ES2874558T3

ES2874558T3 - Moléculas de unión a CD20 y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2874558T3
Application number: ES16759586T
Authority: ES
Inventors: Bruce Keyt; Omar Duramad; Beatrice Tien-Yi Wang; Ramesh Baliga; Fen Zhang
Original assignee: IGM Biosciences Inc
Current assignee: IGM Biosciences Inc
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2036-03-04
Also published as: WO2016141303A2; AU2016226060A1; JP2018508214A; JP2021036885A; DK3265575T3; CA2978324A1; BR112017018941B1; PT3265575T; IL254223B2; JP2023099206A; EP3957738A1; EP3265575B1; CN107532188A; HUE054642T2; WO2016141303A3; IL254223B1; SG10202109717TA; US20190100597A1; EP3265575A4; KR20220018081A

Abstract

Una molécula de unión pentamérica que comprende cinco unidades de unión bivalentes y una cadena J o un fragmento funcional o variante de la misma, donde cada unidad de unión comprende dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM, cada una asociada con un dominio de unión a antígeno, donde al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión al antígeno CD20 que comprende: una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40; la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41; la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43; la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44; y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión a CD20 y usos de las mismas

ANTECEDENTES

Desde la llegada de los anticuerpos humanizados, el uso terapéutico de anticuerpos tales como RITUXAN® (rituximab) ha revolucionado el tratamiento de las neoplasias malignas de linfocitos B. El rituximab, un anticuerpo monoclonal quimérico específico contra CD20, es la primera terapia dirigida eficaz aprobada por la FDA para el tratamiento del linfoma no hodgkiniano de linfocitos B recidivante o resistente al tratamiento. Este logro científico no solo ha cambiado la práctica de referencia para el tratamiento del linfoma de linfocitos B, sino que ha estimulado un interés significativo en la próxima generación de AcM contra CD20. Muchos AcM contra CD20 innovadores han entrado en la clínica, cada uno con modificaciones estructurales para mejorar además la eficacia. En esta solicitud, describimos una serie de anticuerpos contra CD20 que pueden presentar una eficacia mejorada utilizando modos de acción adicionales, ya que estos anticuerpos contra CD20 se expresan en formatos que no son IgG, como IgA e IgM.

La CD20 es una proteína tetramembrana tetraspanina no glucosilada de 36 kDa (producto del gen MS4A1) expresada exclusivamente en linfocitos B y en más del 90 % del linfoma linfocítico B (véase la Figura 1). La CD20 se expresa en la fase avanzada de los prelinfocitos B y se regula al alza en la mayoría de los linfocitos del linaje B normales y malignos antes de que se regule a la baja en las células plasmáticas diferenciadas terminalmente. Esta molécula de superficie de los linfocitos B participa en el desarrollo y diferenciación de los linfocitos B en células plasmáticas.

Aunque el rituximab presenta una actividad antitumoral significativa en pacientes con linfoma no hodgkiniano de linfocitos B, existe una necesidad para mejorar la eficacia de las terapias con anticuerpos para el tratamiento de las neoplasias de linfocitos B. El rituximab como terapia de agente único da lugar a una tasa de respuesta clínica del 50 %, y no está claro por qué el 50 % restante de los pacientes no responde. Además, la mayoría de los pacientes que responden adquiere resistencia a la terapia adicional con rituximab. Un mecanismo de resistencia inicial o adquirida es la regulación a la baja o la modulación de CD20 en las células tumorales (o expansión clonal de tumores de baja expresión). Existe una clara necesidad médica no satisfecha para mejorar el tratamiento de estos pacientes resistentes al tratamiento cuyos tumores resistentes al tratamiento tienen la expresión de CD20 minimizada. Al aumentar la afinidad y la avidez con la multivalencia de IgA o IgM, estos agentes más nuevos tienen como objetivo lograr tasas de respuesta mejoradas en comparación con rituximab. Además, alterar las funciones efectoras cambiando el isotipo del anticuerpo puede mejorar la potencia y eficacia de los anticuerpos contra CD20.

Desde el lanzamiento de rituximab, se ha aprendido mucho sobre los posibles mecanismos de la eficacia terapéutica de los AcM contra CD20. El rituximab induce la muerte de los linfocitos B principalmente a través de la lisis dependiente del complemento (CDC) y los mecanismos efectores de toxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) y, en menor grado, a través de la apoptosis celular. Los anticuerpos contra CD20 se describen como tipo I (tales como rituximab/RITUXAN® o ofatumumab/ARZERRA®), que redistribuyen la CD20 en balsas lipídicas resistentes a los detergentes; y tipo II tales como tositumumab (B1) y obinutuzumab/GAZYVA®, que no lo son. La agrupación por anticuerpos de tipo I favorece la asociación con otras proteínas de la superficie celular tales como el receptor de los linfocitos B (RLB) y la unión a C1q, lo que da lugar a una potente citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La IgM es muy potente para inducir la citotoxicidad dependiente del complemento y, como tal, las formas IgM de los anticuerpos contra CD20 pueden producir una eficacia significativamente mayor. Por el contrario, los anticuerpos de tipo II, tales como tositumomab (B1), provocan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, pero no citotoxicidad dependiente del complemento. Los anticuerpos de tipo II son muy potentes para desencadenar directamente la muerte celular a través de la adhesión homotípica inducida por anticuerpos y la muerte celular lisosomal. Las formas oligoméricas de los anticuerpos, tales como IgA e IgM, presentan un aumento de la multivalencia y pueden mostrar una eficacia potenciada para inducir la adhesión homotípica y la muerte celular. Es importante destacar que tanto los anticuerpos de tipo I como los de tipo II reclutan células que expresan FcR para mediar en funciones efectoras celulares como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos.

Los AcM contra CD20 de segunda generación de tipo I se han aprobado para uso humano. Ofatumumab es un AcM contra CD20 de tipo I, IgG1 completamente humana, que presenta citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), pero tiene una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) más fuerte en comparación con rituximab. Como anticuerpo de tipo I, el ofatumumab es relativamente ineficaz para desencadenar la muerte celular. La FDA ha aprobado el ofatumumab para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (LLC). Obinutuzumab/GA101 es un AcM de tipo II de segunda generación de IgGI humanizado que muestra una actividad proapoptótica mejorada, CCDA potenciada pero sin actividad de fijación del complemento. La FDA ha aprobado el obinutuzumab para el tratamiento de la LLC. Otro anticuerpo IgGlK contra CD20 completamente humano huMAb 1.5.3 (véanse la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007-0014720 y el documento w O 2006/130458 A2) se ha diseñado para una potencia potenciada. Los estudios preclínicos han demostrado que huMAb 1.5.3 tiene una mayor apoptosis en comparación con rituximab, y presenta tanto una potente actividad CDC como CCDA. HuMAb 1.5.3 parece combinar tanto las actividades de tipo I como las de tipo II, incluida la destrucción celular eficaz a través de la inducción de apoptosis directa, CDC y CCDA. La IgM y la IgA pueden contribuir a una potencia potenciada adicional de los anticuerpos contra CD20 con una mayor avidez que puede mediar una sensibilidad y citotoxicidad aumentadas en células tumorales de baja expresión de CD20. Además, la eficacia de las actividades de CD20 de tipo I y tipo II se puede aumentar con formatos IgA o IgM, lo que permite el desarrollo de anticuerpos antitumorales más potentes utilizando mecanismos de acción combinados de manera óptima, que incluyen la activación de la apoptosis directa, CDC y CCDA potenciadas.

RESUMEN

En un primer aspecto, la invención proporciona una molécula de unión pentamérica que comprende cinco unidades de unión bivalentes y una cadena J o un fragmento funcional o variante de la misma, donde cada unidad de unión comprende dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM, cada una asociada con un dominio de unión a antígeno, donde al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión al antígeno CD20 que comprende: una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en donde la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40; la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41; la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 ; la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44; y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45.

En una realización, las regiones constantes de la cadena pesada de IgM son regiones constantes de IgM humana, cada una de las cuales comprende un dominio C|^j2, un dominio C|^j1, un dominio C|^j3 y un dominio Cji4-tp.

En una realización, la cadena J o el fragmento funcional o variante de la misma comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 o un fragmento funcional de la misma.

En una realización, la cadena J o el fragmento funcional o variante de la misma es una cadena J modificada o un fragmento funcional o variante de la misma que comprende además un polipéptido heterólogo, donde el polipéptido heterólogo se fusiona directa o indirectamente con la cadena J o el fragmento funcional o variante de la misma. En una realización, el polipéptido heterólogo fusionado directa o indirectamente a la cadena J o fragmento funcional o variante de la misma comprende un dominio de unión que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En una realización, el polipéptido heterólogo es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD3e.

En una realización, la cadena J modificada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 (V15J) o la SEQ ID NO: 66 (J15V).

En una realización, el dominio de unión al antígeno CD20 comprende: una VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 38, y una VL que comprende una secuencia al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 42.

En una realización, el dominio de unión al antígeno CD20 comprende: una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En una realización, cada unidad de unión comprende dos cadenas pesadas de IgM, cada una de las cuales comprende un extremo amino situado en VH a la región constante de IgM, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en VL a una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina, donde las unidades de unión son idénticas, donde las cadenas pesadas de IgM en cada unidad de unión comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, y donde las cadenas ligeras de inmunoglobulina en cada unidad de unión comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.

En una realización, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20 a una potencia más alta que una cantidad equivalente de un an anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, donde el anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico es 1.5.3, que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

En una realización, la célula que expresa CD20 es un linfocito B maligno en un sujeto humano con cáncer, y donde el cáncer es una leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20.

En una realización, el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab.

En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende: un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de cadena pesada de la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la subunidad polipeptídica de la cadena pesada comprende una región constante de la cadena pesada de IgM y al menos la porción VH del anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20; un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de la cadena ligera, donde la subunidad polipeptídica de la cadena ligera comprende la porción VL del anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20, y un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J, o fragmento funcional o variante de la misma.

En un aspecto, la invención proporciona la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en el tratamiento del cáncer, donde el cáncer es una leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20, donde la molécula de unión se dirige a la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como por linfocitos T de un linfocito B maligno del cáncer, donde la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de una célula que expresa CD20 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, y donde el anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico es 1.5.3, que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

Esta descripción proporciona una molécula de unión multimérica que incluye al menos dos unidades de unión bivalentes o variantes o fragmentos de las mismas, donde cada unidad de unión incluye al menos dos regiones constantes de la cadena pesada o fragmentos de las mismas, cada una asociada con un dominio de unión a antígeno. Al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión proporcionada es un dominio de unión al antígeno CD20 que incluye las seis regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde HCDR1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 39 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; HCDR2 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 40 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; HCDR3 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 41 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; LCDR1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o la SEQ ID NO: 43 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; LCDR2 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 o la SEQ ID NO: 44 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; y LCDR3 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o la SEQ ID NO: 45 con una o dos sustituciones de un único aminoácido.

La descripción proporciona además una molécula de unión multimérica que incluye al menos dos unidades de unión bivalentes o variantes o fragmentos de las mismas, donde cada unidad de unión incluye al menos dos regiones constantes de la cadena pesada o fragmentos de las mismas, cada una asociada con un dominio de unión a antígeno. Al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión proporcionada es un dominio de unión al antígeno CD20 que incluye una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL), donde VH incluye una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 38, y la VL incluye una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 42.

En ciertos aspectos, una molécula de unión proporcionada por la descripción es una molécula de unión dimérica que incluye dos unidades de unión de IgA bivalentes o fragmentos de las mismas y una cadena J o fragmento o variante de la misma, donde cada unidad de unión incluye dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o fragmentos de las mismas, cada uno asociado con un dominio de unión a antígeno. Una molécula de unión de IgA dimérica, como se proporciona en esta invención, puede incluir además un componente secretor, o un fragmento o variante del mismo. Las regiones constantes de la cadena pesada de IgA o los fragmentos de las mismas pueden incluir cada una un dominio Ca2 o un dominio Ca3-tp y pueden, en ciertos aspectos, incluir además un dominio Ca1. En ciertos aspectos, las regiones constantes de cadena pesada de IgA pueden ser regiones constantes de IgA humana. En ciertos aspectos, cada unidad de unión incluye dos cadenas pesadas de IgA que incluyen cada una un extremo amino situado en la VH para la región constante de IgA, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que incluyen cada una un extremo amino situado en la VL para una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona una molécula de unión pentamérica o hexamérica que incluye cinco o seis unidades de unión de IgM bivalentes, respectivamente, donde cada unidad de unión incluye dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM o fragmentos de las mismas cada una asociada con un domino de unión a antígeno. Las regiones constantes de cadena pesada de IgM o los fragmentos de las mismas pueden incluir cada una un dominio C|j3 o un dominio C j4-tp y pueden, en ciertos aspectos, incluir además un dominio C|j2, un dominio Cji1 o cualquier combinación de los mismos.

Cuando la molécula de unión es pentamérica, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, o un fragmento de la misma, o una variante funcional de la misma. En ciertos aspectos, la cadena J o el fragmento de la misma incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 o un fragmento funcional de la misma. En ciertos aspectos, la cadena J o fragmento de la misma puede incluir además un polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo se puede fusionar directa o indirectamente a la cadena J o un fragmento de la misma. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo se puede fusionar indirectamente a la cadena J o un fragmento de la misma mediante un conector peptídico. En ciertos aspectos, el conector peptídico puede incluir, por ejemplo, al menos 5 aminoácidos, pero no más de 25 aminoácidos. En ciertos aspectos, el conector peptídico consiste en GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 67). El polipéptido heterólogo se puede fusionar a o cerca del extremo N de la cadena J o fragmento de la misma, el extremo C de la cadena J o fragmento de la misma, o tanto al extremo N como al extremo C de la cadena J o fragmento de la misma. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo puede incluir un dominio de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. El fragmento de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento Fv monocatenario (scFv), un fragmento Fv unido a disulfuro (sdFv), o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo se puede unir específicamente a CD3e. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la cadena J modificada puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 (V15J) o la SEQ iD NO: 66 (J15V). Además, en ciertos aspectos, estas cadenas J modificadas particulares pueden incluir además un péptido señal, donde la cadena J modificada incluye a continuación la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63 (Vl5J) o de la SEQ ID NO: 65 (J15V).

En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM son regiones constantes de la cadena pesada humanas. En ciertos aspectos, cada unidad de unión incluye dos cadenas pesadas de IgM que incluyen cada una un extremo amino situado en la VH para la región constante de IgM, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que incluyen cada una un extremo amino situado en la VL para una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.

En ciertos aspectos, al menos una unidad de unión de una molécula de unión multimérica proporcionada en esta invención incluye dos de los dominios de unión al antígeno CD20, que pueden ser iguales o diferentes. En determinados aspectos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o al menos doce copias del mismo dominio de unión al antígeno CD20.

En ciertos aspectos donde la molécula de unión es una molécula de unión de IgM, las dos cadenas pesadas de IgM dentro de al menos una unidad de unión incluyen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56.

En ciertos aspectos donde la molécula de unión incluye cadenas ligeras de inmunoglobulina, las dos regiones constantes de la cadena ligera de una unidad de unión determinada pueden ser regiones constantes lambda humanas o regiones constantes kappa humanas. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena ligera son idénticas e incluyen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.

En ciertos aspectos, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis de las unidades de unión de una molécula de unión multimérica proporcionada en esta invención son idénticas.

En ciertos aspectos, la molécula de unión como se describe anteriormente puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD-20 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que uno o más dominios de unión al antígeno CD20 de la molécula de unión. En ciertos aspectos, el anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico es 1.5.3, que incluye una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En ciertos aspectos, la célula que expresa CD-20 es una línea celular de linfoma, por ejemplo, una línea celular Ramos, una línea celular Raji, una línea celular Daudi, una línea celular Namalwa, una línea celular Granta, una línea celular Z138, una línea celular DoHH2 o una línea celular DB. En ciertos aspectos, donde la célula que expresa CD20 es una línea celular Raji, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos cuatro veces, al menos diez veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico, tal como se mide, por ejemplo, en pg/ml. En ciertos aspectos, donde la célula que expresa CD20 es una línea celular Ramos, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces o al menos 100 veces menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico, medido, por ejemplo, como equivalentes molares. En ciertos aspectos, la célula que expresa CD-20 es un linfocito B maligno en un sujeto con cáncer, por ejemplo, leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20. En ciertos aspectos, el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab. En ciertos aspectos, el sujeto es humano.

La descripción proporciona además una composición que incluye la molécula de unión como se describe anteriormente.

La descripción proporciona además un polinucleótido que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de una molécula de unión multimérica como se proporciona en esta invención. En ciertos aspectos, la descripción proporciona un polinucleótido que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de la cadena pesada de una molécula de unión multimérica como se proporciona en esta invención, donde la subunidad polipeptídica de la cadena pesada incluye una región constante de la cadena pesada de IgM o un fragmento de la misma o una región constante de la cadena pesada de IgA o fragmento de la misma, y al menos la porción VH del anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20. En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica de la cadena pesada puede incluir una región constante de IgM humana o un fragmento de la misma fusionado al extremo C de una VH que incluye (a) una HCDR1, HCDR2, HCDR3, donde la HCDR1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 39 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; la HCDR2 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 40 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; la HCDR3 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 41 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; o (b) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 38. En ciertos aspectos, el polinucleótido proporcionado puede codificar la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56. La descripción proporciona además una composición de polinucleótidos que incluye un polinucleótido como se describe.

La composición de polinucleótidos proporcionada puede incluir además, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de la cadena ligera, donde la subunidad polipeptídica de la cadena ligera incluye la porción VL del anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20. En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica de la cadena ligera puede incluir una región constante de la cadena ligera de anticuerpo humano o fragmento de la misma que se fusiona al extremo C de una VL que incluye: (a) una LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde la LCDR1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o la SEQ ID NO: 43 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; la LCDR2 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 o la SEQ ID NO: 44 con una o dos sustituciones de un único aminoácido y la LCDR3 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o la SEQ ID NO: 45 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; o (b) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90%, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 42. En ciertos aspectos, la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad polipeptídica de la cadena ligera puede codificar la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.

En ciertos aspectos de la composición de polinucleótidos proporcionada, la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad polipeptídica de la cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad polipeptídica de la cadena ligera pueden estar en vectores separados o pueden estar situadas en un único vector.

