CN1675245A - 人源化单克隆抗体hPAM4 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单价和多价单特异性抗体以及多价多特异性抗体。这些抗体的一个实施方案具有一个或多个相同的结合部位，其中每个结合部位与靶抗原或靶抗原上的表位结合。这些抗体的另一个实施方案具有两个或更多个结合部位，其中这些结合部位对靶抗原上的不同表位或者不同的靶抗原具有亲和性，或者对靶抗原和半抗原具有亲和性。本发明还涉及可用于在宿主中表达这些功能性抗体的重组载体。更准确地讲，本发明涉及命名为PAM4的肿瘤相关抗体。本发明还涉及人源化PAM4抗体和人PAM4抗体以及所述抗体在诊断和治疗中的用途。

Description

人源化单克隆抗体hPAM4
                     发明领域
本发明涉及单价和多价单特异性抗体以及多价多特异性抗体。准确地讲，本发明涉及命名为PAM4的MUC1抗原特异性抗体。本发明还涉及人源化PAM4抗体和人PAM4抗体及其片段以及所述抗体及其片段在诊断和治疗中的用途。
在一个实施方案中，本发明的抗体具有一个或多个相同的结合部位，其中每个结合部位对靶抗原或靶抗原上的表位都具有亲和性。在另一个实施方案中，本发明的抗体具有两个或更多个结合部位，所述结合部位对靶抗原上或者相同或不同靶抗原上的相同或不同表位具有亲和性，或者至少一个结合部位对靶抗原具有亲和性，至少一个结合部位对半抗原具有亲和性。本发明也描述了可用于在宿主中表达本文所述抗体的重组载体。
                     发明背景
胰腺产生胰岛素和酶，胰岛素帮助机体将葡萄糖转化成能量，而酶帮助机体消化食物。胰腺癌是主要发生在胰腺管细胞的胰腺的恶性生长。该疾病是排在第九位的最常见癌症形式，还是分别排在第四位和第五位的男性和女性癌症死亡的原因。胰腺癌几乎总是致命的，5年存活率小于3％。
胰腺癌最常见的症状包括黄疸、腹痛和体重减轻，并伴有本质上是非特异性的其它呈递因子。因此，在肿瘤生长的早期诊断出胰腺癌常常是困难的，需要经过深思熟虑的怀疑和多方面的诊断检查，时常包括探察手术。内窥镜超声成像和计算机断层成像是目前最好的可利用的非侵害性诊断胰腺癌的手段。然而，小肿瘤以及鉴别胰腺癌和局灶性胰腺炎的可靠检测极其繁琐。遗撼的是，目前，绝大多数患者当处于晚期时才被诊断出来，此时肿瘤已经从囊向外延伸，侵袭周围器官和/或已经向全身转移。Gold等，Crit.Rev.Oncology/Hematology，39：147-54(2001)。该病的晚期检测是普通的，而“早期”胰腺癌诊断在临床上是罕见的。
用于胰腺癌的当前疗法一直不能治愈，基本上也不能延长存活时间。手术切除术一直是提供存活机会的唯一方式。然而，由于大肿瘤负担，仅10％-25％的患者是“治疗性切除术”的候选者。对于这些经历手术治疗的患者，5年存活率仍不理想，平均仅约为10％。
胰腺癌的早期检测和诊断以及对该疾病的适当分期将会提供增加的存活优势。许多实验室都在进行基于使肿瘤相关标记释放到血流中以及检测活检标本中的标记物来开发诊断方法。对于胰腺癌，最好的肿瘤相关标记一直是针对CA19.9的免疫测定。在70％的胰腺癌患者体内发现该唾液酸化Lea表位结构的水平升高，但该表位结构在任何所检查的局灶性胰腺炎标本中都没有被发现。然而，发现CA19.9水平在许多其它恶性和良性病症中也会升高，所以目前该测定不能用于诊断。然而，该测定可用于监测，手术后CA19.9血清水平持续升高说明预后差。据报道，许多其它的单克隆抗体(MAb)结合免疫测定可以在不同的发展期用于诊断。这些包括但不限于DUPAN2、SPAN1、B72.3、Ia3和各种抗CEA抗体。
人造抗体、特别是MAb和工程抗体或抗体片段已经进行了全面的测试，表明它们在检测和治疗胰腺癌以及包括癌症、自身免疫病、感染性疾病、炎性疾病和心血管疾病在内的其它各种人类疾病中具有价值[Filpula和McGuire，Exp.Opin.Ther.Patents(1999)9：231-245]。抗体或抗体源性试剂的临床应用主要取决于其结合特殊疾病相关性特异性靶抗原的能力。选择性对于在人类疾病的检测和治疗阶段期间将例如以下的诊断剂或治疗剂传递到靶部位是有价值的：同位素、药物、毒素、细胞因子、激素、激素类拮抗剂、酶、酶抑制剂、寡核苷酸、生长因子、寡核苷酸、放射性核素、血管生成抑制剂或金属，如果所述诊断剂或治疗剂对机体正常组织有毒性的情况下特别重要。放射性标记抗体在包括卵巢癌、结肠癌和淋巴瘤在内的许多恶性肿瘤中的应用已取得了一定的成功。该项技术也证明可用于胰腺癌。然而，除抗CEA抗体和B72.3的应用之外，几乎没有其它的现有临床资料。
该抗体系统的潜在限制在Goldenberg，The American Journal ofMedicine，94：298-299(1993)中有讨论。检测和治疗技术的重要参数是存在靶细胞的部位的具体位置的注射剂量以及摄取率即具体结合抗体的浓度与周围正常组织内存在的放射性浓度之比。当将抗体注射到血流中时，它通过许多区室，进行代谢和排泄。当通过机体的其余部位时，所述抗体必须能够定位并结合靶细胞抗原。控制抗原靶向的因素包括位置、大小、抗原密度、抗原可及性、病理组织的细胞组成和靶向抗体的药代动力学。通过抗体具体影响肿瘤靶向的其它因素包括靶抗原的表达(肿瘤内和其它组织内)和由于放射性标记抗体的较慢血-清除率引起的骨髓毒性。中靶的肿瘤细胞所累积的靶向抗体量受血管形成的影响和抗体穿透肿瘤的屏障以及肿瘤内压力的影响。肝、肾或骨髓等非靶器官的非特异性摄取是该项技术、尤其是放射免疫疗法的另一潜在的限制，其中骨髓的照射常常引起剂量-限制毒性。
用于将药剂传递到靶部位的一个推荐方法，称之为直接靶向，是设计用携带诊断性或治疗性放射性同位素的抗体靶向特异性抗原的技术。就肿瘤而论，直接靶向方法利用通过其抗原识别靶肿瘤的放射性标记抗肿瘤单特异性抗体。该项技术包括将标记单特异性抗体注射到患者体内，让所述抗体定位在靶肿瘤，从而获得诊断或治疗益处。未结合的抗体被机体清除。该方法可用于诊断或治疗其它的哺乳动物疾病。
另一推荐方法，称之为“亲和力增强系统(Affnity EnhancementSystem)(AES)”，是一项特别设计用以克服携带诊断性或治疗性放射性同位素的抗体靶向肿瘤的缺陷的技术[US-5,256,395(1993)，Barbet等，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 14：153-166(1999)]。AES利用既识别靶肿瘤又识别放射性半抗原的放射性标记二价半抗原和抗肿瘤/抗半抗原双特异性抗体。具有较高价数的半抗原和具有较高特异性的抗体也可用于该方法中。该项技术包括将所述抗体注射到患者体内，让其定位在靶肿瘤。在未结合抗体从血流中清除足够时间后，给予放射性标记半抗原。半抗原与位于靶细胞部位的抗体-抗原复合物结合，从而获得诊断或治疗益处，同时未结合半抗原快速从机体内清除。Barbet提及二价半抗原可与双特异性抗体交联的可能性(如果后者也结合到肿瘤表面的话)。结果，放射性标记复合物更稳定并且在肿瘤上停留时间更长。该系统可用于诊断或治疗哺乳动物疾病。
本领域仍然需要产生可用于直接靶向系统的多价单特异性抗体以及产生可用于亲和力增强系统的多价多特异性抗体。准确地讲，仍然需要作为胰腺癌的有效诊断工具并表现出增强摄取中靶抗原、血浓度降低以及保护正常组织和细胞抵抗毒性药物的抗体。
                     发明概述
本发明考虑结合位于MUC1的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域的抗体、融合蛋白及其片段。在一个优选的实施方案中，所述抗体、融合蛋白或其片段是PAM4抗体。本发明的PAM4抗体、融合蛋白或其片段是通过用粘蛋白免疫和/或选择而获得的，并且最好对胰腺癌粘蛋白有反应性。因此，本发明的PAM4抗体、融合蛋白及其片段最好结合胰腺癌细胞相关性抗原。
在一个优选的实施方案中，所述PAM4抗体或其片段是人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体或其片段，或者所述PAM4融合蛋白包含人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体或其片段。还优选所述PAM4抗体、融合蛋白及其片段可以与至少一种治疗剂和/或诊断剂缀合。
本文中考虑的是人源化PAM4抗体或其片段，所述人源化PAM4抗体或其片段包含鼠PAM4单克隆抗体的互补性决定区(CDR)和人抗体轻链可变区和重链可变区的构架(FR)区以及人抗体轻链恒定区和重链恒定区，其中所述人源化PAM4单克隆抗体轻链可变区的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SASSSVSSSYLY的氨基酸序列；CDR2包含STSNLAS的氨基酸序列；而CDR3包含HQWNRYPYT的氨基酸序列；所述人源化PAM4单克隆抗体重链可变区的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SYVLH的氨基酸序列；CDR2包含YINPYNDGTQYNEKFKG的氨基酸序列；而CDR3包含GFGGSYGFAY的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述人源化PAM4抗体或其片段的轻链可变区和重链可变区的FR包含至少一个被鼠PAM4单克隆抗体的相应FR取代的氨基酸。更优选所述人源化PAM4抗体或其片段包含至少一个选自图1B中PAM4 VH氨基酸序列的鼠重链可变区氨基酸残基5、27、30、38、48、66、67和69的氨基酸。还优选其中来自所述鼠单克隆抗体的所述氨基酸是至少一个选自图1A中PAM4 Vκ序列的鼠轻链可变区氨基酸残基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸的人源化PAM4抗体或其片段。最优选所述人源化PAM4抗体或其片段包含图1A中的PAM4 Vκ核苷酸序列和图1B中的PAM4 VH核苷酸序列和/或包含图4A中的hPAM4 VH氨基酸序列和图4B中的hPAM4 Vκ氨基酸序列。
本发明的另一实施方案是靶向癌细胞的包含抗体组分的诊断用免疫缀合物，所述抗体组分包含本发明的抗体、融合蛋白或其片段中任一个的抗体或其片段，其中所述抗体、融合蛋白或其片段与至少一种诊断剂/检测剂结合。
优选所述诊断剂/检测剂选自放射性核素、造影剂和光敏诊断剂/检测剂。更优选所述诊断剂/检测剂是能量介于20keV和4000keV之间的放射性核素，或者是选自以下的放射性核素：110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ发射体、β发射体或正电子发射体。还优选所述诊断剂/检测剂是顺磁离子例如包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(HI)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)在内的金属或不透射线物质例如钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。
还优选所述诊断剂/检测剂是荧光标记化合物，选自：异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；化学发光标记化合物，选自鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯；或生物发光化合物，选自萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。在另一个实施方案中，本发明的诊断用免疫缀合物用于手术中、内窥镜检查或血管内肿瘤诊断。
本发明的另一实施方案是靶向癌细胞的包含抗体组分的治疗用免疫缀合物，所述抗体组分包含本发明抗体、融合蛋白或其片段中任一个的抗体或其片段，其中所述抗体、融合蛋白或其片段与至少一种治疗剂结合。
优选所述治疗剂选自放射性核素、免疫调节剂、激素、激素类拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂和它们的组合。
在一个实施方案中，寡核苷酸例如抑制bcl-2表达的反义分子在U.S.5,734,033(Reed)中有描述，可以缀合或形成本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分，所述专利通过引用全部结合到本文中。或者，所述寡核苷酸可以与本发明裸PAM4抗体或缀合PAM4抗体或抗体片段同时给予或者序贯给予。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸是反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸最好是针对B细胞恶性肿瘤的癌基因或癌基因产物例如bcl-2。
在一个优选的实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂例如药物或毒素。还优选所述药物选自氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素类拮抗剂、内皮细胞抑制素(endostatin)、紫杉醇、喜树碱、SN-38、多柔比星及其类似物、抗代谢药、烷化剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11和它们的组合。
在另一个实施方案中，所述治疗剂是寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可以是反义寡核苷酸，例如针对癌基因如bcl-2和p53的反义寡核苷酸。
在另一个优选的实施方案中，所述治疗剂是毒素，选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素和它们的组合；免疫调节剂，选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素和它们的组合；放射性核素，选自32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、90Y、111A、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac和它们的组合；或光敏治疗剂，选自色原和染料。
更优选所述治疗剂是选自以下的酶：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
本文中考虑的是多价多特异性抗体或其片段，其包含不止一个对PAM4靶抗原具有亲和性的抗原结合部位以及一个或多个对半抗原分子具有亲和性的半抗原结合部位。优选所述抗体或其片段是人源化或全人抗体或其片段。还优选所述多价多特异性抗体或其片段还包含诊断剂/检测剂和/或治疗剂。
本文中还描述的是能携带至少一种诊断剂和/或治疗剂的双特异性抗体或其片段，其包含至少一个对PAM4靶抗原具有亲和性的结合部位以及对至少一个选自以下的靶向构建体/缀合物具有亲和性的结合部位：
DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 271)；
DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 277)；
DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 288)；
DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 0281)；和
DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP 284)。其它适用于本发明的靶向构建体在于2003年6月13日申请的美国临时专利申请、题目为“D-氨基酸肽”(McBride)中公开，代理档案号018733/1206。
本发明的另一实施方案是包含至少两种PAM4单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段，其中所述单克隆抗体或片段包含本发明的抗体及其片段中任一个。还优选所述抗体融合蛋白或其片段包含本发明的抗体及其片段中任一个的至少一种第一PAM4单克隆抗体或其片段和除本发明抗体及其片段的单克隆抗体或其片段之外的至少一种第二单克隆抗体或其片段。优选所述第二单克隆抗体是癌相关抗体，优选选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根据路易斯(Lewis)抗原Le(y)定义的抗体和针对以下的抗体：CSAp、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、IL-6、MUC2、MUC3、MUC4、TAG-72、EGFR、CD40、血小板衍生生长因子、IL-6、血管生成因子(例如VEGF)、癌基因产物和HER2/neu。本发明的抗体融合蛋白或其片段还可以包含至少一种诊断剂和/或治疗剂。
本文中还描述的是包含编码选自以下的单克隆抗体或其片段的核酸的DNA序列：
(a)本发明中描述的抗体中任一个的PAM4抗体或其片段；
(b)包含至少两个(a)中描述的单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段；
c)包含至少一种第一PAM4单克隆抗体或其片段和至少一种第二单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段，所述第一PAM4单克隆抗体或其片段包含本发明的PAM4抗体或其片段的所述单克隆抗体或其片段，所述第二单克隆抗体或其片段不是本发明的抗体或其片段中任一个的单克隆抗体或其片段；和
(d)包含至少一种第一单克隆抗体或其片段和至少一种第二单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段，所述第一单克隆抗体或其片段包含本发明的抗体或其片段中任一个的所述单克隆抗体或其片段，所述第二单克隆抗体或其片段不是本发明抗体或其片段中任一个的所述单克隆抗体或其片段，其中所述第二单克隆抗体是癌相关抗体。优选所述癌相关抗体选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根据路易斯抗原Le(y)定义的抗体和针对以下的抗体：CD40、血管生成因子(例如VEGF)、癌基因产物、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子、腱生蛋白、IL-6和HER2/neu。
本发明中还描述的是包含本发明抗体、融合蛋白或其片段中任一个的DNA序列的表达载体和宿主细胞。
本发明的另一实施方案是一种将诊断剂或治疗剂或其组合传递到靶的方法，所述方法包括(i)提供包含与至少一种诊断剂/检测剂和/或治疗剂缀合的PAM4抗体或其片段的组合物和(ii)给予有需要的患者本发明抗体、融合蛋白或其片段中任一个的诊断用缀合物或治疗用缀合物。优选所述诊断剂/检测剂选自放射性核素、造影剂和光敏诊断剂/检测剂，所述治疗剂优选选自药物、毒素、细胞毒性剂、细胞因子、免疫调节剂、激素、激素类拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属。
本发明还考虑一种将诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合传递到靶的方法，所述方法包括(a)给予患者对PAM4抗原具有亲和性并且包含一个或多个半抗原结合部位的本发明多价多特异性抗体或其片段中任一个的抗体或其片段；和(b)等待足够长的时间，以清除所述患者血流中的非抗体量；和(c)给予所述患者包含诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合并且与所述抗体的结合部位结合的载体分子。优选所述载体分子与所述抗体的不止一个结合部位结合。更优选所述诊断剂/检测剂或所述治疗剂选自同位素、药物、毒素、细胞因子、寡核苷酸、激素、激素类拮抗剂、酶、酶抑制剂、生长因子、放射性核素和金属。
在一个实施方案中，寡核苷酸例如抑制bcl-2表达的反义分子描述于U.S.5,734,033(Reed)中，可以缀合或形成本发明免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分，所述专利通过引用结合到本文中。或者，所述寡核苷酸以及本发明的裸PAM4抗体或缀合PAM4抗体或抗体片段可以同时或序贯给予。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸是优选针对B细胞恶性肿瘤的癌基因或癌基因产物例如bcl-2的反义寡核苷酸。
本发明描述一种用于诊断或治疗癌症的方法，所述方法包括：(a)给予有需要的患者对PAM4抗原具有亲和性并且包含一个或多个半抗原结合部位的本发明多价多特异性抗体或其片段中任一个的抗体或其片段；(b)等待足够长的时间，以清除所述患者血流中的未结合抗体量；和(c)给予所述患者包含诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合并且与所述抗体的结合部位结合的载体分子。在一个优选的实施方案中，癌症是胰腺癌。还优选所述方法可用于手术中鉴定患病组织、经内窥镜检查鉴定患病组织或血管内鉴定患病组织。
本发明的另一实施方案是一种治疗患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括：(a)给予所述患者治疗有效量的包含本发明抗体、融合蛋白或其片段中任一个的PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段的抗体或其片段，其中所述PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段与至少一种治疗剂缀合；和(b)将所述PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段配制在药学上适合的赋形剂中。优选所述方法还包括不在本发明抗体、融合蛋白或其片段中任一个中的第二单克隆抗体或其片段。更优选所述第二单克隆抗体或其片段是裸单克隆抗体或其片段。还优选所述第二单克隆抗体或其片段选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、ND2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根据路易斯抗原Le(y)定义的抗体和针对以下的抗体：CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、CD40、血管生成因子(例如VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、癌基因产物和HER2/neu。
