CN108699157A - Psma结合抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了称为10B3的新型PSMA结合抗体及抗体10B3的药学和诊断性用途。PSMA抗体10B3不与现有技术PMSA结合抗体J591交叉竞争并相比于J591具有降低的抗原转移诱导以及与不同来源的鳞状细胞癌(SCC)细胞的独特反应性。

Description

PSMA结合抗体及其用途

技术领域

本发明提供了新型PSMA结合抗体。本发明的PSMA抗体不与现有技术PMSA结合抗体J591交叉竞争并相比于J591具有降低的抗原转移诱导以及具有与不同来源的鳞状细胞癌(SCC)细胞的独特反应性。此外，本发明涉及双特异性PSMAxCD3抗体分子。本发明还涉及用于产生本发明的抗体分子以及核酸、载体和宿主细胞的方法。本发明还涉及使用本发明的PMSA抗体分子治疗或诊断疾病的方法。

背景技术

从20世纪80年代开始的科学工作已经确定针对肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞受体(TCR)/CD3-复合体的双特异性抗体能够活化T细胞，导致TAA表达肿瘤细胞被活化的T细胞裂解(Staerz等人Nature 1985,314:628-631；Perez等人Nature 1985,316:354-356；Jung等人Proc Natl Acad Sci USA 1986,83:4479-4483)。因为经由它们的Fc部分与Fc受体(FcR)结合的CD3-抗体在诱导T细胞活化和细胞因子释放(作为不希望的副作用)方面非常有效，至关重要的是构建Fc-耗竭或-减弱的双特异性TAAxCD3-抗体，以防止FcR结合并使得靶细胞受限-而不是FcR-介导的T细胞活化(Jung等人Immunol Today 1988；9:257-260；Jung等人Eur J Immunol 1991；21:2431-2435)。

双特异性抗体的产生在工业质量和数量上达到这一关键先决条件仍然是一个难以应付的挑战。最近，具有CD19xCD3-特异性的重组双特异性单链(bssc)抗体，称为博纳吐单抗(Blinatumomab)，已经在ALL患者的治疗中表现出相当高的效率(Bargou等人Science2008,321:974-977)并且已经获得FDA的突破性疗法认定(under a break throughdesignation)。值得注意的是，由于药物的低血清半衰期和相当高的毒性，该药物在数周内以连续24小时输注施用：安全适用的剂量为每位患者每天约30μg，比用于已建立的单特异性抗肿瘤抗体治疗的那些药物低10.000倍(Adams和Weiner.Nat Biotechnol 2005,23:1147-57)。所得的药物血清浓度低于1ng/ml(Topp等人J Clin Oncol 2011；29:2493-2498)。这种严重的剂量限制，也在早期临床试验中用不同的双特异性抗体观察到(Kroesen等人Br J Cancer 1994；70:652-661；Tibben等人Int J Cancer 1996；66:477-483)，这是由于脱靶T细胞活化导致全身细胞因子释放。显然，这种现象阻止了刺激TCR/CD3复合物的双特异性抗体的最佳治疗活性。

原则上，剂量限制性脱靶T细胞活化和由此产生的毒性问题可能由下面更详细讨论的问题P1和P2引起；问题P3讨论低血清半衰期：

(P1)双特异性抗体靶向的TAA不完全是肿瘤特异性的，造成由于与正常的TAA表达细胞结合而导致抗体介导的T细胞活化。严格意义上说，这不是脱靶活化，因为它是由抗原表达靶细胞诱导的，尽管是“错误的细胞”，即正常而非恶性细胞。博纳吐单抗、上述双特异性CD19xCD3-抗体一定面临这个问题，因为其靶抗原CD19在正常B淋巴细胞上表达。显然，恶性组织的靶向抗原的特异性对于防止这种脱靶T细胞活化至关重要。PSMA在这方面是特别适合的抗原，因为广泛的免疫组织学评价揭示这种抗原在正常组织上的表达局限于前列腺上皮、乳腺和肾近端小管[人蛋白图谱，http://www.proteinatlas.org]。在恶性组织上，抗原在前列腺癌细胞和多种其它实体肿瘤中大量表达，诸如结肠癌、乳腺癌和胰腺癌以及成胶质细胞瘤(Chang等人Cancer Res 1999,59:3192；Ross等人Cancer Met Rev 2005,24:521)。然而，在这些后面的肿瘤中，PSMA表达严格限于脉管系统并且绕过(spare)肿瘤细胞本身。奇怪的是，在前列腺癌(迄今为止肿瘤细胞上有表达的唯一肿瘤)中，脉管系统在大多数情况下缺乏PSMA表达(Chang等人1999)，因此，最佳情况(即脉管上以及肿瘤细胞本身的表达)很少出现(P1.1)。

除了其特异性外，靶向抗体的另一性质可能对其治疗活性至关重要：抗体可通过将抗原“脱落”或摄取至靶细胞中而引起抗原转移。抗原摄取在免疫毒素的情况下是合乎需要的，免疫毒素是包含抗体和毒素的构建体，其通常需要摄入细胞中以发挥其活性。然而，如果抗体用于募集免疫效应细胞，通过任何机制进行的抗原转移都可能妨碍抗体的活性。事实上，已经证明治疗性CD20抗体在不同的淋巴瘤细胞中诱导抗原转移至可变程度，并且这种现象至少部分地导致了这些抗体的可变治疗作用(Glennie等人Mol Immunol.2007；44:3823)。在任何情况下，在T细胞活化双特异性抗体的情况下，似乎需要选择诱导最小抗原转移的靶向抗体(P1.2)。

(P2)T细胞活化不是-它应该是-靶细胞受限制的，即，即使在双特异性抗体构建体内的单价CD3效应子结合位点也能够在没有抗体以其靶向部分结合其上的靶细胞的情况下诱导一些T细胞活化。这表示严格意义上的脱靶活化，因为不需要携带靶抗原的细胞来诱导该现象。我们已经注意到，如果使用不同形式的不同CD3抗体并且如果添加提供T细胞活化的共刺激的某些刺激旁观者细胞(SBC)诸如淋巴瘤细胞(SKW6.4)或内皮细胞(HUVEC)，则这种现象变化很大。因此，应选择诱导最小“脱靶”T细胞活化的CD3部分，以构建双特异性抗体(P2.1)。

除了由真正的单体CD3刺激诱导的T细胞活化之外，最近的一篇论文提出了脱靶活化的另一种机制，涉及双特异性抗体的靶向部分；如果该部分由诱导双特异性抗体的效应部分在T特细胞表面上聚集的单链片段组成，则可诱导紧张性(tonic)信号传导，从而导致T细胞耗尽(Long等人Nat Med 2015；6:581)，这通过传统的短期体外测定几乎检测不到，但严重影响体内效率。这些观察结果是使用用嵌合性抗原受体(CAR T细胞)转染的T细胞进行的。嵌合性T细胞受体包含作为靶向部分的单链抗体。Long等人(2015)的结果非常可能同样适用于具有此类靶向部分的双特异性抗体，因为这些试剂一旦与T细胞结合，就与用相应的CAR转染的T细胞在功能上等效。相当于T细胞转染的功能。在该领域中公知的是，大多数单链抗体具有形成多聚体和聚集物的倾向(Worn等人J Mol Biol 2001,305:989-1010)，并且因此不足为奇的是，由Long等人(2015)测试的除了一种CAR之外的所有CAR都展示了群集和紧张性CD3信号传导的现象，尽管程度不同(Long等人2015)。这里概述的问题(P.2.2)要求双特异性形式，防止靶向部分的多聚化和成簇。

(P3)大多数双特异性形式由于分子量降低和缺失CH3结构域而经历非常低的血清半衰期(1-3小时)。因此，原型博纳吐单抗抗体通过在数周内连续24小时i.v.输注来施用。使用具有增加的血清半衰期的全部基于IgG的形式，诸如图1B中所示的IgGsc，被认为是不适合的，这是因为由二价C-末端CD3结合部分诱导的可能增加的脱靶活化。

基于以上内容，本领域需要改良的抗体分子，其解决了上述问题中的至少一个。

发明概述

本发明涉及能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体分子或其抗原结合片段，其包含：(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:03中示出的CDRH1区(GFTFSDFYMY)、SEQ ID NO:04中示出的CDRH2区(TISDGGGYTSYPDSVKG)和SEQ ID NO:05中示出的CDRH3区(GLWLRDALDY)，或包含与SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04或SEQ ID NO:05具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRH1、CDRH2或CDRH3序列；以及(ii)轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:06中示出的CDRL1区(SASSSISSNYLH)、SEQ ID NO:07中示出的CDRL2区(RTSNLAS)和SEQ ID NO:08中示出的CDRL3区(QQGSYIPFT)，或包含与SEQ ID NO:06、SEQ IDNO:07或SEQ ID NO:08具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRL1、CDRL2或CDRL3序列。

本发明还涉及能够结合至人PSMA的抗体分子或其抗原结合片段，其能够与本发明的抗体分子或其抗原结合片段竞争结合人PSMA。

本发明还涉及双特异性抗体分子，其包含：(i)可变区，其包含本发明的PMSA结合抗体分子的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述可变区包含能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的第一结合位点；以及(ii)抗体分子的重链可变区和轻链可变区，其包含第二结合位点。

本发明还涉及包含本发明的抗体分子或其抗原结合片段的药物组合物。

本发明还涉及用于诊断或治疗疾病的本发明的抗体分子或其抗原结合片段。

本发明还涉及诊断疾病的体外方法，其包括使从受试者获得的样品与本发明的抗体分子或其抗原结合片段接触。

本发明还涉及编码本发明的抗体分子或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。

本发明还涉及产生本发明的抗体分子或其抗原结合片段的方法，其包括在允许核酸表达的条件下表达编码抗体分子的核酸。

附图简述

当结合非限制性示例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：

图1描绘了已经用于本发明中的双特异性抗体分子的各种形式。描绘了呈Fabsc形式(图1A)和IgGsc形式(图1B)的双特异性PSMAxCD3抗体。在这两种形式中，通过限定的氨基酸修饰防止CH2结构域与Fc-受体的结合。还描绘了bssc(双特异性单链Fv)形式(图1C)。

图2描绘了不同的PSMAxCD3抗体进行的脱靶T细胞活化。在不存在和存在SKW6.4淋巴瘤细胞的情况下，将PBMC与指定的抗体一起孵育。3天后，通过流式细胞术分析T细胞的CD69表达。

在图3中显示了T细胞活化，其通过³H胸苷摄取进行评估。在图3A中，显示了在不存在靶细胞的情况下的脱靶T细胞活化，而相比之下，图3B描绘了用呈Fabsc形式的PSMAxCD3抗体进行的中靶(on-target)T细胞活化并且分别含有CD3抗体UCHT1(NPCU)和OKT3(NPCO)。在图3C中，通过Xelligence细胞毒性测定证明了经活化的T细胞将表达PSMA的靶细胞裂解。

图4描绘了不同双特异性抗体形式的多聚化和成簇。在图4A和图4B中，比较了具有FLT3xCD3-特异性的抗体(Fabsc形式对比bssc形式)，而在图4C-4F中，比较了具有PSMAxCD3-特异性的那些抗体(Fabsc形式对比IgGsc形式)。在Superdex S200柱上进行凝胶过滤。

图5描绘了现有技术PSMA-抗体J591和本发明的抗体10B3与表达PSMA的细胞的结合。通过流式细胞术使用PSMA转染的Sp2/0细胞来评估结合(图5A)、缺乏结合竞争(图5B)和PSMA抗原在抗体结合后的转移(图5C)。在图5B中，证明嵌合性(ch)J591，尤其是由山羊抗人二级抗体检测，被鼠(mu)J591但不是鼠10B3竞争下去。

图6显示了用PSMA结合现有技术抗体J591和本发明的10B3抗体染色的冷冻切片。在图6A和图6B中，将前列腺癌样品(平行地)用两种抗体和来自Zytomed,Berlin,Germany(POLHRP-100)的聚合物体系染色，而在图6C和图6D中，将鳞状细胞癌样品用两种抗体使用来自Zytomed的聚合物体系再次平行染色。箭头指示肿瘤基质(Tu)和血管(Ve)。显示了10个前列腺癌样品中的9个和10个鳞状细胞样品中的7个的代表性结果。在各种不同的正常人组织(从BioCat,Heidelberg,Germany获得，T6234701-2)中，两种抗体的染色模式是相同的，除了10B3与皮肤中的上皮细胞具有微弱反应性之外。

图7显示了人源化的和小鼠10B3抗体分子的结合。将含有人源化的、CDR-移植的(h10B3)可变结构域或小鼠(m10B3)抗体可变结构域的具有PSMAxCD3(10B3xOKT3)-特异性的双特异性Fabsc抗体分子与PSMA-表达22RV1细胞一起孵育并通过流式细胞术分析。

图8描绘了不同PSMAxCD3抗体的CD3-靶向部分的结合。将CD3-阳性Jurkat细胞与指定的抗体一起孵育，并通过流式细胞术分析。

图9描绘了不同PSMA抗体的细胞裂解活性。将表达PSMA的22RV1前列腺癌细胞与PBMC和指定的双特异性PSMAxCD3抗体以5:1的PBMC:靶标的比率一起孵育。使用Xelligence系统评估粘附靶细胞的存活力。显示了用不同健康志愿者的PBMC进行的四个不同实验之一的代表性结果。

图10显示了鼠和人源化10B3抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。图10A显示了鼠10B3抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:01)。将CDR序列加下划线。图10B显示了鼠10B3抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:02)。将CDR序列加下划线。图10C显示了人源化10B3抗体的重链可变区的氨基酸序列，其中将鼠抗体10B3的重链的CDR环(CDRH1、CDRH2和CHDR3)移植至重链种系序列IGHV3-11*06的可变结构域(SEQ ID NO:09)。将CDR序列加下划线。此外，将存在于重链种系序列IGHV3-11*06的位置49处的丝氨酸残基在SEQ ID NO:9的可变结构域中回复突变为存在于鼠抗体10B3中的丙氨酸。将位置49处的该丙氨酸残基在图10C中用粗体和斜体突出显示。图10D显示了人源化10B3抗体的轻链可变区的氨基酸序列，其中CDR环(将抗体10B3的轻链的CDRL1、CDRL2、CDRL3移植至人κ轻链IGKV3-20*02的可变结构域(SEQ ID NO:10)。将CDR序列加下划线。此外，将在IGKV3-20*02的人轻链序列的可变结构域中的序列位置72处存在的苯丙氨酸在SEQ ID NO:10的可变结构域中回复突变为鼠抗体10B3中的该序列位置处存在的酪氨酸残基。位置72处的该酪氨酸残基在图10D中以粗体和斜体突出显示。

图11显示了PSMA(人源化h10B3)X CD3(人源化hUCHT1)双特异性IgGsc形式抗体分子的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。重链包含10B3的人源化重链(HC)可变区、IgG1CH1结构域、IgG1铰链区、经修饰的IgG1 CH2结构域、IgG1 CH3结构域和人源化CD3(UCHT1)单链Fv片段。

图12显示了PSMA(人源化h10B3)X CD3(鼠OKT3)双特异性Fabsc形式抗体分子的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。重链包含10B3的人源化HC可变区、IgG1 CH1结构域、IgG1铰链区、经修饰的IgG1 CH2结构域、IgG1 CH3结构域的起始部分及鼠CD3(OKT3)单链Fv片段。

图13显示了PSMA(人源化h10B3)抗体(SEQ ID NO:13)的κ轻链的氨基酸序列。该轻链将SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的重链构建体补全，以分别形成h10B3xUCHT1 IgGsc分子和h10B3xOKT3 Fabsc分子(参见图1)。

图14显示了抗体J519的可变结构域的氨基酸序列，其中图14A显示了抗体J519的重链的可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)，图14B显示了轻链的可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。

图15显示了本发明的双特异性抗体的体外治疗作用。将本发明的PSMA(人源化h10B3)X CD3(人源化hUCHT1)双特异性IgGsc形式抗体分子及对照双特异性抗体(NG2xCD3)在PBMC的存在下在有或没有肿瘤细胞的情况下孵育。

图16显示了本发明的PSMA(人源化h10B3)X CD3(人源化hUCHT1)双特异性IgGsc形式抗体分子在小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。