La composición de polinucleótidos proporcionada puede incluir además, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J, o un fragmento funcional de la misma, o una variante funcional de la misma. En ciertos aspectos, la cadena J o el fragmento de la misma puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 o un fragmento funcional de la misma. Asimismo, la cadena J o fragmento de la misma puede ser una cadena J modificada que además incluye un polipéptido heterólogo. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo se puede fusionar directa o indirectamente a la cadena J o un fragmento de la misma. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo puede incluir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo puede ser, por ejemplo, un scFv que se puede unir específicamente a CD3e. En ciertos aspectos, la cadena J modificada puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 (V15J) o la SEQ ID NO: 66 (J15V). En aquellos aspectos en los que la cadena J modificada comprende además un péptido señal, la cadena J modificada puede incluir la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63 (V15J) o la SEQ ID NO: 65 (J15V). En ciertos aspectos de la composición de polinucleótidos proporcionada, la secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J, o un fragmento funcional de la misma, o una variante funcional de la misma, puede incluir la SEQ ID NO: 68 o la SEQ ID NO: 69.

En ciertos aspectos de la composición de polinucleótidos proporcionada, la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad polipeptídica de la cadena pesada, la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad polipeptídica de la cadena ligera y la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena J pueden estar situadas en un único vector, o pueden estar situadas en dos o tres vectores separados. La descripción proporciona además el vector o los vectores que contienen de forma individual o colectiva la composición de polinucleótidos proporcionada. La descripción proporciona además una célula huésped que incluye el polinucleótido proporcionado, la composición de polinucleótidos proporcionada o el vector o vectores proporcionados, donde la célula huésped puede expresar una molécula de unión anti-CD20 multivalente como se proporciona en esta invención. La descripción proporciona además un procedimiento para producir la molécula de unión anti-CD20 multivalente como se proporciona en esta invención, donde el procedimiento incluye cultivar la célula huésped y recuperar la molécula de unión.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona un procedimiento para dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, donde el procedimiento incluye poner en contacto una célula que expresa CD20 con una molécula de unión multimérica como se proporciona en esta invención o una composición que incluye la molécula de unión proporcionada. Según estos aspectos, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD-20 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 como el dominio de unión al antígeno CD20. En ciertos aspectos, el anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico es 1.5.3, que incluye una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42. En ciertos aspectos, la célula que expresa CD-20 es una línea celular de linfoma, por ejemplo, una línea celular Ramos, una línea celular Raji, una línea celular Daudi, una línea celular Namalwa, una línea celular Granta, una línea celular Z138, una línea celular DoHH2 o una línea celular DB. En ciertos aspectos, la célula que expresa CD20 es una línea celular Raji y la molécula de unión dirige la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos cuatro veces, al menos diez veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico, tal como se mide, por ejemplo, en pg/ml. En ciertos aspectos, donde la célula que expresa CD20 es una línea celular Ramos, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces o al menos 100 veces menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico, medido, por ejemplo, como equivalentes molares. En ciertos aspectos, la célula que expresa CD-20 es un linfocito B maligno en un sujeto con cáncer, por ejemplo, leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20. En ciertos aspectos, el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab. En ciertos aspectos, el sujeto es un ser humano.

En otros aspectos, la descripción proporciona un procedimiento para dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, donde el procedimiento incluye poner en contacto una célula que expresa CD20 con una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica que incluye dos, cinco o seis unidades de unión bivalentes, respectivamente, donde cada unidad de unión incluye dos regiones constantes de la cadena pesada de IgA o IgM o fragmentos de las mismas y dos dominios de unión a antígeno, donde al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión al antígeno CD20, y donde la molécula de unión puede dirigir la destrucción de una célula que expresa CD-20 mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T a una mayor potencia que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20.

Según estos procedimientos proporcionados, el dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir las seis regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR³, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde la HCDR1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 2 con una o dos sustituciones de un único aminoácido; la HCDR2 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 3 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido; la HCDR3 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 4 con una, dos o tres sustituciones de un único aminoácido, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 31, el LCDR1 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 6 con una, dos o tres sustituciones de un único aminoácido; la LCDR2 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 7 con una o dos sustituciones de un único aminoácido y la LCDR3 incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 8 con una o dos sustituciones de un único aminoácido.

Según estos procedimientos proporcionados, el dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una VH y una VL que incluyen, respectivamente: (a) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5; (b) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 11; (c) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 18; (d) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 22 o la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29; (e) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 32; o (f) una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 35 y una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 37.

Según estos procedimientos proporcionados, las regiones constantes de la cadena pesada de IgA o fragmentos de las mismas de la molécula de unión pueden incluir cada una un dominio Ca2 o un dominio Ca3-tp, y una o más regiones constantes de la cadena pesada de IgA o fragmentos de las mismas pueden incluir además un dominio Ca1. En ciertos aspectos, las regiones constantes de la cadena pesada de IgA es una región constante de IgA humana. En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica según estos procedimientos proporcionados puede incluir además un componente secretor.

Según estos procedimientos proporcionados, las regiones constantes de la cadena pesada de IgM o los fragmentos de las mismas de la molécula de unión incluyen cada una un dominio C|j3 y un dominio C j4-tp y, en ciertos aspectos, pueden incluir además un dominio Cj 2, un dominio Cj 1 o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos las regiones constantes de la cadena pesada de IgM es una región constante de IgM humana.

Según estos procedimientos proporcionados, cuando la molécula de unión es pentamérica, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, o un fragmento funcional de la misma, o una variante funcional de la misma. En ciertos aspectos, la cadena J o el fragmento de la misma incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 o un fragmento funcional de la misma. En ciertos aspectos, la cadena J o fragmento de la misma puede incluir además un polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo se puede fusionar directa o indirectamente a la cadena J o un fragmento de la misma. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo se puede fusionar indirectamente a la cadena J o un fragmento de la misma mediante un conector peptídico. En ciertos aspectos, el conector peptídico puede incluir, por ejemplo, al menos 5 aminoácidos, pero no más de 25 aminoácidos. En ciertos aspectos, el conector peptídico consiste en GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 67). El polipéptido heterólogo se puede fusionar a o cerca del extremo N de la cadena J o fragmento de la misma, el extremo C de la cadena J o fragmento de la misma, o tanto al extremo N como al extremo C de la cadena J o fragmento de la misma. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo puede incluir un dominio de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. El fragmento de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento Fv monocatenario (scFv), un fragmento Fv unido a disulfuro (sdFv), o cualquier combinación de los mismos. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo se puede unir específicamente a CD3e. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la cadena J modificada puede incluir la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 64 (V15J) o la SEQ ID NO: 66 (Jl5V). Asimismo, en ciertos aspectos, estas cadenas J modificadas particulares pueden incluir además un péptido señal, donde la cadena J modificada incluye a continuación la secuencia SEQ ID NO: 63 (V15J) o la SEQ ID NO: 65 (J15V).

Según estos procedimientos proporcionados, cada unidad de unión de la molécula de unión puede incluir dos cadenas pesadas de IgA o IgM que incluyen cada una un extremo amino situado en la VH para la región constante de IgA o IgM, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que incluyen cada una un extremo amino situado en la VL para una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina. En ciertos aspectos, al menos una unidad de unión de la molécula de unión incluye dos dominios de unión al antígeno CD20 idénticos, y donde las dos cadenas pesadas de IgA o IgM dentro de la al menos una unidad de unión son idénticas. En algunos aspectos, las dos cadenas pesadas de IgM dentro de al menos una unidad de unión incluyen la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52. En algunos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena ligera son regiones constantes lambda humanas o regiones constantes kappa humanas que pueden ser idénticas e incluyen la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54.

Según estos procedimientos proporcionados, la molécula de unión puede incluir al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o al menos doce dominios de unión al antígeno CD20 que, en ciertos aspectos, pueden ser idénticos. Según estos procedimientos proporcionados, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis de las unidades de unión dentro de la molécula de unión pueden ser idénticas.

Según estos procedimientos proporcionados, el anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico de referencia puede ser rituximab, que incluye una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

Según estos procedimientos proporcionados, la célula que expresa CD-20 puede ser una línea celular de linfoma, por ejemplo, una línea celular Ramos, una línea celular Raji, una línea celular Daudi, una línea celular Namalwa, una línea celular Granta, una línea celular Z138, una línea celular DoHH2 o una línea celular DB. En ciertos aspectos donde la línea celular es una línea celular Granta, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de la línea celular a aproximadamente seis veces la potencia de rituximab. En ciertos aspectos donde la línea celular es una línea celular Raji o la línea celular Ramos, y donde la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de la línea celular a aproximadamente tres veces la potencia de rituximab.

Según estos procedimientos proporcionados, la célula que expresa CD-20 puede ser un linfocito B maligno en un sujeto con cáncer, por ejemplo, leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20. En ciertos aspectos, el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab. En ciertos aspectos, el sujeto es humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

FIGURA 1: El diagrama molecular de la molécula CD20. La CD20 es una proteína transmembrana tetraspanina que permanece predominantemente en la membrana de los linfocitos B sin internalización tras la unión al anticuerpo. Se indican los sitios de unión de los anticuerpos monoclonales contra CD20, rituximab y ofatumumab. Se incluye un diagrama lineal de CD20 para mostrar la orientación de la transmembrana (TM), los dominios extracelulares (DEC) y las regiones citoplasmáticas.

FIGURA 2: Diagramas esquemáticos de IgG, hexámero de IgM y pentámero de IgM. La IgG se muestra como una proteína de 150 kDa con las cadenas ligeras y pesadas indicadas. La IgM que incluye una cadena J se indica como un pentámero de aproximadamente 915 kDa. La IgM sin una cadena J se muestra como un hexámero que tiene un peso molecular de aproximadamente 1080 kDa.

FIGURA 3: SDS-PAGE no reductora de IgG e IgM. Los anticuerpos IgG e IgM contra CD20 basados en rituximab se procesan en electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada SDS no reductora. El primer y último carril son estándares de peso molecular. Los anticuerpos IgGI murinos y humanos (segundo y tercer carril, respectivamente) presentan pesos moleculares de aproximadamente 150 kDa. La IgM la versión de la cadena J (un anticuerpo IgM contra CD20 comercialmente disponible de Invivogen) presenta un peso molecular de aproximadamente 1050 kDa (cuarto carril). El anticuerpo anti-CDIM IGM-55.5 (véase la publicación PCT n.° WO 2013/120012) (quinto carril) se incluye como otra IgM para comparar.

FIGURA 4: Ensamblaje de oligómeros de IgM anti-CD20. La SDS-PAGE no reductora muestra que los anticuerpos anti-CD20 que comprenden los dominios variables de rituximab y 1.5.3 se pueden ensamblar como IgM. La IgM rituximab se muestra en el primer panel sin cadena J (carril 2) y con cadena J (carril 3). La IgM de 1,5.3 se muestra en el primer panel sin cadena J (carril 2) y con cadena J (carril 3).

FIGURA 5A: Resultados de ELISA que muestran la unión de la IgM 1.5.3 y la IgG 1.5.3 a CD20 a una densidad de antígeno alta (10 pg/ml).

FIGURA 5B: Resultados de ELISA que muestran la unión de la IgM 1.5.3 y la IgG 1.5.3 a CD20 a una densidad de antígeno baja (0,3 pg/ml).

FIGURA 6A-E La IgM anti-CD20 es más potente que la IgG anti-CD20 a una citotoxicidad dependiente del complemento. Se incubaron células de linfoma o leucemia humanas cultivadas con IgM o IgG anti-CD20 disponibles comercialmente más complemento humano al 10 %. La viabilidad celular se midió después de 4 horas usando un tinte indicador metabólico (CCK8). En la mayoría de las líneas celulares de linfoma (Granta (Figura 6A), Raji (Figura 6B) y Ramos (Figura 6C)), el isotipo IgM anti-CD20 era más potente que el isotipo IgG correspondiente, en presencia de complemento. A modo de comparación, el ensayo también se llevó a cabo en células Namalwa (Figura 6E), que presentan una expresión mínima de CD20, y células Nalm-6n (Figura 6D), que carecen de expresión de CD20.

FIGURA 7: La IgM anti-CD20 es más potente que el rituximab en la citotoxicidad dependiente del complemento en la línea celular Raji medida en un base en pg/ml.

FIGURA 8A-B: La IgM anti-CD20 es más eficaz que el rituximab y la IgG 1.5.3 en la citotoxicidad dependiente del complemento. Las células Ramos se incubaron con concentraciones crecientes de IgM o IgG anti-CD20 y complemento humano al 10 %. La viabilidad celular se midió después de 4 horas. La Figura 8A compara rituximab (IgG) y una IgM similar rituximab cadena J. La Figura 8B compara 1.5.3 (IgG), IgM 1.5.3 y IgM 1.5.3 cadena J. Las tablas de cada panel muestran los resultados de CE50 en concentraciones molares.

FIGURA 9: Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de IgGI rituximab (círculos abiertos), IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab cadena J (círculos cerrados), IgGI 1.5.3 (cuadrados abiertos) y IgM 1.5.3 anti-CD20 J (cuadrados cerrados) en células DOHH2 y Z138.

FIGURA 10: Caracterización de anticuerpos IgM 1.5.3 mediante electroforesis en gel y inmunoelectrotransferencia. Clave de carril: 1: Marcador; 2: IgM 1.5.3 V15J; 3: IgM 1.5.3 J de tipo natural; 4: 1.5.3 IgM (hexámero); 5: Marcador. La Figura 10A muestra las formas de hexámero y pentámero en un gel híbrido. La Figura 10B muestra los anticuerpos resueltos por SDS-PAGE no reductora. La Figura 10C muestra los anticuerpos resueltos mediante SDS-PAGE reductora. El gel en la Figura 10C se transfirió a una membrana y se detectó la cadena J mediante inmunoelectrotransferencia, que se muestra en la Figura 10D.

FIGURA 11: IgM 1.5.3 V15J (cuadrados cerrados) provoca la activación de linfocitos T en un cocultivo de células CD20 RPMI8226 y linfocitos T Jurkat manipulados genéticamente en mayor medida que blinatumomab (círculos cerrados) o IgM 1.5.3 J de tipo natural (cuadrados abiertos).

FIGURA 12: Activación de linfocitos T por IgM 1.5.3 V15J en función de la expresión de CD20 usando una serie de líneas de células tumorales, cada una de las cuales expresa un nivel diferente de antígeno CD20 (expresado como intensidad de fluorescencia media o IFM).

FIGURA 13: Destrucción de células tumorales en sangre humana usando el ensayo de detección KILR™. Clave: diamantes: IgM 1.5.3 V15J; cuadrados: IgM 1.5.3 J de tipo natural; círculos cerrados: IgG 1.5.3; círculos abiertos IgG Rituxan; triángulos: blinatumomab.

FIGURA 14A-B: Destrucción de linfocitos B dirigidos a linfocitos Tin vivo en ratones NSG injertados con células CD34 para generar un sistema hematopoyético humano. Se dosificó a los ratones con IgM 1.5.3 monoespecífica o biespecífica y se midió el número de linfocitos B humanos antes y 6 horas después de la administración.La Figura 14A muestra los resultados para el anticuerpo monoespecífico con cadena J de tipo natural, y la Figura 14B muestra los resultados del biespecífico para la cadena J de anti-CD3 V15J.

FIGURA 15: Comparación de la destrucción y recuperación de linfocitos B (10 días después de la dosis) entre 1.5.3 V15J (fila superior) y rituximab (fila inferior).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

El término "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "una molécula de unión" representa una o más moléculas de unión. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno(a) o más" y "al menos uno(a)" se pueden usar de manera indistinta en esta invención.

Además, "y/o" donde se usa en esta invención debe tomarse como una descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por consiguiente, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A y/o B" en esta invención, incluya "A y B", "A o B", "A" (sola) y "B" (sola). De manera similar, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C" abarque cada una de las siguientes realizaciones: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (sola); B (sola); y C (sola).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entendería comúnmente un experto en la técnica a la que se refiere esta descripción. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; elConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y elOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a una experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta descripción.

A menos que se especifique lo contrario, las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. Los encabezados proporcionados en esta invención no limitan los varios aspectos o relaciones de la descripción, los cuales pueden estar vinculados a la memoria descriptiva en su totalidad como referencia. Por consiguiente, los términos definidos a continuación se definen más pormenorizadamente a modo de referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Como se usa en esta invención, el término "polipéptido" pretende abarcar un único "polipéptido", así como varios "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos de manera lineal por enlaces de amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por consiguiente, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en vez de, o de manera indistinta con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende hacer referencia a los productos de modificaciones post-expresión del polipéptido, incluyendo, entre otros, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación y derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología de recombinación, pero no es necesariamente traducido a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier forma, incluyendo síntesis química.

Un polipéptido, como se describe en esta invención, puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tengan necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que adoptan una gran cantidad de diferentes conformaciones, se denominan no plegados. Como se usa en esta invención, el término glucoproteína se refiere a una proteína acoplada al menos a un resto carbohidrato que está unido a la proteína a través de una cadena lateral que contiene oxígeno o nitrógeno de un aminoácido, por ejemplo, una serina o una asparagina.

Por polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede retirarse de su entorno original o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados como se describe en esta invención, al igual que los polipéptidos naturales o recombinantes que han sido separados, fraccionados, o parcial o sustancialmente purificados por cualquier técnica adecuada.

Como se usa en esta invención, el término "un polipéptido de origen no natural" o cualquier variante gramatical del mismo, es una definición condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye, aquellas formas del polipéptido que son, o podrían ser, determinadas o interpretadas por un juez u organismo administrativo o judicial como "de origen natural".

Otros polipéptidos descritos en esta invención son fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo", como se describen en esta invención, incluyen cualquier polipéptido que retenga al menos algunas de las propiedades del correspondiente anticuerpo o polipéptido natural, por ejemplo, que se una específicamente a un antígeno. Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos, así como también fragmentos de deleción, además de fragmentos de anticuerpo específicos descritos en otro punto en esta invención. Las variantes de, por ejemplo, un polipéptido incluyen fragmentos como se ha descrito anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. En ciertos aspectos, las variantes pueden ser de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, eliminaciones o adiciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. Los derivados son polipéptidos que han sido alterados para presentar características adicionales que no se encuentran en el polipéptido original. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Las variantes de polipéptidos también pueden denominarse en esta invención "análogos de polipéptidos". Como se usa en esta invención, un "derivado" de un polipéptido también puede hacer referencia al polipéptido de un sujeto que tiene uno o más aminoácidos químicamente derivados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina se puede sustituir con prolina, la 5-hidroxilisina se puede sustituir con lisina; la 3-metilhistidina se puede sustituir con histidina; la homoserina se puede sustituir con serina; y la ornitina se puede sustituir con lisina.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la que un residuo de aminoácido se remplaza con otro residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. Las familias de aminoácidos que pueden estar sustituidos en el polipéptido incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una tirosina con una fenilalanina es una sustitución conservadora. En determinadas realizaciones, las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la descripción no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al antígeno al que se une la molécula de unión. En la técnica, se conocen procedimientos para identificar sustituciones conservadores de nucleótidos y aminoácidos (véase, por ejemplo, Brummell y col., Biochem. 32: 11801 187 (1993); Kobayashi y col., Protein Eng. 12(10):879884 (1999); y Burks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:.412417 (1997)).

