具有100μM以下的IC50值，并且具有极高的DPPIV抑制活性。
[表4]
表4
(实施例8)
(活性肽含量的测量)
将获自实施例4中的各个材料的肽组合物的各个浓缩的级分以2mg/mL的浓度溶解于蒸馏水，并且将得到的溶液进行0.45μm膜过滤处理，以用于测量活性肽的含量。基于作为从来自作为原材料的秋鲑鱼白生产DNA过程中DNA提取和分离得到的残留物的副产物制备类似的肽组合物，并且测量其中活性肽的含量。在上文所述的鉴定的肽中，使用JMSLCmate(由JEOLLtd.制造)在下述条件A下将IP，VPI，VPL，IPI，LPL，LPI和IPL定量确定。在上文所述的这样确定的肽中，在下述条件B下将FPVG，LPVL，VPFP和LPF定量确定。因此获得的定量确定结果和上述实施例中鉴定的各个肽的DPPIV抑制活性的IC50值(μM)用于根据以下等式计算活性贡献比例：
贡献比例＝(每g的肽组合物的确定的肽的含量/(确定的肽的IC50值(μM)x确定的肽的分子量/1000))/(1000/肽组合物的IC50值(μg/mL))x100
(定量分析确定的肽的条件A)
＜用于HPLC分析的条件＞
-HPLC系统：AllianceWaters2695(由Waters制造)
-柱：Discovery(注册商标)HSF5，5μm，2.1x250mm(由SUPELCO，Inc.制造)
-流动相A：H2O(含有0.1体积％的甲酸和0.01体积％的TFA，由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-流动相B：甲醇(由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-梯度：在0至30分钟的时期内40体积％的溶液B至80体积％的溶液B的线性梯度，和在30至35分钟的时期内保持的80体积％的溶液B
-分析时间：35min
-流速：0.2mL/min
-注射量：5μL
＜用于MS的检测条件＞
-系统：JMS-LCmate(由JEOLLtd.制造)
-电离模式：ESI+，SIM测量离子：m/z：229.2，328.2，342.2
(用于确定的肽的定量分析的条件B)
＜用于HPLC分析的条件＞
-HPLC系统：AllianceWaters2695(由Waters制造)
-柱：XTerra(注册商标)Phenyl3.5μm，4.6x100mm柱(由Waters制造)
-流动相A：H2O(含有0.1体积％的甲酸和0.01体积％的TFA，由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-流动相B：甲醇(由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-梯度：在0至4分钟的时期内保持40体积％的溶液B，在4至24分钟的时期内40体积％的溶液B至60体积％的溶液B的线性梯度，和在24至29分钟的时期内保持60体积％的溶液B
-分析时间：29min
-流速：0.2mL/min
-注射量：5μL
＜用于MS的检测条件＞
-系统：JMS-LCmate(由JEOLLtd.制造)
-电离模式：ESI+，SIM测量离子：m/z：376.2，419.2，441.3，459.3
定量分析测试的结果[各个肽组合物(1g)中的活性肽含量(mg/g)]在表5中显示。关于具有低DPPIV抑制活性的源自鲑鱼皮的胶原蛋白肽，未检测确定的肽。另一方面，在发现具有DPPIV抑制活性的源自鱿鱼鱼白的肽组合物，检测到前述活性肽，并且其表明，这些活性肽为这些肽组合物的DPPIV抑制活性做出贡献。发现了，含有来自这些活性肽的多种肽的肽组合物具有DPPIV抑制活性。
鲑鱼鱼白肽组合物中的活性肽的活性贡献比例可以是如表6中显示的范围。
[表5]
表5
注意：该表中的符号″-″意为N.D.(未检测)。
[表6]
表6
如表5中所示，作为由所有水解酶导致的共有成分，各个肽组合物含有作为二肽的Ile-Pro(IP)和作为三肽的Val-Pro-Leu(VPL)。关于使用丝氨酸蛋白酶获得的肽化合物，除了Ile-Pro(IP)和Val-Pro-Leu(VPL)，还含有Ile-Pro-Leu(IPL)和Leu-Pro-Val-Leu(LPVL)。关于源自鲑鱼鱼白的肽组合物，尽管改变了水解酶，除了Ile-Pro(IP)和Val-Pro-Leu(VPL)之外，还含有Ile-Pro-Leu(IPL)。
(实施例9)
(DPPIV抑制活性和源自各个水产品的鱼白的肽组合物的肽含量)
通过使用各个水产品(秋鲑，粉鲑，鲱鱼，鳕鱼，鲣鱼，鱼(幼鱼)和鱿鱼)的鱼白作为原材料，以与实施例1相同的方式获得肽组合物。具体地，将水加至10g的各个水产品的鱼白的碾碎产物以将得到的溶液调节至pH8.0；向其中加入0.016g的酶(蛋白酶P″Amano″3SD)；并且在50℃进行酶分解反应5小时。反应后，将这样获得的反应溶液加热至90℃以将酶失活，并且在将溶液冷却后，将所得物通过使用Celite过滤。将滤液冷冻干燥，获得DPPIV抑制性肽组合物的粉末。
将肽组合物溶解于蒸馏水，并且将所得物进行0.45μm膜过滤处理，以用于测量DPPIV抑制活性和活性肽的含量。
通过使用部分改进的DPPIVDrugDiscovery测定试剂盒(由EnzoLifeSciences，Inc制造)测量DPPIV抑制活性。作为DPPIV酶的底物，使用AMC底物(H-Gly-Pro-氨基-4-甲基香豆素，BML-P189-9090；由Biomol制造)，作为酶，使用DPPIV(人的，重组的；由Biomol制造)，并且作为对照抑制剂，使用DiprotinA(由PeptideInstituteInc.制造)。具体地，在96-孔板中，加入25μL的50mMTris缓冲液(pH7.5)，10μL的肽组合物(3，10或20mg/mL)，和50μL的AMC底物溶液(0.01mM)并混合，并且将得到的溶液在37℃预孵育。向得到的溶液中加入15μL的DPPIV(0.002mU/μL)溶液以起始反应，并且通过使用微板读数器(GENioPro，由TECAN制造)在340nm的激发波和460nm的测量波长每5分钟测量荧光强度达30分钟。在通过将没有样品的情况下的活性定义为100％，计算各个样品的相对活性值的基础上，计算DPPIV抑制活性的IC50值(μM)。