图17显示了含作为抗CD3特异性的UCHT1的非PSMA靶向的双特异性IgGsc抗体的T细胞活化和肿瘤细胞生长抑制。

发明详述

本发明涉及能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体、抗体分子或其抗原结合片段。抗体、抗体分子或其抗原结合片段包含(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:3中示出的CDRH1区(具有氨基酸序列GFTFSDFYMY)、SEQ ID NO:4中示出的CDRH2区(具有氨基酸序列TISDGGGYTSYPDSVKG)和SEQ ID NO:5中示出的CDRH3区(具有氨基酸序列GLWLRDALDY)或包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRH1、CDRH2或CDRH3序列。其还包含：(iii)轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:6中示出的CDRL1区(具有氨基酸序列SASSSISSNYLH)、SEQ ID NO:7中示出的CDRL2区(具有氨基酸序列RTSNLAS)和SEQ ID NO:8中示出的CDRL3区(具有氨基酸序列QQGSYIPFT)或包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有75％序列同一性或80％序列同一性的CDRL1、CDRL2或CDRL3序列。本发明设想了抗体分子，其包含SEQ ID NO:3中示出的CDRH1区、SEQ ID NO:4中示出的CDRH2区、SEQ ID NO:5中示出的CDRH3区、SEQ IDNO:6中示出的CDRL1区、SEQ ID NO:7中示出的VLCDL2区和SEQ ID NO:8中示出的VLCDL3区。在本文中，应指出，本发明的抗体分子或其抗原结合片段优选不与抗体J591竞争结合(Liu等人,Cancer Res 1997；57:3629-34，这是临床上最高度开发的抗体，参见“Prostate-Specific Membrane Antigen-Based Therapeutics”,Advances in Urology Volume 2012(2012),Article ID 973820)至人PSMA。此外，与J591相比，当与PSMA结合时，本发明的抗体分子或其抗原结合片段可具有减少的抗原转移诱导。它还可以发挥与不同来源的鳞状癌细胞独特的反应性。

本发明还涉及包含重链可变区的抗体、抗体分子或其抗原结合片段，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:01或09中示出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。本发明还涵盖了抗体、抗体分子或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。特别优选的是抗体、抗体分子或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ IDNO:01和SEQ ID NO:02中示出的鼠抗PSMA抗体10B3(m10B3)的重链可变结构域和轻链可变结构域。还优选的是，抗体、抗体分子或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO:09和SEQID NO:10中示出的人源化抗PSMA抗体10B3(h10B3)的重链可变结构域和轻链可变结构域。

PSMA是抗体介导靶向的特别有吸引力的抗原，并且已经开发了几种针对该蛋白的胞外部分的抗体。目前在临床试验中对最先进的试剂J591进行评估(Liu等人,Cancer Res1997；57:3629-34)，其放射性标记或偶联至毒素DM1(一种微管蛋白抑制化合物美登素的衍生物)(Ross JS,等人Cancer Met Rev 2005；24:521；Akhtar等人,2012,同上)。本发明的PSMA抗体具有与正常人组织相同的反应模式。然而，本发明的PSMA抗体与抗体J591的不同之处在于其与不同来源的鳞状癌细胞的反应。令人惊讶的是，本文发现，在这些肿瘤以及前列腺癌中，肿瘤细胞本身和肿瘤内部和周围的脉管系统被PMSA抗体染色，诸如含有如SEQID NO:3至SEQ ID NO:8中所述的重链和轻链可变结构域的CDR序列的抗体10B3(参阅图6)。鳞状癌占耳鼻喉腔、食道和子宫颈中产生的癌症的大部分以及肺肿瘤的20-30％，并且此类肿瘤上的PSMA表达尚未被描述过。因此，本发明的抗体与这些癌症的有利反应性提供了扩展和改良的诊断剂和治疗选择。

PSMA抗体J591和本发明的抗体在另一个重要方面有所不同：通常许多抗体在结合到靶细胞后诱导显著的抗原转移，所述抗原转移是用于构建需要摄取至细胞中以发挥生物活性的免疫毒素的所需特性。例如，基准PSMA抗体J591是用于此目的(Ross等人2005，同上)。然而，如果需要免疫效应细胞的募集，抗原的稳定表达是优选的，而不是其快速摄取到细胞中。图5证明了本发明的抗体与PSMA转染的Sp2/0细胞的结合与J591的结合相当(图5A)，并且两种抗体不相互交叉竞争，这表明它们结合至PSMA分子的不同表位(图5B)。最重要的是，如果与J591相比，本发明的抗体诱导降低的抗原转移(图5C)。然而，在本文中，注意到抗体10B3所结合的PMSA上的表位尚不清楚。在这方面还注意到，抗体10B3在鳞状细胞癌细胞上的结合的表位可能不一定与PMSA上的表位相同，尤其是因为尚未在鳞状癌细胞上报道PMSA表达。因此，本发明的抗体分子在鳞状癌细胞上结合的一个或多个表位可以仅就其氨基酸序列或其构象(confirmation)而言与PMSA上的表位相关。然而，只要本发明的抗体分子结合至表达PMSA的细胞或至如本文所述的鳞状癌细胞，而PMSA或鳞状癌细胞上相应的表位的性质在本发明中是不相关的。在此还应注意，本发明的抗体分子与细胞的结合不一定必须触发生理响应。相反，本发明的抗体结合至给定细胞(上存在的表位)就足够了。如果例如与细胞毒性剂如毒素或放射性配体缀合，则抗体出于治疗目的用作递送或靶向部分，其将肝细胞毒性剂带到在其上细胞毒性剂应发挥其细胞毒性(细胞杀伤)活性的细胞上。同样地，当用于诊断性目的时，本发明的抗体可以缀合至成像部分，所述成像部分提供可检测的信号，其可以用于检测抗体已经结合的细胞。

本发明还提供了通过CDR移植来人源化的10B3的人源化形式，意味着鼠抗体10B3的CDR区被插入人抗体的重链和轻链的框架区。原则上，任何可变人轻链和/或可变重链都可以用作CDR移植的支架。在本发明的人源化抗体的一个说明性实例中，可以将抗体10B3的轻链的CDR区(其意指SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:8的CDR环)插入以登录号L37729保藏于IMGT/LIGM-数据库的人κ轻链序列IGKV3-20*02的(可变结构域)，还参见Ichiyoshi Y.,Zhou M.,Casali P.A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arisesthrough clonal selection from an insulin-specific'germ-line'natural antibodytemplate.Analysis by V gene segment reassortment and site-directedmutagenesis'J.Immunol.154(1):226-238(1995)。在本发明的人源化抗体的另一个说明性实例中，抗体10B3的重链的CDR区(其意指SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:5的CDR环)可包括在以登录号AF064919保藏于IMGT/LIGM-数据库中的重链序列IGHV3-11*06的(可变结构域)中(还参见Watson C.T.,等人Complete haplotype sequence of the humanimmunoglobulin heavy-chain variable,diversity,and joining genes andcharacterization of allelic and copy-number variation.Am.J.Hum.Genet.92(4):530-546(2013))。在如本文所述的人源化抗体的另一个说明性的实施方案中，将抗体10B3的重链的CDR环移植至重链种系序列IGHV3-11*06的可变结构域，并且将抗体10B3的轻链的CDR环移植至人κ轻链序列IGKV3-20*02的可变结构域。为了维持亲本鼠抗体10B3的结合性质，人框架的残基可能会被突变回存在于鼠抗体10B3的特定序列位置处的氨基酸残基。在此类人源化抗体的说明性实例中，在IGHV3-11*06的人种系序列的重链的可变结构域中，将位置49处的丝氨酸回复突变为存在于鼠抗体10B3中的丙氨酸(还参见图10C，其中位置49处的丙氨酸残基以粗体和斜体突出显示)，而在IGKV3-20*02的轻链序列的可变结构域中，将人种系序列的序列位置72处的苯丙氨酸回复突变为存在于鼠抗体10B3中的该序列位置处的酪氨酸残基(还参见图10D，其中位置72处的酪氨酸残基以粗体和斜体突出显示)。掺入双特异性Fabsc-抗体中的此类人源化抗体以与小鼠亲本抗体相同的亲合力结合至表达PSMA的细胞系(参阅图7)。

术语“抗体”通常是指基于免疫球蛋白的蛋白质性结合分子。此类抗体的实例是免疫球蛋白的保留结合特异性的衍生物或功能性片段。用于产生抗体和抗体片段的技术是本领域熟知的。术语“抗体”还包括不同类别的免疫球蛋白(Ig)(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(诸如IgG1、lgG2等)。还如上所提及，抗体衍生物或分子的说明性实例包括Fab片段、F(ab’)₂、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双链抗体或结构域抗体(Holt LJ等人,TrendsBiotechnol.21(11),2003,484-490)。术语“抗体”的定义因此也包括诸如嵌合性抗体、单链抗体和人源化抗体的实施方案。

如本文所用的“抗体分子”可载有具有以下序列的一个或多个结构域，所述序列与免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D或免疫球蛋白E的相应天然存在的结构域具有至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在这方面应注意，如本文所用的术语“约”或“近似”意指在20％的偏差内，诸如在给定值或范围的10％的偏差内或在5％的偏差内。

如本发明中使用的“序列同一性百分比(％)"意指，在本发明的多肽的序列与所讨论的序列的同源性比对之后，就这两条序列中较长的残基的数量而言，成对的相同残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。本文公开的核苷酸序列也是如此。在本文中，如本文描述的至少75％或至少80％的序列同一性就本发明的抗体的CDR序列而言进行说明。首先参考CDR H1，本发明的抗体具有CDRH1序列GFTFSDFYMY(SEQ ID NO:3)或与该序列有80％序列同一性的氨基酸序列。由于该CDRH1序列的长度为10个氨基酸，所以这10个残基中的2个可被替代以与SEQ ID NO:3具有80％的序列同一性。例如，可能是CDR H1的位置3处的苏氨酸残基被丝氨酸替代(进行保守性取代)，并且CDRH1的位置5处的丝氨酸残基被苏氨酸残基替代(也意味着保守性取代)。因此，相对于SEQ ID NO:3，携带这两种保守性氨基酸交换的CDRH1的所得序列GFSFTDFYMY(SEQ ID NO:14)与SEQ ID NO:3的序列具有80％的序列同一性，而其中进行这两种保守性取代中的仅一个的CDR H1序列与SEQ ID NO:3的序列具有90％的序列同一性。类似地，SEQ ID NO:04中示出的CDRH2序列(TISDGGGYTSYPDSVKG)含有17个氨基酸残基，80％的序列同一性允许相对于SEQ ID NO:04的序列最多有3个突变(因为20％理论上对应于3.4个不同的氨基酸)。例如，SEQ ID NO:4的第一苏氨酸残基可以用丝氨酸替代。类似地，SEQ ID NO:05中示出的CDRH3区(GLWLRDALDY)具有10个氨基酸残基的长度。因此，与SEQID NO:05具有80％或90％序列同一性的CDRH3序列(GLWLRDALDY)可包含两种氨基酸替代，例如，相较于SEQ ID NO:5的保守性取代。SEQ ID NO:06中示出的CDRL1区(SASSSISSNYLH)包含12个氨基酸残基。因此，携带相较于SEQ ID NO:06的氨基酸序列的一种或两种氨基酸取代的CDRL1序列与SEQ ID NO:06的序列具有大于80％的序列同一性。SEQ ID NO:07中示出的CDRL2区(RTSNLAS)的长度为7个氨基酸残基。因此，含有相较于SEQ ID NO:7的CDRL2序列的一种氨基酸取代的CDRL2序列与SEQ ID NO:07具有84％的序列同一性。最后，SEQ IDNO:08中示出的CDRL3区(QQGSYIPFT)的长度为9个氨基酸残基。因此，包含相较于SEQ NO:08的序列的一种经取代的氨基酸的CDRL3序列与SEQ ID NO:8具有89％的序列同一性，并且包含相较于SEQ NO:08的两种氨基酸取代的CDL3序列与SEQ ID NO:08的序列具有78％的序列同一性。这里应注意，从上述解释和本文所述的CDR区的序列，本领域技术人员将理解，任何序列都是如此。本发明中涵盖了与本文所述的CDRH1、CDRH2、CDHL3、CDRL1、CDRL2和CDRL3中任一个的序列(SEQ ID NO:03至SEQ ID NO:08)具有至少80％序列同一性并且能够结合至PMSA以及优选地结合至如本文所述的鳞状癌细胞的任何序列。虽然与SEQ ID NO:03至SEQID NO:08中任一个的相应CDR序列具有至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的序列同一性的CDR序列优选包含一种或多种保守性突变，也可能的是，本发明的抗体的六个“亲本”CDR区(SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:8)中的任一个的序列的偏差和因此的75％或更大的序列同一性是由于CDR区中存在非保守性突变导致的，只要抗体保留结合PMSA且优选地结合至鳞状癌细胞结合的能力。

“免疫球蛋白”当在本文中使用时，通常是四聚体的糖基化蛋白，其由两条各自约25kDa的轻(L)链和两条各约50kDa的重(H)链组成。在免疫球蛋白中可以存在两种类型的轻链，称为λ和κ。根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五大类：A、D、E、G和M，并且这些中的一些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgM免疫球蛋白由5个碱性异四聚体单元和一个称为J链的另外多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA免疫球蛋白含有2-5个碱性4链单元，其可以聚合以形成与J链组合的多价聚集体。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。

在免疫球蛋白的IgG类中，重链中有数个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区。在IgG抗体的情况下，IgG同种型各自具有三个CH区：根据如Kabat等人的EU索引，“CH1”是指位置118-220，“CH2”是指位置237-340，并且“CH3”是指位置341-447。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”或“H”在本文中意指在抗体的第一和第二恒定结构域之间包含氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域终止于EU位置220处，并且IgG CH2结构域始于残基EU位置237处。因此对于IgG，铰链在本文中被定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号根据如Kabat等人的EU索引。如本文所定义的恒定重链是指CH1结构域的N-末端至CH3结构域的C-末端，因此包括位置118-447，其中编号根据EU索引。

术语“可变”是指免疫球蛋白结构域的展示序列可变性并且参与确定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即“(一种或多种)可变结构域”)。可变性并非均匀分布在整个抗体的可变结构域中；它在重链和轻链可变区中的每一个的子结构域中是集中的。这些子结构域被称为“高变区”、“HVR”或“HV”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即，非高变)部分被称为“框架”区(FR)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各包括四个FR区，其主要采用β-折叠构型，由三个高变区(其形成环连接)连接，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区由FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的超可变区一起对抗原结合位点的结构有贡献(参见Kabat等人，参见下文)。通常，天然存在的免疫球蛋白包括六个CDR(参见下文)；三个在VH中(H1、H2、H3)并且三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然存在的免疫球蛋白中，H3和L3显示出六个CDR中最广泛的多样性，并且尤其认为H3在赋予免疫球蛋白精细特异性方面发挥独特作用。恒定结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功能，诸如，例如抗体依赖性的、细胞介导的细胞毒性和补体活化。

术语“V_H”(还被称为VH)和“V_L”(还被称为VL)在本文中分别是指免疫球蛋白的重链可变结构域和轻链可变结构域。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个超变区中断的“框架”区组成。因此，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文所用的“CDR”是指所有三个重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)，或所有三个轻链CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)或所有重链和所有轻链CDR两者，如果适合的话。三个CDR构成轻链可变区的结合特征，并且三个构成重链可变区的结合特征。CDR确定了免疫球蛋白分子的抗原特异性，并通过包括支架区或框架区的氨基酸序列分开。确切的定义CDR边界和长度受不同的分类和编号系统的限制。抗体的结构和蛋白折叠可以意味着其它残基被认为是抗原结合区的一部分并且技术人员将理解为这样。CDR为免疫球蛋白与抗原或表位的结合提供了大部分接触残基。