El término "polinucleótido" pretende incluir un único ácido nucleico, así como varios ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aisladas, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace de amida, tal como el encontrado en ácidos nucleicos peptídicos (ANP)). Los términos "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" hacen referencia a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende cualquier forma del ácido nucleico o polinucleótido que se separa de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido purificado en gel o un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se consideraría "aislado". Además, un segmento polinucleotídico, por ejemplo, un producto de PCR, que se ha manipulado genéticamente para tener sitios de restricción para la clonación, se considera "aislado". Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en una solución no natural como un tampón o un suero. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos, donde la transcripción no es una que se encontraría en la naturaleza. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento de regulación, tal como un promotor, sitio de unión a ribosomas, o un terminador de la transcripción.

Como se usa en esta invención, el término "un polipéptido de origen no natural" o cualquier variante gramatical del mismo, es una definición condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye, aquellas formas del ácido nucleico o polinucleótido que son, o podrían ser, determinadas o interpretadas por un juez u organismo administrativo o judicial como "de origen natural".

Como se usa en esta invención, una "región codificante" es una porción del ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualesquiera secuencias flanqueantes, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores de transcripción, intrones y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones de codificación pueden estar presentes en una construcción de un único polinucleótido, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico puede incluir regiones de codificación heterólogas, fusionadas o no fusionadas a otra región de codificación. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, entre otras, aquellas que codifican elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, está asociada con una o más secuencias reguladoras de tal forma como para poner la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) están "asociados de manera operativa" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto génico o interfiere con la capacidad de la plantilla de ADN de transcribirse. Por consiguiente, una región promotora estaría asociada de manera operativa con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de células que dirige la transcripción sustancial del ADN en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción además del promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden estar asociados de forma operativa con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de células.

Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de transcripción que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero no se limitan a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovino y p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocina (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

De manera similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y terminación de traducción y elementos que provienen de picornavirus (en particular, un sitio de entrada a ribosoma interno, o IRES, también llamado secuencia CITE).

En otras realizaciones, un polinucleótido puede ser ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia o ARN ribosómico.

Las regiones de codificación de polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden estar asociadas con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido como se describe en esta invención. Según la hipótesis de las señales, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se inició la exportación de la cadena de proteínas de crecimiento a lo largo del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos en la técnica son conscientes de que los polipéptidos secretados por células vertebradas pueden tener un péptido de señal fusionado al extremo extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir un forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas realizaciones, se usa el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que se asocia operativamente con el mismo. Como alternativa, se puede usar un péptido señal heterólogo de mamífero, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural puede estar sustituida por la secuencia líder de activador de plasminógeno de tejido humano (APT) o p-glucuronidasa de ratón.

Como se usa en esta invención, el término "CD20" se refiere a una proteína de membrana expresada en la superficie de los linfocitos B. En la bibliografía, se hace referencia a la proteína CD20 con otros nombres, por ejemplo, antígeno de linfocitos B CD20, antígeno de superficie celular de linfocitos B B1, Bp35, CVID5, LEU-16, miembro 1 de la subfamilia A de 4 dominios transmembrana, o MS4A2. La secuencia de aminoácidos de la CD20 humana (n.° de acceso de GenBank NP_690605.1) se describe en esta invención como la SEQ ID NO: 50 (Tabla 2).

En esta invención, se describen ciertas moléculas de unión, o fragmentos, variantes o derivados de las mismas que se unen a antígenos. A menos que se refiera específicamente a anticuerpos de tamaño completo, el término "molécula de unión" comprende anticuerpos de tamaño completo así como también subunidades, fragmentos, variantes, análogos o derivados de dichos anticuerpos de unión al antígeno, por ejemplo, moléculas de anticuerpos manipuladas genéticamente o fragmentos que se unen a un antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpos, pero que usen un andamiaje diferente.

Como se usa en esta invención, el término "molécula de unión" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a una diana o determinante molecular, por ejemplo, un epítopo o un determinante antigénico. Como se describe además en esta invención, una molécula de unión puede comprender uno o más de los "dominios de unión a antígeno" descritos en esta invención. Un ejemplo no limitante de una molécula de unión es un anticuerpo o fragmento del mismo que retiene la unión específica al antígeno.

Como se usan en esta invención, los términos "dominio de unión" o "dominio de unión a antígeno" se refieren a una región de una molécula de unión que es suficiente para unirse específicamente a un epítopo. Por ejemplo, un "Fv", por ejemplo, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de un anticuerpo, ya sea como dos subunidades polipeptídicas separadas o como una única cadena, se considera un "dominio de unión". Otros dominios de unión a antígeno incluyen, sin limitación, la cadena pesada variable (VHH) de un anticuerpo derivado de una especie de camélido o seis regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina (CDR) expresadas en un andamiaje de fibronectina. Una "molécula de unión", como se describe en esta invención, puede incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más "dominios de unión a antígeno".

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se pueden usar de manera indistinta en esta invención. Un anticuerpo (o un fragmento, variante o derivado del mismo, como se describe en esta invención) incluye al menos el dominio variable de una cadena pesada (para especies de camélidos) o al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas vertebrados se comprenden relativamente bien; véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988). A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" abarca cualquier cosa, desde un pequeño fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo hasta un anticuerpo de tamaño completo, por ejemplo, un anticuerpo IgG que incluye dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, un anticuerpo IgA que incluye cuatro cadenas pesadas completas y cuatro cadenas ligeras completas y puede incluir una cadena J y/o un componente secretor, o un anticuerpo IgM que incluye diez o doce cadenas pesadas completas y diez o doce cadenas ligeras completas y puede incluir una cadena J.

Como se analizará en más detalle a continuación, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, m, a, 8, e), con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-y4 o a1-a2)). Es la naturaleza de esta cadena la que determina el "isotipo" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (subtipos) por ejemplo, IgGi, IgG², IgG3, IgG4, IgAi, IgA², etc. están bien caracterizadas y se sabe que otorgan especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas inmunoglobulinas son fácilmente discernibles para el experto en la técnica habida cuenta de la presente descripción y, por consiguiente, se encuentran dentro del alcance de esta descripción.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces covalentes disulfuro o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son expresadas, por ejemplo, por hibridomas, linfocitos B o células huéspedes manipuladas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos transcurren desde el extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y al extremo C al final de cada cadena. La estructura básica de ciertos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos IgG, incluye dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera conectados covalentemente mediante enlaces disulfuro para formar una estructura "Y", también denominada en esta invención estructura "H2L2" o "unidad de unión".

El término "unidad de unión" se usa en esta invención para referirse a la porción de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que corresponde a una estructura de inmunoglobulina estándar, es decir, dos cadenas pesadas o fragmentos de las mismas y dos cadenas ligeras o fragmentos de las mismas. En ciertos aspectos, por ejemplo, cuando la molécula de unión es un anticuerpo IgG bivalente o un fragmento de unión a antígeno del mismo, los términos "molécula de unión" y "unidad de unión" son equivalentes. En otros aspectos, por ejemplo, cuando la molécula de unión es un dímero de IgA, un pentámero de IgM o un hexámero de IgM, la molécula de unión comprende dos o más "unidades de unión". Dos en el caso de un dímero de IgA, o cinco o seis en el caso de un pentámero o hexámero de IgM, respectivamente. Una unidad de unión no necesita incluir cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de longitud completa, pero típicamente será bivalente, es decir, incluirá dos "dominios de unión a antígeno", como se define a continuación. Ciertas moléculas de unión proporcionadas en esta descripción son diméricas, pentaméricas o hexaméricas e incluyen dos, cinco o seis unidades de unión bivalentes que incluyen regiones constantes de IgA o IgM o fragmentos de las mismas. Como se usa en esta invención, una molécula de unión que comprende dos o más, por ejemplo, dos, cinco o seis unidades de unión, se denomina "multimérica".

El término "cadena J de secuencia natural" o "cadena J natural", tal como se usa en esta invención, se refiere a la cadena J de los anticuerpos de IgM o IgA de secuencia natural de cualquier especie de animal, que incluye la cadena J humana madura, la secuencia de aminoácidos que se presenta como la SEQ ID NO: 49.

El término "cadena J modificada" se usa en esta invención para referirse a polipéptidos de cadena J de secuencia natural que comprenden un resto heterólogo, por ejemplo, un polipéptido heterólogo, por ejemplo, un dominio de unión extraño introducido en la secuencia natural. La introducción se puede lograr mediante cualquier medio, que incluye la fusión directa o indirecta del polipéptido heterólogo u otro resto mediante la unión a través de un péptido o conector químico. El término "cadena J humana modificada" abarca, sin limitación, una cadena J humana de secuencia natural de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 o un fragmento funcional de la misma modificado mediante la introducción de un resto heterólogo, por ejemplo, un polipéptido heterólogo, por ejemplo, un dominio de unión extraño. En ciertos aspectos, el resto heterólogo no interfiere con la polimerización eficaz de IgM en un pentámero o IgA en un dímero y la unión de tales polímeros a una diana. Se pueden encontrar ejemplos de cadenas J modificadas, por ejemplo, en la publicación PCT n.° WO 2015/153912.

Los términos "valencia", "bivalente", "multivalente" y equivalentes gramaticales se refieren al número de dominios de unión a antígeno en una molécula de unión o unidad de unión dados. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" con respecto a una molécula de unión dada, por ejemplo, un anticuerpo IgM o fragmento del mismo, denotan la presencia de dos dominios de unión a antígeno, cuatro dominios de unión a antígeno y seis dominios de unión a antígeno, respectivamente. En una molécula de unión derivada de IgM típica, donde cada unidad de unión es bivalente, la molécula de unión en sí misma puede tener 10 o 12 valencias. En una molécula de unión derivada de IgA típica, donde cada unidad de unión es bivalente, la molécula de unión en sí misma puede 4 valencias. Una molécula de unión bivalente o multivalente puede ser monoespecífica, es decir, todos los dominios de unión a antígeno son iguales, o pueden ser biespecífica o multiespecífica, por ejemplo, cuando dos o más dominios de unión a antígeno son diferentes, por ejemplo, se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno, o se unen a antígenos completamente diferentes.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante molecular capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En ciertos aspectos, un epítopo puede incluir agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo y, en ciertos aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana que está unida por un anticuerpo.

"Anticuerpos o moléculas de unión multiespecíficas" o "anticuerpos o moléculas de unión biespecíficas" se refieren a moléculas de unión, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la misma diana o en una o más dianas diferentes. "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unión de un único epítopo.

El término "diana" se usa en el sentido más amplio para incluir sustancias que pueden unirse mediante una molécula de unión. Una diana puede ser, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido u otra molécula. Asimismo, una "diana" puede ser, por ejemplo, una célula, un órgano o un organismo que comprende un epítopo unido que puede estar unido por una molécula de unión.

Tanto la cadena ligera como la pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. A este aspecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera variable (VL) y pesada variable (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 o CH4) confieren propiedades biológicas tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Como convención, la numeración de los dominios de región constante aumenta a medida que se alejan más del sitio de unión a antígeno o del extremo amino del anticuerpo. La porción de extremo N es una región variable y la porción de extremo C es una región constante; los dominios CH3 (o CH4 en el caso de la IgM) y CL están en el extremo carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Una "cadena pesada de anticuerpo IgM de longitud completa" es un polipéptido que incluye, en la dirección de extremo N a extremo C, un dominio variable de la cadena pesada (V^h) de anticuerpo, un dominio 1 constante de la cadena pesada constante de anticuerpo (CM1 o C|^j1), un dominio 2 constante de la cadena pesada de anticuerpo (CM2 o C|^j2), un dominio 3 constante de la cadena pesada de anticuerpo (CM3 o Cj 3) y un dominio 4 constante de la cadena pesada de anticuerpo (CM4 o Cj 4) que puede incluir una pieza de cola.

Una "cadena pesada de anticuerpo IgA de longitud completa" es un polipéptido que incluye, en la dirección de extremo N a extremo C, un dominio variable de la cadena pesada (V^h) de anticuerpo, un dominio 1 constante de la cadena pesada constante de anticuerpo (CA1 o Ca1), un dominio 2 constante de la cadena pesada de anticuerpo (CA2 o Ca2) y un dominio 3 constante de la cadena pesada de anticuerpo (CA3 o Ca3) que puede incluir una pieza de cola. La estructura de la IgA monomérica y secretora se describe, por ejemplo, en Woof, JM y Russell, MW, Mucosal Immunology 4:590-597 (2011).

Como se indicó anteriormente, una región variable (es decir, el "dominio de unión a antígeno") permite que una molécula de unión reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el domino VL y el dominio VH (o solo un dominio VH para los anticuerpos de camélidos o condrictoides (denominados VHH)), o la subunidad de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se pueden combinar para formar el dominio de unión a antígeno. Más específicamente, un dominio de unión a antígeno se puede definir por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL (o 3 CDR en un VHH). Ciertos anticuerpos forman estructuras más grandes. Por ejemplo, la IgA puede formar una molécula que incluye dos unidades de unión a H2L2, una cadena J y un componente secretor, conectados covalentemente mediante enlaces disulfuro, que pueden asociarse además con un componente secretor, y la IgM puede formar una molécula dimérica, pentamérica o hexamérica que incluye dos, cinco o seis unidades de unión a H2L2 y, opcionalmente, una cadena J conectada covalentemente mediante enlaces disulfuro.

Las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR", presentes en un dominio de unión a antígeno del anticuerpo, son secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos que se colocan específicamente para formar el dominio de unión a antígeno a medida que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión a antígeno, a los que se hace referencia como regiones "estructurales", muestra menos variabilidad intermolecular. Las regiones estructurales adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina p. Por tanto, las regiones estructurales actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de las CDR en una orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo análogo. Los aminoácidos que conforman las CDR y las regiones estructurales, respectivamente, se pueden identificar fácilmente por un experto en la técnica para determinar cualquier región variable de la cadena pesada o ligera dada, debido a que se han definido de varias maneras diferentes (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., y col, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901917 (1987)).

En el caso en que se usen y/o acepten en la técnica dos o más definiciones de un término, la definición del término como se usa en esta invención pretende incluir todos estos significados, a menos que se indique explícitamente otra cosa. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de tanto los polipéptidos de cadenas pesadas como ligeras. Estas regiones particulares han sido descritas, por ejemplo, por Kabat y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.Uu ., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Las definiciones de Kabat y Chothia incluyen superposición o subunidades de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de ya sea la definición (u otras definiciones conocidas para los expertos en la técnica) para referirse a una CDR de un anticuerpo o una variante del mismo, pretende estar dentro del alcance del término, como se define y se usa en esta invención, a menos que se indique lo contrario. Los aminoácidos adecuados que incluyen las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la Tabla 1 a modo de comparación. Las cantidades exactas de aminoácido que incluyen una CDR en particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar de manera rutinaria cuáles aminoácidos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1 Definiciones de CDR*

Los dominios variables de inmunoglobulina también se pueden analizar, por ejemplo, usando el sistema de información IMGT (www://imgt.cines.fr/) (IMGT®/V-Quest) para identificar segmentos de regiones variables, incluidas las CDR. Véase, por ejemplo, Brochet, X. y col., Nucl. Acids Res. 36:W503-508 (2008).

Kabat y col. también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que se aplica a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar sin ambigüedad este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia.

Como se usa en esta invención, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat y col., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Sin embargo, a menos que se indique explícitamente el uso del sistema de numeración de Kabat, se usa una numeración consecutiva para las secuencias de aminoácidos en esta descripción.

Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos, humanizados o quiméricos, fragmentos de unión a epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')², Fd, Fvs, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados a disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, fragmentos producidos mediante una genoteca de expresión de Fab. Las moléculas ScFv se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5.892.019.

La expresión "se une de manera específica", en general, significa que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo se une a un epítopo a través de su dominio de unión al antígeno y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que una molécula de unión se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio, no relacionado. El término "especificidad" se usa en esta invención para calificar la afinidad relativa mediante la cual una determinada molécula de unión se une un epítopo dado. Se puede considerar, por ejemplo, que la molécula de unión "A" puede tener una mayor especificidad para un epítopo dado que la molécula de unión "B", o se puede decir que la molécula de unión "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene por el epítopo "D" relacionado.

Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, descrito en esta invención, se une a un antígeno diana con una tasa de disociación (k(off)) menor o igual a 5 X 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 X 10-3 s-1, 10-3 s-1, 5 X 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 X 10-5 s-1 o 10-5 s-15 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 o 10-7 s-1.

Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado descrito en esta invención se une a un antígeno diana con una tasa de asociación (k(on)) mayor o igual a 103 M-1 s-1, 5 X 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1, 5 X 104 M-1 s-1, 105 M-1 s-1, 5 X 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5 X 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1.

Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente al epítopo hasta el punto que bloquea, en cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia o el fragmento de unión a antígeno con el epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Puede decirse que una molécula de unión inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo de referencia o el fragmento de unión a antígeno con un epítopo dado en al menos un 90, 80, 70, 60 o al menos un 50 %.

Tal como se usa en esta invención, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con uno o más dominios de unión a antígeno, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988) en las páginas 27-28. Como se usa en esta invención, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de dominios de unión a antígeno y un antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se refiere tanto a la afinidad de los dominios de unión a antígeno individuales en la población con epítopos específicos, como también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo de alta repetición, tal como un polímero, sería una de alta avidez. Una interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente con un receptor presente a una alta densidad en una superficie celular también sería de gran avidez.

Las moléculas de unión o los fragmentos de unión a antígeno, las variantes o derivados de los mismos, como se describe en esta invención, también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en esta invención, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo que es específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medición de la relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Por consiguiente, una molécula de unión tiene reactividad cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo con reactividad cruzada generalmente contiene muchas de las características estructurales de complementariedad como el epítopo inductor, y en algunos casos, puede ajustarse realmente mejor que el original.

Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, una variante o derivado del mismo también puede describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un antígeno. Por ejemplo, una molécula de unión puede unirse a un antígeno con una constante de disociación o Kd no mayor de 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-1° M, 10-1° M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M o 10-15 M.

Los fragmentos de anticuerpos que incluyen anticuerpos de cadena simple u otros dominios de unión a antígeno pueden existir solos o en combinación con uno o más de los siguientes: región de bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, cadena J o componente secretor. También se incluyen fragmentos de unión a antígeno que pueden comprender cualquier combinación de una o más regiones variables con una o más regiones bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, una cadena J o un componente secretor. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, cobaya, camello, llama, caballo o pollo. En otra realización, la región variable puede tener un origen condrictoide (por ejemplo, de tiburones). Como se usa en esta invención, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de genotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y, en algunos casos, pueden expresar inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe infra y, por ejemplo, en la Patente de los EE. UU. n.° 5.939.598 de Kucherlapati y col.

Como se usa en esta invención, el término "subunidad de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una subunidad de cadena pesada puede incluir al menos uno de los siguientes: un dominio VH, un dominio CH1, una bisagra (por ejemplo, una región de bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4 o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede incluir, sin limitación, además de un dominio VH:, un dominio CH1; un dominio CH1, una bisagra y un dominio CH2; un dominio CH1 y un dominio CH3; un dominio CH1, una bisagra y un dominio CH3; o un dominio CH1, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En ciertos aspectos, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo puede incluir, además de un dominio VH, un dominio CH3 y un dominio CH4; o un dominio CH3, un dominio CH4 y una cadena J. Además, una molécula de unión para su uso en la descripción puede carecer de ciertas porciones de región constante, por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2. Un experto en la técnica entenderá que estos dominios (por ejemplo, las subunidades de cadena pesada) se pueden modificar de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina original.

Como se usa en esta invención, el término "subunidad de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. La subunidad de cadena ligera incluye al menos una VL, y puede incluir además un dominio CL (por ejemplo, Ck o CA).

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, pueden describirse o especificarse en términos del/de los epítopo(s) o porción/porciones de un antígeno que reconocen o con el que se unen específicamente. La porción de un antígeno diana que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es un "epítopo" o un "determinante antigénico". Un antígeno diana puede comprender un único epítopo o al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier cantidad de epítopos, dependiendo del tamaño, la conformación y el tipo de antígeno.

Como se usa en esta invención, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol.

Tal como se usa en esta invención, la expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que el sitio o región inmunorreactiva se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, ser parcial o modificada) se obtiene de una segunda especie. En algunas realizaciones, la región o sitio de unión a la diana será de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante será humana.

Los términos "anticuerpo multiespecífico" o "anticuerpo biespecífico" se refieren a un anticuerpo que tiene dominios de unión a antígeno para dos o más epítopos diferentes dentro de una única molécula de anticuerpo. Se pueden construir otras moléculas de unión además de la estructura de anticuerpos canónicos con dos especificidades de unión. La unión del epítopo por anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden construir por medios recombinantes. (Strohlein y Heiss, Future Oncol. 6:138794 (2010); Mabry y Snavely, IDrugs. 13:5439 (20l0)). Un anticuerpo biespecífico también puede ser un diacuerpo.

Como se usa en esta invención, "anticuerpo manipulado genéticamente" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en la cadena pesada o ligera, o en ambas, se altera mediante al menos un reemplazo parcial de uno o más aminoácidos ya sea en la región de CDR o de región estructural. En ciertos aspectos, las CDR completas de un anticuerpo de especificidad conocida pueden injertarse en las regiones estructurales de un anticuerpo heterólogo. Aunque las CDR alternativas pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o, incluso, de una subclase, como el anticuerpo a partir del cual derivan las regiones estructurales, las CDR también pueden derivarse de un anticuerpo de una clase diferente, por ejemplo, de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo manipulado genéticamente en el que una o más CDR "donantes" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injerta en una región estructural de cadena pesada o ligera humana en esta invención se denomina "anticuerpo humanizado". En ciertos aspectos, no todas las CDR se reemplazan con las CDR completas de la región variable del donante y, sin embargo, la capacidad de unión a antígeno del donante todavía puede transferirse a los dominios variables del receptor. Dadas las explicaciones expuestas en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.585.089, 5.693.761,5.693.762 y 6.180.370, llevar a cabo la experimentación habitual o de ensayo y error para obtener un anticuerpo funcional manipulado genéticamente o humanizado será parte de la competencia de los expertos en la técnica.

Como se usa en esta invención, el término "manipulado genéticamente" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas).

Como se usa en esta invención, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" u otros equivalentes gramaticales se pueden usar indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes adicionales, por cualquier medio incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión dentro de la estructura" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta de polinucleótido (ORF) para formar un ORF más largo continuo, de manera que se mantenga el marco de lectura traduccional correcto de los ORF originales. Por consiguiente, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace continuo, por consiguiente, en todos los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, en una secuencia de enlazador en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, dentro del marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región estructural de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" se traduzcan conjuntamente como parte de un polipéptido continuo.

En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección amino o carboxiterminal en la que los aminoácidos que están próximos entre sí en la secuencia son consecutivos en la estructura primaria del polipéptido. Una porción de un polipéptido que es "extremo amino" o "extremo N" para otra porción de un polipéptido es que esa porción que viene antes en la cadena del polipéptido secuencial. De manera similar, una porción de un polipéptido que es "extremo carboxi" o "extremo C" para otra porción de un polipéptido es que esa porción que viene después en la cadena del polipéptido secuencial. Por ejemplo, en un anticuerpo típico, el dominio variable es "extremo N" para la región constante, y la región constante es "extremo C" para el dominio variable.

El término "expresión", como se usa en esta invención, se refiere a un procedimiento por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluyendo, sin limitación, la atenuación génica, así como también la expresión transitoria y la expresión estable. El mismo incluye, entre otras, la transcripción del gen a un ARN, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), y la traducción de dicho ARNm en polipéptido(s). Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y de cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se usa en esta invención, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce de una transcripción. Los productos génicos descritos en esta invención incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones posteriores a la transcripción, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones posteriores a la traducción, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteína, escisión proteolítica y similares.

Los términos tales como "tratar", "tratamiento" o "aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, ralentizan, reducen los síntomas y/o detienen la evolución de una afección o un trastorno patológico diagnosticado. Los términos como "prevenir", "prevención", "evitar", "disuasión" y similares se refieren a medidas profilácticas o preventivas que evitan el desarrollo de una afección o trastorno patológico no diagnosticado. Por consiguiente, "aquellos que necesitan tratamiento" incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, aquellos propensos a tener la enfermedad y aquellos en los cuales se va a evitar el trastorno.

"Sujeto", "individuo", "animal", "paciente" o "mamífero" se refiere a cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para el cual se desea el diagnóstico, el pronóstico o la terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, de granja, de zoológico, deportivos o mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, osos y etc.

Como se usa en esta invención, frases como "un sujeto que se beneficiaría de la terapia" y "un animal que necesita tratamiento" incluyen sujetos, como los mamíferos, que se beneficiarían de la administración de una molécula de unión, como un anticuerpo, que comprende uno o más dominios de unión a antígeno. Dichas moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, se pueden usar, por ejemplo, para procedimientos de diagnóstico y/o para el tratamiento o la prevención de una enfermedad.

Moléculas de unión de IgM

La IgM es la primera inmunoglobulina que producen los linfocitos B en respuesta a la estimulación por el antígeno, y se encuentra presente a aproximadamente 1,5 mg/ml en suero con una semivida de 5 días. La IgM es una molécula dimérica, pentamérica o hexamérica. Una unidad de unión de IgM incluye dos cadenas ligeras y dos pesadas. Mientras que la IgG contiene tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3), la cadena pesada (|j) de IgM de manera adicional contiene un cuarto dominio constante (CH4), que incluye una "pieza de cola" de extremo C. La región constante de IgM humana típicamente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47. La región Cj1 humana varía de aproximadamente el aminoácido 5 a aproximadamente el aminoácido 102 de la SEQ ID NO: 74; la región C j2 humana varía de aproximadamente el aminoácido 114 a aproximadamente el aminoácido 205 de la SEQ ID NO: 74, la región C j3 humana varía de aproximadamente el aminoácido 224 a aproximadamente el aminoácido 319 de la SEQ ID NO: 74, la región C j 4 varía de aproximadamente el aminoácido 329 a aproximadamente el aminoácido 430 de la SEQ ID NO: 74, y la pieza de cola varía de aproximadamente el aminoácido 431 a aproximadamente el aminoácido 453 de la SEQ ID NO: 47 (Tabla 2).

Cinco unidades de unión de IgM pueden formar un complejo con una cadena de polipéptidos pequeña adicional (la cadena J) para formar un anticuerpo IgM. La cadena J humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 (Tabla 2). En la Figura 2 , se representa un pentámero de IgM típico. Sin la cadena J, las unidades de unión de IgM típicamente se ensamblan en un hexámero. En la Figura 2 , se representa un hexámero de IgM típico. Si bien no se pretende limitarse a la teoría, se cree que los dominios C j3 y C j4 participan en el ensamblaje de las unidades de unión de IgM en una molécula de unión hexamérica o pentamérica. En consecuencia, una molécula de unión hexamérica o pentamérica proporcionada en esta descripción típicamente incluye regiones constantes de IgM que incluyen al menos los dominios C j3 y C j4. En la Figura 3 , se muestra una comparación de anticuerpos IgG y anticuerpos IgM mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no reductora.

Una región constante de la cadena pesada de IgM puede incluir adicionalmente un dominio C j2 o un fragmento del mismo, un dominio C j1 o un fragmento del mismo y/u otros dominios de la cadena pesada de IgM. En ciertos aspectos, una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, puede incluir un dominio constante de cadena pesada ( j) de IgM completa, por ejemplo, la SEQ ID NO: 47, o una variante, derivado o análogo del mismo.

Moléculas de unión a CD20 pentaméricas o hexaméricas

Esta descripción proporciona una molécula de unión hexamérica o pentamérica, es decir, una molécula de unión con cinco o seis "unidades de unión" como se define en esta invención, que se puede unir específicamente a CD20, por ejemplo, CD20 humana. Una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, puede poseer características de unión o actividad biológica mejoradas en comparación con una molécula de unión compuesta de una única unidad de unión, por ejemplo, un anticuerpo IgG bivalente. En ciertos aspectos, la descripción proporciona una molécula de unión pentamérica o hexamérica que comprende cinco o seis unidades de unión bivalentes, respectivamente, donde cada unidad de unión incluye dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM o fragmentos de las mismas. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM son regiones constantes de la cadena pesada humanas.

Cuando la molécula de unión proporcionada en esta invención es pentamérica, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, o un fragmento funcional de la misma, o una variante de la misma. En ciertos aspectos, la cadena J es una cadena J modificada que comprende un resto heterólogo o uno o más restos heterólogos, por ejemplo, una secuencia polipeptídica heteróloga, por ejemplo, un dominio de unión extraño introducido en la secuencia natural. En ciertos aspectos, el dominio de unión extraño se une específicamente a CD3, por ejemplo, CD3e. En ciertos aspectos, la cadena J modificada comprende V15J (SEQ ID NO: 64) o J15V (SEQ ID NO: 66).

Una región constante de la cadena pesada de IgM puede incluir uno o más de un dominio C j1, un dominio C j2, un dominio C j3 y/o un dominio C j4, siempre que la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse con una segunda región constante de IgM para formar un dominio de unión a antígeno, o asociarse con otras unidades de unión para formar un hexámero o un pentámero. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de una unidad de unión individual comprenden cada uno un dominio C j3 o un fragmento del mismo, un dominio C j4 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio C j3 y un dominio C j, y una TP o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de una unidad de unión individual comprenden cada una un dominio C j2 o un fragmento de mismo, un dominio C j1 o un fragmento del mismo, o un dominio C j1 o fragmento del mismo y un dominio C j2 o un fragmento del mismo.

En ciertos aspectos, cada una de las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM en una unidad de unión dada se asocia a un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, una porción Fv de un anticuerpo, por ejemplo, una VH y una VL de un anticuerpo humano o murino. En una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión a antígeno anti-CD20, es decir, un dominio de unión a antígeno que se puede unir específicamente a CD20, por ejemplo, CD20 humana.

Moléculas de unión de IgA

La IgA desempeña un papel importante en la inmunidad de la mucosa y comprende aproximadamente un 15 % de la inmunoglobulina total producida. La IgA es una molécula monomérica o dimérica. Una unidad de unión de IgA incluye típicamente dos cadenas ligeras y dos pesadas. La IgA contiene tres dominios constantes de cadena pesada (Cal, Ca2 y Ca3) e incluye una "pieza de cola" de extremo C. La IgA humana tiene dos subtipos, IgA1 e IgA2. La región constante de IgA1 humana típicamente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59. La región Cal humana varía de aproximadamente el aminoácido 6 a aproximadamente el aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 59; la región Ca2 humana varía de aproximadamente el aminoácido 125 a aproximadamente el aminoácido 220 de la SEQ ID NO: 59, la región Ca3 humana varía de aproximadamente el aminoácido 228 a aproximadamente el aminoácido 330 de la SEQ ID NO: 59 y la pieza de cola varía de aproximadamente el aminoácido 331 a aproximadamente el aminoácido 352 de la SEQ ID NO: 59 (Tabla 2). La región constante de IgA2 humana típicamente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60. La región Cal humana varía de aproximadamente el aminoácido 6 a aproximadamente el aminoácido 98 de la SEQ ID NO: 60 (Tabla 2); la región Ca2 humana varía de aproximadamente el aminoácido 112 a aproximadamente el aminoácido 207 de la SEQ ID NO: 60, la región Ca3 humana varía de aproximadamente el aminoácido 215 a aproximadamente el aminoácido 317 de la SEQ ID NO: 60 y la pieza de cola varía de aproximadamente el aminoácido 318 a aproximadamente el aminoácido 340 de la SEQ ID NO: 60.

Dos unidades de unión de IgA pueden formar un complejo con dos cadenas de polipéptidos adicionales, la cadena J (SEQ ID NO: 49) y el componente secretor (SEQ ID NO: 62) para formar un anticuerpo secretor IgA (IgAs). Si bien no se pretende limitarse a la teoría, se cree que los dominios Ca3 y de pieza de cola participan en el ensamblaje de las unidades de unión de IgA en una molécula de unión dimérica. En consecuencia, una molécula de unión dimérica IgAs proporcionada en esta descripción típicamente incluye regiones constantes de IgA que incluyen al menos los dominios Ca3 y de pieza de cola.

Una región constante de cadena pesada de IgA puede incluir adicionalmente un dominio Ca2 o un fragmento del mismo, un dominio Ca1 o un fragmento del mismo y/u otros dominios de cadena pesada de IgA. En ciertos aspectos, una molécula de unión, como se proporciona en esta invención, puede incluir un dominio constante de cadena pesada (a) de IgA completa, por ejemplo, la SEQ ID NO: 59 o la SEQ ID NO: 60, o una variante, derivado o análogo del mismo.

Moléculas de unión a CD20 diméricas

Esta descripción proporciona una molécula de unión dimérica, por ejemplo, una molécula de unión con dos "unidades de unión" de IgA como se define en esta invención, que se puede unir específicamente a CD20, por ejemplo, CD20 humana. Una molécula de unión dimérica, como se proporciona en esta invención, puede poseer características de unión o actividad biológica mejoradas en comparación con una molécula de unión compuesta de una única unidad de unión, por ejemplo, un anticuerpo IgG bivalente. Por ejemplo, una molécula de unión de IgA puede llegar a sitios de la mucosa proporcionando una mayor distribución de tejido para las moléculas de unión proporcionadas en esta invención. En ciertos aspectos, la descripción proporciona una molécula de unión dimérica que comprende dos unidades de unión bivalentes, donde cada unidad de unión incluye dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o fragmentos de las mismas. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA son regiones constantes de cadena pesada humanas.

Una molécula de unión de IgA dimérica, como se proporciona en esta invención, puede comprender además una cadena J, o un fragmento o variante de la misma. Una molécula de unión de IgA dimérica, como se proporciona en esta invención, puede comprender además un componente secretor, o un fragmento o variante del mismo. En ciertos aspectos, la cadena J es una cadena J modificada que comprende un resto heterólogo o uno o más restos heterólogos, por ejemplo, un polipéptido heterólogo, por ejemplo, un dominio de unión extraño introducido en la secuencia natural. En ciertos aspectos, el dominio de unión extraño se une específicamente a CD3, por ejemplo, CD3e. En ciertos aspectos, la cadena J modificada comprende V15J (SEQ ID NO: 64) o J15V (SEQ ID NO: 66).

Una región constante de cadena pesada de IgA puede incluir uno o más de un dominio Ca1, un dominio Ca2 y/o un dominio Ca3, siempre y cuando la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse a una región constante de cadena ligera, a fin de facilitar la formación de un dominio de unión a antígeno, o asociarse a otra unidad de unión de IgA para formar una molécula de unión dimérica. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o sus fragmentos dentro de una unidad de unión individual comprenden cada uno un dominio Ca3 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio Ca3, una TP o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de cadena pesada de IgA o sus fragmentos dentro de una unidad de unión individual comprenden cada uno un dominio Ca2 o un fragmento del mismo, un dominio Ca1 o un fragmento del mismo, o un dominio Ca1 o fragmento del mismo y un dominio Ca2 o un fragmento del mismo.

En ciertos aspectos, cada una de las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgA en un dominio de unión a antígeno dado se asocia a un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, una porción Fv de un anticuerpo, por ejemplo, una VH y una VL de un anticuerpo humano o murino. En una molécula de unión como se proporciona en esta invención, al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión puede ser un dominio de unión al antígeno CD20, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno CD20 humano.

Cadenas J modificadas

En ciertos aspectos, las moléculas de unión a CD20 proporcionadas en esta invención pueden ser biespecíficas e incorporar una cadena J modificada. Como se proporciona en esta invención y en la publicación p Ct n.° WO 2015/153912, una cadena J modificada puede comprender un resto heterólogo, por ejemplo, un polipéptido heterólogo, por ejemplo, un dominio de unión extraño, que puede incluir, por ejemplo, un dominio de unión a polipéptido capaz de unirse específicamente a una diana. El dominio de unión puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un conjugado de fármaco-anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una molécula similar a un anticuerpo. Se puede introducir un dominio de unión a polipéptido en una cadena J seleccionando apropiadamente la ubicación y el tipo de adición (por ejemplo, fusión directa o indirecta, unión química, etc.).