本文中考虑的是一种诊断患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括：(a)给予所述患者诊断有效量的包含本发明抗体、融合蛋白或其片段中任一个的PAM4单克隆抗体或其片段或PAM4抗体融合蛋白或其片段的诊断用缀合物，其中所述PAM4单克隆抗体或其片段或PAM4抗体融合蛋白或其片段与至少一种诊断剂/检测剂缀合；和(b)任选将所述PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段配制在药学上适合的赋形剂中。
本发明的另一实施方案是一种治疗患者的癌细胞的方法，所述方法包括：(i)给予所述患者治疗有效量的包含本发明裸抗体、融合蛋白或其片段中任一个的裸PAM4单克隆抗体或其片段或裸抗体融合蛋白或其片段的组合物；(ii)将所述裸PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段配制在药学上适合的赋形剂中。优选所述方法还包括不是本发明裸抗体、融合蛋白或其片段中任一个的第二裸抗体或其片段。例如，所述第二抗体或其片段可以选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea、根据路易斯抗原Le(y)定义的抗体和针对以下的抗体：CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、CD40、血管生成因子(例如VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、癌基因产物和HER2/neu。
本发明也描述一种诊断患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括：(i)用包含本发明裸抗体、融合蛋白或其片段中任一个的裸PAM4单克隆抗体或其片段或裸抗体融合蛋白或其片段的组合物对来自所述患者的标本进行体外诊断分析。优选所述恶性肿瘤是癌症。更优选所述癌症是胰腺癌。
本发明的另一实施方案是一种手术中鉴定患者的表达PAM4抗原的患病组织的方法，所述方法包括：(A)给予有效量的包含至少一个特异性结合表达PAM4-抗原的靶向组织的臂和至少另一个特异性结合靶向缀合物的臂的双特异性抗体或抗体片段，其中所述一个特异性结合靶向组织的臂是hPAM4抗体或其片段；和(B)给予选自以下的靶向缀合物：
(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；
Figure A0381929400321
和
本文还描述一种经内窥镜检查鉴定患者的表达PAM4抗原的患病组织的方法，所述方法包括：(A)给予有效量的包含至少一个特异性结合表达PAM4-抗原的靶向组织的臂和至少另一个特异性结合靶向缀合物的臂的双特异性抗体或抗体片段，其中所述一个特异性结合靶向组织的臂是hPAM4抗体或其片段；和(B)给予选自以下的靶向缀合物：
(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；
和
本文中考虑一种血管内鉴定患者的表达PAM4抗原的患病组织的方法，所述方法包括：(A)给予有效量的包含至少一个特异性结合表达PAM4-抗原的靶向组织的臂和至少另一个特异性结合靶向缀合物的臂的双特异性抗体或抗体片段，其中所述一个特异性结合靶向组织的臂是hPAM4抗体或其片段；和(B)给予选自以下的靶向缀合物：
(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；
Figure A0381929400341
和
Figure A0381929400342
另一个实施方案是一种在内窥镜检查、血管内导管或外科手术中检测损害的方法，其中所述方法包括：(a)给准备进行所述手术的患者注射双特异性抗体F(ab)2或其F(ab′)2片段、双功能抗体(diabody)、三功能抗体(triabody)或四功能抗体(tetrabody)，其中所述双特异性抗体或其片段、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体具有与PAM4抗原特异性结合的第一抗体结合部位，并且具有与半抗原特异性结合的第二抗体结合部位，允许所述抗体片段附加在靶部位；(b)任选用半乳糖基化抗独特型清除剂清除非靶向抗体片段，如果在注射约24小时内所述双特异性片段大部分没有从循环中清除的话，然后注射二价标记半抗原，所述半抗原很快地集中在靶部位并通过肾脏清除；(c)在初次注射48小时内，通过使用检测手段近距离检测靶部位升高的附加标记水平来检测存在的所述半抗原，然后进行所述手术，其中所述检测在不使用造影剂或扣除剂的情况下进行。
本发明也考虑一种在手术中、血管内手术中或内窥镜手术中近距离损害检测的方法，其中所述方法包括：(a)给准备进行所述手术的患者胃肠外注射有效量的hPAM4免疫缀合物或其片段，(b)在注射48小时内实施所述手术；(c)用检测所述标记抗体或其片段的存在的检测手段，对患者的内部可及部位进行近距离扫描；和(d)根据在所述部位用所述检测手段检测到所述标记抗体或其片段水平升高，对所述标记抗体或其片段的附加部位进行定位。
                        附图简述
图1显示鼠PAM4的克隆化V基因和导出的氨基酸序列。图1A显示PAM4 Vκ的DNA序列和氨基酸序列。图1B显示PAM4 VH的DNA序列和氨基酸序列。由相应DNA序列编码的氨基酸序列以在核苷酸序列之下的单字母密码子给出。核苷酸序列的编号位居右侧。CDR区中的氨基酸残基用粗体加下划线表示。如以上氨基酸残基编号所示，用Kabat Ig分子编号对氨基酸残基进行编号。用单字母编号的氨基酸残基是根据Kabat编号方案定义的插入残基。插入残基具有与前面的残基之前的数字相同的数字。例如，图1B中残基82、82A、82B和82C分别表示为82、A、B和C。
图2显示在Sp2/0细胞中表达的嵌合PAM4(cPAM4)重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。图2A显示cPAM4Vκ的氨基酸序列。图2B显示cPAM4VH的氨基酸序列。所述序列以单字母密码子给出。CDR区中的氨基酸残基用粗体加下划线表示。氨基酸的编号同图1。
图3显示人抗体、PAM4和hPAM4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列比对。图3A显示人抗体Walker与PAM4和hPAM4的Vκ氨基酸序列比对，图3B显示人抗体Wil2(FR1-3)和NEWM(FR4)与PAM4和hPAM4的VH氨基酸序列比对。圆点表示PAM4的残基与人抗体的相应残基相同的残基。方框内的区表示CDR区。hPAM4的N端和C端残基(加下划线)用所用的分期载体定位。用Kabat Ig分子编号方案对图1中的残基进行编号。
图4显示在Sp2/0细胞中表达的人源化PAM4(hPAM4)重链可变区和轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。图4A显示hPAM4 Vκ的DNA序列和氨基酸序列，图4B显示hPAM4VH的DNA序列和氨基酸序列。核苷酸序列的编号位居右侧。由相应DNA序列编码的氨基酸序列以单字母密码子给出。CDR区中的氨基酸残基用粗体加下划线表示。同图1A和图1B中一样，用Kabat Ig分子编号方案对氨基酸残基进行编号。
图5显示人源化PAM4抗体、hPAM4与嵌合PAM4、cPAM4相比的结合活性。hPAM4用菱形表示，cPAM4用实心圆表示。结果表明hPAM4抗体和cPAM4当与125I-cPAM4竞争与CaPan1 Ag结合时的可比结合活性。嵌合抗体是其所含有的抗体分子可变区来源于一种物种的互补性决定区(CDR)而所含有的抗体分子恒定区来源于人抗体恒定区的重组蛋白。
                     优选实施方案的详细描述
概述
本文所述的术语“PAM4抗体”包括鼠PAM4抗体、人PAM4抗体和人源化PAM4抗体。
本发明涉及可用于胰腺癌诊断、检测、分期和治疗的单克隆抗体PAM4。优选本发明的PAM4抗体及其片段是人源化或全人的。所述鼠PAM4(mPAM4)抗体是用作为免疫原的来源于异种移植物RIP-1人胰腺癌的胰腺癌粘蛋白产生的MUC1抗体。Gold等，Int.J.Cancer，57：204-210(1994)。所述mPAM4抗体识别靶胰腺癌抗原上的独特的新表位。免疫组织化学染色研究，例如实施例1中所描述的那些研究，已经表明PAM4 MAb结合位于由乳腺癌细胞、胰腺癌细胞和其它的癌细胞表达的MUC1抗原的的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域，并限制与正常人组织结合。本发明的PAM4抗体对胰腺癌具有相对特异性，因此其优先结合胰腺癌细胞。在一个优选的实施方案中，所述PAM4抗体及其片段是人源化的。所述PAM4抗体与可以迅速内化的靶表位起反应。该表位主要由胰腺癌相关而与局灶性胰腺炎无关的抗原表达。在动物模型中，采用放射性标记PAM4 MAb进行的定位和治疗研究已经证明有肿瘤靶向和治疗功效。
本发明的PAM4抗体结合PAM4抗原，PAM4抗原是位于由许多器官和肿瘤类型产生的抗原MUC1的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域。本发明的优选PAM4抗体优先结合胰腺癌细胞。用PAM4 MAb例如实施例2中的PAM4单克隆抗体进行的研究表明，所述抗体具有一些重要的特性，使其成为用于临床诊断和治疗应用的候选物。由于所述PAM4抗原提供用于诊断和治疗的有效靶，理想的是获得识别不同于早期研究中描述的由非PAM4抗体(CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、aLea和路易斯抗原)识别的表位的胰腺癌抗原的表位的单克隆抗体。
适合用于联合或结合本发明的PAM4抗体使用的抗体包括例如CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea和根据路易斯抗原Le(y)定义的抗体或针对以下的抗体：癌胚抗原(CEA)、结肠-特异性抗原-p(CSAp)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例如VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6以及癌基因产物以及针对以下的抗体：肿瘤坏死因子例如Epstein等的专利(美国专利号6,071491、6,017,514、5,019,368和5,882,626)中所描述的。所述抗体可用于补充当前的PAM4抗体免疫检测和免疫疗法。在治疗应用中，参与抵抗肿瘤细胞的效应细胞功能的免疫调节剂的激动或拮抗性抗体也可以与单独的PAM4抗体联用或者与其它的肿瘤相关抗体联用，一个实例是抗CD40的抗体。Todryk等，J Immunol Methods，248：139-147(2001)；Turner等，J Immunol，166：89-94(2001)。也可使用抗标记或癌基因产物的抗体或者抗血管生成因子例如VEGF的抗体。VEGF抗体描述于Thorpe等，美国专利号6,342,221、5,965,132和6,004,554，所述专利通过引用全部结合到本文中。
此外，其它的PAM4样抗体的利用度对于开发双测定酶联免疫吸附测定(ELISA)是必需的，ELISA可用于检测临床样品中的PAM4抗原。ELISA实验描述于实施例4和实施例7。
本发明描述结合位于MUC1的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域并且可用于诊断方法和治疗方法中的人源化抗体和全人抗体及其片段。在一个优选的实施方案中，所述PAM4抗体是人源化的。还优选本发明的PAM4抗体优先结合胰腺癌细胞。因为非人类单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白，并且重复注射可以导致有害的过敏反应，所以鼠PAM4序列的人源化可以减少患者可能经历的不良免疫应答。对于基于鼠的单克隆抗体，常常将其称为人抗小鼠抗体(HAMA)应答。优选人源化PAM4抗体或其片段的构架区中的某些人残基被其鼠对应物所取代。还优选来自两种不同人抗体的构架序列的组合用于VH。所述抗体分子的恒定区来源于人抗体的恒定区。
本发明另一个优选的实施方案是人PAM4抗体。人抗体是例如从已“工程改造”以产生响应抗原攻击的特异性人抗体的转基因小鼠中获得的抗体。在该项技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件导入来源于含有内源重链基因座和轻链基因座的中靶破坏的胚胎干细胞系的小鼠品系中。所述转基因小鼠可以合成对人抗原有特异性的人抗体，并且所述小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法描述于Green等，Nature Genet.7：13(1994)；Lonberg等，Nature 368：856(1994)；和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)。全人抗体也可以通过基因转染法或染色体转染法以及噬菌体展示技术构建，所有所述技术都是本领域已知的。参见例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)，该文献描述了人抗体及其片段以及从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区基因库(repertoire)的体外产生。在该项技术中，将抗体可变区基因符合读框地克隆到丝状噬菌体的大外壳蛋白基因或小外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒表面。因为所述丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以根据抗体的功能特性进行选择也导致对编码表现出所述特异的基因进行选择。由此可见，所述噬菌体模拟B细胞的某些特性。噬菌体展示可以以各种各样的形式进行，有关噬菌体展示的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 3：5564-571(1993)。
本发明的抗体及其片段优选针对来自人胰腺肿瘤的粗制粘蛋白制剂产生。在一个相关方面中，所述PAM4抗体可以使用基本纯的PAM4抗原制剂来获得。基本纯的蛋白是基本上不含污染细胞组分的蛋白，所述污染细胞组分性质上与所述蛋白相关。
定义
在下面的说明书中，使用了许多术语，为了便于理解本发明，提供以下定义。
本文所述的 抗体是指全长(即天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等等。无论何种结构，抗体片段都与被全长抗体识别的同一抗原结合。例如，抗CD20单克隆抗体片段与CD20的表位结合。术语“抗体片段”也包括同特异性抗原结合形成复合物的抗体起同样作用的任何合成或基因工程蛋白。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离的片段，例如由重链可变区和轻链可变区组成的“Fv”片段、其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接在一起的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”)和由模拟超变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
裸抗体通常是不与治疗剂或诊断剂/检测剂缀合的抗体。然而，它也可以是不与诊断剂/检测剂或治疗剂缀合的抗体片段。这是因为抗体分子的Fc部分提供效应子功能，例如补体结合和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，该机制发挥作用，可以导致细胞裂解。然而，可能Fc部分开始起作用并不需要同其它机制例如细胞凋亡一样的治疗功能。裸抗体既包括多克隆抗体和单克隆抗体，又包括融合蛋白和某些重组抗体例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
嵌合抗体是含有包括来自一种物种(优选啮齿动物抗体)的抗体的互补性决定区(CDR)的可变区的重组蛋白，而所述抗体分子的恒定区来源于人抗体。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定区可以来源于其它物种，例如猫或狗。
人源化抗体是其中来自一种物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链可变区和轻链可变区转移到人重链可变区和轻链可变区的重组蛋白。所述抗体分子的恒定区来源于人抗体的恒定区。
人抗体是从已“工程改造”以产生响应抗原攻击的特异性人抗体的转基因小鼠中获得的抗体。在该项技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件导入来源于含有内源重链基因座和轻链基因座的中靶破坏的胚胎干细胞系的小鼠品系中。所述转基因小鼠可以合成对人抗原有特异性的人抗体，并且所述小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法描述于Green等，NatureGenet.7：13(1994)；Lonberg等，Nature 368：856(1994)；和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)。全人抗体也可以通过染色体转染法以及噬菌体展示技术构建，所有所述技术都是本领域已知的。参见例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)，该文献描述了人抗体及其片段以及从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区基因库的体外产生。在该项技术中，将抗体可变区基因符合读框地克隆到丝状噬菌体的大外壳蛋白基因或小外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒表面。因为所述丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以根据抗体的功能特性进行选择也导致对编码表现出所述特异性基因进行选择。由此可见，所述噬菌体模拟B细胞的某些特性。噬菌体展示可以以各种各样的形式进行，有关噬菌体展示的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in StructuralBiology 3：5564-571(1993)。
人抗体也可以通过体外活化B细胞产生。参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号，所述专利通过引用全部结合到本文中。
治疗剂是与抗体部分独立、同时或序贯给予或者与抗体部分即抗体或抗体片段或亚片段缀合的并且可用于治疗疾病的分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。
诊断剂/检测剂是与抗体部分即抗体或抗体片段或亚片段缀合给予并且可用于通过定位含有所述抗原的细胞来诊断疾病的分子或原子。有用的诊断剂/检测剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如生物素-链霉抗生物素蛋白复合物)、造影剂、荧光化合物或分子和磁共振成像(MRI)用增强剂(例如顺磁离子)。美国专利第6,331,175号描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备方法，所述专利通过引用全部结合到本文中。优选所述诊断剂/检测剂选自放射性同位素、供磁共振成像用的增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁离子加载抗体组分，可能必需使其与具有连接多个螫合基团以结合离子的长尾的试剂反应。这样的尾可以是具有可以结合螫合基团的侧基的聚合物，例如多聚赖氨酸、多糖或其它的衍生化链或可衍生链，所述螫合基团例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的基团。采用标准化学方法，使螯合物与抗体偶联。螯合物通常通过能与免疫反应性最小损失，最小聚集和/或内部交联的分子形成化学键的基团与抗体连接。螯合物与抗体缀合的其它更与众不同的方法和试剂公开于1989年4月25日授予Hawthorne的美国专利4,824,659，题目为“抗体缀合物”，所述专利文献的公开内容通过引用全部结合到本文中。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其一甲基类似物和环己基类似物，它们与以下总能量范围为60-4,000keV的诊断用同位素联用：例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br，供放射成像用。相同的螯合物当与非放射性金属例如锰、铁和钆络合时，可与本发明抗体一起用于MRI。大环螯合物例如NOTA、DOTA和TETA可分别与各种各样的金属和放射性金属、最特别是与镓、钇和铜的放射性核素联用。这样的金属-螯合物络合物可以根据目标金属的环大小定制，因而是非常稳定的。本发明包括其它的环型螯合物例如大环聚醚，它们对于用于RAIT的稳定结合核素例如223Ra有价值。
免疫缀合物是与至少一种治疗剂和/或诊断剂/检测剂缀合的抗体、融合蛋白或其片段。所述诊断剂/检测剂可以包括放射性核素或非放射性核素、造影剂(例如用于磁共振成像、计算机断层成像或超声成像)，所述放射性核素可以是γ发射同位素、β发射同位素、α发射同位素、俄歇电子发射同位素或正电子发射同位素。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，基因表达处于某些调节元件的控制之下，所述调节元件包括组成型启动子或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。这样的基因被认为是与调节元件“有效连接”的。
重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核细胞或真核细胞。该术语也包括已经进行基因工程改造以在宿主细胞或宿主细胞的细胞的染色体或基因组中含有克隆化基因的那些原核细胞或真核细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨髓瘤细胞，例如SP2/0细胞和NS0细胞以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、杂交瘤细胞系及其它可用于表达抗体的哺乳动物宿主细胞。另外，用于表达mAb及其它融合蛋白的特别有用的宿主细胞是人细胞系PER.C6，其公开于WO0063403 A2，产生比常规哺乳动物细胞系例如CHO、COS、Vero、Hela、BHK和SP2-细胞系高2-200倍的重组蛋白。具有经修饰的免疫系统的特殊转基因动物对于制备全人抗体特别有用。
