CN102713623A - 早期胰腺腺癌的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了使用抗胰腺癌抗体或其片段，例如鼠、嵌合、人源化或人PAM4抗体的组合物和方法。题述抗体表现出许多新的并且有用的诊断特征，例如以高特异性结合到胰腺癌和其它癌症上，但不结合到正常胰腺组织上，以及结合到高百分比的早期胰腺癌上。在优选的实施方案中，所述抗体结合到胰腺癌粘蛋白上。所述抗体和片段可用于检测和诊断早期胰腺癌。在优选的实施方案中，所述抗胰腺癌抗体可用于血清样品的免疫测定，其中所述免疫测定可以检测血清中早期胰腺癌的标记。更优选在免疫测定前用有机相例如丁醇萃取血清。

Description

早期胰腺腺癌的检测
相关申请
根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2010年1月22日提交的美国临时申请61/297,303、2010年4月14日提交的61/323,944、2010年6月2日提交的61/350,567以及2010年8月19日提交的61/375,119的权益。上面引用的每篇优先权申请均以引用的方式整体并入本文。
有关联邦政府资助的研究或开发的申明
这项工作部分由NIH基金RO1-CA096924资助。美国政府可享有本发明的某些权利。
发明背景
发明领域
本发明涉及抗胰腺癌抗体的用途，所述抗体以高选择性结合到胰腺癌细胞上从而检测和/或诊断胰腺腺癌，优选地最早期的胰腺腺癌。更优选地，基于抗体的测定能够检测约85%或更多的胰腺腺癌，对健康对照的假阳性率为5%或更低。在特定实施方案中，所述方法和组合物可用来通过筛检来自受试者的血清样品来检测和/或诊断胰腺腺癌，并优选可通过血清样品分析检测60%或更多的I期胰腺癌以及80%或更多的II期胰腺癌。
在优选实施方案中，所述抗胰腺癌抗体与PAM4抗体竞争结合到胰腺癌粘蛋白上，所述PAM4抗体包含轻链可变区互补决定区(CDR)序列CDR1(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO:1)、CDR2(STSNLAS,SEQID NO:2)和CDR3(HQWNRYPYT,SEQ ID NO:3)，以及重链CDR序列CDR1(SYVLH,SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)。最优选地，所述抗胰腺癌抗体是人源化PAM4(hPAM4)抗体，其包含轻链CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO:1)、CDR2(STSNLAS,SEQID NO:2)和CDR3(HQWNRYPYT,SEQ ID NO:3)，以及重链CDR序列CDR1(SYVLH,SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)，以及人抗体构架区(FR)和恒定区序列。
相关领域
胰腺癌是主要发生于胰腺导管细胞的胰腺恶性生长。这种疾病是排在第九位的最常见癌症形式，但它分别是排在第四和第五位的男性和女性癌症死亡的主要原因。胰腺癌几乎总是致命的，5年存活率小于3％。
胰腺癌最常见的症状包括黄疸、腹痛和体重减轻，这些症状与其它表现症状(presenting factor)都是非特异性的。因而，在肿瘤生长早期诊断出胰腺癌常常是困难的，需要大量的诊断性检查，时常包括探查术。内窥镜超声成像和计算机断层成像是目前可用的最好的非侵入性诊断胰腺癌的手段。然而，小肿瘤的可靠检测以及胰腺癌和局灶性胰腺炎的区分是困难的。目前，绝大多数胰腺癌患者处于晚期时才被诊断出来，此时肿瘤已从囊向外延伸，侵袭周围器官和/或已经广泛转移。Gold等，Crit.Rev.Oncology/Hematology,39:147-54(2001)。该疾病的晚期检测是常见的，早期胰腺癌诊断在临床上是罕见的。这很重要，因为胰腺癌的晚期检测导致存活率低下。
可用的胰腺癌现行治疗程序没有导致治愈或明显提高存活时间。手术切除是提供存活机会的唯一方式。然而，由于肿瘤负荷大，仅10%至25%的患者是“治愈性切除”的候选者。对于接受手术治疗的那些患者，5年存活率仍然很低，平均仅约为10%。
胰腺癌的早期检测和诊断以及对该疾病的适当分期将会提供提高的存活优势。许多实验室已试图基于肿瘤相关标记至血流中的释放以及活检样本内的标记物质的检测来开发诊断程序。对于胰腺癌，先前表征的最好的肿瘤相关标记是针对CA19.9的免疫测定。在70%的胰腺癌患者中发现这种唾液酸化Lea表位结构水平升高，但并未在任何所检查的局灶性胰腺炎样本中发现。然而，发现CA19.9水平在许多其它恶性和良性病状中也升高，所以目前该测定不能用于诊断。该测定对于监测有用，手术后CA19.9血清水平持续增加指示不良预后。已经报道，用于在不同的发展期进行诊断的许多其它单克隆抗体(MAb)的免疫测定。这些抗体包括但不限于DUPAN2、SPAN1、B72.3、Ia3和各种抗-CEA(癌胚抗原，或CEACAM5)抗体。
抗体，特别是MAb和工程化抗体或抗体片段已被全面测试，并被证明在检测和治疗包括癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎性疾病或心血管疾病在内的各种人病症中具有价值[Filpula和McGuire,Exp.Opin.Ther.Patents(1999)9:231-245]。抗体或抗体源性试剂的临床应用主要取决于它们与特定病症相关的特异性靶抗原结合的能力。选择性对于在人病症的检测和治疗阶段期间将诊断剂或治疗剂递送至靶部位是有价值的，特别是如果所述诊断剂或治疗剂对机体正常组织有毒性时更是如此，所述诊断剂或治疗剂为例如药物、毒素、细胞因子、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、寡核苷酸、生长因子、放射性核素、血管生成抑制剂或金属。放射性标记抗体已在包括卵巢癌、结肠癌、甲状腺髓样癌和淋巴瘤在内的许多恶性肿瘤的应用中取得了一些成功。这项技术也被证明对胰腺癌有用。然而，先前报道的抗胰腺癌抗原的抗体到目前为止还没有成功地用于胰腺癌的有效治疗或早期检测和/或诊断。
本领域仍然需要与正常胰腺组织和其它正常组织相比对胰腺癌和其它类型的癌症表现出高选择性的抗体。特别地，仍然需要这样的抗体，其可用作胰腺癌，优选最早期胰腺癌的有效诊断和/或治疗工具，并且在靶抗原中的摄取增强，与健康个体血液中的组分的结合降低，并从而也为正常组织和细胞提供最佳的保护，使其免受当这些组分缀合到此类抗体上时有毒治疗剂的损害。将此类抗体用来检测体液(特别是血液)中的胰腺癌相关抗原，可以改进这种疾病的较早期诊断，只要它明显区别于良性疾病，并且还可以监测治疗反应，并且还可潜在地通过指示疾病负荷来改善预后。
概述
在各种实施方案中，本发明涉及结合到胰腺癌细胞上，而很少或不结合到正常细胞或非赘生性胰腺癌细胞上的抗体、抗原结合抗体片段和融合蛋白。优选地，所述抗体结合到最早期胰腺癌上，对PanIN-1A的检测率为约54%，对Pan1B的检测率为75%，对PanIN-2的检测率为86%。更优选地，所述抗体结合到80%至90%或更多的人侵袭性胰腺腺癌、导管内乳头状粘液性瘤变(neoplasia)、PanIN-1A、PanIN-1B和PanIN-2病变上。最优选地，所述抗体可以区分早期胰腺癌和非恶性病状例如胰腺炎。此类抗体特别可用于癌症的早期检测以及早期胰腺癌和良性胰腺病状的鉴别诊断。在优选的实施方案中，此类抗体可用于体内或离体分析来自疑似患有早期胰腺癌或某些其它癌症的个体的样品。更优选地，所述抗体可用于通过分析血清样品检测和诊断早期胰腺癌。
所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以通过用粘蛋白免疫和/或选择而获得，并优选对人胰腺癌粘蛋白有反应性。因此，所述抗体、抗体片段或融合蛋白优选结合到与胰腺癌细胞相关的抗原上。更优选地，所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以结合到表达于胰腺癌中的粘蛋白例如MUC-1或MUC-5上。
在替代实施方案中，所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以结合到合成肽序列上，例如结合到噬菌体展示肽上。可结合到抗胰腺癌抗体上的示例性肽包括但不限于WTWNITKAYPLP (SEQ ID NO:7)和ACPEWWGTTC (SEQ ID NO:8)。此类合成肽可以是线形或环状的，并且可能与或不与结合到内源性胰腺癌抗原上的抗体竞争。合成肽序列某些位置中的氨基酸对于抗体结合性而言可能不如其它氨基酸关键。例如，在SEQ ID NO:7中，位于肽序列的位置7、8和11处的残基K、A和L可以改变，同时仍然保留抗体结合性。类似地，在SEQID NO:8中，该序列的位置8和9处的苏氨酸残基可以改变，但位置9处苏氨酸的置换可显著影响抗体对所述肽的结合。
所述抗体与靶胰腺癌抗原的结合可以通过用如二硫苏糖醇(DTT)和/或高碘酸盐的试剂处理靶抗原来抑制。因而，所述抗体与胰腺癌抗原的结合可能取决于二硫键的存在和/或靶抗原的糖基化状态。在更优选的实施方案中，题述抗体识别的表位与报道的其它粘蛋白特异性抗体例如MA5抗体、CLH2-2抗体和/或45M1抗体没有交叉反应性(参见，例如，Major等，J Histochem Cytochem.35:139-48,1987;Dion等，Hybridoma 10:595-610,1991)。
题述抗体或片段可以是裸抗体或片段，或者优选缀合到至少一种治疗和/或诊断剂上以便将所述试剂递送至靶组织。在替代实施方案中，PAM4抗体或片段可以是双特异性融合蛋白或抗体的一部分，所述双特异性融合蛋白或抗体具有针对靶细胞抗原的第一结合位点和针对缀合到可靶向构建体上的半抗原的第二结合位点。可靶向构建体继而可以连接至可用于预靶向技术的至少一种治疗和/或诊断剂。
在优选的实施方案中，题述抗体、抗体片段或融合蛋白包含鼠、嵌合、人源化或人PAM4抗体或片段，其包含轻链可变区CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO:1)、CDR2(STSNLAS,SEQ IDNO:2)和CDR3(HQWNRYPYT,SEQ ID NO:3)，以及重链可变区CDR序列CDR1(SYVLH,SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)。
特定实施方案可以涉及使用鼠PAM4抗体的组合物和方法，所述鼠PAM4抗体优选包含如图1A和1B中所公开的鼠PAM4可变区序列(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12)。此类鼠PAM4抗体或片段可用于体外或离体诊断技术，例如来自疑似患有胰腺癌或其他类型的癌症的受试者的组织样品的免疫组织化学分析或体液样品的免疫测定。
其它特定实施方案可以涉及使用嵌合PAM4抗体的组合物和方法，所述嵌合PAM4抗体包含连接至人抗体恒定区序列的鼠可变区序列。所述嵌合PAM4抗体或片段优选包含图2A和2B中所示的cPAM4可变区序列(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。此类嵌合抗体在人中的免疫原性小于鼠抗体，同时保留了亲本鼠抗体的抗原结合特异性。用于癌症的诊断性和/或治疗性治疗的嵌合抗体是本领域熟知的。
又其它特定实施方案可以涉及使用人源化PAM4抗体或其片段的组合物和方法，所述人源化PAM4抗体或其片段包含如上所讨论的鼠PAM4 MAb的互补决定区(CDR)和人抗体构架区(FR)和恒定区序列。在优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或其片段的轻链和重链可变区的FR包含至少一种被鼠PAM4 MAb的相应FR置换的氨基酸。还更优选人源化PAM4抗体或其片段可包含至少选自鼠PAM4重链可变区(图1B,SEQ ID NO:12)的氨基酸残基5、27、30、38、48、66、67和69的氨基酸残基，和/或至少一种选自鼠PAM4轻链可变区(图1A,SEQ ID NO:10)的氨基酸残基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸。最优选地，人源化PAM4抗体或其片段包含图4A (SEQ IDNO:19)的hPAM4 VH氨基酸序列和图4B(SEQ ID NO:16)的hPAM4VK氨基酸序列。
在替代实施方案中，抗胰腺癌抗体可以是与嵌合PAM4(cPAM4)抗体结合到相同的抗原决定簇(表位)上，或者与嵌合PAM4(cPAM4)抗体竞争结合到人胰腺粘蛋白上的鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。如下面所讨论的，cPAM4抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO:1)、CDR2(STSNLAS,SEQ IDNO:2)和CDR3(HQWNRYPYT,SEQ ID NO:3)，以及重链可变区CDR序列CDR1(SYVLH,SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)的抗体。结合到相同的抗原决定簇上的抗体可以通过本领域已知的多种技术鉴定，例如通过使用cPAM4抗体作为竞争抗体和使用人胰腺粘蛋白作为靶抗原的竞争性结合研究鉴定。(参见例如下面的实施例1)。阻断cPAM4抗体(与cPAM4抗体竞争)结合至人胰腺粘蛋白的抗体称为交叉阻断抗体。优选地，此类交叉阻断抗体是通过用包含人胰腺癌粘蛋白的提取物进行免疫来制备。
另一个实施方案是癌细胞靶向性诊断免疫缀合物，其包含结合到至少一种诊断(或检测)剂上的抗胰腺癌抗体、抗体片段或融合蛋白。
优选地，所述诊断剂选自由放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂组成的组。还更优选所述诊断剂为能量介于20keV和4,000keV之间的放射性核素，或者为选自由以下组成的组的放射性核素：110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr，或其它γ发射体、β发射体或正电子发射体。在特别优选的实施方案中，将诊断放射性核素18F用于标记和PET成像，如下面的实施例中所描述的。18F可以通过如下方式连接至抗体、抗体片段或肽：使它与金属例如铝复合，然后使18F-金属复合物结合至缀合到靶向蛋白、肽或其它分子上的螯合部分。
还优选地，所述诊断剂为顺磁离子，如铬(Ⅲ)、锰(II)、铁(Ⅲ)、铁(II)、钴(Ⅱ)、镍(II)、铜(II)、钕(Ⅲ)、钐(Ⅲ)、镱(Ⅲ)、钆(Ⅲ)、钒(II)、铽(Ⅲ)、镝(Ⅲ)、钬(Ⅲ)和铒(Ⅲ)，或不透射线的材料，如钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、碘肥胺、碘沙酸、碘古酰胺(iogulamide)、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。
在又其它实施方案中，所述诊断剂是选自由异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺组成的组的荧光标记化合物，选自由鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯组成的组的化学发光标记化合物，或选自由萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白组成的组的生物发光化合物。在另一个实施方案中，所述诊断免疫缀合物用于手术中、内窥镜检查或血管内肿瘤诊断。
另一个实施方案是癌细胞靶向性治疗免疫缀合物，其包含结合到至少一种治疗剂上的抗体或其片段或融合蛋白。优选地，所述治疗剂选自由放射性核素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、如反义寡核苷酸或siRNA的寡核苷酸、酶抑制剂、光敏治疗剂、如药物或毒素的细胞毒性剂、血管生成抑制剂和促凋亡剂组成的组。在使用一种以上的治疗剂的实施方案中，所述治疗剂可以包含多个拷贝的相同治疗剂或者不同治疗剂的组合。
在一个实施方案中，寡核苷酸，例如抑制bcl-2表达的反义寡核苷酸或siRNA描述于美国专利第5,734,033号(其实施例部分以引用方式并入本文)中，可以缀合到免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分上或者形成免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分。或者，所述寡核苷酸可以与裸或缀合的抗胰腺癌抗体或抗体片段例如PAM4抗体同时施用或相继施用。在优选的实施方案中，所述寡核苷酸是针对癌基因或癌基因产物如bcl-2、p53、ras或其它熟知的癌基因的反义寡核苷酸。
在优选的实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂，如药物或毒素。还优选地，所述药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位复合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮细胞抑制素(endostatin)、紫杉醇、喜树碱、SN-38、多柔比星及其类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11及其组合。
在另一个优选的实施方案中，所述治疗剂是毒素，其选自由以下组成：蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素及其组合。或者免疫调节剂，其选自由以下组成的组：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。
或者，所述治疗剂是酶，其选自由以下组成的组：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此类酶可以，例如与以相对无毒形式施用并在靶位被所述酶转化成细胞毒性剂的前药组合使用。在其它替代实施方案中，药物可以被受试者内源酶转化成毒性较低的形式，但可被所述治疗酶再转化成细胞毒性形式。
其它治疗剂包括放射性核素，例如14C、13N、15O、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、67Cu、67Ga、67Ga、75Br、75Se、75Se、76Br、77As、77Br、80mBr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo、99mTc、103mRh、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、109Pt、111Ag、111In、113mIn、119Sb、121mTe、122mTe、125I、125mTe、126I、131I、133I、142Pr、143Pr、149Pm、152Dy、153Sm、161Ho、161Tb、165Tm、166Dy、166Ho、167Tm、168Tm、169Er、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189mOs、189Re、192Ir、194Ir、197Pt、198Au、199Au、199Au、201Tl、203Hg、211At、211Bi、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、215Po、217At、219Rn、221Fr、223Ra、224Ac、225Ac或255Fm。
还涵盖多价、多特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原有亲和性的结合位点，和一个或多个对半抗原分子有亲和性的半抗原结合位点。优选地，所述抗体或其片段为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体或其片段。所述半抗原分子可以缀合到用于递送一种或多种治疗和/或诊断剂的可靶向构建体上。在某些优选的实施方案中，所述多价抗体或其片段可以通过停靠和锁定(DNL)技术制备，如下面的实施例中所描述的。并入hPAM4抗体片段的示例性DNL构建体命名为TF10，如下所述。
还涵盖双特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原有亲和性的结合位点，和至少一个对可靶向构建体/缀合物有亲和性的结合位点，所述可靶向构建体/缀合物选自由以下组成的组：
DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 271)；
DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 277)；
DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 288)；
DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 0281)；
NOTA-ITC  苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 449)；
NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP460)；
NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 461)；
NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 462)；
NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 465)；
C-NETA-琥珀酰基-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP467)；
S-NETA-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 469)；和
L-NETA-琥珀酰基-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP470)，
其能够携带至少一种诊断剂和/或治疗剂。其它适用的可靶向构建体公开于，例如美国专利第6,576,746号、第6,962,702号、第7,052,872号、第7,138,103号、第7,172,751号、第7,405,320号、第7,597,876号、第7,563,433号，以及2008年12月24日提交的美国专利申请序列第12/343,655号、2009年4月30日提交的美国专利申请序列第12/433,212号、2009年6月17日提交的美国专利申请序列第12/485,998号、2009年8月14日提交的美国专利申请序列第12/541,527号以及2010年12月1日提交的美国专利申请序列第12/958,889号中，这些专利和专利申请的实施例部分都以引用方式并入本文。
其它实施方案涉及包含至少两种本文所述的抗胰腺癌抗体及其片段的融合蛋白。或者，所述融合蛋白或其片段可以包含至少一种第一抗胰腺癌抗体或其片段和至少一种第二MAb或其片段。优选地，第二MAb结合到肿瘤相关抗原上，所述肿瘤相关抗原例如选自由以下组成的组：CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、Lea、路易斯抗原Le(y)、CSAp、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮糖蛋白-1(EGP-1)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、CD-80、胎盘生长因子(PlGF)、碳酸酐酶IX、肌腱蛋白、IL-6、HLA-DR、CD40、CD74(例如，milatuzumab)、CD138(多配体聚糖-1)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、TAG-72、EGFR、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成因子(例如，VEGF和PlGF)、癌基因产物(例如，bcl-2、Kras、p53)、cMET、HER2/neu，以及与胃癌和结肠直肠癌相关的抗原。所述抗体融合蛋白或其片段可以进一步包含至少一种诊断剂和/或治疗剂。
本文还描述了包含编码如本文所述的抗胰腺癌抗体、融合蛋白、多特异性抗体、双特异性抗体或其片段的核酸的DNA序列。其它实施方案涉及包含所述抗体编码DNA序列的表达载体和/或宿主细胞。在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞可以为用突变Bcl-2基因，例如用三重突变Bcl-2基因(T69E、S70E、S87E)转化的、已适应于细胞转化和在无血清培养基中生长的Sp2/0细胞系。(参见，例如，美国专利第7,531,327号、第7,537,930号和第7,608,425号，其中每篇的实施例部分均以引用方式并入本文)。
另一个实施方案涉及将诊断或治疗剂或其组合递送至靶的方法，其包括(i)提供包含缀合到至少一种诊断剂和/或治疗剂上的抗胰腺癌抗体或片段例如PAM4抗体或片段的组合物，和(ii)将本文要求保护的抗体、抗体片段或融合蛋白中的任一者的诊断或治疗缀合物施用给需要它的受试者。
还涵盖将诊断剂、治疗剂或其组合递送至靶的方法，其包括：(a)向受试者施用对PAM4抗原有亲和性并包含一个或多个半抗原结合位点的多价、多特异性或双特异性抗体或其片段中的任一者；(b)等待足够长的时间以便未结合到PAM4抗原上的抗体从受试者血流中清除；和(c)向所述受试者施用包含诊断剂、治疗剂或其组合并可结合到所述抗体的结合位点上的载体分子。优选地，所述载体分子结合到所述抗体的一个以上的结合位点上。
本文描述了用于诊断或治疗癌症的方法，其包括(a)向受试者施用对PAM4抗原有亲和性并包含一个或多个半抗原结合位点的本文要求保护的多价、多特异性抗体或其片段中的任一者；(b)等待足够长的时间以便未结合抗体从受试者血流中清除；和(c)向所述受试者施用包含诊断剂、治疗剂或其组合并可结合到所述抗体的结合位点上的载体分子。在优选的实施方案中，所述癌症是胰腺癌。还优选地，所述方法可用于手术中鉴定患病组织、经内窥镜检查鉴定患病组织，或血管内鉴定患病组织。
另一个实施方案是治疗受试者的恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的结合到PAM4抗原上并任选地缀合到至少一种治疗剂上的抗体或其片段。所述抗体或其片段可以替代地为裸抗体或其片段。在更优选的实施方案中，所述抗体或片段在施用如上所述的另一种治疗剂之前施用、与它同时施用或在它之后施用。
本文涵盖诊断受试者的恶性肿瘤，特别是癌症的方法，其包括(a)向所述受试者施用包含可结合到PAM4抗原上的抗体或其片段的诊断缀合物，其中所述MAb或其片段缀合到至少一种诊断剂上；和(b)检测结合到胰腺癌细胞或其它恶性肿瘤细胞上的标记抗体的存在，其中所述抗体的结合是对胰腺癌或另一种恶性肿瘤的存在的诊断。在优选的实施方案中，所述抗体或片段结合到胰腺癌上，而不结合到正常胰腺组织、胰腺炎或其它非恶性病状上。在次优选的实施方案中，所述抗体或片段以与非恶性细胞相比显著较高的水平结合到癌细胞上，允许癌症与非恶性病状的鉴别诊断。在最优选的实施方案中，所述诊断剂可以是通过PET成像检测的F-18标记分子。
在更优选的实施方案中，使用抗胰腺癌抗体例如hPAM4抗体允许在恶性疾病最早期以高特异性和敏感度检测和/或诊断胰腺癌。优选地，所述诊断抗体或片段能够标记至少70%，更优选至少80%，更优选至少90%，更优选至少95%，最优选约100%的高分化、中分化和低分化的胰腺癌以及90%或更多的侵袭性胰腺腺癌。有用的抗胰腺癌抗体优选能够检测85%或更多的PanIN-1A、PanIN-1B、PanIN-2、IPMN和MCN前驱病变。最优选地，使用抗胰腺癌抗体的免疫测定能够检测89%或更多的总PanIN、86%或更多的IPMN以及92%或更多的MCN。
替代实施方案是通过体外分析血液、血浆或血清样品检测个体中的PAM4抗原和/或诊断个体的胰腺癌的方法。优选地，在针对利用抗胰腺癌抗体例如PAM4抗体的免疫检测处理样品之前，使用有机溶剂例如丁醇对它进行有机相萃取。有机相萃取之后，采用本领域已知的多种免疫测定技术中的任一种，例如ELISA、三明治免疫测定、固相RIA和类似技术对所萃取的水相分析所述样品中PAM4抗体的存在。令人惊讶地，有机相萃取除去了可结合到PAM4靶抗原上的PAM4抑制剂，使得新鲜血清样品中的PAM4靶抗原能被检测到。更令人惊讶地，利用本文所述的体外分析技术，可以分析血清样品来检测和/或诊断处于胰腺腺癌最早期的受试者的胰腺癌。这些意外结果提供了第一种基于血清的诊断早期胰腺癌的存在的测定技术。
另一个实施方案是治疗受试者的癌细胞的方法，其包括向所述受试者施用包含可结合到PAM4抗原上的裸抗体或其片段或者裸抗体融合蛋白或其片段的组合物。优选地，所述方法进一步包括施用选自由以下组成的组的第二裸抗体或其片段：CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、抗-CEA、抗-CEACAM6、抗-EGP-1、抗-EGP-2、抗-Lea、由路易斯抗原Le(y)定义的抗体，以及针对以下的抗体：CSAp、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、TAG-72、EGFR、CD40、HLA-DR、CD74、CD138、血管生成因子(例如，VEGF和胎盘样生长因子(PlGF))、胰岛素样生长因子(IGF)、肌腱蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、癌基因产物、cMET和HER2/neu。
又其它实施方案涉及诊断受试者的恶性肿瘤的方法，其包括(i)用包含可结合到PAM4抗原上的抗体或其片段的组合物对来自所述受试者的样本进行体外诊断分析；和(ii)检测结合到样本中恶性肿瘤细胞上的抗体或片段的存在。优选所述恶性肿瘤是癌症。还优选所述癌症是胰腺癌。
附图简述
图1.鼠PAM4抗体的可变区cDNA序列和推导的氨基酸序列。图1A示出鼠PAM4Vk的DNA(SEQ ID NO:9)序列和氨基酸(SEQ IDNO:10)序列。图1B示出鼠PAM4 VH的DNA(SEQ ID NO:11)序列和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。由相应DNA序列编码的氨基酸序列在核苷酸序列之下以单字母密码子给出。核苷酸序列的编号位居右侧。CDR区中的氨基酸残基用粗体和下划线表示。利用Kabat Ig分子编号对氨基酸残基进行编号，如氨基酸残基上面的编号所示。用字母编号的氨基酸残基是根据Kabat编号方案定义的插入残基。插入残基具有与前面残基之前的数字相同的数字。例如，图1B中的残基82、82A、82B和82C分别表示为82、A、B，和C。
图2.在Sp2/0细胞中表达的嵌合PAM4(cPAM4)重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。图2A示出cPAM4 Vk的氨基酸序列(SEQ IDNO:13)。图2B示出cPAM4 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。该序列以单字母密码子给出。CDR区中的氨基酸残基用粗体和下划线表示。氨基酸的编号与图1相同。
图3.人抗体、PAM4和hPAM4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列比对。图3A示出人抗体Walker(SEQ ID NO:15)与PAM4(SEQ ID NO:10)和hPAM4(SEQ ID NO:16)的VK氨基酸序列比对，图3B示出人抗体Wil2(FR1-3)(SEQ ID NO:17)和NEWM(FR4)(SEQ IDNO:18)与PAM4(SEQ ID NO:12)和hPAM4(SEQ ID NO:19)的VH氨基酸序列比对。圆点表示与人或人源化抗体相应残基相同的PAM4的残基。方框内区域代表CDR区。hPAM4的N端和C端残基(加下划线)都用所用的分期载体固定。利用Kabat Ig分子编号方案对残基进行编号，如同图1。
图4.在Sp2/0细胞中表达的人源化PAM4(hPAM4)重链可变区和轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图4A示出hPAM4VK的DNA(SEQ ID NO:20)序列和氨基酸(SEQ ID NO:16)序列，图4B示出hPAM4 VH的DNA(SEQ ID NO:21)序列和氨基酸(SEQ ID NO:19)序列。核苷酸序列的编号位居右侧。由相应DNA序列编码的氨基酸序列以单字母密码子给出。CDR区中的氨基酸残基用粗体加下划线表示。利用Kabat Ig分子编号方案对氨基酸残基进行编号，如同图1A和图1B。
图5.人源化PAM4抗体hPAM4与嵌合PAM4 cPAM4的结合活性比较。hPAM4用菱形表示，cPAM4用实心圆表示。当与结合到CaPan1抗原上的125I-cPAM4竞争时，结果表明hPAM4抗体和cPAM4的相当的结合活性。
图6.用分次90Y-hPAM4加吉西他滨治疗的不宜手术的转移性胰腺癌患者在治疗前(左侧)和治疗后(右侧)的PET/CT融合图像。圆圈指示原发病变的位置，其显示在治疗后PET/CT强度显著降低。
图7.用分次90Y-hPAM4加吉西他滨治疗的不宜手术的转移性胰腺癌患者在治疗前(左侧)和治疗后(右侧)的3D PET图像。箭头指向原发病变位置(右侧)和转移瘤位置(左侧)，每个均显示在用放射性标记hPAM4加吉西他滨治疗之后PET图像强度显著降低。
图8.在存在或不存在预靶向性TF10双特异性抗胰腺癌粘蛋白抗体的情况下，利用111In-标记的diHSG肽(IMP 288)的肿瘤体内成像。图8A-小鼠示出肿瘤位置(箭头)。图8B示出在存在(上面)或不存在(下面)TF10双特异性抗体的情况下利用111In-标记IMP 288检测到的肿瘤。
图9.TF10、PAM4-IgG、PAM4-F(ab')2和单价bsPAM4化学缀合物(PAM4-Fab'x抗-DTPA-Fab')的示例性结合曲线。与靶粘蛋白抗原的结合通过ELISA测定法测量。
图10.CaPan1人胰腺癌异种移植物(～0.25g)的免疫闪烁成像。(A)注射双特异性TF10(80μg,5.07x10-10mol)，接着在16小时后施用111In-IMP-288(30μCi,5.07x10-11mol)的小鼠的图像。该图像是在3小时后获取的。增加图像本底的强度从而使其与施用单独111In-IMP-288(30μCi,5.07x10-11mol)时获得的图像强度匹配。(B)在给予单独111In-IMP-288的小鼠中未观察到靶向。(C)给予111In-DOTA-PAM4-IgG(20μCi,50μg)、在24小时之后成像的小鼠图像。虽然可见肿瘤，但在这个时间点仍然存在相当强的本底活性。
图11.荷有CaPan1人胰腺癌异种移植物(预靶向和IgG动物组的平均肿瘤重量+/-SD分别为0.28+/-0.21和0.10+/-0.06g)的裸小鼠中111In-DOTA-PAM4-IgG(20μCi,50μg)和TF10-预靶向的111In-IMP-288(80μg,5.07x10-10mol TF10，16小时后30μCi,5.07x10-11mol111In-IMP-288)的延长生物分布。