En ciertos aspectos, el dominio de unión puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos y multiespecíficos. El fragmento de anticuerpo puede ser, sin limitación, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un scFv, un fragmento (scFv)², moléculas de anticuerpo monocatenario, minicuerpos o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En ciertos aspectos, el fragmento de anticuerpo es un scFv.

En otros aspectos, el dominio de unión puede ser una molécula similar a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo de dominio humano (dAb), una molécula de re-direccionamiento de doble afinidad (DART), un diacuerpo, un di-diacuerpo, un anticuerpo de dominio variable doble, un anticuerpo de dominio variable apilado, un inmunofármaco modular pequeño (SMIP), un Surrobody, un dominio de intercambio de cadena (SEED)-cuerpo manipulado genéticamente o TandAb.

El dominio de unión se puede introducir en la secuencia de la cadena J natural en cualquier ubicación que permita la unión del dominio de unión a su diana de unión sin interferir con la unión de la molécula de IgM o IgA receptora a su diana de unión o dianas de unión o la capacidad de la cadena J para incorporarse eficazmente en un dímero de IgA o un pentámero de IgM. En ciertos aspectos, el dominio de unión se puede insertar en el extremo C o cerca del mismo, en el extremo N maduro o cerca del mismo (es decir, el aminoácido número 23 de la SEQ ID NO: 49 después de la escisión del péptido señal) o en una ubicación interna que, basada en la estructura tridimensional de la cadena en J, es accesible. En ciertos aspectos, el dominio de unión se puede introducir en la cadena J de la secuencia natural sin aproximadamente 10 residuos del extremo C o sin aproximadamente 10 residuos de aminoácidos del extremo N maduro, de la cadena J humana de la SEQ ID NO: 49. En otro aspecto, el dominio de unión se puede introducir en la cadena J humana de la secuencia natural de la SEQ ID NO: 49 entre los residuos de cisteína 114 y 123 de la SEQ ID NO: 49, o en una ubicación equivalente de otra cadena J de la secuencia natural. En un aspecto adicional, el dominio de unión se puede introducir en una cadena J de la secuencia natural, tal como una cadena J de la SEQ ID NO: 49, en o cerca de un sitio de glucosilación. En ciertos aspectos, el dominio de unión se puede introducir en la cadena J humana de la secuencia natural de la SEQ ID NO: 49 dentro de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos del extremo C.

La introducción se puede lograr mediante fusión directa o indirecta, es decir, mediante la combinación de la cadena J y el dominio de unión en una cadena de polipéptidos mediante la combinación en marco de sus secuencias de nucleótidos de codificación, con o sin un conector peptídico. El conector peptídico (fusión indirecta), si se usa, puede ser aproximadamente de 1 a 50, o aproximadamente de 1 a 40, o aproximadamente de 1 a 30, o aproximadamente de 1 a 20, o aproximadamente de 1 a 10, o aproximadamente de 10 a 20 residuos de aminoácidos, y pueden estar presentes en uno o ambos extremos del dominio de unión para introducirlo en la secuencia de cadena J. En ciertos aspectos, el conector peptídico tiene aproximadamente de 10 a 20, o 10 a 15 aminoácidos de longitud. En ciertos aspectos, el conector peptídico tiene 15 aminoácidos de longitud. En ciertos aspectos, el conector peptídico es (GGGGS)a (SEQ ID NO: 67).

También es posible introducir más de un polipéptido heterólogo, por ejemplo, más de un dominio de unión, en una cadena J.

La cadena J modificada se puede producir mediante técnicas bien conocidas de tecnología de ADN recombinante, al expresar ácido nucleico que codifica la cadena J modificada en un organismo hospedador procariota o eucariota adecuado.

La cadena J modificada también se puede expresar conjuntamente con las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo IgM o IgA, receptor como se describe en otra parte de esta invención. La molécula de unión a receptor, antes de la incorporación de la cadena J modificada, puede ser monoespecífica, biespecífica o multiespecífica, por ejemplo, un anticuerpo IgA o IgM monoespecífico, biespecífico o multiespecífico. Las moléculas de unión de IgM e IgA biespecíficas y multiespecíficas, que incluyen los anticuerpos, se describen, por ejemplo, en las publicaciones con n.° de serie 61/874.277 y 61/937.984.

En ciertos aspectos, una molécula de unión de IgM o IgA anti-CD20, como se describe en esta invención, puede incluir una cadena J modificada con especificidad de unión para una célula inmunitaria efectora, tal como un linfocito T, una célula NK, un macrófago o un neutrófilo. En ciertos aspectos, la célula efectora es un linfocito T y la diana de unión es CD3 (analizado más adelante). Al activar y redirigir células efectoras, por ejemplo, linfocitos T efectores, a linfocitos B que expresan CD20, por ejemplo, linfocitos B malignos, una molécula de unión de IgM o IgA anti-CD20 x anti-CD3 biespecífica, como se proporciona en esta invención, puede producir una respuesta inmunitaria mejorada contra la diana, la respuesta que comprende, por ejemplo, citotoxicidad mediada por el complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), lo que aumenta aún más la potencia y la eficacia. En ciertos aspectos, una molécula de unión de IgM o IgA anti-CD20 x anti-CD3 biespecífica, como se proporciona en esta invención, que comprende una cadena J modificada, se puede usar para el tratamiento de cánceres relacionados con los linfocitos B.

En el caso de los linfocitos T, la agrupación de diferenciación 3 (CD3) es un complejo de proteínas multiméricas, conocido históricamente como el complejo T3, y está compuesto por cuatro cadenas de polipéptidos distintas (e, y, 6, Z) que se ensamblan y funcionan como tres pares de dímeros (ey, e6, ZZ). El complejo c D3 sirve como correceptor de linfocitos T que se asocia de forma no covalente con el receptor de linfocitos T (RLT). Los componentes de este complejo CD3, especialmente CD3e, pueden ser dianas para una cadena J modificada de una molécula de unión de IgM o IgA biespecífica proporcionada en esta invención.

En ciertos aspectos, una molécula de unión de IgM o IgA anti-CD20 x anti-CD3 biespecífica se une a CD20 a través de los dominios de unión de anticuerpos, mientras que la cadena J se modifica se une a CD3e.

En ciertos aspectos, el dominio de unión anti-CD3E de una cadena J modificada proporcionado en esta invención es un scFv. El scFv anti-CD3E se puede fusionar en o cerca del extremo N de la cadena J, o en o cerca del extremo C de la cadena J, ya sea directa o indirectamente con un conector sintético introducido entre las secuencias del scFv y de la cadena J, por ejemplo, un conector (GGGGS)3n (SEQ ID NO: 67). En ciertos aspectos, el scFv comprende las regiones VH y VL de visilizumab (Nuvion). En ciertos aspectos, la cadena J modificada comprende un scFv que comprende la VH de visilizumab, un conector (GGGGS)3 y la VL de visilizumab.

En ciertos aspectos, la cadena J modificada comprende un scFv de visilizumab fusionado al extremo N de la cadena J humana a través de un conector de 15 aminoácidos (GGGGS)3, una cadena J modificada denominada en esta invención V15J. V15J puede incluir además un péptido señal para facilitar el transporte y ensamblaje en moléculas de unión de IgM o IgA. La proteína V15J madura se presenta como la SEQ ID NO: 64, la versión precursora, que comprende un péptido señal de cadena pesada de inmunoglobulina de 19 aminoácidos se presenta como la SEQ ID NO: 63. En ciertos aspectos, la cadena J modificada comprende un scFv de visilizumab fusionado al extremo C de la cadena J humana a través de un conector de 15 aminoácidos (GGGGS)3, una cadena J modificada denominada en esta invención J15V. J15V puede incluir además un péptido señal para facilitar el transporte y ensamblaje en moléculas de unión de IgM o IgA. La proteína J15V madura se presenta como la SEQ ID NO: 65, la versión precursora, que comprende el péptido señal de la cadena J de 22 aminoácidos se presenta como la SEQ ID NO: 66. En ciertos aspectos, se pueden usar otros péptidos señal. La selección e inclusión de péptidos señal adecuados para facilitar la expresión, secreción e incorporación de una cadena J modificada en una molécula de unión de IgM o IgA anti-CD20, como se proporciona en esta invención, se encuentra dentro de las capacidades de un experto en la técnica.

Dominios de unión a CD20

En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 comprende las seis regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos al menos seis CDR se relacionan con las CDR correspondientes de 1.5.3 descritas en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007-0014720. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 39 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, uno o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una Hc d R2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 40 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 o la SEQ ID NO: 41 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o la SEQ ID NO: 43 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 o la SEQ ID NO: 44 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o la SEQ ID NO: 45 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una cualquiera, dos, tres, cuatro, cinco o las seis secuencias de aminoácidos de la CDR como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 incluye una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40, una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41, una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43, una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44 y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45.

En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL), donde la región VH, la región VL o ambas regiones Vh y VL se relacionan con la región VH y VL correspondiente de 1.5.3 descritas en la publicación de Patente de EE. UU. n.° 2007-0014720. En ciertos aspectos, la VH puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 38. En ciertos aspectos, la VL puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 42. En ciertos aspectos, la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

Si bien un experto en la técnica puede contemplar una variedad de diferentes moléculas de unión diméricas, pentaméricas o hexaméricas basadas en esta descripción, y, como tales, las mismas se incluyen en esta descripción, en ciertos aspectos, se proporciona una molécula de unión, como se describió anteriormente, donde cada unidad de unión comprende dos cadenas pesadas de IgA o IgM que comprenden cada una un extremo amino situado en VH para la región constante de IgA o IgM o un fragmento de la misma, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en VL para una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.

Asimismo, en ciertos aspectos, al menos una unidad de unión de la molécula de unión, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión, comprende o comprende dos de los dominios de unión al antígeno CD20 como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, los dos dominios de unión al antígeno CD20 en la unidad de unión de la molécula de unión, o las dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión, pueden ser diferentes entre sí, o pueden ser idénticos.

En ciertos aspectos, las dos cadenas pesadas de IgM dentro de una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas pesadas de IgM idénticas dentro de al menos una unidad de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 56.

En ciertos aspectos, las dos cadenas ligeras dentro de una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos una unidad de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión son cadenas ligeras kappa, por ejemplo, cadenas ligeras lambda humanas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos una unidad de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión comprenden cada una la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 58.

En ciertos aspectos, al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica proporcionada por esta descripción comprende o comprende cada una dos cadenas de IgM idénticas que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 56, y dos cadenas ligeras idénticas que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 58. Según este aspecto, los dominios de unión al antígeno CD20 en una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión pueden ser idénticos. Además, según este aspecto, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, o al menos doce copias de un dominio de unión al antígeno CD20 como se describió anteriormente. En ciertos aspectos, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis de las unidades de unión pueden ser idénticas y, en ciertos aspectos, las unidades de unión pueden comprender dominios de unión idénticos, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o al menos doce dominios de unión a CD20 pueden ser idénticos. En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 idéntico puede comprender una VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

En ciertos aspectos, una molécula de unión a CD20 de la dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede poseer propiedades estructurales o funcionales ventajosas en comparación con otras moléculas de unión. Por ejemplo, la molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica, o hexamérica puede poseer actividad mejorada en un ensayo biológico, ya sea in vitro o in vivo, que una molécula de unión correspondiente, por ejemplo, una IgGI 1.5.3 como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007-0014720. Los ensayos biológicos incluyen, pero no se limitan a, citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA).

En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, por ejemplo, un linfocito que expresa CD20, a mayor potencia que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, por ejemplo, una versión de IgG1 de 1.5.3 que comprende IgGI humana y una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 y una VL con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42. En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o mediada por linfocitos T o mediada por el complemento de una célula que expresa CD20, por ejemplo, un linfocito B que expresa CD20 a mayor potencia que una cantidad equivalente de anticuerpo monoclonal contra CD20 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo, donde el anticuerpo es, o comprende las mismas regiones VH y VL que, por ejemplo, rituximab (Genentech), ofatumumab (Glaxo SmithKline) , veltuzumab (Takeda), ocaratuzumab (Lilly), tositumumab (Glaxo SmithKline) u obinutumumab (Roche/Genentech).

Por "potencia" se entiende la cantidad mínima de una molécula de unión dada necesaria para lograr un resultado biológico dado, por ejemplo, la destrucción del 50 % de las células en un ensayo dado, por ejemplo, un ensayo de CDC o CCDA (OI⁵⁰). La potencia se puede expresar como una curva en la que el % de supervivencia de las células está en el eje Y y la concentración de la molécula de unión (en, por ejemplo, jg/m l o j M) está en el eje X.

En ciertos aspectos, la CDC se puede medir in vitro y la célula que expresa CD20 puede ser una línea celular inmortalizada, por ejemplo, una línea celular de linfoma de linfocitos B, por ejemplo, una línea celular Ramos, una línea celular Raji, una línea celular Daudi, una línea celular Namalwa, una línea celular Granta, una línea celular Z138, una línea celular DoHH2 o una línea celular DB. Se conocen líneas celulares similares y las puede obtener fácilmente un experto en la técnica.

En ciertos aspectos, CDC se puede medir o demostrar in vitro o in vivo, y la línea celular que expresa CD20 es un linfocito B maligno obtenido a partir de, o en, un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, con cáncer, por ejemplo, con un linfoma, leucemia o mieloma relacionado con los linfocitos B. En ciertos aspectos, el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia convencional, por ejemplo, quimioterapia o terapia con anticuerpos monoclonales con uno o más de, por ejemplo, rituximab (Genentech), ofatumumab (Glaxo SmithKline), veltuzumab (Takeda), ocaratuzumab (Lilly), tositumumab (Glaxo SmithKline) u obinutumumab (Roche/Genentech). En ciertos aspectos, se proporciona una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica que comprende uno cualquiera o más de los dominios de unión descritos en esta invención, por ejemplo, en la Tabla 5.

En ciertos aspectos, la CCDA se puede medir in vitro a través de ensayos de activación de linfocitos T, por ejemplo, cultivando conjuntamente linfocitos B que expresan CD20 y linfocitos T que expresan CD3 manipulados genéticamente en presencia de una molécula de unión de IgM anti-CD20 x anti-CD3 biespecífica, como se proporciona en esta invención, y midiendo la activación de los linfocitos T mediante la liberación de citocinas, lisis de células diana u otro procedimiento de detección. En ciertos aspectos, la CCDA se puede medir mediante la destrucción de linfocitos B dirigida a linfocitos T. En ciertos aspectos, la célula que expresa CD20 puede ser una línea celular inmortalizada, por ejemplo, una línea celular de linfoma de linfocitos B, por ejemplo, una línea celular Ramos, una línea celular Raji, una línea celular Daudi, una línea celular Namalwa, una línea celular Granta, una línea celular Z138, una línea celular DoHH2 o una línea celular DB. Se conocen líneas celulares similares y las puede obtener fácilmente un experto en la técnica. En ciertos aspectos, la línea celular que expresa CD20 se puede derivar de un paciente que padece un cáncer relacionado con los linfocitos B.

En ciertos aspectos, la totalidad de la destrucción de células CD20+, por ejemplo, por CDC, CCDA y otros modos de destrucción, por ejemplo, apoptosis, se puede someter a prueba in vitro en un ensayo usando sangre completa que incluye tanto linfocitos T como complemento.

En ciertos aspectos, por ejemplo, cuando la molécula de unión es una molécula de unión pentamérica que comprende cinco unidades de unión idénticas, cada una de las cuales comprende dos dominios de unión a CD20 idénticos con, por ejemplo, la VH y VL de 1.5.3, sometidos a prueba en un ensayo de CDC usando, por ejemplo, la línea de células Raji que expresan CD20, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos treinta veces, al menos cuarenta veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces o más menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgGI monoespecífico bivalente, por ejemplo, 1.5.3 o rituximab, tal como se mide, por ejemplo, en jg/ml. En ciertos aspectos, donde la célula que expresa CD20 es una línea celular Ramos, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces o al menos 100 veces menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico, medido, por ejemplo, como equivalentes molares.

En ciertos aspectos, por ejemplo, una molécula de unión pentamérica que comprende cinco unidades de unión idénticas, cada una de las cuales comprende dos dominios de unión idénticos con, por ejemplo, la VH y VL de 1.5.3, o la VH y VL de rituximab, más una cadena J de tipo natural o modificada, como se proporciona en esta invención, puede presentar una potencia aumentada en un ensayo de CDC realizado en células que presentan niveles de expresión de CD20 más bajos. Por ejemplo, IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab J o IgM anti-CD20 de 1.5.3 J, sometida a prueba en un ensayo de CDC usando las líneas celulares DoHH2 (alta expresión de CD20) y Z138 (baja expresión de CD20) que expresan CD20, puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos treinta veces, al menos cuarenta veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces o más baja que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente de los equivalentes de anticuerpos IgGI monoespecífico bivalente, por ejemplo, rituximab (IgG1) o 1.5.3 (IgG1), tal como se mide, por ejemplo, como equivalentes molares. En ciertos aspectos, IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab J y IgM anti-CD201.5.3 J, sometida a prueba en un ensayo de CDC usando las líneas celulares Z138 (baja expresión de CD20), puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de la línea celular en condiciones de un 50 % de destrucción (CE⁵⁰) con las moléculas de IgG equivalentes que no pueden lograr ni siquiera a una concentración de 100 nM.

En ciertos aspectos, una molécula de unión pentamérica biespecífica que comprende cinco unidades de unión idénticas, cada una de las cuales comprende dos dominios de unión a CD20 idénticos con, por ejemplo, la VH y VL de 1.5.3, o la VH y VL de rituximab, más una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V, como se proporciona en esta invención, puede presentar una potencia aumentada en un ensayo de CCDA. Por ejemplo, IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab V15J o J15V, o IgM anti-CD20 1.5.3 V15J o J15V, sometida a prueba en un ensayo de activación de linfocitos T, por ejemplo, usando la línea celular DB cultivada conjuntamente con linfocitos T de Jurkat manipulados genéticamente puede facilitar la destrucción de linfocitos T con una CI⁵⁰al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos treinta veces, al menos cuarenta veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces o más baja que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente de una molécula de unión biespecífica monovalente que se une a linfocitos B y linfocitos T, por ejemplo, una molécula anti-CD19 (monovalente) x anti-CD3 (monovalente) biespecífica blinatumomab.