本文所用的术语 抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中具有相同或不同特异性的两个或更多个相同或不同的天然抗体、单链抗体或抗体片段区段连接在一起。融合蛋白的价数表示结合臂或部位的总数，所述融合蛋白必定是抗原或表位；即单价、二价、三价或四价。抗体融合蛋白的多价是指它可以在与抗原结合时具有多种相互作用优势，因而增加与抗原结合的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能结合多少种抗原或表位；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义时，天然抗体例如IgG是二价的，因为它具有两个结合臂，但却是单特异性的，因为它结合一种抗原。单特异性多价融合蛋白对于一个表位具有不止一个结合部位，但仅与同一抗原上的相同或不同表位结合，例如具有两个结合部位的并与同一抗原起反应的双功能抗体。所述融合蛋白可以包含不同抗体组分或多拷贝的相同抗体组分的多价或多特异性组合。所述融合蛋白还可包含治疗剂。适合所述融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一种优选的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，优选重组RNA酶。
多特异性抗体是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶例如两种不同的抗原、同一抗原上的两个不同的表位、或半抗原和/或抗原或表位的抗体。一种特异性将会是针对B细胞、T细胞、髓样细胞、浆细胞和肥大细胞抗原或表位。另一种特异性可以是针对同一细胞类型上的不同抗原，例如B细胞上的CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74和CD22。多特异性多价抗体是具有不止一个结合部位的构建体，并且所述结合部位具有不同的特异性。例如，双功能抗体，其一个结合部位与一种抗原反应，而另一个结合部位与另一种抗原反应。
双特异性抗体是可以同时结合两个具有不同结构的靶的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个特异性结合例如B细胞、T细胞、髓样细胞、浆细胞和肥大细胞抗原或表位的臂和至少另一个特异性结合携带治疗剂或诊断剂/检测剂的靶向缀合物的臂。可以用分子工程技术产生各种各样的双特异性融合蛋白。在一种形式中，所述双特异性融合蛋白是由例如对一种抗原具有一个结合部位的scFv和对第二种抗原具有一个结合部位的Fab片段组成的单价双特异性融合蛋白。在另一种形式中，所述双特异性融合蛋白是由例如对一种抗原具有一个结合部位的IgG和对第二种抗原具有两个结合部位的两个scFv组成的二价双特异性融合蛋白。
人源化PAM4抗体和人PAM4抗体的制备
通过本领域技术人员已知的方法可以获得特定抗原的单克隆抗体。参见例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)和Coligan等(编著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷、第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)(在下文称为“Coligan”)。简而言之，可以通过如下方法获得PAM4 MAb：给小鼠注射包含PAM4抗原的组合物，取出血清样品确定抗体产生的存在，取出脾脏获取B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生抗PAM4抗原的抗体的阳性克隆，培养产生抗PAM4抗原的抗体的克隆，从杂交瘤培养物中分离出PAM4抗体。本发明的PAM4抗体结合PAM4抗原即位于MUC1的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域。本发明的PAM4抗体优先结合胰腺癌细胞。
在开始产生抗免疫原的抗体之后，可以对所得抗体进行测序，然后通过重组技术来制备。鼠抗体和抗体片段的人源化是本领域技术人员众所周知的。例如，通过将来自小鼠免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的鼠互补决定区转移到人可变区中，然后取代鼠对应物构架区中的人残基，产生人源化单克隆抗体。来源于人源化单克隆抗体的抗体组分的应用避免了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
本发明的全人抗体即人PAM4可以得自转基因非人类动物。参见例如Mendez等，Nature Genetics，15：146-156(1997)；美国专利第5,633,425号，所述文献通过引用全部结合到本文中。例如，可以从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中回收人抗体。通过使内源免疫球蛋白基因失活并导入人免疫球蛋白基因座中，将小鼠体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂并且包含许多总体几乎占人类基因组的0.2％的不同区段。为了确保转基因小鼠能够产生适当的抗体组分，必须将人重链基因座和轻链基因座的大部分导入小鼠基因组中。从在种系构型中含有人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)的形成开始，分步做到这一点。由于每个插入片段的大小约为1Mb，因此YAC构建需要免疫球蛋白基因座的重叠片段的同源重组。通过含YAC酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合，将两个YAC(其中一个含有重链基因座，另一个含有轻链基因座)独立地导入小鼠中。然后将胚胎干细胞克隆微注射到小鼠胚泡中。所得嵌合雄鼠根据其YAC通过其种系遗传的能力进行选择，并让其与鼠抗体产生缺陷型小鼠配种。繁育这两个转基因品系(其中一个含有人重链基因座，而另一个含有人轻链基因座)，产生当免疫应答时产生人抗体的后代。
克隆鼠免疫球蛋白可变区的通用技术在例如以下出版物中有描述：Orlandi等，Proc.Nat′l Acad Sci.USA 86：3833(1989)，所述文献通过引用全部结合到本文中。产生人源化单克隆抗体的技术在例如以下文献中有描述：Carter等，Proc.Nat′l Acad Sci.USA 89：4285(1992)；Singer等，J.Immun.150：2844(1992)；Mountain等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.10：1(1992)和Coligan，第10.19.1-10.19.11页，每个所述文献都通过引用结合到本文中。
一般而言，通过各种分子克隆方法，例如RT-PCR、5′-RACE和cDNA文库筛选，可以获得PAM4抗体的Vκ(轻链可变区)序列和VH(重链可变区)序列。具体地说，分别通过RT-PCR和5′RACE，通过PCR扩增克隆来自杂交瘤细胞的MAb PAM4的VH基因和Vκ基因，然后它们的序列通过DNA测序进行测定。为了证实其真实性，按照Orlandi等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：3833(1989))所描述的方法，让克隆化VL基因和VH基因在细胞培养物中表达为抗体，所述文献通过引用结合到本文中。然后，按照Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所描述的方法，可以基于V基因序列设计和构建人源化PAM4抗体，所述文献通过引用结合到本文中。可以用通用分子克隆技术(Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第二版(1989))，从任何产生鼠PAM4抗体或人源化PAM4抗体的已知杂交瘤系或转染细胞系，制备cDNA。实施例7描述了hPAM4 MAb所使用的人源化过程。
抗体一般可以从如下的细胞培养基中分离出来。转染瘤培养物适于无血清培养基。对于人源化抗体生产，使用HSFM，让细胞在滚瓶内的500ml培养物中生长。将培养物离心，上清液通过0.2μm膜过滤。将过滤的培养基以1ml/min的流速通过A蛋白柱(1×3cm)。树脂柱然后用约10倍柱体积的PBS洗涤，用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.5)从柱子上洗出A蛋白结合抗体。将1.0ml流分收集到装有10μl 3M Tris(pH 8.6)的试管中，用280/260nm处的吸光度测定蛋白质浓度。将峰流分合并，对PBS透析，例如用Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)浓缩抗体。如上所述，用ELISA测定抗体浓度，抗体浓度用PBS调至约1mg/ml。向样品中方便地加入0.01％(w/v)叠氮化钠(作为防腐剂)。
制备PAM4抗体所使用的引物的核苷酸序列在下面的实施例7中有讨论。在一个优选的实施方案中，人源化PAM4抗体或抗体片段包含鼠PAM4单克隆抗体的互补性决定区(CDR)和人抗体轻链可变区和重链可变区的构架(FR)区和人抗体轻链恒定区和重链恒定区，其中所述人源化PAM4的轻链可变区的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SASSSVSSSYLY的氨基酸序列；CDR2包含STSNLAS的氨基酸序列；而CDR3包含HQWNRYPYT的氨基酸序列；所述人源化PAM4单克隆抗体的重链可变区的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SYVLH的氨基酸序列；CDR2包含YINPYNDGTQYNEKFKG的氨基酸序列；而CDR3包含GFGGSYGFAY的氨基酸序列。还优选所述人源化抗体的轻链可变区和重链可变区的FR包含至少一个被鼠PAM4单克隆抗体的所述相应FR取代的氨基酸。
PAM4 MAb可以通过各种公认的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这样的分离技术包括用A蛋白琼脂糖凝胶的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见例如Coligan，第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另见Baines等，“免疫球蛋白G(IgG)的纯化”，载于：METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.1992)。
PAM4 MAb可以通过本领域技术人员熟知的各种技术进行表征。例如，使用间接酶免疫测定、流式细胞仪分析或蛋白质印迹分析，可以证实PAM4 MAb与PAM4抗原结合的能力。
PAM4抗体片段的产生
本发明考虑了PAM4抗体片段的应用。可以用已知的技术产生识别特定表位的抗体片段。所述抗体片段是抗体的抗原结合部分例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等等。例如可以用胃蛋白酶消化抗体分子产生F(ab′)2片段，可以将F(ab′)2片段的二硫键还原产生Fab′。这些方法描述于例如Goldenberg的美国专利第4,036,945号和第4,331,647号和其中所包括的参考文献，所述专利通过引用全部结合到本文中。另见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)；Edelman等，载于：METHODS INENZYMOLOGY，第1卷，第422页(Academic Press 1967)和Coligan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。另一方面，可以构建Fab′表达文库(Huse等，1989，Science，246：1274-1281)，以便快速容易地鉴定出具有所需特异性的单克隆Fab′片段。本发明包括抗体和抗体片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL区和VH区。VL区和VH区结合形成靶结合部位。这两个区通过肽接头(L)进一步共价连接。scFv分子表示VL-L-VH(如果VL区是scFv分子的N端部分的话)，或者表示VH-L-VL(VH区是scFv分子的N端部分的话)。制备scFv分子和设计合适肽接头的方法描述于美国专利第4,704,692号、美国专利第4,946,778号，R.Raag和M.Whitlow，″Single Chain Fvs.″FASEB第9卷：73-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker，″Single Chain Antibody VariableRegions，″TIBTECH，第9卷：132-137(1991)。这些参考文献通过引用结合到本文中。
可以通过蛋白酶水解全长抗体或者通过在大肠杆菌(E.coli)或其它宿主中表达编码所述片段的DNA，可以制备抗体片段。采用常规方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体，可以获得抗体片段。例如，用胃蛋白酶酶解抗体，可以产生抗体片段，提供约100Kd片段，称为F(ab′)2。该片段可以用硫醇还原剂和任选避免二硫键断裂的巯基保护基进一步裂解，产生约50Kd Fab′单价片段。或者，用木瓜蛋白酶酶解，直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法例如描述于Goldenberg的美国专利第4,036,945号和第4,331,647号和其中所包括的参考文献，所述专利通过引用全部结合到本文中。另见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)；Edelman等，载于：METHODS INENZYMOLOGY，第1卷，第422页(Academic Press 1967)和Coligan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
抗体片段的另一形式是编码一个互补性决定区(CDR)的肽。CDR是在结构上与抗体结合的表位互补的但比可变区的其余部分更多变化的抗体可变区的区段。因此，CDR有时也被称为超变区。一个可变区包含三个CDR。CDR肽可以通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得。例如通过采用聚合酶链式反应(PCR)从抗体生产细胞的RNA合成可变区，制备所述基因。参见例如Larrick等，Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 2：106(1991)；Courtenay-Luck、″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″载于：MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCION，ENGINEERING ANDCLINICAL APPLICATION，Ritter等(编著)，第166-179页(CambridgeUniversity Press 1995)；和Ward等，″Genetic Manipulation andExpression of Antibodies，″载于：MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(编著)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。
也可以使用裂解抗体的其它方法例如分离重链形成单价轻链-重链片段后进一步裂解片段或其它酶、化学或遗传技术，只要片段结合完整抗体所识别的抗原即可。
人源化PAM4抗体和人PAM4抗体融合蛋白的产生
本发明的抗体融合蛋白可以用各种各样的常规方法来制备，范围从戊二醛键至官能团间的更多特定键。包括本文描述的融合蛋白的抗体和/或抗体片段最好直接或通过接头部分、通过抗体或片段上的一个或多个官能团例如氨基、羧基、苯基、巯基或羟基彼此共价结合在一起。除戊二醛之外，还可以使用各种常规接头，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯等等。
用于产生人源化和人PAM4融合蛋白的一个简单方法是将抗体或片段在戊二醛存在下混合在一起。例如通过氢硼化物还原成仲胺，可以使初始席夫(Schiff)碱键稳定。可以用二异硫氰酸酯或碳二亚胺代替戊二醛作为非位点特异性接头。在本发明的一个实施方案中，抗体融合蛋白包含一种人源化或人PAM4单克隆抗体或其片段，其中所述MAb与MUC1抗原的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域结合。该融合蛋白及其片段优先结合胰腺癌细胞。该单价单特异性MAb可用于直接靶向抗原，其中所述MAb与治疗剂、诊断剂/检测剂或其组合连接，并且将所述蛋白直接给予有需要的患者。
本发明的PAM4抗体融合蛋白及其片段还可以包含至少两种人源化或人PAM4单克隆抗体或其片段，其中至少两个单克隆抗体或其片段结合PAM4抗原的不同表位。例如，MAb可以产生抗原特异性双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，它们对于PAM4抗原是多价但却是单特异性的。两个或更多个scFv分子的非共价缔合可以形成功能性双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。单特异性双功能抗体是相同scFv的同型二聚体，其中每个scFv都包含来自通过短接头与同一抗体的VL区连接的所选抗体的VH区。双功能抗体是通过两个scFv的非共价缔合形成的二价二聚体，产生两个Fv结合部位。三功能抗体是由三个scFv形成的三价三聚体，产生三个结合部位，而四功能抗体是四个scFv的四价四聚体，产生四个结合部位。用含有包含VH1-接头-VL1的重组基因构建体的表达载体，已经制备出一些单特异性双功能抗体。参见Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；Atwell等，Molecular Immunology 33：1301-1302(1996)；Holliger等，Nature Biotechnology 15：632-631(1997)；Helfrich等，Int.J.Cancer 76：232-239(1998)；Kipriyanov等，Int.J.Cancer 77：763-772(1998)；Holiger等，Cancer Research 59：2909-2916(1999))。scFv的构建方法公开于US-4,946,778(1990)和US-5,132,405(1992)。基于scFv产生多价单特异性抗体的方法公开于US-5,837,242(1998)、US-5,844,094(1998)和WO-98/44001(1998)。所述多价单特异性抗体融合蛋白结合可以位于同一抗原或不同抗原上的两个或更多个相同类型的表位。增加的价数允许额外的相互作用、增加的亲和性和更长的滞留期。这些抗体融合蛋白可以用于直接靶向系统，其中所述抗体融合蛋白与治疗剂、诊断剂/检测剂或其组合缀合，并且将其直接给予有需要的患者。
本发明的一个优选实施方案是包含不止一个对PAM4靶表位具有亲和性的抗原结合部位和一个或多个与胰腺癌抗原相关的额外表位的多价多特异性抗体或其片段。该融合蛋白是多特异性，因为其结合至少两个不同的表位，该表位可以位于相同或不同的抗原上。例如，所述融合蛋白可以包含不止一个抗原结合部位，第一个对于一个PAM4抗原表位具有亲和性，第二个对于另一靶抗原例如TAG-72或CEA具有亲和性。另一实例是可以包含CA19.9 MAb(或其片段)和PAM4 MAb(或其片段)的双特异性PAM4抗体融合蛋白。这样的融合蛋白将会对CA19.9以及位于MUC1的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域具有亲和性。本发明还考虑包含不止一个对至少两个不同PAM4抗原表位具有亲和性的抗原结合部位的融合蛋白。
本发明的抗体融合蛋白及其片段可以用于直接靶向系统，其中所述抗体融合蛋白与治疗剂、诊断剂/检测剂或其组合缀合，并且将其直接给予有需要的患者。
本发明的另一个优选实施方案是包含不止一个对PAM4靶表位具有亲和性的抗原结合部位和至少一个对半抗原分子具有亲和性的半抗原结合部位的多价多特异性抗体及其片段。例如，双特异性PAM4抗体融合蛋白可以包含679MAb(或其片段)和PAM4 MAb(或其片段)。单克隆抗体679以高亲和力与含有三肽部分即组胺琥珀酰甘氨酰(HSG)的分子结合。如上所述，这样的双特异性PAM4抗体融合蛋白可以例如通过获得来自679的F(ab′)2片段来制备。679 F(ab′)2片段的链间二硫桥被胱氨酸温和还原，需小心避免轻链-重链键，形成Fab′-SH片段。该SH基团被过量的双马来酰亚胺接头(1，1′-(亚甲基二-4，1-亚苯基)双-马来酰亚胺)活化。将PAM4 MAb转变成Fab′-SH，然后与活化MR23 Fab′-SH片段反应，获得双特异性PAM4抗体融合蛋白。双特异性抗体融合蛋白例如此种蛋白可以用于亲和力增强系统，其中靶抗原用所述融合蛋白进行预先靶向，随后用与由预靶向形成的抗体-抗原复合物结合的诊断剂或治疗剂靶向。
双特异性抗体可以通过各种各样的常规方法和基因工程方法制备，所述常规方法例如完整IgG或优选F(ab′)2片段的混合物的二硫键裂解和重新形成，不止一个杂交瘤融合形成产生具有不止一种特异性的抗体的多杂交瘤(polyoma)。通过氧化性裂解Fab′片段，导致不同抗体的还原性裂解，制备双特异性抗体融合蛋白。最好如下进行这一步：将通过用胃蛋白酶消化两种不同的抗体产生的两种不同的F(ab′)2片段混合，还原性裂解形成Fab′片段的混合物，接着氧化性重新形成二硫键，产生包括含对每个原始表位Fab′potion特异性的双特异性抗体融合蛋白的F(ab′)2片段混合物。抗体融合蛋白制备的通用技术可以见于例如Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.93：470(1961)；H_mmerling等，J.Exp.Med.128：1461(1968)和美国专利第4,331,647号。本发明考虑包含至少一种第一PAM4单克隆抗体或其片段和至少一种第二单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段，所述第二单克隆抗体或其片段不是本发明的PAM4单克隆抗体或其片段。