图12.用0.15mCi 90Y-hPAM4IgG或者0.25或0.50mCi TF10-预靶向的90Y-IMP-288对所形成的CaPan1肿瘤(~0.4cm3)进行的单次治疗的治疗活性。
图13.吉西他滨对PT-RAIT疗法的增强作用。
图14.西妥昔单抗与吉西他滨和PT-RAIT的组合的作用。
图15.利用基于PAM4的免疫测定的胰腺癌鉴别诊断。红色线表示基于ROC分析选定的阳性结果的截断水平。
图16.来自健康志愿者和处于不同分期的胰腺癌个体的患者血清中PAM4抗原的频率分布。
图17.PAM4血清免疫测定的ROC曲线。
图18.PAM4免疫测定的准确度确定为在2.40单位/mL的截断值处或之上测得的标称浓度的10%范围内。计算得线性趋势，方程为y=0.965x+0.174，拟合优度r2=0.999。
图19.患者血清中PAM4反应性抗原根据病期的频率分布。截断值=2.4单位/mL(红色线)。示出每个研究组的中位值(单位/mL)。
图20.针对基于PAM4的免疫测定执行情况的接受者操作特征(ROC)曲线；胰腺腺癌与健康成体的比较。提供了曲线下面积(AUC)和95%置信限的值。
详述
定义
除非另有说明，否则“一个”或“一种”表示一个(种)或多个(种)。
本文所用的“约”表示加或减10%。例如“约100”将包括介于90和110之间的任何数字。
本文所述的术语“PAM4抗体”包括鼠PAM4抗体、嵌合PAM4抗体、人源化PAM4抗体和人PAM4抗体。在优选的实施方案中，PAM4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的CDR序列。
本文所用的“PAM4抗原”是被PAM4抗体结合的抗原。在优选的实施方案中，通过用DTT或高碘酸盐处理PAM4抗原来抑制或阻止PAM4抗体的结合。在更优选的实施方案中，PAM4抗原是由胰腺癌细胞表达的粘蛋白如MUC-1或MUC-5的表位。
本文所用的“抗胰腺癌抗体”是表现出与PAM4抗体相同的诊断、治疗和结合特征的抗体。在优选的实施方案中，“抗胰腺癌抗体”与PAM4抗体结合到相同的表位上。
“非内分泌性胰腺癌”一般是指由外分泌胰腺产生的癌症。该术语不包括胰腺胰岛素瘤，而包括胰腺癌、胰腺腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌和巨细胞癌以及前驱病变，如胰腺上皮内瘤变(PanIN)、粘液性囊性赘生物(MCN)和胰腺内粘液性赘生物(IPMN)，它们是赘生性的，但还不是恶性的。术语“胰腺癌”和“非内分泌性胰腺癌”在本文互换使用。
本文所述的抗体是指全长(即，天然存在或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分，如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv等。无论何种结构，抗体片段所结合的抗原都与全长抗体所识别的抗原相同。术语“抗体片段”也包括由抗体可变区组成的分离片段，如由重链和轻链可变区组成的"Fv"片段，以及其中轻和重可变区由肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。
裸抗体是未缀合到治疗或诊断剂上的抗体或其片段。一般地，抗体分子的Fc部分提供效应子功能，例如补体介导的细胞毒性(CDC)和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，其启动可导致细胞裂解的机制。然而，Fc部分可能不是治疗功能所需要的，而是其它机制如信号诱导的凋亡发挥作用。裸抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体以及融合蛋白和某些重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
嵌合抗体是重组蛋白，其含有包括来源于一种物种的抗体，优选啮齿动物抗体的互补决定区(CDR)的可变结构域，而所述抗体分子的恒定结构域来源于人抗体恒定结构域。对于兽医学应用，所述嵌合抗体的恒定结构域可以来源于其它物种如猫或狗的恒定结构域。
人源化抗体是重组蛋白，其中来自一种物种的抗体，例如啮齿动物抗体的CDR已从所述啮齿动物抗体的重和轻可变链转移到人重和轻可变结构域(例如，构架区序列)中。所述抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，可以将亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的构架区氨基酸残基置换到人抗体构架区序列中。
人抗体是例如从已经过“工程化”从而在响应于抗原攻击时产生特定人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基因座元件引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源性鼠重链和轻链基因座的靶向性破坏。该转基因小鼠可以合成对特定抗原有特异性的人抗体，并且该小鼠可以用来生成人抗体分泌杂交瘤。从转基因小鼠获取人抗体的方法在Green等，NatureGenet.7:13(1994),Lonberg等，Nature 368:856(1994)，和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)中有描述。全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建，所有这些技术都是本领域已知的。参见，例如，McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)，该文献描述了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库于体外生成人抗体及其片段的方法。在这种技术中，将抗体可变结构域基因框内克隆到丝状噬菌体的较大或较小外壳蛋白基因中，并作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择还导致对编码表现出这些特性的抗体的基因的选择。以这种方式，噬菌体模拟B细胞的某些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，关于它们的综述参见，例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3:5564-571(1993)。人抗体也可以由体外激活的B细胞产生。参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号，其实施例部分以引用方式并入本文。
治疗剂是与抗体部分单独、同时或相继施用或者缀合到抗体部分，即抗体或抗体片段或亚片段上，并且可用于治疗疾病的化合物、分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、细胞毒性剂、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。下面更详细地描述了有用的治疗剂。
诊断剂是分子、原子或其它可检测部分，其可以通过缀合到抗体部分或可靶向构建体上施用，并且对于通过定位含有靶抗原的细胞来检测或诊断疾病有用。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料、造影剂、荧光化合物或分子和磁共振成像(MRI)或正电子发射断层成像(PET)扫描用增强剂(例如，顺磁离子)。优选地，所述诊断剂选自由放射性同位素、用于磁共振或PET成像的增强剂和荧光化合物组成的组。为了用放射性金属、顺磁离子或其它诊断阳离子加载抗体组分，可能需要使它与具有连接多个螯合基团以结合所述离子的长尾的试剂反应。这样的尾可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或其它衍生化链或可衍生链，所述螯合基团为例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、NETA、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。采用标准化学方法使螯合物偶联至抗体。所述螯合物通常通过能够以使免疫反应性损失最小、聚集和/或内部交联最小的方式与所述分子形成键的基团连接至抗体。用于使螯合物缀合到抗体上的其它较不寻常的方法和试剂公开在美国专利第4,824,659号中，该专利的实施例部分以引用方式并入。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围为60至4,000keV的诊断同位素一起用于放射成像，所述同位素为例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br。所述螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时可与本发明抗体一起用于MRI。大环螯合物如NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N″-三乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)和TETA(对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)可分别与多种金属和放射性金属，最特别是与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。本发明包括其它环类型的螯合物如大环聚醚，它们对于稳定地结合核素如用于放射免疫疗法(RAIT)的223Ra有价值。最近，用可用于PET成像的18F原子标记几乎任何分子的通用技术描述于美国专利第7,563,433号中，该专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
免疫缀合物是缀合到至少一种治疗剂和/或诊断剂上的抗体、抗体片段或抗体融合蛋白。所述诊断剂和/或治疗剂如上所定义。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，基因表达处于某些调节元件的控制之下，所述调节元件包括组成型启动子或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。据说此种基因“可操作地连接至”调节元件。
重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。这个术语还包括经基因工程化从而在宿主细胞染色体或基因组中含有克隆基因的那些原核或真核细胞以及转基因动物。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如SP2/0细胞和NS0细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、杂交瘤细胞系和其它可用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞。此外，用于表达mAb和其它融合蛋白的特别有用的宿主细胞是用凋亡抑制剂如Bcl-EEE基因转染并适应于在无血清条件下生长和进一步转染的SP2/0细胞，如美国专利第7,531,327号、第7,537,930号和第7,608,425号中描述的，这些专利的实施例部分以引用方式并入本文。
PAM4抗体
本发明各种实施方案涉及相对于正常或良性胰腺组织以非常高的选择性与胰腺癌反应的抗体。所述抗胰腺癌抗体及其片段优选针对来自人胰腺肿瘤的粗粘蛋白制剂产生，虽然可以利用部分纯化或甚至纯化的粘蛋白。此类抗体的非限制性实例为PAM4抗体。
鼠PAM4(mPAM4)抗体通过采用来源于异种移植的RIP-1人胰腺癌的胰腺癌粘蛋白作为免疫原来制备。(Gold等，Int.J.Cancer,57:204-210,1994)。如下所讨论，抗体交叉反应性和免疫组织化学染色研究表明PAM4抗体识别靶胰腺癌抗原上的独特的新表位。免疫组织化学染色研究，例如实施例2中所描述的研究，已证明PAM4 MAb结合到由乳腺癌、胰腺癌和其它癌症细胞表达的抗原上，与正常人组织的结合受限；然而，最高的表达通常来自胰腺癌细胞。因而，PAM4抗体对胰腺癌有相对特异性，并优先结合胰腺癌细胞。PAM4抗体与可内化的靶表位起反应。这个表位主要由与胰腺癌相关而与局灶性胰腺炎或正常胰腺组织无关的抗原表达。PAM4抗体与PAM4抗原的结合通过用DTT或高碘酸盐处理所述抗原来抑制。在动物模型中使用放射性标记PAM4MAb进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向性和治疗效力。
PAM4抗体结合到PAM4抗原上，PAM4抗原由许多器官和肿瘤类型表达，但优先表达于胰腺癌细胞中。利用例如实施例3中的PAM4MAb进行的研究表明，所述抗体表现出数种重要的特性，使其成为临床诊断和治疗应用的良好候选物。PAM4抗原提供了对于胰腺癌和其它癌症的诊断和治疗有用的靶。PAM4抗体显然识别出胰腺癌抗原的表位，其与由非PAM4抗胰腺癌抗体(CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、CEACAM5、B72.3、抗-Lea和其它抗路易斯抗原)识别的表位不同。
令人惊讶地，下面的实施例表明患有非常早期的胰腺癌患者的血清中存在可检出浓度的PAM4抗原。还令人惊讶的是，新鲜人血清中似乎存在可结合到PAM4抗原上的PAM4抗体的内源性抑制剂。所述抑制剂通过长期冷冻储存血清样品除去，或通过对新鲜血清进行有机相萃取除去。这些意外的结果为利用血液、血清或血浆样品进行的相对非侵入性的胰腺癌早期测试提供了基础。
对于治疗使用，适合于与PAM4抗体组合使用或结合使用的抗体包括，例如，抗体CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、抗-CEA、抗-CEACAM6、抗-Lea、抗-HLA-DR、抗-CD40、抗-CD74、抗-CD138，和由路易斯抗原Le(y)定义的抗体，或针对以下的抗体：结肠特异性抗原-p(CSAp)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、EGP-1、EGP-2、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例如VEGF和PlGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌腱蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6及癌基因产物(bcl-2、Kras、p53)、cMET，以及针对肿瘤坏死物质的抗体，例如授予Epstein等的专利(美国专利第6,071,491号、第6.017,514号、第5,019,368号和第5,882,626号)中描述的。此类抗体可用于补充PAM4抗体免疫检测和免疫治疗方法。当在PAM4抗体施用之前施用、与PAM4抗体一起施用或在PAM4抗体施用之后施用时，这些和其它治疗剂可以与抗胰腺癌抗体如PAM4抗体协同作用。
在治疗应用中，与抵抗肿瘤细胞的效应细胞功能有关的免疫调节剂激动或拮抗性抗体也可以与单独的PAM4抗体组合使用，或者与其它肿瘤相关性抗体组合使用，一个实例是针对CD40的抗体。Todryk等，J.Immunol Methods,248:139-147(2001);Turner等，J.Immunol,166:89-94(2001)。此外，也可使用针对标记或癌基因产物(例如，bcl-2、Kras、p53、cMET)的抗体，或针对血管生成因子，如VEGFR和胎盘样生长因子(PlGF)的抗体。
另一种可结合到PAM4抗原不同表位上的PAM4样抗体的可利用性对于可用来检测临床样品中PAM4抗原的双决定簇酶联免疫吸附测定(ELISA)的开发是重要的。ELISA实验描述于实施例1和5中。
本文所述的鼠PAM4抗体、嵌合PAM4抗体、人源化PAM4抗体和全人PAM4抗体及其片段是用于诊断和/或治疗方法中的示例性抗胰腺癌抗体。下面的实施例公开了人源化PAM4抗体的构建和使用的优选实施方案。因为非人单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白，并且重复注射可以导致有害的超敏反应，所以鼠抗体序列的人源化可以减少患者可能经历的不良免疫响应。对于基于鼠的单克隆抗体，这通常称为人抗小鼠抗体(HAMA)响应。优选将人源化抗胰腺癌抗体或其片段的构架区中的某些人残基用它们的鼠对应物替代。还优选将来自两种不同人抗体的构架序列的组合用于VH。所述抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。
抗体制备
针对特定抗原的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法获得。参见，例如，Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)，和Coligan等，(编著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)(在下文称为"Coligan")。简言之，抗胰腺癌MAb可以通过如下方法获得：给小鼠注射包含来自胰腺癌的粘蛋白例如PAM4抗原的组合物，通过取出血清样品来证实抗体产生的存在，取出脾脏从而获得B淋巴细胞，使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对PAM4抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对PAM4抗原的抗体的克隆，和从杂交瘤培养物中分离出抗胰腺癌抗体。
在初始产生针对所述免疫原的抗体之后，可以对所述抗体进行测序，随后通过重组技术来制备所述抗体从而产生嵌合抗体或人源化抗体。鼠抗体和抗体片段的嵌合是本领域技术人员熟知的。来源于嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用减少与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的通用技术在例如以下出版物中有描述：Orlandi等，Proc Nat'l Acad.Sci.USA 86:3833(1989)，其以引用方式并入本文。一般而言，鼠抗体的VK(轻链可变区)和VH(重链可变区)序列可以通过多种分子克隆程序，例如RT-PCR、5'-RACE和cDNA文库筛选获得。具体地，通过RT-PCR，通过PCR扩增从杂交瘤细胞中克隆出鼠PAM4 MAb的VH和VK序列，然后通过DNA测序测定它们的序列。为了证实它们的真实性，可以按照Orlandi等，(Proc Natl.Acad.Sci.,USA,86:3833,1989)所述使克隆的VK和VH基因在细胞培养物中表达为嵌合Ab。
在优选的实施方案中，嵌合PAM4抗体或抗体片段包含鼠PAM4MAb的互补决定区(CDR)和构架区(FR)以及人抗体的轻链和重链恒定区，其中嵌合PAM4的轻链可变区的CDR包含：包含SASSSVSSSYLY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、包含STSNLAS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR2，和包含HQWNRYPYT(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR3；并且嵌合PAM4 MAb的重链可变区的CDR包含：包含SYVLH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR1、包含YINPYNDGTQYNEKFKG(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列的CDR2和包含GFGGSYGFAY(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR3。来源于嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用减少与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
鼠抗体和抗体片段的人源化也是本领域技术人员熟知的。生成人源化MAb的技术公开在例如以下文献中：Carter等，Proc Nat'l Acad.Sci.USA 89:4285(1992),Singer等，J.Immun.150:2844(1992),Mountain等，Biotechnol Genet Eng Rev.10:1(1992)，和Coligan第10.19.1-10.19.11页，这些文献以引用方式并入本文。例如，可以通过将来自小鼠免疫球蛋白重和轻可变链的鼠互补决定区转移到人可变结构域中，然后取代鼠对应物构架区中的人残基，产生人源化单克隆抗体。除了人恒定区序列之外，人构架区序列的使用还进一步减少诱导HAMA反应的概率。
按照Leung等(Mol Immunol.32:1413(1995))所描述，可以基于如上所述获得的PAM4可变区序列，设计和构建人源化PAM4抗体，该文献以引用方式并入本文。实施例1描述了用于构建hPAM4 MAb的人源化方法。
用于制备hPAM4抗体的引物的核苷酸序列在下面的实施例1中有讨论。在优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或抗体片段包含上面所公开的轻链和重链CDR序列(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6)。还优选所述人源化抗体的轻链和重链可变区的FR包含至少一种被鼠PAM4 MAb的所述相应FR取代的氨基酸。
全人抗体，例如人PAM4可以从转基因非人动物中获得。参见，例如，Mendez等，Nature Genetics,15:146-156(1997)；美国专利第5,633,425号。例如，可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中回收人抗体。通过灭活内源免疫球蛋白基因和引入人免疫球蛋白基因座，将小鼠体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂，并包含大量的不连续区段，这些不连续区段总共几乎占据人基因组的0.2%。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体库，必须将人重链和轻链基因座的大部分引入小鼠基因组中。这以分步法完成，从在种系构型中含有人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)的形成开始。因为每个插入片段大小约为1Mb，所以YAC构建需要免疫球蛋白基因座的重叠片段的同源重组。通过使含有YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞融合将一个含有重链基因座而另一个含有轻链基因座的两个YAC单独地引入小鼠中。然后将胚胎干细胞克隆显微注射到小鼠囊胚中。根据通过其种系传输YAC的能力筛选所得嵌合雄鼠，然后使其与鼠抗体产生缺陷型小鼠品种。繁育两个转基因品系，一个含有人重链基因座，另一个含有人轻链基因座，产生在响应于免疫时产生人抗体的后代。然而，这些技术不是限制性的，也可以采用本领域已知的生成人抗体的其它方法，例如使用噬菌体展示来生成人抗胰腺癌抗体。
可以采用本领域已知的方法通过细胞培养技术生成抗体。在一个实例中，转染瘤培养物适应于无血清培养基。为了生成人源化抗体，使用HSFM使细胞在滚瓶内生长成500ml培养物。离心培养物，并通过0.2μm膜过滤上清液。使过滤的培养基以1ml/min的流速通过蛋白A柱(1x3cm)。然后用约10个柱体积的PBS洗涤树脂，并用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.5)从柱上洗脱蛋白A结合的抗体。将1.0ml级分收集在含有10μl 3 M Tris(pH 8.6)的管中，从280/260nm处的吸光度确定蛋白质浓度。汇集峰级分，对PBS透析，例如用Centricon 30过滤器(Amicon,Beverly,MA)浓缩抗体。通过ELISA测定抗体浓度，并使用PBS将其浓度调节至约1mg/ml。向样品中适当地加入0.01%(w/v)叠氮化钠作为防腐剂。
可以通过多种良好建立(well-established)的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化抗体。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱、体积排阻色谱和离子交换色谱。参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另外，参见Baines等，"Purificationof Immunoglobulin G(IgG),"，于METHODS IN MOLECULARBIOLOGY，第10卷，第79-104页(The Humana Press,Inc.1992)。
可以通过本领域技术人员熟知的多种技术表征抗胰腺癌MAb。例如，可以利用间接酶免疫测定、流式细胞仪分析、ELISA或蛋白质印迹分析验证抗体结合至PAM4抗原的能力。
抗体片段
抗体片段是抗体的抗原结合部分，例如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、scFv等。识别特定表位的抗体片段可以通过已知技术产生。F(ab′)2片段，例如可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生。这些和其它方法描述于，例如Goldenberg，美国专利第4,036,945号和第4,331,647号以及其中所包含的参考文献中。另外，参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J.73:119(1959),Edelman等，于METHODS IN ENZYMOLOGY，第1卷，第422页(Academic Press 1967)，和Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。或者，可以构建Fab'表达文库(Huse等，1989,Science,246:1274-1281)，以允许快速且容易地鉴定出具有所需特异性的单克隆Fab’片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL结构域和VH结构域联合形成靶结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。如果VL结构域是scFv分子的N端部分，则scFv分子表示为VL-L-VH，或者如果VH结构域是scFv分子的N端部分，则scFv分子表示为VH-L-VL。用于制备scFv分子和设计合适的肽接头的方法描述于美国专利第4,704,692号，美国专利第4,946,778号，R.Raag和M.Whitlow，"Single Chain Fvs."FASEB，第9卷：73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker,Single Chain Antibody Variable Regions,TIBTECH，第9卷：132-137(1991)。
其它抗体片段，例如单结构域抗体片段是本领域已知的，并可以用于要求保护的构建体中。可以例如采用标准免疫技术从骆驼(camel)、羊驼(alpaca)或美洲驼(llama)中获得单结构域抗体(VHH)。(参见，例如，Muyldermans等，TIBS 26:230-235,2001;Yau等，J ImmunolMethods 281:161-75,2003;Maass等，J Immunol Methods 324:13-25,2007)。该VHH可以具有强大的抗原结合能力，并可以与常规VH-VL对所不可及的新表位相互作用。(Muyldermans等，2001)。羊驼血清IgG含有约50%的只有骆驼重链的IgG抗体(HCAb)(Maass等，2007)。可以用已知抗原如TNF-α免疫羊驼，然后可以分离出结合到靶抗原上并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并可以将它用来构建羊驼VHH噬菌体展示文库，可利用所述文库通过本领域熟知的标准生物淘选技术(Maass等，2007)分离抗体片段。
可通过使全长抗体蛋白水解或者通过在大肠杆菌或另一宿主中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。可采用常规方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶裂解抗体来产生抗体片段，从而提供称为F(ab′)2的约100Kd片段。这种片段可以利用硫醇还原剂和任选的用作由二硫键裂解形成的巯基的保护基进一步裂解，从而产生约50Kd Fab'单价片段。或者，利用木瓜蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。
也可以使用裂解抗体的其它方法，如分离重链从而形成单价轻链-重链片段，片段的进一步裂解，或其它酶、化学或遗传技术，只要所述片段可结合到由完整抗体识别的抗原上即可。
抗体融合蛋白和多价抗体
包含目标抗胰腺癌抗体的融合蛋白可以通过多种常规程序制备，范围为从官能团之间的戊二醛连接至更多特定连接。包含本文所述的融合蛋白的抗体和/或抗体片段优选彼此直接共价结合或通过接头部分，通过抗体或片段上的一个或多个官能团，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基而共价结合。除戊二醛之外，还可以使用各种常规接头，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯等。
用于生成融合蛋白的一个简单方法是在戊二醛的存在下混合抗体或抗体片段。初始的希夫(schiff)碱键合可以例如通过用硼氢化物将其还原成仲胺来稳定化。可以用二异硫氰酸酯或碳二亚胺代替戊二醛作为非位点特异性接头。在一个实施方案中，抗体融合蛋白包含抗胰腺癌MAb或其片段，其中所述MAb可结合到PAM4抗原上。这种融合蛋白及其片段优先结合胰腺癌细胞。这种单价单特异性MAb可用于直接靶向抗原，其中所述MAb连接至治疗剂、诊断剂或其组合，并且将蛋白质直接施用给患者。
所述融合蛋白可以替代地包含可结合到PAM4抗原不同表位上的至少两种抗胰腺癌MAb。例如，所述MAb可以产生抗原特异性双链抗体、三链抗体和四链抗体，它们对于PAM4抗原是多价的但为单特异性的。两个或更多个scFv分子的非共价缔合可以形成功能性双链抗体、三链抗体和四链抗体。单特异性双链抗体是相同scFv的同型二聚体，其中每个scFv均包含来自所选抗体的VH结构域，其通过短接头连接至相同抗体的VL结构域。双链抗体是由两个scFv的非共价缔合形成的二价二聚体，产生两个Fv结合位点。三链抗体是由三个scFv形成的三价三聚体，产生三个结合位点，四链抗体是由四个scFv形成的四价四聚体，产生四个结合位点。已使用含有包含VH1-接头-VL1的重组基因构建体的表达载体制备数种单特异性双链抗体。参见，Holliger等，Proc Natl.Acad.Sci USA 90:6444-6448(1993);Atwell等，Molecular Immunology 33:1301-1302(1996);Holliger等，Nature Biotechnology 15:632-631(1997);Helfrich等，Int J Cancer 76:232-239(1998);Kipriyanov等，Int J Cancer 77:763-772(1998);Holiger等，Cancer Research 59:2909-2916(1999))。构建scFv的方法公开在美国专利第4,946,778号(1990)和美国专利第5,132,405号(1992)中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。基于scFv生成多价单特异性抗体的方法公开在美国专利第5,837,242号(1998)、美国专利第5,844,094号(1998)和WO-98/44001(1998)中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。所述多价单特异性抗体融合蛋白结合到两个或更多个相同类型的表位上，所述表位可以位于相同的抗原或不同的抗原上。增加的化合价允许额外的相互作用、增加的亲和性和更长的停留时间。这些抗体融合蛋白可以用于直接靶向系统中，其中所述抗体融合蛋白缀合到治疗剂、诊断剂或其组合上，并直接施用给需要它的患者。
优选的实施方案是多价多特异性抗体或其片段，其包含一个或多个对PAM4靶表位有亲和性的抗原结合位点，和一个或多个另外的针对与胰腺癌相关的其它表位的结合位点。这种融合蛋白是多特异性的，因为它结合至少两个不同的表位，该表位可位于相同或不同的抗原上。例如，所述融合蛋白可以包含一个以上的抗原结合位点，第一抗原结合位点对PAM4抗原表位有亲和性，第二抗原结合位点对另一种靶抗原如TAG-72或CEA有亲和性。另一个实例是可包含CA19.9MAb(或其片段)和PAM4 MAb(或其片段)的双特异性抗体融合蛋白。此种融合蛋白将对CA19.9和PAM4抗原有亲和性。所述抗体融合蛋白及其片段可以用于直接靶向系统中，其中所述抗体融合蛋白缀合到治疗剂、诊断剂或其组合上，并直接施用给需要它的患者。
另一个优选的实施方案是多价多特异性抗体，其包含至少一个对PAM4抗原表位有亲和性的结合位点和至少一个对半抗原分子有亲和性的半抗原结合位点。例如，双特异性融合蛋白可以包含679MAb(或其片段)和PAM4 MAb(或其片段)。单克隆679抗体以高亲和性结合到含有三肽部分组胺琥珀酰亚胺甘氨酰(HSG)的分子上。如上所述，此种双特异性PAM4抗体融合蛋白可以例如通过获得来自679的F(ab′)2片段来制备。用DTT温和地还原679F(ab')2片段的链间二硫桥键，需小心避免轻链-重链键合形成，从而形成Fab'-SH片段。该SH基团用过量的双马来酰亚胺接头(1,1'-(亚甲基二-4,1-亚苯基)双-马来酰亚胺)活化。将PAM4 MAb转化成Fab'-SH，然后使其与活化的679 Fab'-SH片段反应从而获得双特异性抗体融合蛋白。双特异性抗体融合蛋白例如这种蛋白可以用于亲和性增强系统中，其中所述靶抗原用融合蛋白进行预靶向，随后用连接至含有一种或多种HSG半抗原的载体部分(可靶向构建体)的诊断或治疗剂靶向。在替代的优选实施方案中，基于DNL的hPAM4-679构建体，如TF10可以按照下面的实施例中所描述的方法制备和使用。
双特异性抗体可以通过多种常规方法和基因工程制备，所述常规方法为例如完整IgG或优选F(ab')2片段的混合物的二硫化物裂解和重新形成，一个以上的杂交瘤融合以形成产生具有一种以上的特异性的抗体的多瘤(polyoma)。已通过氧化裂解由不同抗体的还原裂解产生的Fab'片段来制备双特异性抗体融合蛋白。这可有利地如下进行：将由两种不同的抗体的胃蛋白酶消化产生的两种不同的F(ab')2片段混合，还原裂解从而形成Fab'片段混合物，接着氧化重新形成二硫键从而产生Fab'片段混合物，其包括含有对每个原始表位有特异性的Fab'部分的双特异性抗体融合蛋白。制备抗体融合蛋白的通用技术可见于例如Nisonoff等，Arch Biochem Biophys.93:470(1961),Hammerling等，J Exp Med.128:1461(1968)，和美国专利第4,331,647号。
