JP2023551535A - T細胞がんを治療するための方法および材料 - Google Patents
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Abstract
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料に関する。例えば、1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。例えば、T細胞がんを有する哺乳動物を治療するための1つまたは複数の二重特異性分子を使用するための方法および材料が提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年12月1日に出願された米国特許出願第63/119,753号の恩典を主張するものである。先行出願の開示は、本出願の開示の一部と見なされる(かつ参照によりその中に組み入れられる)。
本出願は、2020年12月1日に出願された米国特許出願第63/119,753号の恩典を主張するものである。先行出願の開示は、本出願の開示の一部と見なされる(かつ参照によりその中に組み入れられる)。
連邦政府資金援助に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号CA009071、AR048522、CA006973、CA062924、GM007309およびCA230400の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号CA009071、AR048522、CA006973、CA062924、GM007309およびCA230400の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表
本文書は、44807-0384WO_SL_ST25.txtという名称のASCIIテキストファイルとして電子提出されている配列表を含む。2021年11月30日に作成されたASCIIテキストファイルは、サイズが335キロバイトである。ASCIIテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本文書は、44807-0384WO_SL_ST25.txtという名称のASCIIテキストファイルとして電子提出されている配列表を含む。2021年11月30日に作成されたASCIIテキストファイルは、サイズが335キロバイトである。ASCIIテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
1. 技術分野
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料に関する。例えば、1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。例えば、本文書は、T細胞がんを有する哺乳動物を治療するための1つまたは複数の二重特異性分子を使用するための方法および材料を提供する。
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料に関する。例えば、1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。例えば、本文書は、T細胞がんを有する哺乳動物を治療するための1つまたは複数の二重特異性分子を使用するための方法および材料を提供する。
2. 背景情報
T細胞がんは、約15%の非ホジキンリンパ腫(Swerdlow et al., Blood 127:2375-2390 (2016)(非特許文献1))および20%の急性リンパ芽球性白血病(ALL; Han et al., Cancer Causes & Control 19:841-858 (2008)(非特許文献2);およびDores et al., Blood 119:34-43 (2012)(非特許文献3))を含む異種の悪性腫瘍群である。T細胞リンパ腫および再発性T細胞ALL(T-ALL)の治療成績は、同等のB細胞悪性腫瘍に対するものより悪く、推定5年生存率は、T細胞リンパ腫でわずか32%(Weisenburger et al., Blood 117:3402-3408 (2011)(非特許文献4))、再発性T-ALLで7%(Fielding et al., Blood 109:944-950 (2007)(非特許文献5))である。
T細胞がんは、約15%の非ホジキンリンパ腫(Swerdlow et al., Blood 127:2375-2390 (2016)(非特許文献1))および20%の急性リンパ芽球性白血病(ALL; Han et al., Cancer Causes & Control 19:841-858 (2008)(非特許文献2);およびDores et al., Blood 119:34-43 (2012)(非特許文献3))を含む異種の悪性腫瘍群である。T細胞リンパ腫および再発性T細胞ALL(T-ALL)の治療成績は、同等のB細胞悪性腫瘍に対するものより悪く、推定5年生存率は、T細胞リンパ腫でわずか32%(Weisenburger et al., Blood 117:3402-3408 (2011)(非特許文献4))、再発性T-ALLで7%(Fielding et al., Blood 109:944-950 (2007)(非特許文献5))である。
悪性のB細胞またはT細胞は、それらの非がん性対応物と異なる細胞表面抗原を発現しない。CD19またはCD20などのpan-B細胞抗原を標的としたB細胞悪性腫瘍に対する標的免疫療法剤がいくつかあるが、それに伴う正常B細胞無形成が臨床的に十分に忍容性であるため、実現的である。しかしながら、pan-T細胞抗原を標的とした同様の戦略は、結果として生じるT細胞枯渇が臨床的に許容できないレベルの免疫抑制を導くため、実現的でない。
Swerdlow et al., Blood 127:2375-2390 (2016)
Han et al., Cancer Causes & Control 19:841-858 (2008)
Dores et al., Blood 119:34-43 (2012)
Weisenburger et al., Blood 117:3402-3408 (2011)
Fielding et al., Blood 109:944-950 (2007)
概要
