CN107532188A - Cd20结合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供五聚和六聚CD20结合分子，和采用所述分子引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法。

Description

CD20结合分子及其用途
发明人：
B·基特(Bruce Keyt)
O·杜拉玛德(Omar Duramad)
B·T-Y·王(Beatrice Wang)
R·巴利加(Ramesh Baliga)
F·张(Fen Zhang)
背景技术
因人源化的抗体的问世，抗体例如(利妥昔单抗)的治疗应用已彻底改变B细胞恶性肿瘤的治疗。利妥昔单抗(rituximab)，CD20特异性嵌合单克隆抗体，是通过FDA批准用于治疗复发或难治B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的首要有效的目标治疗。该科学成就不仅改变了B细胞淋巴瘤治疗的实践标准，而且激发了下一代代CD20 mAb的极大兴趣。许多新型CD20 mAb已进入临床，它们各自带有结构修饰以进一步改善功效。本申请中，我们描述了一系列CD20抗体，它们能够显示利用其它作用模式的改善的功效，因为这些CD20抗体以非IgG形式表达，例如IgA和IgM。
CD20是36kDa非糖基化的；四-跨膜蛋白(MS4A1基因产物)，其仅在B淋巴细胞上且在超过90％的B淋巴细胞淋巴瘤上表达(参见图1)。CD20在前B细胞晚期时表达，且在最正常的和恶性的B系细胞上上调，然后其在末期分化的血浆细胞中下调。该B淋巴细胞表面分子涉及B细胞向血浆细胞的发育和分化。
尽管利妥昔单抗在B细胞非霍奇金氏淋巴瘤患者中显示显著的抗肿瘤活性，仍然需要改善用于治疗B细胞肿瘤的抗体治疗的功效。利妥昔单抗最为单一药剂治疗导致50％的临床响应率，但仍不清楚剩余的50％患者为何不响应。此外，绝大多数响应性患者对进一步的利妥昔单抗治疗产生了抗性。初始抗性或产生的抗性的一个机制是肿瘤细胞上CD20的下调或调节(或低表达肿瘤的克隆增殖)。医学上仍有如下未解之需：对于这些难治患者(其难治肿瘤具有最小化CD20表达)进行改善的治疗。通过增加与IgA或IgM的多价的亲和性和亲和力，这些新药剂的目标是相较于利妥昔单抗实现改善的响应率。此外，通过改变抗体同种型来改变效应功能可能能够改善CD20抗体的效力和功效。
自从利妥昔单抗的引入以来，关于CD20 mAb的治疗功效的潜在机制已经了解了不少。利妥昔单抗对B细胞死亡的诱导主要通过补体依赖性裂解(CDC)和抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)效应机制，而通过细胞凋亡的程度较小。CD20抗体被描述为I型(例如利妥昔单抗/或奥法木单抗/)，其将CD20重新分配进入去污剂耐受脂质筏；和II型，例如托西莫单抗(B1)和阿托珠单抗/其不进行上述重新分配。通过I型抗体的簇集促进与其它细胞表面蛋白质(例如B细胞受体(BCR))的联合，以及与C1q的结合，导致有力的补体依赖性细胞毒性(CDC)。IgM在诱导补体依赖性的细胞毒性方面是高度有力的，并且就其本身而言CD20抗体的IgM形式能产生显著较大功效。不同的是，II型抗体，例如托西莫单抗(B1)，会引发抗体依赖性细胞毒性，而非补体依赖性细胞毒性。II型抗体在通过抗体诱导的同型粘附和溶酶体性细胞死亡来直接触发细胞死亡方面是非常有力的。抗体的寡聚体形式，例如IgA和IgM显示增加的多价，并且能够显示在诱导同型粘附和细胞死亡方面的增强的功效。重要的是，I型和II型抗体均招募FcR表达型细胞，以介导细胞效应功能，例如抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用。
第二代I型CD20 mAb已获批用于人类应用。奥法木单抗是完全人IgG1，I型CD20mAb，其显示抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)但相较于利妥昔单抗具有更强的补体依赖性细胞毒性(CDC)。作为I型抗体，奥法木单抗在触发细胞死亡方面是相对有效的。奥法木单抗经FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。阿托珠单抗/GA101是人源化的IgG1第二代II型mAb，其显示改善的促凋亡活性，增强的ADCC，但无补体结合活性。阿托珠单抗经FDA批准用于治疗CLL。另一种完全人IgG1κ CD20抗体huMAb 1.5.3(参见美国专利公开号2007-0014720)，设计用于增强效力。临床前研究已显示，huMAb 1.5.3相较于利妥昔单抗具有较大凋亡，并且同时显示有力的CDC以及ADCC活性。HuMAb 1.5.3似乎结合了I型和II型活性，包括通过引导凋亡诱导、CDC和ADCC的有效细胞杀伤。IgM和IgA能够致力于具有增加的亲和力的CD20抗体的进一步增强的效力，这可介导对于低CD20表达肿瘤细胞的增加的敏感性和细胞毒性。此外，I型和II型CD20活性的功效可利用IgA或IgM形式来增加，这允许开发利用最优结合的作用机制(包括触发直接凋亡、增强的CDC和ADCC)的最有力的抗肿瘤抗体。
发明内容
本发明提供多聚结合分子，其包括至少两个二价结合单元或其变体或片段，其中各结合单元包括至少两个重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联。本文提供的结合分子的至少一个抗原结合结构域是CD20抗原结合结构域，其包括六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包括SEQ ID NO:39或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HCDR2包括SEQ ID NO:40或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:40的氨基酸序列；HCDR3包括SEQ ID NO:41或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:41的氨基酸序列；LCDR1包括SEQ ID NO:43或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:43的氨基酸序列；LCDR2包括SEQ ID NO:44或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且LCDR3包括SEQ ID NO:45或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
本公开内容还提供多聚结合分子，其包括至少两个二价结合单元或其变体或片段，其中各结合单元包括至少两个重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联。本文提供的结合分子的至少一个抗原结合结构域是CD20抗原结合结构域，其包括抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)，其中VH包括与SEQ ID NO:38至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包括与SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面中，本文提供的结合分子是二聚结合分子，它包括两个二价IgA结合单元或其片段和J链或其片段或变体，其中各结合单元包括两个IgA重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联。本文提供的二聚IgA结合分子还可包含分泌型组分，或其片段或变体。所述IgA重链恒定区或其片段能各自包括Cα2结构域或Cα3-tp结构域，并且，在某些方面中，还能包括Cα1结构域。在某些方面中，所述IgA重链恒定区可以是人IgA恒定区。在某些方面中，各结合单元包括两个IgA重链，其各自包括位于IgA恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，其各自包括位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
在某些方面中，本文提供的结合分子是分别包括五个或六个二价IgM结合单元的五聚或六聚结合分子，其中各结合单元包括两个IgM重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联。所述IgM重链恒定区或其片段能各自包括Cμ3结构域和Cμ4-tp结构域，并且在某些方面中，还能包括Cμ2结构域、Cμ1结构域，或其任何组合。
其中所述结合分子是五聚化的，该结合分子还可包括J链，或其片段，或其功能片段，或其功能变体。在某些方面中，J链或其片段包括氨基酸序列SEQ ID NO:49或其功能片段。在某些方面中，J链或其片段还可包括异源多肽。所述异源多肽可直接或间接融合至J链或其片段。在某些方面中，所述异源多肽可通过肽接头间接融合至J链或其片段。在某些方面中，所述肽接头可包括，例如，至少5个氨基酸，但不多于25氨基酸。在某些方面中，所述肽接头由GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)组成。所述异源多肽可融合至或接近J链或其片段的N末端，J链或其片段的C末端，或至J链或其片段的N末端和C末端。在某些方面中，所述异源多肽可包括结合结构域，例如，抗体或其抗原结合片段。所述抗原结合片段可以是，例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫-连接的Fv(sdFv)片段，或其任何组合。在某些方面中，所述异源多肽能特异性地结合至CD3ε。例如在某些方面中，所述经修饰的J链可包括氨基酸序列SEQ ID NO:64(V15J)或SEQ ID NO:66(J15V)。此外在某些方面中，这些具体的经修饰的J链还可包括信号肽，其中所述经修饰的J链还包括氨基酸序列SEQ ID NO:63(V15J)或SEQ ID NO:65(J15V)。
在某些方面中，所述IgM重链恒定区可以是人IgM重链恒定区。在某些方面中，各结合单元包括两个IgM重链，其各自包括位于IgM恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，其各自包括位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
在某些方面中，本文提供的多聚结合分子的至少一个结合单元包括所述CD20抗原结合结构域中的两个，其可以是相同或不同的。在某些方面中，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个，或至少十二个拷贝的相同CD20抗原结合结构域。
在其中所述结合分子是IgM结合分子的某些方面中，至少一个结合单元中的所述两个IgM重链包括氨基酸序列SEQ ID NO:56。
在其中所述结合分子包括免疫球蛋白轻链的某些方面中，给定结合单元的所述两个轻链恒定区可以是人λ恒定区或人κ恒定区。在某些方面中，所述两个轻链恒定区是相同的并且包括氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在某些方面中，本文提供的多聚结合分子的结合单元中至少两个，至少三个、至少四个、至少五个或至少六个是相同的。
在某些方面中，相较于特异性地与上述结合分子的一个或多个CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量单特异性、二价IgG1抗体或其片段，所述结合分子能以较高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞的杀伤。在某些方面中，所述单特异性、二价IgG1抗体是1.5.3，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL。在某些方面中，所述CD-20表达型细胞是淋巴瘤细胞系，例如，Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。在其中所述CD20表达型细胞是Raji细胞系的某些方面中，所述结合分子能引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少四倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍，例如，以μg/ml计。在其中所述CD20表达型细胞是Ramos细胞系的某些方面中，所述结合分子能引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍，或至少100倍，例如，以摩尔当量计。在某些方面中，所述CD-20表达型细胞是患癌(例如，CD20阳性白血病、淋巴瘤，或骨髓瘤)对象中的恶性B细胞。在某些方面中，所述癌对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。在某些方面中，该对象是人。
本文还提供包括上文所述的结合分子的组合物。
本文还提供多核苷酸，其包括编码本文提供的多聚结合分子的多肽亚基的核酸序列。在某些方面中，本文提供多核苷酸，其包括编码本文提供的多聚结合分子的重链多肽亚基的核酸序列，其中所述重链多肽亚基包括IgM重链恒定区或其片段或IgA重链恒定区或其片段，和CD20抗原结合结构域的至少抗体VH部分。在某些方面中，所述重链多肽亚基可包括融合至VH的C末端的人IgM恒定区或其片段，所述VH包括(a)HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中HCDR1包括SEQ ID NO:39或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HCDR2包括SEQ ID NO:40或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:40的氨基酸序列；HCDR3包括SEQ ID NO:41或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:41的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO:38至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，所述提供的多核苷酸能编码氨基酸序列SEQ ID NO:56。本文还提供多核苷酸组合物，其包括本文所述的多核苷酸。
本文提供的多核苷酸组合物还可包括，例如，编码轻链多肽亚基的核酸序列，其中所述轻链多肽亚基包括CD20抗原结合结构域的抗体VL部分。在某些方面中，所述轻链多肽亚基可包括融合至VL的C末端的人抗体轻链恒定区或其片段，所述VL包括：(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包括SEQ ID NO:43或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:43的氨基酸序列；LCDR2包括SEQ ID NO:44或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且LCDR3包括SEQ ID NO:45或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:45的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，编码所述轻链多肽亚基的核酸序列能编码氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在本文提供的多核苷酸组合物的某些方面中，编码重链多肽亚基的核酸序列和编码轻链多肽亚基的核酸序列可位于分开的载体上，或它们可位于单一载体上。
本文提供的多核苷酸组合物还可包括，例如，编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列。在某些方面中，所述J链或其片段可包括氨基酸序列SEQ ID NO:49或其功能片段。此外，J链或其片段可以是还包括异源多肽的经修饰的J链。在某些方面中，所述异源多肽可以直接或间接融合至J链或其片段。在某些方面中，所述异源多肽可包括抗体或其抗原结合片段。在某些方面中，所述异源多肽可以是，例如，能特异性地结合至CD3ε的scFv。在某些方面中，所述经修饰的J链可包括氨基酸序列SEQ ID NO:64(V15J)或SEQ ID NO:66(J15V)。在其中经修饰的J链还包含信号肽的那些方面中，该经修饰的J链可包括氨基酸序列SEQ ID NO:63(V15J)或SEQ ID NO:65(J15V)。在本文提供的多核苷酸组合物的某些方面中，编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列可包括SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69。
在本文提供的多核苷酸组合物的某些方面中，编码重链多肽亚基的核酸序列、编码轻链多肽亚基的核酸序列，和编码J链的核酸序列可位于单一载体上，或它们可位于两个或三个分开的载体上。本文还提供一种或多种载体，它们各自或共同包含本文提供的多核苷酸组合物。本文还提供宿主细胞，其包括本文提供的多核苷酸、本文提供的多核苷酸组合物，或本文提供的载体或载体，其中所述宿主细胞能表达本文提供的多价抗CD20结合分子。本发明还提供一种产生本文提供的多价抗-CD20结合分子的方法，其中，所述方法包括培养所述宿主细胞和回收所述结合分子。
在某些方面中，本文提供用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，其中，所述方法包括使CD20表达型细胞与本文提供的多聚结合分子或包含本文提供的结合分子的组合物接触。根据这些方面，相较于特异性地与CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段，所述结合分子能以更高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞的杀伤。在某些方面中，所述单特异性、二价IgG1抗体是1.5.3，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL。在某些方面中，所述CD-20表达型细胞是淋巴瘤细胞系，例如，Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。在某些方面中，所述CD20表达型细胞是Raji细胞系，并且所述结合分子引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少四倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍，例如，以μg/ml计。在其中所述CD20表达型细胞是Ramos细胞系的某些方面中，所述结合分子能引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍，或至少100倍，例如，以摩尔当量计。在某些方面中，所述CD-20表达型细胞是患癌(例如，CD20阳性白血病、淋巴瘤，或骨髓瘤)对象中的恶性B细胞。在某些方面中，所述癌对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。在某些方面中，该对象是人。
在其它方面中，本文提供用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，其中所述方法包括，使CD20表达型细胞与二聚、五聚或六聚结合分子接触，所述二聚、五聚或六聚结合分子分别包括两个、五个，或六个二价结合单元，其中各结合单元包括两个IgA或IgM重链恒定区或其片段和两个抗原结合结构域，其中所述结合分子的至少一个抗原结合结构域是CD20抗原结合结构域，并且其中，相较于特异性地与CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段，所述结合分子能以更高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞的杀伤。
根据这些提供的方法，所述CD20抗原结合结构域可包括六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包括SEQ ID NO:2或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；HCDR2包括SEQ ID NO:3或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列；HCDR3包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:4、或具有一个、两个或三个单氨基酸取代的SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR1包括SEQ ID NO:6或具有一个、两个或三个单氨基酸取代的SEQ ID NO:6的氨基酸序列；LCDR2包括SEQ ID NO:7或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列；并且LCDR3包括SEQ ID NO:8或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
根据这些提供的方法，所述CD20抗原结合结构域可包括VH和VL，其分别包括：(a)与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；(c)与SEQID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ IDNO:18至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；(d)与SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；(e)与SEQ ID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:32至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；或(f)与SEQ ID NO:35至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:37至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