通过使用异双官能接头例如马来酰亚胺羟基琥珀酰亚胺酯，可以实现更多选择的连接。酯与抗体或片段的反应会将抗体或片段上的氨基衍生化，然后所得衍生物可以与例如具有游离巯基的抗体Fab片段(或具有附在其上的巯基的较大片段或完整片段，通过例如Traut试剂)反应。这样的接头很少与同一抗体中的基团交联，从而改进了对键的选择性。
最好将抗体或片段在远离抗原结合部位的位点进行连接。通过例如如上所述经裂解的链间巯基的键，可以完成这一步。另一种方法包括使具有氧化糖部分的抗体与另一具有至少一个游离氨基官能的抗体反应。这产生初始席夫碱(mime)连接，最好通过还原成仲胺而稳定，例如通过氢硼化物还原，形成最终的复合物。这样的位点特异性连接公开于美国专利第4,671,958号(对于小分子)和美国专利第4,699,784号(对于较大附加物)，所述专利通过引用结合到本文中。
通过将PAM4抗原结合部分加入到双特异性人源化或人PAM4抗体融合蛋白中，可以获得多特异性PAM4抗体融合蛋白。例如，采用上述的双马来酰亚胺活化方法，可以使双特异性抗体融合蛋白与2-亚氨基噻烷反应，引入一个或多个用于使所述双特异性融合蛋白与第三PAM4单克隆抗体或片段偶联的巯基。这些用于产生抗体融合蛋白的技术是本领域技术人员熟知的。参见例如美国专利第4,925,648号，所述专利通过引用全部结合到本文中。
具有长度大于12个氨基酸残基的接头(例如15个残基接头或18个残基接头)的scFv允许同一链上的VH区和VL区之间的相互作用，一般形成单体、二聚体(称为双功能抗体)和少量更高质量的多聚体的混合物(Kortt等，Eur.J.Biochem.(1994)221：151-157)。然而，具有5个或更少氨基酸残基的接头的scFv阻止同一链上VH区和VL区的分子内配对，迫使与不同链上的VH区和VL区配对。介于3个残基和12个残基之间的接头主要形成二聚体(Atwell等，Protein Engineering(1999)12：597-604)。用介于0残基和2个残基之间的接头，形成scFv的三聚体(称为三功能抗体)、四聚体(称为四功能抗体)或较高寡聚体结构；然而，除接头长度之外，寡聚化的准确模式似乎还取决于V区的组成和取向。例如，抗神经氨酸苷酶抗体NC10的scFv主要形成具有0残基接头的三聚体(VH至VL取向)或四聚体(VL至VH取向)(Dolezal等，Protein Engineering(2000)13：565-574)。对于用具有1个残基和2个残基接头的NC10构建的scFv，VH至VL取向主要形成双功能抗体(Atwell等，Protein Engineering(1999)12：597-604)；相反，VL至VH取向形成四聚体、三聚体、二聚体和较高质量多聚体的混合物(Dolezal等，Protein Engineering(2000)13：565-574)。对于用抗CD19抗体HD37以VH至VL取向构建的scFv，0残基接头只形成三聚体，1个残基接头只形成四聚体(Le Gall等，FEBS Letters(1999)453：164-168)。
表达载体和宿主细胞
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，基因表达处于某些调节元件的控制之下，所述调节元件包括组成型启动子或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。这样的基因被认为是与调节元件“有效连接”的。启动子是指导结构基因转录的DNA序列。结构基因是转录成信使RNA(mRNA)后翻译成以具体多肽为特征的氨基酸序列的DNA序列。通常，启动子位于基因的5′区，靠着结构基因的转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应随诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调节。增强子是可以增加转录效率的DNA调节元件，并且与增强子相对于转录起始位点的距离或方向无关。
分离的DNA分子是没有整合在生物体基因组DNA中的DNA片段。例如，克隆化PAM4抗原基因是已从哺乳动物细胞的基因组DNA分离出来的DNA片段。分离的DNA分子的另一个实例是没有整合在生物体基因组DNA中的化学合成的DNA分子。互补DNA(cDNA)是以mRNA为模板通过逆转录酶形成的单链DNA分子。通常，用与mRNA的一部分互补的短的合成寡核苷酸作为起始逆转录产生第一链DNA的引物。本领域技术人员也用术语“cDNA”表示由这样的单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。
克隆载体是在宿主细胞中具有自主复制能力的DNA分子例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少量限制内切核酸酶识别位点以及标记基因，其中在所述限制内切核酸酶识别位点将外源DNA序列以确定的方式插入而不会丧失载体的必需生物学功能，所述标记基因适合用于对用克隆载体转化的细胞的鉴定和选择。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。重组宿主可以是任何含有克隆载体或表达载体的原核细胞或真核细胞。该术语也包括那些经基因工程改造以在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆化基因的原核细胞或真核细胞。术语表达是指基因产物的生物合成。例如，就结构基因而言，表达包括结构基因转录成mRNA，然后mRNA翻译成一个或多个多肽。
合适的宿主细胞包括微生物或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主是人细胞系PER.C6，其已开发用于产生MAb及其它的融合蛋白。因此，本发明的一个优选实施方案是包含编码PAM4 MAb、缀合物、融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主细胞。用含有处于人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制之下的Ad血清型5(Ad5)E1A编码序列和E1B编码序列(Ad5核苷酸459-3510)的质粒转染原代人胚胎视网膜细胞，产生PER.C6细胞(WO 97/00326)。E1A和E1B分别是腺病毒早期基因激活蛋白1A和1B。所述方法和组合物尤其可用于产生稳定表达的翻译后修饰(例如糖基化)的目标人重组蛋白。一些特征使PER.C6尤其可用作重组蛋白生产的宿主，例如，PER.C6是充分表征的人细胞系，其开发遵从药品非临床研究质量管理规范(goodlaboratory practices)。此外，PER.C6可以在不含任何人或动物源性蛋白的已知成分的无血清培养基中生长成为悬浮培养物，并且其生长与滚瓶、摇瓶、旋转瓶和生物反应器兼容，倍增时间约为35小时。最后，存在的E1A引起处于CMV增强子/启动子控制之下的基因表达上调，而存在的E1B阻止可能通过重组转基因过量表达增加的p53依赖性细胞凋亡。在一个实施方案中，所述细胞能够产生比常规哺乳动物细胞系多2-200倍的重组蛋白和/或蛋白质性物质。
供治疗和诊断用的人源化PAM4抗体和人PAM4抗体
本发明考虑一种诊断或治疗患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的包含PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段的治疗用缀合物，其中所述PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂结合，然后将其配制在药学上适合的赋形剂中。还优选一种用于诊断或治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者包含一个或多个PAM4抗原的抗原结合部位以及一个或多个半抗原结合部位的多价多特异性抗体或其片段，等待足够长的时间，以清除所述患者血流中的非抗体量；然后给予所述患者结合所述多价多特异性抗体或其片段的结合部位、包含以下组分的载体分子：诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合。在一个优选的实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是多价单特异性抗体或其片段。
单克隆抗体在体外诊断中的应用是众所周知的。参见例如Carlsson等，Bio/Technology 7(6)：567(1989)。例如，单克隆抗体可用于检测来自活检样品的组织中存在的肿瘤相关抗原。采用放射免疫测定、酶联免疫吸附测定和荧光免疫测定等技术，单克隆抗体也可以用于测定临床体液样品中肿瘤相关抗原的含量。
靶向肿瘤的单克隆抗体和毒素的缀合物可用于在体内选择性杀死癌细胞(Spalding，Bio/Technology 9(8)：701(1991)；Goldenberg，Scientific American Science & Medicine 1(1)：64(1994))。例如，在实验动物模型中进行的治疗研究已经证明携带细胞毒放射性核素的抗体的抗肿瘤活性。有关对动物模型和治疗研究的讨论，参见实施例3和实施例5。(Goldenberg等，Cancer Res.41：4354(1981)，Cheung等，J.Nat′l Cancer Inst.77：739(1986)和Senekowitsch等，J.Nucl.Med.30：531(1989))。
人源化抗体和全人抗体及其片段适用于治疗方法和诊断方法。因此，本发明考虑一种将诊断剂或治疗剂或其组合传递到靶的方法，所述方法包括(i)提供包含与至少一种诊断剂和/或治疗剂缀合的PAM4抗体或其片段的组合物和(ii)给予有需要的患者所述诊断用抗体缀合物或治疗用抗体缀合物。在一个优选的实施方案中，所述PAM4抗体及其片段是人源化或全人的。在另一个实施方案中，本发明的人源化PAM4抗体和全人PAM4抗体及其片段用于治疗恶性肿瘤的方法中。
本文还描述靶向癌细胞、包括含本发明的抗体中任一个的PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段的抗体组分的诊断用缀合物或治疗用缀合物，其中所述抗体组分与至少一种诊断剂或至少一种治疗剂结合。优选所述诊断用缀合物是光敏诊断剂/检测剂、超声检测剂或MRI造影剂。更优选所述诊断剂/检测剂是其能量介于20keV和4000keV之间的放射性核素。
本发明的另一实施方案是一种用于诊断或治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括给予治疗或诊断有效量的至少一种裸PAM4抗体或其片段和/或PAM4融合蛋白或其片段，任选将所述PAM4抗体、融合蛋白或其片段与药用赋形剂一起配制。
治疗用组合物含有至少一种单独和未缀合的、或者缀合或未缀合的并且与其它抗体或其片段例如其它人源化抗体或嵌合抗体、人抗体、治疗剂或免疫调节剂组合的人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体或其片段。抗相同或不同表位或抗原的裸抗体或缀合抗体也可以与本发明的一种或多种PAM4抗体或其片段组合。
因此，本发明考虑给予作为裸抗体或抗体片段、单独的PAM4抗体及其片段(包括PAM4融合蛋白及其片段)，或者作为多模式疗法给予。所述抗体最好是人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体或其片段。本发明的多模式疗法还包括补充给予其它抗体的裸PAM4抗体的免疫疗法，所述其它抗体为裸抗体、融合蛋白的形式或者作为免疫缀合物。例如，一种人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体可以与另一种裸人源化PAM4或其它抗体、或者与同位素、一种或多种化疗药、细胞因子、毒素或其组合缀合的人源化PAM4或其它抗体组合。例如，本发明考虑在用其它的胰腺肿瘤相关抗体治疗之前、同时或之后用裸PAM4抗体或缀合PAM4抗体或其片段治疗，所述胰腺肿瘤相关抗体例如CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、la3、aLea抗体及其它的路易斯抗原(例如Le(y))的抗体以及抗以下的抗体：癌胚抗原(CEA)、结肠-特异性抗原-p(CSAp)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、HER2/neu、EGFR、血管生成因子(例如VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子和IL-6以及癌基因产物和抗肿瘤坏死因子的抗体。这些实体瘤抗体尤其可以是裸或缀合的药物、毒素、同位素、外部辐射或免疫调节剂。本发明中也可以使用人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体和毒素的融合蛋白。许多不同的抗体组合与治疗剂或免疫调节剂一起可以构建成裸抗体或者构建成部分裸和部分缀合的抗体。或者，不同的裸抗体可用于与其它治疗剂例如细胞毒性药物或辐射连续、同时或序贯联合用药。
本文中描述的与诊断剂或治疗剂连接的单特异性抗体直接靶向PAM4阳性肿瘤。所述单特异性分子选择性结合靶向抗原，并且由于分子上的结合位点数目增加，对靶细胞的亲和性也增加，因此在所需部位观察到较长的保留时间。此外，没有结合抗原的分子被机体快速清除，从而使正常组织的暴露减至最小。多特异性抗体的应用是在AES系统中，其中PAM4预先靶向阳性肿瘤，随后特异性传递诊断剂或治疗剂。所述试剂由含组胺琥珀酰甘氨酰(HSG)的肽携带。命名为679(IgG1，K)的鼠单克隆抗体以高亲和力与含有三肽部分HSG的分子结合(Morel等，Molecular Immunology，27，995-1000，1990)。679MAb可以与HSG和靶抗原结合的hPAM4形成双特异性抗体。也可以使用替代的半抗原。这些抗体与靶向抗原选择性结合，使得可以增加亲和性并且在所需部位的保留时间更长。此外，未结合抗原的双功能抗体被机体快速清除，从而使正常组织的暴露减至最小。PAM4抗体及其片段和缀合物可以用来诊断和治疗哺乳动物疾病例如癌症。
按照本发明将诊断剂或治疗剂传递到靶供诊断或治疗用包括提供带有诊断剂或治疗剂的PAM4抗体或其片段，并且将所述抗体给予有需要的患者。诊断还需要用已知技术检测结合蛋白的步骤。
在本申请的上下文中，术语“诊断”或“检测”可互换使用。鉴于诊断通常是指确定组织的具体组织学状态，因此检测可鉴别含有特定抗原的组织、损害或生物体并对其进行定位。
将本发明含有诊断剂或治疗剂的抗体及其片段给予哺乳动物可以通过以下给药途径来实现：静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、经局部导管输注或直接损害内注射。当采用注射给予所述抗体时，给药可以是通过连续输注或者通过单次或多次快速浓注。
带有所述诊断剂或治疗剂的抗体可以作为供人或哺乳动物治疗和诊断用的试剂盒提供，所述试剂盒包含药学上可接受的注射用溶媒、最好是生理pH和浓度下的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。所述制剂最好是无菌的，特别是将其计划供人用时。所述试剂盒的任选组分包括稳定剂、缓冲剂、标记试剂、放射性同位素、顺磁化合物、用于提高清除率的第二抗体和常规注射器、柱、小瓶等。
裸抗体疗法
可以将治疗有效量的裸人源化PAM4抗体和全人PAM4抗体或其片段或PAM4融合蛋白或其片段配制在药学上可接受的赋形剂中。裸人源化PAM4抗体和全人PAM4抗体及其片段的功效也可通过以下方法增强：给这些裸抗体补充一种或多种其它的裸抗体、人源化PAM4抗体和全人PAM4抗体的一种或多种免疫缀合物、缀合一种或多种治疗剂(包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、寡核苷酸、激素类拮抗剂、酶、酶抑制剂、治疗性放射性核素、血管生成抑制剂等)，按处方上的给药方案与PAM4抗体或其片段同时或序贯用药。可以补充裸PAM4抗体及其片段的裸抗体可以针对同一肿瘤类型或者针对可以被募集以增强所选裸抗体的抗肿瘤效应的免疫调节细胞(例如CD40+细胞)。
PAM4免疫缀合物
本发明也考虑与至少一种治疗剂和/或诊断剂/检测剂缀合的人源化PAM4抗体和人PAM4抗体及其片段在治疗或诊断中的用途。对于免疫疗法，目的是将细胞毒性剂量的放射性、毒素或药物传递到靶细胞，同时使非靶组织的暴露减至最小。本发明的PAM4抗体可用来诊断和治疗胰腺肿瘤。
可以将本发明的任何抗体、抗体融合蛋白及其片段与一种或多种治疗剂或诊断剂/检测剂缀合。一般而言，一种治疗剂或诊断剂/检测剂与每种抗体、融合蛋白或其片段连接，但不止一种治疗剂和/或诊断剂/检测剂可以与同一抗体或抗体片段连接。如果Fc区不存在(例如当用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段时)，有可能将糖部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见例如Leung等，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等，美国专利第5,443,953号(1995)，Leung等，美国专利第6,254,868号，所有所述文献通过引用全部结合到本文中。工程糖部分可以用来连接治疗剂或诊断剂/检测剂。
肽与抗体组分通过抗体糖部分缀合的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Shih等，Int.J.Cancer 41：832(1988)；Shih等，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；和Shih等，美国专利第5,057,313号，所有所述文献通过引用全部结合到本文中。通用方法包括使具有氧化糖部分的抗体组分与具有至少一个游离氨基官能并且加载许多肽的载体聚合物反应。该反应产生初始席夫碱(亚胺)键，该键可以由于还原成仲胺形成最终的缀合物而稳定。
本发明的抗体融合蛋白及其片段包含两种或更多种抗体或其片段，并且每种组成该融合蛋白的抗体都可以含有至少一种治疗剂和/或诊断剂/检测剂。例如，抗体融合蛋白可以包含一种抗体(两个抗原结合部位)和一个抗体片段、两个抗体片段或者两种抗体。所述抗体融合蛋白则可以与至少一种诊断剂/检测剂和/或治疗剂缀合。
因此，所述抗体融合蛋白的一种或多种抗体或其片段可以具有不止一种所连接的治疗剂和/或诊断剂/检测剂。此外，所述治疗剂并不需要是相同的，而可以是不同的治疗剂，例如，可以将药物和放射性同位素与同一融合蛋白连接。具体地说，IgG可以是用131I放射性标记并且与药物连接。131I可以掺入到IgG的酪氨酸中，所述药物连接到IgG赖氨酸的ε氨基上。治疗剂和诊断剂/检测剂也可以连接到还原的SH基团上和连接到糖侧链上。
各种各样的诊断剂和治疗剂可以同时或序贯给药，或者最好与本发明的抗体缀合，所述诊断剂和治疗剂例如药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、激素、激素类拮抗剂、酶、酶抑制剂、治疗性放射性核素、血管生成抑制剂等。此处列举的治疗剂是那些也可用于与如上所述的裸抗体独立给药的药物。治疗剂包括例如化疗药，例如长春花生物碱、蒽环霉素、吉西他滨、表鬼臼毒素、紫杉烷类、抗代谢药、烷化剂、抗生素、SN-38、COX-2抑制剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药和细胞凋亡剂、特别是多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜树碱(camptothecans)和其它来自这些及其它类别的抗癌药的药物等等。供同时或序贯给药用或供免疫缀合物和抗体融合蛋白制备用的其它有用的癌症化疗药包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等等。合适的化疗药描述于REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)和GOODMAN AND GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)以及这些出版物的修订版本。其它合适的化疗药例如实验用药物是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，本发明的人源化PAM4抗体及其片段与吉西他滨缀合。在另一个实施方案中，在给予本发明的裸人源化PAM4抗体或缀合人源化PAM4抗体或其片段之前、之后或同时给予吉西他滨。优选所述缀合的人源化PAM4抗体或抗体片段与放射性核素缀合。
毒素可以来源于动物、植物或微生物。毒素例如假单胞菌外毒素也可与本发明的PAM4和hPAM4抗体的免疫缀合物的治疗剂部分复合，或者形成本发明的PAM4和hPAM4抗体的免疫缀合物的治疗剂部分。其它适用于所述缀合物或其它融合蛋白制备的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如Pastan等，Cell 47：641(1986)和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians 44：43(1994)。适用于本发明的其它毒素是本领域技术人员已知的，公开于美国专利6,077,499中，所述专利通过引用全部结合到本文中。
免疫调节剂例如细胞因子也可以与PAM4和hPAM4免疫缀合物的治疗剂部分缀合，或者形成PAM4和hPAM4免疫缀合物的治疗剂部分，或者可以与本发明的人源化或人PAM4抗体或其片段或PAM4融合蛋白或其片段一起给予，但不与本发明的人源化或人PAM4抗体或其片段或PAM4融合蛋白或其片段缀合。所述PAM4融合蛋白或其片段可以包含与不同抗原结合的一种或多种抗体或其片段。例如，所述融合蛋白可以结合PAM4抗原以及免疫调节细胞或因子。或者，患者可以接受裸PAM4抗体、融合蛋白或其片段，独立给予细胞因子，可以在给予所述裸PAM4抗体之前、同时或之后给予细胞因子。本文所用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)和造血因子例如白介素(例如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12和IL-18、IL-21)、集落刺激因子(例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)、命名为“S1因子”的干细胞生长因子、红细胞生成素和血小板生成素。合适免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α等等。