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料を提供する。いくつかの場合に、本文書は、T細胞がんを治療するために使用できる二重特異性分子を提供する。例えば、、第1の抗原結合ドメイン(例えば、第1の単鎖可変断片(scFv))がT細胞受容体β鎖可変(TRBV)ポリペプチドに結合でき、第2の抗原結合ドメイン(例えば、第2のscFv)がT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる、少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子を使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。いくつかの場合に、本文書は、T細胞がんを治療するための方法を提供する。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物)を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料を提供する。いくつかの場合に、本文書は、T細胞がんを治療するために使用できる二重特異性分子を提供する。例えば、、第1の抗原結合ドメイン(例えば、第1の単鎖可変断片(scFv))がT細胞受容体β鎖可変(TRBV)ポリペプチドに結合でき、第2の抗原結合ドメイン(例えば、第2のscFv)がT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる、少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子を使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。いくつかの場合に、本文書は、T細胞がんを治療するための方法を提供する。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物)を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。
本明細書において実証されるように、T細胞がんは、T細胞受容体(TCR)抗原の特定のサブセットを標的化することによって治療することができる。例えば、TRBV5-5とCD3を標的とする二重特異性抗体は、健康なT細胞を刺激して、TRBV5-5+悪性T細胞を特異的に溶解することができる。同様に、TRBV12とCD3を標的とする二重特異性抗体は、健康なT細胞を刺激して、TRBV12+悪性T細胞を特異的に溶解することができる。また、本明細書において実証されるように、TRBV5-5とCD3を標的とする二重特異性抗体およびTRBV12とCD3を標的とする二重特異性抗体は、哺乳動物内の正常T細胞の大部分を保存することができ、かつ生存期間を改善することができる。
VDJ組換えは、対立遺伝子排除を伴って、各T細胞の表面上に30のT細胞受容体β鎖可変(TRBV)ポリペプチドのうちの1つの発現をもたらし、その結果、各TRBVが、正常ヒト末梢血T細胞全体の1~5%の表面上に発現される。これに対して、クローン性T細胞がんは、単一のTRBVポリペプチドを発現する。本明細書に記載するようにT細胞がんを(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む1つまたは複数の二重特異性分子を投与することによって)治療する能力を有することは、正常T細胞の大部分を保持しながらクローン性T細胞がんを選択的に枯渇させる、唯一かつまだ実現されていない機会を提供する(例えば、図1Aを参照のこと)。加えて、本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)は、T細胞がんに対する対費用効果の高い既製の標的治療薬として使用することができる。
概して、本文書の一局面は、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチドと、T細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む、二重特異性分子を特徴とする。第1のポリペプチドは、単鎖可変断片(scFv)、抗原結合断片(Fab)、F(ab')2断片、またはその生物学的に活性な断片であり得る。TRBVポリペプチドは、TRBV2ポリペプチド、TRBV3-1ポリペプチド、TRBV4-1ポリペプチド、TRBV4-2ポリペプチド、TRBV4-3ポリペプチド、TRBV5-1ポリペプチド、TRBV5-4ポリペプチド、TRBV5-5ポリペプチド、TRBV5-6ポリペプチド、TRBV5-8ポリペプチド、TRBV6-1ポリペプチド、TRBV6-2ポリペプチド、TRBV6-3ポリペプチド、TRBV6-4ポリペプチド、TRBV6-5ポリペプチド、TRBV6-6ポリペプチド、TRBV6-8ポリペプチド、TRBV6-9ポリペプチド、TRBV7-2ポリペプチド、TRBV7-3ポリペプチド、TRBV7-4ポリペプチド、TRBV7-6ポリペプチド、TRBV7-7ポリペプチド、TRBV7-8ポリペプチド、TRBV7-9ポリペプチド、TRBV9ポリペプチド、TRBV10-1ポリペプチド、TRBV10-2ポリペプチド、TRBV10-3ポリペプチド、TRBV11-1ポリペプチド、TRBV11-2ポリペプチド、TRBV11-3ポリペプチド、TRBV12-2ポリペプチド、TRBV12-3ポリペプチド、TRBV12-4ポリペプチド、TRBV12-5ポリペプチド、TRBV13ポリペプチド、TRBV14ポリペプチド、TRBV15ポリペプチド、TRBV16ポリペプチド、TRBV18ポリペプチド、TRBV19ポリペプチド、TRBV20-1ポリペプチド、TRBV24-1ポリペプチド、TRBV25-1ポリペプチド、TRBV27 TRBV28ポリペプチド、TRBV29-1ポリペプチド、またはTRBV30ポリペプチドであり得る。例えば、TRBVポリペプチドは、TRBV5-5ポリペプチドであり得る。TRBV5-5ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む軽鎖を含み得;かつ、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む重鎖を含み得る。いくつかの場合に、軽鎖は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含み得、かつ重鎖は、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合に、軽鎖は、SEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含み得、かつ重鎖は、SEQ ID NO:39に示されるアミノ酸配列を含み得る。例えば、TRBVポリペプチドは、TRBV12ポリペプチドであり得る。TRBV12ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む軽鎖を含み得;かつ、SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR2、およびSEQ ID NO:14に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む重鎖を含み得る。いくつかの場合に、軽鎖は、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含み得、かつ重鎖は、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合に、軽鎖は、SEQ ID NO:40に示されるアミノ酸配列を含み得、かつ重鎖は、SEQ ID NO:41に示されるアミノ酸配列を含み得る。第2のポリペプチドは、scFv、Fab、F(ab')2断片、またはその生物学的に活性な断片であり得る。T細胞共受容体ポリペプチドは、分化抗原群3(CD3)ポリペプチドまたはT細胞受容体ポリペプチドであり得る。CD3ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:19に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む軽鎖を含み得;かつ、SEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR2、およびSEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む重鎖を含み得る。いくつかの場合に、軽鎖は、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含み得、かつ重鎖は、SEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含み得る。