CDR3通常是抗体结合位点内最大的分子多样性来源。H3，例如可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型在本领域中是公知的。有关抗体结构的综述，参见Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Harlow等人编,1988。本领域的技术人员将认识到每个亚基结构(如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构)包括活性片段，如VH、VL或CDR亚基结合至抗原的部分，即抗原结合片段，或如CH亚基的结合至和/或活化如Fc受体和/或补体的部分。CDR通常是指Kabat CDR，如Sequences of Proteins of immunological Interest,US Department of Health andHuman Services(1991),Kabat等人编中所述。用于表征抗原结合位点的另一个标准是指如Chothia描述的高变环。参见，如Chothia,等人(1992；J.MoI.Biol.227:799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14:4628-4638。又一个标准是由Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的AbM定义。通常参见，如Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains.In:Antibody Engineering Lab Manual(编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)。关于Kabat CDR描述的实施方案可以可替代地使用与Chothia高变环或AbM定义的环相似的描述关系来实施。

相应的免疫球蛋白μ重链、γ重链、α重链、δ重链、ε重链、λ轻链或κ轻链可以是任何物种的，诸如哺乳动物物种，包括啮齿动物物种，如子类滑体亚纲的两栖动物(包括如青蛙、蟾蜍、蝾螈或小蝾螈)，或无脊椎动物物种。哺乳动物的实例包括但不限于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、刺猬、鸭嘴兽、美洲鼠兔、犰狳、狗、狐猴、山羊、猪、牛、负鼠、马、蝙蝠、土拨鼠、猩猩、恒河猴、羊毛猴、猕猴、黑猩猩、绢毛猴(绒顶柽柳猴(saguinus oedipus))、狨猴或人类。

如本文所述，免疫球蛋白通常是糖蛋白，其包括通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条重链都有重链可变区(在本文中缩写为V_H)和重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包括三个结构域C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链都有轻链可变区(在本文中缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域C_L。V_H和V_L区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变性区，其中散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。CDR含有大部分残基负责抗体与抗原的特异性相互作用。每个V_H和V_L具有三个CDR和四个FR，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原的表位相互作用的结合结构域。

“框架区”或“FR”残基是高变区以外的那些可变结构域残基。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。因此，“人框架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的框架区基本相同(约85％或更大，通常90-95％或更大)的框架区。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于定位和对齐CDR。CDR主要负责结合至抗原的表位。

术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”应理解为定义包括V_H、C_H1、V_L和C_L免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指呈分离状态的该区，或者在抗体分子的上下文中的该区，以及全长免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。通常，Fab区含有抗体的整条轻链。可以采用Fab区来定义免疫球蛋白分子的“一个臂”。它含有此Ig的表位结合部分。天然存在的免疫球蛋白的Fab区可以通过木瓜蛋白酶消化作为蛋白水解片段获得。“F(ab’)₂部分”是胃蛋白酶-消化的免疫球蛋白的蛋白水解片段。“Fab’部分”是由还原F(ab’)₂部分的二硫键产生的产物。如本文所用，术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”还可包括限定抗体臂的C末端的铰链区。该铰链区对应于在全长免疫球蛋白内的CH1结构域的C末端存在的铰链区，其中抗体分子的臂可以用于定义Y。术语铰链区用于本领域，因为免疫球蛋白在这个区域有一定的灵活性。如本文所用的“Fab重链”被理解为Fab片段的包含V_H和C_H1的部分或多肽，而如本文所用的“Fab轻链”被理解为Fab片段的包含V_L和C_L的部分或多肽。

术语“Fc区”或“Fc片段”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然-序列Fc区和变体Fc区。Fc部分介导抗体的效应子功能，如活化补体系统和携带Fc-受体的免疫效应子细胞，诸如NK细胞。在人IgG分子中，通过木瓜蛋白酶切割N末端至Cys226产生Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体分子的产生或纯化期间，或者通过重组工程化编码抗体分子的重链的核酸去除。天然-序列Fc区包括哺乳动物(如人或鼠)的IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。Fc区含有两个或三个恒定结构域，这取决于抗体的类别。在免疫球蛋白是IgG的实施方案中，Fc区具有CH2和CH3结构域。

术语“单链可变片段”(scFv)在本文中用于定义抗体片段，其中免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区融合在一起，其与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含用于灵活性的甘氨酸，以及用于溶解度的苏氨酸，并且可以连接VH的N末端与VL的C末端，或者连接VL的N末端与VH的C末端。scFv片段保留了特异性抗原结合位点，但缺乏免疫球蛋白的恒定结构域。

术语“表位”，也被称为“抗原决定簇”，是指抗原的与抗体或T细胞受体特异性结合、从而形成复合体的部分。因此，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何分子或蛋白决定簇。本文描述的抗体分子的一个或多个结合位点(互补位)可以特异性结合至构象表位或连续表位/与构象表位或连续表位相互作用，其对于靶结构是独特的。表位决定簇通常由通过分子(诸如氨基酸或糖侧链)分组的化学活性表面组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，表位决定因素包括通过分子(如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)分组的化学活性表面，以及在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特性。就多肽抗原而言，构象表位或不连续表位的特征在于存在两个或多个分散的氨基酸残基，其在一级序列中分离，但在多肽折叠成天然蛋白质/抗原时在分子表面上组装成一致的结构(SeIa,M.,Science(1969)166,1365-1374；Laver,W.G.,等人Cell(1990)61,553-556)。促成表位的两个或多个分散的氨基酸残基可以存在于一条或多条多肽链的分开的部分上。当所述一条或多条多肽链折叠成三维结构以构成表位时，这些残基在分子的表面上聚集在一起。相反，连续表位或直链表位由两个或多个分散的氨基酸残基组成，其存在于多肽链的单个直链区段中。

在本文中，术语“特异性”或“特异性结合”也用作“针对(directed to)”根据本发明意指抗体或免疫受体片段能够与特异性抗原或配体或一组特异性抗原或配体特异性地相互作用和/或结合至特异性抗原或配体或一组特异性抗原或配体，但基本上不与其它抗原或配体结合。此类结合可以通过“锁钥原理”的特异性来举例说明。如果抗体交叉竞争，则抗体被称为“结合至相同表位”，因此只有一个抗体可以在给定的时间点结合至表位，即一个抗体防止另一个的结合或调控作用。

通常，当结合亲和力高于10^-6M或10^-7M时，结合被认为是有特异性的。特别地，当结合亲和力为约10^-8至10^-11M(K_D)或约10^-9至10^-11M或甚至更高时，结合被认为是有特异性的。如果有必要，可以通过改变结合条件来减少结合位点的非特异性结合而基本上不影响特异性结合。

如本文所用的术语"经分离的抗体分子"是指已从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体分子。其天然环境中的污染组分是会干扰抗体的诊断性或治疗性用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些实施方案中，抗体分子被纯化为按重量计大于95％的抗体，如通过劳里法(Lowry method)所测定，诸如按重量计大于99％。在一些实施方案中，抗体在使用考马斯亮蓝(Coomassie blue)或优选银染色的还原或非还原条件下被纯化至如通过SDS-PAGE所判断的均一性。经分离的抗体分子可以在一个实施方案中，存在于其中抗体的天然环境的一种或多种组分不存在的重组细胞内。通常，通过至少一个纯化步骤制备经分离的抗体。

结合至如本文所述的PMSA和/或鳞状癌细胞的本发明的(重组)抗体分子可以以任何适合的重组抗体形式使用，例如作为Fv片段、scFv、缺乏铰链区的单价抗体、微抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段。本发明的重组抗体分子还可以包含恒定结构域(区域)，例如人IgG恒定区、CH1结构域(Fab片段也如此)和/或整个Fc区。可替代地，本发明的抗体分子也可以是全长(整个)抗体。

抗体介导细胞效应有许多可能的机制，包括经由阻断所需生长途径的抗增殖、导致凋亡的细胞内信号传导、增强的受体的下调和/或周转、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和促进适应性免疫响应(Cragg等人,1999,Curr Opin Immunol 11 541-547，Glennie等人,2000,ImmunolToday 21 403-410)。抗体功效可能是由于这些机制的组合导致的，并且它们在肿瘤学临床治疗中的相对重要性似乎是癌症依赖性的。

FcγR-介导的效应子功能对一些抗体的活性的重要性已经在小鼠中得以证实(Clynes等人,1998,Proc Natl Acad Sci U S A 95 652-656，Clynes等人,2000,Nat Med6 443-446,)，并且从观察到的人类临床功效与FcγRIIIa的高(V158)或低(F158)亲和力多晶型的其同种异型之间的相关性(Cartron等人,2002,Blood 99 754-758，Weng&Levy,2003,Journal of Clinical Oncology,21 3940-3947)中得以证实。这些数据一起表明，针对某些FcγR结合而优化的抗体可以更好地介导效应子功能，并且从而在患者中更有效地破坏靶细胞。因此，用于增强抗体的抗肿瘤效力的有希望的手段是经由增强它们介导细胞毒性效应子功能诸如ADCC、ADCP和CDC的能力进行的。此外，抗体可以经由生长抑制性或凋亡性信号传导介导抗肿瘤机制，所述信号传导在抗体结合至其在肿瘤细胞上的靶标时可能发生。当抗体经由FcγR呈递给与免疫细胞结合的肿瘤细胞时，这种信号传导可以被加强。因此，抗体对FcγR的亲和力增加可导致增强的抗增殖作用。

通过选择性增强与FcγR的结合来修饰抗体以提供增强的效应子功能已经取得了一些成功。使用氨基酸修饰实现了用于优化的效应子功能的抗体工程化(参见例如美国专利申请US 2004-0132101或美国专利申请2006-0024298。

因此，本发明还考虑本发明的抗体分子或其抗原结合片段被修饰以对FcγRIIIa受体具有增强的亲和力或与亲本抗体相比具有增强的ADCC效应子功能。实现增强的ADCC的一种方法是通过在抗体分子的Fc部分的CH2结构域中引入氨基酸取代239D和332E，例如至鼠或人源化10B3抗体中进行。然后，可以显著增加或甚至首次检测并产生这些抗体的细胞杀伤活性。在一个实施方案中，氨基酸取代是S239D和I332E。

本发明的抗体分子能够与人PSMA结合。术语“前列腺特异性膜抗原”或“PSMA”在本文中可互换使用，并且包括人PSMA变型、同种型和物种同系物。PSMA也被称为谷氨酸羧肽酶II、NAALADase I＝N-乙酰基-L-天冬氨酰-L-谷氨酰肽酶I、叶酸水解酶I(FolathydrolaseI，FOLH1)。人PSMA的UniProt登录号为Q04609(2015年12月9日175版)。因此，在某些情况下，本发明的抗体可以与来自人以外的物种的PSMA或与同人PSMA结构相关的其它蛋白质(如人PSMA同系物)交叉反应。如前所述，本发明的优选实施方案是抗体10B3或其人源化形式。然而，与10B3结合相同表位的其它抗体分子也在本发明的范围内。

为了确定表位，可以使用本领域已知的标准表位作图方法。例如，结合抗体的PMSA的片段(肽)(例如，合成肽)可用于确定候选抗体或其抗原结合片段是否结合相同的表位。对于线性表位，合成具有确定长度(如，8个或更多个氨基酸)的重叠肽。该肽可以通过1个氨基酸侧移，使得制备覆盖PSMA蛋白序列的每8个氨基酸片段的一系列肽。通过使用更大的侧移，如2个或3个氨基酸，可以制备更少的肽。此外，可以合成更长的肽(如9-聚体、10-聚体或11-聚体)。肽与抗体或抗原结合片段的结合可以使用标准方法确定，包括表面等离子体共振(BIACORE)和ELISA测定。为了检查构象表位，可以使用更大的PSMA片段。已经描述了使用质谱法来定义构象表位的其它方法，并且可以是这些方法(参见，如，Baerga-Ortiz等人,Protein Science 11:1300-1308,2002和其中引用的参考文献)。用于表位测定的其它方法在标准实验室参考书中提供，诸如Current Protocols in Immunology,Coligan等人,编辑,John Wiley&Sons的单元6.8(“噬菌体展示选择和B细胞表位分析(Phage DisplaySelection and Analysis of B-cell Epitopes)”)和单元9.8(“使用合成肽组合文库鉴定抗原决定簇(Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic PeptideCombinatorial Libraries)”)。表位可以通过以下步骤来确认：将点突变或缺失引入已知的表位中，然后测试与一个或多个抗体或抗原结合片段的结合来确定哪个突变减少抗体或抗原结合片段的结合。

在本发明范围内，还有与本发明的抗体分子(诸如10B3)结合至PSMA相竞争的抗体分子，例如竞争性抑制10B3结合至PSMA。为了确定竞争性抑制，可以采用本领域普通技术人员已知的各种测定。例如，交叉竞争测定可用于确定抗体或其抗原结合片段是否通过另一种抗体或抗原结合片段竞争性抑制与PSMA的结合。这些包括采用流式细胞术或固相结合分析的基于细胞的方法。还可以使用评价抗体或其抗原结合片段交叉竞争在细胞表面、固相或溶液相中不表达的PSMA分子的能力的其它测定。例如，在实施例10中给出了可以测试交叉竞争的测定。

如本文所述，本发明包括当与PSMA结合时与J591相比具有降低的抗原转移的抗体。此类降低的抗原转移可以例如使用实施例10中大体描述的方法进行评估。在一个优选的实施方案中，在PMSA转染的Sp2/0细胞中检测到此类降低的抗原转移。

根据本发明的抗体分子可以具有两条链，一条较短的链，其可以在一些实施方案中是轻链，以及一条主链，其可以在一些实施方案中也可被称为重链。抗体分子通常是这两条链的二聚体。

本发明的抗体分子可优选为双特异性抗体分子。双特异性抗体分子可以包含(i)可变区，所述可变区包含如前述权利要求中任一项所定义的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述可变区包含能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的第一结合位点，以及(ii)包含第二结合位点的抗体分子的重链可变区和轻链可变区。应理解，PSMA的结合位点优选是本文所述的本发明的PSMA结合抗体的结合位点。

“双特异性”或“双功能性”抗体分子是具有两个不同表位/抗原结合位点并因此对两个不同的靶标表位具有结合特异性的抗体分子。这两个表位可以是相同抗原或不同抗原的表位。与此相反，“二价抗体”可以具有有相同抗原特异性的结合位点。

“双特异性抗体”可以是抗体分子，其以两个或更多个结合臂中的一个结合一个抗原或表位，所述结合臂由第一对重链和轻链或者主链和较短链/较小链所限定，并且在第二臂上结合不同的抗原或表位，所述第二臂由第二对重链和轻链或者主链和较小链所限定。此类双特异性抗体的实施方案具有两个在特异性和CDR序列两方面都不同的抗原结合臂。通常，双特异性抗体对于其结合的每个抗原是单价的，即它仅以一个臂结合至相应的抗原或表位。然而，双特异性抗体也可以是二聚化的或多聚化的。例如，在如本文所述的二聚体IgGsc形式中，抗体可以对于每个抗原具有两个结合位点。双特异性抗体可以是杂合抗体分子，其可以具有由第一轻链可变区和第一重链可变区限定的第一结合区，以及由第二轻链可变区和第二重链可变区限定的第二结合区。本发明设想这些结合区中的一个可以由重链/轻链对限定。在本发明的上下文中，双特异性抗体分子可具有由主链和较小链的可变区限定的第一结合位点，以及由包含在抗体分子主链中的scFv片段的可变区限定的不同的第二结合位点。

制备双特异性抗体分子的方法是本领域已知的，如两种不同的单克隆抗体的化学缀合，或例如两个抗体片段(例如两个Fab片段)的化学缀合。可替代地，双特异性抗体分子由四价体瘤技术制成，即通过产生亲本抗体的杂交瘤的融合。由于H链和L链的随机分类，产生了十种不同抗体结构的潜在混合物，其中只有一种具有所需的结合特异性。

本发明的双特异性抗体分子可以作为就每个靶标而言的单克隆抗体(MAb)。在一些实施方案中，抗体是嵌合性、人源化或完全人类的。双特异性抗体分子可以例如是双特异性串联单链Fv、双特异性Fab₂或双特异性双抗体。