根据这些提供的方法，所述结合分子的IgA重链恒定区或其片段可各自包括Cα2结构域或Cα3-tp结构域，并且一个或多个IgA重链恒定区或其片段还可包括Cα1结构域。在某些方面，IgA重链恒定区是人类重链恒定区。在某些方面中，根据这些提供的方法的二聚结合分子还可包括分泌型组分。
根据这些提供的方法，所述结合分子的IgM重链恒定区或其片段各自包括Cμ3结构域和Cμ4-tp结构域，并且在某些方面中，还可包括Cμ2结构域、Cμ1结构域，或其任何组合。在某些方面中，所述IgM重链恒定区是人IgM恒定区。
根据这些提供的方法，其中所述结合分子是二聚或五聚时，所述结合分子还可包括J链，或其功能片段，或其功能变体。在某些方面中，J链或其片段包括氨基酸序列SEQ IDNO:49或其功能片段。在某些方面中，J链或其片段还可包括异源多肽。所述异源多肽可直接或间接融合至J链或其片段。在某些方面中，所述异源多肽可通过肽接头间接融合至J链或其片段。在某些方面中，所述肽接头可包括，例如，至少5个氨基酸，但不多于25氨基酸。在某些方面中，所述肽接头由GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)组成。所述异源多肽可融合至或接近J链或其片段的N末端，J链或其片段的C末端，或至J链或其片段的N末端和C末端。在某些方面中，所述异源多肽可包括结合结构域，例如，抗体或其抗原结合片段。所述抗原结合片段可以是，例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫-连接的Fv(sdFv)片段，或其任何组合。在某些方面中，所述异源多肽能特异性地结合至CD3ε。例如在某些方面中，所述经修饰的J链可包括氨基酸序列SEQ ID NO:64(V15J)或SEQ ID NO:66(J15V)。此外在某些方面中，这些具体的经修饰的J链还可包括信号肽，其中所述经修饰的J链还包括氨基酸序列SEQ ID NO:63(V15J)或SEQ ID NO:65(J15V)。
根据这些提供的方法，所述结合分子的各结合单元可包括两个IgA或IgM重链，其各自包括位于所述IgA或IgM恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，其各自包括位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。在某些方面中，所述结合分子的至少一个结合单元包括两个相同的CD20抗原结合结构域，并且其中所述至少一个结合单元中的两个IgA或IgM重链是相同的。在一些方面中，至少一个结合单元中的两个IgM重链包括氨基酸序列SEQ ID NO:52。在一些方面中，所述两个轻链恒定区是人λ恒定区或人κ恒定区，其可以是相同的并且包括氨基酸序列SEQ ID NO:54。
根据这些提供的方法，所述结合分子可包括至少两个，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个CD20抗原结合结构域，其在某些方面中可以是相同的。根据这些提供的方法，所述结合分子中至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元可以是相同的。
根据这些提供的方法，参比单特异性、二价IgG1抗体可以是利妥昔单抗，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL。
根据这些提供的方法，所述CD-20表达型细胞是淋巴瘤细胞系，例如，Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。在其中所述细胞系是Granta细胞系的某些方面中，所述结合分子能引导的该细胞系的补体介导的杀伤是利妥昔单抗效力的约六倍。在某些方面中，其中所述细胞系是Raji细胞系或Ramos细胞系，并且其中所述结合分子能引导的该细胞系的补体介导的杀伤是利妥昔单抗效力的约三倍。
根据这些提供的方法，CD-20表达型细胞可以是患癌(例如，CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)对象中的恶性B细胞。在某些方面中，所述癌对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。在某些方面中，该对象是人。
附图简述
图1：CD20分子的分子图。CD20是四次跨膜蛋白质，其主要保留于B细胞的膜上且不在抗体结合后内化。指示了CD20单克隆抗体、利妥昔单抗和奥法木单抗的结合位点。包括了CD20的线形图，以显示跨膜(TM)、胞外结构域(ECD)和胞质区的取向。
图2：IgG、IgM六聚体和IgM五聚体的示意图。IgG显示为150kDa蛋白质，并且指示重链和轻链。包括J链的IgM指示为约915kDa的五聚体。不含J链的IgM显示为分子量约1080kDa的六聚体。
图3：IgG和IgM的非还原性SDS-PAGE。基于利妥昔单抗，IgG和IgM CD20抗体在非还原性SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上跑动。第一和最末泳道是分子量标准品。鼠和人IgG1抗体(分别是第二和第三泳道)显示约150kDa的分子量。IgM+J链形式(市售可得的CD20 IgM抗体，可获自英杰公司(Invivogen))显示约1050kDa的分子量(第四泳道)。包括抗CDIM抗体IGM-55.5(参见PCT公开号WO2013/120012)(第五泳道)，作为另一IgM，以供比较。
图4：抗CD20 IgM寡聚体的组装。非还原性SDS-PAGE显示，包含利妥昔单抗和1.5.3的可变结构域的抗CD20抗体可组装为IgM。利妥昔单抗IgM示于第一幅图，不含J链(泳道2)，和含J链(泳道3)。1.5.3 IgM示于第二幅图，不含J链(泳道2)和含J链(泳道3)。
图5A：ELISA结果，其显示1.5.3 IgM和1.5.3 IgG与CD20以高抗原密度(10μg/ml)结合。
图5B：ELISA结果，其显示1.5.3 IgM和1.5.3 IgG与CD20以低抗原密度(0.3μg/ml)结合。
图6A-E：在补体依赖性的细胞毒性方面，抗CD20 IgM比抗CD20 IgG更有力。人培养的白血病或淋巴瘤细胞与市售可得的抗CD20 IgM或IgG加10％人补体孵育。细胞活力在4小时后采用代谢指标染料(CCK8)检测。在大多数淋巴瘤细胞系(Granta(图6A)、Raji(图6B)和Ramos(图6C))中，在补体存在下，抗CD20的IgM同种型比对应的IgG同种型更有力。以供比较，该试验还在Namalwa细胞(图6E)(其显示CD20的最小表达)和Nalm-6细胞(图6D)(其缺乏CD20表达)中进行。
图7：在补体依赖性的细胞毒性方面，在Raji细胞系中，抗CD20 IgM比利妥昔单抗更有力，以μg/ml为基准计。
图8A-B：在补体依赖性的细胞毒性方面，抗CD20 IgM比利妥昔单抗和1.5.3IgG更有效。Ramos细胞与递增浓度的抗CD20 IgM或IgG和10％人补体孵育。4小时后检测细胞活力。图8A：比较利妥昔单抗(IgG)和利妥昔单抗样IgM+J链。图8B：比较1.5.3(IgG)、1.5.3IgM和1.5.3 IgM+J链。各图中的表格显示EC50结果，以摩尔浓度计。
图9：利妥昔单抗IgG1(空心圆)、利妥昔单抗源性的抗人CD20 IgM+J(实心圆)、1.5.3 IgG1(空心方块)，和1.5.3抗CD20 IgM+J(实心方块)在DOHH2和Z138细胞上的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
图10：通过凝胶电泳和western印迹表征1.5.3 IgM抗体。泳道关键信息：1：标志物；2：1.5.3 IgM+V15J；3：1.5.3 IgM+wtJ；4：1.5.3 IgM(六聚体)；5：标志物。图10A：显示杂化凝胶上的六聚体和五聚体形式。图10B：显示通过非还原性SDS-PAGE离析的抗体。图10C：显示通过还原性SDS-PAGE离析的抗体。图10C中的凝胶转移至膜，并通过western印迹检测J链，示于图10D。
图11：1.5.3 IgM+V15J(实心方块)引发CD20+RPMI8226细胞和经工程改造的Jurkat T细胞的共同培养物中的T细胞活化的程度大于博纳吐单抗(实心圆)或1.5.3 IgM+wt J(空心方块)。
图12：通过1.5.3 IgM V15J的T细胞活化与CD20表达的关系，采用一系列肿瘤细胞系，其各自表达不同的水平的CD20抗原(表示为平均荧光强度或MFI)。
图13：人血中的肿瘤细胞杀伤，采用KILRTM检测试验。关键信息：菱形：1.5.3 IgM+V15J；方形：1.5.3 IgM+野生型J；实心圆：1.5.3 IgG；空心圆利妥昔单抗IgG；三角形：博纳吐单抗。
图14A-B：用CD34+细胞移植以产生人造血系统的NSG小鼠中的体内T细胞引导的B细胞杀伤。对小鼠给予单特异性或双特异性1.5.3 IgM，并且在给药前和给药后6小时检测人B细胞数量。图14A：显示具有野生型J链的单特异性抗体的结果，而图14B显示具有V15J抗CD3J链的双特异性的结果。
图15：1.5.3+V15J(上排)和利妥昔单抗(下排)之间的B细胞杀伤和回复(给药后10天)的比较。
具体实施方式
定义
本文所述术语“一个”或一种”实体指一种或多种该实体；例如，“一种结合分子”应理解为表示一种或多种结合分子。如此，本文所述术语一个摂(或一种摂)、一个或多个摂和至少一个摂在本文中可互换使用。
此外，本文所用“和/或”时应视作具体公开了两种特征或组分的每一种，有或没有另一种。因此，本文短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B(单独)。”同样，短语如“A、B、和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括各种以下实施方式：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另有定义，本文使用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，《生物医药和分子生物学简明词典》(Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRCPress)；《细胞和分子生物学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；和《牛津生物化学和分子生物学辞典》(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，向技术人员提供了本发明使用的很多术语的常用词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，氨基酸以氨基到羧基的取向从左到右书写。本文提供的标题不是本发明的各种方面的限制，可以参考说明书整体理解本发明的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。
本文所用的术语“多肽”意在包括单数形式“多肽”和复数形式“多肽”，指由酰胺键(也称肽键)线性连接的多个单体(氨基酸)所组成的分子。术语"多肽"指的是两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链，并且不表示特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与任意这些术语替代或互换使用。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化，和通过已知保护/阻断基团衍生化、蛋白酶切割或非天然产生氨基酸修饰。多肽可由生物来源衍生或由重组技术产生，但不必定由指定核酸序列翻译而来。其可以任何方式产生，包括通过化学合成。
本文公开的多肽的大小可以是约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，但它们不必定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽被称为折叠多肽，不具有确定三维结构但能采用大量不同构象的多肽被称为非折叠多肽。本文所用的术语糖蛋白指偶联于至少一个糖部分的蛋白质，所述糖部分通过某一氨基酸如丝氨酸或天冬酰胺的含氧或含氮侧链连接于蛋白质。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不处于其天然环境中的多肽。没有规定的具体纯化水平。例如，可从其自然或天然环境中移出分离多肽。在宿主细胞中表达的重组产生多肽和蛋白质被认为是如本文公开的分离的，通过任何合适技术分离、分级，或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也如此。
本文中所用的术语“非天然产生的多肽”或其任何语法变化形式，是条件性的限定，其明确地排除，但仅排除，被法官或管理部门或司法机关或可能会被法官或管理部门或司法机关确定或解释为“天然产生的”那些多肽形式。
本文公开的其它多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。本文所述的术语"片段"、"变体"、"衍生物"和"类似物"包括保持对应的原始抗体或多肽的至少一些性质(例如，特异性结合至抗原)的任何多肽。除本文他处讨论的具体抗体片段外，多肽的片段还包括，例如，蛋白酶水解片段以及缺失片段。例如，多肽的变体包括如上所述的片段，以及因氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些方面中，变体可以是非天然产生的。可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已经改变从而显示原始多肽上不存在的其它特征的多肽。例子包括融合蛋白。多肽变体在本文中也可称作“多肽类似物”。本文所用的多肽的"衍生物"还可指：具有通过功能侧基的反应经由化学方法衍生的一个或多个氨基酸的对象多肽。“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸中的一个或多个衍生形式的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；且鸟氨酸可取代赖氨酸。
“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸替代的情况。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸的家族，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方式中，本发明的多肽和抗体的序列中的保守取代不废除包含所述氨基酸序列的多肽或抗体与所述结合分子结合的抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell等，Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:.412-417(1997))。
术语“多核苷酸”意在包括单个核酸和多个核酸，指分离的核酸分子或构建物，例如信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”或“核酸序列”指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，如DNA或RNA片段。
"分离的"核酸或多核苷酸意为与其原始环境分离的核酸或多核苷酸的任何形式。例如，凝胶纯化的多核苷酸，或编码载体中所含多肽的重组多核苷酸将被视作是“分离的”。并且，认为已被工程改造以具有供于克隆的限制性位点的多核苷酸区段，例如，PCR产物，是“分离的”。分离的多核苷酸的其它示例包括在异源性宿主细胞中维持的重组多核苷酸或在非原始溶液(例如缓冲液或盐水)中(部分地或基本上地)纯化的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录本，其中，所述转录本不是自然中存在的转录本。分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成方式产生的这样的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调节元件例如启动子、核糖体结合位点，或转录终止子。
本文中所用的术语“非天然产生的多核苷酸”或其任何语法变化形式，是条件性的限定，其明确地排除，但仅排除，被判定机构或管理部门或司法机关或可能会被被判定机构或管理部门或司法机关确定或解释为“天然产生的”那些核酸或多核苷酸形式。
本文所用的术语“编码区”指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单一多核苷酸构建物中，例如在单一载体上，或者在分开的多核苷酸构建物中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体均能包含单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如，单一载体可分开编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可包括异源性的编码区，其融合或未融合至另一个编码区。异源性的编码区包括不限于，编码专有的元件或基序(例如分泌信号肽或异源性的功能结构域)的那些。
在某些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。对DNA而言，包含多肽编码核酸的多核苷酸通常包含启动子和/或其它转录或翻译控制元件，这些元件与一个或多个编码区操作性连接。操作性连接指当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以此方式连接时，将该基因产物的表达置于该调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的mRNA转录，且如果两个DNA片段间连接的属性不干扰表达调控序列指导基因产物表达或不干扰转录DNA模板的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区及其相连的启动子)“操作性连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与多肽编码核酸操作性连接。启动子可以是在预定细胞中指导DNA实质转录的细胞特异性启动子。启动子以外的其它转录控制元件如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，能与多核苷酸可操作连接以指导细胞特异性转录。
多种转录控制区对于本领域技术人员而言是已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联用)、猿病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，通过干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。它们包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
在其它实施方式中，多核苷酸可以是RNA，例如，信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA的形式。
多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的其它编码区相关联，所述编码分泌或信号肽引导本文所述的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链跨粗面内质网的输出启动，所述序列从成熟蛋白质上切除。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽可具有融合于所述多肽N末端的信号肽，它们从完整或“全长”多肽上切割产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者使用仍然能够指导与其操作性相连多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者，可采用异源性的哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可用小鼠β-葡萄糖醛酸酶或人组织纤溶酶原激活剂(TPA)的前导序列取代。
本文中所用的，术语“CD20”指在B淋巴细胞表面上表达的膜蛋白质。CD20蛋白在文献中以其它名称表示，例如，B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Bp35、CVID5、LEU-16、跨膜4-结构域亚家族A成员1，或MS4A2。人CD20的氨基酸序列(GenBank登录号NP_690605.1)在本文中公开为SEQ ID NO:50(表2)。
本文公开了某些结合分子，或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非特定地述及全尺寸抗体，否则术语"结合分子"涵盖全尺寸抗体以及所述抗体的抗原结合亚基、片段、变体、类似物或衍生物，例如，以类似于抗体分子的方式结合抗原但采用不同的支架的工程改造的抗体分子或片段。
本文中所用的术语“结合分子”以其最宽泛的含义指特异性结合至靶标或分子决定簇(例如，表位或抗原决定簇)的分子。如本文进一步描述，结合分子可包含本文所述的一个或多个“抗原结合结构域”。结合分子的非限制性示例是抗体或其保持抗原-特异性结合的片段。
本文中所用的术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”指的是足以特异性结合至表位的结合分子的区域。例如，“Fv”，例如，抗体的可变重链和可变轻链，作为两个分开多肽亚基或作为单一链，被视作是“结合结构域”。其它结合结构域包括但不限于，源自骆驼科物种的抗体的可变重链(VHH)，或在纤连蛋白支架上表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。本文所述的“结合分子”可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个“抗原结合结构域”。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体(或其片段、变体或衍生物，如本文所述)包括：至少重链的可变区(对于骆驼科物种而言)或至少重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对较好地了解的。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，第2版，1988)。除非另有说明，术语“抗体”涵盖从抗体的小抗原结合片段到全尺寸抗体的范围内的任何物质，例如，IgG抗体，其包括两个完整重链和两个完整轻链，IgA抗体，其包括四个完整重链和四个完整轻链，并且可以包括J链和/或分泌型组分，或IgM抗体，其包括十个或十二个完整重链和十个或十二个完整轻链，并且可以包括J链。