或者，本发明的抗体和片段可以通过将抗体与酶连接而被可检测标记。当抗体-酶缀合物在合适底物存在下温育时，酶部分与底物反应，产生可被检测的化学部分，例如通过分光光度计、荧光计或目测法。可用于可检测标记抗体的酶的实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
治疗剂或诊断剂/检测剂可以通过二硫键形成连接在还原抗体组分的绞链区。作为一个可供选择的方法，可以使用异双官能交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，将所述试剂与抗体组分连接。Yu等，Int.J.Cancer 56：244(1994)。所述缀合的通用技术是本领域众所周知的。参见例如Wong，CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等，″Modification of Antibody by Chemical Methods，″载于：MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(编著)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″载于：MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编著)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。或者，所述治疗剂或诊断剂/检测剂可以通过抗体Fc区中的糖部分缀合。所述糖基团可用于增加与巯基结合的同一试剂的载药量，或者所述糖部分可以用于结合不同的肽。
在本发明的方法中，所述靶向构建体可以包含一种或多种可用于检测患病组织的放射性同位素。特别有用的诊断用放射性核素包括但不限于110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ发射体、β发射体或正电子发射体，其衰变能量优选在20-4,000keV的范围之内，更优选在25-4,000keV的范围之内，甚至更优选在25-1,000keV的范围之内，再更优选在70-700keV的范围之内。有用正电子发射放射性核素的总衰变能量优选＜2,000keV，更优选＜1,000keV，最优选＜700keV。可用作利用γ射线检测的诊断剂/检测剂的放射性核素包括但不限于51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、111In、114mIn、123I、125I、131I、169Yb、197Hg和201Tl。有用的γ射线发射放射性核素的衰变能量优选为20-2000keV，更优选为60-600keV，最优选100-300keV。
在本发明的方法中，靶向构建体可以包含一种或多种可用于治疗患病组织的放射性同位素。特别有用的治疗性放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。所述治疗性放射性核素的衰变能量对于俄歇发射体，在20-6,000keV的范围之内，优选在60-200keV的范围之内；对于β发射体，在100-2,500keV的范围之内；对于α发射体，在4,000-6,000keV的范围之内。有效的β粒子发射核素的最大衰变能量优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，最优选为500-2,500keV。还优选基本上为俄歇发射粒子衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有效β粒子发射核素的衰变能量优选＜1,000keV，更优选＜100keV，最优选＜70keV。还优选基本上为产生α粒子衰变的放射性核素。这样的放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有效α粒子发射放射性核素的衰变能量优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，最优选为4,000-7,000keV。
例如，67Cu，由于其61.5小时半衰期和大量供给β粒子和γ射线而被认为是更有希望的供放射免疫疗法用的放射性同位素，可以使用螯合剂对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA)与PAM4抗体缀合。Chase，参见上文。或者，使用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，可以使发射高能β粒子的90Y与PAM4抗体、融合蛋白或其片段偶联。
其它潜在的放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等等。
在另一个实施方案中，放射性致敏剂可以与本发明的裸PAM4抗体或缀合PAM4抗体或抗体片段联用。例如，所述放射性致敏剂可以与放射性标记PAM4抗体或抗体片段联用。与单独用放射性标记抗体或抗体片段治疗相比，加入放射性致敏剂可以产生增强的效力。放射性致敏剂描述于D.M.Goldenberg(编著)，CANCERTHERAPY WITH RADIOLABILED ANTIBODIES，CRC Press(1995)，所述文献通过引用全部结合到本文中。
通常将会按相似的方式实现具有加载附加硼的载体、供热中子激活疗法用的本发明PAM4抗体或其片段或PAM4融合蛋白或其片段。然而，最好是等到非靶向PAM4免疫缀合物清除，然后进行中子照射。可以使用结合PAM4抗体的抗体，加速清除。有关该一般原理的描述，参见美国专利第4,624,846号。例如，碳硼烷等硼附加物可以与PAM4抗体连接。用侧接支链上的羧基官能可以制备碳硼烷，这是本领域众所周知的。可以通过激活碳硼烷的羧基并与载体上的氨基缩合，完成碳硼烷与载体例如氨基葡聚糖的连接。然后中间缀合物与PAM4抗体缀合。给予PAM4抗体缀合物后，硼附加物被热中子照射所激活，转变成放射性原子，放射性原子通过α发射衰变，产生高毒性短程效应。
此外，本发明包括诊断患者的癌症的方法。通过给予与药学上适合的赋形剂一起配制的诊断有效量的诊断用缀合物，然后检测所述标记，可以完成诊断。所述PAM4抗体、融合蛋白及其片段可以与诊断剂/检测剂缀合，或者在给予所述诊断剂/检测剂之前、同时或之后，给予未与诊断剂/检测剂缀合的所述PAM4抗体、融合蛋白及其片段。上文已经论述了可以用作诊断剂/检测剂的放射性物质。合适的非放射性诊断剂/检测剂是适用于磁共振成像、X射线成像、计算机断层成像或超声成像的造影剂。当与本发明抗体一起使用时，磁成像剂包括例如非放射性金属例如锰、铁和钆、与金属-螯合物组合的络合物，包括2-苄基-DTPA及其一甲基类似物和环己基类似物。参见于2001年10月10日申请的美国顺序号09/921,290，所述文献通过引用全部结合到本文中。
本发明考虑的造影剂例如MRI造影剂包括例如钆离子、镧离子、镝离子、铁离子、锰离子或其它的对比标记、CT造影剂和超声造影剂均适用于本发明。
适合本发明的顺磁离子包括铬(III)、锰(III)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，其中特别优选钆。
可用于其它方面例如X射线成像的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)、尤其是铋(III)。荧光标记包括罗丹明、荧光素和肾造影剂。罗丹明和荧光素常常通过异硫氰酸酯中间体连接。
金属也可用于诊断剂/检测剂，包括那些供磁共振成像技术用的金属。这些金属包括但不限于钆、锰、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬和钕。为了给抗体组分加载放射性金属或顺磁离子，有必要使其与具有连接多个螫合基团以结合离子的长尾的试剂反应。这样的尾可以是具有可以结合螫合基团的侧基的聚合物，例如多聚赖氨酸、多糖或其它的衍生化链或可衍生链等，所述螫合基团例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的基团。采用标准化学方法，使螯合物与PAM4抗体、融合蛋白或其片段偶联。螯合物通常通过能与免疫反应性最小损失和最小聚集和/或内部交联的分子形成化学键的基团与抗体连接。螯合物与抗体缀合的其它更与众不同的方法和试剂公开于1989年4月25日授予Hawthorne的美国专利4,824,659，题目为“抗体缀合物”，所述专利文献的公开内容通过引用全部结合到本文中。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其一甲基类似物和环己基类似物，供与总能量范围为20-2,000keV的诊断用同位素联用。相同的螯合物当与非放射性金属例如锰、铁和钆络合时，当与本发明抗体联用时可用于MRI。大环螯合物例如NOTA、DOTA和TETA供与各种各样的金属和放射性金属联用，最特别是分别与镓、钇和铜的放射性核素联用。这样的金属-螯合物络合物可以根据目标金属的环大小定制，因而是非常稳定的。本发明包括其它的环型螯合物例如大环聚醚，它们对于用于RAIT的稳定结合核素例如223Ra有价值。
不透射线材料和造影剂材料可用来增强X射线和计算机断层成像，并且包括碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。特殊的化合物包括钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。
本发明的抗体、融合蛋白及其片段也可被荧光化合物标记。存在的荧光-标记MAb可以通过使抗体暴露于适当波长的光下，然后检测所产生的荧光来确定。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。荧光标记的抗体对于流式细胞仪分析特别有用。
或者，本发明的抗体、融合蛋白及其片段可以通过使抗体与化学发光化合物偶联被可检测标记。存在的化学发光标记的MAb通过检测在化学反应过程中所产生的发光的存在来确定。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样，生物发光化合物可用于标记本发明的抗体及其片段。生物发光是一种在生物系统中存在的化学发光，其中催化性蛋白质增加化学发光反应的效率。存在的生物发光蛋白可以通过检测存在的发光来确定。可用于标记的生物发光化合物包括萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
因此，描述一种诊断患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括用包含裸PAM4单克隆抗体或其片段或裸抗体融合蛋白或其片段的组合物对来自所述患者的标本(流体、组织或细胞)进行体外诊断分析。免疫组织化学可用来检测细胞或组织中存在的PAM4。优选进行诊断的恶性肿瘤是癌症。最优选所述癌症是胰腺癌。
另外，可以使螯合剂例如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或合适肽与可检测标记例如荧光分子或细胞毒性剂例如重金属或放射性核素缀合。例如，通过使光敏剂或染料与抗体融合蛋白缀合，可以获得治疗上有用的免疫缀合物。荧光组合物例如荧光染料及其它对可见光敏感的色原或染料例如卟啉已经用来检测并且通过将合适的光直接导向损害部位而治疗所述损害。在治疗中，这被称之为光辐射、光线疗法或光动力疗法(Jori等(编著)，PHOTODYNAMICTHERAPY OF ATUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto1985)；van den Bergh，Chem.Britain 22：430(1986))。此外，使单克隆抗体与光活化染料偶联，实现光线疗法。Mew等，J.Immunol.130：1473(1983)；同上，Cancer Res.45：4380(1985)；Oseroff等，Proc.Natl.AcadSci.USA 83：8744(1986)；同上，Photochem Photobiol.46：83(1987)；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.288：471(1989)；Tatsuta等，Lasers Surg.Med.9：422(1989)；Pelegrin等，Cancer 67：2529(1991)。然而，这些早期研究并没有包括内窥镜检查治疗的应用，尤其是抗体片段或亚片段的应用。因此，本发明考虑包含光敏剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。
对于治疗目的，将本发明的PAM4抗体及其片段以治疗有效量给予患者。如果给予的量在生理学上是显著性的，则认为抗体是以“治疗有效量”给予的。如果某一物质的存在导致接受的患者的生理机能发生可检测变化，则该物质在生理学上有显著性。
诊断剂/检测剂是可以给予的、与抗体部分即抗体或抗体片段或亚片段、融合蛋白及其片段缀合的并可用于通过对含有疾病相关抗原的细胞进行定位来诊断/检测疾病的分子或原子。有效的诊断剂/检测剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如生物素-链霉抗生物素蛋白复合物)、不透射线物质(例如碘、钡、镓和铊化合物等)、造影剂、荧光化合物或分子和磁共振成像(MRI)用增强剂(例如顺磁离子)。美国专利第6,331,175号描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备方法，所述专利通过引用全部结合到本文中。优选所述诊断剂/检测剂选自供核成像、内窥镜检查和血管内检查用的放射性同位素、供磁共振成像或超声成像用的增强剂、供X射线和计算机断层成像的不透射线物质和造影剂以及供萤光镜检查(包括内窥镜检查的萤光镜检查)用的荧光化合物。与抗体缀合的或用于双特异性预先靶向方法的荧光剂和放射性物质对于内窥镜检查、手术中检查或血管内检查与患病组织或细胞簇例如恶性肿瘤相关的靶向抗原特别有用，特别是γ发射体、β发射体和正电子发射体，参见以下公开的文献：Goldenberg的美国专利号第5,716,595、第6,096,289号和美国申请顺序号09/348,818，所述专利通过引用全部结合到本文中。内窥镜检查应用当存在允许内窥镜检查的结构例如结肠时可以使用。可用于正电子发射型断层成像的放射性核素包括但不限于F-18、Mn-51、Mn-52m、Fe-52、Co-55、Cu-62、Cu-64、Ga-68、As-72、Br-75、Br-76、Rb-82m、Sr-83、Y-86、Zr-89、Tc-94m、In-110、I-120和I-124。有用的正电子发射放射性核素的总衰变能量优选＜2,000keV，更优选＜1,000keV，最优选＜700keV。可用作诊断剂/检测剂并利用γ射线检测的放射性核素包括但不限于Cr-51、Co-S7、Co-S8、Fe-59、Cu-67、Ga-67、Se-75、Ru-97、Tc-99m、In-111、In-114m、I-123、I-125、I-131、Yb-169、Hg-197和Tl-201。有用的γ射线发射放射性核素的衰变能量优选为20-2000keV，更优选为60-600keV，最优选为100-300KeV。
体外诊断
本发明考虑包括PAM4融合蛋白及其片段在内的PAM4抗体在体外筛选生物样品中存在的PAM4抗原中的用途。如下所述，在这样的免疫测定中，所述PAM4抗体、融合蛋白或其片段可用于液相或结合到固相载体上。在一个优选的实施方案中，所述PAM4抗体或其片段是人源化的。还优选所述PAM4抗体或其片段是全人的。更优选所述PAM4融合蛋白包含人源化PAM4抗体或全人PAM4抗体。
用于测定生物样品是否含有PAM4抗原的筛选方法的一个实例是放射免疫测定(RIA)。例如，在一种形式的RIA中，将待测物质在放射性标记PAM4抗原存在下与PAM4抗原MAb混合。在该方法中，试验物质的浓度与结合所述MAb的标记PAM4抗原的量成反比，而与游离的标记PAM4抗原成正比。其它的合适的筛选方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
或者，进行体外测定，在该测定中，使PAM4抗体、融合蛋白或其片段与固相载体结合。例如，MAb可以与聚合物例如氨基葡聚糖连接，以便使所述MAb与不溶性支持物例如包埋聚合物的珠、板或管连接。
其它的合适的体外测定对于本领域技术人员而言是显而易见的。可检测标记PAM4抗体和PAM4抗原的具体浓度、温育的温度和时间以及其它测定条件可以根据包括样品中的PAM4抗原浓度、样品性质等在内的诸多因素而变化。PAM4抗体样品的结合活性可以按照众所周知的方法来测定。本领域技术人员将能够使用常规实验确定每一测定的操作和最佳测定条件。
其它诸如洗涤、搅拌、摇动、过滤等的步骤可以添加到测定中，这是具体情况下常规或必需的。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)，可以测定生物样品中存在的PAM4抗原。在直接竞争性ELISA中，使纯或半纯的抗原制剂与对于在待测流体或细胞提取物中不溶的固相支持物结合，然后加入一定量的可检测标记的可溶性抗体，使得可以对固相抗原和标记抗体二者间形成的二元复合物进行检测和/或定量。
相比之下，“双决定簇(double-determinant)”ELISA，也称之为“双位点(two-site)”ELISA或“夹层测定(sandwich assay)”，需要少量的抗原，并且该项测定并不需要非常纯的抗原。因此，对于检测临床样品中的抗原，双决定簇ELISA优于直接竞争性ELISA。参见例如双决定簇ELISA在定量测定活检标本中的c-myc致癌蛋白中的应用。Field等，Oncogene 4：1463(1989)；Spandidos等，AntiCancer Res.9：821(1989)。
在双决定簇ELISA中，使一定量的未标记MAb或抗体片段(“捕获抗体”)与固相支持物结合，导致试验样品与捕获抗体接触，加入一定量的可检测标记的可溶性抗体(或抗体片段)，使得可以对捕获抗体、抗原和标记抗体三者间形成的三元复合物进行检测和/或定量。抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等等。在本发明中，抗体片段是结合PAM4抗原的表位的PAM4单克隆抗体的一部分。术语“抗体片段”也包括任何通过结合特定抗原形成复合物同抗体一样起作用的合成蛋白或基因工程蛋白。例如，抗体片段包括由轻链可变区组成的分离的片段、由重链可变区和轻链可变区组成的“Fv”片段和其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子。抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中具有相同或不同特异性的相同或不同的单链抗体或抗体片段的区段中的两个或更多个连接在一起。所述融合蛋白可以包含一种抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合、或同一抗体组分的多拷贝。所述融合蛋白可以另外包含与诊断剂/检测剂和/或治疗剂缀合的抗体或抗体片段。术语PAM4抗体包括人源化抗体、人抗体和鼠抗体、其抗体片段、免疫缀合物及其片段和抗体融合蛋白及其片段。
进行双决定簇ELISA的方法是众所周知的。参见例如Field等，参见上文；Spandidos等，参见上文；和Moore等，″Twin-Site ELISAs forfos and myc oncoprotiens Using the AMPAK System，″载于：METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第273-281页(The HumanaPress，Inc.1992)。
在双决定簇ELISA中，可溶性抗体或抗体片段必须结合不同于捕获抗体所识别的表位的PAM4表位。可以进行双决定簇ELISA，以确定活检样品中是否存在PAM4抗原。或者，可以进行所述测定，以定量测定临床体液样品中是否存在可检测量的PAM4抗原。可以进行定量测定，并且包括对纯化的PAM4抗原进行稀释。
本发明的PAM4 MAb、融合蛋白及其片段也适合制备成测定试剂盒。这样的试剂盒可以包括载体工具，即间隔化以在密闭区室中容纳一个或多个容器装置，例如小瓶、管等，每个所述容器装置包括免疫测定的独立元件。
例如，可以有一个装有固定在固相支持物上的捕获抗体的容器装置，以及另一个装有可检测标记抗体的溶液的容器装置。其它的容器装置可以装有包含连续稀释的PAM4抗原的标准溶液。可以用PAM4抗原的标准溶液产生用横坐标为PAM4抗原浓度对纵坐标为检测信号所作出的标准曲线。根据此图可以内推出从含有PAM4抗原的样品所获得的结果，从而得出生物样品中的PAM4抗原浓度。
本发明的PAM4抗体、融合蛋白及其片段也可以用来检测从组织学标本制备的组织切片中存在的PAM4抗原。这样的原位检测可以用来确定所测组织中存在的PAM4抗原以及确定PAM4抗原的分布。通过将可检测标记的PAM4抗体用于冷冻组织切片中，可以完成原位检测。研究表明，PAM4抗原保存在石蜡包埋的切片中。原位检测的通用技术是本领域普通技术人员熟知的。参见例如Ponder，″Cell Marking Techniques and Their Application，″载于：MAMMALIANDEVELOPMENT：A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk(编著)(IRL Press 1987)和Coligan，第5.8.1-5.8.8页。
PAM4抗体、融合蛋白及其片段可以用任何合适的标记部分进行可检测标记，所述标记部分例如放射性同位素、酶、荧光标记、染料、色原、化学发光标记、生物发光标记或顺磁标记。所述可检测标记的PAM4抗体的制备方法和检测方法是本领域普通技术人员熟知的，并且在下文有更详细的描述。
所述标记部分可以是通过应用诸如γ计数器或闪烁计数器或放射自显影等方法检测的放射性同位素。在一个优选的实施方案中，所述诊断用缀合物是γ发射同位素、β发射同位素或正电子发射同位素。本发明说明书中的标记部分是指在预定条件下将会产生信号的分子。标记部分的实例包括放射性同位素、酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和顺磁标记。本文所用的诊断剂或治疗剂是与抗体部分缀合产生可用于诊断和治疗的缀合物的分子或原子。诊断剂或治疗剂的实例包括药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、细胞因子、激素、激素类拮抗剂、酶、酶抑制剂、同位素，其它的抗体、螯合剂、染料、色原、硼化合物和标记部分。