更具选择性的键合可以通过使用异型双功能接头如马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯实现。所述酯与抗体或片段的反应将使所述抗体或片段上的氨基衍生化，然后所得衍生物可以与，例如具有游离巯基的抗体Fab片段(或具有通过例如Traut试剂附接在其上的巯基的较大片段或完整抗体)反应。此种接头与同一抗体中的基团交联的可能性较小，并提高键合的选择性。
将抗体或片段在远离抗原结合位点的位点处连接是有利的。这可以通过，例如对如上所述的裂解的链间巯基进行连接来完成。另一种方法涉及使具有氧化糖部分的抗体与另一种具有至少一个游离胺官能的抗体反应。这产生初始希夫碱键合，所述希夫碱键合优选通过还原成仲胺来稳定化，例如通过硼氢化物还原，从而形成最终的复合物。对于小分子，此类位点特异性键合公开在美国专利第4,671,958号中，而对于较大附加物则公开在美国专利第4,699,784号中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。
具有长度大于12个氨基酸残基的接头(例如，15个或18个残基接头)的ScFv允许在同一链上的VH和VL结构域之间相互作用，一般形成单体、二聚体(称为双链抗体)和少量较高质量的多聚体的混合物(Kortt等人，Eur J Biochem.(1994)221:151-157)。然而，具有5个或更少氨基酸残基的接头的ScFv阻止同一链上的VH和VL结构域的分子内配对，迫使与不同链上的VH和VL结构域配对。介于3个残基和12个残基之间的接头主要形成二聚体(Atwell等，Protein Engineering(1999)12:597-604)。对于介于0个残基和2个残基之间的接头，形成scFv的三聚体(称为三链抗体)、四聚体(四链抗体)或更高的寡聚结构；然而，除接头长度之外，寡聚化的确切模式似乎还取决于V结构域的组成和取向。
最近，用于构建几乎任何组合中的抗体、抗体片段和/或其它效应部分的混合物的新技术已描述于美国专利第7,550,143号、第7,521,056号、第7,534,866号、第7,527,787号和第7,666,400号中，每篇专利的实施例部分以引用方式并入本文。该技术一般称为停靠和锁定(DNL)，涉及在其N或C端包含两个互补肽序列之一的融合蛋白的生成，所述两个互补肽序列称为二聚化和停靠结构域(DDD)序列和锚定结构域(AD)序列。在优选的实施方案中，DDD序列来源于cAMP依赖性蛋白激酶的调节亚基，而AD序列来源于A激酶锚定蛋白(AKAP)的序列。DDD序列形成结合到AD序列上的二聚体，这允许三聚体、四聚体、六聚体或多种其它复合物中的任一种的形成。通过将效应部分如抗体或抗体片段连接至DDD和AD序列，可以由任何所选的抗体或抗体片段的组合形成复合物。DNL复合物可以通过形成二硫键或其它键合而共价稳定化。
已知抗体
可以利用包含任何已知抗-TAA抗体的抗原结合可变区序列的双特异性抗体，其包括但不限于hPAM4(美国专利第7,282,567号)、hA20(美国专利第7,251,164号)、hA19(美国专利第7,109,304号)、hIMMU31(美国专利第7,300,655号)、hLL1(美国专利第7,312,318号)、hLL2(美国专利第7,074,403号)、hMu-9(美国专利第7,387,773号)、hL243(美国专利第7,612,180号)、hMN-14(美国专利第6,676,924号)、hRS7(美国专利第7,238,785号)、hMN-3(美国专利第7,541,440号)、hMN-15(2010年7月29日提交的美国专利申请序列第12/846,062号)和hR1(2010年3月12日提交的美国专利申请序列第12/772,645号)，所列举的每篇专利或专利申请的实施例部分均以引用方式并入本文。
其它有用的抗体可以从多种已知来源商购获得。例如，多种抗体分泌杂交瘤是得自美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(ATCC,Manassas,VA)。针对包括但不限于肿瘤相关抗原的各种疾病靶的大量抗体已经保藏在ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可用于要求保护的方法和组合物中。参见，例如，美国专利第7,312,318号、第7,282,567号、第7,151,164号、第7,074,403号、第7,060,802号、第7,056,509号、第7,049,060号、第7,045,132号、第7,041,803号、第7,041,802号、第7,041,293号、第7,038,018号、第7,037,498号、第7,012,133号、第7,001,598号、第6,998,468号、第6,994,976号、第6,994,852号、第6,989,241号、第6,974,863号、第6,965,018号、第6,964,854号、第6,962,981号、第6,962,813号、第6,956,107号、第6,951,924号、第6,949,244号、第6,946,129号、第6,943,020号、第6,939,547号、第6,921,645号、第6,921,645号、第6,921,533号、第6,919,433号、第6,919,078号、第6,916,475号、第6,905,681号、第6,899,879号、第6,893,625号、第6,887,468号、第6,887,466号、第6,884,594号、第6,881,405号、第6,878,812号、第6,875,580号、第6,872,568号、第6,867,006号、第6,864,062号、第6,861,511号、第6,861,227号、第6,861,226号、第6,838,282号、第6,835,549号、第6,835,370号、第6,824,780号、第6,824,778号、第6,812,206号、第6,793,924号、第6,783,758号、第6,770,450号、第6,767,711号、第6,764,688号、第6,764,681号、第6,764,679号、第6,743,898号、第6,733,981号、第6,730,307号、第6,720,15号、第6,716,966号、第6,709,653号、第6,693,176号、第6,692,908号、第6,689,607号、第6,689,362号、第6,689,355号、第6,682,737号、第6,682,736号、第6,682,734号、第6,673,344号、第6,653,104号、第6,652,852号、第6,635,482号、第6,630,144号、第6,610,833号、第6,610,294号、第6,605,441号、第6,605,279号、第6,596,852号、第6,592,868号、第6,576,745号、第6,572;856号、第6,566,076号、第6,562,618号、第6,545,130号、第6,544,749号、第6,534,058号、第6,528,625号、第6,528,269号、第6,521,227号、第6,518,404号、第6,511,665号、第6,491,915号、第6,488,930号、第6,482,598号、第6,482,408号、第6,479,247号、第6,468,531号、第6,468,529号、第6,465,173号、第6,461,823号、第6,458,356号、第6,455,044号、第6,455,040号、6,451,310号、第6,444,206号、6,441,143号、第6,432,404号、第6,432,402号、第6,419,928号、第6,413,726号、第6,406,694号、第6,403,770号、第6,403,091号、第6,395,276号、第6,395,274号、第6,387,350号、第6,383,759号、第6,383,484号、第6,376,654号、第6,372,215号、第6,359,126号、第6,355,481号、第6,355,444号、第6,355,245号、第6,355,244号、第6,346,246号、第6,344,198号、第6,340,571号、第6,340,459号、第6,331,175号、第6,306,393号、第6,254,868号、第6,187,287号、第6,183,744号、第6,129,914号、第6,120,767号、第6,096,289号、第6,077,499号、第5,922,302号、第5,874,540号、第5,814,440号、第5,798,229号、第5,789,554号、第5,776,456号、第5,736,119号、第5,716,595号、第5,677,136号、第5,587,459号、第5,443,953号和第5,525,338号，其中的每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。这些仅为示例性的，多种其它抗体及其杂交瘤是本领域已知的。技术人员将会意识到，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤都可以通过在ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中简单地检索针对选定的目标疾病相关靶的抗体而获得。可以采用本领域熟知的标准技术，对克隆的抗体的抗原结合结构域进行扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适应的宿主细胞中并用于蛋白质生成。
预靶向
双特异性或多特异性抗体可以用于预靶向技术中。预靶向是多步骤过程，最初开发用于解决直接靶向抗体的血液清除缓慢，导致对正常组织如骨髓造成不期望的毒性的问题。利用预靶向，放射性核素或其它治疗剂连接至小递送分子(可靶向构建体或可靶向缀合物)上，这种小分子可在几分钟内从血液中清除。首先施用具有针对可靶向构建体和靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，使游离抗体从循环中清除，然后施用可靶向构建体。
预靶向方法是本领域熟知的，例如，如以下所公开的：Goodwin等，美国专利第4,863,713号；Goodwin等，J.Nucl.Med.29:226,1988;Hnatowich等，J.Nucl.Med.28:1294,1987;Oehr等，J.Nucl.Med.29:728,1988;Klibanov等，J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos等，J.Nucl.Med.31:1791,1990;Schechter等，Int.J.Cancer 48:167,1991;Paganelli等，Cancer Res.51:5960,1991;Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12:211,1991；美国专利第5,256,395号；Stickney等，Cancer Res.51:6650,1991;Yuan等，Cancer Res.51:3119,1991;美国专利第6,077,499号；美国专利第6,090,381号；美国专利第6,472,511号；和美国专利第6,962,702号。
治疗或诊断受试者的疾病或病症的预靶向方法可以通过如下提供：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗原结合抗体片段；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并允许所述组合物从循环中清除抗体；和(3)向受试者施用含有一种或多种螯合或化学结合的治疗剂或诊断剂的可靶向构建体。该技术也可以用于抗体依赖性酶前药疗法(ADEPT)，方法是施用缀合到可靶向构建体上的酶，接着施用可被所述酶转化成活性形式的前药。
抗体的治疗和诊断用途
某些实施方案涉及诊断或治疗受试者的恶性肿瘤的方法，其包括向受试者施用抗胰腺癌MAb、融合蛋白或其片段，其中所述MAb、融合蛋白或片段结合到至少一种诊断剂和/或治疗剂上。还优选诊断或治疗癌症的方法，其包括向受试者施用包含一个或多个针对PAM4抗原的抗原结合位点和一个或多个半抗原结合位点的多价多特异性抗体或其片段，等待足够长的时间以便未结合抗体从受试者血流中清除；和然后向受试者施用包含诊断剂、治疗剂或其组合并可结合到定位抗体的半抗原结合位点上的载体分子。在更优选的实施方案中，所述癌症是非内分泌性胰腺癌。
MAb在体外诊断中的用途是熟知的。参见，例如，Carlsson等，Bio/Technology 7(6):567(1989)。例如，可以利用MAb检测来自活检样品的组织中肿瘤相关抗原的存在。采用诸如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定和荧光免疫测定的技术，MAb也可用来测量临床流体样品中肿瘤相关抗原的量。下面进一步详细讨论体外和体内诊断方法。
肿瘤靶向的MAb和毒素的缀合物可以用来在体内选择性地灭杀癌细胞(Spalding,Bio/Technology 9(8):701(1991);Goldenberg,Scientific American Science & Medicine 1(1):64(1994))。例如，在实验性动物模型中进行的治疗研究已证明携带细胞毒放射性核素的抗体的抗肿瘤活性(Goldenberg等，Cancer Res.41:4354(1981),Cheung等，J.Nat'l Cancer Inst.77:739(1986)，和Senekowitsch等，J.Nucl.Med.30:531(1989))。在优选的实施方案中，所述缀合物包含90Y标记的hPAM4抗体。所述缀合物可任选地与一种或多种其它治疗剂结合施用。在优选的实施方案中，将90Y标记的hPAM4与吉西他滨或5-氟尿嘧啶一起施用给胰腺癌患者。在进一步优选的实施方案中，90Y缀合到用于连接至hPAM4的DOTA螯合物上。在又进一步优选的实施方案中，90Y-DOTA-hPAM4与吉西他滨以分次给药方式组合，包括，例如其中重复的较低的低毒性剂量的吉西他滨与较低的分次剂量的90Y-DOTA-hPAM4组合的治疗周期。
因为能耐受，所以这种分次给药方案的重复周期是适用的。举例来说，每周4剂200mg/m2吉西他滨与每周3剂8mg/m2 90Y-DOTA-hPAM4组合，构成单个治疗周期，后者开始于吉西他滨施用的第二周。每种组分的又其它较高和较低的剂量也可构成分次剂量，分次剂量由评估造血毒性的常规方式确定(参见，例如，美国专利第6,649,352号、第7,112,409号、第7,279,289号、第7,465,551号)，因为这两种药剂的骨髓抑制作用可以累加。此种治疗干预的医师可以根据患者的骨髓状态和总体健康状态，根据包括先前暴露于骨髓抑制治疗剂在内的许多因素调整这些剂量。这些原则也可应用于放射性标记hPAM4与包括放射增敏药物例如5-氟尿嘧啶和顺铂在内的其它治疗剂的组合。
嵌合抗体、人源化抗体和人抗体及其片段已用于体内治疗和诊断方法。因此涵盖将诊断剂或治疗剂或其组合递送至靶的方法，其包括(i)提供包含缀合到至少一种诊断剂和/或治疗剂上的抗胰腺癌抗体或其片段(如嵌合、人源化或人PAM4抗体)的组合物，和(ii)将所述诊断或治疗抗体缀合物施用给受试者。在优选的实施方案中，抗胰腺癌抗体及其片段是人源化或全人的。
另一个实施方案涉及治疗恶性肿瘤的方法，其包括施用裸抗胰腺癌抗体、抗体片段或融合蛋白，例如PAM4抗体，单独施用或与一种或多种其它治疗剂结合施用。所述其它治疗剂可以在所述抗体之前、与所述抗体同时，或在所述抗体之后加入。在优选的实施方案中，所述治疗剂是吉西他滨，并且在更优选的实施方案中，吉西他滨与hPAM4放射性缀合物一起按分次给药方案给予，以低于每周给予一次持续6周的吉西他滨的常规800-1,000mg/m2剂量的剂量。例如，当与分次治疗剂量的90Y-PAM4组合时，重复输注旨在用作放射增敏剂的200-380mg/m2吉西他滨分次剂量。技术人员将会意识到，本文描述和要求保护的抗体、融合蛋白和/或其片段可以与包括但不限于热休克蛋白质90(Hsp90)的任何已知或描述的治疗剂一起施用。
在另一种形式的多元模式治疗中，受试者接受与标准癌症化疗结合的免疫缀合物。例如，"CVB"(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷(Etoposide)和150-200mg/m2卡莫司汀(carmustine))是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗方案。Patti等，Eur.J.Haematol.51:18(1993)。其它合适的组合化疗方案是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Freedman等，"Non-Hodgkin's Lymphomas,"于CANCERMEDICINE，第2卷，第三版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea& Febiger 1993)。举例来说，中间级非霍奇金淋巴瘤(NHL)治疗的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、甲基苄肼(procarbazine)和强的松(prednisone))和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)。有用的第二代化疗方案为m-BACOD(甲氨喋呤、博莱霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸(leucovorin))，而合适的第三代治疗方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)。另外有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀(bendamustine)和苔藓抑制素-1(bryostatin-1)。
本发明涵盖包括融合蛋白及其片段在内的抗胰腺癌抗体及其片段作为裸抗体或抗体片段的单独施用，或作为多元模式治疗施用。优选地，所述抗体是人源化或全人PAM4抗体或其片段。多元模式治疗进一步包括利用裸抗胰腺癌抗体进行的免疫治疗，其中施用裸抗体、融合蛋白形式或作为免疫缀合物的其它抗体作为补充。例如，人源化或全人PAM4抗体可以与另一种裸抗体，或缀合到同位素、一种或多种化疗剂、细胞因子、毒素或其组合上的人源化PAM4抗体或其它抗体组合。例如，本发明涵盖裸或缀合PAM4抗体或其片段的治疗，所述治疗在其它胰腺肿瘤相关抗体的治疗之前，与其组合或在其之后进行，所述其它胰腺肿瘤相关抗体例如CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、抗-Lea抗体，和针对其它路易斯抗原(例如Le(y))的抗体，以及针对以下的抗体：癌胚抗原(CEA或CEACAM5)、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、HER2/neu、EGFR、EGP-1、EGP-2、血管生成因子(例如VEGF、PlGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌腱蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6及癌基因产物(例如bcl-2、Kras、p53)、cMET，以及针对肿瘤坏死物质的抗体。
这些实体瘤抗体可以是裸抗体或缀合到尤其是药物、毒素、同位素、放射性核素或免疫调节剂上的抗体。可以构建许多不同的抗体组合，它们可以以裸或缀合形式使用。或者，不同的裸抗体组合可以用于与连续给予、同时给予或相继给予的其它治疗剂例如细胞毒性药物或辐射组合施用。
所述抗体及其片段的施用可以通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、通过区域导管灌注，或直接病变内注射进行。当通过注射施用所述抗体时，所述施用可以是连续输注或单次或多次快速推注。
可以配制本发明的免疫缀合物用于静脉施用，经由例如快速推注注射或连续输注施用。优选地，本发明抗体在少于约4小时的时间内输注，更优选在少于约3小时的时间内输注。例如，前25-50mg可以在30分钟内，优选甚至15分钟内输注，其余部分在接下来的2至3小时内输注。注射制剂可以单位剂量形式存在于例如安培瓶或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。该组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以呈粉末形式，其在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构建(constitution)。
可以采用另外的药学方法控制治疗缀合物的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附免疫缀合物来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology 10:1446(1992)。免疫缀合物或抗体从此种基质释放的速率取决于免疫缀合物或抗体的分子量、基质内免疫缀合物或抗体的量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等，出处同上。其它固体剂型描述于以下文献中：Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea &Febiger 1990)，和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版。
一般而言，免疫缀合物对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。期望为接受者提供在约1mg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉输注的免疫缀合物、抗体融合蛋白的剂量，但如情况需要也可以施用较低或较高的剂量。对于70kg患者而言1-20mg/kg的剂量例如为70-1,400mg，或者对于1.7-m患者为41-824mg/m2。这个剂量可以根据需要重复给予，例如，每周一次持续4至10周、每周一次持续8周，或每周一次持续4周。它也可以根据维持疗法的需要，以更低的频率给予，例如每隔一周一次持续数月，或者每月或每季度一次持续多个月。
或者，抗体可以按照每2周或3周一剂施用，总共重复至少3剂。或者，所述抗体可以每周施用2次，持续4至6周。如果将所述剂量减低至约200-300mg/m2(对于1.7-m患者为340mg/剂，或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，则它可以每周施用一次或甚至两次，持续4至10周。或者，可以减少给药日程(dosage schedule)，即，每2或3周一次持续2至3个月。然而，已经确定，在重复给药周期内即使较高的剂量例如每周一次或每2至3周一次的20mg/kg也可以通过缓慢的静脉输注施用。所述给药方案可任选地以其它间隔重复，并且可以通过各种肠胃外途径给药，并可适当地调整剂量和方案。
免疫缀合物
抗胰腺癌抗体及其片段可以缀合到至少一种用于治疗或诊断的治疗和/或诊断剂上。对于免疫疗法，目标是将细胞毒性剂量的放射性、毒素、抗体和/或药物递送至靶细胞，同时将暴露于非靶组织的量减至最小。优选将抗胰腺癌抗体用于诊断和/或治疗胰腺肿瘤。
可采用本领域已知的多种技术，使所述抗体、抗体片段和融合蛋白中的任一者与一种或多种治疗或诊断剂缀合。可以使一种或多种治疗或诊断剂连接至每种抗体、抗体片段或融合蛋白上，例如通过使试剂缀合到所述抗体Fc区中的糖部分上进行。如果不存在Fc区(例如在使用某些抗体片段时)，则可以将糖部分引入到抗体或抗体片段的轻链可变区中，治疗剂或诊断剂可连接至所述糖部分。参见，例如，Leung等，J Immunol.154:5919(1995);Hansen等，美国专利第5,443,953号(1995),Leung等，美国专利第6,254,868号，每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。
使肽与抗体组分经由抗体糖部分缀合的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Shih等，Int J Cancer 41:832(1988);Shih等，Int J Cancer 46:1101(1990)；和Shih等，美国专利第5,057,313号，其实施例部分以引用方式并入本文。通用方法涉及使具有氧化糖部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能并加载有多种治疗剂如肽或药物的载体聚合物反应。这种反应产生初始希夫碱(亚胺)键合，该键合可以通过还原成仲胺从而形成最终缀合物来稳定化。
抗体融合蛋白或多特异性抗体包含两种或更多种抗体或其片段，它们中的每种均可连接至至少一种治疗剂和/或诊断剂。因此，所述抗体融合蛋白的一种或多种抗体或其片段可以具有一种以上连接的治疗和/或诊断剂。进一步地，所述治疗剂不必相同，而可以是不同的治疗剂，例如可以将药物和放射性同位素连接至同一融合蛋白。例如，IgG可用131I放射性标记并且可连接至药物。可以将131I并入到IgG的酪氨酸和连接至IgG赖氨酸的ε氨基的药物中。也可以将治疗剂和诊断剂都连接至还原SH基团和连接至抗体的糖侧链。或者，双特异性抗体可以包含一种针对疾病抗原的抗体或其片段，和另一种针对连接至可靶向构建体的半抗原的抗体或其片段，以便用于如上所述的预靶向技术中。
治疗剂或诊断剂可以通过二硫键的形成而连接在还原抗体组分的铰链区。作为替代，可以使用异型双功能交联剂如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)将此类试剂连接至抗体组分。Yu等，Int.J.Cancer 56:244(1994)。此种缀合的通用技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROS S-LINKING(CRC Press 1991);Upeslacis等，"Modification ofAntibodies by Chemical Methods,"于MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等(编)，第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995);Price,"Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies,"于MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION,Ritter等(编)第60-84页(Cambridge University Press1995)。
点击化学
将螯合部分、药物或其它官能团连接至抗体、片段或融合蛋白的替代方法涉及点击化学反应的使用。点击化学途径最初被设想为通过以模块化方式将小亚基接合在一起来迅速产生复杂物质的方法。(参见，例如，Kolb等，2004,Angew Chem Int Ed 40:3004-31;Evans,2007,Aust J Chem 60:384-95)。各种形式的点击化学反应是本领域已知的，如Huisgen 1,3-偶极环加成铜催化反应(Tornoe等，2002,J OrganicChem 67:3057-64)，这通常称为“点击反应”。其它替代反应包括环加成反应，例如Diels-Alder反应、亲核取代反应(尤其对于小的张力环，如环氧和氮丙啶化合物)、尿素化合物的羰基化学形成反应，和涉及碳-碳双键如巯基-炔反应中的炔烃的反应。
叠氮化物-炔烃Huisgen环加成反应在还原剂的存在下使用铜催化剂催化连接至第一分子的末端炔基的反应。在包含叠氮化物部分的第二分子的存在下，该叠氮化物与活化炔烃反应从而形成1,4-二取代的1,2,3-三唑。该铜催化的反应在室温下进行，并且具有足够的特异性以致反应产物通常不需要纯化。(Rostovstev等，2002,Angew ChemInt Ed 41:2596;Tornoe等，2002,J Org Chem 67:3057)。叠氮和炔烃官能团对于水性介质中的生物分子在很大程度上是惰性的，使得该反应在复合溶液中进行。所形成的三唑是化学稳定的，并且没有发生酶裂解，使得点击化学产物在生物系统中高度稳定。虽然铜催化剂对活细胞有毒性，但基于铜的点击化学反应可以在体外用于免疫缀合物形成。
已建议将无铜点击反应用于生物分子的共价修饰。(参见，例如，Agard等，2004,JAm Chem Soc 126:15046-47)无铜点击反应使用环张力代替铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔烃环加成反应(同上)。例如，环辛炔是包含内部炔键的8-碳环结构。该封闭环结构诱导乙炔的显著键角变形，其与叠氮基高度反应从而形成三唑。因而，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。
另一类无铜点击反应在Ning等(2010,Angew Chem Int Ed49:3065-68)中有报道，涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成反应。为了解决原始环辛炔反应速率慢的问题，将吸电子基团与三键邻接(同上)。此种取代的环辛炔实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛醇和氮杂环辛炔(同上)。替代的无铜反应涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成从而得到N-烷基化异噁唑啉(同上)。该反应据报道具有异常迅速的反应动力学并用于位点特异性的肽和蛋白质修饰的一锅三步骤方案(同上)。硝酮由合适的醛与N-甲基羟胺缩合制备，该环加成反应在乙腈和水的混合物中进行(同上)。这些和其它已知点击化学反应可以用来在体外将螯合部分连接至抗体或其它靶向分子。
治疗剂
多种多样的治疗剂可以同时或相继施用，或者有利地缀合到本发明抗体上，例如，药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、放射性核素、血管生成抑制剂、促凋亡剂，等等。此处列举的治疗剂是可用于缀合到抗体、片段或融合蛋白上或者与如上所述的裸抗体独立施用的那些试剂。
治疗剂包括，例如化疗药物，如长春花生物碱、蒽环霉素、吉西他滨、表鬼臼毒素、紫杉烷、抗代谢物、烷化剂、抗生素、SN-38、COX-2抑制剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成和细胞凋亡剂，特别是多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜树碱、蛋白酶体抑制剂、mTOR抑制剂、HDAC抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂，和其它来自这些和其它类别的抗癌剂的药物。
其它有用的癌症化疗药物包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、抗代谢物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配合物、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、喜树碱和激素。合适的化疗剂描述于REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(MackPublishing Co.1995)，以及GOODMAN AND GILMAN'S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)，以及这些出版物的修订版中。其它合适的化疗剂，例如实验用药物是本领域技术人员已知的。
在优选的实施方案中，喜树碱和相关化合物，例如SN-38的缀合物可以缀合到hPAM4或其它抗胰腺癌抗体上，例如如美国专利第7,591,994号和2006年3月23日提交的美国专利申请序列11/388,032中所公开的，其每个的实施例部分以引用方式并入本文。
在另一个优选的实施方案中，hPAM4抗体缀合到吉西他滨上，吉西他滨可以在裸或缀合的嵌合、人源化或人PAM4抗体之前、之后或同时给予。优选地，所述缀合的hPAM4抗体或抗体片段缀合到放射性核素上。
毒素可以来源于动物、植物或微生物。毒素，例如假单胞菌外毒素也可以复合到抗胰腺癌的免疫缀合物和hPAM4抗体的治疗剂部分上，或者形成抗胰腺癌的免疫缀合物和hPAM4抗体的治疗剂部分。其它适用于此类缀合物或其它融合蛋白制备的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见，例如，Pastan等，Cell 47:641(1986),Goldenberg,CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994),Sharkey和Goldenberg,CA--A Cancer Journal for Clinicians 56:226(2006)。另外的适用毒素是本领域技术人员已知的，公开在美国专利第6,077,499号中，其实施例部分以引用方式并入本文。
免疫调节剂，例如细胞因子，也可以缀合到所述免疫缀合物的治疗剂部分上或者形成所述免疫缀合物的治疗剂部分，或者可以与抗体、抗体片段或融合蛋白一起施用但没有缀合到所述抗体、抗体片段或融合蛋白上。所述融合蛋白可以包含结合到不同抗原上的一种或多种抗体或其片段。例如，所述融合蛋白可以结合PAM4抗原以及结合免疫调节细胞或因子。或者，受试者可以接受裸抗体、抗体片段或融合蛋白和独立施用的细胞因子，所述细胞因子可在施用所述裸抗体之前、同时或之后施用。本文所用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、促乳激素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、S1因子、IL-1、IL-1cc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和IL-25、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑制素、血小板反应蛋白、内皮细胞抑制素和LT。
所述治疗剂可以包含可用于治疗患病组织的一种或多种放射性同位素。特别有用的治疗放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。优选所述治疗放射性核素的衰变能量对于俄歇发射体在20至6,000keV的范围内，优选在60至200keV的范围内，对于β发射体为100至2,500keV，对于α发射体为4,000至6,000keV。有用的β粒子发射核素的最大衰变能量优选为20至5,000keV，更优选100至4,000keV，最优选500至2,500keV。还优选基本上为俄歇发射粒子衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β粒子发射核素的衰变能量优选<1,000keV，更优选<100keV，最优选<70keV。还优选基本上为产生α粒子衰变的放射性核素。此类放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α粒子发射放射性核素的衰变能量优选为2,000至10,000keV，更优选为3,000至8,000keV，最优选为4,000至7,000keV。