正如下文中更详细讨论，术语“免疫球蛋白”包括可通过生化性质区分的各种类型多肽。本领域技术人员应理解，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(如γ1-γ4或α1-α2)。该链的特性决定抗体“同种型”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2已被充分表征，且已知赋予功能特化。根据本文公开内容，本领域技术人员能容易地区分这些免疫球蛋白各自的经修饰形式，从而，它们涵盖在本发明范围内。
轻链分类为kappa或lambda(κ、λ)。各重链类别可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合，并且当由例如杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞表达免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从Y构型的分叉末端处的N-端到各条链的底部处的C-端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基础结构包括两个重链亚基和两个轻链亚基，其通过二硫键共价连接以形成“Y”结构，也在本文中称为“H2L2”结构，或“结合单元”。
本文中所用的术语“结合单元”指结合分子的部分，例如，抗体或其抗原结合片段，其对应于标准免疫球蛋白结构，例如，两个重链或其片段和两个轻链或其片段，或两个重链或其片段，例如，衍生自骆驼科或软骨鱼抗体。在例如其中所述结合分子是二价IgG抗体或其抗原结合片段的某些方面中，术语“结合分子”和“结合单元”是等同的。在例如其中所述结合分子是IgA二聚体、IgM五聚体或IgM六聚体的其它方面中，所述结合分子包含两个或更多个“结合单元”。分别地，在IgA二聚体的情况中是两个，或在IgM五聚体或六聚体的情况中是五个或六个。结合单元不必包括全长抗体重链和轻链，但通常将是二价的，即，将包括两个“结合结构域”，如下定义。本文提供的某些结合分子是二聚、五聚或六聚的，并且包括两个、五个或六个二价结合单元，其包括IgA或IgM恒定区或其片段。本文中所用的，包含两个或更多个结合单元，例如，两个、五个或六个结合单元的结合分子可称作“多聚”。
本文中所用的术语“原初序列J链”或“原初J链”指任何动物物种的原初序列IgM或IgA抗体的J链，包括成熟人J链，其氨基酸序列示作SEQ ID NO:49。
本文中所用的术语“经修饰的J链”指包含异源部分的原初序列J-链多肽的变体，例如，异源多肽，例如，引入所述原初序列中的外来结合结构域。该引入可通过任何方式实现，包括所述异源多肽或其它部分的直接或间接融合或通过经由肽或化学接头的连接。术语“经修饰的人J链”涵盖但不限于，SEQ ID NO:49的氨基酸序列的原初序列人J链，或其经引入异源部分而被修饰的功能片段，所述异源部分例如，异源多肽，例如，外来结合结构域。在某些方面中，所述异源部分不干扰IgM向五聚体或IgA向二聚体的高效聚合和所述聚合物与靶标的结合。示例性的经修饰的J链可见于，例如，PCT公开号WO 2015/153912，其通过引用其全文纳入本文。
术语“价”、“二价”、“多价”和语法等同形式，指的是给定的结合分子或结合单元中抗原结合结构域的数量。如此，述及给定的结合分子，例如，IgM抗体或其片段，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示存在两个抗原结合结构域、四个抗原结合结构域，和六个抗原结合结构域。在其中各结合单元是二价的典型的IgM源性的结合分子中，该结合分子本身可具有10或12价。在其中各结合单元是二价的典型的IgA源性的结合分子中，该结合分子本身可具有4价。二价或多价结合分子可以是单特异性的，即，所有抗原结合结构域均是相同的，或可以是双特异性的或多特异性的，例如，其中两个或更多个抗原结合结构域是不同的，例如，结合至相同的抗原上的不同的表位，或结合至完全不同的抗原。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体的任何分子决定簇。在某些方面中，表位可包括分子的化学活性的表面基团(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团)，而在某些方面中，表位可具有一定的三维结构特点和/或特定的电荷特点。表位是由抗体结合的靶标的区域。
“多特异性结合分子或抗体”或“双特异性结合分子或抗体”指结合分子、抗体、或其抗原结合片段，其具有与两个或多个不同的表位在相同或不同靶标上特异性结合的能力。“单特异性”指与唯一一种表位结合的能力。
术语“靶标”以最广泛的含义使用以包括可由结合分子结合的物质。靶标可以是，例如，多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其它分子。此外，例如，“靶标”可以是包含可被结合分子结合的表位的细胞、器官或生物体。
轻链和重链都划分成结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，应理解可变轻(VL)链或可变重(VK)链部分的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定区(CL)和重链的恒定区(例如，CH1、CH2、CH3或CH4)提供生物学特性，例如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或抗体的氨基端而增加。N末端部分是可变区，并且C末端部分是恒定区；CH3(或在IgM的情况中的CH4)和CL结构域实际上分别是重链和轻链的羧基端。
“全长IgM抗体重链”是这样的多肽，其以N末端向C末端的方向包括，抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定结构域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定结构域3(CM3或Cμ3)，和抗体重链恒定结构域4(CM4或Cμ4)，其可包括尾片段。
“全长IgA抗体重链”是这样的多肽，其以N末端向C末端的方向包括，抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CA1或Cα1)、抗体重链恒定结构域2(CA2或Cα2)，和抗体重链恒定结构域3(CA3或Cα3)，其可包括尾片段。单体或分泌IgA的结构在例如Woof,JM和Russell,MW,Mucosal Immunology 4:590-597(2011)中描述。
如上所示，可变区(即，“抗原结合结构域”)允许结合分子选择性地识别且特异性地结合抗原上的表位。即，结合分子(例如抗体)的VL结构域VH结构域(或仅骆驼科或软骨鱼抗体的VH结构域(指定为VHH))，或互补决定区(CDR)，可合并以形成抗原结合结构域。更具体地，所述抗原结合结构域可由各VH和VL链上的三个CDR(或VHH上的3个CDR)确定。某些抗体形成较大结构。例如，IgA可形成这样的分子，它包括两个H2L2结合单元、J链和分泌型组分，其通过二硫键共价连接；并且IgM可这样的形成二聚、五聚或六聚分子，它包括两个、五个或六个H2L2结合单元，和任选地，通过二硫键共价连接的J链。
抗体抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是氨基酸的非连续短序列，其特异性地定位，以随着抗体在水性环境中采用其三维构型而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸称为“构架”区，显示较小的分子间差异。构架区主要采用β-片层构象，并且CDR形成连接β-片层结构且在某些情况下形成β-片层结构的部分的环。因此，构架区用于通过链间非共价相互作用形成为CDR提供正确方向位置的支架。定位的CDR形成的抗原结合结构域确定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其互补表位的非共价结合。分别组成CDR和构架区域的氨基酸，可由本领域普通技术人员通过任何给定的重或轻链可变区而容易地鉴定，因为它们已以多种不同的方式被定义(参见，"免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)"，Kabat,E.等，美国卫生及公共服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，其通过引用其全文纳入本文)。
除非明确表述为相反的含义，否则在本领域内所使用和/或接受的某一术语有两种或多种定义的情况下，本文所用的术语定义应包括所有这些含义。具体示例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这些具体的区域已被描述，例如，由Kabat等，美国卫生及公共服务部，"免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)"(1983)，和由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其通过引用纳入本文。Kabat和Chothia定义包括氨基酸在彼此比较时的重叠或子集。不过，除非另有说明，述及抗体或其变体的CDR的定义(或本领域普通技术人员已知的其它定义)意图落在本文定义或所用的术语范围之内。合适的氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，如下表1所示以作对比。涵盖具体CDR的确切氨基酸编号将根据CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员能够常规地确定哪些氨基酸包含具体CDR。
表1 CDR定义*
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
*表1中所有CDR定义的编号均按照Kabat等所述的编号规则(见下文)。
可以使用例如IMGT信息系统(www://imgt.cines.fr/)(/V-Quest)对免疫球蛋白可变结构域进行分析，以鉴定不同区段，包括CDR。参见例如，Brochet,X等，Nucl.Acids Res.36:W503-508(2008)。
Kabat等也定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将所述“Kabat编号系统”应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。本文所用的“Kabat编号”指Kabat等(1983)美国卫生与公众服务部，“免疫学热门蛋白质序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)”(1983)中所述的编号系统。除非明确注明采用Kabat编号系统，否则，对本发明的氨基酸序列采用连贯的编号。
结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于，多克隆、单克隆、人、人源化的或嵌合抗体、单一链抗体、表位-结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段，通过Fab表达文库产生的片段。ScFv分子是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号5,892,019。
"特异性结合"一般表示，结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物通过其抗原结合结构域结合至表位，并且所述结合需要所述抗原结合结构域和所述表位之间的一些互补性。按照这一定义，当结合分子通过其抗原结合结构域与表位结合比与随机无关的表位结合更容易时，称该结合分子“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，可认为结合分子“A”比结合分子“B”对给定表位具有更高特异性，或者可以说结合分子“A”以比对相关表位“D”的特异性更高的特异性或亲和性结合表位“C”。
可以说结合分子，例如，本文公开的抗体或其片段、变体或衍生物，以小于或等于5X10-2秒-1、10-2秒-1、5X10-3秒-1、10-3秒-1、5X10-4秒-1、10-4秒-1、5X10-5秒-1或10-5秒-15X10-6秒-1、10-6秒-1、5X10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率(k(off))结合靶标抗原。
可以说本文公开的结合分子，例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物，以大于或等于103M-1秒-1、5X103M-1秒-1、104M-1秒-1、5X104M-1秒-1、105M-1秒-1、5X105M-1秒-1、106M-1秒-1或5X106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合速率(k(on))结合靶标抗原。
如果结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物，以一定程度上阻断参比抗体或抗原结合片段与该表位的结合的程度优先结合至该表位，则可以说，该结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物竞争性地抑制参比抗体或抗原结合片段与给定的表位的结合。可通过本领域已知的任意方法确定竞争性抑制，例如，竞争ELISA试验。可以说，结合分子竞争性地抑制参比抗体或抗原结合片段与给定表位的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％的结合。
本文所用的术语“亲和性”指单独表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个结合结构域结合的强度量度。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:ALaboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)，第27-28页。本文中所用的术语“亲和力(avidity)”指的是抗原结合结构域的群体和抗原之间的复合物的总体稳定性。参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独抗原结合结构域与特定表位的亲和性相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一个例子。二价单克隆抗体与以高密度存在于细胞表面上的受体之间的相互作用也将具有高亲和力。
本文公开的结合分子或其抗原结合片段、变体或衍生物也可就其交叉反应性进行描述或说明。本文所用的术语“交叉反应性”指，结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)对某一种抗原具有特异性、与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间关联性的量度。因此，如果结合分子与诱导其形成的表位以外的其他表位结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更匹配。
结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物还可就它们与抗原的结合亲和性来描述或说明。例如，结合分子可以不超过5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10- 5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的解离常数或KD结合至抗原。
包括单链抗体或其它结合结构域的抗体片段可单独存在或以如下一种或多种的组合的形式存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链，或分泌型组分。还包括抗原结合片段，其可包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌型组分中的一个或多个的任何组合。结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段，可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。所述抗体可以是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲鸵、马或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区可以是软骨鱼(condricthoid)来源(例如，来自鲨鱼)。本文中所用的"人"抗体包括，具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括从人免疫球蛋白文库分离或来自一种或多种人免疫球蛋白的动物转基因的抗体，并且其可在一些示例中表达内源性免疫球蛋白，但一些则不是，如下文所述，例如，描述于Kucherlapati等的美国专利号5,939,598。
本文中所用的术语“重链亚基”包括这样的氨基酸序列，其源自免疫球蛋白重链、结合分子，例如，包含重链亚基的抗体，可包括如下至少一项：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或其变体或片段。例如，结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物，除了VH结构域以外，还可包括但不限于：CH1结构域；CH1结构域，铰链和CH2结构域；CH1结构域和CH3结构域；CH1结构域，铰链和CH3结构域；或CH1结构域，铰链结构域，CH2结构域和CH3结构域。在某些方面中，结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物，除VH结构域以外，还可包括，CH3结构域和CH4结构域；或CH3结构域，CH4结构域和J链。此外，用于本发明的结合分子可缺乏某些恒定区部分，例如，CH2结构域的全部或部分。本领域普通技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链亚基)，从而其氨基酸序列不同于原始免疫球蛋白分子。
本文所用的术语“轻链亚基”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基包括至少VL，并且还可包括CL(例如，Cκ或Cλ)结构域。
结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可就它们识别或特异性结合的表位或抗原部分进行描述或说明。靶抗原与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可包含单个表位，或至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。
本文所用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫键或桥接第二巯基基团的巯基基团。
本文所用的术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(其可能是完整、一部分或修饰的)获自第二物种。在一些实施方式中，靶标结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人的。
术语“多特异性抗体”，例如，“双特异性抗体”，指的是在单一抗体分子中具有针对两个或更多个不同的表位的抗原结合结构域的抗体。可构建除了标准抗体结构以外的具有两种结合特异性的其它结合分子。由双特异性抗体或多特异性抗体进行的表位结合可以是同时或相继的。三元杂交瘤(trioma)和杂合杂交瘤是可分泌双特异性抗体的细胞系的两个示例。双特异性抗体还可通过重组手段构建。(和Heiss,Future Oncol.6:1387-94(2010)；Mabry和Snavely,IDrugs.13:543-9(2010))。双特异性抗体也可以是双特异抗体(diabody)。
本文中所用的术语"工程改造的抗体"指的是这样的抗体，其中重链和轻链之一或两者中的可变结构域通过在CDR或构架区域的一个或多个氨基酸的至少部分替代而被改变。在某些方面中，来自具有已知特异性的抗体整个CDR可被移接到异源性抗体的构架区域中。虽然替代性的CDR可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或甚至亚类的抗体，但CDR仍可衍生自不同类别的抗体，例如，不同物种的抗体。将来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链构架区内形成的工程改造的抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些方面中，并非全部CDR由来自供体可变区的完整CDR替代，而所述供体的抗原结合能力仍可被转移至受者可变结构域。鉴于例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中给出的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验法或通过试验和误差检定来获得功能工程改造的或人源化的抗体。
本文所用的术语“工程改造的”包括通过合成手段(例如通过重组技术、体外肽合成，通过酶或化学偶联肽，或这些技术的一些组合)进行的核酸或多肽分子的操作。
本文中所用的术语"连接的"、"融合的"或"融合"或其它语法等同形式可互换使用。这些术语指通过包括化学偶联或重组在内的方式将两个或更多元件或组件连接在一起。“框内融合”指以维持原始ORF翻译读框的方式，将两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)连接形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是包含两个或多个片段的单一蛋白质，所述片段对应原始ORF编码的多肽(这些片段在自然条件下通常不如此连接)。尽管因此阅读框在融合片段中是连续的，但片段仍可被物理或空间分隔，如框内接头序列。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可框内融合，但用编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外CDR区的多核苷酸间隔开，前提是“融合的”CDR作为连续多肽的一部分共同翻译。