在本发明抗体分子中包含的结构域的基础上，本发明的双特异性抗体分子可包含Fab片段，其通常可包含铰链区、CH2结构域和单链Fv片段。此类双特异性抗体分子被称为“Fabsc”抗体分子，并且已在国际专利申请WO 2013/092001中首度描述。更具体地，如这里使用的“Fabsc”形式抗体分子通常是指具有Fab片段的本发明的双特异性抗体分子，所述Fab片段通常包含铰链区，所述铰链区在连接至CH2结构域的N末端的Fab片段的C末端，其中C末端继而连接至scFv片段的N末端。此类“Fabsc”不包含或基本上不包含CH3结构域。在本文中，“不包含”或“基本上不包含”意指抗体分子不包含全长CH3结构域。其优选地意指抗体分子包含CH3结构域的10个或更少、优选5个或更少、优选3个或甚至更少的氨基酸。图1A中显示了Fabsc形式抗体分子的说明性实例，图12中显示了Fabsc形式抗体分子的另一个说明性实例。在说明性实施方案中(在这方面还参阅图1A)，本发明的Fabsc抗体分子可以包含CH2结构域，其缺乏由通过根据Kabat编号[EU-索引]由铰链区的序列位置226处的半胱氨酸残基和/或铰链结构域之一的序列位置229处的半胱氨酸残基形成的二硫键进行二聚化的能力。因此，在这些实施方案中，在序列位置226和/或序列位置229处的半胱氨酸残基可以例如通过丝氨酸残基去除或替代。此外，或可替代地，本发明的“Fabsc”抗体分子也可以具有“Fc减弱的”CH2结构域(其包含铰链区)。这种“Fc减弱”是通过在能够介导与Fc受体的结合的CH2结构域中缺失和/或取代(突变)选定氨基酸残基中的至少一种来实现的。在说明性实施方案中，铰链区或能够介导与Fc受体结合的CH2结构域的以及缺失或被突变的至少一种氨基酸残基选自：序列位置228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据EU-索引的序列位置编号)。在说明性实例中，此类Fc减弱的抗体分子可以含有选自以下的至少一种突变：氨基酸228的缺失、氨基酸229的缺失、氨基酸230的缺失、氨基酸231的缺失、氨基酸232的缺失、氨基酸233的缺失、取代Glu233→Pro、取代Leu234→Val、氨基酸234的缺失、取代Leu235→Ala、氨基酸235的缺失、氨基酸236的缺失、氨基酸237的缺失、氨基酸238的缺失，取代Asp265→Gly、取代Asn297→Gln，取代Ala327→Gln和取代Ala330→Ser(根据EU索引的序列位置编号，还参见例如国际专利申请WO 2013/092001的图1O和图1P)。在活化T细胞的双特异性抗体的情况下，例如针对肿瘤细胞，可能需要Fc-减弱以防止抗体与携带Fc受体的细胞结合，这可能导致T细胞的不希望的脱靶活化。

根据Coloma和Morrison的出版物(Nat Biotechnol 15:159-63,1997)，本发明的双特异性抗体分子也可具有通常排列在CH2结构域的C末端的CH3结构域。此类分子在本文中还被称为“IgGsc”形式抗体分子，并且意指具有Fab片段的本发明的双特异性抗体分子，所述Fab片段通常包含铰链区，所述铰链区在连接至CH2结构域的N末端的Fab片段的C末端，其中C末端继而连接至scFv片段的N末端。图1B中显示了IgGsc形式抗体分子的说明性实例，此类分子的重链和轻链序列分别是图11和13中所示的分子。

抗体形式Fabsc和IgGsc的共同之处在于，N末端靶向部分分别由“生理学”Fab区或Fab₂区组成，从而避免在该分子部分中使用单链部分。如果这些形式用于靶细胞限制的T细胞活化，则可以采用Fc受体(FcR)结合的减弱(如果想要或需要的话)以防止FcR介导的活化。这可以如通过引入分子的CH2结构域中的限定且公知的突变来实现，如上文和国际专利申请WO 2013/092001以及Armor等人Eur J Immunol 1999；29:2613中所述。因此，本发明的IgGsc抗体分子也可以具有CH2结构域(包括铰链区)，其中铰链区或能够介导与Fc受体的结合的CH2结构域的至少一个氨基酸残基缺失或被突变。如上所解释，在CH2和铰链区中的这一残基分别可选自：序列位置228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据EU-索引的序列位置编码)。然而，由于IgGsc分子中存在CH3结构域，两个单独的分子将经由CH3结构域(自发地)同二聚化以形成四价分子(在这方面再次参见图1B)。因此，没有必要删除或突变铰链区的序列位置226和/或序列位置229处的半胱氨酸残基。因此，本发明的此类四聚体IgGsc抗体分子可以根据Kabat编号[EU-索引]在相应的铰链结构域之一的序列位置226和/或序列位置229处具有半胱氨酸残基。

根据包含介导PMSA结合和/或结合至鳞状癌细胞的一组CDR区(例如，SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:8的CDR序列或具有80％序列同一性的序列)的双特异性抗体分子的上述公开内容，本发明的抗体分子可以包含特异性结合至免疫细胞(诸如T细胞或NK细胞)上的受体的第二结合位点。存在于免疫细胞上的该受体可以是能够活化免疫细胞或刺激免疫细胞的免疫响应的受体。引起的免疫响应可以优选是细胞毒性免疫响应。此类适合的受体可以例如是CD3、抗原特异性T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)和CD95。特别优选的是抗体分子，其中第二结合位点结合至CD3、TCR或CD16。最优选的是抗体分子，其中第二结合位点特异性结合至CD3。优选的抗体分子包含对应于抗CD3抗体OKT3的抗原结合位点的第二结合位点。图12中描绘了OKT3抗体的VH和VL序列。抗体OKT3的重链的可变结构域和轻链的可变结构域的氨基酸序列也描述于例如Arakawa等人J.Biochem.120,657-662(1996)和国际专利申请WO 2015/158868(参见WO2015/158868的序列表中的SEQ ID NOS:17和18)中。另一种优选的抗体分子包含对应于抗CD3抗体UCHT1的抗原结合位点的第二结合位点。人源化UCHT1抗体的VH和VL序列描绘于图11中，并且也描述于例如国际专利申请WO 2013/092001中。可用于本发明中的CD3结合抗体分子的其它实例包括欧洲专利2 155 783B1或欧洲专利EP 2 155 788B1中描述的抗体分子，其能够结合至人和普通狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε链的表位。

因此，本发明的双特异性抗体分子可以是包含如本文所述的Fab片段和scFv片段的双特异性抗体分子，诸如Fabsc分子和IgGsc分子。在该分子中，第一结合位点可以结合至PSMA并且可以包含在如本文所述的Fab片段中，并且第二结合位点(其可以结合至免疫受体)可以包含在scFv片段中。可替代地，结合至PMSA的第一结合位点包含在单链Fv片段中，并且第二结合位点(其可结合至免疫受体)包含在Fab片段中。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体分子本身在结合(诸如结合至CD3)后不会活化免疫细胞，如T细胞。相反，只有当两个结合位点，如PMSA特异性结合位点和CD3特异性结合位点都与T细胞上的受体和靶细胞上的PMSA结合时，前者可以交联活化受体，从而触发效应子细胞杀伤特定的靶细胞。评价淋巴细胞在存在和不存在本发明的双特异性抗体分子时的靶细胞杀伤能力的标准功能性测定，可经设置以评估和/或筛选抗体分子活化其所结合的受体的能力。

不希望受理论束缚，通常认为本发明的双特异性CD3结合抗体在不存在靶细胞时不活化T细胞，因为单价CD3刺激不足以引发有效的T细胞活化。然而，在一些情况下，可能存在这种假设行为的一些偏差。当UCHT1在此用作双特异性Fabsc构建体内的CD3抗体时，在不存在表达PSMA的靶细胞的情况下注意到一些T细胞活化。当在刺激旁观者细胞(诸如SKW6.4淋巴瘤细胞)存在下进行实验时，这些发现显著更明显。相比之下，发明人还令人惊讶地发现，含有OKT3的抗体以及(令人惊讶的是)还有包含UCHT1的IgGsc抗体诱导显著减弱的脱靶T细胞活化。通过使用表达CD3的Jurkat细胞的亲合力测量至少部分地解释了包含UCHT1的IgGsc抗体的出乎意料的低脱靶活性。这些实验证明，如果以IgGsc(而不是Fabsc)形式表达，UCHT1丢失并且OKT3获得亲合力(参阅图8)。当针对表达PSMA的22RV1细胞在长期细胞毒性测定(Xelligence)中测试时，本发明的发明人令人惊讶地发现以下细胞裂解活性排序：IgGsc(UCHT1)～Fabsc(UCHT1)>Fabsc(OKT3)>IgGsc(OKT3)。因此，在IgGsc形式内，UCHT1可能是优选的CD3抗体(有利的脱靶活化和细胞裂解活性)，而在Fabsc形式内，OKT3可能是优选的，因为含有UCHT1的Fabsc有不希望的高脱靶活性(参阅图9)。

无论使用何种具体的CD3抗体，由靶向单链片段之间的相互作用诱导的T细胞表面上双特异性抗体的群集也可导致在靶细胞不存在时脱靶T细胞活化。为了防止这种现象，可能需要使用Fab部分或Fab₂部分，诸如分别包含在Fabsc形式或IgGsc形式中的Fab部分或Fab₂部分，而不是作为双特异性构建体内的靶向部分的单链抗体。与用双特异性单链抗体观察到的相比，以此类形式表达的双特异性抗体的多聚化和聚集显著减少。图4A和4B显示具有FLT3xCD3特异性的双特异性单链形式的聚集不如呈双特异性单链(bssc)或BiTE形式的另外的相同抗体的聚集显著，如通过尺寸排阻色谱所确定。图4C-F显示，同样地，呈Fabsc以及IgGsc形式的四种PSMAxCD3抗体形成多聚体或聚集体的趋势大大降低。值得注意的是，本发明的发明人令人惊讶地发现，与包含OKT3抗体的构建体相比，在含有UCHT1抗体的两种构建体中，多聚体的形成甚至相当不太明显。在任何情况下，据信聚集如果发生，是由于表达为单链的CD3效应子部分所致。在此认为并发现N末端靶向部分处的生理Fab部分和Fab₂部分不聚集，并因此认为可能导致体内T细胞耗竭的N末端靶向部分的单链群集不能发生在本发明的相应抗体分子中。

此外，本发明人在此预见抗体分子的血清半衰期主要由CH3结构域与FcRn受体的相互作用决定。由于大多数双特异性抗体缺乏这种结构域，它们的血清半衰期可能相当短(最多几个小时)。相比之下，整个IgG分子通常具有数天的血清半衰期。尽管基于IgG的双特异性形式已经在数年间是可用的，但它们很少用于构建CD3刺激抗体，因为认为二价CD3刺激可导致脱靶T细胞活化。然而，本发明的发明人令人惊讶地发现对于含有UCHT1抗体的两种不同的形式，情况恰恰相反：Fabsc形式导致的脱靶T细胞活化明显高于呈IgGsc形式的抗体导致的脱靶T细胞活化。不希望受理论束缚，据信这是因为后一种形式中CD3部分的亲合力受损(再次参阅图8)。这意味着，在包含UCHT1的可变区的抗体分子的情况下，IgGsc形式令人惊讶地不仅提供显著提高的血清半衰期，而且还提供降低的脱靶T细胞活化。因此，如果需要延长的血清半衰期如以避免长期连续输注，则呈IgGsc形式的10B3x UCHT1双特异性抗体可能是优选的，其中Fab部分包含来源于10B3的抗体的抗原结合位点并且其中scFv部分包含来源于OKT3的抗体的抗原结合位点。

因此，换言之，在另一个方面，本发明还涉及四价和同型二聚体双特异性抗体分子(呈本文所述的IgGsc形式的双特异性抗体)，其在每个单体中包含：(i)包含可变区的N末端Fab片段，所述可变区包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述可变区包含能够结合至抗原的第一结合位点；(ii)C末端scFv片段，其包含人源化UCHT1的重链可变区和轻链可变区，并且其中(i)和(ii)通过CH2和CH3结构域连接。

在一些实施方案中，优选本发明的四价双特异性抗体分子，其中能够介导与Fc受体结合的CH2结构域的至少一个氨基酸残基缺失或被突变(还参见本文的其它地方)。

在一些实施方案中，本发明的四价双特异性抗体分子是优选的，其中Fab片段不是非人源化、嵌合或人源化10B3或J591抗体的Fab片段，优选其中第一结合位点不能与PSMA结合。因此，在一些优选的实施方案中，由N末端Fab片段提供的第一结合位点对PSMA没有特异性，但对于非PSMA抗原、优选与除PSMA外的肿瘤相关抗原有特异性。术语“肿瘤相关的抗原”涉及在正常条件下即在健康受试者中，在有限数量的器官和/或组织中或特定发育阶段期间特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤相关抗原可以在正常情况下于胃组织中，优选在胃粘膜中、在生殖器官中(如在睾丸中)、在滋养层组织中(如在胎盘中)或在种系细胞中特异性表达，并且在一种或多种肿瘤或癌症组织中表达或异常表达。在本文中，"有限数量"优选意指不超过3，更优选不超过2或1。本发明的上下文中的肿瘤相关抗原包括，例如，分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在某个分化阶段的某种细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸中以及有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原是优选的，不在或者仅在正常组织中表达或在肿瘤细胞中突变。优选地，肿瘤相关抗原或肿瘤相关抗原的异常表达识别癌细胞。在本发明的上下文中，受试者(如患有癌症疾病的患者)中由癌细胞表达的肿瘤相关抗原，优选是在所述受试者中的自体蛋白。在优选的实施方案中，在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原在正常条件下特异性地在非必需的组织或器官(即免疫系统损害时不会导致受试者死亡的组织或器官)中或导致免疫系统无法或几乎无法接近的身体器官或结构中表达。优选地，肿瘤相关抗原在MHC分子的背景下由表达它的癌细胞呈递。

根据本方面的优选实施方案，可用于本发明并且不是PSMA的TAA的实例是p53、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、CLAUDlN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap 100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A 10、MAGE-A11或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUCl"、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NFl、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90小BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPl/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT。

根据本发明的本方面，人源化UCHT1优选为包含轻链可变区序列和重链可变区序列的scFv片段，如SEQ ID NO:11所示，以氨基酸序列DIQMT...开始并且以…VTVSS结尾(如图11所示)。优选地，scFv片段中的轻链可变区序列和重链可变区序列经由如图11所示(“接头区”)的接头连接。

在上下文中应注意，在本发明的范围内，抗体分子可包含一个或多个突变的氨基酸残基。“突变的”、“突变体”和“突变”就核酸或多肽而言分别指核酸或多肽是指与“天然”存在的核酸(即可用于定义野生型的参考序列)相比一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。例如，如通过免疫获得并如本文所述的抗体分子10B3的可变结构域可以视作野生型序列。

在这方面应理解，术语“位置”，当根据本发明使用时，意指在本文所述的氨基酸序列内的氨基酸的位置。该位置可以相对于类似的天然序列(如天然存在的IgG结构域或链的序列)表示。如本文所用的术语“相应的”还包括位置不一定或不仅仅由前述核苷酸/氨基酸的数量决定。因此，可被取代的根据本发明的给定氨基酸的位置可以由于抗体链中其它位置的氨基酸的缺失或添加而变化。

因此，在根据本发明的“相应的位置”中，应理解氨基酸可以在指定的数量方面不同，但仍可具有相似的相邻氨基酸。所述可以交换、缺失或添加的氨基酸也涵盖在术语“相应的位置”中。为了确定给定的氨基酸序列中的氨基酸残基是否对应于天然存在的免疫球蛋白结构域或链的氨基酸序列中的某个位置，技术人员可以使用本领域熟知的手段和方法，如，手动或使用计算机程序诸如BLAST2.0(代表基础本地比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool))或ClustalW或任何其它适合的程序(适于生成序列比对)进行比对。

在一些实施方案中，取代(或替代)是保守性取代。保守性取代一般是以下取代，根据待变异的氨基酸列出，每个之后跟着一个或多个可以视作是保守性的替代物：Ala→Gly,Ser,Val；Arg→Lys；Asn→Gln,His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg,Asn,Gln；Ile→Leu,Val；Leu→Ile,Val；Lys→Arg,Gln,Glu；Met→Leu,Tyr,Ile；Phe→Met,Leu,Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp,Phe；Val→Ile,Leu。其它取代也是允许的，并且可以凭经验确定或者根据其它已知的保守性或非保守性取代来确定。作为进一步的定向，以下八组各自含有通常可以用来定义彼此的保守性取代的氨基酸：

丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)；

天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)；

天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(Gln)；

精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)；

异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，甲硫氨酸(Met)，缬氨酸(Val)；

苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)；

丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)；和

半胱氨酸(Cys)，甲硫氨酸(Met)

如果此类取代导致生物活性变化，那么可以引入更实质性的变化，诸如以下或如下参考氨基酸类别而进一步描述的，并筛选产物的所需特征。此类更实质性的变化的实例是：Ala→Leu,Ile；Arg→Gln；Asn→Asp,Lys,Arg,His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met,Ala,Phe；Leu→Ala,Met,正亮氨酸(norleucine)；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val,Ile,Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr,Ser；Val→Met,Phe,Ala。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子包含一个或多个氨基酸残基，包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个或十八个氨基酸残基，其被突变以防止经由半胱氨酸残基进行二聚化或调控Fc功能(参见上文)。在这些实施方案的一些中，能够介导与Fc受体的结合的CH2结构域和/或铰链区的一个或多个氨基酸残基被突变。如果存在，能够介导与Fc受体结合的一个或多个氨基酸残基可以是能够活化抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性(CDC)的氨基酸残基。在一些实施方案中，通常在比较免疫球蛋白(诸如IgG)中的序列与相应的天然存在的结构域的序列时，能够介导与Fc受体结合的相应氨基酸残基被另一种氨基酸取代。在一些实施方案中，此类能够介导与Fc受体结合的氨基酸残基通常相对于免疫球蛋白(诸如IgG)中的相应的天然存在的结构域的序列被缺失。

在一些实施方案中，一个或多个突变的，如取代的或缺失的，氨基酸残基是位于位置226、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330之一处的氨基酸。再次，所使用的氨基酸的编号对应于根据Kabat编号[EU-索引]的序列位置。氨基酸的相应的缺失可以例如是氨基酸228的缺失、通常是IgG中的脯氨酸，氨基酸229的缺失、通常是IgG中的半胱氨酸，氨基酸230的缺失、通常是IgG中的脯氨酸，氨基酸231的缺失、通常是IgG中的丙氨酸，氨基酸232的缺失、通常是IgG中的脯氨酸，氨基酸233缺失、通常是IgG中的谷氨酸，氨基酸234的缺失、通常是IgG中的亮氨酸，氨基酸235的缺失、通常是IgG中的亮氨酸，氨基酸236的缺失、通常是IgG中的甘氨酸，氨基酸237的缺失、通常是IgG中的甘氨酸，氨基酸238的缺失、通常是IgG中的脯氨酸和氨基酸265的缺失、通常是IgG中的天冬氨酸。氨基酸的相应的取代可以例如是氨基酸226的取代、通常是IgG中的半胱氨酸，氨基酸228的取代、通常是IgG中的脯氨酸，氨基酸229的取代、通常是IgG中的半胱氨酸，氨基酸230的取代、通常是IgG中的脯氨酸，氨基酸231的取代、通常是IgG中的丙氨酸，氨基酸232的取代、通常是IgG中的脯氨酸，氨基酸233的取代、通常是IgG中的谷氨酸，氨基酸234的取代、通常是IgG中的亮氨酸，氨基酸235的取代、通常是IgG中的亮氨酸，氨基酸265的取代、通常是IgG中的天冬氨酸，氨基酸297的取代、通常是IgG中的天冬酰胺，氨基酸327的取代、通常是IgG中的丙氨酸，和氨基酸330的取代、通常是IgG中的丙氨酸。相应的取代可以是以下中的一个：取代Cys226→Ser，取代Cys229→Ser，取代Glu233→Pro，取代Leu234→Val，取代Leu235→Ala，取代Asp265→Gly，取代Asn297→Gln，取代Ala327→Gln，取代Ala327→Gly和取代Ala330→Ser。从以上可以看出，在一些实施方案中，在铰链区的位置226和229处的一个或两个半胱氨酸残基被取代为另一种氨基酸，例如被取代为丝氨酸残基。由此可以防止与另一条主链形成二硫键。此外，如下所解释，缺失和/或取代(突变)能够介导与Fc-受体结合的CH2结构域中所选氨基酸残基可导致本发明的抗体分子就抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体结合(fixation of complement)而言具有较少的活性或没有活性。

抗体的另一种类型的氨基酸变体改变了抗体分子的原始糖基化模式(如果有的话)。改变意指缺失抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列中的任何一个都会产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可使用。通过改变氨基酸序列使其含有一条或多条上述三肽序列，可方便地实现将糖基化位点添加至抗体(对于N-连接的糖基化位点)。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至或取代原始抗体的序列来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。

在本发明的上下文中，在一些实施方案中，本发明的抗体分子的主链的代表免疫球蛋白Fc区的部分，对于与Fc受体的结合通常是惰性的，或者至少基本上具有低影响。如所述，这通过缺失和/或取代(突变)能够介导与Fc受体的结合的CH2结构域中至少一个选定的氨基酸残基来实现。此类分子在本文中称为“Fc减弱的”抗体分子或“Fc^ko”抗体分子。例如，根据本发明的抗体链的可用于表示Fc片段的一部分的部分，即CH2结构域，以及(如果存在的话)CH3结构域，因此可以定义“支架”而不提供特定的生物功能诸如效应子功能。然而，在本发明中已发现，与已知的抗体分子相比，该支架在本发明的抗体分子的纯化、生产效率和/或稳定性方面可以提供显著的优点。

在一些实施方案中，该Fc相应的部分对给定Fc受体的识别和相应的结合低于天然存在的免疫球蛋的Fc区约2倍、约5倍、约8倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍或更低。在一些实施方案中，该Fc相应的部分完全没有结合至Fc受体的能力。本领域技术人员使用标准技术诸如表面等离子体共振，如使用Biacore^TM测量，可以容易地确定抗体与Fc受体的结合，包括确定解离常数。同样可以使用任何其它测量生物分子结合的方法，其可以例如依赖于光谱学、光化学、光度学或放射学手段。相应的检测方法的实例分别是荧光相关光谱法、光化学交联和使用光活性或放射性标签。这些方法中的一些可包括另外的分离技术诸如电泳或HPLC。

如果需要，可以实施如上所解释的氨基酸残基的取代或缺失以达到这种效果。适合的突变可以例如取自Armour等人(Eur.J.Immunol.[1999]29,2613-2624)。用于抗体链序列突变的另外适合的位置可以取自FcγRIII和人IgG1Fc片段之间的复合物所公布的晶体结构数据(Sondermann等人,Nature[2000]406,267-273)。除了测量如上所述的结合亲和力以评估“Fc减弱”或结合亲和力丧失的水平，还可功能性地评估介导结合至Fc受体的能力(的缺失)。在将CD3作为一个靶标结合的抗体分子的情况下，例如可通过细胞上的此类CD3结合抗体分子的有丝分裂(mitogenity)来评估结合。有丝分裂是通过CD3抗体与辅助细胞(诸如单核细胞)上的Fc受体结合而介导的。如果具有一个CD3结合位点的本发明的抗体分子不显示任何促有丝分裂作用，而具有功能性Fc部分的亲本单克隆抗CD3抗体在T细胞中诱导强烈的有丝分裂，则很明显由于缺乏有丝分裂，本发明的抗体分子缺乏Fc结合的能力并因此可以被认为是“Fc敲除”分子。评估抗CD3介导的有丝分裂的方法的说明性实例由Davis,Vida&Lipsky(J.Immunol(1986)137,3758)和Ceuppens,JL,&van Vaeck,F,(参见J.Immunol.(1987)139,4067，或Cell.Immunol.(1989)118,136)描述。用于评估抗体有丝分裂的测定的进一步说明性适合的实例由Rosenthal-Allieri等人(Rosenthal-Allieri MA,Ticcioni M,Deckert M,Breittmeyer JP,Rochet N,Rouleaux M和Senik A,Bernerd A,Cell Immunol.1995 163(1):88-95)和Grosse-Hovest等人(Grosse-Hovest L,HartlappI,Marwan W,Brem G,Rammensee H-G和Jung G,Eur J Immunol.[2003]5月；33(5):1334-1340)描述。此外，可以通过本发明的抗体分子介导Fc部分的一种或多种公知的效应子功能的能力来评估Fc结合的缺失。

如上所述，可以进行半胱氨酸残基的取代或缺失，以引入或去除一个或多个二硫键，这包括引入或除去潜在或先前存在的二硫键。由此可以控制(包括建立、加强或消除)根据本发明的抗体分子的主链和较低重量/较短长度链之间的键联。通过引入或去除一个或多个半胱氨酸残基，可以引入或去除二硫桥。作为说明性实例，根据本发明的四聚体抗体分子通常具有一个或多个连接两个二聚体抗体分子的二硫键。一个此类二硫键通常由第一二聚体抗体分子的主链中的半胱氨酸和第二二聚体抗体分子的铰链区中的半胱氨酸限定。在这方面，在一个实施方案中，根据本发明的抗体可以包括相对于根据Kabat编号[EU-索引]的人IgG免疫球蛋白的序列，在位置226和/或229处的天然半胱氨酸残基由另一种氨基酸残基进行氨基酸取代。

也可以进行氨基酸残基诸如精氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的取代或缺失以修饰抗体的糖基化模式。作为说明性实例，IgG分子在CH2结构域的Asn297处具有单个N-连接的双触角碳水化合物。对于来自血清的IgG或在杂交瘤或经工程化的细胞中离体产生的IgG，IgG相对于Asn297连接的碳水化合物是异质的。对于人IgG，核寡糖通常由GlcNAc₂Man₃GlcNAc组成，具有不同数量的外部残基。

如所指出的，除了抗原/表位的结合之外，已知免疫球蛋白具有另外的“效应子功能”，即可归因于免疫球蛋白的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性，并且随免疫球蛋白同种型而改变。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(如B细胞受体)；和B细胞活化。发挥抗体的效应子功能通常涉及募集效应子细胞。数种免疫球蛋白效应子功能由结合抗体的Fc区的Fc受体(FcR)介导。FcR由其免疫球蛋白同种型的特异性限定；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的Fc受体被称为FcεR，IgA的Fc受体被称为FcαR等。可以使用任何这些效应子功能(或此类效应子功能的丧失)，例如CDC或ADCC，以评价本发明的抗体分子是否缺乏Fc结合的能力。

在上下文中，应注意术语“Fc受体”或“FcR”定义受体，通常是能够与抗体的Fc区结合的蛋白。Fc受体存在于生物体免疫系统的某些细胞的表面上，例如天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。体内Fc受体结合至固定在受感染细胞上或存在于入侵病原体上的免疫球蛋白。它们的活性刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞以通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性来破坏微生物或受感染细胞。一些病毒诸如黄病毒使用Fc受体以通过称为抗体依赖性感染增强的机制帮助它们感染细胞。FcR已经在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中进行了综述。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化由补体系统(Clq)的第一组分与抗体(适当的亚类)的结合引发，所述抗体结合至其同源抗原。为了评估补体活化，可以进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1997)中所述。

术语“补体系统”在本领域中用于指在血液中发现的许多小蛋白(被称为补体因子)通常作为无活性前体(前蛋白)循环。术语是指这种不可改变和不适应的系统能够“补充”抗体和吞噬细胞从生物体清除病原体诸如细菌以及抗原-抗体复合物的性能的能力。补体因子的实例是复合物C1，其包括C1q和两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s。复合物C1是CDC途径的组分。C1q是六价分子，分子量约为460,000，并且结构类似于一束郁金香，其中六个胶原“茎”连接到六个球状头部区。为了激活补体级联，C1q必须结合至IgG1、IgG2或IgG3的至少两个分子。

“抗体依赖性细胞的细胞毒性”或ADCC是指一种形式的细胞毒性，其中结合在Fc受体(FcR)上的存在于某些细胞毒性细胞(诸如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的免疫球蛋白分子使这些细胞毒性效应子细胞能够特异性结合至携带抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且这是通过这种机制杀伤靶细胞所必需的。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRlI和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目标分子的ADCC活性，可以进行诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC测定。用于此类测定的有用的效应子细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，可以如在诸如Clynes等人,PNAS USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中在体内评估目标分子的ADCC活性。

本发明的抗体分子可以使用任何已知和公知的表达系统和重组细胞培养技术产生，例如，通过在细菌宿主(原核系统)或真核系统(诸如酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达。例如，本发明的抗体分子，当以“IgGsc”形式使用时，抗体分子可以(当然)如Coloma和Morrison(Nat Biotechnol 15:159-63,1997)所述或如本申请的实施例章节所述产生。同样地，以“Fabsc”形式使用的本发明的抗体分子可以如国际专利申请WO2013/092001中所述或如本文实施例章节中所述进行制备。本发明的抗体分子也可以在转基因生物体中产生，诸如山羊、植物或XENOMOUSE转基因小鼠，即一种经工程化的小鼠，其具有人免疫球蛋白基因座的大片段并且有小鼠抗体生产缺陷。抗体也可以通过化学合成产生。

为了产生本发明的重组抗体分子，通常分离编码抗体的多核苷酸并将其插入可复制的载体诸如质粒中，以进一步克隆(扩增)或表达。适合的表达系统的说明性实例是谷氨酸合成酶系统(诸如由Lonza Biologics出售)，其中宿主细胞是例如CHO或NS0。编码抗体的多核苷酸易于使用常规程序分离和测序。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是典型的实施方案。通常，此类载体还包括与轻链和/或重链多核苷酸可操作地连接的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，以促进表达。可以将编码轻链和重链的多核苷酸插入到单独的载体中并且转染至相同的宿主细胞中，或者如果需要，可将重链和轻链都插入到相同的载体中以转染至宿主细胞中。例如，两条链可以在双顺反子操纵子的控制下排列，并且表达以产生功能性和正确折叠的抗体分子，如Skerra,A.(1994)Use of the tetracycline promoter for thetightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichiacoli,Gene 151,131-135或Skerra,A.(1994)A general vector,pASK84,for cloning,bacterial production,and single-step purification of antibody Fab fragments,Gene 141,79-8中所述。因此，根据本发明的一个方面，提供了构建编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的载体的方法，所述方法包括将编码本发明的抗体分子的轻链和/或重链的多核苷酸插入载体中。

当使用重组技术时，抗体分子可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中(还参阅Skerra 1994，同上)。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去颗粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。抗体也可以在任何氧化环境中产生。此类氧化环境可以由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质在革兰氏阳性细菌的胞外环境中或在真核细胞(包括动物细胞诸如昆虫或哺乳动物细胞)的内质网内腔中提供，并且通常有利于结构二硫键的形成。然而，也可能的是在宿主细胞诸如大肠杆菌的胞液中产生本发明的抗体分子。在这种情况下，多肽可以直接以可溶和折叠状态获得或以包涵体的形式回收，然后在体外复性。另一种选择是使用具有氧化细胞内环境的特定宿主菌株，因此可以允许胞液中二硫键的形成(Venturi M,Seifert C,Hunte C.(2002)“High levelproduction of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterialcytoplasm.”J.Mol.Biol.315,1-8)。

由细胞产生的抗体分子可以使用任何常规的纯化技术纯化，例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱，其中亲和色谱是一种优选的纯化技术。抗体分子可以经由亲和力纯化用特异性地和可逆地结合恒定结构域(诸如CH1或CL结构域)的蛋白质/配体进行纯化。此类蛋白质的实例是结合免疫球蛋白的细菌蛋白诸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L，其中蛋白L结合仅限于含有κ轻链的抗体分子。纯化含κ-轻链的抗体的另一种方法是使用珠子偶联的抗κ抗体(KappaSelect)。蛋白A作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。用于本发明的特定抗体分子的纯化方法的选择在本领域普通技术人员的知识范围内。

也可能的是将本发明的抗体分子的一条链配备一个或多个亲和力标签。亲和力标签诸如或II(Schmidt,T.G.M.等人(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-标签、FLAG^TM-标签、His6-标签或HA-标签以允许轻松检测并允许简单纯化重组抗体分子。