例如，67Cu由于其61.5小时的半衰期和充足的β粒子和γ射线供应而被认为是用于放射免疫疗法的较有前途的放射性同位素之一，可以利用螯合剂对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)使它缀合到抗体上。或者，可以利用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，或更优选利用DOTA使发射高能β粒子的90Y可偶联至抗体、抗体片段或融合蛋白。使90Y缀合到抗体或可靶向构建体上的方法是本领域已知的，并可以采用任何此类已知的方法。(参见，例如，美国专利第7,259,249号，其实施例部分以引用方式并入本文。另外参见Lindén等，ClinCancer Res.11:5215-22,2005;Sharkey等，J Nucl Med.46:620-33,2005;Sharkey等，J Nucl Med.44:2000-18,2003)。
另外的潜在的治疗放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。
在另一个实施方案中，放射增敏剂可以与裸或缀合抗体或抗体片段组合使用。例如，放射增敏剂可以与放射性标记抗体或抗体片段组合使用。当与用单独的放射性标记抗体或抗体片段治疗相比时，放射增敏剂的加入可以增强效力。放射增敏剂描述于D.M.Goldenberg(编),CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES,CRCPress(1995)中。可用于这个技术的其它典型的目标放射增敏剂包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶和顺铂，它们已经与外部照射组合用于包括胰腺癌在内的多种癌症的治疗。因此，我们已研究被认为是吉西他滨放射增敏剂量(在4周内，每周一次200mg/m2)的剂量的吉西他滨与分次剂量的90Y-hPAM4组合的组合，已观察到在被证明能很好耐受(无3-4级毒性，根据NCI-CTC v.3标准)的单个周期的这种组合治疗后胰腺癌减轻的客观证据。
通常将会按相似的方式产生具有加载硼附加物的载体用于供热中子激活疗法的抗体或其片段。然而，等到非靶向的免疫缀合物清除之后才执行中子照射将是有利的。可以利用结合到抗胰腺癌抗体上的抗独特型抗体加速清除。有关这种一般原理的描述，参见美国专利第4,624,846号。可以将硼附加物例如碳硼烷连接至抗体。如本领域熟知的，可以用侧挂型侧链上的羧基官能制备碳硼烷。可以通过激活碳硼烷的羧基并与载体上的胺缩合，实现碳硼烷与载体例如氨基葡聚糖的连接。然后使中间缀合物缀合到抗体上。施用抗体缀合物后，硼附加物由热中子照射激活并转化成放射性原子，放射性原子通过α发射衰变从而产生高毒性短程效应。
干扰RNA
另一类治疗剂是RNAi或siRNA。RNA干扰(RNAi)由RNA诱导的沉默复合体(RISC)介导，并由与催化RISC成分argonaute相互作用的短双链RNA分子启动(Rand等，2005,Cell 123:621-29)。RNAi分子的类型包括微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。RNAi物种可以通过互补碱基配对与信使RNA(mRNA)结合，并通过转录后基因沉默抑制基因表达。结合到互补mRNA物种上后，RNAi诱导RISC的argonaute成分裂解所述mRNA分子。除其它特征外，miRNA和siRNA的差异在于对特定基因靶的特异性程度，其中siRNA相对而言对特定靶基因有特异性，而miRNA抑制多个mRNA物种的翻译。
已尝试将RNAi抑制选定基因表达的治疗用途用于多种疾病状态，例如黄斑变性和呼吸道合胞病毒感染(Sah,2006,Life Sci79:1773-80)。已表明siRNA在宿主细胞中起着抵抗病毒感染的作用，并已对siRNA作为抗病毒治疗的途径进行广泛地研究(参见，例如，Zhang等，2004,Nature Med 11:56-62;Novina等，2002,Nature Med8:681-86;Palliser等，2006,Nature 439:89-94)。也已尝试将siRNA用于癌症治疗。Fujii等(2006,Int J Oncol 29:541-48)用针对HPV E6和E7的siRNA转染HPV阳性宫颈癌细胞，并抑制了肿瘤生长。已报道乳腺癌细胞中siRNA介导的异粘蛋白(metadherin)表达敲低抑制实验性肺转移(Brown和Ruoslahti,2004,Cancer Cell 5:365-74)。
已尝试提供靶向的siRNA递送以便减少脱靶毒性的可能性。Song等(2005,Nat Biotechnol 23:709-17)使用针对HIV包膜蛋白的鱼精蛋白缀合的Fab片段将siRNA递送至循环细胞。Schiffelers等(2004,NuclAcids Res 32:e149)使RGD肽缀合到纳米粒子上从而将抗-VEGFR2siRNA递送至肿瘤并抑制裸小鼠的肿瘤血管生成和生长速率。Dickerson等使用抗-EphA2受体肽官能化的纳米凝胶，用针对EGFR的siRNA来增加卵巢癌细胞对化疗的敏感度。树状高分子缀合的磁性纳米粒子已应用于反义存活素寡脱氧核苷酸的靶向递送(Pan等，2007,Cancer Res 67:8156-63)。
技术人员将会意识到任何siRNA或干扰RNA物种都可以连接至题述抗体。针对多种多样的靶的siRNA和RNAi物种是本领域已知的，而且在要求保护的方法和组合物中可以利用任何此类已知的寡核苷酸物种。
具有潜在用途的已知siRNA物种包括对IKK-γ有特异性的那些(美国专利第7,022,828号)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利第7,148,342号)；Bcl2和EGFR(美国专利第7,541,453号)；CDC20(美国专利第7,550,572号)；转导素(β)-样3(美国专利第7,576,196号)；KRAS(美国专利第7,576,197号)；碳酸酐酶II(美国专利第7,579,457号)；补体成分3(美国专利第7,582,746号)；白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利第7,592,443号)；存活素(美国专利第7,608,7070号)；过氧化物歧化酶1(美国专利第7,632,938号)；MET原癌基因(美国专利第7,632,939号)；β淀粉样前体蛋白(APP)(美国专利第7,635,771号)；IGF-1R(美国专利第7,638,621号)；ICAM1(美国专利第7,642,349号)；补体因子B(美国专利第7,696,344号)；p53(7,781,575)，和载脂蛋白B(7,795,421)，其中的每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文。
另外的siRNA物种可得自已知商业来源，例如Sigma-Aldrich(StLouis,MO)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz,CA)、Ambion(Austin,TX)、Dharmacon(Thermo Scientific,Lafayette,CO)、Promega(Madison,WI)、Mirus Bio(Madison,WI)和Qiagen(Valencia,CA)，以及许多其它商业来源。siRNA物种的其它公开可用来源包括Stockholm Bioinformatics Centre的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、Broad Institute的RNAi Consortium shRNA文库，和NCBI的Probe数据库。例如，NCBI Probe数据库中存在30,852个siRNA物种。技术人员将会意识到对于任何目标基因，siRNA物种已被设计或者可以容易地利用公开可用软件工具进行设计。任何此类siRNA物种都可以利用题述DNL复合物递送。
已报道的示例性siRNA物种在表1中列出。虽然siRNA是作为双链分子递送的，但为简单起见仅在表1中给出正义链序列。
表1.示例性siRNA序列
Figure BDA00001896026000511
Figure BDA00001896026000521
诊断剂
在本申请的上下文中，术语“诊断”或“检测”可以互换使用。诊断通常是指确定组织的具体组织学状态，而检测是识别含有特定抗原的组织、病变或生物并探明它们的位置。
通过使所述抗体连接至酶上可以可检测地标记题述抗体和片段。当在合适底物的存在下孵育抗体-酶缀合物时，酶部分与底物反应从而产生可例如通过分光光度计、荧光计或视觉方式检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的酶实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、α-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
所述免疫缀合物可以包含可用于检测患病组织的一种或多种放射性同位素。特别有用的诊断放射性核素包括但不限于110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr，或其它γ、β或正电子发射体，其衰变能量优选在20至4,000keV的范围内，更优选在25至4,000keV的范围内，甚至更优选在25至1,000keV的范围内，还更优选在70至700keV的范围内。有用的正电子发射放射性核素的总衰变能量优选<2,000keV，更优选<1,000keV，最优选<700keV。可用作利用γ射线检测的诊断剂的放射性核素包括但不限于：51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、111In、114mIn、123I、125I、131I、169Yb、197Hg和201Tl。有用的γ射线发射放射性核素的衰变能量优选为20-2000keV，更优选60-600keV，最优选100-300keV。
诊断受试者的癌症的方法可以通过施用诊断免疫缀合物和检测连接至定位于癌症或肿瘤的免疫缀合物的诊断标记来完成。所述抗体、抗体片段和融合蛋白可以缀合到诊断剂上，或者可以使用连接至诊断剂的可靶向构建体以预靶向技术施用。可用作诊断剂的放射性试剂在上文有讨论。合适的非放射性诊断剂是适合于磁共振成像、X射线、计算机断层成像或超声的造影剂。磁成像剂包括，例如，与包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物在内的金属螯合物组合复合的非放射性金属，如锰、铁和钆。参见2001年10月10日提交的美国专利申请序列第09/921,290号，其实施例部分以引用方式并入本文。也可以使用其它成像剂，例如PET扫描核苷酸，优选18F。
造影剂可用作诊断剂，所述造影剂为，例如，包括例如钆离子、镧离子、镝离子、铁离子、锰离子或其它的对比标记在内的MRI造影剂、CT造影剂和超声造影剂。适用的顺磁离子包括铬(Ⅲ)、锰(II)、铁(Ⅲ)、铁(II)、钴(Ⅱ)、镍(II)、铜(II)、钕(Ⅲ)、钐(Ⅲ)、镱(Ⅲ)、钆(Ⅲ)、钒(Ⅱ)、铽(Ⅲ)、镝(Ⅲ)、钬(Ⅲ)和铒(Ⅲ)，特别优选钆。
可用于其它环境如X射线成像中的离子包括但不限于镧(Ⅲ)、金(Ⅲ)、铅(II)和铋(Ⅲ)。荧光标记包括若丹明、荧光素和肾造影剂。若丹明、荧光素通常经由异硫氰酸酯中间体连接。
金属也可用于诊断剂中，包括用于磁共振成像技术的金属。这些金属包括但不限于：钆、锰、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬和钕。为了用放射性金属或顺磁离子加载抗体，可能需要使它与具有连接多个螯合基团以结合所述离子的长尾的试剂反应。这样的尾可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或其它衍生化链或可衍生链，所述螯合基团为，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。
采用标准化学方法，使螯合物偶联至抗体、融合蛋白或其片段。螯合物通常通过能以使免疫反应性损失最小、聚集和/或内部交联最小的方式与所述分子形成键的基团连接至抗体。用于使螯合物缀合到抗体上的其它较不寻常的方法和试剂公开在1989年4月25日授予Hawthorne、题目为"Antibody Conjugates"的美国专利第4,824,659号中，其实施例部分以引用方式并入。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围20至2,000keV的诊断同位素一起使用。相同的螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时可用于MRI。大环螯合物如NOTA、DOTA和TETA可分别与多种金属和放射性金属，最特别是与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。本发明包括其它环类型的螯合物如大环聚醚，它们对于稳定地结合核素如用于RAIT的223Ra有价值。
不透射线材料和造影材料可用来增强X射线和计算机断层成像，并且包括碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。具体化合物包括钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、碘肥胺、碘沙酸、碘古酰胺、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。
所述抗体、抗体片段和融合蛋白也可以用荧光化合物进行标记。通过将所述抗体暴露于适当波长的光下并检测所产生的荧光，确定荧光标记MAb的存在。荧光标记化合物包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、级联蓝(CascadeBlue)、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、异硫氰酸荧光素、荧光胺、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、酞酸、对酞酸、异酞酸、甲酚固紫(cresyl fast violet)、甲酚蓝紫(cresyl blue violet)、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、酞菁、酞醛(phthaldehyde)、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴合物、三联吡啶二胺铕、铕穴合物或螯合物、二胺、双花青、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白(allopycocyanin)、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、异硫氰酸若丹明、若丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明和德克萨斯红。荧光标记的抗体特别可用于流式细胞仪分析，但也可以用于内窥镜检查和血管内检测方法。
或者，通过使所述抗体偶联至化学发光化合物可以可检测地标记所述抗体、抗体片段和融合蛋白。通过检测化学反应过程中产生的发光的存在，确定化学发光标识的MAb的存在。化学反光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
类似地，生物发光化合物也可用于标记这里的抗体和片段。生物发光是一类在生物系统中发现的化学发光，其中催化蛋白增加化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
因此，描述了诊断受试者的恶性肿瘤的方法，其包括用包含抗胰腺癌MAb、融合蛋白或其片段的组合物对来自受试者的样本(流体、组织或细胞)进行体外诊断分析。可利用免疫组织化学，通过检测结合抗体的存在来检测细胞或组织中PAM4抗原的存在。优选被诊断的恶性肿瘤是癌症。最优选所述癌症是胰腺癌。
另外，可使连接有可检测标记例如荧光分子或细胞毒性剂例如重金属或放射性核素的螯合剂，例如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或合适的肽缀合到受试者抗体上。例如，通过使光敏剂或染料缀合到抗体融合蛋白上，可以获得治疗有用的免疫缀合物。荧光组合物例如荧光染料，和其它对可见光敏感的发色团或染料例如卟啉已用来检测病变和通过将合适的光导向病变来治疗所述病变。在治疗中，这称为光辐射、光线疗法或光动力学疗法(Jori等(编)，PHOTODYNAMICTHERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto1985);van den Bergh,Chem.Britain 22:430(1986))。此外，单克隆抗体已与光活化染料偶联用于实现光线疗法。Mew等，J.Immunol.130:1473(1983);idem.,Cancer Res.45:4380(1985);Oseroff等，ProcNatl.Acad.Sci.USA 83:8744(1986);idem.,Photochem.Photobiol.46:83(1987);Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.288:471(1989);Tatsuta等，Lasers Surg.Med.9:422(1989);Pelegrin等，Cancer 67:2529(1991)。
缀合到抗体上或用于双特异性预靶向方法中的荧光性和放射性试剂特别可用于内窥镜检查、手术中或血管内检测与患病组织或细胞簇例如恶性肿瘤相关的靶向抗原，如Goldenberg的美国专利第5,716,595号、第6,096,289号和第6,387,350号中所公开的，每篇专利的实施例部分均以引用方式并入本文，特别是γ、β和正电子发射体。当允许内窥镜检查的结构例如结肠遭到蔓延时可以使用内窥镜检查。可用于正电子发射断层成像的放射性核素包括但不限于：F-18、Mn-51、Mn-52m、Fe-52、Co-55、Cu-62、Cu-64、Ga-68、As-72、Br-75、Br-76、Rb-82m、Sr-83、Y-86、Zr-89、Tc-94m、In-110、I-120和I-124。有用的正电子发射放射性核素的总衰变能量优选<2,000keV，更优选低于1,000keV，最优选<700keV。可用作利用γ射线检测的诊断剂的放射性核素包括但不限于：Cr-51、Co-57、Co-58、Fe-59、Cu-67、Ga-67、Se-75、Ru-97、Tc-99m、In-111、In-114m、I-123、I-125、I-131、Yb-169、Hg-197和Tl-201。有用的γ射线发射放射性核素的衰变能量优选为20-2000keV，更优选60-600keV，最优选100-300keV。
体外诊断
本发明涵盖抗胰腺癌抗体在体外筛选生物样品以确定PAM4抗原的存在方面的用途。在此类免疫测定中，所述抗体、抗体片段或融合蛋白可以以液相利用或者结合到固相载体上，如下所述。为了体外诊断，可以利用任何类型的抗体例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，因为不用考虑宿主免疫响应。
用于确定生物样品是否含有PAM4抗原的筛选方法的一个实例是放射性免疫测定(RIA)。例如，在一种形式的RIA中，将所测试的物质与PAM4MAb在放射性标记PAM4抗原的存在下混合。在这种方法中，测试物质的浓度将与结合到所述MAb上的标记PAM4抗原的量成反比，而与游离的标记PAM4抗原的量直接相关。其它合适的筛选方法对于本领域技术人员是显而易见的。
或者，可以进行体外测定，其中使抗胰腺癌抗体、抗体片段或融合蛋白结合到固相载体上。例如，可以将MAb连接至聚合物例如氨基葡聚糖，以便将所述MAb连接至不溶性支持物例如聚合物包被的珠、板或管。
其它合适的体外测定对于本领域技术人员是显而易见的。可检测标记抗体和PAM4抗原的具体浓度、孵育温度和时间，以及其它测定条件可以根据包括样品中PAM4抗原的浓度、样品性质等在内的各种因素而变化。抗胰腺癌抗体样品的结合活性可以根据熟知的方法测定。本领域技术人员将能够采用常规实验确定每一测定的操作和最佳分析条件。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)可以测定生物样品中PAM4抗原的存在(例如，Gold等，J Clin Oncol.24:252-58,2006)。在直接竞争性ELISA中，使纯或半纯抗原制剂结合到不溶于所测试流体或细胞提取物的固相支持物上，并加入一定量的可检测标记的可溶性抗体从而允许对在固相抗原和标记抗体之间形成的二元复合物进行检测和/或定量。
对比之下，“双决定簇”ELISA，也称为“双位点ELISA”或“三明治测定法”，需要少量的抗原并且该测定不需要充分地纯化抗原。因而，在检测临床样品中的抗原方面，双决定簇ELISA优于直接竞争性ELISA。参见，例如，双决定簇ELISA在定量测定活检样本中c-myc癌蛋白中的用途。Field等，Oncogene 4:1463(1989);Spandidos等，AntiCancer Res.9:821(1989)。
在双决定簇ELISA中，使一定量的未标记MAb或抗体片段(“捕获抗体”)结合到固相支持物上，使测试样品与所述捕获抗体接触，并加入一定量的可检测标记的可溶性抗体(或抗体片段)，从而允许对在捕获抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物进行检测和/或定量。在本发明背景下，抗体片段是可结合到PAM4抗原表位上的抗胰腺癌抗体MAb的一部分。进行双决定簇ELISA的方法是熟知的。参见，例如，Field等，出处同上，Spandidos等，出处同上，和Moore等，"Twin-Site ELISAs for fos and myc Oncoproteins Using the AMPAKSystem,"于METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第273-281页(The Humana Press,Inc.1992)。
在双决定簇ELISA中，所述可溶性抗体或抗体片段必须结合到与捕获抗体所识别的表位不同的PAM4表位上。可以进行双决定簇ELISA以确定活检样品中是否存在PAM4抗原。或者，可以进行所述测定，以定量测定临床体液样品中存在的PAM4抗原的量。所述定量测定可以通过包括稀释纯化的PAM4抗原来进行。
抗胰腺癌MAb、融合蛋白及其片段也适用于制备测定试剂盒。此种试剂盒可以包括载体装置，该载体装置被隔开以在密闭区室中容纳一个或多个容器装置，例如小瓶、管等，每个所述容器装置均包括免疫测定的独立元件。
也可以利用题述抗体、抗体片段和融合蛋白来检测由组织学样本制备的组织切片中PAM4抗原的存在。可以利用此种原位检测来测定所检查组织中PAM4抗原的存在以及测定所检查组织中的PAM4抗原的分布。原位检测可以通过将可检测标记的抗体施加到冷冻组织切片上来完成。研究表明PAM4抗原保存在石蜡包埋的切片中。原位检测的通用技术是技术人员熟知的。参见，例如，Ponder，"Cell MarkingTechniques and Their Application,"于MAMMALIAN DEVELOPMENT:A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk(编)(IRL Press 1987)，和Coligan第5.8.1-5.8.8页。
抗体、抗体片段和融合蛋白可以用任何合适的标记部分进行可检测地标记，所述标记部分例如放射性同位素、酶、荧光标记、染料、发色团、化学发光标记、生物发光标记或顺磁标记。
标记部分可以是采用γ计数器或闪烁计数器等方式或通过放射自显影检测的放射性同位素。在优选的实施方案中，诊断缀合物是γ、β或正电子发射同位素。本说明书中的标记部分是指将在预定条件下产生信号的分子。标记部分的实例包括放射性同位素、酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和顺磁标记。
标记部分与抗胰腺癌抗体的结合可以采用本领域已知的标准技术完成。在这方面的典型方法描述于Kennedy等，Clin Chim Acta 70:1(1976),Schurs等，Clin.Chim.Acta 81:1(1977),Shih等，Int J Cancer46:1101(1990)中。
上述体外和原位检测方法可以用来协助病理病状的诊断或分期。例如，此类方法可用来检测表达PAM4抗原的肿瘤，例如胰腺癌。体内诊断/检测
用放射性标记MAb进行体内诊断成像的各种方法是熟知的。在免疫闪烁成像技术中，例如，用γ发射放射性同位素标记抗体，并将其引入患者中。利用γ照相机检测γ发射放射性同位素的位置和分布。参见，例如，Srivastava(编),RADIOLABELED MONOCLONALANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY(Plenum Press 1988),Chase,"Medical Applications of Radioisotopes,"于REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Gennaro等(编)，第624-652页(Mack Publishing Co.,1990)，和Brown,"Clinical Use of MonoclonalAntibodies,"于BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49,Pezzuto等(编)(Chapman & Hall 1993)。
对于诊断成像，放射性同位素可以直接或通过利用中间官能团间接地结合到抗体上。有用的中间官能团包括螯合剂，例如乙二胺四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸。例如，参见，Shih等，出处同上，和美国专利第5,057,313号。
通过选择最小半衰期、体内最低保留的最佳组合的同位素以及允许检测和准确测量的同位素的最低数量，使递送至患者的辐射剂量保持在尽可能低的水平。可以结合到抗胰腺癌抗体上并且适合于诊断成像的放射性同位素的实例包括99mTc、111In和18F。
题述抗体、抗体片段和融合蛋白也可以用顺磁离子和多种放射学造影剂进行标记，以便用于体内诊断。对磁共振成像特别有用的造影剂包含钆、锰、镝、镧或铁离子。另外的试剂包括铬、铜、钴、镍、铼、铕、铽、钬或钕。抗体及其片段也可以缀合到超声造影剂/增强剂上。例如，一种超声造影剂是脂质体。还优选所述超声造影剂是气体填充的脂质体。
在优选的实施方案中，双特异性抗体可以缀合到造影剂上。例如，所述双特异性抗体可以包含一种以上的超声成像中使用的图像增强剂。在另一个优选的实施方案中，所述造影剂是脂质体。优选所述脂质体包含共价连接至所述脂质体外表面的二价DTPA-肽。
药学上适合的赋形剂
在治疗应用中，可以采用另外的药学方法控制抗胰腺癌抗体的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附抗体、抗体片段或融合蛋白来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology 10:1446(1992)。抗体、抗体片段或融合蛋白从此种基质释放的速率取决于抗体、抗体片段或融合蛋白的分子量、基质内抗体的量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等，出处同上。其它固体剂型描述于以下文献中：Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(MackPublishing Company 1990)，及其修订版。
待递送至受试者的抗体、其片段或融合蛋白可以包含一种或多种药学上适合的赋形剂、一种或多种另外的成分或它们的一些组合。所述抗体可以根据制备药学上有用的组合物的已知方法配制，从而将所述免疫缀合物或裸抗体与药学上适合的赋形剂混合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(MackPublishing Company 1990)，及其修订版。
所述免疫缀合物或裸抗体可以配制用于静脉施用，经由例如快速推注注射或连续输注施用。注射制剂可以以单位剂量形式存在于例如在安培瓶或多剂量容器中，其中添加有防腐剂。所述组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以呈粉末形式，其在使用前前用合适的媒介物例如无菌无热原水构建。
所述免疫缀合物、裸抗体、其片段或融合蛋白也可以通过皮下或其它肠胃外途径施用给哺乳动物。在优选的实施方案中，所述抗体或其片段以每剂20至2000毫克蛋白质的剂量施用。此外，所述施用可以通过连续输注或者通过单次或多次快速推注进行。一般而言，免疫缀合物、融合蛋白或裸抗体对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。通常，期望为接受者提供在约1mg/kg至20mg/kg范围内的作为单次静脉或输注的免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体的剂量，但如情况需要也可以施用较低或较高的剂量。这个剂量可以根据需要重复给予，例如，每周一次持续4至10周，优选每周一次持续8周，更优选每周一次持续4周。它也可以以更低的频率给予，例如每隔一周一次持续数月，或者可以以更高的频率给予，例如每周2次或3次。所述剂量可以通过各种肠胃外途径给予，并可适当地调整剂量和方案。
试剂盒
各种实施方案可以涉及含有适合于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有至少一种如本文所述的抗体、抗原结合片段或融合蛋白。如果含有用于施用的组分的组合物未被配制成经由消化道递送例如通过口服递送，则可包括能够通过某些其它途径递送试剂盒组分的设备。用于诸如肠胃外递送的应用的一种类型的设备是用于将组合物注射进受试者身体的注射器。也可以使用吸入设备。在某些实施方案中，抗胰腺癌抗体或其抗原结合片段可以以含有抗体的无菌液体制剂或冻干制品的预灌封注射器或自动注射笔形式提供。(例如，Kivitz等，Clin.Ther.2006,28:1619-29)。
所述试剂盒组分可以一起包装或者分装在两个或更多个容器中。在一些实施方案中，所述容器可以是含有适合于重构(reconstitution)的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒也可以含有一种或多种适合于重构和/或稀释其它试剂的缓冲剂。可以使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可以包装到容器内并保持无菌。可以包括的另一组成部分是试剂盒的使用说明书。
实施例
下面的实施例仅说明本发明的实施方案，而不限制权利要求的范围。所述实施例讨论了利用示例性抗胰腺癌单克隆抗体(例如，PAM4)进行的研究。利用PAM4 MAb进行的临床研究已证明患者中的大多数胰腺癌病变被靶向，并且不存在正常组织摄取的迹象。剂量测定法表明向肿瘤递送10至20cGy/mCi是可能的，其中肿瘤与红骨髓的剂量比为3:1至10:1。该数据表明PAM4可用于治疗胰腺癌。
实施例1.人源化PAM4 MAb
在优选的实施方案中，要求保护的方法和组合物利用抗体hPAM4，hPAM4是针对胰腺癌粘蛋白产生的鼠PAM4 MAb的人源化IgG。利用鼠PAM4序列的人源化来降低人抗小鼠抗体(HAMA)响应。为了生成人源化PAM4，将鼠互补决定区(CDR)从小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链转移到人构架区(FR)抗体序列中，接着用它们的鼠对应物替代某些人FR残基。人源化单克隆抗体适用于体外和体内诊断和治疗方法。
鼠PAM4MAb(图1A和1B)的可变区构架序列与Kabat数据库中的已知人抗体的比较表明，PAM4 VK和VH的FR分别与人抗体WalkerVK和Wil2 VH的FR具有最高程度的序列同一性。因此，分别选择Walker VK和Wil2 VH FR作为鼠PAM4 VK和VH的CDR移植到其中的人构架(图3)。然而，用人抗体的FR4序列NEWM替代Wil2 FR4序列，供PAM4重链人源化用(图3B)。将推定CDR两侧的PAM4 FR中的几个氨基酸残基保留在hPAM4中，基于考虑到这些残基对Ag结合的影响比其它FR残基大。这些残基为VK的21M、47W、59P、60A、85S、87F和100G，以及VH的27Y、30P、38K、48I、66K、67A和69L。hPAM4 VK(SEQ ID NO:16)和VH(SEQ ID NO:19)的DNA和氨基酸序列分别在图3A和3B中示出。
使用长寡核苷酸合成和PCR的组合，按照Leung等(Leung等，1994)所描述的改进策略构建设计的hPAM4的VK和VH基因(图4)。为了构建hPAM4 VH结构域，在自动化DNA合成仪(AppliedBiosystems)上合成两种长寡核苷酸，hPAM4 VH A(173-mer)和hPAM4VH B(173-mer)。
hPAM4 VH A表示hPAM4 VH结构域的核苷酸17-189。
5'-AGTCTGGGGC TGAGGTGAAG AAGCCTGGGGCCTCAGTGAA GGTCTCCTGC GAGGCTTCTG GATACACATTCCCTAGCTAT GTTTTGCACT GGGTGAAGCA GGCCCCTGGACAAGGGCTTG AGTGGATTGG ATATATTAAT CCTTACAATGATGGTACTCA GTACAATGAGAAG-3'(SEQ ID NO:54)
hPAM4 VHB表示与核苷酸169-341互补的hPAM4 VH结构域的负链。
5'-AGGGTTCCCT GGCCCCAGTA AGCAAATCCGTAGCTACCAC CGAAGCCTCT TGCACAGTAA TACACGGCCGTGTCGTCAGA TCTCAGCCTG CTCAGCTCCA TGTAGGCTGTGTTGATGGAC GTGTCCCTGG TCAGTGTGGC CTTGCCTTTGAACTTCTCAT TGTACTGAGT ACC-3'(SEQ ID NO:55)
hPAM4VHA和VHB的3’-端序列(21个核苷酸残基)彼此互补。在定义的PCR条件下，使hPAM4VHA和VHB的3’-端退火形成位于长寡核苷酸其余部分两侧的短双链DNA。每个退火端均用作单链DNA转录的引物，产生由hPAM4 VH的核苷酸17-341组成的双链DNA。将这种DNA在两种短寡核苷酸hPAM4 VHBACK和hPAM4 VHFOR的存在下进一步扩增从而形成全长hPAM4 VH。加下划线部分是用于亚克隆的限制位点，如图4B所示。
hPAM4 VHBACK 5'-CAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGGGCT GAG GTG A-3'(SEQ ID NO:56)