对于多肽而言，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基到羧基末端方向上氨基酸的顺序，在序列中彼此相邻的氨基酸是多肽一级结构中的毗连残基。多肽的部分处于在连续的多肽链中出现得较早的多肽的另一个部分的“氨基末端”或“N末端”。类似地，多肽的部分处于在连续的多肽链中出现得较晚的多肽的另一个部分的“羧基末端”或“C末端”。例如，在典型的抗体中，可变区位于恒定区的“N末端”，并且恒定区位于可变区的“C末端”。
本文所用的术语“表达”指基因生成生化物质如多肽的过程。该过程包括在细胞内基因功能存在的任何表现，包括但不限于，基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于，基因转录成RNA，例如信使RNA(mRNA)，和将这类mRNA翻译成多肽。如果所需的最终产物是生化物质(biochemical)，则表达包括产生该生化物质和任何前体。基因的表达产生"基因产物"。本文中所用的基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或由转录本翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，例如聚腺苷酸化，或具有翻译后修饰的多肽，如甲基化、糖基化、加入脂质、连接其它蛋白质亚基、经蛋白酶水解切割等。
术语例如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗(to treat)”或“缓解(alleviating)”或“以缓解(to alleviate)”指的是治愈、减缓、减少现存的已经诊断的病理病症或紊乱的症状，和/或截停或减缓现存的已经诊断的病理病症或紊乱的进展的治疗性措施。术语例如“预防(prevent)”、“预防(prevention)”、“避免”、“遏制(deterrence)”等指的是预防未经诊断的目标病理病症或紊乱的进展的预防性的或预防用的措施。因此，需要治疗的那些(对象)可包括已经患有疾病的那些(对象)；易于患有疾病的那些(对象)；和需要预防疾病的那些(对象)。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞技动物或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、奶牛、熊等。
本文中所用的短语例如“将受益于治疗的对象”和“有治疗需求的动物”包括这样的对象，例如哺乳动物对象，其将受益于结合分子例如包含一个或多个抗原结合结构域的抗体的给予。所述结合分子，例如，抗体，可用于，例如，诊断性操作方法和/或用于疾病的治疗或预防。
IgM结合分子
IgM是通过B细胞响应抗原刺激产生的第一种免疫球蛋白，并且以约1.5mg/ml在血清中以5天的半衰期存在。IgM是二聚、五聚或六聚分子。IgM结合单元包括两个轻和两个重链。尽管IgG包含三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，IgM的重(μ)链还包含第四恒定结构域(CH4)，其包括C末端“尾片段”。人IgM恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:47。人Cμ1区的范围是SEQ ID NO:47的约氨基酸5-约氨基酸102；人Cμ2区的范围是SEQ ID NO:47的约氨基酸114-约氨基酸205，人Cμ3区的范围是SEQ ID NO:47的约氨基酸224-约氨基酸319，Cμ4区的范围是SEQ ID NO:47的约氨基酸329-约氨基酸430，并且所述尾片段的范围是SEQ IDNO:47的约氨基酸431-约氨基酸453(表2)。
五个IgM结合单元可与另一个小多肽链(J链)形成复合物，以形成IgM抗体。人J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:49(表2)。典型的IgM五聚体示于图2。在没有J链的情况下，IgM结合单元通常组装成六聚体。典型的IgM六聚体示于图2。尽管不希望受理论限制，认为IgM结合单元组装成六聚化或六聚化结合分子涉及Cμ3和Cμ4结构域。因此，本发明提供的六聚或五聚结合分子通常包括IgM恒定区，其包括至少Cμ3和Cμ4结构域。IgG抗体和IgM抗体的比较通过非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳示于图3。
IgM重链恒定区还可包括Cμ2结构域或其片段、Cμ1结构域或其片段，和/或其它IgM重链结构域。在某些方面中，本文提供的结合分子可包括完整IgM重(μ)链恒定结构域(例如，SEQ ID NO:47)或其变体、衍生物或类似物。
五聚或六聚CD20结合分子
本发明提供六聚或五聚结合分子，即，具有本文定义的五个或六个“结合单元”的结合分子，其能特异性地结合至CD20，例如，人CD20。相较于由单一结合单元组成的结合分子，例如，二价IgG抗体，本文提供的结合分子可具有改善的结合特点或生物活性。在某些方面中，本发明提供五聚或六聚结合分子，其分别包含五个或六个二价结合单元，其中各结合单元包括两个IgM重链恒定区或其片段。在某些方面中，所述两个IgM重链恒定区是人重链恒定区。
如果所述本文提供的结合分子是五聚的，则该结合分子还可包含J链，或其片段，或其变体。在某些方面中，所述J链是经修饰的J链，其包含异源部分或一个或多个异源部分，例如，异源多肽序列，例如，引入该原初序列的外来结合结构域。在某些方面中，所述外来结合结构域特异性地结合至CD3，例如，CD3ε。在某些方面中，所述经修饰的J链包含V15J(SEQ ID NO:64)或J15V(SEQ ID NO:66)。
IgM重链恒定区可包括Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域和/或Cμ4结构域中的一个或多个，限制条件是，所述恒定区可在该结合分子中提供所需功能，例如，与第二IgM恒定区相关联以形成结合结构域，或与其它结合单元相关联以形成六聚体或五聚体。在某些方面中，个体结合单元中的两个IgM重链恒定区或其片段各包含Cμ3结构域或其片段、Cμ4结构域或其片段、尾片段(TP)或其片段，或Cμ3结构域Cμ结构域，和TP或其片段的任何组合。在某些方面中，个体结合单元中的两个IgM重链恒定区或其片段还各自包含Cμ2结构域或其片段、Cμ1结构域或其片段，或Cμ1结构域或其片段和Cμ2结构域或其片段。
在某些方面，给定结合单元中的两个IgM重链恒定区各自与抗原结合结构域，例如抗体的Fv部分，例如，人或鼠抗体的VH和VL相关联。在本文提供的结合分子中，所述结合分子的至少一个抗原结合结构域是抗CD20抗原结合结构域，即，能特异性地结合至CD20(例如，人CD20)的抗原结合结构域。
IgA结合分子
IgA在粘膜免疫中起一定作用，并且占产生的总免疫球蛋白的约15％。IgA是单体或二聚分子。IgA结合单元通常包括两个轻链和两个重链。IgA包含三个重链恒定结构域(Cα1、Cα2和Cα3)，并且包括C末端“尾片段”。人IgA具有两个亚型，IgA1和IgA2。人IgA1恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:59。人Cα1区的范围是SEQ ID NO:59的约氨基酸6-约氨基酸98；人Cα2区的范围是SEQ ID NO:59的约氨基酸125-约氨基酸220，人Cα3区的范围是SEQ IDNO:59的约氨基酸228-约氨基酸330，并且所述尾片段的范围是SEQ ID NO:59的约氨基酸331-约氨基酸352(表2)。人IgA2恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。人Cα1区的范围是SEQ ID NO:60(表2)的约氨基酸6-约氨基酸98；人Cα2区的范围是SEQ ID NO:60的约氨基酸112-约氨基酸207，人Cα3区的范围是SEQ ID NO:60的约氨基酸215-约氨基酸317，并且所述尾片段的范围是SEQ ID NO:60的约氨基酸318-约氨基酸340。
两个IgA结合单元可与两个其它多肽链，J链(SEQ ID NO:49)和分泌型组分(SEQID NO:62)形成复合物，以形成分泌IgA(sIgA)抗体。尽管不希望受理论限制，认为IgA结合单元组装成二聚sIgA结合分子涉及Cα3和尾片段结构域。因此，本发明提供的二聚sIgA结合分子通常包括IgA恒定区，其包括至少Cα3和尾片段结构域。
IgA重链恒定区还可包括Cα2结构域或其片段、Cα1结构域或其片段，和/或其它IgA重链结构域。在某些方面中，本文提供的结合分子可包括完整IgA重(α)链恒定区(例如，SEQID NO:59或SEQ ID NO:60)或其变体、衍生物或类似物。
二聚CD20结合分子
本发明提供二聚结合分子，例如，具有两个本文定义的IgA“结合单元”的结合分子，其能特异性地结合至CD20，例如，人CD20。相较于由单一结合单元组成的结合分子，例如，二价IgG抗体，本文提供的二聚结合分子可具有改善的结合特点或生物活性。例如，IgA结合分子可到达粘膜位点，提供本文提供的结合分子的更大的组织分布。在某些方面中，本发明提供二聚结合分子，其包含两个二价结合单元，其中各结合单元包括两个IgA重链恒定区或其片段。在某些方面中，所述两个IgA重链恒定区是人重链恒定区。
本文提供的二聚IgA结合分子还可包含J链，或其片段，或其变体。本文提供的二聚IgA结合分子还可包含分泌型组分，或其片段，或其变体。在某些方面中，所述J链是经修饰的J链，其包含异源部分或一个或多个异源部分，例如，异源多肽，例如，引入该原初序列的外来结合结构域。在某些方面中，所述外来结合结构域特异性地结合至CD3，例如，CD3ε。在某些方面中，所述经修饰的J链包含V15J(SEQ ID NO:64)或J15V(SEQ ID NO:66)。
IgA重链恒定区可包括Cα1结构域、Cα2结构域和/或Cα3结构域中的一个或多个，限制条件是，所述恒定区可在该结合分子中发挥所需功能，例如，与轻链恒定区相关联以促进抗原结合结构域的形成，或与另一个IgA结合单元相关联以形成二聚结合分子。在某些方面中，个体结合单元中的两个IgA重链恒定区或其片段各自包含Cα3结构域或其片段、附属物(TP)或其片段，或Cα3结构域、TP或其片段的任何组合。在某些方面，个体结合单元中的两个IgA重链恒定区或其片段还各自包含Cα2结构域或其片段、Cα1结构域或其片段，或Cα1结构域或其片段和Cα2结构域或其片段。
在某些方面中，给定抗原结合结构域中的两个IgA重链恒定区各自与抗原结合结构域相关联，例如抗体的Fv部分，例如，人或鼠抗体的VH和VL。在本文提供的结合分子中，所述结合分子的至少一个抗原结合结构域可以是CD20抗原结合结构域，例如，人CD20抗原结合结构域。
经修饰的J链
在某些方面中，本文提供的CD20结合分子可以是双特异性的，纳入经修饰的J链。如本文和PCT公开号WO 2015/153912提供，经修饰的J链可包含异源部分，例如，异源多肽，例如，外来结合结构域，其可包括，例如，能够特异性地结合至靶标的多肽结合结构域。所述结合结构域可以是，例如，抗体或其抗原结合片段，抗体-药物偶联物或其抗原结合片段，或抗体样分子。通过正确地选择添加位置和类型(例如直接或间接融合、化学衔接等)，可将多肽结合结构域引入J链。
在某些方面中，该结合结构域可以是抗体或抗体的抗原结合片段，包括单特异性、双特异性和多特异性抗体及抗体片段。所述抗体片段可以是但不限于，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、(scFv)2片段、单链抗体分子、微抗体，或由抗体片段形成的多特异性抗体。在某些方面中，所述抗体片段是scFv。
在其它方面中，所述结合结构域可以是抗体样分子，例如，人结构域抗体(dAb)、双-亲和性重定向(DART)分子、双特异抗体、双-双特异抗体、双重-可变结构域抗体、堆叠可变结构域抗体、小模块免疫药物(SMIP)、替代抗体(Surrobody)、链交换工程改造的结构域(SEED)-体，或双特异性抗体(TandAb)。
结合结构域可在允许结合结构域与其结合靶标结合而不干扰受体IgM或IgA分子与其一种或多种结合靶标结合或不干扰J链有效纳入IgA二聚体或IgM五聚体的能力的任何位置引入原初J链序列。在某些方面中，基于可及的J链的三维结构，所述结合结构域可在C末端处或附近，在成熟N末端处或附近(即，切割信号肽之后的SEQ ID NO:49的氨基酸编号23)或在内部位置处插入。在某些方面中，所述结合结构域可被引入原初序列J链，在距离SEQ ID NO:49的人J链的C末端超过(without)约10个残基处或距离成熟N末端超过(without)约10个氨基酸残基处。在另一方面中，所述结合结构域可被引入SEQ ID NO:49的原初序列人J链，引入SEQ ID NO:49的半胱氨酸残基114和123之间，或在另一原初序列J链的等同的位置。在另一方面中，所述结合结构域可被引入原初序列J链，例如SEQ ID NO:49的J链的糖基化位点处或附近。在某些方面中，所述结合结构域可被引入原初序列SEQ IDNO:49的人J链的距离C末端的约10个氨基酸残基之内处。
引入可通过直接或间接融合来实现，即通过将J链与一个多肽链中的结合结构域的合并，通过将其编码核苷酸序列框内合并，采用或不采用肽接头。若采用肽接头(间接融合)，其长度可以是约1-50，或约1-40，或约1-30，或约1-20，或约1-10，或约10-20氨基酸，并且可存在于待引入J链序列的结合结构域的一端或两端处。在某些方面中，肽接头长度为约10-20，或10-15个氨基酸。在某些方面中，所述肽接头长度为15个氨基酸。在某些方面中，所述肽接头是(GGGGS)3(SEQ ID NO:67)。
也有可能将超过一个异源性多肽，例如，超过一个结合结构域引入J链。
经修饰的J链可由已知的重组DNA技术通过在合适的原核生物或真核宿主生物中表达编码经修饰J链的核苷酸产生。
如本文他处所述，经修饰的J连还可与受体IgM或IgA结合分子的重链和轻链共同表达。在修饰的J链纳入之前，受体结合分子可以是单特异性、双特异性或多特异性的，例如，单特异性、双特异性、或多特异性IgA和IgM抗体。双特异性、或多特异性IgA和IgM结合分子(包括抗体)在例如，美国专利申请序列号61/874,277和61/937,984中描述，其均通过引用全文纳入本文。
在某些方面中，本文所述的抗CD20 IgM或IgA结合分子可包括经修饰的J链，其具有针对免疫效应细胞，例如T细胞、NK-细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞的结合特异性。在某些方面中，所述效应细胞是T细胞并且结合靶标是CD3(如下讨论)。通过活化和重新引导效应细胞，例如效应T细胞，至CD20表达型B细胞，例如，恶性B细胞，本文提供的双特异性抗CD20x抗CD3IgM或IgA结合分子可产生针对靶标的增强的免疫应答，所述应答包括，例如，补体介导的细胞毒性和/或抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)，由此进一步增加效力和功效。在某些方面中，可采用本文提供的包含经修饰的J链的双特异性抗CD20x抗CD3IgM或IgA结合分子用于治疗B细胞相关的癌。
在T细胞的情况中，分化簇3(CD3)是多聚蛋白质复合物，一度被称作T3复合物，并且由四个独特的多肽链(ε，γ，δ，ζ)组成，其组装并作为三对二聚体(εγ，εδ，ζζ)发挥功能。CD3复合物作为T细胞共同受体起作用，其与T细胞受体(TCR)非共价地相关联。该CD3复合物的组分，尤其是CD3ε，可以是本文提供的双特异性IgM或IgA结合分子的经修饰的J链的靶标。
在某些方面中，双特异性抗CD20x抗CD3IgM或IgA结合分子通过抗体结合结构域结合至CD20，而J链经修饰以结合至CD3ε。
在某些方面中，本文提供的经修饰的J链的抗CD3ε结合结构域是scFv。抗CD3εscFv可直接地或利用引入scFv和J链序列之间的合成接头(例如，(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:67))间接地融合在J链的N末端处或附近，或在J链的C末端处或附近。在某些方面中，所述scFv包含韦西珠单抗(Nuvion)的VH和VL区。在某些方面中，所述经修饰的J链包含scFv，其包含韦西珠单抗的VH、(GGGGS)3接头，和韦西珠单抗的VL。
在某些方面中，所述经修饰的J链包含韦西珠单抗的scFv，其通过15氨基酸(GGGGS)3接头融合至人J链的N末端，经修饰的J链在本文中可称作V15J。V15J还可包括信号肽以促进运输和组装成IgM或IgA结合分子。成熟V15J蛋白质示作SEQ ID NO:64，前体形式，其包含19-氨基酸-免疫球蛋白重链信号肽，示作SEQ ID NO:63。在某些方面中，所述经修饰的J链包含韦西珠单抗的scFv，其通过15氨基酸(GGGGS)3接头融合至人J链的C末端，经修饰的J链在本文中可称作J15V。J15V还可包括信号肽以促进运输和组装成IgM或IgA结合分子。成熟J15V蛋白质示作SEQ ID NO:65，前体形式，其包含22-氨基酸-人J链信号肽，示作SEQID NO:66。在某些方面中，可采用其它信号肽。选择和包含合适的信号肽以促进经修饰的J链的表达、分泌和纳入进入本文提供的抗CD20 IgM或IgA结合分子，这完全落在本领域普通技术人员的能力范围内。
CD20结合结构域
在某些方面中，所述CD20抗原结合结构域包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个CDR相关于公开于美国专利公开号2007-0014720的1.5.3的对应的CDR。CD20抗原结合结构域可包括HCDR1，其包含SEQ ID NO:39或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:39的氨基酸序列。CD20抗原结合结构域可包括HCDR2，其包含SEQ ID NO:40或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:40的氨基酸序列。CD20抗原结合结构域可包括HCDR3，其包含SEQ ID NO:41或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:41的氨基酸序列。CD20抗原结合结构域可包括LCDR1，其包含SEQ ID NO:43或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ IDNO:43的氨基酸序列。CD20抗原结合结构域可包括LCDR2，其包含SEQ ID NO:44或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:44的氨基酸序列。CD20抗原结合结构域可包括LCDR3，其包含SEQ ID NO:45或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:45的氨基酸序列。CD20抗原结合结构域可包括任何一个、任何两个、任何三个、任何四个、任何五个或全部六个如上所述的CDR氨基酸序列。在某些方面中，所述CD20抗原结合结构域包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:39的HCDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的HCDR2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HCDR3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的LCDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的LCDR2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的LCDR3。
在某些方面中，所述CD20抗原结合结构域包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)，其中，所述VH区、所述VL区，或所述VH和VL区两者与公开于美国专利公开号2007-0014720的1.5.3的对应的VH和VL相关。在某些方面中，所述VH可包含与SEQ ID NO:38至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，所述VL可包含与SEQ ID NO:42至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:38且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。
尽管本领域普通技术人员基于本发明可设想多种不同的二聚、五聚和六聚结合分子，并因而包括在本发明中，但在某些方面中，提供如上所述的结合分子，其中各结合单元包含两个IgA或IgM重链，其各包含位于IgA或IgM恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，其各包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
此外，在某些方面中，所述结合分子的至少一个结合单元，或所述结合分子的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元，包含如上所述的CD20抗原结合结构域中的两个。在某些方面中，所述结合分子中的结合单元中的两个CD20抗原结合结构域，或所述结合分子的两个、三个、四个、五个或六个结合单元，可以是彼此不同的，或它们可以是相同的。
在某些方面中，所述结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的两个IgM重链是相同的。在某些方面中，所述结合分子的至少一个结合单元中，或至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元中的两个相同的IgM重链包含氨基酸序列SEQID NO:56。