En ciertos aspectos, una molécula de unión pentamérica biespecífica o monoespecífica que comprende cinco unidades de unión idénticas, cada una de las cuales comprende dos dominios de unión a idénticos con, por ejemplo, la VH y VL de 1.5.3, o la VH y VL de rituximab, más una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V, como se proporciona en esta invención, puede presentar una potencia aumentada en un ensayo de citotoxicidad in vitro con sangre completa. Por ejemplo, IgM anti-CD20 1.5.3 V15J o J15V, o IgM anti-CD20 de 1.5.3 V15J o J15V, sometida a prueba en un ensayo de citotoxicidad in vitro KILR™ usando la línea celular ARH-77 de KILR™ que expresa CD20 cultivada conjuntamente con sangre humana anticoagulada con hirudina puede lograr la destrucción de la línea celular ARH-77 de KILR™ con una CI⁵⁰al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos treinta veces, al menos cuarenta veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces o más baja que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente de una molécula de unión anti-CD20 bivalente monoespecífica, por ejemplo, IgG de 1.5.3, o una molécula de unión biespecífica monovalente que se une a linfocitos B y linfocitos T, por ejemplo, una molécula anti-CD19 (monovalente) x anti-CD3 (monovalente) biespecífica blinatumomab.

En ciertos aspectos, una molécula de unión pentamérica biespecífica o monoespecífica que comprende cinco unidades de unión idénticas, cada una de las cuales comprende dos dominios de unión a idénticos con, por ejemplo, la VH y VL de 1.5.3, o la VH y VL de rituximab, más una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V, como se proporciona en esta invención, puede presentar una destrucción de linfocitos B significativa in vivo, por ejemplo, en un modelo de ratón humanizado como se describe en otra parte de esta invención.

Polinucleótidos, vectores y células huésped

La descripción proporciona además un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido aislado, recombinante y/o de origen no natural que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se describe en esta invención. Por "subunidad polipeptídica" se entiende una porción de una molécula de unión, una unidad de unión o un dominio de unión a antígeno que se puede traducir independientemente. Los ejemplos incluyen, sin limitación, un dominio variable de anticuerpo, por ejemplo, una VL o una Fv, un Fv de cadena simple, una cadena pesada de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo, una región constante de la cadena pesada de anticuerpo, una región constante de la cadena ligera de anticuerpo y/o cualquier fragmento de la misma.

En cierto aspecto, la subunidad polipeptídica puede comprender una región constante de la cadena pesada de IgA o IgM y al menos la porción de Vh de anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20. En ciertos aspectos, el polinucleótido puede codificar una subunidad polipeptídica que comprende una región constante de IgA o IgM humana o un fragmento de la misma fusionada al extremo C de una VH, donde la VH comprende una HCDR1, HCDR2 y HCDR3, donde la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 39 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido; la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 40 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, o dos sustituciones de un único aminoácido; la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, la SEQ ID NO: 41 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido; o la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 38. En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56.

En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica puede comprender una porción VL de anticuerpo de un dominio de unión al antígeno CD20 como se describe anteriormente. En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica puede comprender una región constante de la cadena ligera de un anticuerpo humano o un fragmento de la misma fusionada al extremo C de una VL, donde la VL comprende una LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o la SEQ ID NO: 43 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido; la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 o la SEQ ID NO: 44 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido; y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o la SEQ ID NO: 45 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido; o la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % al menos un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 42. En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.

En ciertos aspectos, la subunidad polipeptídica puede comprender un anticuerpo VH o una porción de anticuerpo VL de un dominio de unión al antígeno CD20 que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos de VH o VL descritas anteriormente y/o en la Tabla 5.

La descripción proporciona además una composición que comprende dos o más polinucleótidos, donde los dos o más polinucleótidos colectivamente pueden codificar una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se describe anteriormente. En ciertos aspectos, la composición puede incluir un polinucleótido que codifica una cadena pesada de IgA o IgM o un fragmento de la misma, por ejemplo, una cadena pesada de IgA o IgM humana como se describe anteriormente, donde la cadena pesada de IgA o IgM comprende al menos la VH de un dominio de unión al antígeno CD20, y un polinucleótido que codifica una cadena ligera o fragmento de la misma, por ejemplo, una cadena ligera kappa o lambda humana que comprende al menos la VL de un dominio de unión al antígeno CD20. Una composición de polinucleótidos, como se proporciona, puede incluir además un polinucleótido que codifica una cadena J, por ejemplo, una cadena J humana, un fragmento de la misma o una variante de la misma. En ciertos aspectos, los polinucleótidos que forman una composición como se proporciona en esta invención se pueden situar en dos o tres vectores separados, por ejemplo, vectores de expresión. La descripción proporciona dichos vectores. En ciertos aspectos, dos o más de los polinucleótidos que forman una composición, como se proporciona en esta invención, se pueden situar en un único vector, por ejemplo, un vector de expresión. La descripción proporciona dicho vector.

La descripción proporciona además una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped procariota o eucariota, que comprende un polinucleótido o dos o más polinucleótidos que codifican una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención, o cualquier subunidad de la misma, una composición de polinucleótidos como se proporciona en esta invención, o un vector o dos, tres o más vectores que codifican colectivamente una molécula de unión a la CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención, o cualquier subunidad de la misma. En ciertos aspectos, una célula huésped proporcionada por la descripción puede expresar una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta descripción, o una subunidad de la misma.

En un aspecto relacionado, la descripción proporciona un procedimiento para producir una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta descripción, donde el procedimiento comprende cultivar una célula huésped como se describió anteriormente y recuperar la molécula de unión.

Procedimientos de uso

Esta descripción proporciona procedimientos mejorados para dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de células que expresan CD20, por ejemplo, linfocitos B, por ejemplo, linfocitos B malignos o inmortalizados, usando una molécula de unión a CD20 basada en IgA o IgM dimérica, pentamérica o hexamérica. Los procedimientos descritos a continuación pueden utilizar moléculas de unión que comprenden dominios de unión al antígeno CD20 derivados de cualquier anticuerpo contra CD20, que incluye, sin limitación, 1.5.3 como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007 0014720, rituximab, ofatumumab, veltuzumab, ocaratuzumab, obinutumumab o variantes, derivados o análogos de los mismos, donde la molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica puede proporcionar una destrucción mejorada mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de células que expresan CD20 en comparación con un anticuerpo IgG equivalente, fragmento, variante, derivado o análogo del mismo, que comprende el mismo dominio de unión a antígeno. En ciertos aspectos, la molécula de unión a CD20 basada en IgA o IgM comprende además una cadena J, ya sea una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V como se proporciona en esta invención. En base a esta descripción, la construcción de una molécula de unión a CD20 basada en IgA o IgM dimérica, pentamérica o hexamérica que comprende cualquier dominio de unión a CD20 de interés se encuentra dentro de las capacidades de un experto en la técnica. La actividad mejorada puede, por ejemplo, permitir que se use una dosis reducida, o puede dar lugar a una destrucción más efectiva de las células que son resistentes a la destrucción por el anticuerpo original. Por "resistente" se entiende cualquier grado de actividad reducida de un anticuerpo contra CD20, por ejemplo, rituximab, en la célula que expresa CD20. El uso de una molécula de unión basada en IgA puede permitir, por ejemplo, una mayor distribución de tejido para una molécula de unión proporcionada en esta invención.

En ciertos aspectos, esta descripción proporciona un procedimiento para dirigir la destrucción mejorada mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, donde el procedimiento incluye poner en contacto una célula que expresa CD20 con una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica como se describe en esta invención, donde la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por linfocitos T como mediada por el complemento de una célula que expresa CD20, por ejemplo, un linfocito B que expresa CD20, a una mayor potencia que una cantidad equivalente de una IgG monoespecífica, bivalente, por ejemplo, un anticuerpo IgGI o un fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, por ejemplo, rituximab, que comprende una IgGI humana y una VH con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. La molécula de unión dimérica o pentamérica puede incluir además una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V, como se proporciona en esta invención. En ciertos aspectos, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o mediada por linfocitos T o mediada por el complemento de una célula que expresa CD20, por ejemplo, un linfocito B que expresa CD20 a mayor potencia que una cantidad equivalente de anticuerpo monoclonal contra CD20 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo, donde el anticuerpo es, o comprende las mismas regiones VH y VL que, por ejemplo, ofatumumab, veltuzumab, ocaratuzumab o obinutumumab.

Por tanto, esta descripción proporciona un procedimiento para dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, donde el procedimiento incluye: poner en contacto una célula que expresa CD20 con una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica que comprende dos, cinco o seis unidades de unión bivalentes, respectivamente, donde cada unidad de unión comprende dos regiones constantes de la cadena pesada de IgA o IgM o fragmentos de las mismas y dos dominios de unión a antígeno. Los ejemplos no limitantes de moléculas de unión adecuadas incluyen una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica basada en 1.5.3 proporcionada por esta descripción, u otras moléculas de unión como se describe en otra parte de esta descripción. La molécula de unión dimérica o pentamérica puede incluir además una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V como se proporciona en esta invención. Según el procedimiento, al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión al antígeno CD20. Además, según el procedimiento, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de una IgG monoespecífica, bivalente, por ejemplo, anticuerpo IgGI o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, por ejemplo, un anticuerpo IgGI bivalente que comprende un dominio de unión al antígeno CD20 similar a, por ejemplo, idéntico a un dominio de unión al antígeno CD20 de la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica proporcionada por esta descripción.

Por ejemplo, la descripción proporciona un procedimiento para dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, donde el procedimiento incluye: poner en contacto una célula que expresa CD20 con una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica que comprende al menos un dominio de unión a antígeno relacionado con 1.5.3, como se describe en otra parte de esta invención, donde la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento y como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD-20 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20 relacionado con 1.5.3. La molécula de unión dimérica o pentamérica puede incluir además una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V como se proporciona en esta invención. En ciertos aspectos, el anticuerpo IgGI bivalente monoespecífico es 1.5.3 y comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42.

En ciertos aspectos, por ejemplo, cuando la molécula de unión es una molécula de unión pentamérica que comprende cinco unidades de unión idénticas, cada una de las cuales comprende dos dominios de unión idénticos con la VH y VL de 1.5.3, sometidos a prueba en un ensayo de CDC usando la línea celular Raji que expresa CD20, la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento con una CI⁵⁰al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos 20 veces, al menos treinta veces, al menos cuarenta veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces o más menor que la CI⁵⁰de una cantidad equivalente del anticuerpo IgGI monoespecífico bivalente, por ejemplo, 1.5.3, tal como se mide, por ejemplo, en pg/ml o en equivalentes molares.

En ciertos aspectos, la célula que expresa CD-20 es una línea celular inmortalizada, por ejemplo, una línea celular de leucemia o linfoma de linfocitos B. La línea celular puede ser, sin limitación, una línea celular Ramos, una línea celular Raji, una línea celular Daudi, una línea celular Namalwa, una línea celular Granta, una línea celular Z138, una línea celular DoHH2 o una línea celular DB. Otras líneas celulares que pueden ser útiles en los procedimientos proporcionados en esta invención los puede identificar fácilmente un experto en la técnica.

En ciertos aspectos, la línea celular es una línea celular Granta, y la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de la línea celular a aproximadamente seis veces la potencia de rituximab medida en pg/ml. En ciertos aspectos, la línea celular es una línea celular Ramos, y la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de la línea celular a aproximadamente 30-40 veces la potencia de rituximab medida en equivalentes molares.

En ciertos aspectos donde la línea celular es una línea celular Raji o una línea celular Ramos, y la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de la línea celular a aproximadamente tres veces la potencia de rituximab.

En ciertos aspectos, la célula que expresa CD20 es un linfocito B maligno en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, con cáncer. El cáncer puede ser, por ejemplo, leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20. En ciertos aspectos, la línea celular que expresa CD20 o el linfocito B maligno es resistente, por ejemplo, responde mínimamente o no responde a la destrucción por un anticuerpo monoclonal contra CD20 disponible comercialmente, por ejemplo, la línea celular que expresa CD20 o linfocito B maligno en un sujeto con cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab.

En otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para dirigir la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20, donde el procedimiento incluye: poner en contacto una célula que expresa CD20 con una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica que comprende al menos un dominio de unión a antígeno relacionado con el AcM contra c D20 rituximab, o un fragmento, variante, derivado o análogo del mismo. La molécula de unión dimérica o pentamérica puede incluir además una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V como se proporciona en esta invención.

En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 de la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica comprende las seis regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos al menos seis CDR se relacionan con las CDR correspondientes del AcM contra CD20 rituximab. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 2 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 3 con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido. Por ejemplo, la HCDR2 puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 4 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una, dos o tres sustituciones de un único aminoácido. Por ejemplo, la HCDR3 puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 36. En otros aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 10 con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido. En otros aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 31 con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 6 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una, dos o tres sustituciones de un único aminoácido. Por ejemplo, la LCDR1 puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 33. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 7 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. Por ejemplo LCDR2 puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 20. El dominio de unión al antígeno CD20 puede incluir una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 8 con una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de un único aminoácido, por ejemplo, una o dos sustituciones de un único aminoácido. Por ejemplo, la LCDR3 puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 34.

En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 de la molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica comprende una VH y una VL, donde la región VH, la región VL o ambas regiones VH y VL se relacionan con la VH y VL correspondientes de rituximab. En ciertos aspectos, el dominio de unión al antígeno CD20 puede comprender una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 5.

En ciertos aspectos, VH y VL se pueden derivar del AcM contra CD20 descrito en la patente de EE. UU. n.° 7.679.900. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno CD20 puede comprender una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 11.

En ciertos aspectos, VH y VL se pueden derivar del AcM contra CD20 descrito en la patente de EE. UU. n.° 8.153.125. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno CD20 puede comprender una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 18.

En ciertos aspectos, VH y VL se pueden derivar del AcM contra CD20 descrito en la patente de EE. UU. n.° 8.337.844. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno CD20 puede comprender una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 22 o la SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29.

En ciertos aspectos, VH y VL se pueden derivar del AcM contra CD20 descrito en la patente de EE. UU. n.° 8.337.844. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno CD20 puede comprender una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 30 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 32.

En ciertos aspectos, VH y VL se pueden derivar del AcM contra CD20 descrito en la patente de EE. UU. n.° 7.151.164. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno CD20 puede comprender una secuencia de aminoácidos de VH al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 35 y una secuencia de aminoácidos de VL al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 37.

Una molécula dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención es una molécula de unión con dos, cinco o seis "unidades de unión", como se define en esta invención, que se pueden unir específicamente a CD20, por ejemplo, un CD20 humano. En ciertos aspectos, una molécula dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención comprende dos, cinco o seis unidades de unión bivalentes, respectivamente, donde cada unidad de unión incluye dos regiones constantes de la cadena pesada de IgA o IgM o fragmentos de la misma. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgA o IgM son regiones constantes de la cadena pesada humanas.

Donde la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención es la molécula de unión pentamérica, la molécula de unión puede comprender además una cadena J, o un fragmento de la misma, o una variante de la misma. La cadena J puede ser una cadena J de tipo natural o una cadena J modificada capaz de unirse a CD3 humana, por ejemplo, V15J o J15V como se proporciona en esta invención.

Una región constante de la cadena pesada de IgM de una molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede incluir uno o más de un dominio Cj 1, un dominio C|^j2, un dominio C|^j3 y/o un dominio Cj 4, siempre y cuando la región constante pueda cumplir una función deseada en la molécula de unión, por ejemplo, asociarse a una segunda región constante de la cadena ligera para formar un dominio de unión a antígeno, o asociarse a otras unidades de unión para formar un hexámero o pentámero. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de una unidad de unión individual comprenden cada uno un dominio Cj 3 o un fragmento del mismo, un dominio Cj 4 o un fragmento del mismo, una pieza de cola (TP) o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de un dominio Cj 3 y un dominio Cj , y una TP o un fragmento de los mismos. En ciertos aspectos, las dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM o sus fragmentos dentro de una unidad de unión individual comprenden cada una un dominio C|j2 o un fragmento de mismo, un dominio Cj 1 o un fragmento del mismo, o un dominio Cj 1 o fragmento del mismo y un dominio Cj 2 o un fragmento del mismo.

Si bien experto en la técnica basado en esta descripción puede contemplar una variedad de diferentes moléculas de unión diméricas, pentaméricas y hexaméricas para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, y, como tales, las mismas se incluyen en esta descripción, en ciertos aspectos, se proporciona una molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, donde cada unidad de unión comprende dos cadenas pesadas de IgA o IgM que comprenden cada una un extremo amino situado en VH para la región constante de IgA o IgM o un fragmento de la misma, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en VL para una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.

Asimismo, en ciertos aspectos, al menos una unidad de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención, comprende o comprende dos de los dominios de unión al antígeno CD20 como se describe anteriormente. En ciertos aspectos, los dos dominios de unión al antígeno CD20 en una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención pueden ser diferentes entre sí, o pueden ser idénticas.

En ciertos aspectos, las dos cadenas pesadas de IgM dentro de una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas pesadas de IgM idénticas dentro de al menos una unidad de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52.

En ciertos aspectos, las dos cadenas ligeras dentro de una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención son idénticas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos una unidad de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención son cadenas ligeras kappa, por ejemplo, cadenas ligeras lambda humanas. En ciertos aspectos, dos cadenas ligeras idénticas dentro de al menos una unidad de unión, o dentro de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de la molécula de unión para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención comprenden cada una la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54.

En ciertos aspectos, al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis unidades de unión de una molécula de unión pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención comprende o comprende cada una dos cadenas pesadas de IgM idénticas que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52, y dos cadenas ligeras idénticas que comprende cada una la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54. Según este aspecto, los dominios de unión al antígeno CD20 en una, dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades de unión de la molécula de unión pueden ser idénticos. Además, según este aspecto, una molécula de unión dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, o al menos doce copias de un dominio de unión al antígeno CD20 como se describe anteriormente. En ciertos aspectos, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis de las unidades de unión pueden ser idénticas y, en ciertos aspectos, las unidades de unión pueden comprender dominios de unión idénticos, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o al menos doce dominios de unión a CD20 pueden ser idénticos. En ciertos aspectos el dominio de unión al antígeno CD20 idéntico puede comprender una VH con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una VL con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

Las moléculas de unión a CD20 diméricas, pentaméricas o hexaméricas para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede poseer propiedades estructurales o funcionales ventajosas en comparación con otras moléculas de unión. Por ejemplo, una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica para su uso en los procedimientos proporcionados en esta invención puede poseer una actividad mejorada en un ensayo biológico, in vitro o in vivo, en comparación con una molécula de unión correspondiente, por ejemplo, rituximab o una variante, análogo o derivado del mismo. Los ensayos biológicos incluyen, pero no se limitan a, citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA).

Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración

Los procedimientos de preparación y administración de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, a un sujeto que lo necesita son conocidos por un experto en la técnica a la luz de esta descripción. La vía de administración de una molécula de unión a CD20 puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, tal como se usa en esta invención, incluye, por ejemplo, la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Aunque todas estas formas de administración se contemplan como formas adecuadas, otro ejemplo de una forma de administración sería una solución para inyección, en particular, para una inyección intravenosa o intraarterial, o goteo. Una composición farmacéutica adecuada puede comprender un tampón (porejemplo, un tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc.

Como se analiza en esta invención, una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica como se proporciona en esta invención se puede administrar en una cantidad farmacéuticamente efectiva para el tratamiento in vivo de enfermedades o trastornos en los que es deseable reducir los linfocitos B. A este respecto, se apreciará que las moléculas de unión descritas pueden formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. Las composiciones farmacéuticas según la presente descripción comprenden un vehículo estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Una cantidad farmacéuticamente efectiva de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, significa una cantidad suficiente para lograr la unión efectiva a una diana y lograr un beneficio terapéutico. Las formulaciones adecuadas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16.a ed. (1980).

Determinadas composiciones farmacéuticas, como se describen en esta invención, se pueden administrar por vía oral en una forma galénica aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar mediante aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se pueden preparar como soluciones en solución salina, usando alcohol bencílico u otros conservantes, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales adecuados.

La cantidad de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica que se puede combinar con materiales portadores para producir una forma galénica única variará dependiendo, por ejemplo, del sujeto tratado y el modo particular de administración. La composición puede administrarse como una dosis única, dosis múltiples o durante un período de tiempo establecido en una infusión. Las pautas de administración también se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica).

Según el alcance de la presente descripción, una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, se puede administrar a un sujeto que necesita terapia en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica, como se proporciona en esta invención, se puede administrar al sujeto en una forma galénica convencional preparada combinando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la descripción con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y convencional, según técnicas conocidas. La forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable pueden ser dictados por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica, que, cuando se administra, produce una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con una enfermedad o afección que se va a tratar.

Las dosis terapéuticamente efectivas de las composiciones descritas en esta invención para el tratamiento de enfermedades o trastornos en los que es deseable reducir los linfocitos B pueden variar dependiendo de muchos factores diferentes, como los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En ciertos aspectos, el sujeto o paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, incluyendo los mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento pueden ajustarse usando procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

La cantidad de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica que se va a administrar la determinará fácilmente un experto en la técnica sin experimentación indebida dada esta descripción. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad, los antecedentes de la enfermedad y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo sometido a la terapia. De manera similar, la cantidad de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica que se va a administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una dosis única o a dosis múltiples de este agente.

Esta descripción también proporciona el uso de una molécula de unión a CD20 dimérica, pentamérica o hexamérica en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o controlar una enfermedad o trastorno en el que es deseable reducir los linfocitos B, por ejemplo, linfoma de linfocitos B, leucemia o mieloma.

La puesta en práctica de la descripción usará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro de la especialización en la materia. Dichas técnicas se explican de manera completa en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2.a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook y col., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) Dn A Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis y col. Pat. de los EE.UU. No. 4.683.195; Hames y Higgins, ed. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, ed. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos ed. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu y col., ed., Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155; Mayer y Walker, ed. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, ed., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel y col. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

Los principios generales de la manipulación genética de anticuerpos se expone en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2.a ed.; Oxford Univ. Press). Los principios generales de la ingeniería de proteínas se exponen en Rickwood y col., ed. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press en Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Los principios generales de la unión de anticuerpos y haptenos de anticuerpos se expone en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2.a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman y Hall, Nueva York, N.Y.). Además, los procedimientos estándares en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente se pueden seguir como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites y col., ed. (1994) Basic and Clinical Immunology (8.a ed.; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell y Shiigi (ed.) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

Los trabajos de referencia estándar que establecen principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett y col., ed. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden y col., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby y col., ed. (2000) Kuby Immunology (4.a ed..; H. Freemand & Co.); Roitt y col. (2001) Immunology (6.a ed.; Londres: Mosby); Abbas y col. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5.a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003) Pc R Primer (Cold Spring Harbor Press).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo y no limitativo.

Ejemplos

Ejemplo 1: generación de construcciones de ADN para la expresión de CD20-hIgM

Las construcciones de plásmido que pueden expresar moléculas de unión de IgM pentaméricas o hexaméricas que se pueden unir específicamente a CD20 se produjeron mediante el siguiente procedimiento.

Los fragmentos de ADN que codifican las regiones VH y VL de rituximab (SEQ ID NO 1 y 5, respectivamente) o 1.5.3 (SEQ ID NO 38 y 42, respectivamente) fueron sintetizados por un proveedor comercial (Genescript), con un sitio de restricción EcoRV en el extremo '5 y un sitio de restricción XbaI en el extremo 3' para la subclonación en vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera. Las construcciones de ADN sintetizado se volvieron a suspender en tampón Tris-EDTA a 1 jg/ml. Las muestras de ADN (1 |jg) se digirieron con EcoRV y XbaI, y la VH y VL sintetizadas se separaron del ADN plasmídico portador por electroforesis. El ADN digerido se ligó a ADN plasmídico predigerido (pFUSEss-CHIg-hM*03 para la cadena j , pFUSE2ss-CLIg-hk para la cadena kappa, disponible de Invivogen) mediante técnicas estándar de biología molecular. Los ADN ligados se transformaron en bacterias competentes y se colocaron en placas de LB con múltiples antibióticos selectivos. Se eligieron varias colonias bacterianas y las preparaciones de ADN se realizaron mediante técnicas de biología molecular estándar. Las construcciones que codifican la cadena pesada y las cadenas ligeras se verificaron mediante secuenciación. Las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena pesada de rituximab IgM se presentan como SEC ID NO: 51 y SEC ID NO: 52, respectivamente, y las secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena ligera de rituximab se presentan como SEC ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, respectivamente. El ADN y las secuencias de la cadena pesada de IgM de 1.5.3 se presentan como SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, respectivamente, y el ADN y las secuencias de la cadena ligera de IgM de 1.5.3 se presentan como SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena J humana se presenta como SEQ ID NO: 49.

Las construcciones de plásmidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de IgM o las cadenas pesadas, las cadenas ligeras y la cadena J se transfectaron conjuntamente en células CHO, y se seleccionaron las células que expresan el anticuerpo IgM contra CD20, ya sea con nuestra cadena J o sin ella, todo ello según métodos estándar.

Los anticuerpos presentes en los sobrenadantes celulares se recuperaron usando Capture Select IgM (Catálogo 2890.05, BAC, Thermo Fisher) según el protocolo del fabricante. Los anticuerpos se evaluaron en SDS PAGE en condiciones no reductoras para mostrar el ensamblaje de pentámeros y hexámeros. Se agregó tampón de muestra NuPage LDS (Life Technologies) a las muestras antes de cargarlas en un gel NativePage Novex de bis-Tris al 3-12 % (n.° de catálogo de Life Technologies BN1003). Se usó tampón Novex Tris-Acetate SDS Running (n.° de catálogo de Life Technologies LA0041) para la electroforesis en gel. El gel se hizo fluir hasta que el frente del tinte alcanzó la parte inferior del gel. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con tinte Colloidal Blue (n.° de catálogo de Life Technologies LC6025). Los resultados se muestran en la Figura 4. En condiciones no reductoras, la IgM 1.5.3 pentamérica (cinco unidades de IgM H2L2 más cadena J, Figura 4, segundo panel, carril 3) y la IgM rituximab pentamérica (primer panel, carril 3) produjeron una banda de proteína de aproximadamente 1.000.000 de peso molecular e IgM 1,5,3 hexamérica (seis unidades de IgM de H2L2, Figura 4, segundo panel, carril 2) produjeron una banda de proteína de aproximadamente 1.180.000.

Ejemplo 2: unión y actividad de CD20-hIgM

Detección de unión mediante ensayo ELISA con CD20

Se recubrieron placas para ELISA de poliestireno blanco de 96 pocillos (Pierce 15042) con 100 jL por pocillo de 10 |jg/ml o 0,3 jg/m l de CD20 humana con fusión de N-Fc (AcroBiosystems, CDO-H526a) durante la noche a 4 °C. A continuación, las placas se lavaron con PBS-Tween al 0,05 % y se bloquearon con BSA-PBS al 2 %. Después del bloqueo, se añadieron a los pocillos 100 j l de diluciones en serie de IgM de 1,5,3, IgG de 1,5,3, patrones y controles y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, las placas se lavaron e incubaron con antikappa humana de ratón conjugada con PRP (Southern Biotech, 9230-05. diluida 1:6000 en BSA-PBS al 2 %) durante 30 min. Después de 10 lavados finales usando PBS-Tween al 0,05 %, las placas se leyeron utilizando sustrato quimioluminiscente SuperSignal (ThermoFisher, 37070). Los datos luminiscentes se recogieron en un lector de placas EnVision (Perkin-Elmer) y se analizaron con GraphPad Prism utilizando un modelo logístico de 4 parámetros.

Los resultados se muestran en la Figura 5A y Figura 5B, que comparaba IgM frente a IgG por concentraciones molares. El anticuerpo IgM anti-CD20 presentaba una unión más efectiva, en ambas densidades del antígeno CD20 y, especialmente, en la concentración baja de antígeno CD20 (Figura 5B).

Citotoxicidad dependiente del complemento: ensayo colorimétrico

Las líneas celulares Granta (n.° de cat. de DSMZ ACC 342), Raji (n.° de cat. de ATCC CCL-86), Ramos (n.° de cat. de ATCC CRL-1596), Nalm-6 (n.° de cat. de DSMZ ACC 128) y Namalwa (n.° de cat. de ATCC CRL-1432) eran de ATCC y DSMZ. Se sembraron 50.000 células de cada línea celular en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron con IgM anti-CD20 humana disponible comercialmente diluida en serie (n.° de cat. de Invivogen cat. hcd20-mab5) o IgGI anti-CD20 humana (n.° de cat. de Invivogen hcd20-mab1). Se añadió complemento de suero humano (n.° de cat. de Quidel A113) a cada pocillo a una concentración final del 10 %. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Se añadió reactivo Cell Counting Kit-SK (CCK-SK) (n.° de cat. de Dojindo CK04-13) en 1/10, el volumen total de reacción y la placa se incubaron durante 3 horas más a 37 °C. Se midió la absorbancia a 450 nm mediante un espectrofotómetro.

Los resultados se muestran en la Figura 6A-E. El anticuerpo IgM contra CD20 fue 6 veces más potente en la destrucción celular que la IgG en las células Granta (Figura 6A), tres veces más potente en las células Raji (Figura 6B) y tres veces más potente en las células Ramos (Figura 6C). Ningún anticuerpo fue efectivo para destruir células Nalm-6 (Figura 6D) o células Namalwa (Figura 6E), que expresan niveles bajos o nulos de CD20, respectivamente.

Citotoxicidad dependiente del complemento: ensayo luminiscente

(a) Se utilizó la línea celular Raji que expresa CD20 (n.° de cat. de ATCC CCL-86). Se sembraron 50.000 células en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron con los siguientes anticuerpos diluidos en serie: rituximab (IgGI), IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab J como se produce en el Ejemplo 1, o IgM anti-CD20 humana de 1.5.3 J, producida como se describe en el Ejemplo 1. Se añadió complemento de suero humano (n.° de cat. de Quidel A113) a cada pocillo a una concentración final del 10 %. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Se añadió un volumen de reactivo Cell Titer Glo (n.° cat. de Promega G7572) igual al volumen de medio de cultivo celular presente en cada pocillo. La placa se agitó durante 2 minutos, se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente y se midió la luminiscencia en un luminómetro.

Los resultados se muestran en la Figura 7 y en la Tabla 2. Un anti-CD20 como IgG (rituximab) logró aproximadamente la mitad de la destrucción máxima de células Raji con el complemento, mientras que el isotipo IgM (rituximab) logró una citotoxicidad dependiente del complemento casi máxima. Ambos anticuerpos IgM fueron más potentes en la citotoxicidad dependiente del complemento que el rituximab, y en este experimento, el anticuerpo IgM similar a 1.5.3 fue más potente que el anticuerpo IgM anti-CD20 humana que lleva la VH y VL de rituximab. El anticuerpo IgM similar a 1.5.3 mostró una potencia cuatro veces mayor en comparación con la del anti-CD20 de tipo 1 (rituximab como IgM).

Tabla 2: CDC (CI⁵⁰) en células Raji (|jg/ml)

CI⁵⁰(jg/m l)

IgG1 anti-CD20 (rituximab) >50

IgG anti-CD20 2,0

IgM de 1.5.3 J 0,5

(b) Se repitió el ensayo de CDC como se describe anteriormente usando la línea celular Ramos que expresa CD20 con los siguientes anticuerpos diluidos en serie: rituximab (IgGI), IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab J como se produce en el Ejemplo 1, 1.5.3 (IgGI), IgM anti-cD20 1.5.3 o IgM anti-CD20 1.5.3 J, producida como se describe en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la Figura 8A (rituximab e IgM similar a rituximab) y la Figura 8B (1.5.3, IgM 1.5.3 J, e IgM similar a AcM humano. En este experimento, las versiones de IgG e IgM se compararon sobre una base equivalente molar. Las CI⁵⁰para las versiones de IgM eran todas de 30 a 40 veces más efectivas en la citotoxicidad dependiente del complemento que las versiones de IgG.

(c) A continuación, se compararon los anticuerpos para determinar la actividad CDC en diferentes líneas celulares con niveles de expresión de c D20 decrecientes. El ensayo se llevó a cabo con los siguientes anticuerpos diluidos en serie: rituximab (IgGI), IgM anti-CD20 humana derivada de rituximab J como se produce en el Ejemplo 1, 1.5.3 (IgGI) y IgM anti-CD20 1.5.3 J, producidas como se describe en el Ejemplo 1. Las células usadas fueron células DoHH2 (n.° de DSMZ ACC 47), y se usaron células Z138 (ATCC CRL-3001) en este ensayo. Las células Z138 presentan niveles de expresión de CD20 más bajos que las células DoHH2, como se muestra en la Tabla 4 a continuación. Las células diana se lavaron y se volvieron a suspendieron en medio de ensayo de CDC (RPMI 1640, FBS inactivado por calor al 10 %) y se añadieron a una densidad de 1,0 x 106 células/ml y 10 jl/pocillo a una placa de poliestireno blanco tratada con cultivo de tejidos de 384 pocillos Nunc. Se prepararon diluciones en serie al triple de los anticuerpos de prueba en medio de ensayo, se añadieron 10 jl/pocillo a la placa de ensayo, y la placa se incubó durante 2 horas a 37 °C en una incubadora con CO²al 5 % para permitir que se produjera la opsonización. El complemento de suero humano normal (Quidel) se congeló en partes alícuotas, se descongeló una vez para su uso, se diluyó al 30 % en el medio de ensayo y se añadieron 10 j/pocillo a la placa de ensayo. La placa se incubó durante 4 h a 37 °C en una incubadora con CO²al 5 %. El reactivo Cell Titer-Glo (Promega) se descongeló para su uso y se añadieron 15 j/pocillo a la placa de ensayo. La placa se mezcló suavemente durante 2 minutos en un agitador de placas para lisar las células y, a continuación, durante otros 10 minutos a temperatura ambiente antes de medir la luminiscencia en un lector de placas EnVision (Perkin-Elmer). Después de restar la señal de fondo, se representó el porcentaje de viabilidad frente a la concentración de anticuerpo y se determinaron los valores de CE50 usando GraphPad Prism.

Los resultados se muestran en la Figura 9 y en la Tabla 3. En ambas líneas celulares, las versiones IgM de los anticuerpos presentaron una mayor destrucción de CDC que las versiones IgG. En las células Z-138 que expresan menos CD20, la actividad CDC de las versiones IgM mejoró más de 100 veces con respecto a las versiones de IgG.

Tabla 3: la actividad CDC depende del nivel de expresión del antí eno CD20

Ejemplo 3: preparación de IgM anti-CD20 biespecífica que comprende una cadena J modificada que se une a CD3

Se produjeron IgM anti-CD20 humana similar a rituxan e IgM anti-CD20 1.5.3 como se describe en el Ejemplo 1.

Se construyeron dos variantes de cadena J diferentes con sitios de fusión distintos que incorporaban regiones variables del anticuerpo anti-CD3 visilizumab (Nuvion). A continuación, se muestran las secuencias para dos cadenas J con el scFv correspondiente a visilizumab (V) (VH-(GGGGS)3-VL, doble subrayado) fusionado a la cadena J (cursiva) a través de un conector (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 67, subrayada) que contiene 15 aminoácidos en dos orientaciones diferentes: V15J y J15V. Cada secuencia contiene un péptido señal aminoterminal que se muestra sin subrayado ni cursiva. En ciertos aspectos, otras secuencias de péptidos señal pueden sustituir a los péptidos señal que se muestran aquí.