hPAM4 VHFOR 5'-TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCCCTG GCC CCA-3'(SEQ ID NO:57)
将极少量hPAM4 VHA和VHB(凭经验确定)在10μL 10X PCR缓冲液(500mM KCl、100mM Tris HCl缓冲液pH 8.3、15mM MgCl2)、2μmol hPAM4 VHBACK和hPAM4 VKFOR，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,Conn.)的存在下进行扩增。对这种反应混合物进行3个聚合酶式链反应(PCR)循环，所述聚合酶式链反应循环由94℃变性1分钟，45℃退火1分钟和72℃聚合1.5分钟组成。这个操作程序之后接着27个PCR反应循环，所述PCR反应循环由94℃变性1分钟、55℃退火1分钟和72℃聚合1分钟组成。对hPAM4 VH的双链PCR扩增产物进行凝胶纯化、用PstI和BstEII限制位点进行限制性消化，并将其克隆到重链分期载体VHpBS2的互补PstI/BstEII限制位点中，在VHpBS2中，VH序列用编码翻译起始密码子的DNA序列完全装配，然后将分泌信号肽框内连接在5’-端并将内含子序列框内连接在3’-端。VHpBS2是VHpBS的修饰分期载体(Leung等，Hybridoma,13:469,1994)，其中在翻译起始密码子上游的16位碱基处引入XhoI限制位点以便利于接下来的亚克隆步骤。将装配的VH基因作为XhoI-BamHI限制片段亚克隆到表达载体pdHL2中，该表达载体含有处于IgH增强子和MT1启动子控制之下的人IgG重链和轻链的表达盒，以及作为选择和扩增标记的小鼠d/fr基因。因为pdHL2的重链区缺乏BamHI限制位点，所以这种连接需要使用接头来提供介于可变链的BamHI位点和pdHL2载体中存在的HindIII位点之间的桥。所得表达载体命名为hPAM4 VHpdHL2。
为了构建人源化VK序列的全长DNA，如上所述合成hPAM4 VKA(157-mer)和hPAM4 VKB(156-mer)。如上所述通过两种短寡核苷酸hPAM4 VKBACK和hPAM4 VKFOR扩增hPAM4 VKA和VKB。
hPAM4 VKA表示hPAM4 VK结构域的核苷酸16-172。
5'-CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTAGGAGACAGAG TCACCATGAC CTGCAGTGCC AGCTCAAGTGTAAGTTCCAG CTACTTGTAC TGGTACCAAC AGAAACCAGGGAAAGCCCCC AAACTCTGGA TTTATAGCAC ATCCAACCTGGCTTCTG-3'(SEQ ID NO:58)
hPAM4 VKB表示与核苷酸153-308互补的hPAM4 VK结构域的负链。
5'-GTCCCCCCTC CGAACGTGTA CGGGTACCTATTCCACTGAT GGCAGAAATA AGAGGCAGAA TCTTCAGGTTGCAGACTGCT GATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCAGATCCACTGCCACTG AAGCGAGCAG GGACTCCAGA AGCCAGGTTGGATGTG-3'(SEQ ID NO:59)
hPAM4 VKA和VKB的3’-末端序列(20个核苷酸残基)彼此互补。在定义的PCR条件下，使hPAM4 VKA和VKB的3’-端退火形成位于长寡核苷酸其余部分两侧的短双链DNA。每个退火端均用作单链DNA转录的引物，产生由hPAM4 VK的核苷酸16-308组成的双链DNA。将这种DNA在两种短寡核苷酸hPAM4 VKBACK和hPAM4VKFOR的存在下进一步扩增从而形成全长hPAM4 VK。加下划线部分是用于亚克隆的限制位点，如下所述。
hPAM4 VKBACK 5'-GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCATCC TCC CTG-3'(SEQ ID NO:60)
hPAM4 VKFOR 5'-TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC CCC TCCGAA CGT-3'(SEQ ID NO:61)
将hPAM4 VK的凝胶纯化PCR产物用PvuII和BglII进行限制性消化，并将其克隆到轻链分期载体VKpBR2的互补PvuII/BclI位点中。VKpBR2是VKpBR的修饰分期载体(Leung等，Hybridoma,13:469,1994)，其中在翻译起始密码子上游的16位碱基处引入XbaI限制位点。将装配的VK基因作为XbaI-BamHI限制片段亚克隆到含有VH序列的表达载体hPAM4 VHpdHL2中。所得表达载体命名为hPAM4pdHL2。
约30μg hPAM4pdHL2通过用SalI消化而线性化，并通过450V和25μF下的电穿孔将其转染到Sp2/0-Ag14细胞中。将转染的细胞涂布到96孔板中，并在CO2细胞培养孵育器中孵育2天，然后针对MTX抗性进行选择。在2至3周开始选出存活的菌落，并通过ELISA测定针对人抗体分泌进行筛选。简言之，将来自存活菌落的上清液(~100ul)加入到用山羊抗人IgG F(ab′)2片段特异性Ab预先包被的ELISA微孔板的孔中。将该板在室温下孵育1小时。通过用洗涤缓冲液(含有0.05%吐温-20的PBS)洗涤三次去除未结合蛋白。向该孔中加入辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fc片段特异性Ab。接着孵育1小时，洗涤后，向该孔中加入含有4mM邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和0.04%PBS中的H2O2的的底物溶液(100μL/孔)。避光显色30分钟，通过加入50μL4N H2SO4溶液终止反应。通过在ELISA读板器上读出490nm处的吸光度来测量结合的人IgG。扩充阳性细胞克隆，并通过在蛋白A柱上进行亲和色谱，从细胞培养上清液中纯化出hPAM4。
通过在用胰腺癌细胞提取物包被的微量滴定板中的ELISA测定证实hPAM4的Ag结合活性。利用PAM4抗原包被的板进行ELISA竞争性结合测定以评估与由鼠V和人C结构域组成的嵌合PAM4的Ag结合活性相比较的hPAM4的Ag结合活性。向所述包被的孔中加入与不同浓度的cPAM4或hPAM4混合的恒定量的HRP缀合的cPAM4，并在室温下孵育1至2小时。加入含有4mM邻苯二胺二盐酸盐和0.04%H2O2的底物溶液之后，通过读出490nm处的吸光度揭示结合到CaPan1 Ag上的HRP缀合的cPAM4的量。如图4中的竞争性测定所示，hPAM4和cPAM4抗体表现出相似的结合活性。
实施例2：免疫组织化学染色研究
对正常成体组织的免疫组织化学表明PAM4反应性表位局限于胃肠道，在这里染色弱，但是为阳性(表2)。包括胰腺管、胰腺小管、胰腺腺泡和胰岛细胞在内的正常胰腺组织呈阴性染色。以组织匀浆物作为抗原的基于PAM4的酶免疫测定总的来说支持所述免疫组织学数据(表3)。PAM4表位不存在于正常胰腺和其它非胃肠道组织中。在赘生性组织中，PAM4与25个胰腺癌中的21个(85%)(表4和表5)，以及与26个结肠癌中的10个有反应性，但与胃、肺、乳腺、卵巢、前列腺、肝或肾的肿瘤(表5)只有有限的反应性。PAM4反应性似乎与肿瘤分化阶段关联，其中在高分化的胰腺癌中观察到的染色百分比高于在中分化或低分化的肿瘤中所观察到的。一般地，低分化的肿瘤占所有胰腺癌的不到10%。
这些研究表明，PAM4反应性和组织分布(正常和癌症)与所报道的CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2和B72.3抗体和针对路易斯抗原的抗体的反应性和组织分布不同。所得数据与利用这些MAb中的某些进行的交叉阻断研究一起表明，PAM4 MAb识别独特的新表位。当与CA19.9、DUPAN2和抗-Lea抗体识别的抗原进行比较时，PAM4抗原似乎在其组织分布上更加受到限制，并且与较高百分比的胰腺肿瘤有反应性。此外，它在等量浓度下得到较高的总体反应强度，并且与较高百分比的胰腺肿瘤内的细胞有反应性。最后，发现PAM4仅与12个慢性胰腺炎样本中的3个有弱反应性，而CA19.9和DUPAN2与所有12个样本都有强反应性。虽然意识到特异性部分依赖于所采用测定的类型和所检查组织的范围和数量，但PAM4判别正常胰腺组织和赘生性胰腺组织的能力、它与高百分比的癌症样本反应的能力、所述反应的高强度，和区分早期胰腺癌和良性病状例如胰腺炎的能力是这种示例性抗胰腺癌抗体的重要特征。
表2.利用MAb PAM4进行的正常成体组织免疫过氧化物酶染色
  组织   染色
  反应
  胰腺(22)a   -
  胰腺管   -
  胰腺腺泡   -
  胰岛   -
  颌下腺(2)   -
  食管(2)   -
  胃(3)   +粘液分泌细胞
  十二指肠(3)   +杯状细胞
  空肠(3)   +杯状细胞
  回肠(3)   +杯状细胞
  结肠(5)   +杯状细胞
  肝脏(3)   -
  胆囊(2)   -
  支气管(3)   -
  肺(3)   -
  心脏(3)   -
  脾脏(3)   -
  肾脏(3)   -
  膀胱(3)   -
  前列腺(2)   -
  睾丸(2)   -
  子宫(2)   -
  卵巢(2)   -
a–括号中为所检查的个体样本数
表3.经EIA测定的单克隆抗体PAM4与正常成体组织匀浆物的反应性
  组织   μg/g组织a
  胰腺   6.4
  食管   8.1
  胃   61.3
  十二指肠   44.7
  空肠   60.6
  结肠   74.5
  肝脏   0.0
  胆囊   5.6
  心脏   3.7
  脾脏   3.4
  肾脏   6.6
  膀胱   4.9
  甲状腺   3.5
  肾上腺   1.3
  输尿管   2.6
  睾丸   3.9
  CaPan1胰腺肿瘤   569
a–数值是来自两个尸检样本的平均值
表4.几种单克隆抗体与胰腺肿瘤的免疫组织化学反应性
  分化   PAM4   CA19.9   Lea   DUPAN2
  1   W   +++   -   -   +++
  2   M   ++   +++   +++   +
  3   M   +   -   +   +
  4   M   +++   +++   +++   +
  5   M   ++   +   -   -
  6   M   +   ND   ND   ND
  7   M*   +++   +++   +++   +++
  8   M   +   -  -   +++
  9   M   ++   +   ++   -
  10   M*   ++   ++   ++   +++
  11   M   ++   +++   +++   +
  12   M   ++   +   +   +++
  13   M   +   +++   +++   +
  14   M   ++   +   +   ++
  15   M   +++   +   +   ++
  16   M   +   +   ++   -
  17   M   -   +   +   -
  18   M   ++   ++   ++   ++
  19   M   +++   +   +++   ++
  20   M   +   -   -   -
  21   M   +++   +++   +   ++
  22   P   +   +   +   +++
  23   P   -   -   -   -
  24   P   -   -   -   -
  25   P   -   -   +   -
  总数   21/25   17/24   18/24   16/24
-：阴性；+：5-20%的组织被染色；++:21-50%的组织被染色；
+++：>50%的组织被染色；W，M,P：高分化、中分化或低分化；
*：转移组织；ND：未进行。
表5.利用MAb PAM4进行的赘生性组织免疫过氧化物酶染色
  癌组织   阳性数/总数
  胰腺   21/25
  结肠   10/26
  胃   1/5
  肺   1/15
  乳腺   0/30
  卵巢   0/10
  前列腺   0/4
  肝脏   0/10
  肾脏   0/4
实施例3.放射性标记PAM4的体内生物分布和肿瘤靶向
用涵盖预期分化范围的一系列的四种不同异种移植的人胰腺肿瘤，进行PAM4的初始生物分布研究。所用四种肿瘤系AsPc1、BxPc3、Hs766T和CaPan1中的每一种显示肿瘤内131I-PAM4浓度(第3天，范围：21%-48%ID/g)显著(P<0.01-0.001)高于同时施用的非特异性的同种型匹配的Ag8抗体(第3天，范围：3.6%-9.3%ID/g)。利用该生物分布数据评价对肿瘤的潜在辐射剂量：对于AsPc1、BxPc3、Hs766T和CaPan1，注射剂量分别为12,230cGy/mCi、10,684cGy/mCi、6,835cGy/mCi和15,843cGy/mCi。鉴于实际最大耐受剂量(MTD)为0.7mCi，PAM4可以为每个异种移植的肿瘤模型提供相当大的拉德剂量。在每种肿瘤系中，放射性标记PAM4的血液水平显著(P<0.01-0.001)低于非特异性Ag8。PAM4对血液的潜在辐射剂量比Ag8对血液的潜在辐射剂量低1.4-4.4倍。当将PAM4对肿瘤的辐射剂量归一化至PAM4的血液剂量时，肿瘤所接受的剂量分别比血液的高2.2、3.3、3.4和13.1倍。重要地，对非肿瘤组织的潜在辐射剂量最小。
采用CaPan1肿瘤模型，将PAM4的生物分布与抗-CEA抗体AMN-14进行比较。在早期时间点，肿瘤内的PAM4浓度比MN-14浓度高得多，在第3天时肿瘤:血液比值对于PAM4为12.7±2.3，相比之下，对于MN-14为2.7±1.9。虽然在早期时间点肿瘤内的PAM4摄取显著高于MN-14(第1天--P<0.001；第3天--P<0.01)，但是剂量测定分析表明，在14天的研究期间内PAM4对肿瘤的剂量仅比MN-14对肿瘤的剂量高出3.2倍。这是由于PAM4从肿瘤中迅速清除，致使在较晚时间点在肿瘤中存在的这两种抗体的浓度相似。也在BxPc3和Hs766T肿瘤模型中观察到PAM4从肿瘤中迅速清除，但未在AsPc1肿瘤模型中观察到。这些观察结果与所报道的其它抗粘蛋白抗体例如G9和B72.3在结肠直肠癌中的结果不同，其中每种抗体都表现出比MN-14抗体长的保留时间。对PAM4代谢研究的结果表明，在初始结合到肿瘤细胞上后，抗体迅速释放，可能发生异化或者作为抗原:抗体复合物脱落。血液清除也非常迅速。这些数据表明，对于治疗应用，131I可能是不适当选择的同位素。可频繁施用的短寿命同位素例如90Y或188Re可能是更有效的试剂。
PAM4没有显示出靶向正常组织的证据，除了在CaPan1肿瘤模型中，在这里观察到少量但统计学显著性的脾脏摄取(在第3天，范围为3.1-7.5%ID/g)。这种类型的脾脏靶向已在抗粘蛋白抗体B72.3和CC49的临床应用中观察到。重要地，这些研究还报道了脾脏靶向既不影响抗体的肿瘤摄取，也不干扰核扫描的解释。这些研究表明，脾脏靶向既不是由脾脏中的交叉反应性抗原引起，也不是由Fc受体的结合引起，而是由下面可能性中的一种或多种引起：直接靶向脾脏中捕获的抗原，或者间接摄取在血液中形成的或从肿瘤部位释放的抗原:抗体复合物。后者要求血液中存在免疫复合物。然而，当通过将放射性标记抗体作为天然物质洗脱的凝胶过滤(HPLC,GF-250柱)检查早至5分钟和迟至7天的样本时并未观察到免疫复合物。鉴于CaPan1肿瘤产生比所检查的其它肿瘤细胞系高出100至1000倍的大量的PAM4反应性抗原这一事实，前者的解释似乎更可能。这些其它肿瘤细胞系中缺乏PAM4的脾脏靶向表明，这个现象与过多抗原的产生有关。通过将蛋白质剂量从原始2μg剂量增加至10μg剂量，可以克服脾脏靶向。推测较大量的脾脏捕获的抗原与未标记的PAM4复合，而不与放射性标记抗体复合。增加蛋白质剂量对于PAM4对肿瘤组织或非肿瘤组织的靶向没有不良影响。实际上，蛋白质剂量增加至100μg时，是CaPan1肿瘤内放射性标记PAM4浓度的两倍以上。
实施例4.无胸腺裸小鼠中原位胰腺肿瘤模型的开发
为了更接近动物模型中胰腺癌的临床表现，我们通过将肿瘤细胞直接注射到胰腺头中而开发出原位模型。原位CaPan1肿瘤进行性生长，没有出现明显的症状，直至产生腹水，并在10至14周死亡。到移植后3至4周时，动物形成可触知的约0.2g的肿瘤。在生长的8周内，观察到约1.2g的原发性肿瘤以及进入肝脏和脾脏中的转移瘤(1-3个转移瘤/动物；每个肿瘤<0.1g)。在10至14周时，产生腹水的隔膜接种是明显的。腹水形成和偶发性黄疸通常是肿瘤生长的第一个明显的指征。这时肿瘤会相当大，有1至2g重，大多数情况下动物会在3至4周后死亡。
施用给荷有4周龄原位肿瘤(约0.2g)的动物的放射性标记131I-PAM4表现出对原发性肿瘤的特异性靶向，定位指数第1天为7.9±3.0，在第14天增加至22.8±15.3。没有观察到特异性靶向其它组织的证据。在一种观察到肿瘤转移到肝脏和脾脏的情况下，这两种转移瘤都被靶向并且具有高浓度的放射性标记抗体。另外，大约一半的动物在切口部位形成皮下肿瘤。在同一动物的原位和皮下肿瘤靶向上没有观察到显著性差异，并且无论动物是否带有另外的皮下肿瘤都没有在原位肿瘤靶向上观察到显著性差异。PAM4的估计辐射剂量对于原发性肿瘤和血液分别为6,704cGy/mCi和1,655cGy/mCi。
实施例5.胰腺癌的实验性放射免疫疗法
利用在无胸腺小鼠中作为皮下异种移植物生长的CaPan1肿瘤进行131I-PAM4治疗用途的初步研究。在实验中，向荷有0.25g肿瘤的动物施用350μCi131I-PAM4，还将其与相似剂量的非特异性Ag8的治疗效果进行比较。向荷有1cm3肿瘤的动物施用的131I-PAM4的MTD是700μCi。到5周和6周时，经PAM4治疗的动物显示出肿瘤显著消退，甚至在27周时，8只动物中有5只仍保持无瘤。未治疗动物和经Ag8治疗的动物显示出肿瘤生长迅速进展，但在这两个对照组间观察到显著性差异。在7周，来自未治疗组的肿瘤自开始时间点生长了20.0±14.6倍，而经131I-Ag8治疗的肿瘤仅生长了4.9±1.8倍。在这个时间点，PAM4肿瘤已消退到其原始大小的0.1±0.1倍，与未治疗动物(P<0.001)和经非特异性Ag8-治疗的动物(P<0.01)均有显著性差异。
这些数据表明，CaPan1肿瘤对131I-PAM4的治疗敏感。结果，也就是说肿瘤的消退或进展取决于包括原始肿瘤大小在内的数个因素。因而，对荷有0.25g、0.5g、1.0g或2.0g CaPan1肿瘤负荷的动物组用单剂350μCi131I-PAM4进行治疗。大多数带有原始大小为0.25g和0.5g的肿瘤的动物(每组10只动物中的9只)显示出治疗后肿瘤消退或生长抑制长达至少16周。在1.0g肿瘤组中，7只动物中的5只显示没有肿瘤生长长达16周，而在2.0g肿瘤组中，9只动物中的6只显示没有肿瘤生长长达6周，之后肿瘤开始生长。虽然单剂350μCi对于较大肿瘤不是那么有效，但是单剂可能不是大肿瘤的合适方案。
毒性研究表明，给予多个周期的放射免疫疗法的能力，这对于较大的肿瘤负荷可能更有效。给予荷有平均1.0g CaPan1肿瘤的动物单剂350μCi131I-PAM4、在零时间点和4周时给予2剂，或者不治疗。未治疗组的平均存活时间为3.7±1.0周(存活时间定义为肿瘤达到5cm3的时间)。早在3周就有动物死亡，无动物存活超过6周。单剂350μCi131I-PAM4使存活时间显著地增加至18.8±4.2周(P<0.0001)。动物死亡范围从13周延长至25周。在26周的研究期结束时，没有动物活着。
观察到与单剂组相比，两剂组的存活时间显著性增加。在26周时间点，有一半动物活着，肿瘤大小为1.0-2.8cm3，自原始肿瘤大小的平均肿瘤生长速率为1.6±0.7倍。对于那些在26周没有存活着的动物，平均存活时间(17.7±5.3周)与单剂组相似。
还采用原位肿瘤模型，进行利用PAM4的治疗研究。对荷有4周龄原位肿瘤(估计肿瘤重量为0.25g)的动物组不加以治疗，或者用单剂350μCi131I-PAM4或350μCi131I-非特异性Ag8进行治疗。到10周时，未治疗动物的死亡率50%，并且在第15周时无存活者。在肿瘤生长4周时施用非特异性131I-Ag8的动物显示在7周时的死亡率为50%，并且在第14周时无存活者。虽然这两组之间没有统计学差异(logrank分析)，但经Ag8治疗的动物可能发生辐射中毒。放射性标记PAM4与未治疗动物或经Ag8治疗的动物相比具有显著存活优势(P<0.001)，16周即实验结束时的存活率为70%。此时处死存活动物从而测定肿瘤大小。所有动物的肿瘤平均重量为1.2g，以及7只动物中的4只中明显出现一个或两个小(<0.1g)转移瘤。生长16周时，这些肿瘤比8周龄肿瘤更有代表性。
实施例6.
Figure BDA00001896026000761
化疗与131I-PAM4实验性放射免疫疗法的组合形式
将吉西他滨
Figure BDA00001896026000762
与131I-PAM4放射免疫疗法组合使用的初步研究作为测试板阵列(checkerboard array)进行；单剂吉西他滨(0、100、200、500mg/kg)与单剂131I-PAM4([MTD=700μCi]100%、75%、50%、0%的MTD)。发现组合MTD是500mg/kg吉西他滨和350μCi131I-PAM4(50%MTD)。根据体重减轻测量的毒性达到被认为无毒的最大值；即，体重减轻了20%。虽然组合的治疗方案比单独的吉西他滨更显著有效，但该治疗没有单独的放射免疫疗法有效。用低剂量的吉西他滨和放射免疫疗法进行下一步的研究，以检查是否可以观察到真正的协同治疗作用。在第0、3、6、9和12天给荷有约1cm3(约体重的5%)肿瘤的无胸腺裸小鼠施用100mg/kg吉西他滨，并在第0天给予100μCi131I-PAM4。观察到与单独的吉西他滨相比，肿瘤的统计学显著性(P<0.0001)消退(5个肿瘤中的2个小于0.1cm3)和/或生长抑制的治疗效果。因而，在治疗剂的剂量较低时，吉西他滨和放射免疫疗法的组合出人意料地似乎存在协同作用。另外注意到，依据体重，未观察到毒性。需要时，所述组合治疗方案可以以多个周期递送，其中第2个治疗周期开始于第4周，如对上述单独的放射免疫疗法研究所做的处理一样。
实施例7.PAM4抗体与转染的细胞系的结合
转染的胰腺细胞
利用如Hudson等(Amer.J.Pathol.148,3:951-60,1996)中所公开的和得自Dr.M.A.Hollingsworth (Univ.of Nebraska Medical Center,Omaha,NE)的MUC-1编码cDNA，转染不表达MUC-1粘蛋白的PanC1人胰腺腺癌细胞。MUC-1 cDNA编码MUC-1的30个串联重复序列(30TR)或42个串联重复序列(42TR)形式(Hudson等，1996;Lidell等，FEBS J.275:481-89,2008)。除了所编码的串联重复序列的数目之外，MUC-1序列是相同的。
通过对细胞培养上清液的酶免疫测定，检查用30TR或42TRMUC-1或对照载体(无插入片段或反向插入片段)转染的PanC1细胞或未转染PanC1细胞与PAM4抗体的反应性。未转染PanC1细胞和对照转染的PanC1细胞都没有产生可通过免疫测定的可检出水平的PAM4反应性粘蛋白(未示出)。然而，30TR和42TR MUC-1转染的细胞都与PAM4抗体有高反应性(未示出)。
利用更敏感的免疫测定再次检查转染的PanC1细胞。简言之，使细胞在T75烧瓶中生长直至它们达到约80%-90%的汇合度(初始接种后的约4至5天)。此时，收集废弃培养基，高速离心，并用于通过酶免疫测定对PAM4反应性粘蛋白进行定量。还收集细胞并进行计数。来自Dr.Hollingsworth的Panc1亲本细胞系和得自美国模式培养物保藏所(Manassas,VA)的单独的Panc1细胞系以及载体对照产生少量但可检出数量的PAM4反应性粘蛋白(分别为0.87±0.17、0.54±0.17和0.02±0.02μg/mL/106个细胞)，而30TR-MUC-1基因转染的细胞产生14.17±2.22μg/mL/106个细胞(30TR-MUC-1基因转染的培养基与所有其它样品比较，P<0.0003或更好)。
已报道用MUC-1 cDNA转染PanC1细胞除了增加所转染PanC1细胞的MUC-1表达之外，还对细胞蛋白表达产生次生效应，例如增加转染细胞(Hudson等，1996，Abstract)中，但仅增加用较大(42TR)MUC-1 cDNA转染的细胞中的细胞角蛋白8和18的水平(Hudson等，1996，第956页，第1栏，第3段)。
转染的肾细胞
MUC-1基因转染的HEK-293(人胚胎肾细胞)产生的MUC-1与MA5单克隆抗体有反应性，但与PAM4无反应性(未示出)。然而，如上所讨论，表达非常低水平的内源性MUC-1的MUC-1转染的PanC1细胞合成的MUC-1与PAM4有强反应性，而与MAb-MA5无反应性。利用数种细胞系的上清液时，异源性三明治免疫测定(PAM4→MA5和MA5→PAM4捕获/探针)没有运行产生信号。使用多克隆抗粘蛋白抗血清作为探针，用PAM4或MA5 MAb作为捕获试剂时，确实提供了有效的免疫测定。使用多克隆作为探针，这两种MAb在它们各自的免疫测定中的交叉阻断表明这些MAb与独立表位有反应性。
该数据表明PAM4和MA5表位没有共表达于相同的抗原分子中，并且PanC1细胞系可以具有产生PAM4表位的生物合成过程，而HEK-293细胞没有。MUC-1蛋白核心的转录后修饰的差异(特异性糖基转移酶的表达/活性)可能是产生这些研究结果的原因。
实施例8.试剂处理对PAM4抗原的免疫反应性的影响
用DTT处理胰腺粘蛋白PAM4抗原(室温下15分钟)，这完全破坏了它与PAM4的反应性(DTT-EC50,0.60+0.00μM)。MUC-1内唯一的半胱氨酸(胱氨酸桥)存在于跨膜结构域内，并且应当是DTT不可及的。MUC-1的分泌形式不含跨膜结构域，因而没有分子内胱氨酸桥。来自高碘酸盐氧化处理，即室温下用0.05M高碘酸钠处理PAM4抗原2小时的数据得出，与PAM4抗体的免疫反应性丧失40%(未示出)。进一步的高碘酸盐研究显示，与PAM4抗体的免疫反应性丧失了高达60%(未示出)。高碘酸盐和DTT研究结果表明PAM4表位从构象上依赖于某些极小的糖基化形式，并可能受分子间二硫键形成影响。
实施例9.PAM4抗原的分布和交叉反应性
PanIN内PAM4表位的表达对于MUC-1是非典型的。它与所报道的通过市售MAb-CLH2-2检测的MUC-5ac的表达相似。然而，将PAM4作为捕获试剂和MAb-CLH2-2作为探针的尝试性三明治免疫测定给出阴性结果。虽然这可能表明PAM4和CLH2-2表位可能重叠，因而彼此阻断，但CLH2-2被报道与42/66(64%)的胃癌有反应性，而PAM4 MAb仅与6/40(15%)的胃癌有反应性，当然这些仅为局灶反应性。
在EIA(用PAM4作为捕获试剂)中使用市售45M1，抗-MUC-5acMAb作为探针试剂提供了阳性结果，表明这两个表位可能存在于相同的抗原分子上。阻断研究(任一方向)表明由45M1和PAM4结合的表位实际是两个不同的表位，因为没有观察到阻断。由来自侵袭性胰腺癌的核心组成的组织微阵列标记已证明个体患者样本中45M1和PAM4表位的表达具有显著性差异。在28个样本当中，仅在17个病例(61%)中观察到一致性。PAM4与24/28病例(86%)有反应性，而45M1与13/28(46%)病例有反应性(未示出)。
这可能是因为在有关MUC-1基因转染的上述研究(实施例7)中，MUC-1的表达可能已经上调另一种粘蛋白的表达，或者以某种其它方式影响PAM4表位的暴露。高碘酸盐研究结果与糖基化作为PAM4抗原与PAM4抗体免疫反应的一个因素相一致。因而，利用核粘蛋白(apomucin)的研究结果对于抗原测定可能不是决定性的。
虽然基于EIA捕获，PAM4抗体似乎与45M1抗-MUC-5ac MAb结合至相同的抗原蛋白，但注意到MUC-5ac对胰腺癌没有特异性，并且还在许多正常组织(除了PAM4与其有反应性的胃粘膜以外的正常组织)中发现MUC-5ac。例如，在正常肺组织、结肠组织和其它组织中发现MUC-5ac。PAM4抗体不结合到正常肺组织上，除了上面指出的在少数样品中以及有限和极少量的结合的情况之外。
至于DTT和高碘酸盐的影响，可能是因为肽核心二硫桥键总是相同的，不论是什么组织产生该蛋白质。特异性氨基酸序列应当以特定方式折叠，而与组织来源无关。然而，糖基化形式可能会根据组织来源的不同而不同。
实施例10.噬菌体展示肽与PAM4抗体的结合
用两种不同的噬菌体展示肽文库检查PAM4抗体结合。第一种是由12个氨基酸序列组成的线性肽文库，第二种是由通过二硫桥键环合的7个氨基酸序列组成的环状肽。我们交替地针对hPAM4和hLL2(抗-CD22抗体的阴性选择)淘选各个文库，总共淘选4轮，然后筛选与hPAM4和mPAM4有反应性，而对hLL2有很小或没有反应性的噬菌体展示的肽。丢弃以非特异性方式结合(即，结合到依帕珠单抗[hLL2]上)的噬菌体。
对于线性噬菌体展示的肽，鉴定出序列WTWNITKAYPLP(SEQID NO:7)30次(在35个测序噬菌体中)，每次均显示与PAM4抗体有反应性。进行突变分析，其中如上构建基于这个序列并在每个位置具有7.5%的简并性的文库，并进行淘选和筛选。注意到所获得的PAM4结合呈阳性的19个肽序列的变化性，其中7个与亲本序列相同，5个具有序列WTWNITKEYPQP(SEQ ID NO:62)，其余几个是独特存在的。表6显示这种突变分析的结果。上面一排列出鉴定的序列，下面一排列出其中的每种氨基酸在那个位置被鉴定出的频率。亲本序列最频繁出现(加粗)，下一个最高变化是位置8处的A被E置换和位置11处的L被Q置换。这些置换似乎对免疫反应性没有很大影响。
表6.结合到PAM4抗体上的线性肽的噬菌体展示氨基酸序列(SEQID NO:113)变化
Figure BDA00001896026000811
利用噬菌体展示的环状文库获得的结果与线性文库显著不同(表7)。所检查的35个肽序列的33个中存在序列ACPEWWGTTC(SEQID NO:63)。环状文库分析给出下列结果(带星号位置无变化并且没有经受文库中的选择压力(selective presssure))。
表7.结合到PAM4抗体上的线性肽的噬菌体展示氨基酸序列(SEQID NO:114)变化
Figure BDA00001896026000821
两个半胱氨酸(在位置2和10处)形成二硫桥键。位置9处的T被任何氨基酸置换都极大地影响免疫反应性。与在共有肽序列C末端表现出同源性的上面所示的环状肽序列相比，序列GTTGTTC (SEQID NO:64)在MUC-5ac蛋白内朝向氨基末端存在。然而，环状肽与PAM4抗体的免疫反应性仅为线性序列与PAM4抗体的免疫反应性的10%。线性和环状共有序列都与半胱氨酸关联，这可能或可能不与DTT对PAM4抗原免疫反应性的影响有关。
本文报道的结果表明，PAM4表位依赖于可由二硫桥键产生的特定构象，以及特定糖基化形式。
实施例11.在胰腺炎样本中的胰腺癌的免疫组织学
数种病理病状使患者容易罹患胰腺癌，例如胰腺炎、糖尿病、抽烟和许多其它病理状况。在这种预先选定的组的患者中，筛选措施对于胰腺瘤变的早期检测特别重要。我们检查9个来自初步诊断患有慢性胰腺炎的患者的慢性胰腺炎组织样本。我们采用抗-CD74MAb、LL1作为炎性浸润的指示剂，MAb-MA5作为胰腺导管和腺泡细胞的阳性对照。然而，这两个对照MAb提供了与胰腺炎一致的免疫组织学证据，在任何情况下PAM4都不与炎性胰腺组织反应。然而，在一个病例中，该组织样本中还存在中分化的胰腺腺癌。PAM4使得这个肿瘤内的赘生性细胞为强染色。在第二个病例中，当发炎组织呈PAM4阴性时，鉴定出PAM4标记的小PanIN前驱病变。在这个后者样本中PanIN的标记与诊断为患有非恶性疾病的患者的胰腺瘤变的早期检测一致。这些结果表明，利用PAM4抗体可以在良性胰腺组织的背景下以高敏感度和选择性对胰腺瘤变进行检测和/或诊断。
实施例12.对患有不宜手术并且转移的胰腺癌的患者的治疗
患者118-001，CWG是63岁男性，2007年11月被诊断为患有IV期胰腺腺癌伴有多个肝脏转移瘤。他同意采取组合的放射免疫疗法和吉西他滨化疗作为第一治疗策略，给予他6.5mCi/m2 90Y-hPAM4组合200mg/m2吉西他滨的第一治疗周期，其中吉西他滨在1-4周每周给予一次，90Y-hPAM4在2-4周每周给予一次(3剂)。2个月后，重复相同的治疗周期，因为在第一个治疗周期之后未观察到较大的毒性。在第一个治疗周期后的4周，令人惊讶地观察到原发性肿瘤和3个肝脏转移瘤中的2个直径减小的CT证据，并且这与FDG-PET扫描的SUV值的显著性减小一致，其中4个肿瘤中的3个此时恢复到正常本底SUV水平(图6和图7)。该患者的CA-19.9水平从治疗前的1,297降低到77的低水平，进一步支持该治疗是有效的。表8显示利用90Y-hPAM4的放射免疫疗法组合吉西他滨化疗对这位患者的治疗效果。令人惊讶和意外地，如此低剂量的缀合到抗体上的放射性核素，组合如此低的无毒性剂量的吉西他滨甚至在单个疗程的这种治疗之后就表现出这样的抗肿瘤活性。
表8.利用90Y-hPAM4的放射免疫疗法组合吉西他滨化疗对转移性胰腺癌的治疗效果
Figure BDA00001896026000831
实施例13.对患有不宜手术的转移性胰腺癌的患者的治疗
一位56岁男性患者，患有广泛的不宜手术的胰腺腺癌，伴有直径为1至4cm范围的数个肝脏转移瘤、体重明显减轻(体重30磅或以上)、轻度黄疸、嗜睡和乏力以及需要药物治疗的腹痛，每周给他输注4次各200mg/m2剂量的吉西他滨。在最后3次吉西他滨输注中，以10mCi/m2 90Y和20mg抗体蛋白的剂量施用90Y-DOTA-hPAM4放射性标记人源化抗体，在2小时内静脉输注。2周后，给予该患者由每周静脉输注3剂600mg/m2组成的吉西他滨化疗疗程。4周后对该患者进行评估，该患者患有轻度白细胞减少症(2级)，无其它超过基线的较大的血液或酶变化，但血液CA19.9滴度有所改善，从5,700降低到1,200，而且黄疸减轻，总主观症状得到改善。接着在3周后重复给予较低剂量吉西他滨(每周1次x4周)与3剂90Y-DOTA-hPAM4的治疗周期。4周后，重新评估该患者，CT和PET扫描证实总肿瘤质量(原发性癌症和转移瘤)减少约40%，CA19.9滴度进一步降低至870。该患者恢复食欲和活力，并能够返回到更多的日常活动中而不需要止痛药。在开始这项实验性治疗后他的体重增加12磅。6周后，重复扫描和血液值表明这种反应得到保持。
实施例14.用于预靶向的停靠和锁定(DNL)构建体的制备
DDD和AD融合蛋白
DNL技术可以用来制备包含几乎任何抗体或其片段或其他效应部分的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等。对于某些优选的实施方案，IgG抗体或Fab抗体片段可以作为含有二聚化和停靠结构域(DDD)序列或锚定结构域(AD)序列的融合蛋白生成。虽然在某些优选的实施方案中，DDD和AD部分作为融合蛋白生成，但技术人员将会意识到在要求保护的方法和组合物的范围内可以采用其它缀合方法，例如化学交联或点击化学。
双特异性抗体可以通过将第一抗体的Fab-DDD融合蛋白与第二抗体的Fab-AD融合蛋白组合来形成。或者，可以制备组合IgG-AD融合蛋白和Fab-DDD融合蛋白的构建体。该技术不是限制性的，任何有用的蛋白质或肽都可以作为AD或DDD融合蛋白生成以便并入DNL构建体中。如果利用化学交联，则AD和DDD缀合物不限于蛋白质或肽，并可以包含可采用本领域已知的任何交联技术交联至AD或DDD序列的任何分子。在某些示例性实施方案中，聚乙二醇(PEG)或其它聚合物部分可以并入到DNL构建体中，如下面进一步详细描述的。