在某些方面中，所述结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的两个轻链是相同的。在某些方面中，所述结合分子的至少一个结合单元中，或至少两个、至少三个、至少四个、至少五个，或至少六个结合单元中的两个相同的轻链是κ轻链，例如，人κ轻链，或λ轻链，例如，人λ轻链。在某些方面中，所述结合分子的至少一个结合单元中，或至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元中的两个相同的轻链各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在某些方面中，本发明提供的二聚、五聚或六聚结合分子的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元包含或各自包含两个相同的IgM重链，其各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:56，和两个相同的轻链，其各自包含氨基酸序列SEQ IDNO:58。根据该方面，所述结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的CD20抗原结合结构域可以是相同的。此外根据该方面，本文提供的二聚、五聚或六聚结合分子可包含如上所述的CD20抗原结合结构域的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个，或至少十二个拷贝。在某些方面中，所述结合单元中至少两个、至少三个、至少四个、至少五个，或至少六个可以是相同的，并且，在某些方面中，所述结合单元可包含相同的抗原结合结构域，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个，或至少十二个CD20抗原结合结构域可以是相同的。在某些方面中，所述相同的CD20抗原结合结构域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL。
在某些方面中，相较于其它结合分子，本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子可具有有利的结构或功能性质。例如，相较于对应的结合分子(例如，公开于美国专利公开号2007-0014720的IgG1 1.5.3)，所述二聚、五聚或六聚CD20结合分子可在体外或体内生物试验中具有改善的活性。生物试验包括但不限于补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。
在某些方面中，相较于特异性地与CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段(例如，1.5.3的IgG1形式，其包含人IgG1，具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL)，本文提供的二聚、五聚或六聚结合分子能以更高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞(例如，CD20表达型B细胞)的杀伤。在某些方面中，相较于等量的单特异性、二价CD20单克隆抗体或其片段(其中所述抗体是或包含，例如，与利妥昔单抗(Genentech)、奥法木单抗(Glaxo SmithKline)、维妥珠单抗(Takeda)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)(Lilly)、托西莫单抗(Glaxo SmithKline)或阿托珠单抗(Roche/Genentech)相同的VH和VL区)，本文提供的二聚、五聚或六聚结合分子能以更高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞(例如，CD20表达型B细胞)的杀伤。
通过“效力”表示获得给定生物结果(例如，给定试验(例如，CDC或ADCC试验)中细胞的50％杀伤(IC50))所需的给定结合分子的最小的量。效力可以表示为曲线形式，其中细胞的存活率％以Y轴表示，而结合分子浓度(例如，以μg/ml或μM计)以X轴表示。
在某些方面中，CDC可体外检测，并且，CD20表达型细胞可以是永生化细胞系，例如，B细胞淋巴瘤细胞系，例如，Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。类似的细胞系是已知的并且易由本领域普通技术人员获得。
在某些方面中，CDC可经体外或体内检测或证实，并且CD-20表达型细胞系是恶性B细胞，其获自或处于对象中，例如，患癌(例如，B细胞相关的淋巴瘤、白血病，或骨髓瘤)人患者。在某些方面中，所述癌对于常规治疗最小响应或无响应，所述常规治疗是，例如，化疗，或采用以下一种或多种的单克隆抗体治疗，例如，利妥昔单抗(Genentech)、奥法木单抗(Glaxo SmithKline)、维妥珠单抗(Takeda)、奥卡拉珠单抗(Lilly)、托西莫单抗(GlaxoSmithKline)，或阿托珠单抗(Roche/Genentech)。在某些方面中，提供包含任何一个或多个本文所述的结合结构域的二聚、五聚或六聚结合分子，例如，示于表5中。
在某些方面中，ADCC可通过T细胞活化试验体外检测，例如，通过在本文提供的双特异性抗CD20x抗CD3IgM结合分子的存在下共培养CD20表达型B细胞和经工程改造的CD3-表达T细胞，并且通过细胞因子释放、靶细胞裂解，或其它检测方法来检测T细胞活化。在某些方面中，ADCC可通过T细胞引导的B细胞杀伤来检测。在某些方面中，所述CD20表达型细胞可以是永生化细胞系，例如，B细胞淋巴瘤细胞系，例如，Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。类似的细胞系是已知的并且易由本领域普通技术人员获得。在某些方面中，所述CD20表达型细胞系可源自患有B细胞相关的癌的患者。
在某些方面中，例如，通过CDC、ADCC和其它杀伤模式，例如，凋亡，的CD20+细胞的杀伤总量可在采用包含T细胞和补体的全血体外检测。
在某些方面中，例如，其中所述结合分子是包含五个相同的结合单元的五聚结合分子，所述结合单元各自包含两个与例如1.5.3的VH和VL相同的CD20结合结构域，在CDC试验中测试，该试验采用，例如，CD20表达型Raji细胞系，所述结合分子能引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体(例如，1.5.3或利妥昔单抗)的IC50低至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍或更多，例如，以μg/ml计。在某些方面中，其中所述CD20表达型细胞是Ramos细胞系，所述结合分子能引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍，或至少100倍，例如，以摩尔当量计。
在某些方面中，例如，包含五个相同的结合单元的五聚结合分子，所述结合单元各自包含两个与例如1.5.3的VH和VL或利妥昔单抗的VH和VL相同的结合结构域，加本文提供的野生型或经修饰的J链，其能在显示较低CD20表达水平的细胞中进行的CDC试验中显示增加的效力。例如，利妥昔单抗源性的抗人CD20 IgM+J或1.5.3抗CD20 IgM+J，在采用CD20表达型DoHH2(CD20高表达)和Z138(CD20低表达)细胞系的CDC试验中，能引导的补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体等同物(例如，利妥昔单抗(IgG1)，或1.5.3(IgG1))的IC50低至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍或更多，例如，以摩尔当量计。在某些方面中，利妥昔单抗源性的抗人CD20IgM+J和1.5.3抗CD20 IgM+J，在采用Z138(CD20低表达)细胞系的CDC试验中测试，在其中采用等同IgG分子甚至在100nM的浓度都无法实现50％杀伤(EC50)的条件下，能引导补体介导的所述细胞系的杀伤。
在某些方面中，包含五个相同的结合单元的双特异性五聚结合分子，所述结合单元各自包含两个与例如1.5.3的VH和VL或利妥昔单抗的VH和VL相同的CD20结合结构域，加能够结合至人CD3的经修饰的J链(例如，本文提供的V15J或J15V)，其能在ADCC试验中显示增加的效力。例如，利妥昔单抗源性的抗人CD20 IgM+V15J或J15V，或1.5.3抗CD20 IgM+V15J或J15V，在T细胞活化试验中测试，例如，采用与经工程改造的Jurkat T细胞共同培养的CD20表达型DB细胞系，可促进T细胞介导的杀伤的IC50比结合B细胞和T细胞的等量的单价双特异性结合分子(例如，双特异性抗CD19(单价)x抗CD3(单价)分子博纳吐单抗)的IC50低至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍。
在某些方面中，包含五个相同的结合单元的单特异性或双特异性五聚结合分子，所述结合单元各自包含两个与例如1.5.3的VH和VL或利妥昔单抗的VH和VL相同的结合结构域，加野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V，其能在全血体外细胞毒性试验中显示增加的效力。例如，1.5.3抗CD20 IgM+V15J或J15V，或1.5.3抗CD20 IgM+J，在KILRTM体外细胞毒性试验中测试，采用与水蛭素抗凝结人血共同培养的CD20表达型KILRTM ARH-77细胞系，可实现KILRTM ARH-77细胞系的杀伤的IC50比等量的单特异性二价抗CD20结合分子(例如，1.5.3 IgG，或，结合B细胞和T细胞的单价双特异性结合分子，例如，双特异性抗CD19(单价)x抗CD3(单价)分子博纳吐单抗)的IC50低至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍或更多。
在某些方面中，包含五个相同的结合单元的单特异性或双特异性五聚结合分子在例如人源化的小鼠模型中能显示显著的体内B细胞杀伤，所述结合单元各包含两个与例如1.5.3的VH和VL或利妥昔单抗的VH和VL相同的结合结构域，加野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链(例如，本文提供的V15J或J15V)，如本文他处所述。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明还提供多核苷酸，例如，分离的、重组和/或非天然产生的多核苷酸，其包含编码本文提供的二聚、五聚或六聚结合分子的多肽亚基的核酸序列。“多肽亚基”表示可被独立地翻译的结合分子、结合单元或结合结构域的部分。示例包括但不限于，抗体可变结构域，例如，VH或VL、单链Fv、抗体重链、抗体轻链、抗体重链恒定区、抗体轻链恒定区，和/或其任何片段。
在某些方面中，所述多肽亚基可包含IgA或IgM重链恒定区和CD20抗原结合结构域的至少抗体VH部分。在某些方面中，所述多核苷酸能编码包含融合至VH的C末端的人IgA或IgM恒定区或其片段的多肽亚基，其中所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:39或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:40或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:40的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ IDNO:41、具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ IDNO:41的氨基酸序列；或VH包含与SEQ ID NO:38至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，所述多肽亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:56。
在某些方面中，所述多肽亚基可包含如上所述的CD20抗原结合结构域的抗体VL部分。在某些方面中，所述多肽亚基可包含融合至VL的C末端的人抗体轻链恒定区或其片段，其中所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述LCDR1包含SEQ ID NO:43或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:43的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:44或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:45或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:45的氨基酸序列；或VL包含与SEQ ID NO:42至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，所述多肽亚基包含氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在某些方面中，所述多肽亚基可包含CD20抗原结合结构域的抗体VH或抗体VL部分，所述CD20抗原结合结构域包含上文所述和/或表5中所示的VH或VL氨基酸序列中的任何一个或多个。
本发明还提供一种组合物，其包含两个或更多个多核苷酸，其中，所述两个或更多个多核苷酸可共同地编码如上所述的二聚、五聚或六聚结合分子。在某些方面中，所述组合物可包括编码IgA或IgM重链或其片段，例如，如上所述的人IgA或IgM重链的多核苷酸，其中，所述IgA或IgM重链包含CD20抗原结合结构域的至少VH，和，编码轻链或其片段，例如，人κ或λ轻链的多核苷酸，所述轻链包含CD20抗原结合结构域的至少VL。提供的多核苷酸组合物还可包括编码J链(例如，人J链)或其片段或其变体的多核苷酸。在某些方面中，本文提供的组合物所含的多核苷酸可位于两个或三个分开载体(例如，表达载体)上。本发明提供所述载体。在某些方面中，本文提供的组合物所含的多核苷酸中的两种或更多种可位于单一载体(例如，表达载体)上。本发明提供所述载体。
本发明还提供宿主细胞，例如，原核或真核宿主细胞，其包含编码本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子或其任何亚基的多核苷酸或两个或更多个多核苷酸，本文提供的多核苷酸组合物，或载体或两个、三个或更多个载体，其共同地编码本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子，或其任何亚基。在某些方面中，本发明提供的宿主细胞可表达本发明提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子，或其亚基。
在一个相关方面中，本发明提供产生本发明提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子的方法，其中，所述方法包括培养如上所述的宿主细胞，和，回收结合分子。
使用方法
本发明提供，采用二聚、五聚或六聚的基于IgA或IgM的CD20结合分子，用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的表达CD20的细胞的杀伤的改善的方法，所述表达CD20的细胞例如B细胞，例如，恶性或永生化B细胞。下文所述的方法可采用包含源自任何CD20抗体的CD20抗原结合结构域的结合分子，所述CD20抗体包括但不限于公开于美国专利公开号2007-0014720的1.5.3、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、奥卡拉珠单抗、阿托珠单抗或其变体、衍生物或类似物，其中，相较于包含相同抗原结合结构域的等同的IgG抗体、其片段、变体、衍生物或类似物，所述二聚、五聚或六聚CD20结合分子能够提供改善的补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤。在某些方面中，所述基于IgA或IgM的CD20结合分子还包含J链，其为野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V。基于本发明，包含任何感兴趣的CD20结合结构域的二聚、五聚或六聚的基于IgA或基于IgM的CD20抗原结合分子的构建完全在本领域普通技术人员的能力范围内。改善的活性可以，例如，允许使用减少的剂量，或可导致对于耐受原始抗体的杀伤的细胞的更有效杀伤。“耐受”表示CD20抗体(例如，利妥昔单抗)对CD20表达型细胞的任何程度的活性降低。基于IgA的结合分子的应用可允许，例如，本文提供的结合分子的更大的组织分布。
在某些方面中，本发明提供用于引导改善的补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，其中，所述方法包括，使CD20表达型细胞与本文所述的二聚、五聚或六聚结合分子接触，其中，相较于等量的单特异性、二价IgG(例如，特异性地与CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的IgG1抗体或其片段，例如，利妥昔单抗，其包含人IgG1和具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL)，所述结合分子能以较高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞(例如，CD20表达型B细胞)的杀伤。所述二聚或五聚结合分子还可包括野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V。在某些方面中，相较于等量的单特异性、二价CD20单克隆抗体或其片段(其中所述抗体是或包含与例如奥法木单抗、维妥珠单抗、奥卡拉珠单抗或阿托珠单抗相同的VH和VL区)，本文提供的二聚、五聚或六聚结合分子能以较高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞(例如，CD20表达型B细胞)的杀伤。
本发明因此提供用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，其中所述方法包括：使CD20表达型细胞与分别包含两个、五个或六个二价结合单元的二聚、五聚或六聚结合分子接触，其中各结合单元包含两个IgA或IgM重链恒定区或其片段和两个抗原结合结构域。合适的结合分子的非限制性示例包括基于1.5.3的本发明提供的二聚、五聚或六聚结合分子，或本发明他处描述的其它结合分子。所述二聚或五聚结合分子还可包括野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V。根据所述方法，所述结合分子的至少一个抗原结合结构域是CD20抗原结合结构域。此外，根据所述方法，所述结合分子能以较高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞的杀伤，相较于等量的单特异性、二价IgG，例如，特异性地与CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的IgG1抗体或其片段，例如，包含类似于(例如，相同于)本发明提供的二聚、五聚或六聚结合分子的CD20抗原结合结构域的CD20抗原结合结构域的二价IgG1抗体。
例如，本文提供用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，其中所述方法包括：使CD20表达型细胞与如本文他处所述的包含与1.5.3相关的至少一个抗原结合结构域的二聚、五聚或六聚结合分子接触，其中，所述结合分子能以较高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞的杀伤，相较于等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段，其特异性地与1.5.3相关的CD20抗原结合结构域结合至相同的CD20表位。所述二聚或五聚结合分子还可包括野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V。在某些方面中，所述单特异性、二价IgG1抗体是1.5.3，并且包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL。
在某些方面中，例如，其中所述结合分子是包含五个相同的结合单元的五聚结合分子，所述结合单元各自包含两个与1.5.3的VH和VL相同的结合结构域，在采用CD20表达型Raji细胞系的CDC试验中测试，所述结合分子能引导补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体(例如，1.5.3)的IC50低至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍或更多，例如，以μg/ml计或以摩尔当量计。
在某些方面中，所述CD-20表达型细胞是永生化细胞系，例如B细胞白血病或淋巴瘤细胞系。所述细胞系可以是，但不限于，Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。可用于本文提供的方法的其它细胞系可由本领域普通技术人员容易地鉴定。
在某些方面中，所述细胞系是Granta细胞系，并且所述二聚、五聚或六聚结合分子能引导补体介导的所述细胞系的杀伤的效力是利妥昔单抗效力的约六倍，以μg/ml计。在某些方面中，所述细胞系是Ramos细胞系，并且所述二聚、五聚或六聚结合分子能引导补体介导的所述细胞系的杀伤的效力是利妥昔单抗效力的约30-40倍，以摩尔当量计。
在某些方面中，所述细胞系是Raji细胞系或Ramos细胞系，并且所述二聚、五聚或六聚结合分子能引导补体介导的所述细胞系的杀伤的效力是利妥昔单抗效力的约三倍。
在某些方面中，所述CD20表达型细胞是，对象，例如，人类癌症患者，的恶性B细胞。所述癌症可以是，例如，CD20阳性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些方面中，所述CD20表达型细胞系或恶性B细胞对于市售可得的CD20单克隆抗体的杀伤具有抗性，例如，具有最小响应或无响应，例如，患癌对象中的CD20表达型细胞系或恶性B细胞对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。
在另一方面中，本文提供用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，其中所述方法包括：使CD20表达型细胞与包含至少一个抗原结合结构域的二聚、五聚或六聚结合分子接触，所述抗原结合结构域与CD20mAb利妥昔单抗或其片段、变体、衍生物或类似物相关。所述二聚或五聚结合分子还可包括野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V。