在一个实施方案中，U.S.5,734,033(Reed)描述了抑制bcl-2表达的反义分子等寡核苷酸，所述专利通过引用全部结合到本文中，所述寡核苷酸可以与本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分缀合，或者形成本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白的治疗剂部分。或者，所述寡核苷酸可以与本发明的裸PAM4抗体或缀合PAM4抗体或抗体片段同时或序贯给药。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸是反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸最好针对B细胞恶性肿瘤的癌基因或癌基因产物，例如bcl-2。
本领域技术人员将会知道其它可以按照本发明使用的合适标记。采用本领域已知的标准技术，可以完成标记部分与PAM4抗体的结合。该方面的常用方法描述于Kennedy等，Clin.Chim.Acta 70：1(1976)；Schurs等，Clin.Chim.Acta 81：1(1977)；Shih等，Int′l J.Cancer46：1101(1990)。
上述体外和原位检测方法在病理病症的诊断或分期中可以作为辅助方法。例如，这样的方法可以用于检测表达PAM4抗原的肿瘤例如胰腺癌。
体内诊断
本发明考虑了PAM4抗体在体内诊断中的应用。用放射性标记MAb诊断的造影方法是众所周知的。例如，在免疫闪烁照相技术中，抗体被γ发射放射性同位素标记，然后将其引入患者体内。用γ照相机来检测γ发射放射性同位素的位置和分布。参见例如Srivastava(编著)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGINGAND THERAPY(Plenum Press 1988)，Chase，″Medical Applications ofRadioisotopes，″载于：REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版，Gennaro等(编著)，第624-652页(Mack PublishingCo.，1990)和Brown，″Clinical Use of Monoclonal Antibodies，″载于：BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49，Pezzuto等(编著)(Chapman & Hall 1993)。
对于诊断性造影，放射性同位素可以直接与PAM4抗体结合或者通过中间官能团与PAM4抗体间接结合。有用的中间官能团包括螯合剂，例如乙二胺四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸。例如参见Shih等，参见上文；美国专利第5,057,313号。
通过选择机体内的最小半衰期、最小残留的最佳组合的同位素以及允许检测并准确测定的最低剂量的同位素，使传递到患者的辐射剂量保持在尽可能低的水平。可以结合PAM4抗体并且适用诊断性造影的放射性同位素的实例包括99mTc和111In。
对于体内诊断目的，所述PAM4抗体、融合蛋白及其片段也可以用顺磁离子以及各种各样的放射性造影剂标记。磁共振成像的特别有用造影剂包括钆、锰、镝、镧或铁离子。另外的造影剂包括铬、铜、钴、镍、铼、铕、铽、钬或钕。PAM4抗体及其片段也可以与超声造影剂/增强剂缀合。例如，超声造影剂是包含人源化PAM4 IgG或其片段的脂质体。还优选所述超声造影剂是充气的脂质体。
在一个优选的实施方案中，双特异性抗体可以与造影剂缀合。例如，所述双特异性抗体可以包含不止一种供超声成像用的影像增强剂。在一个优选的实施方案中，所述造影剂是脂质体。优选所述脂质体包含与脂质体外表面共价连接的二价DTPA-肽。更优选所述脂质体是充气的。
药学上适合的赋形剂
在治疗应用中，可以用另外的制药方法来控制PAM4抗体的起效持续时间。通过应用复合或吸附PAM4抗体、融合蛋白及其片段的聚合物，可以制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括乙烯/乙酸乙烯酯共聚物骨架和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物骨架。Sherwood等，Bio/Technology 10：1446(1992)。从所述骨架中释放PAM4抗体、融合蛋白及其片段的速率取决于PAM4抗体、融合蛋白及其片段的分子量、骨架中的PAM4抗体含量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.J 55：163(1989)；Sherwood等，参见上文。其它固体剂型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEM，第5版(Lea & Febiger 1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版本。
准备给予患者的所述人源化PAM4抗体和人PAM4抗体及其片段可以由单独的抗体、免疫缀合物、融合蛋白或其片段组成，或者可以包含一种或多种药学上适合的赋形剂、一种或多种额外成分或它们的某种组合。
本发明的免疫缀合物、裸抗体及其片段可以按照制备有效药用组合物的已知方法进行配制，其中将所述免疫缀合物或裸抗体在含有药学上适合的赋形剂的混合物中进行混合。无菌的磷酸缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它的合适的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEM，第5版(Lea & Febiger1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版本。
可以将本发明的免疫缀合物或裸抗体配制成供通过例如快速浓注或连续输注的静脉内给药用。注射用制剂可以为单位剂型，例如安瓿和多剂量容器并且添加防腐剂。所述组合物可以采取油性或水性溶媒的混悬剂、溶液制剂或乳剂的形式，并且可以含有配方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可以为临用前用合适溶媒例如无菌无热原水重建的粉针剂。
所述免疫缀合物、裸抗体及其片段也可以通过皮下途径或者甚至通过胃肠外途径给予哺乳动物。在一个优选的实施方案中，以每剂20-2000毫克蛋白的剂量给予所述PAM4抗体或其片段。此外，所述给药可以通过连续输注或通过单次或多次快速浓注。一般而言，所给予的免疫缀合物、融合蛋白或裸抗体的人用剂量将会根据诸如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学病症或先前的用药史等因素而变化。通常，最好为接受者提供在约1mg/kg-20mg/kg范围内的、作为一次静脉内输注的免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体的剂量，虽然也可以按需给予更低或更高的剂量。该剂量可以按需重复给予，例如，每周一次，给予4-10周，优选每周一次，给予8周，更优选每周一次，给予4周。也可以以更少的频率，例如每隔一周一次，给予数月。所述剂量可以通过各种胃肠外途径给予，并且可以适当调节剂量和方案。
本发明的PAM4抗体、融合蛋白及其片段可以按照制备有效药用组合物的已知方法进行配制，其中将所述PAM4抗体、融合蛋白及其片段在含有药学上适合的载体的混合物中进行混合。组合物如果给药可以被接受者患者耐受，则认为它是“药学上可接受的载体”。无菌磷酸缓冲盐溶液是药学上可接受的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见例如REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(1990)。
对于治疗目的，将所述免疫缀合物或裸抗体以治疗有效量给予哺乳动物。本发明的合适患者通常是人，虽然也考虑非人类动物患者。抗体制剂如果给予的量在生理学上是显著性的，则认为所述抗体制剂是以“治疗有效量”给予的。如果某一物质的存在导致接受的哺乳动物的生理机能发生可检测变化，则该物质在生理学上有显著性。
实施例
下面的实施例是为了说明本发明的实施方案，决不是用来以任何方式限制本发明的范围。
下面的实施例讨论了用PAM4 MAb和CaPan1人胰腺癌进行的实验研究。CaPan1人胰腺癌在皮下部位和同位中作为异种移植物。所述MAb和药物可以导致存活时间显著改进。表明高浓度的PAM4单克隆抗体靶向人肿瘤异种移植模型，靶向患者体内原始部位的大多数胰腺肿瘤。用体外免疫测定定量测定患者血液中的PAM4反应性抗原，似乎在其鉴别胰腺癌和胰腺炎以及其它的疾病和正常组织的能力方面是有希望的。
用PAM4 MAb进行的临床研究已表明，靶向患者体内的大多数损害，没有证据表明正常组织的摄取。剂量测定法表明，可以将10-20cGy/mCi传递到肿瘤，其中肿瘤与红骨髓剂量之比为3∶1至10∶1。这些数据提示，PAM4可用于开发用于治疗胰腺癌的I期试验。
实施例1-免疫组织化学染色研究
对正常成体组织的免疫组织化学显示，PAM4反应性表位局限于胃肠道，在此染色弱，但仍定义为阳性(表1)。包括胰腺管、胰腺小管、胰腺腺泡和胰岛细胞在内的正常胰腺组织染色呈阴性。用组织匀浆物作为抗体，基于PAM4的酶免疫测定总的来讲支持该免疫组织学数据(表2)。PAM4表位在正常胰腺及其它非胃肠组织中不存在。在非瘤性组织中，PAM4与25个胰腺癌中的21个(85％)有反应性(表3)。似乎PAM4反应性与肿瘤分化阶段相关。例如，21个孔中有20个孔和中等分化的胰腺肿瘤呈阳性，而4个分化差的肿瘤中仅有1个呈阳性。一般而言，分化差的肿瘤占所有胰腺癌的10％以下。
这些研究表明，PAM4反应性和组织分布(正常和癌症)与所报道的CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3和路易斯抗原的不同。结合用这些MAb中的某些进行的交叉阻断研究，所得数据提示，PAM4 MAb识别一个独特的新表位。当与CA19.9、DUPAN2和aLea进行比较时，似乎PAM4在其组织分布上更加受到限制，并且它与较高百分比的胰腺肿瘤有反应性。此外，等量浓度下，得到总体反应强度更高，并且与较高百分比的肿瘤内的细胞有反应性。最后，发现PAM4仅与12个慢性胰腺炎标本中的3个有弱反应性，而CA19.9和DUPAN2与所有12个标本有强反应性。虽然认识到特异性依赖于所用的测定类型和所检查组织的范围和数目，但是PAM4有鉴别正常胰腺组织和瘤性胰腺组织的能力、其能与大百分比的癌症标本有反应性以及高反应强度，对于继续从事临床应用的开发研究是重要的理论基础。
表1-MAb PAM4对正常成体组织的免疫过氧化物酶染色
    组织  染色
 反应
    胰腺(22)a
    胰腺管  -
    胰腺腺泡  -
    胰岛  -
    颌下腺(2)  -
    食管(2)  -
    胃(3)  +粘液分泌细胞
    十二指肠(3)  +杯形细胞
    空肠(3)  +杯形细胞
    回肠(3)  +杯形细胞
    结肠(5)  +杯形细胞
    肝脏(3)  -
    胆囊(2)  -
    支气管(3)  -
    肺(3)  -
    心脏(3)  -
    脾脏(3)  -
    肾脏(3)  -
    膀胱(3)  -
    前列腺(2)  -
    睾丸(2)  -
    子宫(2)  -
    卵巢(2)  -
a-()所检查的个体标本数。
表2-经EIA测定单克隆抗体PAM4与正常成体组织匀浆的反应性
    组织     μg/g组织a
    胰腺     6.4
    食管     8.1
    胃     61.3
    十二指肠     44.7
    空肠     60.6
    结肠     74.5
    肝脏     0.0
    胆囊     5.6
    心脏     3.7
    脾脏     3.4
    肾脏     6.6
    膀胱     4.9
    甲状腺     3.5
    肾上腺     1.3
    输尿管     2.6
    睾丸     3.9
    CaPan1胰腺肿瘤     569
a-数值是来自两个尸检标本的平均值
表3-一些单克隆抗体与胰腺肿瘤的免疫组织化学反应性
    分化   PAM4     CA19.9   aLea     DUPAN2
    1     W   +++     -   -     +++
    2     M   ++     +++   +++     +
    3     M   +     -   +     +
    4     M   +++     +++   +++     +
    5     M   ++     +   -     -
    6     M   +     ND   ND     ND
    7     M   +++     +++   +++     +++
    8     M   +     -   -     +++
    9     M   ++     +   ++     -
    10     M   ++     ++   ++     +++
    11     M   ++     +++   +++     +
    12     M   ++     +   +     +++
    13     M   +     +++   +++     +
    14     M   ++     +   +     ++
    15     M   +++     +   +     ++
    16     M   +     +   ++     -
    17     M   -     +   +     -
    18     M   ++     ++   ++     ++
    19     M   +++     +   +++     ++
    20     M   +     -   -     -
    21     M   +++     +++   +     ++
    22     P   +     +   +     +++
    23     P   -     -   -     -
    24     P   -     -   -     -
    25     P   -     -   +     -
    总数   21/25     17/24   18/24     16/24
-：阴性；+：5-20％的组织被染色；++：21-50％的组织被染色；+++：＞50％的组织被染色；W、M、P：良好分化、中等分化或差分化；*：转移组织；ND：未进行
表4-瘤性组织与MAb PAM4的免疫过氧化物酶染色
  组织     阳性数/总数
  胰腺     21/25
  结肠     10/26
  胃     1/5
  肺     1/15
  乳腺     0/30
  卵巢     0/10
  前列腺     0/4
  肝脏     0/10
  肾脏     0/4
实施例2-放射性标记PAM4的体内生物分布和肿瘤靶向
用一系列4个不同的异种移植的人胰腺肿瘤，涵盖预期分化的范围，进行PAM4初始生物分布研究。所用的四个肿瘤系即AsPc1、BxPc3、Hs766T和CaPan1中的每个都在肿瘤内显示有131I-PAM4(第3天，浓度范围：21％-48％ ID/g)，与同时给予的非特异性同种型匹配的Ag8抗体(第3天，浓度范围：3.6％-9.3％ ID/g)相比，显著升高(p＜0.01-0.001)。用所得生物分布数据估计对肿瘤的潜在辐射剂量，对于AsPc1、BxPc3、Hs766T和CaPan1，辐射剂量分别为12,230cGy/mCi、10,684cGy/mCi、6,835cGy/mCi和15,843cGy/mCi。鉴于实际最大耐受剂量(MTD)为0.7mCi，PAM4可以为每个异种移植肿瘤模型提供相当大的拉德剂量。在每种肿瘤系中，放射性标记的PAM4的血液水平都有显著性(p＜0.01-0.001)，低于非特异性Ag8。来自PAM4的血液的潜在辐射剂量比来自Ag8的血液的潜在辐射剂量低1.4-4.4倍。当将来自PAM4的肿瘤的辐射剂量归一化至来自PAM4的血液剂量时，肿瘤接受的剂量分别为2.2、3.3、3.4；其比血液高13.1倍。重要的是，对于非肿瘤组织的潜在辐射剂量最小。
采用CaPan1肿瘤模型，将PAM4的生物分布与抗CEA抗体MN14进行比较。肿瘤内的PAM4浓度比MN14浓度高得多(早期时间点)，在第3天，肿瘤浓度与血液浓度之比对于PAM4为12.7±2.3，相比之下，对于MN14为2.7±1.9。虽然在早期时间点，肿瘤内PAM4摄取显著比MN14高(第1天-P＜0.001；第3天-P＜0.01)，剂量测定分析表明，在14天的研究期间，来自PAM4的肿瘤的剂量仅比MN14高3.2倍。这是由于PAM4从肿瘤中快速清除，致使稍后的时间点，在肿瘤内出现这两种抗体的相似浓度。在BxPc3和Hs766T中，也观察到PAM4从肿瘤中快速清除，但在AsPc1肿瘤模型中没有观察到这一现象。这些观察结果与报道的其它抗粘蛋白抗体不一致，例如与结肠直肠癌中的G9和B72.3不一致，其中每种抗体都表现出比MN14抗体长的保留时间。对PAM4代谢研究的结查表明，在与肿瘤细胞的发生结合后，快速释放出抗体，抗原：抗体复合物可能被分解或者脱落。这一点对于所述抗体在患者中的应用是非常不利的，只是例外的是血液清除也非常快速。这些数据提示，对于治疗应用，131I可能是不适合选择的同位素。可以给予的短寿同位素例如90Y或188Re通常证明是更有效的试剂。
PAM4显示没有靶向正常组织的证据，只是在CaPan1肿瘤模型中，其中观察到少量但统计学显著性的脾脏摄取(在第3天，范围3.1-7.5％ ID/g)。在抗粘蛋白抗体B72.3和CC49的临床应用中，观察到该类型的脾脏靶向。重要的是，这些研究也报道，脾脏靶向并不影响抗体的肿瘤摄取，也不干扰对核扫描的解释。这些研究提示，脾脏靶向既不是由于脾脏中的交叉反应性抗原所致，也不是通过Fc受体结合所致，而是下面的一种或多种可能性所致：直接靶向在脾脏中捕获的抗原或者间接摄取在血液中形成的或从肿瘤部位释放的抗原：抗体复合物。后者将会需要在血液中存在免疫复合物；然而，当通过凝胶过滤(HPLC，GF-250柱)放射性标记抗体作为天然物质被洗出，检查早至5分钟且迟至7天的标本时并未观察到这一现象。前者的解释似乎更有可能是鉴于CaPan1肿瘤产生大量的PAM4反应性抗原比所检查的其它肿瘤细胞系高100-1000倍的事实。在这些其它肿瘤系中PAM4缺乏脾脏靶向提示，该现象与过量的抗原产生相关。在任何情况下，可以通过将蛋白质剂量从原始的2μg剂量增至10μg剂量来克服脾脏靶向。更大量的脾脏捕获的抗原推测与未标记的PAM4复合而不与放射性标记抗体复合。在PAM4靶向肿瘤或非肿瘤组织时，增加蛋白质剂量确实没有负面效应。事实上，蛋白质剂量增加至100μg是CaPan1肿瘤内放射性标记PAM4浓度的两倍。
实施例3-无胸腺裸鼠中同位胰腺肿瘤模型的开发
为了更接近模拟胰腺癌在动物模型中的临床表现，本发明申请人通过将肿瘤细胞直接注射到胰腺头而开发出一种同位模型。同位CaPan1肿瘤进行性生长而没有明显症状，直到产生腹水，在10-14周死亡。截止到植入后3-4周，动物发生可触知的肿瘤，肿瘤重约为0.2g。在生长的8周内，观察到约1.2g的原发性肿瘤随转移瘤一起转移到肝脏和脾脏(1-3个转移瘤/动物；每个肿瘤＜0.1g)。在10-14周，产生腹水的隔膜接种是显而易见的。腹水形成和偶发性黄疸通常是肿瘤生长第一个最明显的指征。腹水是腹腔内体液的累积，而黄疸是由于血液中胆色素过多而使皮肤和眼发黄。此时，肿瘤会相当大，有1-2g重，大多数情况下动物会在3-4周后死亡。
将放射性标记131I-PAM4给予带有4周龄同位肿瘤(约0.2g)的动物，显示特异性靶向原发性肿瘤，局部化指数第1天为7.9±3.0，在第14天增加至22.8±15.3。没有观察到特异性靶向其它组织的证据。在一种观察到肿瘤转移到肝脏和脾脏的情况下，这两种转移瘤均被靶向并且具有高浓度的放射性标记抗体。另外，大约一半的动物在切口部位发生皮下肿瘤。在同一动物中，在靶向同位肿瘤和皮下肿瘤时，没有观察到显著性差异，并且在靶向同位肿瘤时，无论动物是否带有另外的皮下肿瘤都没有观察到显著性差异。PAM4的估计辐射剂量对于原发性肿瘤和血液分别为6,704cGy/mCi和1,655cGy/mCi。
实施例4-用于定量循环肿瘤抗原的酶免疫测定的开发
我们已经开发出一种用PAM4作为捕获试剂的酶免疫测定，并且使用来自兔多克隆抗胰腺粘蛋白的未标记纯化IgG，接着通过过氧化物酶标记的驴抗兔IgG作为检测试剂。通过使用该项测定获得了下面的结果。
在所述测定检测的抗原范围内，获得的变异系数值小于10％。检查了25位健康个体的血清，显示平均值±S.D.为4.0±3.1单位。然后将阳性反应的截止值设定为平均值+2S.D.＝10.2单位。在总共37位胰腺癌患者中，32位或86％在该项测定中呈阳性，而13位胰腺炎患者中仅有3位呈阳性。PAM4抗原在55％(18/33)的结肠直肠癌症患者中升高，通过免疫组织化学测定，大致接近40％的结肠直肠癌症标本与PAM4有反应性。在其它癌症中，PAM4抗原在16位卵巢癌患者中有4位呈阳，在20位乳腺癌患者中有5位呈阳性，在所有患有广泛性疾病(extensive disease)患者中全都呈阳性。另外，正如可以从下表5中所见到的，胰腺癌的中位值(84.5单位)是所有其它癌症组的10倍以上(胆囊癌除外)，尽管这些病例中的绝大多数是晚期、带有大肿瘤。
表5-PAM4与血清的反应性
                              单位/ml
  n     平均值     SD   中位值   范围   ％阳性a
  正常   25     4.0     3.1   4.7   0.0-9.4   0％
  胰腺炎   13     14.6     20.3   6.8   0.4-66.7   23％
  胰腺癌   37     317.5     427.1   84.5   0.9-1000   86％
  胆囊癌   8     155.4     343.8   37.8   6.6-1000   63％
  肝细胞癌   30     7.9     8.0   6.4   0.0-32.8   30％
  结肠直肠癌   33     50.0     171.6   11.8   3.4-1000   55％
  肺癌   38     25.8     44.6   9.3   0.0-196.0   39％
  乳腺癌   20     11.1     18.5   5.8   0.0-83.3   25％
  卵巢癌   16     68.9     248.4   5.5   0.0-1000   25％
  非霍奇金淋巴瘤   14     6.6     3.1   7.5   2.2-12.8   14％
a截止值10.2单位/ml(平均值+2 S.D.)