对于预靶向应用，可将含有针对与患病组织相关的抗原，例如肿瘤相关抗原(TAA)的结合位点的抗体或片段，与结合可靶向构建体上的半抗原的第二抗体或片段组合，所述可靶向构建体上连接有治疗剂和/或诊断剂。将基于DNL的双特异性抗体施用给受试者，允许循环抗体从血液中清除并定位于靶组织，然后加入缀合的可靶向构建体，所述缀合的可靶向构建体结合到用于诊断或治疗的定位的抗体上。
可以为每种Fab或IgG融合蛋白开发独立的转基因细胞系。模块一经生成，便可以根据需要将模块纯化或者保持在细胞培养上清液中。生成之后，可将任何DDD融合蛋白模块与任何AD融合蛋白模块组合从而产生双特异性DNL构建体。对于不同类型的构建体，可以利用不同的AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供在下面。
DDD1:
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:65)
DDD2:
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:66)
AD 1:QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:67)
AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO:68)
技术人员将会意识到，DDD1和DDD2包含蛋白激酶A人RIIα形式的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可以基于蛋白激酶A人RIα形式的DDD序列，和相应的AKAP序列，如下面DDD3、DDD3C和AD3中所示例。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO:69)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO:70)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO:71)
表达载体
质粒载体pdHL2已用于生成许多抗体和基于抗体的构建体。参见，Gillies等，J Immunol Methods(1989),125:191-202;Losman等，Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体指导IgG的重链和轻链合成。该载体序列对于许多不同的IgG-pdHL2构建体而言大部分相同，而仅在可变结构域(VH和VL)序列上存在差异。利用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可以将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和人RIIα的前44个残基(称为DDD1)的序列替代。为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和称为AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1)的序列替代，所述17个残基的合成AD采用生物信息学和肽阵列技术产生并显示以非常高的亲和性(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445-50。
设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)端和SacII限制核酸内切酶位点组成，所述SacII限制核酸内切酶位点是CH1编码序列的5’。右侧引物由编码铰链(PKSC(SEQ ID NO:115))前4个残基的序列组成，所述残基后面是4个甘氨酸和丝氨酸，最后两个密码子(GS)包含Bam HI限制位点。将410 bp PCR扩增引物克隆到
Figure BDA00001896026000871
PCR克隆载体(Inc.)中，并根据T7(5’)方向的插入片段来筛选克隆。
命名为(G4S)2DDD1(公开为SEQ ID NO:116的'(G4S)2')的双链寡核苷酸由Sigma(Haverhill,UK)合成，以编码DDD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列前面是接头肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。下面示出编码的多肽序列。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFA VEYFTRLREARA(SEQ ID NO:72)
合成在其3’端有30个碱基对重叠的命名为RIIA1-44上和RIIA1-44下的两个寡核苷酸，并对它们进行组合从而包含174bpDDD1序列的中心154个碱基对。使该寡核苷酸退火，并用Taq聚合酶对其进行引物延伸反应。引物延伸之后，通过PCR扩增双链体。将该扩增引物克隆到
Figure BDA00001896026000881
中，并根据T7(5’)方向的插入片段进行筛选。
合成双链寡核苷酸，以编码AD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列前面是接头肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。下面示出编码的多肽序列。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:73)
合成编码上述肽序列的两个互补重叠的寡核苷酸，命名为AKAP-IS上和AKAP-IS下，并使其退火。通过PCR扩增该双链体。将扩增引物克隆到
Figure BDA00001896026000882
载体中并根据T7(5’)方向的插入片段进行筛选。
连接DDD1与CH1
利用BamHI和NotI限制酶从中切除编码DDD1序列的190bp片段，然后将其连接到
Figure BDA00001896026000884
中的相同位点处从而产生穿梭载体
Figure BDA00001896026000885
连接AD1与CH1
利用BamHI和NotI从中切除含有AD1序列的110bp片段，然后将其连接到
Figure BDA00001896026000887
中的相同位点处从而产生穿梭载体
Figure BDA00001896026000888
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体中
利用这种模块设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1并入到pdHL2载体中的任何IgG构建体中。将整个重链恒定结构域用上述构建体之一替代，通过从pdHL2中除去SacII/EagI限制片段(CH1-CH3)，并将它用从各自的pGemT穿梭载体中切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段替代。
构建h679-Fd-AD1-pdHL2
h679-Fd-AD1-pdHL2是用于生成h679Fab的表达载体，其中AD1经由14个氨基酸残基构成的柔性Gly/Ser肽间隔序列偶联至Fd的CH1结构域的羧基末端。将含有h679的可变结构域的基于pdHL2的载体转化为h679-Fd-AD1-pdHL2，通过将SacII/EagI片段用利用SacII和EagI从CH1-AD1-SV3穿梭载体中切除的CH1-AD1片段替代。
构建C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于生成稳定二聚体的表达载体，所述稳定二聚体包含两个拷贝的融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14，其中DDD1经由柔性肽间隔序列在CH1羧基末端连接至hMN-14Fab。将已用于生成hMN-14 IgG的质粒载体hMN-14(I)-pdHL2转化为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2，通过用SacII和EagI限制核酸内切酶进行消化从而除去CH1-CH3结构域，并插入利用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体中切除的CH1-DDD1片段。
已采用同样的技术生成用于多种多样的已知抗体的Fab表达的质粒，所述已知抗体例如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其它抗体。一般地，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体中，如上所述转化所述表达载体以生成AD或DDD融合蛋白。可以将包含此种抗体中任何一种的Fab片段的AD融合蛋白和DDD融合蛋白，以大约2个DDD融合蛋白/1个AD融合蛋白的比率组合，从而产生包含第一抗体的两个Fab片段和第二抗体的一个Fab片段的三聚DNL构建体。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于生成C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有DDD2的二聚化和停靠结构域序列，所述DDD2经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附接至hMN-14的Fd羧基末端。分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用而固定在一起的两个相同拷贝的hMN-14Fab构成。
所述表达载体如下进行工程化。合成性制备两个重叠的互补寡核苷酸，其包含接头肽的一部分和DDD2的残基1-13的编码序列。使所述寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，在5’和3’端产生分别适合于与用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的突出端。
将所述双链DNA与通过用BamHI和PstI消化而制备的穿梭载体
Figure BDA00001896026000901
连接，从而产生穿梭载体
Figure BDA00001896026000902
用SacII和EagI从
Figure BDA00001896026000903
中切除507bp片段，并将其与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终的表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已采用类似的技术产生许多不同人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2
h679-Fab-AD2经设计作为B与作为A的C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于生成h679-Fab-AD2的表达载体，其具有AD2的锚定结构域序列，所述AD2经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附接至CH1结构域的羧基末端。AD2具有一个位于AD1的锚定结构域序列之前的半胱氨酸残基和另一个位于AD1的锚定结构域序列之后的半胱氨酸残基。
所述表达载体如下进行工程化。合成性制备两个重叠的互补寡核苷酸(AD2上和AD2下)，其包含AD2和接头序列的一部分的编码序列。使所述寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，在5’和3’端产生分别适合于与用限制核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的突出端。
将所述双链DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载体
Figure BDA00001896026000911
中，从而产生穿梭载体
Figure BDA00001896026000912
利用SacII和EagI限制酶从所述穿梭载体中切除含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段，并将其连接到通过用这些相同的酶消化制备的h679-pdHL2载体中。最终的表达载体命名为h679-Fd-AD2-pdHL2。
实施例15.从多个抗体生成AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白
采用前述实施例中描述的技术，构建表9中示出的IgG和Fab融合蛋白，并将其并入到DNL构建体中。所述融合蛋白保留了亲本抗体的抗原结合特征，并且所述DNL构建体表现出所并入抗体或抗体片段的抗原结合活性。
表9.包含IgG或Fab的融合蛋白
  融合蛋白   结合特异性
  C-AD1-Fab-h679   HSG
  C-AD2-Fab-h679   HSG
  C-(AD)2-Fab-h679   HSG
  C-AD2-Fab-h734   铟-DTPA
  C-AD2-Fab-hA20   CD20
  C-AD2-Fab-hA20L   CD20
  C-AD2-Fab-hL243   HLA-DR
  C-AD2-Fab-hLL2   CD22
  N-AD2-Fab-hLL2   CD22
  C-AD2-IgG-hMN-14   CEACAM5
  C-AD2-IgG-hR1   IGF-1R
  C-AD2-IgG-hRS7   EGP-1
  C-AD2-IgG-hPAM4   MUC
  C-AD2-IgG-hLL1   CD74
  C-DDD1-Fab-hMN-14   CEACAM5
  C-DDD2-Fab-hMN-14   CEACAM5
  C-DDD2-Fab-h679   HSG
  C-DDD2-Fab-hA19   CD19
  C-DDD2-Fab-hA20   CD20
  C-DDD2-Fab-hAFP   AFP
  C-DDD2-Fab-hL243   HLA-DR
  C-DDD2-Fab-hLL1   CD74
  C-DDD2-Fab-hLL2   CD22
  C-DDD2-Fab-hMN-3   CEACAM6
  C-DDD2-Fab-hMN-15   CEACAM6
  C-DDD2-Fab-hPAM4   MUC
  C-DDD2-Fab-hR1   IGF-1R
  C-DDD2-Fab-hRS7   EGP-1
  N-DDD2-Fab-hMN-14   CEACAM5
实施例16.用于DNL的序列变体
在某些优选的实施方案中，并入到DNL构建体中的AD和DDD序列包含如上所讨论的AD1、AD2、AD3、DDD1、DDD2、DDD3或DDD3C的氨基酸序列。然而，在替代实施方案中，AD和/或DDD部分的序列变体可以用于构建DNL复合物。例如，人PKA DDD序列仅存在4个变体，与PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分相对应。RIIαDDD序列是上面公开的DDD1和DDD2的基础。这四种人PKA DDD序列在下面示出。所述DDD序列表示RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(注意DDD1的序列是通过对人PKA RIIαDDD部分稍作修饰而得到的。)
PKA RIα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQ ID NO:74)
PKA RIβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO:75)
PKA RIIiα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO:76)
PKA RIIβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO:77)
AD和DDD结构域的结构功能关系已经是调查的主题。(参见，例如，Burns-Hamuro等，2005,Protein Sci 14:2982-92;Carr等，2001,J Biol Chem 276:17332-38;Alto等，2003,Proc Natl Acad Sci USA100:4445-50;Hundsrucker等，2006,Biochem J 396:297-306;Stokka等，2006,Biochem J 400:493-99;Gold等，2006,Mol Cell 24:383-95;Kinderman等，2006,Mol Cell 24:397-408，其中的每篇文献均以引用方式整体并入本文。)
例如，Kinderman等(2006)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人DDD序列含有许多对于二聚体形成或AKAP结合重要的保守氨基酸残基，在下面SEQ ID NO:65中加下划线标出。(参见Kinderman等，2006中的图1，该文献以引用方式并入本文。)技术人员将会意识到，在设计DDD序列的序列变体时，期望避免改变加下划线残基中的任何一个，而可以对对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基进行保守性氨基酸置换。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:65)
Alto等(2003)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析，以设计称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQ ID NO:67)，其对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列被设计为结合到PKA上的AKAP的肽拮抗剂。在AKAP-IS序列中，其置换往往会降低对DDD的结合的残基在SEQ ID NO:67中加下划线标出。技术人员将会意识到，在设计AD序列的序列变体时，期望避免改变加下划线残基中的任何一个，而可以对对于DDD结合不太关键的残基进行保守性氨基酸置换。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:67)
Gold(2006)利用结晶学和肽筛选开发SuperAKAP-IS序列(SEQID NO:78)，其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸置换的位置，所述氨基酸置换增强对RIIα的DDD部分的结合。在这个序列中，N-末端Q残基编号为残基号4，C-末端A残基是残基号20。可以进行置换以影响对RIIα的亲和性的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等，2006)。在某些替代实施方案中，认为可以用SuperAKAP-IS序列置换AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。可以置换AKAP-IS AD序列的其它替代序列在SEQ IDNO:79-81中示出。相对于AKAP-IS序列的置换加下划线标出。可以预料，与SEQ ID NO:68中所示的AD2序列一样，AD部分也可以包括另外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO:78)
替代AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:79)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:80)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:81)
Gold等的图2公开了另外的来自多种AKAP蛋白的DDD结合序列，如下面所示。
RII-特异性AKAP
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO:82)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO:83)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO:84)
RI-特异性AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO:85)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO:86)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO:87)
双重特异性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO:88)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO:89)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO:90)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO:91)
Stokka等(2006)也开发了结合到PKA上的AKAP的肽竞争剂，如SEQ ID NO:92-94中所示。所述肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ IDNO:92)、RIAD(SEQ ID NO:93)和PV-38(SEQ ID NO:94)。Ht-31肽对PKA的RII同种型表现出较大亲和性，而RIAD和PV-38对RI表现出较大亲和性。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO:92)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO:93)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO:94)
Hundsrucker等(2006)开发了另外其它结合到PKA上的AKAP的肽竞争剂，其对PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗肽的序列提供在Hundsrucker等的表1中，复制在下表10中。AKAPIS表示合成RII亚基结合肽。所有其它肽都来源于所指示的AKAP的RII结合结构域。
表10.AKAP肽序列
Figure BDA00001896026000971
Figure BDA00001896026000981
不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下面通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO:67)加下划线指示。所述残基与Alto等(2003)所观察到的相同，添加了C-末端丙氨酸残基。(参见，Hundsrucker等(2006)的图4，该文献以引用方式并入本文。)对RIIDDD序列有特别高的亲和性的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的那些。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：67)
Carr等(2001)检查了来自人和非人蛋白的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度，并在所述DDD序列中鉴定出在不同DDD部分中似乎最高度保守的残基。这些残基在下面通过参考SEQID NO:65的人PKA RIIαDDD序列加下划线指示。特别保守的残基通过用斜体进一步指示。所述残基与Kinderman等(2006)提出的对于对AKAP蛋白的结合而言重要的残基重叠但不相同。技术人员将会意识到，在设计DDD的序列变体时，最优选避免改变最保守的残基(斜体表示)，也优选避免改变保守的残基(加下划线)，而可以考虑对未加下划线也未用斜体表示的残基进行保守性氨基酸置换。
SHIQ
Figure BDA00001896026000991
P
Figure BDA00001896026000992
TE
Figure BDA00001896026000993
Q
Figure BDA00001896026000994
Y
Figure BDA00001896026000995
Q
Figure BDA00001896026000996
P
Figure BDA00001896026000997
VE
Figure BDA00001896026000998
VE
Figure BDA00001896026000999
TR
Figure BDA000018960260009910
REA
Figure BDA000018960260009911
A(SEQ ID NO:65)
技术人员将会意识到，可以利用DNL构建体的抗体部分或接头部分中的这些和其它氨基酸置换来增强所得DNL构建体的治疗特性和/或药物动力学特性。
实施例17.TF2DNL预靶向构建体的产生
通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得三聚DNL构建体，命名为TF2。如下产生试验批量的TF2，产率>90%。将蛋白质L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1的摩尔比混合。总蛋白质浓度为在含有1mM EDTA的PBS中的1.5mg/ml。后续步骤涉及TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP 291亲和色谱。在加入TCEP之前，SE-HPLC没有显示出a2b形成的任何证据。5mM TCEP的加入迅速导致a2b复合物的形成，与二元结构所预期的157kDa蛋白质一致。通过IMP 291亲和色谱(未示出)将TF2纯化至接近均质性。IMP 291是含有679Fab结合到其上的HSG半抗原的合成肽(Rossi等，2005,Clin Cancer Res11:7122s-29s)。IMP 291未结合级分的SE-HPLC分析表明a4、a2和游离κ链已从产物(未示出)中除去。
非还原SDS-PAGE分析表明大部分TF2作为大的共价结构存在，其相对迁移率与IgG(未示出)接近。另外的条带表明在所述实验条件(未示出)下二硫化物的形成不完全。还原SDS-PAGE表明在非还原凝胶中明显的任何另外的条带都是产物相关的(未示出)，因为仅代表TF2的组成多肽的条带是明显的(未示出)。然而，四种多肽中的每一种的相对迁移率太靠近以至于不能分离。MALDI-TOF质谱(未示出)揭示156,434Da的单峰，其在TF2计算质量(157,319Da)的99.5%之内。
通过
Figure BDA000018960260009912
分析测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原的a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)，并使其通过用HSG固定化的传感器芯片。对TF2的响应大约为这两个对照样品的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分结合到并保留在传感器芯片上。随后注入的WI2IgG、针对hMN-14的抗独特型抗体证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分，如另外的信号响应所指示的。由WI2与固定在传感器芯片上的TF2的结合产生的响应单位的额外增加对应于两个全功能性结合位点，每个均由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基贡献。这由TF2结合WI2的两个Fab片段(未示出)的能力证实。
实施例18.用于预靶向的TF10双特异性抗体的生成
采用类似的方案产生三聚TF10DNL构建体，其包含两个拷贝的C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝的C-AD2-Fab-679。TF10中的癌症靶向抗体组分来源于hPAM4，一种已作为放射性标记MAb被详细研究的人源化抗胰腺癌粘蛋白MAb(例如，Gold等，Clin.Cancer Res.13:7380-7387,2007)。半抗原结合的组分来源于h679，一种人源化抗-组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)MAb。采用如上所述的所公开的用于生成(抗CEA)2x抗HSG bsAb TF2的方法来生成TF10双特异性([hPAM4]2xh679)抗体。TF10构建体带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。
两种融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)独立地表达于稳定转染的骨髓瘤细胞中。合并组织培养上清液，导致2倍摩尔过量的hPAM4-DDD。将该反应混合物在使用1mM还原型谷胱甘肽的温和还原条件下于室温孵育24小时。还原后，通过使用2mM氧化型谷胱甘肽的温和氧化来完成DNL反应。通过使用以高特异性结合到h679Fab上的IMP 291-亲和凝胶树脂的亲和色谱来分离TF10。
已针对正进入临床试验的hPAM4 IgG和抗-CEA x抗-HSGbsMAb检查了全面的组织组织学和血液细胞结合板(panel)。在1/3的样本中，hPAM4结合被限制成以非常弱的结合力结合到膀胱和胃上(没有发现体内结合)，对正常组织没有结合归因于抗-CEA x抗-HSGbsMAb。此外，针对带有H1和H2组胺受体的细胞系的体外研究表明，IMP 288二-HSG肽没有拮抗或激动活性，并且在2个不同物种中进行的动物研究表明，与所述组胺组分相关的肽在比成像所用剂量高20,000倍的剂量下没有药理活性。因此，HSG-组胺衍生物不具有药理活性。
实施例19.采用预靶向技术使用TF10双特异性抗体和111In-标记肽的成像研究
下面的研究证明采用预靶向技术使用并入了hPAM4的双特异性抗体和标记肽进行体内成像的可行性。如前述实施例中所述制备包含两个拷贝的C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝的C-AD2-Fab-679的TF10双特异性抗体。采用预靶向技术使用TF10和111In-IMP-288肽，对荷有0.2至0.3g人胰腺癌异种移植物的裸小鼠进行成像。图8所示结果证明，采用bsMAb预靶向方法使用111In-标记的二-HSG肽IMP-288在动物模型中检测到的肿瘤轮廓有多清晰。图8顶部的六只动物接受2种不同剂量的TF10(与给定肽摩尔数的摩尔比为10:1和20:1)，并在第二天给予它们111In-标记的二HSG肽(IMP 288)。图8底部的另3只动物仅接受111In-IMP-288(无预靶向)。图像是在注射标记肽后3h获取的，该图像显示出预靶向动物中0.2至0.3g肿瘤的清晰定位，给予单独111In-肽的动物中没有肿瘤定位。肿瘤摄取平均为20-25%ID/g，其中肿瘤/血液比值超过2000:1，肿瘤/肝脏比值为170:1，且肿瘤/肾脏比值为18/1。
实施例20.用于预靶向和18F标记的靶向肽的生成
在多种实施方案中，18F标记的蛋白质或肽采用新技术制备并用于诊断和/或成像研究，例如PET成像。用于18F标记的新技术涉及18F-金属复合物，优选18F-铝复合物的制备，所述复合物螯合到螯合部分例如DOTA、NOTA或NETA或者其衍生物上。可以采用本领域熟知的缀合技术，使螯合部分连接至蛋白质、肽或任何其它分子。在某些优选的实施方案中，首先在溶液中形成18F-Al复合物，然后使其连接至已经缀合到蛋白质或肽上的螯合部分。然而，在替代实施方案中，可以首先使铝连接至螯合部分，然后加入18F。
肽合成
采用Fmoc策略通过固相肽合成法合成肽。通过使用允许差异化脱保护的Fmoc/Aloc保护基将基团添加至二氨基氨基酸的侧链。Aloc基团按照Dangles等(J.Org.Chem.1987,52:4984-4993)的方法除去，除了以与所用乙酸的1:1比例加入哌啶之外。按照McBride等(美国专利申请公布第2005/0002945号，其实施例部分以引用方式并入)中描述的方法制备不对称的四叔丁基DTPA。
三叔丁基DOTA、不对称的四叔丁基DTPA、ITC-苄基DTPA、p-SCN-Bn-NOTA和TACN得自
Figure BDA00001896026001021
(Dallas,TX)。DiBocTACN、NODA-GA(tBu)3和NO2AtBu购自CheMatech(Dijon,France)。Aloc/Fmoc赖氨酸和Dap(二氨基丙酸衍生物(也称Dpr))得自
Figure BDA00001896026001022
(Louisville,KY)或(Torrance,CA)。Sieber酰胺树脂得自
Figure BDA00001896026001024
(San Diego,CA)。其余Fmoc氨基酸得自(Burlington,MA)、EMD
Figure BDA00001896026001026
(San Diego,CA)、
Figure BDA00001896026001027
(Wood Dale,IL)或
Figure BDA00001896026001028
氯化铝六水合物购自
Figure BDA00001896026001029
(Milwaukee,WI)。其余溶剂和试剂购自FISHER
Figure BDA000018960260010210
(Pittsburgh,PA)或
Figure BDA000018960260010211
(Milwaukee,WI)。18F由IBA
Figure BDA000018960260010212
(Somerset,NJ)供应。
IMP 272的18F-标记
制备并用18F标记的第一种肽是IMP 272：
DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2MH+1512
如(美国专利第7,534,431号，其实施例部分以引用方式并入本文)所述合成IMP 272。
乙酸盐缓冲溶液-将1.509g乙酸稀释在~160mL水中，并通过添加1M NaOH调节pH，然后稀释至250mL从而制备0.1M pH 4.03溶液。
乙酸铝缓冲溶液-通过将0.1028g AlCl3六水合物溶解在42.6mLDI水中来制备铝溶液。将4mL铝溶液的等分试样与16mL 0.1M pH4NaOAc溶液混合从而提供2mM Al储液。
IMP 272乙酸盐缓冲溶液-将0.0011g肽、7.28x10-7mol IMP 272溶解在364μL0.1M pH 4乙酸盐缓冲溶液中从而获得2mM肽储液。
IMP 272的F-18标记-将3μL铝储液的等分试样放入REACTI-VIALTM中并使其与50μL 18F(按原样)和3μL IMP 272溶液混合。将溶液在110℃的加热块中加热15min，并通过反相HPLC分析。HPLC分析(未示出)显示93%18F是游离的，7%18F结合到肽上。向反应液中加入另外的10μL IMP 272溶液，再次加热并通过反相HPLC(未示出)分析。HPLC跟踪显示，8%18F位于空隙体积中，92%的活性连接至肽。将肽溶液的剩余部分与150μL PBS在室温下孵育~1小时，然后通过反相HPLC检查。HPLC(未示出)显示，58%18F未结合，而42%18F仍连接至肽。该数据表明18F-Al-DTPA复合物在与磷酸盐混合时可能是不稳定的。