在某些方面中，所述二聚、五聚或六聚结合分子的CD20抗原结合结构域包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个CDR与CD20mAb利妥昔单抗的对应的CDR相关。所述CD20抗原结合结构域可包括HCDR1，其包含SEQ ID NO:2或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。所述CD20抗原结合结构域可包括HCDR2，其包含SEQ ID NO:3或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列。例如，HCDR2可包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。所述CD20抗原结合结构域可包括HCDR3，其包含SEQ ID NO:4或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一、二或三个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。例如，HCDR3可包含氨基酸序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:36。在其它方面中，所述CD20抗原结合结构域包括HCDR3，其包含SEQ ID NO:10或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在其它方面中，所述CD20抗原结合结构域包括HCDR3，其包含SEQ ID NO:31或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代的SEQ ID NO:31的氨基酸序列。所述CD20抗原结合结构域可包括LCDR1，其包含SEQ ID NO:6或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一、二或三个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:6的氨基酸序列。例如，LCDR1可包含氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27，或SEQ ID NO:33。CD20抗原结合结构域可包括LCDR2，其包含SEQ ID NO:7或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:7的氨基酸序列。例如LCDR2可包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:20。CD20抗原结合结构域可包括LCDR3，其包含SEQ ID NO:8或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代(例如，一个或两个单氨基酸取代)的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。例如，LCDR3可包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21，或SEQ ID NO:34。
在某些方面中，所述二聚、五聚或六聚结合分子的CD20抗原结合结构域包含VH和VL，其中，所述VH区、所述VL区，或所述VH和所述VL区两者与利妥昔单抗的对应的VH和VL相关。在某些方面中，所述CD20抗原结合结构域可包含与SEQ ID NO:1至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VH氨基酸序列，和与SEQ ID NO:5至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VL氨基酸序列。
在某些方面中，所述VH和VL可源自描述于美国专利号7,679,900的CD20mAb。例如，所述CD20抗原结合结构域可包含与SEQ ID NO:9至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VH氨基酸序列，和与SEQ ID NO:11至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VL氨基酸序列。
在某些方面中，所述VH和VL可源自描述于美国专利号8,153,125的CD20mAb。例如，所述CD20抗原结合结构域可包含与SEQ ID NO:15至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VH氨基酸序列，和与SEQ IDNO:18至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VL氨基酸序列。
在某些方面中，所述VH和VL可源自描述于美国专利号8,337,844的CD20mAb。例如，CD20抗原结合结构域可以含有与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的VH氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的VL氨基酸序列。
在某些方面中，所述VH和VL可源自描述于美国专利号8,337,844的CD20mAb。例如，所述CD20抗原结合结构域可包含与SEQ ID NO:30至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VH氨基酸序列，和与SEQ IDNO:32至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VL氨基酸序列。
在某些方面中，所述VH和VL可源自描述于美国专利号7,151,164的CD20mAb。例如，所述CD20抗原结合结构域可包含与SEQ ID NO:35至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VH氨基酸序列，和与SEQ IDNO:37至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，至少95％或100％相同的VL氨基酸序列。
用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚结合分子，是具有如本文定义的两个、五个或六个“结合单元”的结合分子，其可特异性结合至CD20，例如，人CD20。在某些方面中，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚结合分子分别包含两个、五个或六个二价结合单元，其中各结合单元包括两个IgA或IgM重链恒定区或其片段。在某些方面中，所述两个IgA或IgM重链恒定区是人重链恒定区。
如果用于本文提供的方法的所述结合分子是五聚的，则该结合分子还可包含J链，或其片段，或其变体。所述J链可以是野生型J链或能够结合至人CD3的经修饰的J链，例如，本文提供的V15J或J15V。
用于本文提供的方法的结合分子的IgM重链恒定区可包括Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域和/或Cμ4结构域中的一个或多个，限制条件是，恒定区可在该结合分子中发挥所需功能，例如，与第二IgM恒定区相关联以形成抗原结合结构域，或与其它结合单元相关联以形成六聚体或五聚体。在某些方面中，个体结合单元中的两个IgM重链恒定区或其片段各包含Cμ3结构域或其片段、Cμ4结构域或其片段、尾片段(TP)或其片段，或Cμ3结构域Cμ结构域，和TP或其片段的任何组合。在某些方面中，个体结合单元中的两个IgM重链恒定区或其片段还各自包含Cμ2结构域或其片段、Cμ1结构域或其片段，或Cμ1结构域或其片段和Cμ2结构域或其片段。
尽管本领域普通技术人员基于本发明可设想多种用于本文提供的方法的不同的二聚、五聚或六聚结合分子，并因而包括在本发明中，但在某些方面中，提供用于本文提供的方法的结合分子，其中各结合单元包含两个IgA或IgM重链，其各包含位于IgA或IgM恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，其各包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
此外在某些方面中，用于本文提供的方法的结合分子的至少一个结合单元，或用于本文提供的方法的结合分子的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个，或至少六个结合单元，包含如上所述的两个CD20抗原结合结构域。在某些方面中，在用于本文提供的方法的结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的两个CD20抗原结合结构域可以是彼此不同的，或它们可以是相同的。
在某些方面中，用于本文提供的方法的结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的两个IgM重链是相同的。在某些方面中，用于本文提供的方法的结合分子的至少一个结合单元中，或至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元中的两个相同的IgM重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52。
在某些方面中，用于本文提供的方法的结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的两个轻链是相同的。在某些方面中，用于本文提供的方法的结合分子的至少一个结合单元，或所述结合分子的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个，或至少六个结合单元内的两个相同的轻链是κ轻链，例如，人κ轻链，或λ轻链，例如，人λ轻链。在某些方面中，用于本文提供的方法的结合分子的至少一个结合单元中，或至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元中的两个相同的轻链各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。
在某些方面中，用于本文提供的方法的五聚或六聚结合分子的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元包含或各自包含两个相同的IgM重链，其各自包含氨基酸序列SEQ ID NO:52，和两个相同的轻链，其各自包含氨基酸序列SEQID NO:54。根据该方面，所述结合分子中的一、二、三、四、五或六个结合单元中的CD20抗原结合结构域可以是相同的。此外根据该方面，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚结合分子可包含如上所述的CD20抗原结合结构域的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个，或至少十二个拷贝。在某些方面中，所述结合单元中至少两个、至少三个、至少四个、至少五个，或至少六个可以是相同的，并且，在某些方面中，所述结合单元可包含相同的抗原结合结构域，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个，或至少十二个CD20抗原结合结构域可以是相同的。在某些方面中，所述相同的CD20抗原结合结构域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL。
相较于其它结合分子，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚CD20结合分子可以具有有利的结构或功能性质。例如，相较于对应的结合分子(例如，利妥昔单抗或其变体、类似物，或衍生物)，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚CD20结合分子可在生物试验(体外或体内)中具有改善的活性。生物试验包括但不限于补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。
药物组合物和给药方法
制备和给予本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子至有此需要的对象的方法是本领域人员熟知且能根据本发明容易地确定的。CD20结合分子的给予途径可以是，例如，经口、胃肠外、通过吸入或局部给予。本文所用的术语胃肠外包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。尽管这些给予形式设想为合适的形式，但给予形式的其它示例将是注射用溶液，具体地是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。合适的药物组合物可包含缓冲剂(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(如聚山梨酯)，以及任选的稳定剂(如人白蛋白)。
如本文所述，本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子可以药学有效量给予用于体内治疗那些希望消耗B细胞的疾病或紊乱。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。药物组合物因此可包含药学上可接受的、非毒性无菌运载体，例如生理盐水、非毒性缓冲液、防腐剂等。本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子的药学有效的量表示足以实现有效结合至靶标并实现治疗益处的量。合适的制剂描述于《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)马克出版公司(Mack Publishing Co.)第16版.(1980)。
本文提供的某些药物组合物可以可接受的剂型口服给予，包括例如，胶囊、片剂、水性悬液或溶液。也可通过鼻气溶胶或吸入来给予某些药物组合物。这类组合物可采用苯甲醇或其他合适的防腐剂，吸收促经济以增强生物可及性，和/或其他常规增溶剂或分散剂制备成盐水溶液。
可与运载体材料组合以产生单一剂型的二聚、五聚或六聚CD20结合分子的量将根据，例如，处理的对象和具体的给予模式而变化。可以单剂型、多剂型或在确立的时间段内的输注中给予组合物。也可调整给药方案，以提供最优所需响应(例如，治疗或预防性响应)。
保持在本发明范围内，本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子可以足够的量给予有治疗需求的对象以产生治疗作用。本文提供的二聚、五聚或六聚CD20结合分子可以常规的剂型给予该对象，该常规的剂型通过根据已知技术，将本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与常规的药学上可接受的运载体或稀释剂相组合来制备。药学上可接受的运载体或稀释剂的形式和性质可根据其将要组合的活性成分的量、给予途径和其它熟知变量来描述。
"治疗有效剂量或量"或"有效量"意在表示，当给予时，就患有待治疗的疾病或病症的患者的治疗而言，获得积极治疗响应的二聚、五聚或六聚CD20结合分子的量。
用于治疗其中希望B细胞的消耗的疾病或紊乱的本文公开的组合物的治疗有效剂量将根据许多不同的因素变化，包括给药方式、目标位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、给予的其他药物和治疗是预防性还是治疗性。在某些方面中，对象或患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。
待给予的二聚、五聚或六聚CD20结合分子的量是本领域普通技术人员根据本发明而容易地确定的，无需过度实验。影响给予模式和二聚、五聚或六聚CD20结合分子的相应量的因素影响包括但不限于，经历治疗个体的疾病严重性、病史、年龄、身高、体重、健康和身体状况。类似地，待给予的二聚、五聚或六聚CD20结合分子的量将取决于给予模式，以及对象将经历该试剂的单一剂量还是多重剂量。
本发明还提供用于二聚、五聚或六聚CD20结合分子在制备用于治疗、预防或处理其中希望B细胞的消耗的疾病或紊乱(例如，B细胞淋巴瘤、白血病，或骨髓瘤)的药物中的用途。
除非另有说明，本发明将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))；Sambrook等编(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约州的冷泉港实验室出版社(Cold Springs HarborLaboratory，NY))；D.N.Glover编，(1985)DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)；Mullis等，美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》)；Freshney(1987)Culture OfAnimal Cells(《动物细胞培养》)(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))；Immobilized Cells AndEnzymes(《固定的细胞和酶》)(IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide ToMolecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(AcademicPress)，伦敦)；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Baltimore，Md.))。
抗体工程的一般原理可参见Borrebaeck编(1995)《抗体工程(AntibodyEngineering)》(第2版；牛津大学出版社(Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的一般原理可参见Rickwood等编(1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at OxfordUniv.Press，Oxford，Eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(Sinauer Associates，Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies,TheirStructure and Function(《抗体的结构和功能》)(Chapman和Hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法可按照下述文献所述进行：CurrentProtocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(JohnWiley&Sons)；Stites等编(1994)Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；Appleton和Lange，康涅狄格州的诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学的选用方法》)(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co)，纽约州)。
列出免疫学通用原理的标准参考文献包括：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州；Klein(1982)J.，Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(《免疫学：自身-非自身区别的科学》)(约翰韦利父子公司，纽约州)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(普莱努公司(Plenum Press)，纽约州)；Campbell(1984)"MonoclonalAntibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology"(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(的埃尔斯威尔公司(Elsevere)，阿姆斯特丹)；Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《库比免疫学》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health SciencesDivision))；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlag))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。
将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。
通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实施例
实施例1：用于表达CD20-hIgM的DNA构建体的生成
能表达能够特异性地结合至CD20的五聚或六聚IgM结合分子的质粒构建体通过如下方法产生。
编码利妥昔单抗的VH和VL区(分别是SEQ ID NO 1和5)或1.5.3的VH和VL区(分别是SEQ ID NO 38和42)的DNA片段通过市售供应商(Genescript公司)合成，其中在‘5端具有EcoRV限制性酶切位点，并且在3’端具有XbaI限制性酶切位点，用于亚克隆进入重链和轻链表达载体。合成的DNA构建体以1μg/ml重悬于Tris-EDTA缓冲液中。DNA样品(1μg)用EcoRV和XbaI消化，然后通过电泳将合成的VH和VL从载体质粒DNA分离。通过标准分子生物学技术，将消化的DNA连接至预消化的质粒DNA(对于μ链，pFUSEss-CHIg-hM*03，对于κ链，pFUSE2ss-CLIg-hk，可获自英杰公司(Invivogen))。将连接的DNA转化进入能感受的细菌，并铺板于含有多重选择性抗生素的LB板上。挑取若干细菌集落，并通过标准分子生物学技术制备DNA制备物。编码所述重链和轻链的构建体通过测序验证。利妥昔单抗IgM重链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52，而利妥昔单抗轻链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54。1.5.3 IgM重链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，而1.5.3轻链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58。人J链的氨基酸序列示作SEQ ID NO:49。
将编码IgM重链和轻链或重链、轻链和J链的质粒构建体共同转染进入CHO细胞，并且选择表达CD20 IgM抗体(具有或不具有J链)的细胞，全部根据标准方法进行。