结果在图4中说明。尽管存在取决于鱼的种类的差异，但由作为样品的本文使用的所有类型的鱼，都确认高的DPPIV抑制活性。
接着，在各个肽组合物中定量确定活性肽。通过使用Xevo-TQD(由Waters制造)，在以下条件C下进行定量确定：
(用于定量确定活性肽的条件C)
＜用于UPLC分析的条件＞
-UPLC系统：ACQUITY(由Waters制造)
-柱：ACQUITYHSSPFP，1.8μm，2.1x150mm(由Waters制造)
-流动相A：H2O(含有0.1体积％的甲酸，由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-流动相B：甲醇(由KantoChemicalCo.，Inc.制造，用于LC-MS)
-梯度：从0至15分钟的时期为20体积％的溶液B至72体积％的溶液B的线性梯度，并且在15至20分钟的时期保持80体积％的溶液B
-分析时间：20min
-流速：0.2mL/min
＜用于MS的检测条件＞
-系统：Xevo-TQD(由Waters制造)
-电离模式：ESI+，MSMRM测量前体/产物离子(Q1/Q3)：IP＝229.1/86.0，VPI＝328.2/229.1，VPL＝328.2/229.1，IPI＝342.1/229.1，LPL＝342.1/229.1，IPL＝342.2/229.1，LPF＝376.1/263.2，FPVG＝419.2/120.0，LPVL＝441.3/169.1，VPFP＝459.2/197.1
定量确定的结果[各个肽组合物中活性肽的含量(mg/100g)]在表7中显示。在作为样品的本文使用的所有类型的鱼中检测到DPPIV抑制性活性。
[表7]
表7

Claims (20)

1.一种用于抑制二肽基肽酶-IV(DPPIV)的组合物，所述组合物包含通过水解源自水产品的鱼白的蛋白源获得的具有DPPIV抑制活性的肽化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水产品是鲑鱼，粉鲑，鲱鱼，鳕鱼，鲣鱼，鱼(幼鱼)和鱿鱼中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述肽化合物具有通过DPPIV抑制活性抑制血液葡萄糖水平增加的作用。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中源自水产品的鱼白的蛋白源是在从水产品的鱼白提取鱼精蛋白和/或DNA过程中作为副产物获得的提取残留物中包含的蛋白源。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其包含选自Phe-Pro-Val-Gly及其盐，Ile-Pro-Leu及其盐，Leu-Pro-Val-Leu及其盐，和Val-Pro-Phe-Pro及其盐的至少一种作为肽化合物。
6.一种抑制二肽基肽酶-IV(DPPIV)的组合物，其包含选自Phe-Pro-Val-Gly及其盐，Ile-Pro-Leu及其盐，Leu-Pro-Val-Leu及其盐，和Val-Pro-Phe-Pro及其盐的至少一种作为DPPIV抑制活性成分。
7.根据权利要求6所述的组合物，其具有通过DPPIV抑制活性抑制血液葡萄糖水平增加的作用。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，所述组合物用于医疗用途。
9.包含根据权利要求1至7中任一项所述的组合物的食品。
10.包含根据权利要求1至7中任一项所述的组合物的宠物食品。
11.选自Phe-Pro-Val-Gly及其盐，Ile-Pro-Leu及其盐，和Leu-Pro-Val-Leu及其盐的至少一种肽化合物。
12.一种具有二肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制活性的水解产物的制备方法，所述方法包括：
水解源自水产品的鱼白的蛋白源以获得具有DPPIV抑制活性的水解产物的步骤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中所述水产品是鲑鱼，粉鲑，鲱鱼，鳕鱼，鲣鱼，鱼(幼鱼)和鱿鱼中的一种或多种。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，其中所述水解产物具有由于DPPIV抑制活性而抑制血液葡萄糖水平增加的作用。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的制备方法，其中源自水产品的鱼白的蛋白源是从水产品的鱼白提取鱼精蛋白和/或DNA过程中作为副产物获得的提取残留物中包含的蛋白源。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的制备方法，其中所述水解在水解蛋白源的酶的存在下进行。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中水解蛋白源的酶是丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶中的至少一种。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的制备方法，其中所述水解在致使选自Phe-Pro-Val-Gly及其盐，Ile-Pro-Leu及其盐，Leu-Pro-Val-Leu及其盐，和Val-Pro-Phe-Pro及其盐的至少一种被包含在水解产物中的条件下进行。
19.一种用于DPPIV抑制活性的组合物，其包含通过权利要求12至18中任一项所述的制备方法获得的具有DPPIV抑制活性的水解产物。
20.一种具有二肽基肽酶-IV(DPPIV)抑制活性的肽化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
通过权利要求12至18中任一项所述的制备方法获得水解产物；和
从水解产物分离具有DPPIV抑制活性的肽化合物。
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