SEQ ID NO: 63: secuencia de la cadena J modificada por el precursor para V15J (secuencia de ADN: SEQ ID NO: 68):

MGWS YIILFL V AT AT GVHS O V OL V O S GAE VKKPGAS VKV S CKAS

g y t f i s y t m h w v r q a p g o g l e w m g y i n p r s g y t h y n o k l k d k a

TLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWG

OGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIOMTOSPSSLSASVGDRVTI

TCSASSSVSYMNWYOOKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGS

GTDF TLTIS SLOPEDF AT YY C 00 W S SNPPTF GGGTKLEIKGGGGS G

GGGS GGGGS OEDERIVL VDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRII

VPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNOIVTATOSN

ICDEDSATETCYTYDRNKCYTAWPLVYGGETKMVETALTPDACYPD

SEQ ID NO: 64: secuencia de la cadena J modificada madura para VI5J:

OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVROAPGO

GLEWMGYINPRS GYTFTYN OKLKDK ATLT ADKS AS T A YMELS SLR

SEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGOGTLVTVSSGGGGSGGGGS

GGGGSD10MT0SPSSLSASVGDRVT1TCSASSSVSYMNW Y00KPG

KAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYC

OOWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGS6 > ¿m R /F ¿ VDN

KCKCAR1TSRIIRSSEDPNEDIVERN1R1IVPLNNRENISDPTSPLRTRFVY

HLSDL CKKCDPTE VELDNQI VIA TQSNICDEDSA TETC YTYDRNKC YT

A VVPL VYGGETKMVETALTPDACYPD

SEQ ID NO: 65: secuencia de la cadena J modificada precursora para J15V (secuencia de ADN: SEQ ID NO: 69):

MKNHLLFWGVLAVTlKAVtYVKAOEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRS

SEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPT

EVELDNOIVTA TQSNICDEDSA TETCYTYDRNKCYTA W PL VYGGETK

M VETA I.7 ID A ( ’ F/V)GGGGS GGGGS GGGGS OVO LVO S G A E VK K PG

ASVKVSCKASGYTFISYTMHWVROAPGOGLEWMGYINPRSGYT

HYNOKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYY

D YDGF A Y W GO GTEVT VS S GGGGS GGGGS GGGGS DIOMTOSPSSE

SASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYOOKPGKAPKRLIYDTSKLASG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOOWSSNPPTFGGGTK

LEIK

SEQ ID NO: 66: secuencia de la cadena J modificada madura para J15V:

QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENIS

DPTSPLR TRFVYHLSDLCKKCDPTE VELDNQIVTA TQSN1CDEDSATET

CYTYDRNKCYTA W P L VYGGETKMVETAL TPDA CYPDGGGGS GGGG

S GGGGS O VOLVOS G AE VKKPG A S VK VS CK A S G YTFTS YTMHWV

ROAPGOGLEWMGYINPRSGYTHYNOKLKDKATLTADKSASTAY

MELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGOGTLVTVSSGGG

GSGGGGSGGGGSDIOMTOSPSSLSASVGDRVTTTCSASSSVSYMN

WYOOKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOP

e d f a t y y c o q w s s n p p t f g g g t k l e ik

Las construcciones maduras tienen cada una un peso molecular de aproximadamente 45 kD y se pueden unir a la cadena épsilon soluble de CD3 (Sino Biological) o a linfocitos T (datos no mostrados).

Las construcciones de ADN correspondientes a las cadenas pesada y ligera de anti-CD20, así como las correspondientes a las secuencias de cadena J de tipo natural, V15J o J15V, se transfectaron conjuntamente en células de mamífero, por ejemplo, células HEK293 o CHO, y las proteínas se expresaron y purificaron según los procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2015/153912. Las cadenas J fusionadas al scFv anti-CD3 con el conector de 15 aminoácidos se pudieron incorporar a las cadenas pesada y ligera de anti-CD20 para producir una forma pentamérica de IgM biespecífica.

Gel híbrido de agarosa-acrilamida.Las construcciones de IgM se separaron mediante SDS-PAGE no reductora adaptada de un procedimiento descrito anteriormente (Chugai Seiyaki Kabushiki Kaisha, 2010, Pub. n.° : EE UU.

2010/0172899 A1). En resumen, el gel híbrido se mezcló con acrilamida/Bis-acrilamida al 40 %, 37.5:1 (Sigma-Aldrich) y agarosa ultrapura (Invitrogen) a concentraciones finales de 3,6 % y 0,5 %, respectivamente, en tampón Tris 0,375 M, pH 8,8 y glicerol al 15 %. La mezcla resultante se calentó a 50 °C y se inició la polimerización con la adición de TEMED al 0,08 % y persulfato de amonio al 0,08 %. La solución resultante se vertió entre dos placas y la acrilamida se dejó polimerizar a 37 °C durante 1 hora y, a continuación, se dejó a temperatura ambiente durante 30 min para asegurar la polimerización completa. Se cargaron muestras de proteína en el gel híbrido resultante y el gel se procesó en tampón Tris-Acetato SDS Running (Novex) durante 800 Vh. Después, el gel se fijó en metanol al 40 %, acético al 10 % durante 10 minutos, se tiñó usando un kit de tinción Colloidal Blue (Novex) durante al menos 3 horas y, posteriormente, se destiñó en agua.

SDS-Native-PAGE no reductora. Las muestras de proteína se cargaron en un gel Bis-Tris NativePAGE al 3-12 % (Novex). Se añadió tampón Tris-acetato SDS Running (Novex) y el gel se procesó a 40 V durante 15 minutos y, a continuación, a 90 V durante 2 horas. A continuación, el gel se fijó en metanol al 40 %, ácido acético al 10 % durante 10 minutos, se tiñó usando un kit de tinción Colloidal Blue (Novex) durante al menos 3 horas y, posteriormente, se destiñó en agua.

Inmunoelectrotransferencia de la cadena J . Se lavó un gel de acrilamida en condiciones reductoras en una solución de etanol al 20 % durante 10 minutos y, a continuación, la proteína se transfirió a una membrana iBlot PVDF (Invitrogen) usando el sistema iBlot Dry Blotting (Invitrogen) a 20 V durante 10 minutos. Después de la transferencia, la membrana de PVDF se bloqueó usando seroalbúmina bovina al 2 %, Tween 20 al 0,05 % durante al menos 12 horas. Se añadió una dilución 1/500 de cadena J de anticuerpo de Pierce (ThermoFisher) a la membrana, se incubó durante 1 hora y, a continuación, se añadió una dilución 1/5000 de IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch) y se dejó incubar a oscuras durante 30 minutos. Por último, se añadió el sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (ThermoFisher) a la membrana y la señal resultante se visualizó usando el sistema de imágenes ChemiDoc-It HR410 (UVP) o exponiendo la membrana a una película radiográfica.

Como se muestra en la Figura 10A y la Figura 10B, las proteínas e IgM 1.5.3 J de tipo natural y IgM 1.5.3 V15J son visibles como pentámeros de migración más rápida que se distinguen en un gel híbrido de la forma de hexámero de migración más lenta que no contiene una cadena J. La integración de la cadena J se confirma en el gel reductor (Figura 10C), así como la inmunoelectrotransferencia con anticuerpos contra la cadena J (Figura 10D).

Ejemplo 4: ensayo de activación de linfocitos T

Para demostrar que un anticuerpo anti-CD20/anti-CD3 biespecífico podría activar los linfocitos T al unirse a la diana CD20, se realizó el siguiente ensayo. Se cultivaron células T Jurkat manipuladas genéticamente (Promega CS176403) y células RPMI8226 (ATCC CCL-155) en RPMI (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Se incubaron diluciones en serie de IgM 1.5.3 purificada V15J, Blinatumomab (CD19 x CD3 biespecífica) e IgM monoespecífica 1.5.3 con 7500 células RPMI8226 en 20 pl en una placa de ensayo blanca de 384 pocillos durante 2 h a 37 °C con CO²al 5 %. Las células Jurkat manipuladas genéticamente (25.000) se añadieron a la mezcla hasta un volumen final de 40 pl. La mezcla se incubó durante 5 h a 37 °C con CO²al 5 %. A continuación, las mezclas de células se mezclaron con 20 pl de tampón de lisis que contenía luciferina (Promega, Cell Titer Glo) para medir la actividad del indicador de luciferasa. La salida de luz se midió con el lector de placas EnVision y se analizó con el software Prism. La CE50 se determinó mediante un ajuste de una curva de 4 parámetros utilizando el software Prism.

Los resultados se presentan en la Figura 11. La activación de linfocitos T con el anticuerpo 1.5.3-V15J fue mayor que la observada con Blinatumomab en la línea celular RPMI8226. El nivel máximo de activación de linfocitos T mostró una buena correlación con el nivel de expresión de CD20 en la superficie celular como se muestra en la Figura 12 usando una serie de líneas de células tumorales, cada una de las cuales expresa un nivel diferente de antígeno CD20.

Ejemplo 5: destrucción de linfocitos B dirigida por linfocitos T, ensayo de liberación de LDH

Para demostrar que las moléculas de unión de IgM a CD20 x CD3 biespecíficas pueden destruir las células diana en presencia de células de leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T CD8+ (TALL), realizamos experimentos de cultivo conjunto. Se cultivaron conjuntamente 6 x 103 linfocitos B cancerosos con 3 x 104 células TALL (ATCC CRL-11386) en presencia de diferentes concentraciones de los compuestos de ensayo (IgM Rituxan V15J e IgM 1.5.3 V15J) en 45 pl de volumen total de medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % inactivado por calor por pocillo en una placa de cultivo de tejidos negra de 384 pocillos. Después de 24 horas de incubación a 37 °C en una incubadora con CO²al 5 %,se añadieron 15 pl del reactivo de sustrato CytoTox-ONE (Promega, G7891) a cada pocillo para medir el nivel de LDH liberada de las células muertas. Las placas se agitaron brevemente para mezclar los reactivos y, a continuación, se incubaron a temperatura ambiente durante 90 min antes de medir la señal de fluorescencia (485 nm para excitación y 615 nm para emisión) en un lector de placas EnVision (Perkin-Elmer). A continuación, los datos se analizaron con GraphPad Prism para determinar la CE⁵⁰. Como se muestra en la Tabla 4, la CE⁵⁰de la destrucción celular se correlacionó con el nivel de expresión del antígeno CD20 en la superficie celular usando tanto IgM 1.5.3 V15J y IgM V15J Rituximab con una CE50 en la línea celular DB tan baja como 0,4 ng/ml (0,4 pM).

Tabla 4: Destrucción de línfocitos B dirigidos a linfocitos T

E je m p lo 6: e n s a y o d e c ito to x ic id a d in vitro con el k it d e d e te c c ió n K ILR ™

Para examinar la capacidad de IgM 1.5.3 V15J para destruir células tumorales CD20 en sangre completa (es decir, con la inclusión de linfocitos T y complemento), se usó el kit de detección de citotoxicidad in vitro KILR™. La línea celular KILR™ ARH-77 (CD20+) se compró a DiscoverX (97-1001C017) como células diana. Se cultivaron 5-10 x 103 células KILR™ ARH-77 conjuntamente con linfocitos T CD8+ (Precision for Medicine), CMSP (AllCells o Precision for Medicine), o sangre humana anti-coagulada con hirudina (AllCells) en presencia de diferentes concentraciones de compuestos de prueba (IgM 1.5.3 V15J, IgM 1.5.3 J de tipo natural, IgG 1.5.3, IgG Rituximab y blinatumomab) en 200 |jl de volumen total de medio RPMI 1640 complementado con FBS inactivado por calor al 10 % (cuando se usó sangre humana para el cultivo conjunto, se usó menos medio porque la sangre entera absorbió un 20-50 % del volumen) en una placa de poliestireno sin tratamiento de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos (Corning Falcon). Después de 4-48 horas de incubación a 37 °C en una incubadora con CO²al 5 %, las placas se centrifugaron a 27 xg durante 5 min. Se transfirieron 50 j l de los sobrenadantes a una placa de poliestireno blanco de fondo plano de 96 pocillos (Greiner Bio-One) para mezclarlos con 25 j l de solución de trabajo de detección KILR (kit de detección KILR™: DiscoverX 97-0001M) durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente antes de medir la luminiscencia en un lector de placas EnVision (Perkin-Elmer). Las células diana se lisaron con el tampón de lisis suministrado con el kit de detección KILR™ para establecer un control de lisis total. Se representó el porcentaje de viabilidad frente a la concentración de anticuerpo y se determinaron los valores de CE50 usando GraphPad Prism.

Los resultados en presencia de complemento humano normal en sangre completa (con hirudina) se muestran en la F ig u ra 13. Los anticuerpos IgM 1.5.3 J de tipo natural (diamantes) y IgM V15J (cuadrados) mostraron ambos una destrucción muy potente a las cuatro horas. IgG Rituxan (círculos abiertos) y Blinatumomab (triángulos) fueron al menos 30 veces menos potentes.

E je m p lo 7: e s tu d io d e e f ic a c ia in vivo u san d o m o d e lo s d e ra tón co n g e n e s in a c tiv a d o s g a m m a N O D /S C ID h u m a n iza d o s

Los estudios de ratones NSG humanizados CD34+ los realizó In-Vivo Technologies, Inc. Estos ratones son sustitutos de los estudios de inmunoncología humana, ya que poseen células inmunitarias humanas de múltiples linajes en desarrollo. Los ratones se compraron al Laboratorio Jackson y se dosificaron con artículos de prueba mediante inyección en la vena de la cola. Además de un control de vehículo, los artículos de prueba incluían IgM 1.5.3 V15J a 3 jg , 1 jg y 0,3 jg por ratón y rituximab a 1 jg y 0,3 jg por ratón. Se recogieron muestras de sangre a las 6 h, 24 h y 10 días después de la dosis a través de la vena facial. Para los estudios en ratones NSG humanizados con CMSP, se enviaron CMSP congeladas de AllCells al Laboratorio Jackson para su inyección. A cada ratón NSG se le inyectaron 10 millones de CMSP después de una irradiación de cuerpo entero de 100 cGy. Se recogieron muestras de sangre antes y después de la administración en la vena de la cola de los artículos de prueba (como se indicó anteriormente) mediante hemorragia retrorbitaria en puntos temporales designados. Las muestras de sangre de los estudios de ratones CD34+ y CMSP se enviaron de vuelta a IGM Biosciences Inc. para el análisis de linfocitos. Se tiñeron muestras de sangre para los marcadores CD56, CD3, CD19 y CD45 humanas para identificar diferentes poblaciones de linfocitos humanos. Se utilizaron esferas CountBright Absolute Counting (LifeTechnologies, C36950) para cuantificar el número absoluto de linfocitos en las muestras de sangre. Los niveles de linfocitos se representaron y analizaron usando GraphPad Prism.

Los resultados a las 6 horas después de la dosis para IgM 1.5.3 con J de tipo natural y IgM 1.5.3 con V15J, normalizados a los niveles de linfocitos B previos a la dosis, se muestran en la Figura 14A y Figura 14B, respectivamente. El anticuerpo IgM 1.5.3 x V15J biespecífico mostró una potente destrucción de linfocitos B dependiente de linfocitos T en los ratones NSG injertados con tan solo 3 |jg por ratón.

En la Figura 15, de muestra una comparación de los resultados durante todo el período de ensayo entre IgM 1,5,3 x V15J y rituximab.

Tabla 5: Secuencias en la descripción

La extensión y alcance de la presente descripción no se deberían ver limitados por ninguna de las realizaciones ejemplares mencionadas anteriormente, sino que deberían definirse solo según las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión pentamérica que comprende cinco unidades de unión bivalentes y una cadena J o un fragmento funcional o variante de la misma, donde cada unidad de unión comprende dos regiones constantes de la cadena pesada de IgM, cada una asociada con un dominio de unión a antígeno, donde al menos un dominio de unión a antígeno de la molécula de unión es un dominio de unión al antígeno CD20 que comprende: una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2, HCDR3, y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de inmunoglobulina LCDR1, LCDR2 y LCDR3, donde la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40; la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 41; la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43; la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 44; y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45.

2. La molécula de unión de la reivindicación 1, donde las regiones constantes de la cadena pesada de IgM son regiones constantes de IgM humana, cada una de las cuales comprende un dominio C ^|j 2, un dominio Cj 1, un dominio Cj 3 y un dominio Cj4-tp.

3. La molécula de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la cadena J o el fragmento funcional o variante de la misma comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 o un fragmento funcional de la misma.

4. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cadena J o el fragmento funcional o variante de la misma es una cadena J modificada o un fragmento funcional o variante de la misma que comprende además un polipéptido heterólogo, donde polipéptido heterólogo se fusiona directa o indirectamente con la cadena J o el fragmento funcional o variante de la misma.

5. La molécula de unión de la reivindicación 4, donde el polipéptido heterólogo fusionado directa o indirectamente a la cadena J o fragmento funcional o variante de la misma comprende un dominio de unión que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

6. La molécula de unión de la reivindicación 5, donde el polipéptido heterólogo es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD3e.

7. La molécula de unión de la reivindicación 6, donde la cadena J modificada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 (V15J) o la SEQ ID NO: 66 (J15V).

8. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el dominio de unión al antígeno CD20 comprende: una VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 38 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % idéntica a la SEQ iD NO: 42.

9. La molécula de unión de la reivindicación 8, donde el dominio de unión al antígeno CD20 comprende: una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

10. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde cada unidad de unión comprende dos cadenas pesadas de IgM, cada una de las cuales comprende un extremo amino situado en VH a la región constante de IgM, y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden cada una un extremo amino situado en VL a una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, donde las unidades de unión son idénticas, donde las cadenas pesadas de IgM en cada unidad de unión comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, y donde las cadenas ligeras de inmunoglobulina en cada unidad de unión comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.

11. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que puede dirigir la destrucción mediada por complemento, mediada por linfocitos T o mediada por el complemento y mediada por linfocitos T de una célula que expresa CD20 a una potencia más alta que una cantidad equivalente de un an anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, donde el anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico es 1.5.3, que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42.

12. La molécula de unión de la reivindicación 11, donde la célula que expresa CD20 es un linfocito B maligno en un sujeto humano con cáncer, y donde el cáncer es una leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20.

13. La molécula de unión de la reivindicación 12, donde el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab.

14. Una composición que comprende: un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de la cadena pesada de la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la subunidad polipeptídica de la cadena pesada comprende una región constante de la cadena pesada de IgM y al menos la porción VH del anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20; un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad polipeptídica de la cadena ligera, donde la subunidad polipeptídica de la cadena ligera comprende la porción VL del anticuerpo del dominio de unión al antígeno CD20, y un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena J, o fragmento funcional o variante de la misma.

15. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en el tratamiento del cáncer, donde el cáncer es una leucemia, linfoma o mieloma positivo para CD20, donde la molécula de unión se dirige a la destrucción mediada por el complemento, mediada por linfocitos T o tanto mediada por el complemento como por linfocitos T de un linfocito B maligno del cáncer, donde la molécula de unión puede dirigir la destrucción mediada por el complemento de una célula que expresa CD20 a una potencia mayor que una cantidad equivalente de un anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico o fragmento del mismo que se une específicamente al mismo epítopo de CD20 que el dominio de unión al antígeno CD20, y donde el anticuerpo IgG1 bivalente monoespecífico es 1.5.3, que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42.

16. La molécula de unión para el uso de la reivindicación 15, donde el cáncer responde mínimamente o no responde a la terapia con rituximab.