采用Capture Select IgM(商品编号2890.05，BAC，赛默飞(Thermo Fisher))根据生产商方案，回收细胞上清液中存在的抗体。在SDS PAGE上，于非还原性条件下评价抗体，以显示五聚体和六聚体的组装。NuPage LDS样品缓冲液(生命技术公司(LifeTechnologies公司))添加至样品，然后上样至NativePage Novex 3-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies公司，目录号BN1003)。Novex Tris-乙酸盐SDS跑动缓冲液(LifeTechnologies，目录号LA0041)用于凝胶电泳。凝胶跑动直至染料前沿到达凝胶底部。电泳后，凝胶用胶态蓝染剂(Life Technologies公司，目录号LC6025)染色。结果示于图4。在非还原性条件下，五聚1.5.3 IgM(五个H2L2 IgM单元加J链，图4，第二图，泳道3)和五聚利妥昔单抗IgM(第一图，泳道3)产生约1,000,000分子量的蛋白质条带，而六聚1.5.3 IgM(六个H2L2 IgM单元，图4，第二图，泳道2)产生约1,180,000的蛋白质条带。
实施例2：CD20-hIgM的结合和活性
通过CD20 ELISA试验的结合的检测
96孔白色聚苯乙烯ELISA板(Pierce 15042)用100μL每孔的10μg/mL或0.3μg/mL人CD20(有N-Fc融合)(AcroBiosystems公司，CD0-H526a)于4℃被覆过夜。然后，板用0.05％PBS-吐温冲洗并用2％BSA-PBS封闭。封闭后，1.5.3 IgM、1.5.3 IgG、标准品和对照的100μL的连续稀释物添加至孔并室温孵育2小时。然后，板经冲洗并用HRP偶联的小鼠抗人κ(Southern Biotech公司，9230-05.1:6000，在2％BSA-PBS中稀释)孵育30分钟。在采用0.05％PBS-吐温进行10次最终冲洗板之后，采用SuperSignal化学发光底物(ThermoFisher公司，37070)读板。发光数据在EnVision酶标仪(Perkin-Elmer)上采集并用GraphPadPrism采用4参数逻辑模型分析。
结果示于图5A和图5B，通过摩尔浓度比较IgM对比IgG。在两种CD20抗原密度下，且尤其是在低CD20抗原浓度下(图5B)，抗CD20 IgM抗体显示更有效的结合。
补体依赖性的细胞毒性–比色试验
Granta(DSMZ目录号ACC 342)、Raji(ATCC目录号CCL-86)、Ramos(ATCC目录号CRL-1596)、Nalm-6(DSMZ目录号ACC 128)和Namalwa(ATCC目录号CRL-1432)细胞系来自ATCC和DSMZ。各细胞系的50,000个细胞接种于96孔板。细胞用连续稀释的市售可得的抗人CD20IgM(Invivogen公司目录号hcd20-mab5)或抗人CD20 IgG1(Invivogen公司目录号hcd20-mab1)处理。人血清补体(Quidel公司目录号A113)以10％的终浓度添加至各孔。反应混合物在37℃孵育1小时。细胞计数试剂盒-SK试剂(CCK-SK)(Dojindo公司目录号CK04-13)以1/10总反应体积的量添加，并且使板在37℃另孵育3小时。在分光光度计上于450nm检测吸光度。
结果示于图6A-E。在细胞杀伤方面，在Granta细胞(图6A)中IgM CD20抗体比IgG更有力6倍，在Raji细胞(图6B)中更有力3倍，且在Ramos细胞(图6C)中更有力3倍。在杀伤Nalm-6细胞(图6D)或Namalwa细胞(图6E)方面，两种抗体均不是有效的，其分别不表达或表达低水平的CD20。
补体依赖性的细胞毒性–发光试验
(a)采用CD20表达型Raji细胞系(ATCC目录号CCL-86)。50,000个细胞接种于96孔板。细胞采用如下连续稀释的抗体处理：利妥昔单抗(IgG1)、利妥昔单抗源性的抗人CD20IgM+J(如实施例1中生成)，或1.5.3抗人CD20 IgM+J(如实施例1中所述生成)。人血清补体(Quidel公司目录号A113)以10％的终浓度添加至各孔。反应混合物在37℃孵育4小时。CellTiter Glo试剂(Promega公司目录号G7572)以与各孔中存在的培养基体积相等的体积添加。板振荡2分钟，室温孵育10分钟，然后在光度计上测量发光。
结果示于图7和表2。抗CD20，IgG形式(利妥昔单抗)，获得了约半最大(half-maximal)Raji细胞杀伤(有补体)，而IgM同种型(利妥昔单抗)获得了近乎最大补体依赖性的细胞毒性。在补体依赖性的细胞毒性方面，两种IgM抗体均比利妥昔单抗更有力，并且在该实验中，1.5.3样IgM抗体比抗人IgM CD20抗体(携带利妥昔单抗VH和VL)更有力。相较于1型抗CD20(利妥昔单抗，IgM形式)，1.5.3样IgM抗体显示四倍增加的效力。
表2：对于Raji细胞的CDC(IC50)(μg/ml)
(b)重复如上所述的CDC试验，采用CD20表达型Ramos细胞系，采用如下连续稀释的抗体：利妥昔单抗(IgG1)、利妥昔单抗源性的抗人CD20 IgM+J(如实施例1中生成)、1.5.3(IgG1)、1.5.3抗CD20 IgM，或1.5.3抗CD20 IgM+J(如实施例1中所述生成)。
结果示于图8A(利妥昔单抗和利妥昔单抗样IgM)和图8B(1.5.3、1.5.3IgM+J，和huMAb样IgM。该实验中，在摩尔当量基础上比较IgG和IgM形式。在补体依赖性的细胞毒性方面，IgM形式的IC50全部比IgG形式更有效约30-40倍。
(c)接着，比较抗体对于具有减少的CD20表达水平的不同的细胞系的CDC活性。该试验采用如下连续稀释的抗体进行：利妥昔单抗(IgG1)、利妥昔单抗源性的抗人CD20 IgM+J(如实施例1中生成)、1.5.3(IgG1)，和1.5.3抗CD20 IgM+J(如实施例1中所述生成)。该试验所用细胞是DoHH2细胞(DSMZ编号ACC 47)和Z138细胞(ATCC CRL-3001)。Z138细胞显示的CD20表达水平低于DoHH2细胞，如下表4所示。靶细胞经冲洗并以1.0x106细胞/mL的密度重悬于CDC试验培养基(RPMI 1640，10％热失活的FBS)，并且10μL/孔添加至Nunc 384孔组织培养处理的白色聚苯乙烯板。测试抗体的连续3倍稀释物在试验培养基中制备，10μL/孔添加至试验板，并将板于37℃在5％CO2孵育箱中2小时以允许发生调理素作用(opsonization)。正常人血清补体(Quidel公司)以等份冷冻，用前解冻，在试验培养基中稀释至30％，并将10μL/孔添加至试验板。板在37℃于5％CO2孵育箱中孵育4小时。CellTiter-Glo试剂(Promega)用前解冻并将15μL/孔添加至试验板。板温和混合在摇床上2分钟以裂解细胞，然后在室温另置10分钟随后于EnVision酶标仪(Perkin-Elmer公司)上检测发光。减去背景信号后，活力百分比针对抗体浓度作图，并采用GraphPad Prism确定EC50值。
结果示于图9和表3中。对于两种细胞系，抗体的IgM形式显示的CDC杀伤大于IgG形式。对于较低CD20表达型Z-138细胞，IgM形式的CDC活性比IgG形式改善超过100倍。
表3：CDC活性依赖于CD20抗原表达水平
实施例3：包含结合CD3的经修饰的J链的双特异性抗CD20 IgM的制备
利妥昔单抗样抗人CD20 IgM和1.5.3抗CD20 IgM如实施例1中所述生成。
利用不同的融合位点与抗-CD3抗体维西珠单抗(Nuvion公司)的不同区域合并构建两个不同的J链变体。如下显示具有对应于韦西珠单抗(V)(VH-(GGGGS)3-VL，带双下划线)的scFv的两个J链的序列，其所述scFv通过(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:67，带下划线)融合至J链(斜体)，所述接头以两个不同的取向包含15个氨基酸–V15J和J15V。各序列包含N末端信号肽，其不带下划线或斜体显示。在某些方面中，其它信号肽序列可经取代用于本文所示的信号肽。
SEQ ID NO:63：V15J的前体经修饰的J链序列(DNA序列:SEQ ID NO:68)：
SEQ ID NO:64：V15J的成熟的经修饰的J链序列：
SEQ ID NO:65：J15V的前体经修饰的J链序列(DNA序列:SEQ ID NO:69)：
SEQ ID NO:66：J15V的成熟的经修饰的J链序列：
成熟构建体各自具有约45kD的分子量，并且能够结合至CD3(Sino Biological公司)或T细胞(数据未显示)的可溶ε链。
对应于抗CD20重链和轻链以及那些对应于野生型(wt)J链，V15J或J15V J链序列的DNA构建体共转染进入哺乳动物细胞，例如，HEK293或CHO细胞，并且按照标准方法表达并纯化蛋白质。参见例如，PCT公开号WO 2015/072246(其通过引用全文纳入本文)。采用15个氨基酸接头融合至抗CD3 scFv的J链能够伴随抗CD20重链和轻链纳入以产生双特异性IgM的五聚形式。
琼脂糖-丙烯酰胺杂化凝胶。IgM构建体通过更改自前述方法(Chugai SeiyakiKabushiki Kaisha，2010，美国公开号2010/0172899 A1)的非还原性SDS-PAGE分离。简言之，杂化凝胶与40％丙烯酰胺/二丙烯酰胺、37.5:1(Sigma-Aldrich公司)和超纯琼脂糖(Invitrogen公司)在0.375M Tris缓冲液(pH 8.8)和15％甘油中混合至终浓度分别为3.6％和0.5％。所获得的混合物加热至50℃，并通过添加0.08％TEMED和0.08％过硫酸铵起始聚合。所获得的溶液倾倒至两个板之间，并且允许丙烯酰胺在37℃聚合1小时，然后室温留置30分钟以确保完全聚合。蛋白质样品加载至所获得的杂化凝胶，然后凝胶在Tris-乙酸盐SDS跑动缓冲液(Novex)中跑动800Vh。然后，凝胶在40％甲醇、10％乙酸中固定10分钟，采用胶态蓝染色试剂盒(Novex)染色至少3小时，然后在水中脱色。
非还原性SDS-Native-PAGE.蛋白质样品上样至NativePAGE 3-12％双-Tris凝胶(Novex)。添加Tris-乙酸盐SDS跑动缓冲液(Novex公司)，并使凝胶以40V跑动15分钟，然后以90V跑动2小时。然后，凝胶在40％甲醇、10％乙酸中固定10分钟，采用胶态蓝染色试剂盒(Novex公司)染色至少3小时，然后在水中脱色。
J链Western Blot。丙烯酰胺凝胶在还原性条件下跑动，然后在20％乙醇溶液中冲洗10分钟，然后采用iBlot干印迹系统(Invitrogen公司)以20V进行10分钟将蛋白质转移至iBlot PVDF膜(Invitrogen)。转膜后，PVDF膜采用2％牛血清白蛋白、0.05％吐温20封闭至少12小时。Pierce J链抗体(ThermoFisher公司)的1/500稀释物添加至该膜，孵育1小时，然后添加过氧化物酶-偶联的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)的1/5000稀释物并允许避光孵育30分钟。最终，将Super Signal West Pico化学发光底物(ThermoFisher公司)添加至印迹，并采用ChemiDoc-It HR410成像系统(UVP)或通过使该印迹在X光胶片上曝光来观察所获得的信号。
如图10A和图10B所示，1.5.3 IgM+wt J和1.5.3 IgM+V15J蛋白质可见为杂化凝胶上较快迁移的五聚体，与不包含J链的较慢迁移的六聚体形式可区分。在还原性凝胶(图10C)和western印迹(采用针对J链的抗体)(图10D)上证实J链的整合。
实施例4：T细胞活化试验
为显示双特异性抗CD20/抗CD3抗体能够在结合至CD20靶标后活化T细胞，进行如下试验。经工程改造的Jurkat T细胞(Promega CS176403)和RPMI8226细胞(ATCC CCL-155)在补充有10％胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI(Invitrogen公司)中培养。在白色384孔试验板中，纯化的1.5.3 IgM+V15J，博纳吐单抗(双特异性CD19 x CD3)，和单特异性1.5.3IgM的连续稀释物与7500RPMI8226细胞以20μL用5％CO2在37℃孵育2小时。经工程改造的JurkaT细胞(25000)添加至混合物至40μL的终体积。该混合物用5％CO2在37℃孵育5小时。然后，细胞混合物与包含荧光素(Promega，Cell Titer Glo)的20μL裂解缓冲液混合以检测荧光素酶报告物活性。光输出通过EnVision酶标仪检测。EC50采用Prism软件通过4参数曲线拟合来确定。
结果示于图11。对于RPMI8226细胞系，采用1.5.3-V15J抗体的T细胞活化大于采用博纳吐单抗的结果。T细胞活化的最大水平显示与细胞表面上CD20表达水平的良好相关，如图12所示，采用各自表达不同的水平的CD20抗原的一系列肿瘤细胞系。
实施例5：T细胞引导的B细胞杀伤–LDH释放试验
为了显示双特异性CD20 x CD3 IgM结合分子能够在CD8+T细胞急性淋巴母细胞白血病(TALL)细胞的存在下杀伤靶细胞，我们进行了共培养实验。在不同的浓度的测试化合物(利妥昔单抗IgM+V15J和1.5.3 IgM+V15J)的存在下，6x103个癌B细胞与3x104个TALL细胞(ATCC CRL-11386)在每孔45μL总体积的补充有10％热失活的FBS的RPMI 1640培养基中于384孔黑色组织培养物板上共培养。在5％CO2孵育箱中37℃孵育24小时之后，15μL的CytoTox-ONE底物试剂(Promega，G7891)添加至各孔以检测从死细胞释放的LDH的水平。板经短暂振荡以混合试剂，然后室温孵育90分钟，随后在EnVision酶标仪(Perkin-Elmer公司)上检测荧光信号(激发光485nm，发射光615nm)。然后，数据用GraphPad Prism分析以确定EC50。如表4所示，细胞杀伤的EC50与细胞表面上CD20抗原的表达水平相关，采用1.5.3IgM V15J和利妥昔单抗IgM V15J，对于DB细胞系所具有的EC50低至0.4ng/mL(0.4pM)。
表4：T细胞引导的B细胞杀伤
实施例6：采用KILRTM检测试剂盒的体外细胞毒性试验
为了检测1.5.3 IgM+V15J杀伤全血(即，包括T细胞和补体)中CD20+肿瘤细胞的能力，采用KILRTM体外细胞毒性检测试剂盒。KILRTMARH-77细胞系(CD20+)购自DiscoverX公司(97-1001C017)，作为靶细胞。5-10x103个KILRTM ARH-77细胞与人CD8+T细胞(Precisionfor Medicine公司)、PBMC(AllCells公司或Precision for Medicine公司)或水蛭素抗凝结的人血(AllCells公司)在不同浓度的测试化合物(1.5.3 IgM+V15J、1.5.3 IgM+wtJ、1.5.3 IgG、利妥昔单抗IgG和博纳吐单抗)的存在下于200μL总体积的补充有10％热失活的FBS(当人血用于共培养时，采用较少培养基，因为全血占据体积的20-50％)的RPMI 1640培养基中，在96孔U-底非组织培养处理的聚苯乙烯板(Corning Falcon公司)上共培养。在5％CO2孵育箱中于37℃孵育4-48小时之后，板以27xg离心5分钟。50μL的上清液转移至96孔平底白色聚苯乙烯板(Greiner Bio-One公司)，待与25μL的KILR检测工作溶液(KILRTM检测试剂盒：DiscoverX 97-0001M)混合，供于室温孵育1小时，然后在EnVision酶标仪(Perkin-Elmer公司)上检测发光。靶细胞用KILRTM检测试剂盒提供的裂解缓冲液裂解以建立总裂解对照。杀伤百分比针对抗体浓度作图，并采用GraphPad Prism确定EC50值。
全血(采用水蛭素)中存在正常人补体时的结果示于图13。1.5.3 IgM+wtJ(菱形)和IgM+V15J(方形)抗体在四小时处均显示非常有力的杀伤。相比之下，利妥昔单抗IgG(空心圆)和博纳吐单抗(三角形)的有力情况要低至少30倍。
实施例7：采用人源化的NOD/SCIDγ敲除(NSG)小鼠模型的体内功效研究
CD34+人源化的NSG小鼠研究通过体内实验技术公司(In-Vivo Technologies,Inc.)进行。这些小鼠指定用于人免疫-肿瘤学研究，其中它们有发展多向分化人免疫细胞。小鼠购自杰克森实验室公司(Jackson Laboratory)，并且通过尾静脉注射给予测试制品。除了载剂对照以外，测试制品包括3μg、1μg和0.3μg每小鼠的1.5.3 IgM+V15J，以及1μg和0.3μg每小鼠的利妥昔单抗。血样在通过面静脉给药后6小时、24小时和10天时采集。.对于PBMC人源化的NSG小鼠研究，来自AllCells的冷冻PBMC送至杰克森实验室公司(JacksonLaboratory)进行注射。各NSG小鼠在100cGy全身辐照之后注射1千万个PBMC。血样在尾静脉给药测试制品(如上所述)之前和之后通过眶后出血法在指定时间点采集。来自CD34+和PBMC小鼠研究的血样送回至IGM生物科学公司用于淋巴细胞分析。血样针对人CD56、CD3、CD19和CD45标志物染色以鉴定不同人淋巴细胞群体。采用CountBright Absolute计数珠(LifeTechnologies，C36950)来定量血样中淋巴细胞的绝对数量。对淋巴细胞水平作图并采用GraphPad Prism分析。
标准化至给药前B细胞水平的、具有野生型J的1.5.3 IgM和具有V15J的1.5.3 IgM的给药后6小时的结果，分别示于图14A和图14B。在采用少至3μg每小鼠的移植的NSG小鼠中，双特异性1.5.3 IgM x V15J抗体显示有力的T细胞依赖性的B细胞杀伤。
整个试验期间，1.5.3 IgM x V15J和利妥昔单抗的结果的比较示于图15。
表5：本文中的序列
本发明的广度和范围不应受限于任何上述示例性实施方式，而应仅根据下列权利要求书及其等同项来定义。

Claims (121)

1.一种多聚结合分子，包含至少两个二价结合单元，或其变体或片段，其中各结合单元包含至少两个重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联，其中所述结合分子的至少一个抗原结合结构域是包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的CD20抗原结合结构域，其中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:39或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:39的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:40或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:40的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:41或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:41的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:43或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:43的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:44或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:45或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
2.一种多聚结合分子，包含至少两个二价结合单元，或其变体或片段，其中各结合单元包含至少两个重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联，其中所述结合分子的至少一个抗原结合结构域是包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的CD20抗原结合结构域，其中，所述VH包含与SEQ ID NO:38至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的结合分子，其是包含两个二价IgA结合单元或其片段和J链或其片段或变体的二聚结合分子，其中各结合单元包含两个IgA重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联。
4.如权利要求3所述的结合分子，其还包含分泌型组分，或其片段或变体。
5.如权利要求3所述的结合分子，其中，所述IgA重链恒定区或其片段各自包含Cα2结构域或Cα3-tp结构域。
6.如权利要求5所述的结合分子，其中，一个或多个IgA重链恒定区或其片段还包含Cα1结构域。
7.权利要求3-6中任一项所述的结合分子，其中至少一个结合单元包含两个所述CD20抗原结合结构域，并且其中，所述至少一个结合单元中的两个重链是相同的。
8.如权利要求3-7中任一项所述的结合分子，其中，所述IgA重链恒定区是人IgA恒定区。
9.如权利要求3-8中任一项所述的结合分子，其中，各结合单元包含两个IgA重链，所述两个IgA重链各自含有位于IgA恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，所述两个免疫球蛋白轻链各自含有位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
10.如权利要求1或权利要求2所述的结合分子，其为分别包含五个或六个二价IgM结合单元的五聚或六聚结合分子，其中各结合单元包含两个IgM重链恒定区或其片段，各自与抗原结合结构域相关联。
11.如权利要求10所述的结合分子，其中，所述IgM重链恒定区或其片段各自包含Cμ3结构域和Cμ4-tp结构域。
12.如权利要求10或权利要求11所述的结合分子，其中，一个或多个IgM重链恒定区或其片段还包含Cμ2结构域、Cμ1结构域，或其任何组合。
13.如权利要求10-12中任一项所述的结合分子，其中，所述结合分子是五聚的，并且还包含J链，或其功能片段，或其功能变体。
14.如权利要求13所述的结合分子，其中J链或其片段包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其功能片段。
15.如权利要求13或权利要求14所述的结合分子，其中，所述J链或其片段是进一步包含异源多肽的经修饰的J链，其中所述异源多肽直接或间接融合至所述J链或其片段。
16.如权利要求15所述的结合分子，其中所述异源多肽通过肽接头融合至所述J链或其片段。
17.如权利要求16所述的结合分子，其中，所述肽接头包含至少5个氨基酸，但不多于25个氨基酸。
18.如权利要求17所述的结合分子，其中，所述肽接头由GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)组成。