通过将标记肽溶液加到1cc(30mg)
Figure BDA00001896026001031
HLB柱(料号186001879)上并用300μL水洗涤从而除去未结合的F-18，如此纯化标记肽。通过用2x 100μL1:1 EtOH/H2O洗涤柱来洗脱肽。将纯化的肽在水中在25℃孵育，并通过反相HPLC(未示出)分析。HPLC分析显示18F-标记的IMP 272在水中不稳定。在水中孵育40min后，约17%的18F从肽中释放，而83%保留(未示出)。
该肽(16μL2mM IMP 272,48μg)用18F标记，并通过体积排阻HPLC分析它对抗体的结合。体积排阻HPLC显示，该肽结合hMN-14x 679，但不结合无关的双特异性抗体hMN-14x734(未示出)。
利用其它金属的IMP 27218F标记
将~3μL金属储液的等份试样(6x 10-9mol)放入聚丙烯锥形瓶中，并与75μL18F(按原样)混合，在室温下孵育~2min，然后与20μL2mM(4x 10-8mol)IMP 272溶液在0.1M pH 4NaOAc缓冲液中混合。将该溶液在100°C的加热块中加热15min，并通过反相HPLC分析。IMP 272用铟(24%)、镓(36%)、锆(15%)、镥(37%)和钇(2%)(未示出)标记。这些结果证明，18F金属标记技术不限于铝配体，而还可以利用其它金属。对于不同的金属配体，可以利用不同的螯合部分来优化F-18-技术缀合物的结合。
血清稳定的18F-标记肽IMP 449的生成和使用
在Sieber酰胺树脂上制备肽IMP448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1009，通过将下列氨基酸以所示的顺序加入到该树脂上进行：添加Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，裂解Aloc，添加Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，裂解Aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH，最后裂解Fmoc从而制备所需的肽。然后从树脂上裂解肽并通过HPLC纯化从而产生IMP 448，然后使IMP 448偶联至ITC-苄基NOTA。将0.0757g(7.5x10-5mol)肽IMP 448与0.0509g(9.09x10-5mol)ITC苄基NOTA混合，并溶解在1mL水中。然后向搅拌的肽/NOTA溶液中缓慢地加入无水碳酸钾(0.2171g)。在加入所有碳酸盐之后反应液的pH为10.6。将该反应物在室温下搅拌过夜。14小时后，小心地用1M HCl淬灭反应，并通过HPLC纯化从而获得48mg IMP 449。
IMP449的18F标记
将肽IMP 449(0.002g,1.37x10-6mol)溶解在686μL(2mM肽溶液)0.1M NaOAc pH 4.02中。将3微升的2mM Al在pH 4乙酸盐缓冲液中的溶液与15μL,1.3mCi 18F混合。然后将该溶液与20μL 2mMIMP 449溶液混合，并在105℃下加热15min。反相HPLC分析显示，35%(tR~10min)的活性连接至肽，65%的活性从柱中的空隙体积中洗脱(3.1min，未示出)，表明大部分活性与该肽无关。将粗制的标记混合物(5μL)与汇集的人血清混合，并在37℃下孵育。15min后取出等分试样，并通过HPLC分析。HPLC显示9.8%的活性仍连接至肽(从35%下降)。1小时后取出另一等分试样，并通过HPLC分析。HPLC显示7.6%的活性仍连接至肽(从35%下降)。这基本上与15min的跟踪结果相同(数据未示出)。
高剂量18F标记
使用纯化IMP 449进行的进一步研究证明，18F标记的肽在37℃人血清中高度稳定(91%，未示出)至少1小时，并且在37℃人血清中部分稳定(76%，未示出)至少4小时。进行另外的研究，其中在作为稳定剂的抗坏血酸的存在下制备IMP 449。在这些研究(未示出)中，金属-18F-肽复合物在37℃血清中4小时后没有显示可检测到的分解。在注射18F标记的肽后30min，发现小鼠尿中含有结合到肽上的18F(未示出)。这些结果证明本文公开的18F标记的肽在用于18F成像研究的近似体内条件下表现出足够的稳定性。
对于在不存在抗坏血酸情况下的研究，将~400μL水中的~21mCi 18F与9μL 0.1M pH 4NaOAc中的2mM AlCl3混合。加入60μL(0.01M,6x10-7mol，在0.5NaOH pH 4.13中)肽IMP 449，并将该溶液加热至110℃持续15min。然后通过如下方式纯化粗制的标记肽：将反应溶液放入1cc
Figure BDA00001896026001051
HLB柱桶中并用水洗脱从而除去未结合的18F，接着用1:1EtOH/H2O洗脱18F标记的肽。使粗制的反应溶液通过柱进入废小瓶中，并用3x1mL级分的水(18.97mCi)洗涤柱。然后将HLB柱放在新小瓶上，并用2x200μL1:1EtOH/H2O洗脱从而收集标记肽(1.83mCi)。在所有洗脱完成之后，该柱保留了0.1mCi的活性。将纯化的18F-标记肽的等分试样(20μL)与200μL汇集的人血清混合，并在37℃下加热。通过反相HPLC分析等分试样。结果显示18F-标记的纯化IMP 449在37℃人血清中孵育0小时、1小时(91%标记肽)、2小时(77%标记肽)和4小时(76%标记肽)时的相对稳定性(未示出)。还观察到，18F-标记的IMP 449在TFA溶液中是稳定的，TFA溶液在反相HPLC色谱中偶尔使用。对于本文所述的示例性18F标记分子，观察到它在TFA中的稳定性和在人血清中的稳定性之间似乎存在一般相关性(general correlation)。这些结果证明，根据本文所公开的方法生成的18F标记肽在人血清中显示足够的稳定性，使其能成功地用于体内标记和成像研究，例如利用PET扫描来检测标记细胞或组织的研究。最后，因为IMP 449肽含有对辐射分解敏感的硫脲键合，所以通过RP-HPLC观察到数种产物。然而，当向反应混合物中加入抗坏血酸时，产生的副产物显著减少。
实施例21.使用预靶向性TF10 DNL构建体和18F标记肽的体内研究
18F标记IMP 449制备如下。将~0.5mL的54.7mCi 18F与3μL0.1M pH 4NaOAc缓冲液中的2mM Al的混合。3min后，加入10μL0.5M pH 4NaOAc缓冲液中的0.05M IMP 449，并将该反应物在96℃的加热块中加热15min。用注射器除去反应内容物。然后通过HPLC在C18柱上纯化粗制的标记肽。流速为3mL/min。缓冲液A是在水中的0.1%TFA，缓冲液B是在含有0.1%TFA的水中的90%乙腈。梯度是经15min从100%A至75/25A:B。首先洗脱的标记肽与未标记肽之间的保留时间(tR)差异为约1min。将HPLC洗脱物收集为0.5min(mL)级分。标记肽的tR为6至9min，这取决于所用的柱。通过将目标级分用水稀释两倍并将溶液放入1cc
Figure BDA00001896026001061
HLB柱桶中，如此进一步处理HPLC纯化的肽样品。用3x1mL水洗脱柱筒从而除去乙腈和TFA，接着用400μL 1:1EtOH/H2O洗脱18F标记肽。纯化的[Al18F]IMP 449作为单峰在分析HPLC C18柱上洗脱(未示出)。
将荷有四个缓慢生长的sc CaPan1异种移植物的
Figure BDA00001896026001071
裸小鼠用于体内研究。给3只小鼠注射TF10(162μg)，接着在18h后注射[Al18F]IMP 449。TF10是用于肿瘤成像研究的人源化双特异性抗体，其对PAM-4定义的肿瘤抗原二价结合，而对HSG单价结合(参见，例如，Gold等，2007,J.Clin.Oncol.25(18S):4564)。给1只小鼠注射单独的肽。肽注射后1小时，剖检所有小鼠。立即进行组织计数。对平均分布进行对比，结果显示在肿瘤靶向性双特异性抗体的存在下定位于肿瘤的18F标记肽的水平明显高于任何正常组织(数据未示出)。
给予单独[Al18F]IMP 449的动物或处于预靶向环境下的动物的组织摄取类似(数据未示出)。与给予单独肽的动物相比较，在1小时时，预靶向动物中人胰腺癌异种移植物CaPan1的摄取增加5倍(4.6±0.9%ID/g与0.89%ID/g)。此时获得优异的肿瘤/非肿瘤比值(例如，肿瘤/血液和肝脏的比值分别为23.4±2.0和23.5±2.8)。
结果证明，18F标记肽与含有PAM4的抗体构建体例如TF10 DNL构建体的结合使用为用于执行体内成像例如PET成像分析的18F标记提供了合适的靶向性。
实施例22.使用TF10的进一步成像研究
概述
临床前和临床研究已经证明放射性标记mAb-PAM4在胰腺癌的核成像和放射免疫治疗中的应用。我们已在本文检查TF10构建体在预靶向放射性标记肽从而改进成像和治疗的能力。在荷有CaPan1人胰腺癌异种移植物的裸小鼠中，进行放射性标记TF10和/或TF10预靶向的半抗原-肽(IMP-288)的生物分布研究和核成像。125I-TF10从血液中迅速清除，到16小时时其水平降低至<1%注射剂量/克(ID/g)。在这个时间点，肿瘤摄取为3.47±0.66%ID/g，并且在任何正常组织中都没有累积。为了证明预靶向途径的实用性，在施用TF10后16小时，施用111In-IMP-288。在放射性标记肽施用后第3小时，成像显示肿瘤内的摄取非常高，没有显示出任何正常组织中增积物的证据。在仅给予111In-肽的动物中观察到无靶向性。在16小时时，TF10-预靶向的111In-IMP-288的肿瘤摄取为24.3±1.7%ID/g，而对于单独的111In-IMP-288仅为0.12±0.002%ID/g。对于肿瘤/血液比值，预靶向组(3小时时为～1,000:1)显著性地高于111In-PAM4-IgG(24小时时为～5:1；P<0.0003)。辐射剂量估算表明，TF10/90Y-肽预靶向将比90Y-PAM4-IgG提供更大的抗肿瘤作用。因而，该结果支持：与直接放射性标记PAM4-IgG相比，TF10预靶向可以提供改进的供胰腺癌早期检测、诊断和治疗用的成像(Gold等，Cancer Res 2008,68(12):4819–26)。
我们已鉴定出存在于由>85%的侵袭性胰腺腺癌表达的粘蛋白上的独特的生物标记，所述侵袭性胰腺腺癌包括早期I疾病和前驱病变、胰腺上皮内瘤变和导管内乳头状粘液性瘤变(Gold等，Clin Cancer Res2007,13:7380-87)。如通过mAb-PAM4检测的特定表位(Gold等，Int JCancer 1994,57:204-10)在正常和炎性胰腺组织以及大多数其它恶性组织中是不存在的。因而，所述表位的检测为胰腺瘤变的存在的诊断提供了高可能性。使用131I-和99mTc-标记鼠PAM4 IgG或Fab'进行的早期临床研究分别表明，对10位患有侵袭性胰腺腺癌患者中的8位特异性靶向(Mariani等，Cancer Res 1995,55:5911s-15s;Gold等，CritRev Oncol Hematol 2001,39:147-54)。两位阴性患者当中，一位患有不表达PAM4-表位的低分化的胰腺癌，而另一位患者后来发现患有胰腺炎，而不是恶性病变。
因此，PAM4对胰腺癌的高特异性对早期疾病的检测和诊断有用。除了改进检测之外，还发现90Y-PAM4 IgG对治疗裸小鼠中大的人胰腺癌异种移植物有效(Cardillo等，Clin Cancer Res 2001,7:3186-92)，并且观察到90Y-PAM4 IgG在与吉西他滨组合时进一步提高治疗反应(Gold等，Clin Cancer Res 2004,10:3552–61;Gold等，Int JCancer 2004,109:618–26)。最近完成针对吉西他滨治疗失败的患者的I期治疗试验，发现90Y-人源化PAM4 IgG的最大耐受剂量为20mCi/m2(Gulec等，Proc Amer Soc Clin Onc,43rd Annual Meeting,J ClinOncol 2007,25(18S):636s)。虽然在8周或8周后所有患者都表现出疾病进展，但在数个病例中观察到初始的肿瘤收缩。临床研究正在进行中，以评价90Y-hPAM4 IgG与放射增敏剂量的吉西他滨组合的分次给药方案。
我们在本文报道基于PAM4对胰腺癌的靶向特异性的新型重组人源化双特异性单克隆抗体(mAb)TF10的开发。这种构建体也结合到独特的合成半抗原组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)上，组胺-琥珀酰-甘氨酸已并入在可以用适合于单光子发射计算机断层成像(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)成像以及适合于治疗目的的各式各样的放射性核素进行放射标记的许多小肽中(Karacay等，Clin Cancer Res 2005,11:7879–85;Sharkey等，Leukemia 2005,19:1064–9;Rossi等，Proc NatlAcad Sci U S A 2006,103:6841–6;McBride等，J Nucl Med 2006,47:1678–88)。这些研究说明在成像或治疗应用中这种新构建体靶向胰腺腺癌的潜力。
方法和材料
如上所述制备TF2和TF10双特异性DNL构建体和IMP 288靶向肽。碘化钠(125I)和氯化铟(111In)得自
Figure BDA00001896026001091
采用Iodogen法按常规用125I标记TF10，并通过利用体积排阻螺旋柱纯化。如上所述用111InCl对DOTA-肽和DOTA-PAM4-IgG进行放射性标记(Rossi等，Proc Natl Acad Sci U S A 2006,103:68416;McBride等，JNucl Med 2006,47:1678-88)。通过体积排阻高效液相色谱来检查放射性标记产物的纯度，其中游离未结合同位素的量通过瞬时TLC测定。
对于TF10分布研究，给荷有s.c.CaPan1人胰腺癌异种移植物的～20g的雌性无胸腺裸小鼠(
Figure BDA00001896026001101
Farms)注射125I-TF10(10μCi;40μg,2.50×10-10mol)。在各个时间点剖检小鼠组(n=5)，取出肿瘤和非肿瘤组织并在γ计数器中进行计数从而测定注射剂量百分比/克组织(%ID/g)，利用这些值计算血清除率和肿瘤/非肿瘤比值。
对于预靶向生物分布研究，使用摩尔比为10:1的双特异性mAb/放射性标记肽。例如，给一组荷有s.c.CaPan1人胰腺癌异种移植物的无胸腺裸小鼠施用TF10(80μg,5.07×10-10mol)，而未对第二组治疗。在TF10注射后16小时，施用111In-IMP-288半抗原-肽(30μCi,5.07×10-11mol)。在数个时间点剖检小鼠，取出肿瘤和非肿瘤组织并在γ计数器中进行计数从而测定%ID/g。从这些数据计算肿瘤/非肿瘤比值。为了比较生物分布、核成像和潜在的治疗活性，在单独的研究中，给予小鼠组111In-DOTA-PAM4-IgG(20μC,50μg,3.13×10-10mol)。假设在零时间点无活性，从时间-活性曲线计算放射剂量估算值。利用学生t试验评估显著性差异。
为了进行核免疫闪烁成像，放射性标记肽注射后3小时或者放射性标记hPAM4-IgG注射后24小时，用配备有111In用中能准直器的双头Solusγ照相机(ADAC Laboratories)对荷瘤小鼠进行成像。总共对小鼠成像100,000cpm或10min，不论哪个先进行。
结果
双特异性mAb TF10的体外表征。TF10与靶粘蛋白抗原的结合通过ELISA分析(图9)。结果表明二价TF10、PAM4-IgG和PAM4-F(ab')2的结合曲线几乎相同(计算得半最大结合量分别为1.42±0.10nmol/L、1.31±0.12nmol/L和1.83±0.16nmol/L；对于所有P>0.05)，而单价bsPAM4化学缀合物(PAM4-Fab'x抗-DTPA-Fab')具有显著较低的亲合力(半最大结合量为30.61±2.05nmol/L；与TF10比较P=0.0379)，表明TF10以二价模式结合。结合到粘蛋白上的125I-TF10的免疫活性级分为87%，发现未结合TF10为9%，游离碘化物为3%(未示出)。90%的111In-IMP-288结合到TF10上(未示出)。在结合到TF10上的总111In-IMP-288中，当加入过量的粘蛋白(200μg)时，92%以较高分子量洗脱，仅3%与非粘蛋白反应性TF10级分一起洗脱。另外5%的放射性标记肽在游离肽体积中洗脱。这些放射性标记肽在不存在TF10的情况下都没有结合到粘蛋白抗原上(未示出)。
荷有CaPan1肿瘤的裸小鼠中的 125 I-TF10生物分布。TF10表现出从血液中迅速清除，开始在1小时时为21.03±1.93%ID/g，在16小时时降至仅0.13±0.02%ID/g。计算得生物学半衰期为2.19小时[95%置信区间(95%CI)，2.11–2.27小时]。组织摄取揭示在1小时时肝脏、脾脏和肾脏中的活性增强，到16小时时活性也同样迅速地清除[对于肝脏、脾脏和肾脏，T1/2分别为2.09小时(95%CI,2.08–2.10)、2.84小时(95%CI,2.49–3.29)和2.44小时(95%CI,2.28-2.63)]。胃中的活性最有可能反映出放射性碘的增积和排泄，表明放射性碘化TF10活跃地异化，推测在肝脏和脾脏中异化，从而解释它从血液中迅速清除的原因。然而，到16小时时，胃中放射性碘的浓度低于1%ID/g。给予125I-TF10并在16小时剖检的5只非荷瘤裸小鼠组表现出类似的组织分布，表明肿瘤没有影响正常组织的双特异性mAb分布和清除(数据未示出)。当然，在检查的初始时间点之前可能会有差异出现。TF10的肿瘤摄取在注射后6小时达到峰值(7.16±1.10%ID/g)，在16小时时已降至半最大结合量(3.47±0.66%ID/g)。肿瘤摄取在接下来的32小时内再次降低近2倍，但然后在接下来的24小时内是稳定的。
TF10预靶向的、 111 In标记的肽的生物分布。虽然TF10的肿瘤摄取在6小时达到最大，但先前的经验提示，放射性标记肽需要在TF10的血液水平已清除至<1%ID/g的时间点(即，16小时)给予。血液中TF10的水平较高将会导致不可接受的放射性标记肽在血液中的高结合(即，低肿瘤/血液比值)，而在较晚时间施用肽将意味着TF10在肿瘤中的浓度降低，结果导致肿瘤中放射性标记肽的浓度降低。因而，利用16小时间隔进行初步预靶向研究。将111In-IMP-288量保持恒定(30μCi,5.07x10-11mol)，给予增加量的TF10，以便表示为摩尔比的TF10和IMP-288的施用剂量在5:1至20:1内变化(表11)。
表11.单独的111In-IMP-288(无TF10)或用不同量的TF10预靶向的111In-IMP-288的生物分布
Figure BDA00001896026001121
在3小时时，血液中111In-IMP-288的量几乎检测不到(0.01%)。当施用的双特异性mAb量增加4倍时，肿瘤摄取从19.0±3.49%ID/g增加至28.55±0.73%ID/g(在不同组之间，对于每个TF10/肽比值的比较均观察到统计学显著性差异；P＜0.03或更好)，而正常组织的摄取没有任何明显增加。给予TF10的动物中的肿瘤摄取比给予单独111In-IMP-288时高>100倍。对预先施用或未预先施用TF10的动物的正常组织中111In活性进行比较显示绝对值相似，该值在大多数情况下没有显著性差异。这表明到16小时时，双特异性mAb已从所有正常组织中完全清除，从而避免这些组织中明显的肽摄取。肿瘤/血液比值>2,000:1，肿瘤与其它组织的比值超过100:1。甚至肿瘤/肾脏比值超过10:1。在TF10/肽比值为20:1时，肿瘤摄取的放射性同位素最高，对非肿瘤组织的靶向最低；然而，就信号强度和对比率而言，所述TF10/肽比值中的任一个都可以用来实现对肿瘤的优异靶向。选择10:1比值用于进一步研究，因为在10:1(24.3±1.71%ID/g)和20:1(28.6±0.73%ID/g)比值之间，放射性标记肽的肿瘤摄取的绝对差并不是明显差异的。
给予双特异性mAb/肽比值为10:1的TF10-预靶向的111In-IMP-288的动物，或给予单独111In-IMP-288肽的动物的图像在图10中示出。这些肿瘤中的大多数肿瘤的直径≤0.5cm，重～0.25g。该图像显示出TF10-预靶向的动物中肿瘤的高强度摄取(图10A)。增加TF10-预靶向的动物的图像本底强度从而使其与从给予单独111In-IMP-288的动物获取的图像强度匹配(图10B)。然而，当为TF10-预靶向的小鼠优化图像时，信号强度和对比率太高以至于在动物身体内未观察到另外的活性。在给予单独111In-IMP-288的动物中未观察到肿瘤定位，甚至在增加图像强度时亦是如此(图10C)。
进行另外的实验以评估与TF10-预靶向的111In-IMP-288肽的动力学相比较的靶向性111In-hPAM4全-IgG的动力学。111In-肽的肿瘤摄取在所检查的初始时间点，即在3小时时最高(15.99±4.11%ID/g)，而放射性标记肽的血液浓度仅为0.02±0.01%ID/g，提供946.3±383.0的平均的肿瘤/血液比值。随着时间的推移，放射性肽从肿瘤中清除，生物半衰期为76.04小时。在非肿瘤组织当中，肾脏的摄取最高，在3小时时平均为1.89±0.42%ID/g，随着时间的推移平稳地下降(生物半衰期为33.6小时)。肝脏摄取开始为0.15±0.06%ID/g，随着时间的推移基本上保持不变。与TF10-预靶向的111In-IMP-288相比，111In-hPAM4-IgG从血液中清除较慢，尽管它在前24小时内的大量清除，从3小时时的30.1%ID/g减少至24小时的仅11.5±1.7%ID/g。脾脏的可变化的提高的摄取表明，该抗体可能通过靶向所分泌的已被脾脏捕获的粘蛋白而从血液中除去。肿瘤摄取在48小时时达到峰值，为80.4±6.1%ID/g，并在整个监测期内保持在高水平。高肿瘤摄取与预期的IgG血液清除较快速的清除一起，使得24小时内的肿瘤/血液比值为5.2±1.0。图10C示出111In-PAM4-IgG施用后24小时的动物图像，说明肿瘤可以在这个早期可视化，但腹部内仍存在相当强的活性。与111In-hPAM4-IgG相比，对于TF10-预靶向的111In-标记半抗原-肽的肿瘤/非肿瘤比值大多较高，除了肾脏，在这里肿瘤/肾脏比值在较晚的时间时在使用111In-IMP-288和111In-hPAM4-IgG的情况下类似。然而，对于TF10-预靶向的111In-IMP-288，肿瘤/肾脏比值在3小时时足够高(例如，～7:1)从而容易辨别肿瘤和正常组织。
图11阐明用于递送放射性核素(90Y)的直接和预靶向方法的潜在治疗能力。虽然当使用剂量为其各自最大耐受剂量(对于90Y-hPAM4为0.15mCi，而对于TF10-预靶向的90Y-IMP-288为0.9mCi)的PAM4-IgG和预靶向TF10递送放射性同位素时，前者情况下肿瘤内放射性同位素的浓度(%ID/g)似乎比后者高，但它们对肿瘤的辐射剂量相似(对于90Y-PAM4-IgG和TF10-预靶向的90Y-IMP-288分别为10,080和9,229cGy)。预靶向方法的优势在于血液中异常低的活性(9cGy)，比使用90Y-hPAM4 IgG(1,623cGy)的情况低近200倍。同样重要的是注意到，对肝脏以及其它非肿瘤器官的辐射剂量在使用TF10-预靶向的90Y-IMP-288的情况下要低得多。唯一例外的是肾脏，在这里辐射剂量在这两种方案下在它们的各自最大剂量(对于90Y-PAM4-IgG和TF10-90Y-IMP-288分别为612和784cGy)情况下相似。该数据表明对于90Y-PAM4-IgG，与大多数其它放射性标记全IgGmAb一样，剂量限制性毒性为血液学毒性；然而，对于TF10预靶向方案，剂量限制性毒性为肾脏毒性。
讨论
经常发现现行诊断方式例如提供解剖图像的超声、计算机断层成像(CT)和磁共振成像(MRI)技术，以及代谢环境PET成像提供了检测胰腺肿块的高敏感度。然而，这些数据在大多数情况下都基于对已经表现出临床症状的群体中>2cm的病变的检测。在胰腺癌的进展中，此时的预后非常不乐观。为了改善患者治疗效果，检测无症状患者中的小的早期胰腺赘生物(neoplasm)是必要的。
利用mAb靶向途径成像，例如本文所述的利用mAb-PAM4成像可以提供对这些小的早期癌症的诊断。最重要的是mAb的特异性。我们已经提供相当多的数据，包括组织样本的免疫组织化学研究(Gold等，Clin Cancer Res 2007;13:7380–7;Gold等，Int J Cancer1994;57:204–10)和患者血清的免疫测定(Gold et al.,J Clin Oncol2006;24:252–8)，证明mAb-PAM4与生物标记有高反应性，生物标记的存在为胰腺瘤变的诊断提供了高可能性。此外，我们确定虽然PAM4与正常成体胰腺组织没有反应性，也与活动性胰腺炎没有反应性，但与胰腺内最早期的赘生性进展(胰腺上皮内瘤变1和导管内乳头状粘液性瘤变)有反应性，并且生物标记在整个侵袭性胰腺腺癌进展过程中保持高水平表达(Gold等，Clin Cancer Res 2007;13:7380–7)。利用荷有人胰腺肿瘤异种移植物的无胸腺裸小鼠进行的临床前研究已证明，放射性标记的鼠、嵌合和人源化形式的PAM4的特异靶向性。
在当前的研究中，我们已检查下一代、重组、基于双特异性PAM4的构建体，TF10，其对于PAM4臂是二价，而对于抗HSG半抗原臂是单价。这种称为停靠和锁定的预靶向系统构建体具有数个重要特征，包括它的普遍适用性和易合成性。然而，对于本发明的考虑，与先前报道的化学构建体的主要差别为化合价，其提供了增强的肿瘤抗原结合能力，以及重要地，它的药物动力学。TF10从非肿瘤组织中清除比对所述化学缀合物观察到的清除快得多。所述双特异性构建体的血液水平达到低于1%ID/g所需的时间对于所述化学构建体为注射后40小时，而对于TF10为注射后16小时。预靶向性试剂的较迅速的清除提供了肿瘤/血液比值的极大提高，同时保持肿瘤部位的高信号强度(%ID/g)。
除了提供一种早期检测和诊断的方式之外，该结果支持TF10预靶向性系统在癌症治疗中的应用。在对肿瘤和非肿瘤组织的有效辐射剂量方面的考虑偏爱所述预靶向方法胜于直接放射性标记PAM4-IgG。剂量估算表明这两种递送系统具有不同的剂量限制毒性：对于直接放射性标记PAM4的骨髓中毒性与对于TF10预靶向系统的肾脏毒性。这对于未来临床开发作为治疗剂的放射性标记PAM4有重要意义。
吉西他滨，胰腺癌首选的一线药物，可对肿瘤细胞提供显著的放射增敏作用。在先前的研究中，我们已证明吉西他滨和直接放射性标记PAM4-IgG的组合与任一单独臂相比都提供协同抗肿瘤作用(Gold等，Clin Cancer Res 2004,10:3552–61;Gold等，Int J Cancer 2004,109:618–26)。这种组合的剂量限制因素为重叠的血液学毒性。然而，因为TF10预靶向的剂量限制器官似乎是肾脏而不是血液学组织，所以与吉西他滨的组合应当是毒性较低的，从而允许施用增加量的放射性同位素，结果抗肿瘤效力增大。
在临床前模型中利用TF10预靶向所获得的成像优于利用直接放射性标记DOTA-PAM4-IgG所获得的成像，这提供了利用这种成像系统进行临床试验的令人信服的理由。肿瘤靶向性mAb对胰腺赘生物的特异性，与双特异性抗体平台(platform)技术一起对改善患者总体治疗效果具有很大的潜力，所述双特异性抗体平台技术提供了使各种成像化合物缀合到HSG-半抗原-肽上的能力，所述成像化合物用于SPECT(111In)、PET(68Ga)、超声(Au)，或为其它造影剂，或为用于这方面的90Y或用于治疗的其它放射性核素(Goldenberg等，J Nucl Med2008,49:15863)。特别地，我们相信，基于TF10的免疫PET程序将在筛检有罹患胰腺癌的高风险(例如，遗传倾向、慢性胰腺炎、吸烟者等)的个体方面有较大的临床价值，并且可以作为追踪从常规技术获得可疑腹部图像的患者和/或出现由于存在特异性生物标记所产生的提示或生物化学检查异常的患者的手段。当用作追踪这些患者的进行性医学计划的一部分时，胰腺癌的早期检测可以实现。最后，与吉西他滨组合时，TF10预靶向与直接放射性标记PAM4-IgG相比可以为控制肿瘤生长提供更好的机会。
实施例23.利用吉西他滨和用TF10预靶向的90Y-标记肽对胰腺癌异种移植物的治疗
概述
当前正在I/II期试验中检查90Y-hPAM4 IgG与吉西他滨组合对治疗III/IV期胰腺癌患者的效果。我们公开了用于预靶向放射性核素的新途径，其能够将类似量的放射活性递送至胰腺癌异种移植物，但血液学毒性较小，并且更适合于与吉西他滨组合。给荷有~0.4cm3scCaPan1人胰腺癌的裸小鼠施用重组bsMAb，TF10，1天后施用90Y-标记的半抗原–肽(IMP-288)。在这种治疗中添加各种剂量和给药方案的吉西他滨，并且监测肿瘤进展直至28周。单独的0.7mCi PT-RAIT仅产生血细胞计数的瞬时60%减少，而给予单独的0.9mCi PT-RAIT的动物和给予0.7mCi PT-RAIT+6mg吉西他滨(人等效量~1000mg/m2)的动物在9个月后没有表现出有关肾毒性的组织学证据。单独的单剂0.25或0.5mCi PT-RAIT可以分别完全消融20%和80%的肿瘤。在标准吉西他滨治疗方案(6mg，每周1次x3周；休息1周，重复3次)中添加每月一次的分次PT-RAIT(在每个吉西他滨循环开始时给予0.25mCi/剂)，使得肿瘤达到3.0cm3的中位时间与单独PT-RAIT相比显著性增大。检查在PT-RAIT中添加非细胞毒性放射增敏剂量的吉西他滨治疗方案的其它治疗计划也表现出与单独PT-RAIT相比显著提高的治疗反应。该结果表明PT-RAIT是一种治疗胰腺癌的有前途的新途径。当前的数据表明PT-RAIT与吉西他滨组合将会增强治疗反应。
方法
如上所述制备TF10双特异性抗体。对于预靶向，向荷有人胰腺腺癌细胞系CaPan1的裸小鼠给予TF10。在足以使TF10从血液中清除的时间(16小时)之后，施用放射性标记的二价HSG-肽。小分子量HSG-肽(~1.4kD)在几分钟内从血液中清除，进入血管外空间，在这里它可以结合到预靶向的TF10 bsMAb的抗-HSG臂上。在几个小时内，>80%的放射性标记HSG-肽排泄到尿中，留下定位于肿瘤的肽和存在于正常组织中的微量肽。
结果
图12阐明了源自用0.15mCi 90Y-hPAM4 IgG或者0.25或0.50mCi TF10-预靶向的90Y-IMP-288对所形成的(~0.4cm3)CaPan1肿瘤进行的单次治疗的治疗活性。在0.5-mCi预靶向剂量与0.15-mCi剂量的直接放射性标记IgG之间观察到类似的抗肿瘤活性，但是这种水平的直接缀合物的血液学毒性严重(未示出)，而所述预靶向剂量仅是中等毒性(未示出)。事实上，使用90Y-IMP-288时用于预靶向的MTD在裸小鼠中至少为0.9mCi。
图13示出吉西他滨与PT-RAIT的组合在抗肿瘤治疗上的协同作用。腹膜内给予小鼠人等效剂量的1000mg/m2(6mg)吉西他滨(GEM)，每周一次持续3周，然后在休息1周后，重复这个治疗方案2次。在这3个治疗周期中的每一个中，在给予第一剂GEM后1天，给予PT-RAIT(0.25mCi TF 10-预靶向的90Y-IMP-288)。单独的Gem对肿瘤进展(存活时间基于肿瘤进展达到3.0cm3的时间)没有显著影响。单独的PT-RAIT与未治疗动物相比提高了存活时间，但GEM与PT-RAIT组合的治疗方案使中位存活时间增加近10周。因为血液学毒性对于PT-RAIT不是剂量限制性的，但它是吉西他滨治疗的限制因素之一，所以这些研究表明可以在标准GEM疗法中添加PT-RAIT，具有增强反应的潜在性。吉西他滨加PT-RAIT的显著协同作用是令人惊讶且出乎意料的。
进一步的研究检查了施用时序对吉西他滨加PT-RAIT抗肿瘤作用增强效应的影响。在给予0.25mCi TF10-预靶向的90Y-IMP-288前1天或后1天，给予单剂6-mg剂量的GEM(未示出)。这项研究证实对于GEM已为人所熟知的事，即，放射增敏最好在辐射之前给予。对于单独的PT-RAIT方案和其中吉西他滨在放射性肽施用后22小时给予的PT-RAIT加吉西他滨方案，受治疗小鼠的存活时间百分比表现出很小的差异。然而，在施用PT-RAIT前19小时施用吉西他滨导致存活时间显著增加(未示出)。
单剂PT-RAIT(0.25mCi)与西妥昔单抗(1mg，每周一次，腹膜内施用；7周)组合，或者与西妥昔单抗+GEM(6mg，每周一次x 3周)组合治疗荷有CaPan1的动物，结果显示GEM+西妥昔单抗组合与PT-RAIT一起提供了较好的初步反应(图14)，但与仅将单独的西妥昔单抗加入到PT-RAIT中相关的反应是令人鼓舞的(图14)，因为它与PT-RAIT+GEM一样好或者优于它(图14)。因为这项研究中的整体存活时间优良，在这项研究结束时，即24周后每组中仅2个肿瘤进展达到>2.0cm3，所以这些结果表明在加入到PT-RAIT中时西妥昔单抗的潜在作用。
实施例24.分次预靶向放射免疫疗法(PT-RAIT)对胰腺癌治疗的作用
我们评价了利用90Y-DOTA-di-HSG肽(IMP-288)和TF10的分次治疗。使用TF10和放射性标记IMP-288，在荷有0.32-0.54cm3的s.c.CaPan1人胰腺癌异种移植物的裸小鼠中进行研究。在治疗中，将TF10-预靶向的90Y-IMP-288[A]给予一次(在第0周给予0.6mCi)，或者[B]分次给予(在第0和1周给予0.3mCi)，或者[C](在第0、1和2周给予0.2mCi)，或者[D](在0、1和4周给予0.2mCi)。
观察到大多数小鼠，组[A]、[B]、[C]和[D]中分别9/10、10/10、9/10和8/10小鼠的肿瘤消退(>90%)。在组[A]中，50%小鼠的肿瘤消退在3.7周时达到最大，相比之下，在[B]、[C]和[D]中分别在6.1、8.1和7.1周时达到最大。一些肿瘤表现出再生长，在14周时，在分次治疗组(2x0.3mCi)中观察到最佳的治疗反应，其中6/10小鼠无肿瘤(NT)，相比之下，3x0.2mCi组中的3/10小鼠和1x0.6mCi组中的1/10小鼠无肿瘤。未观察到较大的体重减轻，分次PT-RAIT提供了用于治疗胰腺癌并且毒性极低的另一种替代方式。
实施例25.90Y-hPAM4放射免疫疗法(RAIT)加放射增敏吉西他滨(GEM)对晚期胰腺癌(PC)的治疗
在临床前研究中，90Y-hPAM4，一种对PC高度特异的人源化抗体，在晚期疾病患者中表现出瞬时性活性，并且GEM增强了RAIT的作用。这项研究评价了90Y-hPAM4加GEM的重复治疗周期对未经治疗的不可切除的PC患者的治疗作用。根据队列(cohort)逐渐增加90Y-剂量，其中重复给予患者4周-周期(每周一次200mg/m2GEM，在第2-4周每周一次90Y-hPAM4)，直至疾病进展或产生不可接受的毒性。利用CT、FDG-PET和CA19.9血清水平进行反应评估。
在接受第一种2剂量水平(6.5和9.0mCi/m2 90Y-hPAM4x3)的8位患者(3F/5M,56-72y.o.)中，血液学毒性已经为瞬时性1-2级。2位患者对初步治疗有反应，FDG SUV和CA19.9减小，CT显示病变消退。这两位患者分别在9和11个月之后，在总共3和4个周期之后，到现在一直保持着良好的体力状态，无另外的毒性。第3位患者在初步治疗之后，经PET和CT鉴定具有稳定的反应并且CA19.9水平降低，现在正在接受第二周期。4位其它患者表现出早期疾病进展，其余患者仍在评价之中。在血液学毒性极低，甚至在4个治疗周期后也极低的初始90Y-剂量水平下，在分次90Y-hPAM4 RAIT加低剂量吉西他滨表现出治疗活性之后继续逐渐增加剂量。