对于本发明的核酸，编码根本发明的抗体的一条或多条链的核酸分子可以是呈任何可能构型的任何核酸，诸如单链、双链或其组合。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA的类似物、锁核酸分子(LNA)和蛋白核酸分子(PNA)。DNA或RNA可以是基因组来源或合成来源的，并且可以是单链或双链的。此类核酸可以是如mRNA、cRNA、合成的RNA、基因组DNA、cDNA合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。相应的核酸可以进一步含有非天然核苷酸类似物和/或连接到亲和力标签或标记。

在一些实施方案中，在载体如质粒中包含编码诸如根据本发明的抗体的主链和/或较小链的链的核酸序列。当抗体链中包含取代或缺失时，与抗体的天然存在的结构域或区相比，如包括在免疫球蛋白序列中的相应天然结构域/区的编码序列可以用作诱变的起点。对于选定的氨基酸位置的诱变，本领域技术人员可以使用各种已建立的用于定点诱变的标准方法。常用的技术是使用合成的寡核苷酸的混合物通过PCR(聚合酶链式反应)引入突变，所述寡核苷酸在所需的序列位置处具有简并碱基组成。例如，使用密码子NNK或NNS(其中N＝腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶；S＝腺嘌呤或胞嘧啶)允许在诱变期间掺入所有20种氨基酸加琥珀终止密码子，而密码子VVS将可能掺入的氨基酸的数量限制为12，因为它排除了氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val被掺入多肽序列的选定位置；使用密码子NMS(其中M＝腺嘌呤或胞嘧啶)，例如将选定的序列位置处的可能的氨基酸的数目限制为11，因为它排除了氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val被掺入选定的序列位置处。在这方面，应注意的是，对于其它氨基酸(除了常规的20种天然存在的氨基酸之外)，诸如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸的密码子也可以掺入抗体分子的核酸中。如Wang,L.,等人(2001)Science 292,498-500或Wang,L.和Schultz,P.G.(2002)Chem.Comm.1,1-11所述，也可能使用“人工”密码子诸如通常被识别为终止密码子的UAG，以插入其它不寻常的氨基酸，例如o-甲基-L-酪氨酸或p-氨基苯丙氨酸。

使用具有减少的碱基对的特异性的核苷酸结构单元，如例如肌苷，8-氧代-2’脱氧鸟苷或6-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3,4-二氢-8H-嘧啶-do-1,2-噁嗪-7-酮(Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255,589-603)是将突变引入选择的序列区段的另一种选择。另一种可能性是所谓的三联体诱变。该方法使用不同核苷酸三联体的混合物，每个三联体编码一种氨基酸，用于掺入编码序列中(B,等人,1994 Nucleic Acids Res 22,5600-5607)。

编码根据本发明的抗体的诸如主链和/或较小链的链的核酸分子可以使用任何适合的表达系统、例如在适合的宿主细胞中或在无细胞系统中表达。可以通过选择和/或分离的方式来富集获得的抗体分子。

本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体分子和任选的药学上可接受的赋形剂。

根据本发明的抗体分子可经由对蛋白质性药物治疗有效的任何肠胃外或非肠胃外(肠内)途径施用。肠胃外施加方法包括，例如皮内、皮下、肌内、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内注射和输注技术，如以注射溶液、输注溶液或酊剂以及气雾剂装置和吸入剂的形式，如以气雾剂混合物、喷雾剂或粉剂的形式。关于肺部药物递送，即经由吸入气雾剂(其也可用于鼻内施用)或气管内滴注的概述例如由J.S.Patton等人The lungs as a portal ofentry for systemic drug delivery.Proc.Amer.Thoracic Soc.2004第1卷第338-344页给出。非肠胃外递递模式，例如口服如以丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂的形式，或经直肠施用如栓剂形式。本发明的抗体分子可以按照需要以制剂形式全身或局部施用，所述制剂含有常规无毒的药物上可接受的赋形剂或载体、添加剂和媒介物。

在本发明的一个实施方案中，将药物肠胃外施用给哺乳动物，特别是人类。相应的施用方法包括但不限于，例如皮内、皮下、肌内、气管内或静脉内注射和输注技术，如以注射溶液、输注溶液或酊剂以及气雾剂装置和吸入剂的形式，如以气雾剂混合物、喷雾剂或粉剂的形式。在具有相对短的血清半衰期的化合物的情况下，静脉内和皮下输注和/或注射的组合可能是最方便的。药物组合物可以是水溶液、水包油乳液或油包水乳液。

在这方面，应注意透皮递送技术，如离子电渗疗法、超声电渗疗法或微针增强的递送，如Meidan VM和Michniak BB 2004Am.J.Ther.11(4):312-316中所述，也可用于本文所述的抗体分子的透皮递送。非肠胃外递递模式是例如口服施用，如以丸剂、片剂、胶囊剂、溶液剂或混悬剂的形式，或经直肠施用如栓剂形式。本发明的抗体分子可以在含有各种常规无毒药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和媒介物的制剂中全身性或局部施用。

所施加的抗体分子的剂量可在宽范围内变化，以达到所需的预防效果或治疗性响应。例如，它将取决于抗体分子对选定靶标的亲和力以及抗体分子和配体的复合物的体内半衰期。进一步地，优化剂量将取决于抗体分子或其缀合物的生物分布、施用模式、所治疗的疾病/病症的严重程度以及患者的医疗状况。例如，当局部施用软膏时，可以使用高浓度的抗体分子。然而，如果需要，抗体分子也可以以持续释放制剂给予，所述制剂例如脂质体分散体或水凝胶基聚合物微球，如PolyActiveTM或OctoDEXTM(参阅Bos等人,BusinessBriefing:Pharmatech 2003:1-6)。可用的其它持续释放制剂是例如基于PLGA的聚合物(PRpharmaceuticals)、基于PLA-PEG的水凝胶(Medincell)和基于PEA的聚合物(Medivas)。

因此，本发明的抗体分子可以使用药学上可接受的成分以及确定的制备方法被配制成组合物(Gennaro,A.L.和Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。为了制备药物组合物，可以使用药学上惰性的无机或有机赋形剂。为了制备如丸剂、粉剂、明胶胶囊剂或栓剂，可以使用例如乳糖、滑石粉、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油和硬化油。用于产生溶液、混悬液、乳液、气雾剂混合物或用于在使用前复溶成溶液或气雾剂混合物的粉末的适合赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其适合的混合物以及植物油。

药物组合物还可含有添加剂，诸如例如填充剂、粘合剂、润湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂以及还有用于实现储存效果的溶剂或增溶剂或试剂。后者是融合蛋白可被掺入缓慢或持续释放或靶向递送系统，诸如脂质体和微胶囊。

制剂可以通过多种方法灭菌，包括通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入可以正好在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌培养基中的呈无菌固体组合物形式的灭菌剂。

抗体分子可以是适合的，并且可以用于治疗或预防疾病。因此，在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子可以用于治疗和/或预防医学疾患如病症或疾病的方法中。类似地，本发明的抗体分子可用于治疗疾病。待治疗或预防的疾病可能是增殖性疾病。此类增殖性疾病可以优选为肿瘤或癌症。由于本发明的抗体分子结合PMSA的能力，该抗体分子可用于治疗由表达PSMA的细胞(诸如原发性和转移性前列腺癌细胞)组成的癌症(参阅，以及广谱恶性肿瘤如常规(透明细胞)肾癌、膀胱移行细胞癌、睾丸胚胎癌、结肠腺癌、神经内分泌癌、多形性胶质母细胞瘤、恶性黑素瘤、胰管癌、非小细胞肺癌、软组织肉瘤和乳腺癌的新血管系统(在此参见，Chang SS等人Five different anti prostate specific membraneantigen(PSMA)antibodies confirm PSMA expression in tumor associatedneovasculature.Cancer Res 1999；59:3192)。因此，本发明的抗体分子在一方面可以用于治疗实体癌，诸如前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌或胶质母细胞瘤。然而，由于令人惊讶地发现本发明的抗体结合至鳞状细胞，本发明的抗体分子在另一方面还可优选地用于治疗不同来源的鳞状细胞癌(包括但不限于)：皮肤癌、头颈癌、食道癌、肺癌和子宫颈癌。

用融合蛋白治疗的受试者可以是人或非人动物。此类动物优选为哺乳动物，例如人类、猪、牛、兔、小鼠、大鼠、灵长类动物、山羊、绵羊、鸡或马，最优选为人类。

本发明的抗体分子也可用于诊断疾病，诸如本文所述的疾病。为此目的，抗体分子可以用适合的可检测信号传导标记物进行标记。此类标记的抗体分子可以允许检测或定量PSMA水平或癌症诸如前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌或胶质母细胞瘤鳞状细胞癌以及不同来源的鳞状细胞癌，如上文在样品或受试者中所列举的。当指定用于体内使用时，所述可检测的信号传导标记在体内优选是可检测的。

标记的抗体分子可用于免疫成像技术。然后例如基于用于诊断的免疫成像技术可以选择可检测的信号传导标记物，分别为例如在γ相机成像技术/SPECT的情况下发射γ的放射性核素(或γ-发射体)，在MRI或PET成像技术的情况下的金属或正电子发射体。在这方面，本公开的一种或多种可检测的信号传导标记物包括γ相机可成像剂、PET可成像剂和MRI可成像剂，例如放射性核素、荧光剂、荧光素、发色团、色原体、磷光剂、化学发光剂和生物发光剂。

适合的可检测信号传导标记物可以是放射性核素。所述放射性核素可选自：³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁹Tc、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、^mIn、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr和²⁰¹TI。

适合的可检测信号传导标记物也可以是荧光团或荧光素。所述荧光团或荧光素可以选自：荧光素、罗丹明、丹磺酰、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、荧光素衍生物、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗多尔绿或德克萨斯红。

经标记的抗体分子可以直接或间接偶联于可检测的信号传导标记物。例如，抗体分子可以直接(如经由抗体分子的酪氨酸残基)或间接(如经由接头，作为金属螯合剂)偶联至可检测的信号传导标记物。在一些其它实施方案中，抗体分子可以偶联至分子，所述分子能够在使用时和使用位置处与可检测的信号传导标记物偶联(在体外或体内)。

可检测的信号传导标记物可以通过与抗体分子偶联的一个或多个二乙烯三胺五乙酸(DTPA)残基与抗体分子结合。

本发明还考虑了一种检测或诊断本文定义的疾病的体外方法。此类方法可包括使得自受试者的样品与本发明的优选标记的抗体分子接触。样品可以是血液、尿液或脑脊液样品，但可以优选为组织样品或活检样品。待检测或诊断的疾病优选是前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤或鳞状细胞癌，最优选的是鳞状细胞癌。

本发明的特征还在于以下条款

条款1.能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体分子或其抗原结合片段，其包含：(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:03中示出的CDRH1区(GFTFSDFYMY)、SEQ IDNO:04中示出的CDRH2区(TISDGGGYTSYPDSVKG)和SEQ ID NO:05中示出的CDRH3区(GLWLRDALDY)或者包含与SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04或SEQ ID NO:05具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRH1、CDRH2或CDRH3序列；和(ii)轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:06中示出的CDRL1区(SASSSISSNYLH)、SEQ ID NO:07中示出的CDRL2区(RTSNLAS)和SEQ ID NO:08中示出的CDRL3区(QQGSYIPFT)或者包含与SEQ ID NO:06、SEQID NO:07或SEQ ID NO:08具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRL1、CDRL2或CDRL3序列。

条款2.如条款1所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:01或09中示出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

条款3.如条款1或2所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:02或10中示出的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

条款4.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体选自：scFv、缺乏铰链区的单价抗体、微抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段和全抗体。

条款5.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其包含人IgG恒定结构域。

条款6.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其包含CH1结构域。

条款7.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其包含Fc区。

条款8.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应子功能。

条款9.如条款8所述的抗体分子或其抗原结合片段，其相较于亲本抗体具有对FcγRIIIa受体的增强的亲和力或具有增强的ADCC效应子功能。

条款10.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其包含重链和轻链及相对于亲本抗体在恒定区中的至少一种氨基酸取代，其中所述至少一种氨基酸取代包括氨基酸取代S239D和I332E，其中位置编号是根据EU索引的。

条款11.一种能够结合至人PSMA的抗体分子或其抗原结合片段，其能够与如条款1所述的抗体分子或其抗原结合片段竞争结合人PSMA。

条款12.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体分子或其抗原结合片段不与J591竞争结合人PSMA。

条款13.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体分子或其抗原结合片段当结合至PSMA时具有比J591减少的抗原转移诱导。

条款14.如条款13所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗原转移在PMSA-转染的Sp2/0细胞中被诱导。

条款15.如前述条款中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体分子或其抗原结合片段进一步结合至鳞状细胞癌(SCC)细胞。

条款16.一种双特异性抗体分子，其包含：(i)可变区，其包含如前述条款中任一项所定义的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述可变区包含能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的第一结合位点；和(ii)包含第二结合位点的抗体分子的重链可变区和轻链可变区。

条款17.如条款16所述的抗体分子，其中所述第一结合位点和所述第二结合位点结合至不同的结合伴侣。

条款18.如条款16或17中任一项所述的抗体分子，其中所述第一结合位点或第二结合位点结合至T细胞或天然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。

条款19.如条款16至18中任一项所述的抗体分子，其中所述T-细胞-或NK细胞特异性受体分子是CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、PD-1和CD95中的一种。

条款20.如条款19中任一项所述的抗体分子，其中所述TCR是TCR(α/β)或TCR(γ/δ)。

条款21.如条款19所述的抗体分子，其中所述T-细胞-或NK细胞特异性受体分子是CD3。

条款22.如条款21所述的抗体分子，其中包含第二结合位点的抗体分子的所述重链可变区和轻链可变区是OKT3或UCHT1的重链可变区和轻链可变区。

条款23.如条款15至21中任一项所述的抗体分子，其中(i)所述第一结合位点包含于Fab片段中并且所述第二结合位点包含于scFv片段中；或(ii)所述第一结合位点包含于单链Fv片段中并且所述第二结合位点包含于Fab片段中。

条款24.如条款23所述的抗体分子，其中所述Fab片段和所述单链Fv片段经由CH2结构域和/或CH3结构域连接。

条款25.如条款24所述的抗体分子，其中能够介导与Fc受体结合的CH2结构域的至少一个氨基酸残基缺失或被突变。

条款26.如条款24或25所述的抗体分子，其中序列位置226、228和229处的一个或多个氨基酸残基缺失或被突变(根据EU-索引的序列位置编号)。

条款27.如条款24至26中任一项所述的抗体分子，其中所述Fab片段经由所述Fab片段的重链CH1和VH结构域或经由所述Fab片段的CL和VL轻链结构域连接至所述CH2结构域。

条款28.如条款27所述的抗体分子，其中所述Fab片段的重链结构域或所述Fab片段的轻链结构域在所述抗体分子的多肽链的N末端处排列。

条款29.如前述条款中任一项所述的抗体分子，其中所述Fab片段包含铰链区。

条款30.如条款24至29中任一项所述的抗体分子，其中所述能够介导与Fc受体结合的CH2结构域的至少一个氨基酸残基缺失或被突变，所述氨基酸残基选自：序列位置230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据EU索引的序列位置编号)。

条款31.如条款24至30中任一项所述的抗体分子，其中在位置226和229的一处或两处的半胱氨酸被不同的氨基酸替代。

条款32.如条款24至31中任一项所述的抗体分子，其包含Fab片段、CH2结构域和scFv片段，其中所述Fab片段包含铰链区。

条款33.如条款32所述的抗体分子，其中所述Fab片段是人源化10B3抗体的Fab片段和/或其中所述scFv片段包含来自OKT3抗体的重链可变区和轻链可变区。

条款34.如条款33所述的抗体分子，其中所述抗体分子的重链具有如SEQ ID NO:12中示出的序列和/或其中所述抗体分子的轻链具有SEQ ID NO:13中示出的序列。

条款35.如条款24至31中任一项所述的抗体分子，其包含Fab片段、CH2结构域、CH3结构域和scFv片段，其中所述Fab片段包含铰链区。

条款36.如条款35所述的抗体分子，其中所述Fab片段是人源化10B3抗体的Fab片段和/或其中所述scFv片段包含来自人源化UCHT1抗体的重链可变区和轻链可变区。