除了这些发现之外，在同位模型中进行了初步研究，以检查该PAM4测定在使用中的潜在用途。在同位CaPan1肿瘤植入后2周(估计肿瘤重量为0.15g)，在动物血液中没有可检测抗原。在4周(估计肿瘤重量为0.2g)，5只动物中有1只动物具有可检测水平的抗原(72单位)，而在6周(估计肿瘤重量为0.4g)，5只动物中有4只动物具有可定量的抗原(范围：98-6080单位)。鉴于测定可检测血清源性抗原的最早时间点的严重限制因素为可获得的有限量的血，致使可以进行重复放血。因此，测定前血清以1∶10进行稀释。
实施例5-胰腺癌的实验性放射免疫疗法
用CaPan1肿瘤对将131I-PAM4用于治疗进行初始研究，让CaPan1肿瘤在无胸腺小鼠体内作为皮下异种移植物生长。在实验中，带有0.25g肿瘤的动物给予350μCi 131I-PAM4，也将其与相似剂量的非特异性Ag8的治疗效应进行比较。将131I-PAM4给予带有1cm3肿瘤的动物的MTD为700μCi。截止到5周和6周，经PAM4治疗的动物显示肿瘤显著消退，甚至在27周，8只动物中有5只仍保持无瘤。未治疗动物以及经Ag8治疗的动物显示肿瘤生长的快速进行，虽然在这两个对照组之间也观察到显著性差异。在7周，未治疗组的肿瘤比开始时间点的肿瘤生长20.0±14.6倍，而经131I-Ag8治疗的肿瘤仅生长4.9±1.8倍。在该时间点，PAM4肿瘤一直消退至其原始大小的0.1±0.1倍，未治疗动物(p＜0.001)和经非特异性Ag8治疗的动物(p＜0.01)均有显著性差异。
虽然CaPan1肿瘤对用131I-PAM4治疗敏感，结果也就是说，肿瘤的消退或发展依赖于包括原始肿瘤大小在内的诸多因素。因此，带有CaPan1肿瘤负担为0.25g、0.5g、1.0g或2.0g的动物组用一剂350μCi 131I-PAM4进行治疗。大多数带有原始大小为0.25g和0.5g肿瘤的动物(每组10只动物中有9只动物)显示治疗后肿瘤消退或生长抑制长达至少16周。在1.0g肿瘤组，7只动物中有5只显示没有肿瘤生长达16周，而在2.0g肿瘤组，9只动物中有6只显示没有肿瘤生长达6周，随后肿瘤开始生长。虽然一剂350μCi对于较大肿瘤是无效的，一剂可能并不是非常好的合适方案；但是毒性研究表明，放射免疫疗法能循环给予多次。带有平均1.0g的CaPan1肿瘤的动物或者给予一剂350μCi 131I-PAM4，或者在时间为0和4周时给予两剂，或者不治疗。未治疗组的平均存活时间为3.7+/-1.0周(存活时间定义为肿瘤达到5cm3的时间)。早在3周就有动物死亡，没有动物活过6周。一剂350μCi 131I-PAM4在存活时间方面产生显著性增加，存活时间增加至18.8+/-4.2周(p＜0.0001)。动物死亡范围从13周延长至25周。在26周的研究期结束时，没有动物活着。
与一剂组相比，观察到两剂组的存活时间显著性增加。在26周时间点，有半数动物活着，肿瘤大小为1.0-2.8cm3，而自原始肿瘤大小的平均肿瘤生长速率为1.6+/-0.7倍。对于这些在26周没有存活者的动物，平均存活时间(17.7+/-5.3周)与一剂组相似。
用PAM4的治疗研究也用于同位肿瘤模型。带有4周龄同位肿瘤的动物组(估计肿瘤重量为0.25g)或者不治疗或者用一剂350μCi131I-PAM4治疗或者用一剂350μCi 131I非特异性Ag8治疗。截止到10周，未治疗动物的死亡率为50％，而在第15周，没有动物活着。在肿瘤生长的4周内给予非特异性131I-Ag8的动物的死亡率在7周时为50％，而在14周，没有动物活着。虽然在这两组间没有统计学显著性(logrank分析)，可能会在约一半的Ag8治疗的动物中出现辐射毒性。然而，与未治疗动物或经Ag8治疗的动物相比，放射性标记PAM4提供显著存活优势(p＜0.001)，16周即实验结束时的存活率为70％。此时，处死存活的动物，测定肿瘤大小。所有动物的肿瘤平均重量为1.2g，以及在7只动物中有4只动物明显存在一个或两个小(＜0.1g)转移瘤。生长16周时，这些肿瘤比8周龄肿瘤更有代表性。
实施例6-吉西他滨化疗药和131I-PAM4放射免疫疗法的联合用药
对131I-PAM4放射免疫疗法与吉西他滨(gemzar)联用进行初始研究，作为棋盘阵列；一剂吉西他滨(0mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg)对一剂131I-PAM4([MTD＝700μCi]100％、75％、50％、0％MTD)。发现联合MTD是500mg/kg吉西他滨加上350μCi 131I-PAM4(50％ MTD)。根据体重减轻的测量，毒性达到所认为无毒的最大值；即体重减轻了20％。虽然，联合治疗方案比单独的吉西他滨显著更有效，但是该治疗没有单独的放射免疫疗法有效。对低剂量的吉西他滨和放射免疫疗法进行下一步研究，以检查是否观察到真正的协同疗效。带有约1cm3肿瘤(约占体重的5％)的动物在第0天、第3天、第6天、第9天和第12天给予100mg/kg吉西他滨，在第0天给予100μCI 131I-PAM4。观察到与单独的吉西他滨相比，肿瘤的统计学显著性(p＜0.0001)消退(5个肿瘤中有2个小于0.1cm3)和/或生长抑制的疗效。另外还注意到，根据体重，没有观察到毒性。必要时，联合治疗方案可以在多个循环中给予，其中第2个治疗循环始于第4周，如上述单独的放射免疫疗法的研究做法一样。
实施例7-人源化PAM4 Mab
本发明的一个优选的实施方案使用单克隆抗体即MAb hPAM4，MAb hPAM4是一种针对胰腺癌粘蛋白产生的鼠PAM4的人源化IgG。鼠PAM4序列的人源化用来降低患者经历的人抗小鼠抗体应答。为了产生人源化PAM4，将鼠互补性决定区(CDR)从小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变(V)区转移到人V区，然后用其小鼠对应物取代构架区中的某些人残基。按照本发明的人源化单克隆抗体适合用于体外和体内诊断方法和治疗方法。
将鼠PAM4单克隆抗体的可变(V)区构架(FR)序列(图1A和图1B)与在Kabat数据库中注册的人抗体进行比较，表明PAM4 Vκ和VH的FR表现出分别与人抗体Walker Vκ和Wil2 VH有最高程度的序列同源性。因此，选择Walker Vκ和Wil2 VH FR分别作为移植到鼠PAM4 Vκ和VH的CDR中的人构架(图3)。然而，用人抗体FR4序列NEWM取代Wil2 FR4序列，供PAM4重链的人源化用(图3B)。邻接推定的CDR的PAM4 FR中的几个氨基酸残基保留在hPAM4中，考虑到这些残基对Ag结合的影响要比其它FR残基大些。这些残基是Vκ的21M、47W、59P、60A、85S、87F和100G以及VH的27Y、30P、38K、48I、66K、67A和69L。hPAM4 Vκ和VH的DNA序列和氨基酸序列分别示于图3A和图3B。
使用图4中说明的长寡核苷酸合成和PCR的组合，用根据Leung等(Leung等，1994))描述的策略的改进策略构建设计的hPAM4的Vκ和VH基因。为了构建hPAM4 VH区，在自动化DNA合成仪(AppliedBiosystem)上合成hPAM4VHA(173-mer)和hPAM4VHB(173-mer)。
hPAM4VHA表示hPAM4 VH区的核苷酸17-189。
5’-AGTCTGGGGC TGAGGTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAAGGTCTCCTGC GAGGCTTCTG GATACACATT CCCTAGCTAT GTTTTGCACTGGGTGAAGCA GGCCCCTGGA CAAGGGCTTG AGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATG ATGGTACTCA GTACAATGAG AAG-3’
hPAM4VHB表示与核苷酸169-341互补的hPAM4 VH区的负链。
5’-AGGGTTCCCT GGCCCCAGTA AGCAAATCCG TAGCTACCACCGAAGCCTCT TGCACAGTAA TACACGGCCG TGTCGTCAGA TCTCAGCCTGCTCAGCTCCA TGTAGGCTGT GTTGATGGAC GTGTCCCTGG TCAGTGTGGCCTTGCCTTTG AACTTCTCAT TGTACTGAGT ACC-3’
hPAM4VHA和hPAM4VHB的3′末端序列(21个核苷酸残基)彼此互补。在指定的PCR条件下，使hPAM4VHA和hPAM4VHB的3′端退火形成邻接长寡核苷酸其余部分的短双链DNA。每一退火末端用作单链DNA转录的引物，产生由hPAM4 VH的核苷酸17-341组成的双链DNA。该DNA在这两种短寡核苷酸hPAM4VHBACK和hPAM4VHFOR存在下进一步扩增，形成全长hPAM4 VH。下划线部分是亚克隆的限制位点(如图4B所示)。
hPAM4VHBACK  5’-CAG GTG CAGCTG  CAG CAG TCT GGG GCT GAG GTG A-3’
hPAM4VHFOR   5’-TGA GGA GAC  GGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC CCA-3’
在10μL 10x PCR缓冲液(500mM KCl、100mM Tris、HCl缓冲液pH 8.3、15mM MgCl2)、2μmol hPAM4VHBACK和hPAM4VKFOR和2.5单位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)存在下，扩增少量的hPAM4VHA和hPAM4VHB(凭经验确定)。该反应混合物进行3个聚合酶链式反应(PCR)循环，每个循环的组成如下：94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃聚合1.5分钟。该方法后接27个由以下组成的PCR反应循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃聚合1.5分钟。hPAM4 VH的双链PCR扩增产物进行凝胶纯化，PstI和BstEII限制位点进行限制性消化，然后克隆到重链分期载体VHpBS2的互补PstI/BstEII的限制位点中，其中VH序列用编码翻译起始密码子的DNA序列完全装配，然后将分泌信号肽符合读框地连接在5′端，而将内含子序列符合读框地连接在3′端。VHpBS2是VHpBS的一种修饰的分期载体(Leung等，Hybridoma，13：469(1994))，其中在翻译起始密码子上游16个碱基处导入了一个XhoI限制位点，以便于下一步的亚克隆步骤。将装配的VH基因作为XhoI-BamHI限制片段亚克隆到表达载体pdHL2中，该表达载体含有处于IgH增强子和MT1启动子控制之下的人IgG重链和轻链的表达盒，以及小鼠dhfr基因作为选择和扩增标记(图4B)。由于pdHL2的重链区缺乏BamHI限制位点，因此该连接需要应用接头，以在可变链的BamHI位点和pdHL2载体中存在的HindIII位点之间提供一个桥。所得表达载体命名为hPAM4VHpdHL2。
为了构建人源化Vκ序列的全长DNA，如上所述合成hPAM4VKA(157-mer)和hPAM4VKB(156-MER)。用如上所述的两种短寡核苷酸hPAM4VKBACK和hPAM4VKFOR扩增hPAM4VKA和hPAM4VKB。
hPAM4VKA表示hPAM4 Vκ区的核苷酸16-172。
5’-CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTA GGAGACAGAGTCACCATGAC CTGCAGTGCC AGCTCAAGTG TAAGTTCCAG CTACTTGTACTGGTACCAAC AGAAACCAGG GAAAGCCCCC AAACTCTGGA TTTATAGCACATCCAACCTG GCTTCTG-3’
hPAM4VKB表示与核苷酸153-308互补的hPAM4 Vκ区的负链。
5’-GTCCCCCCTC CGAACGTGTA CGGGTACCTA TTCCACTGATGGCAGAAATA AGAGGCAGAA TCTTCAGGTT GCAGACTGCT GATGGTGAGAGTGAAGTCTG TCCCAGATCC ACTGCCACTG AAGCGAGCAG GGACTCCAGAAGCCAGGTTG GATGTG-3’
hPAM4VKA和hPAM4VKB的3′末端序列(20个核苷酸残基)彼此互补。在指定的PCR条件下，使hPAM4VHA和hPAM4VHB的3′端退火形成邻接长寡核苷酸其余部分的短双链DNA。每一退火末端用作单链DNA转录的引物，产生由hPAM4 Vκ的核苷酸16-308组成的双链DNA。该DNA在这两种短寡核苷酸hPAM4VHBACK和hPAM4VHFOR存在下进一步扩增，形成全长hPAM4 Vκ。下划线部分是亚克隆的限制位点(如下所述)。
hPAM4VKBACK  5’-GAC ATC  CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG-3’
hPAM4VKFOR   5’-TT A GAT CTC CAG TCG TGT CCC CCC TCC GAA CGT-3’
hPAM4 Vκ的凝胶纯化PCR产物用PvuII和BglII进行限制性消化，然后将其克隆到轻链分期载体VKpBR2的互补PvuII/BclI位点中。VKpBR2是VKpBR的一种修饰的分期载体(Leung等，Hybridoma，13：469(1994))，其中在翻译起始密码子上游16个碱基处导入了一个XbaI限制位点。将装配的Vκ基因作为XbaI-BamHI限制片段亚克隆到含有VH序列的表达载体hPAM4VHpdHL2中。所得表达载体命名为hPAM4pdHL2。
约30μg的hPAM4pdHL2通过用SalI消化而线性化，然后将其通过电穿孔(450V和25μF)转移到Sp2/0-Ag14细胞中。将转染细胞接种到96孔板中，在CO2细胞培养箱中培养2天，然后根据MTX抗性进行选择。在2-3周开始选出存活的菌落，通过ELISA测定筛选人抗体分泌。简而言之，向用山羊抗人IgG F(ab′)2片段特异性抗体预包被的ELISA微量培养板的各孔中加入活菌落的上清液(～100μl)。将板在室温下温育1小时。通过用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温-20的PBS)洗涤三次，去除未结合的蛋白。向各孔中加入辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗人IgG Fc片段特异性抗体。然后培养1小时，洗涤后，向各孔中加入含有4mM邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和0.04％ H2O2的PBS的底物溶液(100μL/孔)。避光显色30分钟，通过加入50μL 4NH2SO4溶液终止反应。通过在ELISA读板器上，读出490nm的吸光度，测定结合的人IgG。扩充阳性细胞克隆，通过在A蛋白柱上进行亲和层析，从细胞培养上清液中纯化出hPAM4。
在用胰腺癌细胞提取物包被的微量滴定板中，通过ELISA测定，证实hPAM4的抗原结合活性。采用PAM4-抗原包被的板，开发ELISA竞争性结合测定，以评价hPAM4的抗原结合亲和性，并且将其与由鼠V区和人C区组成的嵌合PAM4的抗原结合亲和性进行比较。向包被孔中加入与不同浓度的cPAM4或hPAM4混合的恒定量的HRP-缀合的cPAM4，在室温下孵育1-2小时。加入含有4mM邻苯二胺二盐酸盐和0.04％ H2O2的底物溶液之后，通过读出490nm的吸光度，揭示出HRP-缀合的cPAM4与CaPan1 Ag结合的量。如图4竞争测定所示，hPAM4抗体和cPAM4抗体均表现出相似的结合活性。
合适的宿主细胞包括微生物或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主是人细胞系PER.C6，其已开发用于产生MAb及其它的融合蛋白。因此，本发明的一个优选实施方案是包含编码PAM4 MAb、缀合物、融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主细胞。用含有处于人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制之下的Ad血清型5(Ad5)E1A编码序列和E1B编码序列(Ad5核苷酸459-3510)的质粒转染原代人胚胎视网膜细胞，产生PER.C6细胞(WO 97/00326)。E1A和E1B分别是腺病毒早期基因激活蛋白1A和1B。所述方法和组合物尤其可用于产生稳定表达的翻译后修饰(例如糖基化)的目标人重组蛋白。一些特征使PER.C6尤其可用作重组蛋白生产的宿主，例如，PER.C6是充分表征的人细胞系，其开发遵从药品非临床研究质量管理规范。此外，PER.C6可以在不含任何人或动物源性蛋白的已知成分的无血清培养基中生长成为悬浮培养物，并且其生长与滚瓶、摇瓶、旋转瓶和生物反应器兼容，倍增时间约为35小时。最后，存在的E1A引起处于CMV增强子/启动子控制之下的基因表达上调，而存在的E1B阻止可能通过重组转基因过量表达增加的p53依赖性细胞凋亡。在一个实施方案中，所述细胞能够产生比常规哺乳动物细胞系多2-200倍的重组蛋白和/或蛋白质性物质。
实施例8-对患有不宜手术的胰腺癌的患者的治疗
56岁男性，患有胰腺的广泛的不宜手术的腺癌，伴有严重体重减轻(体重30磅或以上)，嗜眠和乏力，在2小时内，静脉内给予一剂30mCi 90-Y和50mg抗体蛋白的90Y-PAM4放射性标记人源化抗体。5天后，再给予该患者吉西他滨化疗的标准疗程。几个月后，如果没有来自治疗副作用的证据，则重复该治疗方案。在跟踪检测几周后，预测该患者将会更有力气，体重减轻减慢。预期对胰脏的CT扫描提示疾病得以稳定或肿瘤块略微缩小。几个月后重复检查应该显示，通过计算机断层成像，肿瘤块显著缩小，因此，该患者可考虑进行胰腺肿瘤块的切除手术。
实施例9-用双特异性PAM4 x 734和99mTc标记肽半抗原或111In标记肽半抗原的预靶向
对于采用预靶向方法进行的胰腺癌造影，我们制备由嵌合PAM4(cPAM4)Fab′和鼠734(m734)Fab′组成的双特异性F(ab′)2抗体(bsMAb)。m734抗体识别In-DTPA复合物。该bsMAb用125I标记，然后注射到带有人胰腺癌异种移植物(CaPan1)的无胸腺裸鼠体内(7μCi；15μg)。由嵌合rituximab(抗CD20单克隆抗体)和m734制备的非靶向F(ab′)2 bsMAb用131I标记，并共同注射，作为对照。在不同的时间点(注射后4小时、24小时、36小时、48小时和72小时)，对小鼠实施尸体剖检，取出组织，进行计数，以测定每克注射剂量百分率(％ ID/g)。与对照bsRituximab相比，在各时间点，bsPAM4的肿瘤摄取显著更大(p＜0.032或更小)。对于该类型的预靶向系统，我们过去的经验提示，小于1％ ID/g的血液水平对于获得良好的肿瘤∶非肿瘤比率是必需的。在给予bsPAM4后36小时，在血液中为1.10±0.40％ ID/g，注射后48小时降至0.56±0.08％ ID/g。在这两个时间点的肿瘤摄取分别为6.43±1.50％ ID/g和5.37±2.38％ ID/g。这些数值显著比对照bsRituximab更高，对照bsRituximab在肿瘤内在36小时和48小时分别为0.65±0.33％ ID/g和0.47±0.19％ ID/g(p＜0.018和p＜0.0098)。然而，血清除率却十分相似，没有显著性差异。
基于这些数据，在带有CaPan1肿瘤的小鼠中进行预靶向实验，其中给予bsMAb后40小时注射放射性标记肽-半抗原。使用IMP-192和IMP-156两种肽，每种含有被734 MAb所识别的二价DTPA，但一种具有额外稳定结合99mTc(IMP-192)的特异性基团。给予带瘤小鼠(肿瘤体积约为0.30cm3)125I-bsPAM4(6μCi；15μg)，接着40小时后给予放射性标记肽-半抗原(34.5μCi；1.5×10-11mole；bsMAb∶肽＝10∶1)。一组小鼠接受99mTc标记的IMP192，而第二组小鼠接受111In标记的IMP156。非特异性靶向对照包括两组接受125I-bsRituximab后给予放射性标记肽的小鼠，以及另外两组接受单独的111In标记肽或单独的99mTc标记肽的小鼠。
给予肽后3小时和24小时处死小鼠，测定肿瘤和各种组织的％ID/g。同我们先前的发现相符，肿瘤内的bsPAM4与非靶向对照bsRituximab相比显著更高，分别为8.2±3.4％和0.3±0.08％ ID/g(p＜0.0001)。进行换算，肿瘤摄取111In-IMP156显著更高(20.2±5.5％ID/g vs.0.9±0.1％ ID/g，p＜0.0001)。在用bsPAM4预靶向的小鼠中，与在用bsRituximab预靶向的小鼠中相比，肿瘤摄取99mTc-IMP192显著更高(16.8±4.8％ ID/g vs.1.1±0.2％ ID/g，p＜0.0005)。每种肽的肿瘤摄取，当单独给予时，显著低于接受bsPAM4的小鼠的肿瘤摄取(对于99mTc-IMP192和111In-IMP156分别是0.2±0.05％ ID/g和0.1±0.03％ ID/g；p＜0.0004和p＜0.0001)。
对于3小时时间点，在注射肽后24小时时(bsMAb给予后64小时)肿瘤内的bsPAM4比bsRituximab显著更高(分别是6.4±2.2％ ID/gvs.0.2±0.09％ ID/g；p＜0.0001)。在该时间点，在用bsPAM4预靶向的小鼠中，对于111In-IMP156为11.1±3.5％ ID/g，而对于99mTc-IMP192为12.9±4.2％ ID/g；相比之下，在bsRIT预靶向的肿瘤中分别为0.5±0.2％ ID/g和0.4±0.03％ ID/g(分别是p＜0.0008和p＜0.0002)。与接受bsPAM4预靶向的肽的小鼠相比，在单独接受肽的小鼠中，在肿瘤内的99mTc-IMP192(0.06±0.02％ ID/g，p＜0.0007)和111In-IMP156(0.09±0.02％ ID/g，p＜0.0002)显著更低。
                     表6.早期时间点的肿瘤∶非肿瘤组织比率
        预靶向111In-肽(3小时)           预靶向99mTc-肽(3小时)          125I-bsPAM4F(ab′)2(4小时)
组织肿瘤肝脏脾脏肾脏肺血液骨W.Bone胰腺肿瘤重量(g)(±STD)   平均值1.0036.0733.407.7944.5536.47123.24378.00155.550.189     (±STD)0.0011.7420.622.8112.998.2840.00124.5730.07(0.070)     平均值1.0016.6614.628.1315.759.93--73.290.174     (±STD)0.007.199.123.335.855.21--32.85(0.050)     平均值1.002.342.151.101.580.47--4.650.179     (±STD)0.000.610.740.200.370.11--1.23(0.139)
上表显示这些组的不同组织的肿瘤∶非肿瘤比率(T∶NT)，每个都在给予放射性标记制品后的早期时间点。重要的是注意到，给予bsPAM4 x m734 F(ab′)2后4小时，肿瘤∶血液比率小于2∶1。然而，对于所有所检查的组织，在给药后3小时，预靶向的111In-IMP156和99mTc-IMP192的肿瘤∶非肿瘤比率显著更高，特别是肿瘤∶血液比率等于36∶1和9∶1(分别是p＜0.001和p＜0.011)。当我们检查24小时时间点的肿瘤∶血液比率时，预靶向的111In-IMP156和99mTc-IMP192的值显著更高，分别为274∶1和80∶1；相比之下，单独的125I-bsPAM4为4∶1(p＜0.0002)。这些数据强有力地提示，能够利用该预靶向bsPAM4方法，将高辐射剂量的短半衰期高能放射性同位素传递到肿瘤内，而对非肿瘤组织具有最小辐射剂量。
本领域技术人员将会认识到，可以对本发明的制品、组合物、方法和过程进行各种修改和变化。因此，本发明包括这样的修改和变化，只要所述修改和变化在所附权利要求及其等同实施方案的范围之内即可。
以上引用的所有出版物、专利和专利申请的公开内容都通过引用全部结合到本文中，其程度如同每个出版物或专利文献通过引用全部结合到本文中一样。

Claims (155)

1.一种人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段结合位于MUC1的氨基末端和重复结构域起始位点之间的结构域，其中所述抗体通过用粘蛋白免疫和/或选择而获得。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是针对胰腺癌粘蛋白产生或选择的。
3.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是PAM4抗体或其片段。
4.权利要求3的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是人源化抗体或其片段。
5.权利要求3的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是全人抗体或其片段。
6.一种人源化抗体或其片段，所述人源化抗体或其片段包含鼠PAM4单克隆抗体的互补性决定区(CDR)和人抗体轻链可变区和重链可变区的构架(FR)区以及人抗体轻链恒定区和重链恒定区，其中所述人源化PAM4单克隆抗体轻链可变区的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SASSSVSSSYLY的氨基酸序列；CDR2包含STSNLAS的氨基酸序列；而CDR3包含HQWNRYPYT的氨基酸序列；所述人源化PAM4单克隆抗体重链可变区的CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SYVLH的氨基酸序列；CDR2包含YINPYNDGTQYNEKFKG的氨基酸序列；而CDR3包含GFGGSYGFAY的氨基酸序列。
7.权利要求4的人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体或其片段的轻链可变区和重链可变区的FR包含至少一个被鼠PAM4单克隆抗体的相应FR取代的氨基酸。
8.权利要求7的人源化抗体或其片段，其中来自所述鼠PAM4单克隆抗体的所述取代氨基酸是至少一个选自图1B中PAM4 VH氨基酸序列的鼠重链可变区氨基酸残基5、27、30、38、48、66、67和69的氨基酸。
9.权利要求7的人源化抗体或其片段，其中来自所述鼠单克隆抗体的所述氨基酸是至少一个选自图1A中PAM4 Vκ序列的鼠轻链可变区氨基酸残基21、47、59、60、85、87和100的氨基酸。
10.权利要求3的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含图1A的PAM4 Vκ核苷酸序列和图1B的PAM4 VH核苷酸序列中的至少一个。
11.权利要求4的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含图4A的hPAM4 VH氨基酸序列和图4B的hPAM4 Vκ氨基酸序列。
12.一种靶向癌细胞的包含抗体组分的诊断用缀合物或治疗用缀合物，所述抗体组分包含权利要求1-11中任一项的抗体或其片段，其中所述抗体组分结合至少一种诊断剂和/或治疗剂。
13.权利要求12的诊断用缀合物，其中所述诊断剂/检测剂选自放射性核素、造影剂和光敏诊断剂/检测剂。