19.如权利要求15-18中任一项所述的结合分子，其中所述异源多肽融合至J链或其片段的N末端，J链或其片段的C末端，或融合至J链或其片段的N末端和C末端。
20.如权利要求16-19中任一项所述的结合分子，其中所述异源多肽包含结合结构域。
21.如权利要求20所述的结合分子，其中，所述异源多肽的结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
22.如权利要求21所述的结合分子，其中，所述抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫-连接的Fv(sdFv)片段，或其任何组合。
23.如权利要求22所述的结合分子，其中，所述抗原结合片段是scFv片段。
24.如权利要求20-23中任一项所述的结合分子，其中，所述异源多肽能特异性地结合至CD3ε。
25.如权利要求24所述的结合分子，其中，所述经修饰的J链包含氨基酸序列SEQ IDNO:64(V15J)或SEQ ID NO:66(J15V)。
26.如权利要求25所述的结合分子，其中，所述经修饰的J链还包含信号肽。
27.如权利要求26所述的结合分子，其中，所述经修饰的J链包含氨基酸序列SEQ IDNO:63(V15J)或SEQ ID NO:65(J15V)。
28.如权利要求10-27中任一项所述的结合分子，其中，所述IgM重链恒定区是人IgM恒定区。
29.如权利要求10-28中任一项所述的结合分子，其中，各结合单元包含两个IgM重链，所述两个IgM重链各自含有位于IgM恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，所述两个免疫球蛋白轻链各自含有位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
30.权利要求10-29中任一项所述的结合分子，其中至少一个结合单元包含两个所述CD20抗原结合结构域，并且其中，所述至少一个结合单元中的两个重链是相同的。
31.如权利要求30所述的结合分子，其中，至少一个结合单元中的两个IgM重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:56。
32.如权利要求30或权利要求31所述的结合分子，其中，所述两个轻链恒定区是人λ恒定区或人κ恒定区。
33.如权利要求32所述的结合分子，其中，所述两个轻链恒定区是相同的并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:58。
34.如权利要求10-33中任一项所述的结合分子，其包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个拷贝的所述CD20抗原结合结构域。
35.如权利要求34所述的结合分子，其中，所述至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个所述结合单元是相同的。
36.如权利要求34或权利要求35所述的结合分子，相较于特异性地与所述CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段，所述结合分子能以更高效力引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD-20表达型细胞的杀伤。
37.如权利要求36所述的结合分子，其中，所述单特异性、二价IgG1抗体是1.5.3，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL。
38.如权利要求36或权利要求37所述的结合分子，其中，所述CD-20表达型细胞是淋巴瘤细胞系。
39.如权利要求38所述的结合分子，其中所述细胞系是Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。
40.如权利要求36-39中任一项所述的结合分子，其中，所述CD20表达型细胞是Raji细胞系，并且其中，所述结合分子能引导补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少四倍、至少10倍、至少50倍，或至少100倍，以μg/ml计。
41.如权利要求36-39中任一项所述的结合分子，其中，所述CD20表达型细胞是Ramos细胞系，并且其中，所述结合分子能引导补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍，或至少100倍，以摩尔当量计。
42.如权利要求36所述的结合分子，其中，所述CD-20表达型细胞是患癌对象中的恶性B细胞。
43.如权利要求42所述的结合分子，其中，所述癌是CD20阳性白血病、淋巴瘤，或骨髓瘤。
44.如权利要求42或权利要求43中任一项所述的结合分子，其中，所述癌对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。
45.如权利要求42-44中任一项所述的结合分子，其中，所述对象是人。
46.一种组合物，其包含如权利要求1-45中任一项所述的结合分子，和运载体。
47.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1-45中任一项所述的结合分子的重链多肽亚基的核酸序列，其中，所述重链多肽亚基包含IgM重链恒定区或其片段或IgA重链恒定区或其片段，和所述CD20抗原结合结构域的至少抗体VH部分。
48.如权利要求47所述的多核苷酸，其中，所述重链多肽亚基包含融合至VH的C末端的人IgM恒定区或其片段，所述VH包含：
(a)HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:39或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:39的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:40或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO:41或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:41的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:38至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
49.如权利要求48所述的多核苷酸，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:56。
50.一种组合物，其包含如权利要求47-49中任一项所述多核苷酸。
51.如权利要求50所述的组合物，其还包含编码轻链多肽亚基的核酸序列，其中，所述轻链多肽亚基包含CD20抗原结合结构域的抗体VL部分。
52.如权利要求51所述的组合物，其中，所述轻链多肽亚基包含融合至VL的C末端的人抗体轻链恒定区或其片段，所述VL包含：
(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述LCDR1包含SEQ ID NO:43或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:43的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:44或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:44的氨基酸序列；并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:45或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:45的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
53.如权利要求52所述的组合物，其中，编码所述轻链多肽亚基的核酸编码氨基酸序列SEQ ID NO:58。
54.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其中，编码所述重链多肽亚基的核酸序列和编码所述轻链多肽亚基的核酸序列位于分开的载体上。
55.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其中，编码所述重链多肽亚基的核酸序列和编码所述轻链多肽亚基的核酸序列位于单一载体上。
56.如权利要求50-55中任一项所述的组合物，其还包含编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列。
57.如权利要求56所述的组合物，其中J链或其片段包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其功能片段。
58.如权利要求56或权利要求57所述的组合物，其中，所述J链或其片段是进一步包含异源多肽的经修饰的J链，其中所述异源多肽直接或间接融合至所述J链或其片段。
59.如权利要求56-58中任一项所述的组合物，其中所述异源多肽包含抗体或其抗原结合片段。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述异源多肽包含能特异性地结合至CD3ε的scFv。
61.如权利要求60所述的组合物，其中，所述J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(V15J)或SEQ ID NO:66(J15V)。
62.如权利要求61所述的组合物，其中，所述J链还包含信号肽。
63.如权利要求62所述的组合物其中，所述经修饰的J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:63(V15J)或SEQ ID NO:65(J15V)。
64.如权利要求56-62中任一项所述的组合物，其中，编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69。
65.如权利要求56-64中任一项所述的组合物，其中，编码所述重链多肽亚基的核酸序列、编码所述轻链多肽亚基的核酸序列，和编码所述J链的核酸序列位于单一载体上。
66.如权利要求56-64中任一项所述的组合物，其中，编码所述重链多肽亚基的核酸序列、编码所述轻链多肽亚基的核酸序列，和编码所述J链的核酸序列各自位于分开的载体上。
67.如权利要求55或权利要求65所述的载体。
68.如权利要求54或权利要求66所述的载体。
69.一种宿主细胞，其包含如权利要求47-49中任一项所述的多核苷酸、如权利要求50-66中任一项所述的组合物，或如权利要求67或权利要求68所述的载体，其中，所述宿主细胞能表达如权利要求1-45中任一项所述的结合分子，或其亚基。
70.一种产生如权利要求1-45中任一项所述的结合分子的方法，其包括：培养如权利要求69所述的宿主细胞，和，回收所述结合分子。
71.一种用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，所述方法包括：使CD20表达型细胞与如权利要求1-45中任一项所述的结合分子或如权利要求46所述的组合物接触，其中，相较于特异性地与所述CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段，所述结合分子能以更高效力引导补体介导的CD-20表达型细胞的杀伤。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述单特异性、二价IgG1抗体是1.5.3，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的VL。
73.如权利要求71或权利要求72所述的方法，其中，所述CD-20表达型细胞是淋巴瘤细胞系。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述细胞系是Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。
75.如权利要求71-74中任一项所述的方法，其中，所述CD20表达型细胞是Raji细胞系，并且其中，所述结合分子引导补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少四倍、10倍、50倍，或100倍，以μg/ml计。
76.如权利要求71-74中任一项所述的方法，其中，所述CD20表达型细胞是Ramos细胞系，并且其中，所述结合分子能引导补体介导的杀伤的IC50比等量的单特异性二价IgG1抗体的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍，或至少100倍，以摩尔当量计。
77.如权利要求71或权利要求72所述的方法，其中，所述CD-20表达型细胞是患癌对象中的恶性B细胞。
78.如权利要求77所述的方法，其中，所述癌是CD20阳性白血病、淋巴瘤，或骨髓瘤。
79.如权利要求77-78中任一项所述的方法，其中，所述癌对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。
80.一种用于引导补体介导的、T细胞介导的，或补体介导和T细胞介导的CD20表达型细胞的杀伤的方法，所述方法包括，使CD20表达型细胞与分别包含两个、五个或六个二价结合单元的二聚、五聚或六聚结合分子接触，其中各结合单元包含两个IgA或IgM重链恒定区或其片段和两个抗原结合结构域，其中所述结合分子的至少一个抗原结合结构域是CD20抗原结合结构域，并且其中，相较于特异性地与所述CD20抗原结合结构域结合至相同CD20表位的等量的单特异性、二价IgG1抗体或其片段，所述结合分子能以更高效力引导补体介导的CD-20表达型细胞的杀伤。
81.如权利要求80所述的方法，其中，所述CD20抗原结合结构域包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:3或具有一、二、三、四或五个单氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQID NO:10、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:4、或具有一个、两个或三个单氨基酸取代的SEQ IDNO:4的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6或具有一个、两个或三个单氨基酸取代的SEQ ID NO:6的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:7或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列；并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:8或具有一个或两个单氨基酸取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
82.如权利要求80所述的方法.其中，所述CD20抗原结合结构域包含VH和VL，其分别包含：
(a)与SEQ ID NO:1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:18至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:32至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；或
(f)与SEQ ID NO:35至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列和与SEQ ID NO:37至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中，所述IgA重链恒定区或其片段各自包含Cα2结构域或Cα3-tp结构域。
84.如权利要求83所述方法，其中一个或多个IgA重链恒定区或其片段还包含Cα1结构域。
85.如权利要求83-84所述的方法，其中，所述IgA重链恒定区是人IgA恒定区。
86.如权利要求83-85中任一项所述的方法，其中，所述结合分子还包含分泌型组分。
87.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中，所述结合分子的IgM重链恒定区或其片段各自包含Cμ3结构域和Cμ4-tp结构域。
88.如权利要求87所述的方法，其中，所述结合分子的一个或多个IgM重链恒定区或其片段还包含Cμ2结构域、Cμ1结构域，或其任何组合。
89.如权利要求83-88中任一项所述的方法，其中，所述结合分子是五聚的，并且还包含J链，或其功能片段，或其功能变体。
90.如权利要求89所述的方法，其中J链或其片段包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其功能片段。
91.如权利要求89或权利要求90所述的方法，其中，所述J链或其片段还包含异源多肽，其中所述异源多肽直接或间接融合至所述J链或其片段。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述异源多肽通过肽接头融合至所述J链或其片段。
93.如权利要求92所述的方法，其中，所述肽接头包含至少5个氨基酸，但不多于25个氨基酸。
94.如权利要求93所述的方法，其中，所述肽接头由GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)组成。
95.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其中所述异源多肽融合至J链或其片段的N末端、J链或其片段的C末端，或至J链或其片段的N末端和C末端。
96.如权利要求91-95中任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含结合结构域。
97.如权利要求96所述的方法，其中，所述异源多肽的结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
98.如权利要求97所述的方法，其中，所述抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫-连接的Fv(sdFv)片段，或其任何组合。
99.如权利要求98所述的方法，其中，所述抗原结合片段是scFv片段。
100.如权利要求97-99中任一项所述的方法，其中，所述异源多肽能特异性地结合至CD3ε。
101.如权利要求100所述的方法，其中，所述经修饰的J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:64(V15J)或SEQ ID NO:66(J15V)。
102.如权利要求101所述的方法，其中，所述经修饰的J链还包含信号肽。
103.如权利要求102所述的方法，其中，所述经修饰的J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:63(V15J)或SEQ ID NO:65(J15V)。
104.如权利要求87-103中任一项所述的方法，其中，所述IgM重链恒定区是人IgM恒定区。
105.如权利要求83-104中任一项所述的方法，其中，所述结合分子的各结合单元包含两个IgA或IgM重链，所述两个IgA或IgM重链各自包含位于所述IgA或IgM恒定区或其片段的氨基末端的VH，和两个免疫球蛋白轻链，所述两个免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述结合分子的至少一个结合单元包含两个相同的CD20抗原结合结构域，并且其中，所述至少一个结合单元中的两个IgA或IgM重链是相同的。
107.如权利要求106所述的方法，其中，至少一个结合单元中的两个IgM重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:52。
108.如权利要求107所述的方法，其中，所述两个轻链恒定区是人λ恒定区或人κ恒定区。
109.如权利要求108所述的方法，其中，所述轻链是相同的并且包含氨基酸序列SEQ IDNO:54。
110.如权利要求80-109中任一项所述的方法，其中，所述结合分子包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个CD20抗原结合结构域。
111.如权利要求110所述的方法，其中，所述至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个CD20抗原结合结构域是相同的。
112.如权利要求110或权利要求111所述的方法，其中，所述结合分子中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个结合单元是相同的。
113.如权利要求80-112中任一项所述的方法，其中，所述单特异性、二价IgG1抗体是利妥昔单抗，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL。
114.如权利要求80-113中任一项所述的方法，其中，所述CD-20表达型细胞是淋巴瘤细胞系。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述细胞系是Ramos细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、Namalwa细胞系、Granta细胞系、Z138细胞系、DoHH2细胞系，或DB细胞系。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述细胞系是Granta细胞系，并且其中，所述结合分子能以利妥昔单抗的效力约六倍的效力引导补体介导的所述细胞系的杀伤。
117.如权利要求115所述的方法，其中，所述细胞系是Raji细胞系或Ramos细胞系，并且其中，所述结合分子能以利妥昔单抗的效力约三倍的效力引导补体介导的所述细胞系的杀伤。
118.如权利要求80-112中任一项所述的方法，其中，所述CD-20表达型细胞是患癌对象中的恶性B细胞。
119.如权利要求118所述的方法，其中，所述癌是CD20阳性白血病、淋巴瘤，或骨髓瘤。
120.如权利要求118或权利要求119中任一项所述的方法，其中，所述癌对于利妥昔单抗治疗具有最小响应或无响应。
121.如权利要求118-120中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。
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