条款37.如条款36所述的抗体分子，其中所述抗体分子的重链具有如SEQ ID NO:11中示出的序列和/或其中抗体分子的轻链具有SEQ ID NO:13中示出的序列。

条款38.如条款35至37中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子是四聚体抗体分子。

条款39.如条款16至23中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子是双特异性串联单链Fv、双特异性Fab₂或双特异性双抗体。

条款40.药物组合物，其包含如前述条款中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段。

条款41.如条款1至39中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段，其用于诊断或治疗疾病。

条款42.用于如条款41所述的用途的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述疾病是增殖性疾病。

条款43.用于如条款42所述的用途的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述增殖性疾病是癌症。

条款44.用于如条款43所述的用途的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述癌症是前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌或胶质母细胞瘤。

条款45.用于如条款43所述的用途的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述癌症是鳞状细胞癌。

条款46.诊断疾病的体外方法，其包括使从受试者获得的样品与如条款1至39中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段接触。

条款47.如条款46所述的体外方法，其中所述样品是组织样品或活检样品。

条款48.如条款46或47所述的体外方法，其中所述疾病是癌症，优选前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤或鳞状细胞癌。

条款49.核酸分子，其编码如条款1至39中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段。

条款50.载体，其包含如条款49所述的核酸分子。

条款51.宿主细胞，其包含如条款49所述的核酸分子或如条款50所述的载体。

条款52.产生如条款1至39中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段的方法，其包括在允许核酸表达的条件下表达编码所述抗体分子的核酸。

条款53.如条款52所述的方法，其中所述抗体分子或其抗原结合片段在宿主细胞或无细胞系统中表达。

序列表的简要说明

SEQ ID NO:01：鼠10B3抗体的重链可变结构域(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:02：鼠10B3抗体的轻链可变结构域(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:03：鼠10B3抗体的CDRH1(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:04：鼠10B3抗体的CDRH2(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:05：鼠10B3抗体的CDRH3(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:06：10B3抗体的CDRL1(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:07：鼠10B3抗体的CDRL2(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:08：鼠10B3抗体的CDRL3(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:09：人源化10B3抗体的重链可变结构域(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:10：人源化10B3抗体的轻链可变结构域(氨基酸序列)。

SEQ ID NO:11：人源化h10B3X人源化hUCHT1双特异性IgGsc形式抗体分子的重链

SEQ ID NO:12：人源化h10B3X鼠OKT3双特异性Fabsc形式抗体分子的重链

SEQ ID NO:13：人源化10B3抗体的κ轻链

SEQ ID NO:14：与SEQ ID NO:3具有至少75％序列同一性的鼠10B3抗体(氨基酸序列)的突变CDRH1的说明性实例。

SEQ ID NO:15：抗体J519的重链的可变结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16：抗体J519的轻链的可变结构域的氨基酸序列。

实验性实施例

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例1：10B3抗体的生成、鉴别和产生

用经辐射的PSMA转染的Sp2/0 Ag14细胞免疫雌性BALB/c小鼠后产生抗体10B3(Sp2/0-Ag14细胞获自ATCC，其中它们以商品名CRL-1581^TM商购获得)。最后一次免疫后4天，将脾细胞与转染的Sp2/0细胞融合，并在HAT选择培养基中培养。使用PSMA转染的以及未转染的Sp2/0细胞，通过流式细胞术筛选生长的杂交瘤细胞的上清液用于产生PSMA抗体。通过有限稀释进行亚克隆后，获得稳定的单克隆杂交瘤细胞系。对于抗体产生，使杂交瘤细胞适应先进的DMEM培养基(Gibco,Thermo Scientific,Waltham,MA,USA02451)，所述培养基补充有1％FCS(Biochrom GmbH,Berlin,Germany)以避免在纯化期间被牛IgG污染。通过蛋白A亲和色谱从细胞培养物上清液中分离抗体，并将纯化抗体的同种型鉴定为IgG2b/κ(快速小鼠单克隆同种型试剂盒(Rapid Mouse-Monoclonal Isotyping Kit)，BioAssay Works,Ijamsville,MD,21754)。所示的可变重链的序列(如SEQ ID NO:1和图10A所示)和可变轻链的序列(如SEQ ID NO:2和图10B所示)由Alvedron GmbH,Freiburg,Germany确定。

实施例2：人源化10B3抗体的产生

10B3抗体通过将CDR区移植到人可变κ轻链IGKV3-20*02(该序列以登录号L37729保藏在IMGT/LIGM数据库中，还参见Ichiyoshi Y.,Zhou M.,Casali P.A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from aninsulin-specific'germ-line'natural antibody template.Analysis by V genesegment reassortment and site-directed mutagenesis'J.Immunol.154(1):226-238(1995))和可变重链序列IGHV3-11*06(该序列以登录号AF064919保藏在IMGT/LIGM数据库中，还参见Watson C.T.,等人Complete haplotype sequence of the humanimmunoglobulin heavy-chain variable,diversity,and joining genes andcharacterization of allelic and copy-number variation.Am.J.Hum.Genet.92(4):530-546(2013))的种系序列中而被人源化。这里注意到IMGT/LIGM-DB是来自人类和其它脊椎动物物种的免疫球蛋白(IG)和T细胞受体(TR)核苷酸序列的IMGT综合数据库；参见Nucleic Acids Res.2006年1月1日；34(数据库号):D781-4。

为了维持亲本鼠抗体的结合性质，将以下两个回复突变引入可变的人类的框架区中。在IGHV3-11*06的人种系的重链的可变结构域中，将位置49处的丝氨酸回复突变为存在于鼠抗体10B3中的丙氨酸(还参见图10C，其中位置49处的丙氨酸残基以粗体和斜体突出显示)。在IGKV3-20*02的轻链序列的可变结构域中，将人种系序列的序列位置72处的苯丙氨酸回复突变为存在于鼠抗体10B3中的该序列位置的酪氨酸残基(还参见图10D，其中位置72处的酪氨酸残基以粗体和斜体突出显示)。

实施例3：重组抗体分子的产生和通过不同的PSMAxCD3抗体进行的脱靶T细胞活化

对于重组双特异性抗体分子的构建，PSMA抗体J591和10B3的可变结构域按以下顺序与CD3抗体OKT3或UCHT1的人恒定区和可变区融合：VH-CH1-CH2mod-scFv(OKT3/UCHT1)(对于Fabsc形式)、VH-CH1-CH2mod-CH3-scFv(OKT3/UCHT1)(对于IgGsc形式)(还参阅图1A和1B)。在这些抗体分子中，PMSA结合位点以Fab片段存在，而CD3结合位点以scFv片段存在(再次参阅图1A和1B)。为了消除FcR结合、糖基化位点和二硫键形成，将以下修饰引入到Fabsc形式(EU-索引)的铰链区和CH2结构域中：C226S；C229S；E233P；L234V；L235A；ΔG236；D265G；N297Q；A327Q；A330S(在这方面还参见国际专利申请WO 2013/092001)。IgGsc形式的修饰是相同的，除了IgGsc形式中缺乏在铰链区的序列位置226和229处的两个半胱氨酸突变。将构建体克隆到来源于pcDNA3.1的表达载体(InVitrogen，Thermo Fisher)中并通过电穿孔转染至Sp2/0细胞中，如国际专利申请WO 2013/092001中所述。通过使用kappaSelect(Fabsc)或蛋白A(IGGsc)树脂的亲和色谱从转染的细胞的上清液中纯化抗体分子。两种亲和力树脂均购自GE Health Care Freiburg,Germany。

为了表征脱靶T细胞活化，在不存在和存在SKW6.4旁观者淋巴瘤细胞的情况下，将PBMC与指定的J519和10B3抗体分子一起孵育。2天后，通过流式细胞术分析CD4T细胞的CD69表达。为此，将PMBC与针对CD4(FITC标记的克隆HP2/6)、CD8(APC-标记的克隆HIT8a)和CD69(PE标记的克隆FN50)的检测抗体一起孵育，以鉴定表达活化标记CD69的T细胞。使用来自BDBiosciences的FACS Canto II分析细胞。

结论：如图2所示(其显示了含有抗体J519的可变结构域的双特异性抗体分子的结果)，含有CD3结合抗体UCHT1的scFv片段的Fabsc抗体分子在没有表达PSMA的细胞的情况下诱导T细胞活化(脱靶T细胞活化)，而包含相同靶标(即PMSA结合位点和效应子抗体结合位点(即CD3结合抗体UCHT1的scFv片段))的IgGsc抗体分子不诱导T细胞活化。

实施例4：用呈Fabsc形式的PSMAxCD3抗体进行的中靶T细胞活化

在图3中，通过³H胸苷摄取来评估T细胞活化。在图3A中，示出用于比较的脱靶T细胞活化。在图3C中，通过Xelligence细胞毒性测定证明了经活化的T细胞对表达PSMA的靶细胞的裂解。对于³H-胸苷摄取测定PBMC(20⁵/孔)在96孔板中一式三份接种，并在有(图3B)或没有(图3A)辐照的(100Gy)PSMA表达22RV1细胞(10⁵/孔)的情况下与各种浓度的双特异性抗体分子一起孵育。72小时后，将细胞用³H-胸苷(0.5μCi/孔)脉冲另外20小时，并在滤垫上收获。通过2450微孔板计数器(Perkin Elmer)中的液体闪烁计数测定掺入的放射性。

对于Xelligence测定，将50μl培养基加入96孔E-板(Roche)中以确定本底值。随后，以每孔40.000个细胞的密度接种靶细胞(22RV1)。在接下来的20-24个小时内，使细胞粘附至孔。然后，将通过密度梯度离心分离的PBMC添加到靶细胞。效应子与靶标比率(E:T)为5:1，并且双特异性抗体浓度为1μg/ml。每15分钟监测阻抗，持续数天，作为粘附靶细胞存活力的量度。

结论：含有OKT3(NP-CO)的双特异性PSMAxCD3抗体相较于含有UCHT1(NP-CU)的试剂在调节“中靶”T细胞活化和靶细胞杀伤方面的效果稍差。

实施例5：不同的双特异性抗体形式的多聚化和聚集

在图4A和图4B中，比较了具有FLT3xCD3特异性的抗体分子(Fabsc形式对比bscc形式)，而在图4C-F中，比较了具有PSMAxCD3特异性的那些抗体分子(Fabsc形式对比IgGsc形式)。用于分析多聚化行为的凝胶过滤在Superdex S200柱上进行。

结论：(i)如图4B所示，bssc形式的抗体(参见图1C，用于图4B的实验中的双特异性单链形式)具有形成多聚体和聚集物的显著趋势。在Fabsc形式和IGsc形式的情况下，这种趋势要低得多(图4A，图4C-F)。(ii)与包含UCHT1的那些抗体(图4D、4F)相比，含有OKT3的抗体(图4C、4E)的由Fabsc/IgGsc构建体形成的适量多聚体更高。虽然已经用含有作为PMSA结合位点的抗体J591的可变结构域的Fabsc/IgGsc分子获得了图4C至4F所示的结果，但对于抗体10B3的相应Fabsc分子，也观察到类似行为(数据未显示)。

实施例6：PSMA抗体J591和10B3与表达PSMA的细胞的结合

通过流式细胞术使用PSMA转染的Sp2/0细胞评估在抗体结合后的结合(图5A)、缺乏结合竞争(图5B)和PSMA抗原转移(图5C)。为此，将不同的α-PSMA抗体与这些细胞在96孔板中于4℃孵育30-45分钟。然后洗涤细胞并将其与PE缀合的山羊抗小鼠F(ab)₂片段(图5A、5C)(Jackson ImmunoResearch)或PE-山羊抗人FC-γ特异性片段(JacksonImmunoResearch)(B)孵育。将细胞在FACSCalibur(BD Biosciences)上分析。在图5B中，证明了尤其是由山羊抗人二级抗体检测的嵌合性(ch)PMSA结合抗体J591被鼠(mu)抗体J591而不是鼠抗体10B3(即本发明的抗体)竞争下去。为了测定抗原转移(图5C)，在实验开始时将表达PSMA的细胞与指定抗体一起孵育，并在24小时之后且FACS分析之前用饱和量(10μg/ml)的相应抗体再孵育。由未经处理的细胞进行的PSMA表达作为参考(100％PSMA表达)。

结论：(i)两种抗体(J591和10B3)的结合相当，(ii)抗体彼此不交叉竞争，即它们与不同的表位结合以及(iii)由10B3抗体诱导的抗原转移当与由抗体J591产生的抗原转移相比时显著减少。

实施例7：用PSMA抗体J591和10B3染色的冷冻切片

在图6A、B中，将前列腺癌细胞样品用两种抗体染色，而在图6C和图6D中，将鳞状细胞样品用两种抗体染色。在两个实验中，平行染色并使用来自Zytomed,Berlin,Germany(POLHRP-100)的聚合物系统(POLHRP-100)进行。箭头表示肿瘤基质(Tu)和血管(Ve)。显示了10个前列腺癌样品中的9个以及10个鳞状细胞样品中的7个的代表性结果。

在各种不同的正常人组织(从BioCat,Heidelberg,Germany,T6234701-2获得)中，两种抗体的染色模式是相同的，除了抗体10B3与皮肤中的上皮细胞有微弱反应性。

结论：(i)使用两种抗体的前列腺癌样品和正常组织的染色相当，(ii)在鳞状细胞癌样品中，J5191抗体仅将血管细胞染色而抗体10B3将血管细胞(比J591更广泛)和肿瘤细胞自身染色。

实施例8：人源化和小鼠10B3抗体的结合

将含有人源化CDR移植(h10B3)抗体或小鼠(m10B3)抗体的可变结构域的具有PSMAxCD3(10B3xOKT3)特异性的双特异性Fabsc抗体与表达PSMA的22RV1细胞一起孵育并通过流式细胞术进行分析(图7)。为此，将细胞与指定抗体一起在96孔板中于4℃孵育30-45分钟。在孵育后，将细胞洗涤并与二级PE-山羊-抗人FC-γ特异性片段(JacksonImmunoResearch)一起孵育。在FACSCalibur(BD Biosciences)上分析细胞。

结论：小鼠和人源化10B3形式(在Fabsc抗体分子内作为10B3的可变结构域的Fab部分掺入)与表达PSMA的细胞的结合是相同的。

实施例9：不同的PSMAxCD3抗体与CD3的结合

将Jurkat细胞与抗体分子(Fabsc(UCHT1)＝包含抗体UCHT1的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变结构域的Fabsc分子；IgGsc(UCHT1)＝包含抗体UCHT1的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变结构域的IgGsc分子，Fabsc(OKT3)＝包含抗体OKT3的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变性结构域的Fabsc分子，IgGsc(OKT3)＝包含抗体OKT3的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变结构域的IgGsc分子)在96孔板中于4℃一起孵育30-45分钟。然后将细胞洗涤并与生物素-山羊-抗人IgG、F(ab')₂片段特异性(JacksonImmunoResearch)和链霉亲和素-PE(Life Technologies)一起孵育。在FACSCalibur(BDBiosciences)上分析细胞。

结论：如图8所示，含有UCHT1的Fabsc抗体对CD3的亲合力最高，含有OKT3的抗体对CD3的亲合力最低。在IgGsc形式中，UCHT1构建体失去亲合力，OKT3构建体获得亲合力。由于双特异性抗体分子对CD3的亲合力显然完全取决于CD3结合(位点)，因此，可以假设含有抗体10B3的结合位点的双特异性抗体分子的亲和力的等级与如这里使用抗体J591的可变结构域作为代表性的PMSA结合位点(靶结合位点)所确定的相同。

实施例10：不同的PSMA抗体的细胞裂解活性

将表达PSMA的22RV1前列腺癌细胞与PBMC和指定的双特异性PSMAxCD3抗体分子(Fabsc(UCHT1)＝包含抗体UCHT1的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变结构域的Fabsc分子；IgGsc(UCHT1)＝包含抗体UCHT1的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变结构域的IgGsc分子，Fabsc(OKT3)＝包含抗体OKT3的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变性结构域的Fabsc分子，IgGsc(OKT3)＝包含抗体OKT3的CD3结合可变结构域和抗体J591的可变结构域的IgGsc分子)以5:1的PBMC:靶标比率一起孵育。如实施例4中所述使用Xelligence系统评估粘附靶细胞的存活力。效应子与靶标的比率(E:T)为5：1，并且抗体的浓度设定为5nM。