14.权利要求13的诊断用缀合物，其中所述诊断剂/检测剂是放射性核素。
15.权利要求14的诊断用缀合物，其中所述放射性核素的能量介于20keV和4000keV之间。
16.权利要求14的诊断用缀合物，其中所述放射性核素是γ发射同位素、β发射同位素或正电子发射同位素。
17.权利要求16的诊断用缀合物，其中所述放射性核素选自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ发射体、β发射体或正电子发射体。
18.权利要求13的诊断用缀合物，其中所述诊断剂/检测剂是放射性造影剂。
19.权利要求18的诊断用缀合物，其中所述造影剂是顺磁离子。
20.权利要求19的诊断用缀合物，其中所述顺磁离子是包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)在内的金属。
21.权利要求18的诊断用缀合物，其中所述造影剂是包括镧(III)、金(III)、铅(II)、尤其是铋(III)在内的金属。
22.权利要求18的诊断用缀合物，其中所述造影剂是超声增强剂。
23.权利要求22的诊断用缀合物，其中所述超声增强剂是脂质体。
24.权利要求23的诊断用缀合物，其中所述脂质体是充气的。
25.权利要求18的诊断用缀合物，其中所述造影剂是选自碘化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物的不透射线物质。
26.权利要求25的诊断用缀合物，其中所述不透射线物质选自钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。
27.权利要求13的诊断用缀合物，其中所述诊断剂/检测剂是光敏诊断剂/检测剂。
28.权利要求27的诊断用缀合物，其中所述光敏诊断剂/检测剂是选自以下的荧光标记化合物：异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
29.权利要求27的诊断用缀合物，其中所述光敏诊断剂/检测剂是选自以下的化学发光标记化合物：鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
30.权利要求27的诊断用缀合物，其中所述光敏诊断剂/检测剂是选自萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白的生物发光化合物。
31.权利要求13的诊断用缀合物，其中所述缀合物用于手术中、内窥镜检查或血管内肿瘤诊断。
32.权利要求12的治疗用缀合物，其中所述治疗剂选自放射性核素、免疫调节剂、激素、激素类拮抗剂、寡核苷酸、酶、酶抑制剂、光敏治疗剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂和它们的组合。
33.权利要求32的治疗用缀合物，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸。
34.权利要求33的治疗用缀合物，其中所述寡核苷酸是针对癌基因的反义寡核苷酸。
35.权利要求34的治疗用缀合物，其中所述癌基因是bcl-2或p53。
36.权利要求32的治疗用缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂。
37.权利要求36的治疗用缀合物，其中所述细胞毒性剂是药物或毒素。
38.权利要求37的治疗用缀合物，其中所述药物具有选自抗有丝分裂药、烷化剂、抗代谢药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、生物碱和抗生素及其组合的药物特性。
39.权利要求37的治疗用缀合物，其中所述药物选自氮芥、吉西他滨、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷类、SN-38、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素类拮抗剂、内皮细胞抑制素、紫杉醇、喜树碱、多柔比星及其类似物、抗代谢药、烷化剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11和它们的组合。
40.权利要求37的治疗用缀合物，其中所述毒素的来源选自动物、植物和微生物。
41.权利要求37的治疗用缀合物，其中所述毒素选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
42.权利要求32的治疗用缀合物，其中所述治疗剂是免疫调节剂。
43.权利要求42的治疗用缀合物，其中所述免疫调节剂选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素和它们的组合。
44.权利要求43的治疗用缀合物，其中所述淋巴毒素是肿瘤坏死因子(TNF)，所述造血因子是白介素(IL)，所述集落刺激因子是粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))，所述干扰素是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ，所述干细胞生长因子命名为“S1因子”。
45.权利要求42的治疗用缀合物，其中所述免疫调节剂包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α或它们的组合。
46.权利要求32的治疗用缀合物，其中所述治疗剂是放射性核素。
47.权利要求46的治疗用缀合物，其中所述放射性核素的能量介于60keV和700keV之间。
48.权利要求47的治疗用缀合物，其中所述放射性核素选自32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、90Y、111Ag、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac和它们的组合。
49.权利要求32的治疗用缀合物，其中所述治疗剂是光敏治疗剂。
50.权利要求49的治疗用缀合物，其中所述光敏治疗剂选自色原和染料。
51.权利要求32的治疗用缀合物，其中所述治疗剂是酶。
52.权利要求51的治疗用缀合物，其中所述酶选自苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
53.一种多价多特异性抗体或其片段，所述抗体或其片段包含不止一个对PAM4靶抗原具有亲和性的抗原结合部位和一个或多个对半抗原分子具有亲和性的半抗原结合部位。
54.权利要求53的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是人源化抗体或其片段。
55.权利要求53的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是全人抗体或其片段。
56.权利要求53的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含诊断剂或治疗剂。
57.一种抗体融合蛋白或其片段，所述抗体融合蛋白或其片段包含至少两种PAM4单克隆抗体或其片段。
58.一种抗体融合蛋白或其片段，所述抗体融合蛋白或其片段包含至少一种第一PAM4单克隆抗体或其片段和至少一种第二单克隆抗体或其片段，其中所述第二单克隆抗体或其片段不是PAM4单克隆抗体或其片段。
59.权利要求58的抗体融合蛋白或其片段，其中所述第二单克隆抗体是癌相关抗体。
60.权利要求59的抗体融合蛋白或其片段，其中所述癌相关抗体结合胰腺癌上的抗原或者来源于胰腺癌。
61.权利要求59的抗体融合蛋白或其片段，其中所述癌相关抗体选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根据以下抗原定义的抗体：路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TAG-72、EGFR、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因产物和HER2/neu。
62.权利要求57的抗体融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含至少一种诊断剂或治疗剂。
63.一种DNA序列，所述DNA序列包含编码选自以下的单克隆抗体或其片段的核酸：
(a)PAM4抗体或其片段；
(b)包含至少两种所述PAM4单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段；
(c)包含至少一种包含所述单克隆抗体或其片段的第一PAM4单克隆抗体或其片段和至少一种第二单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段，其中所述第二单克隆抗体或其片段不是PAM4单克隆抗体或其片段；和
(d)包含至少一种第一PAM4单克隆抗体或其片段和至少一种第二单克隆抗体或其片段的抗体融合蛋白或其片段，其中所述第二单克隆抗体是癌相关抗体。
64.权利要求63的DNA序列，其中所述癌相关抗体选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根据以下抗原定义的抗体：路易斯抗原Le(y)、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因产物、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6和HER2/neu。
65.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求60的DNA序列。
66.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求63的DNA序列。
67.一种将诊断剂或治疗剂或其组合传递到靶的方法，所述方法包括(i)提供包含与至少一种诊断剂和/或治疗剂缀合的PAM4抗体或其片段的组合物和(ii)给予有需要的患者权利要求12的诊断用缀合物或治疗用缀合物。
68.权利要求67的方法，其中所述诊断剂/检测剂选自放射性核素、造影剂和光敏诊断剂/检测剂。
69.权利要求68的方法，其中所述诊断剂/检测剂是放射性核素。
70.权利要求69的方法，其中所述放射性核素的能量介于20keV和4000keV之间。
71.权利要求70的方法，其中所述放射性核素是γ发射同位素、β发射同位素或正电子发射同位素。
72.权利要求71的方法，其中所述放射性核素选自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它的γ发射体、β发射体或正电子发射体。
73.权利要求68的方法，其中所述诊断剂/检测剂是造影剂。
74.权利要求73的方法，其中所述造影剂是顺磁离子。
75.权利要求74的方法，其中所述顺磁离子是包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)在内的金属。
76.权利要求73的方法，其中所述造影剂是包括镧(III)、金(III)、铅(II)、尤其是铋(III)在内的金属。
77.权利要求73的方法，其中所述造影剂是超声增强剂。
78.权利要求77的方法，其中所述超声增强剂是脂质体。
79.权利要求78的方法，其中所述脂质体是充气的。
80.权利要求73的方法，其中所述造影剂是选自碘化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物的不透射线物质。
81.权利要求80的方法，其中所述不透射线物质选自钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘磺拉胺葡甲胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。
82.权利要求68的方法，其中所述诊断剂/检测剂是光敏诊断剂/检测剂。
83.权利要求82的方法，其中所述光敏诊断剂/检测剂是选自以下的荧光标记化合物：异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
84.权利要求82的方法，其中所述光敏诊断剂/检测剂是选自以下的化学发光标记化合物：鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
85.权利要求82的方法，其中所述光敏诊断剂/检测剂是选自萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白的生物发光化合物。
86.权利要求67的方法，其中所述治疗剂选自细胞毒性剂、细胞因子、免疫调节剂、激素、激素类拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、造影剂、寡核苷酸、酶、酶抑制剂和光敏治疗剂。
87.权利要求86的治疗用缀合物，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸。
88.权利要求87的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是针对癌基因的反义寡核苷酸。
89.权利要求88的反义寡核苷酸，其中所述癌基因是bcl-2或p53。
90.权利要求86的方法，其中所述治疗剂是细胞毒性剂。
91.权利要求90的方法，其中所述细胞毒性剂是药物或毒素。
92.权利要求91的方法，其中所述药物具有选自抗有丝分裂药、烷化剂、抗代谢药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、生物碱和抗生素及其组合的药物特性。
93.权利要求91的方法，其中所述药物选自氮芥、吉西他滨、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、SN-38、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素类拮抗剂、内皮细胞抑制素、紫杉醇、喜树碱、多柔比星及其类似物、抗代谢药、烷化剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11和它们的组合。
94.权利要求91的方法，其中所述毒素的来源选自动物、植物和微生物。
95.权利要求94的方法，其中所述毒素选自蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
96.权利要求86的方法，其中所述治疗剂是免疫调节剂。
97.权利要求96的方法，其中所述免疫调节剂选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素和它们的组合。
98.权利要求97的方法，其中所述淋巴毒素是肿瘤坏死因子(TNF)，所述造血因子是白介素(IL)，所述集落刺激因子是粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))，所述干扰素是干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ，所述干细胞生长因子命名为“S1因子”。
99.权利要求96的方法，其中所述免疫调节剂是细胞因子。
100.权利要求96的方法，其中所述免疫调节剂包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ、TNF-α或它们的组合。
101.权利要求86的方法，其中所述治疗剂是放射性核素。
102.权利要求101的方法，其中所述放射性核素的能量介于60keV和700keV之间。
103.权利要求96的方法，其中所述放射性核素选自32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、90Y、111Ag、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac和它们的组合。
104.权利要求86的方法，其中所述治疗剂是光敏治疗剂。
105.权利要求104的方法，其中所述光敏治疗剂选自色原和染料。
106.权利要求86的方法，其中所述治疗剂是酶。
107.权利要求106的方法，其中所述酶选自苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
108.一种将诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合传递到靶的方法，所述方法包括：
(a)给予患者权利要求53的抗体或其片段；
(b)等待足够长的时间，以清除所述患者血流中的非抗体量；和
(c)给予所述患者包含诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合并且与所述抗体的结合部位结合的载体分子。
109.权利要求108的方法，其中所述载体分子与所述抗体的不止一个结合部位结合。
110.权利要求108的方法，其中所述诊断剂/检测剂或所述治疗剂选自同位素、药物、毒素、细胞因子、激素、激素类拮抗剂、寡核苷酸、酶、酶抑制剂、生长因子、放射性核素和金属。
111.权利要求110的治疗用缀合物，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸。
112.权利要求111的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是针对癌基因的反义寡核苷酸。
113.权利要求112的反义寡核苷酸，其中所述癌基因是bcl-2或p53。
114.一种诊断或治疗癌症的方法，所述方法包括：
(a)给予有需要的患者权利要求50的抗体或其片段；
(b)等待足够长的时间，以清除所述患者血流中的非抗体量；和
(c)给予所述患者包含诊断剂/检测剂、治疗剂或其组合并且与所述抗体的结合部位结合的载体分子。
115.权利要求114的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
116.权利要求114的方法，其中所述方法可用于患病组织的手术中鉴定、患病组织的经内窥镜检查鉴定或患病组织的血管内鉴定。
117.一种治疗患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)给予所述患者治疗有效量的包含PAM4单克隆抗体或其片段或PAM4抗体融合蛋白或其片段的抗体或其片段，其中所述PAM4单克隆抗体或其片段或PAM4抗体融合蛋白或其片段与至少一种治疗剂缀合；和
(b)将所述PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段配制在药学上适合的赋形剂中。
118.权利要求117的方法，所述方法还包括给予第二单克隆抗体或其片段。
119.权利要求118的方法，其中所述第二单克隆抗体或其片段是裸单克隆抗体或其片段。
120.权利要求118的方法，其中所述第二单克隆抗体或其片段选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根据以下抗原定义的抗体：路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因产物和HER2/neu。
121.权利要求118的方法，其中所述第二单克隆抗体或其片段与治疗剂或诊断剂/检测剂缀合。
122.权利要求117的方法，所述方法还包括给予权利要求1-53中任一项的第二单克隆抗体或其片段。
123.权利要求117的方法，其中所述PAM4抗体经胃肠外给予。
124.权利要求123的方法，其中所述PAM4抗体以20-2000毫克蛋白/剂的剂量给予。
125.权利要求124的方法，其中所述剂量重复给予。
126.权利要求117的方法，其中所述PAM4抗体或其片段选自非人类灵长类PAM4抗体或其片段、人PAM4抗体或其片段和人源化PAM4抗体或其片段。
127.权利要求126的方法，其中所述人PAM4抗体和人源化PAM4抗体恒定区和绞链区包含人IgG的恒定区和绞链区。
128.权利要求117的方法，其中在给予所述患者与由所述恶性肿瘤表达的第二肿瘤标记起反应的第二裸抗体或缀合抗体之前、同时或之后给予所述PAM4抗体。
129.权利要求117的方法，其中在给予所述患者至少一种治疗剂之前、同时或之后给予所述PAM4抗体。
130.一种诊断患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)给予所述患者诊断有效量的包含PAM4单克隆抗体或其片段或PAM4抗体融合蛋白或其片段的诊断用缀合物，其中所述PAM4单克隆抗体或其片段或PAM4抗体融合蛋白或其片段与至少一种诊断剂/检测剂缀合；和
(b)任选将所述PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段配制在药学上适合的赋形剂中。
131.一种治疗患者的癌细胞的方法；所述方法包括：(i)给予所述患者治疗有效量的包含裸PAM4单克隆抗体或其片段或裸抗体融合蛋白或其片段的组合物；(ii)将所述裸PAM4单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段配制在药学上适合的赋形剂中。
132.权利要求131的方法，其中所述组合物还包含第二裸抗体或其片段。
133.权利要求132的方法，其中所述第二裸抗体或其片段是PAM4单克隆抗体或其片段。
134.权利要求132的方法，其中所述第二抗体或其片段不是PAM4单克隆抗体或其片段。
135.权利要求132的方法，其中所述第二抗体或其片段选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根据以下抗原定义的抗体：路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因产物和HER2/neu。
136.权利要求134的方法，其中所述第二抗体或其片段选自CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、CEA、aLea，根据以下抗原定义的抗体：路易斯抗原Le(y)、CSAp、MUC1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、TAG-72、EGFR、胰岛素样生长因子(IGF)、腱生蛋白、血小板衍生生长因子、IL-6、CD40、血管生成因子例如VEGF、癌基因产物和HER2/neu。
137.权利要求131的方法，其中所述裸PAM4抗体经胃肠外给予。
138.权利要求137的方法，其中所述裸PAM4抗体以20-2000毫克蛋白/剂的剂量给予。
139.权利要求138的方法，其中所述剂量重复给予。
140.权利要求131的方法，其中所述裸PAM4抗体选自非人类灵长类PAM4抗体、人PAM4抗体和人源化PAM4抗体。
141.权利要求140的方法，其中所述人和人源化裸PAM4抗体恒定区和绞链区包含人IgG的恒定区和绞链区。
142.权利要求132的方法，其中在给予所述患者所述第二裸抗体之前、同时或之后给予所述裸PAM4抗体或其片段。
143.一种诊断患者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括：(i)对来自所述患者的标本用包含权利要求1的裸PAM4单克隆抗体或其片段或裸抗体融合蛋白或其片段的组合物进行体外诊断分析。
144.权利要求143的方法，其中所述恶性肿瘤是癌。
145.权利要求144的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
146.权利要求143的方法，其中所述体外诊断分析选自免疫测定、PCR、RT-PCR和免疫组织化学。
147.权利要求146的方法，其中所述体外诊断分析是RT-PCR或免疫测定。
148.权利要求147的方法，其中所述标本是体液或组织。
149.权利要求146的方法，其中所述诊断分析是免疫组织化学。
150.权利要求149的方法，其中所述标本是细胞群体或组织。
151.一种手术中鉴定患者的表达PAM4抗原的患病组织的方法，所述方法包括：
(A)给予有效量的包含至少一个特异性结合表达PAM4-抗原的靶向组织的臂和至少另一个特异性结合靶向缀合物的臂的双特异性抗体或抗体片段，其中所述一个特异性结合靶向组织的臂是hPAM4抗体或其片段；和
(B)给予选自以下的靶向缀合物
(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；
Figure A038192940017C1
和
Figure A038192940017C2
152.一种经内窥镜检查鉴定患者的表达PAM4抗原的患病组织的方法，所述方法包括：
(A)给予有效量的包含至少一个特异性结合表达PAM4-抗原的靶向组织的臂和至少另一个特异性结合靶向缀合物的臂的双特异性抗体或抗体片段，其中所述一个特异性结合靶向组织的臂是hPAM4抗体或其片段；和
(B)给予选自以下的靶向缀合物：
(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；
Figure A038192940018C1
和
Figure A038192940018C2
153.一种血管内鉴定患者的表达PAM4抗原的患病组织的方法，所述方法包括：
(A)给予有效量的包含至少一个特异性结合表达PAM4-抗原的靶向组织的臂和至少另一个特异性结合靶向缀合物的臂的双特异性抗体或抗体片段，其中所述一个特异性结合靶向组织的臂是hPAM4抗体或其片段；和
(B)给予选自以下的靶向缀合物：
(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(ii)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2；
(iii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；
Figure A038192940019C1
和
154.一种在内窥镜检查、血管内导管或外科手术中检测损害的方法，其中所述方法包括：
(a)给准备进行所述手术的患者注射双特异性抗体F(ab)2或其F(ab′)2片段、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体，其中所述双特异性抗体或其片段、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体具有与PAM4抗原特异性结合的第一抗体结合部位，并且具有与半抗原特异性结合的第二抗体结合部位，允许所述抗体片段附加在靶部位；
(b)任选用半乳糖基化抗独特型清除剂清除非靶向抗体片段，如果在注射约24小时内所述双特异性片段大部分没有从循环中清除的话，然后注射二价标记半抗原，所述半抗原很快地集中在靶部位并通过肾脏清除；
(c)在初次注射48小时内，通过使用检测手段近距离检测靶部位升高的附加标记水平来检测存在的所述半抗原，然后进行所述手术，其中所述检测在不使用造影剂或扣除剂的情况下进行。
155.一种在手术中、血管内手术中或内窥镜手术中近距离损害检测的方法，其中所述方法包括：
(a)给准备进行所述手术的患者胃肠外注射有效量的hPAM4免疫缀合物或其片段，
(b)在注射48小时内实施所述手术；
(c)用检测所述标记抗体或其片段的存在的检测手段，对患者的内部可及部位进行近距离扫描；和
(d)根据在所述部位用所述检测手段检测到所述标记抗体或其片段水平升高，对所述标记抗体或其片段的附加部位进行定位。
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