实施例26.使用Mab-PAM4的胰腺癌早期检测和体外免疫测定
利用PAM4抗体进行免疫组织化学研究。利用染色的组织切片获得的结果表明，PAM4与正常胰腺管、胰腺小管和胰腺腺泡组织无反应(未示出)。相比之下，在针对相同组织样品使用MA5抗体时，正常胰腺导管和胰腺腺泡组织呈弥漫型阳性染色(未示出)。在高分化或中分化的胰腺腺癌的组织切片中，PAM4染色呈阳性，大多数是细胞质染色，但细胞表面处增强。同一组织切片中的正常胰腺组织未被染色。
表12显示利用PAM4 MAb对各个分化阶段的胰腺腺癌样品进行的免疫组织化学分析的结果。总体而言，对所有胰腺癌样品的检测率为87%，对高分化的胰腺癌的检测率为100%，对中分化的胰腺癌的检测率为近90%。
表12PAM4标记形式
  癌症   n   局灶型   弥漫型   总计
  高分化   13   2   11   13(100%)
  中分化   24   6   15   21(88%)
  低分化   18   5   9   14(78%)
  总计   55   13   35   48(87%)
表13表明PAM4免疫组织化学染色还检测到非常高百分比的胰腺癌前驱病变，包括PanIn-1A至PanIN-3、IPMN(导管内乳头状粘液性赘生物)和MCN(粘液性囊性赘生物)。总体而言，PAM4染色检测到所有胰腺前驱病变的89%。这些结果证明，基于PAM4抗体的免疫检测能够通过体外分析检测到近90%的胰腺癌和前驱病变。在PanIN发展的最早期观察到PAM4表达。在IPMN和MCN样品中观察到强染色(未示出)。PAM4表位以高浓度(强弥漫型染色)存在于极大多数胰腺腺癌中。PAM4与最早期的包括PanIN-1、IPMN和MCN在内的胰腺癌前驱病变有弥漫型强反应性，而与正常胰腺组织没有反应性。综合来看，这些结果表明利用PAM4抗体的诊断和/或检测能够以高特异性检测最早期的胰腺癌发展。
表13PAM4标记形式
  n   局灶型   弥漫型   总计
  PanIn-1A   27   9   15   24(89%)
  PanIn-1B   20   4   16   20(100%)
  PanIn-2   11   6   4   10(91%)
  PanIn-3   5   2   0   2(40%)
  总PanIn   63   21   35   56(89%)
  IPMN   36   6   25   31(86%)
  MCN   27   3   22   25(92%)
开发出针对血清样品中PAM4抗原的基于酶的免疫测定。图15示出利用PAM4免疫测定对胰腺癌与正常组织以及其它类型的癌症进行鉴别诊断的结果。对胰腺癌样本(n=53)与包括胰腺炎、乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌以及淋巴瘤在内的所有其它样本(n=233)进行比较，结果显示对胰腺癌的检测敏感度为77.4%，检测特异性为94.3%。
图15的数据在表14中以表格形式呈现。
表14.患者血清中的PAM4-反应性粘蛋白
Figure BDA00001896026001221
利用表14中的数据构建ROC曲线(未示出)。检查包括53位胰腺癌患者在内的共计283位患者，并对胰腺癌患者和所有其它样品中的循环PAM4抗原的存在进行比较，ROC曲线提供的AUC为0.88±0.03(95%ci,0.84-0.92)，P值<0.0001，即对于胰腺癌与非胰腺癌样品的判别有高度显著性差异。对胰腺癌与其它肿瘤和正常组织进行比较，基于PAM4的血清测定显示出77%的敏感度和95%的特异性。
对来自正常患者、“早期”(1期)胰腺癌和所有胰腺癌样品的血清样品中的PAM4抗原浓度进行比较。样本包括13个来自健康志愿者的血清样本、12个来自1期胰腺癌的血清样本、13个来自2期胰腺癌的血清样本以及25个来自3/4期(晚期)胰腺癌的血清样本。使用8.8单位/ml(红线)的截断值，如通过ROC曲线统计分析确定的。PAM4抗原浓度的频率分布在图16中示出，该图示出92%的“早期”1期胰腺癌位于用于诊断胰腺癌的截断线的上面。基于PAM4的测定的ROC曲线在图17中示出，该图示出PAM4测定检测胰腺癌的敏感度为81.6%，特异性为84.6%。
这些结果证实，基于PAM4抗体结合的酶免疫测定可以检测和定量测定胰腺癌患者血清中的PAM4反应性抗原。该免疫测定对胰腺癌有高敏感度和特异性。利用PAM4免疫测定可以检测到大多数I期疾病患者。
总之，采用PAM4抗体的免疫组织学程序鉴定出约90%的侵袭性胰腺癌及其前驱病变，PanIN、IPMN和MCN。用于定量测定人患者血清中的PAM4抗原的基于PAM4的酶免疫测定对早期胰腺癌的检测表现出高敏感度和特异性。由于PAM4对胰腺癌的高特异性，因此粘蛋白生物标记可以用作供成像剂和治疗剂在体内靶向的靶。用于检测“早期”胰腺癌的免疫PET成像可以用来在早期，在胰腺癌可被更有效地治疗的时候诊断出胰腺癌。利用人源化PAM4抗体构建体的放射免疫疗法，优选与放射增敏剂组合使用来治疗胰腺癌。
实施例27.对人血清中PAM4抗原的体外检测的进一步研究
在某些实施方案中，优选通过体外分析可通过非侵入性技术获得的样品例如血液、血浆或血清样品，检测受试者中PAM4抗原的存在和/或诊断受试者中胰腺癌的存在。此种离体分析可优选用于，例如其中没有先验理由相信个体的特定部位有胰腺肿瘤的筛检程序。本研究的目的在于开发用于检测处于最早期的胰腺癌的可靠、准确、基于血清的测定。
概述
利用基于PAM4的免疫测定，对健康志愿者(N=19)、已知诊断为患有胰腺腺癌的患者(N=68)和初步诊断患有慢性胰腺炎的患者(N=29)的血清中的抗原进行定量。对胰腺腺癌检测的敏感度为82%，对健康对照的假阳性率为5%。晚期疾病患者的抗原水平显著地高于早期疾病患者(P<0.01)，对于3/4期晚期疾病、2期疾病和1期疾病，诊断敏感度分别为91%、86%和62%。我们也评价了慢性胰腺炎血清，发现38%为抗原阳性。但这个观察结果与免疫组织化学研究结果不一致，免疫组织化学研究结果表明炎性胰腺组织不产生PAM4抗原。而且，其组织样本可供病理解释用的数位血清阳性胰腺炎患者表现出赘生性前驱病变的证据。
这些结果表明，PAM4血清测定可以用来检测早期胰腺腺癌，并且PAM4抗原的阳性血清水平不是来源于炎性胰腺组织，而是可以提供亚临床胰腺瘤变的证据。
材料和方法
人样本血清(N=68)得自确诊患有胰腺腺癌、在Johns HopkinsMedical Center,Baltimore,MD接受治疗的患者，并冷冻储存<5年。这些患者中的每一位均经历胰腺手术切除，为准确诊断和分期提供了机会。对于1期疾病，在胰腺外没有观察到赘生性细胞。然而，胰腺腺癌患者在出现症状时可能已患有未检测到的微转移疾病，包括报告患有1期疾病的那些患者。为此，我们评价了随访存活数据。所有患者都被描述成患有1期疾病，存活至少1年(距离最后记录的随访时间)，中位存活时间为2.70年(第25百分位数=1.32年)，相比之下，最近的SEER数据(2002-2006)报道了通过手术切除治疗的1期疾病患者的中位存活时间为1.42年。
共29个来自诊断为患有慢性胰腺炎的患者的血清样本得自JohnsHopkins Medical Center and Zeptometrix Corp.(Franklin,MA)。在Center for Molecular Medicine and Immunology，健康志愿者(N=19)提供了用作对照样本的血液。所有样本都经过识别信息消除处理(de-identified)，提供给调查者的唯一临床数据是疾病的诊断和分期、随访存活时间以及原发性肿瘤的大小。
试剂从CaPan1，一种作为异种移植物生长于无胸腺裸小鼠中的人胰腺癌中分离出人胰腺粘蛋白制品。简言之，将1g组织在10mL含有0.5M氯化钠的0.1M碳酸氢铵中匀化。然后离心样品从而获得上清液，将上清液在
Figure BDA00001896026001251
柱上进行分级，将空隙体积材料在羟磷灰石上色谱分离。用去离子水彻底透析未吸附级分，然后冻干。用含有0.15M氯化钠的0.01M磷酸钠缓冲液(pH,7.2)(磷酸盐缓冲盐水[PBS])制备1mg/mL溶液，将其用作免疫测定标准品的储液。如上所述(Gold等，Cancer Res 43:235-38,1983)，通过免疫家兔制备多克隆抗粘蛋白抗血清。纯化IgG级分，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和分子筛高效液相色谱评估它的纯度。与MUC-1蛋白核心有反应性的鼠MA5抗体得自Immunomedics,Inc.(Morris Plains,NJ)。非结合同种型匹配的对照抗体Ag8从P3X63-Ag8鼠骨髓瘤中纯化。
样品制备所有测定都以盲测方式进行。为了制备用于免疫测定的样本，将300μL血清放入2.0mL微量离心管中并用等体积的1-丁醇萃取。将该管剧烈涡旋2min，此时加入300μL氯仿，再次涡旋该管2min；操作中包括后者步骤的目的是翻转水层和有机层。然后将该管在微量离心机(microfuge)中以12,000rpm的设定离心5min。将上面的水层移入干净管中，并将该样品以1:2稀释在2.0%(w/v)酪蛋白钠盐在0.1M pH 7.2磷酸钠缓冲液(PBS)中的溶液中以用于免疫测定，所述缓冲液内含有0.15M氯化钠。
酶免疫测定在96孔聚乙烯板中进行免疫测定，所述聚乙烯板已用100μL PBS中的20μg/mL人源化-PAM4 IgG包被，在4℃孵育过夜。然后通过加入200μL 2.0%(w/v)PBS中的酪蛋白溶液封闭孔，并在37℃下孵育1.5h。去除孔中的封闭溶液，并用250μL含有0.1%(v/v)吐温-20的PBS洗涤该板5次。将标准品或未知样本，100μL一式三份加入到合适的孔中，并在37℃下孵育1.5h。然后按上面方式用PBS-吐温-20洗涤该板5次。
然后向每个孔中加入在1.0%(w/v)PBS中的酪蛋白中稀释至5μg/mL的多克隆家兔抗粘蛋白抗体，所述PBS内含有50μg/mL非特异性人IgG，并在37℃下孵育1h。然后，按上面方式洗涤孔中的多克隆抗体，并向孔中加入在PBS中的1.0%(w/v)酪蛋白溶液中按1:2000稀释的过氧化物酶标记的驴抗家兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)，所述PBS内也含有50μg/mL人IgG，并在37℃下孵育1h。按上面方式洗涤该板后，向孔中加入100μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物溶液，并在室温下孵育30min。通过加入50μL 4.0N硫酸终止反应，并利用250分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)读取450nm波长处的光密度。因为PAM4-粘蛋白具有相当大的微不均一性，所以我们选择以任意单位/mL形式报道我们的结果，基于从异种移植的CaPan-1人胰腺肿瘤纯化的初始参考标准品。
免疫组织化学在superfrost plus防脱载玻片(Thermo Scientific,Waltham,MA)上将得自Cooperative Human Tissue Network的石蜡包埋的样本切成4微米切片。然后将组织切片在pH 9.0 Tris缓冲液，Target Retrieval Solution(Dako,Carpinteria,CA)中加热至95℃持续20min，然后使其冷却至室温，并然后在室温下用3% H2O2淬灭15min。然后使用10μg/mL的一抗，利用ABC
Figure BDA00001896026001262
试剂盒(VectorLaboratories,Burlingame,CA)标记该组织。由两位病理学者使用与胰腺腺癌生物标记较早期研究所报道的一致的范例(paradigm)独立地对载玻片进行评分(Gold等，2007,Clin Cancer Res 13:7380-87)：0-阴性，<1%的组织被标记；1-1%-25%的组织呈弱局灶标记；2-1%-25%的组织呈强局灶标记；3->25%的组织呈弱弥漫标记；4->25%的组织呈强弥漫标记。仅考虑将合适的组织组分(例如腺癌细胞、正常导管等)用于评估。
统计学分析由免疫测定数据生成标准曲线，进行回归分析从而插补未知样品的浓度(Prism 4.0software,GraphPad,La Jolla,CA)。通过利用Med-Calc统计软件包(7.5版)(Med-Calc,Mariakerke Belgium)生成接受者操作特征(ROC)曲线。利用学生t试验比较任何两个组的变量。利用Cochran-Armitage试验检测检测率和病期之间的趋势。
结果
免疫测定的准确度和精度在不连续的几天(N=7)评价15.60、6.20、2.50和1.00单位/mL标称浓度的一组对照标准品，以确定准确度和精度。对标准品的曲线拟合一般得到r2>0.990的拟合优度值。计算得，准确度在前三种浓度的标称值的8%之内，但对于1.00单位/mL的标准品而言下降至约22%。对这一系列对照的标称与测量的单位/mL进行线性回归分析，得到斜率为0.965，y截距为0.174的趋势线(r2=0.999)，其中1.00的斜率和0.00的y截距将构成100%准确度(图18)。对于两个最低浓度的标准品，标称和恢复的质量之间的平均绝对差值等于0.190±0.173单位/mL，表明EIA的最小绝对误差为约0.2单位/mL。对于这四个对照标准品，变异系数(CV)值分别为6.40%、4.85%、12.0%和66.4%。综合来看，该数据表明，PAM4免疫测定提供的准确度和再现性水平在建议的分析物免疫测定测量的参考(guideline)范围之内；准确度和精度在截断值(2.40单位/mL)之上的浓度的15%范围内，并且在该截断值的20%范围内。为了进一步测试这点，我们检查了3个血清样品，其中的2个来自健康对照，在不同的3天采集的。从这两个健康对照得到的平均结果为0.27±0.06和0.30±0.27单位/mL，每个均与EIA的最小绝对误差接近，结果具有高的CV，分别为21.65%和88.19%。另一个患者血清样品的平均值为19.45±2.51单位/mL，CV为12.9%。
患者血清中抗原的定量在上面实施例26中所报道的初步研究中，基于PAM4血清的免疫测定对胰腺癌的表观敏感度为77%，特异性为94%。我们评价了一组新的24个来自被诊断为患有胰腺腺癌的患者的血清样品。这些血清样品中仅2个具有视为阳性的水平的PAM4反应性抗原。因此，我们考虑和评估免疫测定没有按预期那样进行的原因，包括免疫测定试剂的质量，可能是因为抗原从血清中降解和/或除去、抗原以免疫复合物形式存在或者被阻断物质结合。我们发现冷冻储存很短时间(<5年)的新鲜人血清和/或样本中存在一种物质，该物质似乎结合到PAM4反应性表位上并阻断它与PAM4抗体的结合，因而妨碍免疫测定的检测。从掺有5-20单位/mL浓度的PAM4抗原的新鲜正常人血清(N=2)回收的抗原的百分比大约为33%或更小。
在一系列报道中，Slomiany和同事公开了胃粘蛋白具有共价结合和/或缔合的脂质和脂肪酸(Slomiany等，1984,Arch Biochem Biophys229:560-67;Slomiany等，1986,Biochem Biophys Res Commun141:387-93;Zalesna等，1989,Biochem Int 18:775-84)，并且这些脂质和脂肪酸对粘蛋白的物理化学性质有特定影响。而且，据报道，脂肪酸合成酶水平和活性在胰腺腺癌中显著增高，其它形式的癌症和病理病状也属于这种情况(Walter等，2009,Cancer Epidemiol BiomarkersPrev 19:2380-85)。因为阻断物质可能是脂质性质的，所以我们对来自24位胰腺腺癌患者组并且已冷冻储存<5年的血清进行有机萃取。如上所述，在没有预先萃取的情况下，24个样本中仅2个(8.3%)具有视为阳性水平的PAM4抗原，而在有机萃取之后，24个样本中的22个(92%)具有阳性水平的PAM4抗原。
我们还可以从实施例26中所报道的研究重新评价已冷冻储存>15年的10个胰腺腺癌患者血清以证实前面的结果。在经过萃取或未经萃取的情况下，所有10个样本都具有视为阳性水平的抗原。进行回归分析从而比较来自经萃取和非经萃取的血清的配对结果，得到斜率为1.10的趋势线(r2=0.94)，表明萃取或不萃取这些长期冷冻血清，结果是类似的。据认为，样本的长期储存导致抑制物质的降解或者结合到表位上的能力降低并且导致表位暴露。在免疫测定之前，所有进一步的血清测试都是利用经过有机萃取处理的样本进行。
针对PAM4反应性抗原评价的样本包括根据病期划分的确诊患有胰腺腺癌的68位患者：21位患者处于1期；14位患者处于2期；以及33位患者处于3和4期(晚期)。另外，包括19个从健康成体志愿者采集的血清和29个诊断为患有慢性胰腺炎的患者作为对照组。点阵图(图19)中所示的最大浓度为80单位/mL，因为没有足够量的血清来进行另外的稀释研究。虽然上面实施例26中报道的截断值为10.2单位/mL，但是因为采用了有机萃取程序并且EIA方案有所不同(试剂浓度，缓冲液中包括人IgG)，所以我们选择独立于前面的结果对当前的数据组进行处理。通过用于比较所有胰腺腺癌样本与健康成体的ROC曲线统计(图20)计算得，阳性截断值为2.4单位/mL。对胰腺腺癌检测的总敏感度为82%，曲线下面积为0.92±0.03(95%CI=0.84–0.97)。在这个水平的敏感度下，观察到健康对照组的假阳性率为5%，单一阳性病例所具有的循环抗原为3.65单位/mL，略高于截断值。因为血清量不足，所以未能进行用来与PAM4免疫测定结果进行比较的CA19-9免疫测定。
如表15所示，对早期I期胰腺腺癌的检测的敏感度相对高，21个样本中的13个(62%)高于截断值。与预料的一样，该检测率低于在2期患者(86%)与晚期3期或4期患者(91%)组观察到的检测率。对于检测率与病期，观察到统计学显著性趋势(P<0.01)。我们认为这最有可能是由肿瘤大小或肿瘤负担所导致的。1期、2期和3/4期组的平均肿瘤大小分别为2.14±1.02cm3、3.36±1.18cm3和3.45±1.06cm3。虽然2期和3/4期组之间肿瘤大小没有统计学显著性差异(P>0.41)，但是当将这两组中的每组与1期肿瘤大小相比较时，均观察到统计学显著性差异(P<0.004或更好)。然而，应注意单独的肿瘤大小与血清中的抗原浓度无相关性(r2=0.0065)。
报告为I期的样本可以根据肿瘤大小划分为1A期(N=13)和1B期(N=8)亚组，这两个亚组的检测率分别为54%和75%；但强调需要谨慎，因为每个亚组中的患者数量小。1A期的平均肿瘤大小为1.41±0.58cm3(范围：0.4cm3–2.0cm3)，而1B期的平均肿瘤大小为3.15±0.44cm3(范围：2.5cm3–4cm3)；对于这两个组的比较P<0.001。虽然整体而言，1A期疾病的肿瘤大小小于1B期疾病的肿瘤大小，但单独的肿瘤大小与血液中的PAM4抗原浓度之间没有明显的统计相关性(r2=0.03)。而且，重要的是注意到，在13个1A期样本中，7个阳性病例中的4个具有大大高于截断值的PAM4抗原水平，在17.65-32.65单位/mL范围内。
表15.患者血清中的PAM4反应性抗原
我们还评价了一组29个初步诊断患有慢性胰腺炎的患者血清。当将通过正常和胰腺腺癌患者的ROC评价确定的2.4单位/mL作为截断值时，11位胰腺炎患者(38%)为阳性。直接与胰腺腺癌样本相比较的胰腺炎血清的ROC曲线分析所得的曲线下面积为0.77±0.05(95%CI=0.68-0.85)。胰腺炎组的中位值为1.28单位/mL，与健康志愿者组(1.18单位/mL)相当，但大大低于(低3.5倍)1期胰腺腺癌组(4.53单位/mL)。应注意，我们较早的胰腺炎样本研究结果提示低得多的假阳性率，仅5%。然而，那些胰腺炎样本冷冻储存时间少于5年，而且在分析之前没有经过有机相萃取处理。
活检和/或手术样本从14个慢性胰腺炎样本获得，其中的6个来自被视为循环PAM4抗原呈阳性的患者。在这6个阳性病例中的3个中，在组织切片内鉴定出前驱病变。然后考虑所述阳性血清测试结果是由胰腺炎引起，还是由赘生性前驱病变的存在引起。我们对另外的30个来自诊断为患有胰腺炎的患者的活检样本进行免疫组织化学分析。在这30个样本中，通过利用PAM4染色鉴定出(在不同的样本中鉴定出)一个侧面(frank)侵袭性胰腺腺癌和一个大的PanIN-2-3病变，而周围的腺泡-导管化生(ADM)和正常组织都呈阴性(数据未示出)。在其余28个样本中，19个具有足够用于评价的量的薄壁组织，其中的16个表现出ADM证据。PAM4在除了这2个病例之外的全部病例中都呈阴性，并且在这些病例的每个中，样本内的ADM仅呈非常弱的局灶性标记(数据未示出)。
讨论
采用组织样本免疫组织学分析和循环抗原EIA的实施例26中所报道的研究证明，PAM4反应性表位是侵袭性胰腺腺癌的生物标记并且在胰腺瘤变(即，PanIN-1)的最早期表达。它在正常胰腺组织(胰腺导管、胰腺腺泡和胰岛细胞)内没有检测到，在所检查的大多数非胰腺癌(乳腺癌、肺癌、胃癌和其它癌症)中也没有检测到。因而，血清中的PAM4表位浓度的升高提供了针对胰腺腺癌的高阳性似然比，为16.8。前面的研究缺少有关病期的临床信息。因此，直到现在我们仍无法评价所述免疫测定在检测潜在可治愈的早期疾病方面的价值。
我们在本文报道利用血清样品进行的基于PAM4的EIA可以检测出患有早期胰腺腺癌的患者，并可以准确地判别无疾病个体。检测早期胰腺腺癌的测定敏感度对于1期疾病患者为62%，对于2期疾病患者为86%，并且血清水平一般随着病期的进展而提高。高百分比的1期和2期疾病患者在临床上无症状。我们推测利用PAM4血清测定检测处于这些早期阶段的肿瘤生长可改善患者的生存前景。
这项研究中的癌症患者都经历手术切除，提供了对每位患者进行准确分期的机会。然而，许多胰腺癌患者在出现症状时都被怀疑患有微转移疾病，即使他们没有出现组织学明显的区域淋巴结转移。这突出了早期检测研究，特别是低发病率疾病例如胰腺腺癌的早期检测研究中的普遍问题。定义明确的样本的自然增长是有问题的。这些胰腺癌中的许多是在存在慢性胰腺炎、胆囊炎和赘生性前驱病变以及其它病状的情况下发生的，这进一步使问题复杂化。
在29个初步诊断患有慢性胰腺炎的患者血清中，鉴定出38%呈PAM4抗原阳性。然而，在这些血清阳性患者中，其组织样本可供病理解释用的数位患者表现出赘生性前驱病变的证据。而且，在比较通过免疫组织学得到的组织反应性和通过免疫测定得到的抗原血清水平时观察到不一致。根据免疫组织化学，仅10%的可评价样本表现出ADM内呈PAM4染色的证据，尽管它的强度比在绝大多数胰腺腺癌样本中所观察到的弱得多(Gold等，2007,Clin Cancer Res13:7380-87)。所以，该结果表明血清内阳性水平的PAM4抗原可能不是来源于炎性胰腺组织，而是可以提供亚临床胰腺瘤变例如PanIN病变的证据，并且至少阳性结果提供了对这些患者临床随访的理由。
从基因工程化胰腺腺癌动物模型得到的研究结果表明，人胰腺瘤变可能是在PanIN-1病变之前出现(Leach,2004,Cancer Cell 5:7-11)。ADM是在由Zhu等(2007,Am J Pathol 171:263-73)描述的突变KRAS靶向模型中观察到的最早的变化。另一方面，Shi等(2009,Mol CancerRes 7:230-36)报道，虽然KRAS基因突变可发生在ADM内，但它们主要发生在与PanIN病变相关的ADM内。该作者认为这可能是通过PanIN逆行延伸至周围ADM而发生的。迄今为止，还没有确凿的证据证明ADM进展成PanIN。PAM4与两位胰腺炎患者的ADM有反应性这一事实值得关注。
目前，胰腺癌的普通人群筛查被视为在医学或经济上不值得，因为该疾病实在是太罕见。然而，人们对于筛查预测罹患胰腺腺癌的风险增加的患者有相当大的兴趣。数项研究已经证明，筛查具有强大的胰腺癌家族史的个体可以鉴定出适合手术切除的胰腺前驱赘生物(Canto等，2006,Clin Gastroenterol Hepatol 4:766-81;Canto,2005,ClinGastroenterol Hepatol 3:S46-58;Brentnall等，1999,Ann Intern Med131:247-55)。例如，胰腺癌患者亲属罹患胰腺癌的风险显著地高于普通人群(Shi等，2009,Arch Pathol Lab Med 133:365-74)。低百分比的家族性胰腺癌患者带有PALB2(BRCA2的配偶体和定位体)突变和胰腺癌易患基因(Tischkowitz等，2009,Gastroenterology 137:1183-86)。类似地，患有持久性慢性胰腺炎的患者罹患胰腺癌的风险增加，并且在早发(青少年)遗传性胰腺炎患者当中的风险超过30%(Lowenfels等，1993,New Eng J Med 328:1433-37;Lowenfels等，1997,J NatlCancer Inst 89:442-46)。已在家族非典型多痣(FAMMM)综合征个体中观察到高出20至34倍的风险(Rutter等，2004,Cancer 101:2809-16)。此外，数项研究已证明，符合一定标准的糖尿病个体罹患胰腺癌的风险显著增加(Pannala等，2009,Lancet Oncol 10:88-95)。通过利用PAM4免疫测定纵向监控这些患者可以为瘤变提供早期检测。所述免疫测定的第二潜在用途可以是作为一种检测治疗后疾病复发，特别是据推测肿瘤局限于胰腺的那些患者在手术切除后的复发的手段。
PAM4抗体的相对高特异性提供了一种靶向成像剂和治疗剂并具有高肿瘤摄取和高肿瘤/非肿瘤比值的方式。我们已证明PAM4作为用于胰腺癌核成像和放射免疫疗法的直接放射性标记试剂或双特异性预靶向试剂的潜力。此外，最近报道了用于评价分次给药的90Y-PAM4全IgG(clivatuzumab tetraxetan)与放射增敏吉西他滨治疗方案的组合的临床1b期试验的初步结果(Pennington等，2009,J ClinOncol 27:15s,abstract 4620)。在22位3/4期(大部分4期)疾病患者中，68%表现出疾病控制的证据，其中根据RECIST标准，23%的患者具有部分反应。因而，基于PAM4的免疫测定得到的阳性结果提供了继续进行PAM4靶向成像和治疗的理由，从而提供个性化治疗。
基于PAM4的免疫测定可以鉴定所有分期的胰腺腺癌患者中的大多数。虽然在当前研究中与CA19.9进行直接比较是不可能的，但是前面在一组有限的胰腺腺癌血清(N=41)中对这两种生物标记进行的比较证明，在71%患者样本中为阳性的PAM4抗原水平与在59%样本中为阳性的CA19.9抗原水平之间存在统计学显著性差异(P<0.01)。一般而言，据认为CA19.9缺少提供胰腺腺癌早期检测和/或诊断所需的敏感度和特异性。然而，该测定在根据指示不良预后的CA19.9血清水平持续升高进行的处理法(management)中确实有用。类似地，我们最近以摘要形式(Pennington等，2009,J Clin Oncol 27:15s，abstract 4620)报道了循环PAM4抗原水平在预测抗肿瘤反应方面的用途。
这些结果表明样本储存的条件(例如，冷冻保存时间)可以对所研究表位的可及性有显著的影响。对于基于PAM4的免疫测定，脂肪酸或脂质物质也许能结合所述特定表位并干扰免疫测定。然而，这种材料也可能是低分子量肽或其它可溶于有机溶剂中的物质。通过对血清进行有机萃取除去这种物质的能力使得PAM4免疫测定可再现。另外，提出了有关循环抑制剂：PAM4抗原相互作用的生物学意义的问题。然而，当使用PAM4抗体作为体内靶试剂(例如，放射免疫疗法)时，循环PAM4抗原的存在不是一个因素，因为已在迄今评价的大多数患者中观察到放射性标记PAM4对肿瘤生长部位的靶向。因而，肿瘤内的PAM4抗原似乎不受阻断物质影响。
对于本领域技术人员而言明显的，可以对本发明产品、组合物、方法和过程作出各种修改和改变。因而，本发明涵盖此类修改和修改，条件是它们在所附权利要求或其等价形式的范围内。

Claims (28)

1.一种检测或诊断胰腺癌的方法，其包括：
a)从个体获取血液、血清或血浆样品；和
b)利用抗胰腺癌抗体进行免疫测定从而检测所述样品中胰腺癌粘蛋白的存在；
其中所述胰腺癌粘蛋白的存在指示所述个体患有胰腺癌，并且所述血清免疫测定可以检测早期胰腺癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测1A期、1B期和2期胰腺癌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测80%或更多的总胰腺癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测60%或更多的1期胰腺癌。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测54%的1A期胰腺癌。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测75%的1B期胰腺癌。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测86%的2期胰腺癌。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测90%或更多的3期和4期胰腺癌。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定对于未患胰腺癌或胰腺炎的对照个体的假阳性率为5%或更小。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定对于患有慢性胰腺炎的个体的假阳性率为38%或更小。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清免疫测定可以检测无症状个体的胰腺腺癌。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清样品，并且所述方法进一步包括在进行所述免疫测定之前对所述血清样品进行有机相萃取。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述有机相是丁醇。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫测定检测PanIN-1A、PanIN-1B、PanIN-2、侵袭性胰腺腺癌、胰腺癌、粘液性囊性赘生物(MCN)、胰腺内粘液性赘生物(IPMN)和导管内乳头状粘液性瘤变的存在。
15.一种检测或诊断胰腺癌的方法，其包括：
a)向个体施用抗体构建体，所述抗体构建体包含与嵌合PAM4(cPAM4)抗体结合到相同的表位上或者与嵌合PAM4(cPAM4)抗体竞争结合到胰腺癌粘蛋白上的至少一种抗胰腺癌抗体或抗原结合片段，所述嵌合PAM4(cPAM4)抗体包含轻链可变区CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，(SEQ ID NO:1)、CDR2(STSNLAS,SEQ ID NO:2)和CDR3(HQWNRYPYT，SEQ ID NO:3)，以及重链可变区CDR序列CDR1(SYVLH,SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)；和
b)检测结合到胰腺癌细胞上的所述抗体构建体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使所述抗体构建体在体内或体外暴露于所述样品。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗体或其片段结合到包含氨基酸序列WTWNITKAYPLP(SEQ ID NO:29)的线性肽上，或者结合到包含氨基酸序列ACPEWWGTTC(SEQ ID NO:30)的环状肽上。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体构建体是双特异性或多特异性抗体，其包含(i)至少一种PAM4抗体或其抗原结合片段；和(ii)至少一种结合到可靶向构建体上的半抗原上的抗体或片段；并且所述方法进一步包括施用连接至至少一种诊断剂的可靶向构建体。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗胰腺癌抗体或其抗原结合片段缀合到至少一种诊断剂上。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述诊断剂选自由放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂组成的组。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述诊断剂是选自由以下组成的组的放射性核素：110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr，或其它γ发射体、β发射体或正电子发射体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述放射性核素是18F，并且所述方法进一步包括PET成像。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述顺磁离子选自由以下组成的组：铬(Ⅲ)、锰(II)、铁(Ⅲ)、铁(II)、钴(Ⅱ)、镍(II)、铜(II)、钕(Ⅲ)、钐(Ⅲ)、镱(Ⅲ)、钆(Ⅲ)、钒(II)、铽(Ⅲ)、镝(Ⅲ)、钬(Ⅲ)和铒(Ⅲ)。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述诊断剂是选自由异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺组成的组的荧光标记化合物，或选自由鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯组成的组的化学发光标记化合物，或选自由萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白组成的组的生物发光化合物。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法用于手术中、内窥镜检查或血管内程序。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体构建体是DNL(停靠和锁定)构建体，其包含(i)至少一个拷贝的嵌合、人或人源化PAM4抗体或其片段，其中所述PAM4抗体或其片段包含轻链可变区CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，(SEQ ID NO:1)、CDR2(STSNLAS,SEQ ID NO:2)和CDR3(HQWNRYPYT,SEQ ID NO:3)，以及重链可变区CDR序列CDR1(SYVLH,SEQ ID NO:4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:6)；以及(ii)至少一个拷贝的半抗原结合抗体或其片段。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述半抗原结合抗体是h679抗体或h734抗体。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述DNL构建体包含两个拷贝的每个均连接至DDD部分的PAM4Fab片段，和一个拷贝的连接至AD部分的h679Fab片段，其中所述两个拷贝的DDD部分形成二聚体，所述二聚体结合到所述AD部分上从而形成所述DNL构建体。
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