图9显示了用不同健康志愿者的PBMC进行的四个不同实验中的一个的代表性结果。

结论：裂解活性的等级是：Fabsc(UCHT1)≈IgGsc(UCHT1)>Fabsc(OKT3)>IgGsc(OKT3)。由于双特异性抗体分子的裂解活性依赖于CD3结合(位点)，因此可以假设含有抗体10B3的结合位点的双特异性抗体分子的裂解活性的等级如这里使用抗体J591的可变结构域作为代表性的PMSA结合位点(靶结合位点)所确定的相同。

实施例11：PSMAxCD3 IgGsc(CC-1)的体外治疗作用

将本发明的PSMAxCD3(h10B3xUCHT1)-IgGsc(CC-1)双特异性抗体和对照特异性抗体(NG2xCD3)在有或无肿瘤细胞(22Rv1细胞，人前列腺癌细胞；参见Sramkoski RM等人InVitro Cell Dev Biol Anim.1999Jul-Aug；35(7):403-9.)的情况下一起孵育。在孵育三天后，使用CD69和CD25作为细胞表面标志物，通过FACS分析CD4和CD8T细胞活化。两种T细胞类型均被活化(图15A)，并且干扰素γ水平(图15B)和T细胞增殖增加(图15C)。铬释放测定(20小时后E:T比率10:1)和FACS(超过72小时，E:T比率1:1)进一步显示使用CC-1对肿瘤细胞的强烈裂解(图15D和E)。用本发明的CC-1处理也在体外抑制肿瘤生长。在E:T比率为2:1时，如用Xelligence系统(图15F左)和通过使用显微镜目视检查(图15F右)所分析，在CC-1存在下的肿瘤细胞生长显著受损。

结论：CC-1诱导肿瘤细胞限制性T细胞活化并产生细胞因子，导致T细胞增殖和抗肿瘤活性。

实施例12：PSMAxCD3 IgGsc(CC-1)的体内治疗作用

接下来，在小鼠模型中测试CC-1(本发明的IgGsc双特异性抗体)的体内抗肿瘤活性。将1,5x10⁶个22Rv1细胞静脉内注射到NSG(NOD scidγ，(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ))小鼠中(n＝4只/组)。三天后注射3x106个人类PBMC，并在第3天和第5天注射10μg的CC-1或PBS(作为阴性对照)。在8天后，使用FACS分析肺中的转移形成。在CC-1处理组中发现了形成的转移数量的显著减少(图16A)。然后，向NSG小鼠(n＝3只/组)注射2x10⁷个PBMC/小鼠，并以4天的间隔用2x20μg的“超治疗”CC-1剂量和对照抗体(UCHT1作为阳性对照，其非特异性活化T细胞)或PBS(作为阴性对照)处理。分析IFNγ释放和体重作为自身免疫活性的标记(图16B)。与UCHT1相比，CC-1没有诱导IFNγ产生，并且与UCHT1处理组相反，观察到CC-1处理的小鼠体重没有减轻。在另一个实验中，向NOS/SCID小鼠注射22Rv1细胞(PSMA阳性肿瘤细胞)或DU145细胞(PSMA阴性人类前列腺肿瘤细胞)，并在35天后建立肿瘤后，将小鼠用放射性同位素标记的CC-1抗体(50μCi)处理并在24小时后处死以测量不同器官中的放射性。仅在22Rv1处理的小鼠的肿瘤中，可以观察到放射性的显著增加(图16C)。为了测试本发明的BiTE或IgGsc形式的双特异性抗体的血清半衰期的差异，向Balb/C小鼠注射50μg的CC-1(IgGsc形式)或BiTE形式双特异性PSMAxCD3抗体。随时间推移测量血清浓度。注射2-4小时后检测不到BiTE形式的双特异性抗体，而24小时后血清中仍可检测到CC-1(图16D)。因此，与其它双特异性抗体形式相比，本发明的IgGsc形式提供增加的血清稳定性。

结论：CC-1抑制体内肿瘤生长而不诱导任何非特异性免疫响应。CC-1特异性靶向表达PSMA的肿瘤组织，并且与其它双特异性形式相比，血清半衰期增加。

实施例13：UCHT1和OKT3的比较

为了进一步阐明本文所示的UCHT1作为IgGsc双特异性抗体形式中的CD3结合位点(参见上文)优于OKT3的优势，比较测试了两种单特异性抗体的Fab和IgG形式。通过蛋白A亲和色谱纯化OKT3和UCHT1。通过胃蛋白酶消化产生Fab片段，然后如前所述还原和修饰铰链区二硫键(Jung等人Target cell induced T cell activation with bi-andtrispecific antibody fragments.Eur J Immunol 1991；21,2431-2435)。在SuperdexS200柱上通过尺寸排阻色谱纯化Fab片段。

然后将表达CD3的Jurkat细胞与增加浓度的所示抗体、生物素标记的检测抗体(抗-人Fab)，接着PE缀合的链霉亲和素一起孵育。然后通过流式细胞术分析样品(表1)。示出所观察到的半最大结合的浓度(nM)。

	IgG	Fab
			OKT3	0,3nM	23,7nM
UCHT1	0,6nM	0,6nM

表1：抗CD3抗体的Fab和IgG形式的亲合力

结论：

如果用作单价Fab片段而不是二价完整IgG分子，则OKT3失去亲合力。相反，UCHT1片段的亲合力不会改变。不受理论束缚，这指向完整UCHT1抗体的单价结合，其亲合力与二价结合OKT3抗体相当。单价Fab-片段的结合有利于UCHT1的显著差异解释了Fabsc形式中两种抗体的结合的相应差异(图8，实施例9)。在该形式中，抗体作为与靶向抗体的C末端连接的单价单链分子存在(图1)。UCHT1的单价结合也解释了为什么这种抗体失去亲合力-而OKT3如果存在于IgGsc而不是Fabsc形式中则获得亲合力(图1和图8，实施例9)。

尽管在IgG形式中，含有UCHT1的分子(IgGsc-UCHT1)的亲合力与IgGsc-OKT3的亲合力相当或甚至略低，但IgGsc-UCHT1对肿瘤细胞的活性显著-并且出乎意料地更高(图9，实施例10)。

总之，IgGsc-UCHT1是具有优化性质的形式，所述优化性质结合了低脱靶活性(图2，实施例3)和对肿瘤细胞的最佳裂解活性(图9，实施例10)。

实施例14：UCHT1在其它双特异性IgGsc形式抗体中是有效的

对于其它非PSMA特异性抗体，进一步测试了在基于IgGsc的抗体形式中优选使用UCHT1作为抗CD3抗体。将表达神经节苷脂GD2以及该抗原的O-乙酰化形式(oaGD2)的经辐照的M21黑素瘤细胞与从正常人供体的外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)和具有所示特异性的双特异性IgGsc抗体一起孵育。在这些构建体内，使用的亲本单特异性抗体分别是hu14.18(抗-GD2)、8B6(抗-oaGD2)、J591(抗-PSMA)和UCHT1(抗-CD3)。3天后，使用³H-胸苷掺入测定评估T-细胞活化。此外，将M21细胞与PBMC和指定的双特异性IgGsc抗体(50nM)一起孵育。然后使用Xelligence系统监测肿瘤细胞生长。将具有不相关靶标特异性(MOPC)的双特异性IgGsc抗体用作对照。

结论：

在存在表达GD2和oaGD2的肿瘤细胞和靶向这些抗原的双特异性抗体的情况下，观察到在PBMC群体内T细胞的有效活化。靶向PSMA的对照抗体是无效的，因为M21不表达PSMA(图17A)。

针对GD2或oaGD2作为靶特异性且CD3作为效应子特异性的双特异性IgGsc抗体有效杀伤表达这些抗原的肿瘤细胞(图17B)。使用的特定GD2抗体和CD3抗体列于图17A的图例中。

本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应广泛而无限制地理解。此外，本文使用的术语和表达用作描述的术语而不是限制，并且没有意图使用此类术语和表达来排除所示出的和所描述的特征或其部分的任何等同物，但是应该认识到，在要求保护的本发明的范围内可能进行各种修改。因此，应当理解，尽管通过示例性实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的所实现的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。

序列表

<110> 德国癌症研究公共权益基金会 (Deutsches KrebsforschungszentrumStiftung des oeffentlichen Rechts)

蒂宾根大学 (Eberhard Karls Universitaet Tuebingen)

<120> 新型PSMA结合抗体及其用途

<130> D31545WO

<150> EP16151281.9

<151> 2016-01-14

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 鼠源10B3抗体重链可变区

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Trp Leu Arg Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 鼠源10B3抗体轻链可变区

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ile Thr Met Ala Ala Phe Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ile Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Tyr Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的CDR-H1

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的CDR-H2

<400> 4

Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的CDR-H3

<400> 5

Gly Leu Trp Leu Arg Asp Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的CDR-L1

<400> 6

Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的CDR-L2

<400> 7

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的CDR-L3

<400> 8

Gln Gln Gly Ser Tyr Ile Pro Phe Thr

1 5

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 人源化10B3抗体重链可变区

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Trp Leu Arg Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 人源化10B3抗体轻链可变区

<400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Tyr Ile Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 714

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> h10B3xhUCHT1双特异性IgGsc形式抗体的重链

<400> 11

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Asp Phe Tyr Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr

65 70 75 80

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

85 90 95

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Trp Leu Arg Asp Ala Leu Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

245 250 255

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

465 470 475 480

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

485 490 495

Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val

515 520 525

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr

530 535 540

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

545 550 555 560

Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

565 570 575

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

580 585 590

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

595 600 605

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

610 615 620

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

625 630 635 640

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

645 650 655

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

660 665 670

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

675 680 685

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

690 695 700

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710

<210> 12

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> h10B3xOKT3双特异性Fabsc形式抗体的重链

<400> 12

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Ser Asp Phe Tyr Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr

65 70 75 80

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

85 90 95

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Trp Leu Arg Asp Ala Leu Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val

245 250 255

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Ser Gly Gln Val

355 360 365

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

370 375 380

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

385 390 395 400

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

405 410 415

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

420 425 430

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

450 455 460

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

465 470 475 480

Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

485 490 495

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser

500 505 510

Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser

515 520 525

Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys

530 535 540

Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His

545 550 555 560

Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly

565 570 575

Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser

580 585 590

Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

595 600 605

<210> 13

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 人源化10B3抗体的轻链

<400> 13

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Ser Tyr Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 10B3抗体的突变的CDR-H1

<400> 14

Gly Phe Ser Phe Thr Asp Phe Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> J519抗体的可变重链结构域

<400> 15

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> J519抗体的可变轻链结构域

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

Claims (21)

1.抗体分子或其抗原结合片段，其能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)，所述抗体分子或其抗原结合片段包含：

(i)重链可变结构域，其包含SEQ ID NO:03中示出的CDRH1区(GFTFSDFYMY)、SEQ IDNO:04中示出的CDRH2区(TISDGGGYTSYPDSVKG)和SEQ ID NO:05中示出的CDRH3区(GLWLRDALDY)或者包含与SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04或SEQ ID NO:05具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRH1、CDRH2或CDRH3序列；和

(ii)轻链可变结构域，其包含SEQ ID NO:06中示出的CDRL1区(SASSSISSNYLH)、SEQ IDNO:07中示出的CDRL2区(RTSNLAS)和SEQ ID NO:08中示出的CDRL3区(QQGSYIPFT)或者包含与SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:07或SEQ ID NO:08具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的CDRL1、CDRL2或CDRL3序列。

2.如权利要求1所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含与SEQID NO:01或09中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:02或10中示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

3.抗体分子或其抗原结合片段，其能够结合至人PSMA，所述抗体分子或其抗原结合片段能够与权利要求1所述的抗体分子或其抗原结合片段竞争结合人PSMA。

4.如前述权利要求中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体分子或其抗原结合片段不与J591竞争结合人PSMA，或者其中所述抗体分子或其抗原结合片段当结合至PSMA时，具有比J591降低的抗原转移诱导，或者其中所述抗体分子或其抗原结合片段还结合至鳞状细胞癌(SCC)细胞。

5.双特异性抗体分子，其包含：

(i)可变区，其包含前述权利要求中任一项所定义的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述可变区包含能够结合至人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的第一结合位点；和

(ii)包含第二结合位点的抗体分子的重链可变区和轻链可变区。

6.如权利要求5所述的抗体分子，其中所述第一结合位点或第二结合位点结合至T细胞或天然杀伤(NK)细胞的特异性受体分子，其中所述T细胞或NK细胞的特异性受体分子优选为CD3。

7.如权利要求6所述的抗体分子，其中所述包含第二结合位点的抗体分子的重链可变区和轻链可变区是OKT3或UCHT1的重链可变区和轻链可变区。

8.如权利要求5至7中任一项所述的抗体分子，其中

(i)所述第一结合位点包含于Fab片段中并且所述第二结合位点包含于scFv片段中；或

(ii)所述第一结合位点包含于单链Fv片段中并且所述第二结合位点包含于Fab片段中，

其中所述Fab片段和所述单链Fv片段优选地经由CH2结构域和/或CH3结构域连接。

9.如权利要求8所述的抗体分子，其中所述能够介导与Fc受体的结合的CH2结构域的至少一个氨基酸残基缺失或被突变。

10.如权利要求8或9所述的抗体分子，其包含Fab片段、CH2结构域和scFv片段，其中所述Fab片段包含铰链区，其中所述Fab片段优选为人源化10B3抗体的Fab片段和/或其中所述scFv片段优选包含来自OKT3抗体的重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体分子的重链优选具有如SEQ ID NO:12中示出的序列和/或其中所述抗体分子的轻链优选具有SEQ ID NO:13中示出的序列。

11.如权利要求8或9所述的抗体分子，其包含Fab片段、CH2结构域、CH3结构域和scFv片段，其中所述Fab片段包含铰链区，其中所述Fab片段优选为人源化10B3抗体的Fab片段和/或其中所述scFv片段优选包含来自人源化UCHT1抗体的重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体分子的重链优选具有如SEQ ID NO:11中示出的序列和/或其中所述抗体分子的轻链优选具有SEQ ID NO:13中示出的序列。

12.如权利要求11所述的抗体分子，其中所述抗体分子是四聚体抗体分子或同型二聚体和四价抗体分子。

13.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段。

14.如权利要求1至13中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段，其用于诊断或治疗疾病，其中所述疾病优选为癌症，其中所述癌症优选为前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌或鳞状细胞癌。

15.诊断疾病的体外方法，其包括使从受试者获得的样品与权利要求1至13中任一项所定义的抗体分子或其抗原结合片段接触，其中所述疾病优选为癌症，其中所述癌症优选为前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤或鳞状细胞癌。

16.四价和同型二聚体双特异性抗体分子，其在每个单体中包含：

(i)N末端Fab片段，其包含含重链可变结构域和轻链可变结构域的可变区，其中所述可变区包含能够结合至抗原的第一结合位点；

(ii)C末端scFv片段，其包含人源化UCHT1的重链可变区和轻链可变区，以及

其中(i)和(ii)通过CH2和CH3结构域连接。

17.如权利要求16所述的四价双特异性抗体分子，其中所述能够介导与Fc受体结合的CH2结构域的至少一个氨基酸残基缺失或被突变。

18.如权利要求16或17所述的四价双特异性抗体分子，其中所述Fab片段不是非人源化、嵌合或人源化10B3或J591抗体的Fab片段，优选地，其中所述第一结合位点不能够结合至PSMA。

19.如权利要求16至18中任一项所述的四价双特异性抗体分子，其不是权利要求1至15中任一项所定义的抗体分子，并且其不是权利要求1至15中任一项所定义的抗原结合片段。

20.如权利要求16至19中任一项所述的四价和同型二聚体双特异性抗体分子，其中人源化UCHT1的重链可变区和轻链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的UCHT1的序列，优选以氨基酸序列DIQMT开始且以VTVSS结束。

21.如权利要求16至20中任一项所述的四价双特异性抗体分子，其中所述Fab片段结合至肿瘤相关的抗原。