別の局面では、本文書は、T細胞がんを有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。該方法は、T細胞がんを有する哺乳動物に、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインを有する第1のポリペプチドとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインを有する第2のポリペプチドとを含む二重特異性分子を投与する段階を含み得るか、またはそれから本質的になり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。T細胞がんは、クローン性T細胞がんであり得る。T細胞がんは、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、腸症関連T細胞リンパ腫(EATL)、単形性上皮向性腸管T細胞リンパ腫(MEITL)、濾胞性T細胞リンパ腫(FTCL)、節性末梢性T細胞リンパ腫(節性PTCL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、T細胞大型顆粒リンパ球白血病(T-LGL)、節外性NK/T細胞リンパ腫(NKTL)、または肝脾T細胞リンパ腫であり得る。哺乳動物内のがん細胞を少なくとも95パーセント減少させることができる。該方法は、哺乳動物の生存期間を改善するのに効果的であり得る(例えば、哺乳動物の生存期間を少なくとも37.5パーセント改善するのに効果的であり得る)。
別の局面では、本文書は、セリアック病を有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。該方法は、セリアック病を有する哺乳動物に、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインを有する第1のポリペプチドとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインを有する第2のポリペプチドとを含む二重特異性分子を投与する段階を含み得るか、またはそれから本質的になり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。TRBVポリペプチドは、TRBV4ポリペプチド、TRBV6ポリペプチド、TRBV7ポリペプチド、TRBV9ポリペプチド、TRBV20、またはTRBV29ポリペプチドであり得、かつT細胞共受容体ポリペプチドは、CD3ポリペプチドであり得る。TRBVポリペプチドは、TRBV6-1ポリペプチド、TRBV7-2ポリペプチド、TRBV9-1ポリペプチド、TRBV20-1ポリペプチド、またはTRBV29-1ポリペプチドであり得、かつT細胞共受容体ポリペプチドは、CD3ポリペプチドであり得る。
特に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価な方法および材料を、本発明を実施するために使用できるが、好適な方法および材料を後述する。すべての刊行物、特許出願、特許、および本明細書において言及される他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含め本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は、例示的なものにすぎず、限定を意図するものではない。
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
詳細な説明
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料を提供する。いくつかの場合に、本文書は、T細胞がんを治療するために使用できる二重特異性分子を提供する。例えば、本文書は、第1の抗原結合ドメイン(例えば、第1のscFv)がTRBVポリペプチドに結合でき、第2の抗原結合ドメイン(例えば、第2のscFv)がT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる、少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子を提供し、これを使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。本文書はまた、T細胞がんを治療するための方法も提供する。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物)を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)は、哺乳動物内のT細胞を活性化して、二重特異性分子によって標的化できるTRBVポリペプチドを発現するT細胞を標的化(例えば、標的化かつ破壊)することができる。例えば、本明細書に提供される二重特異性分子によって標的化できるT細胞共受容体ポリペプチドを発現するT細胞は、活性化されて、二重特異性分子によって標的化できるTRBVポリペプチドを発現するT細胞(例えば、がん性T細胞)を標的化(例えば、標的化かつ破壊)することができる。
本文書は、T細胞がんを治療するための方法および材料を提供する。いくつかの場合に、本文書は、T細胞がんを治療するために使用できる二重特異性分子を提供する。例えば、本文書は、第1の抗原結合ドメイン(例えば、第1のscFv)がTRBVポリペプチドに結合でき、第2の抗原結合ドメイン(例えば、第2のscFv)がT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる、少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子を提供し、これを使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。本文書はまた、T細胞がんを治療するための方法も提供する。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物)を、T細胞がんを有する哺乳動物に投与して、哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)は、哺乳動物内のT細胞を活性化して、二重特異性分子によって標的化できるTRBVポリペプチドを発現するT細胞を標的化(例えば、標的化かつ破壊)することができる。例えば、本明細書に提供される二重特異性分子によって標的化できるT細胞共受容体ポリペプチドを発現するT細胞は、活性化されて、二重特異性分子によって標的化できるTRBVポリペプチドを発現するT細胞(例えば、がん性T細胞)を標的化(例えば、標的化かつ破壊)することができる。
任意の適切な哺乳動物(例えば、T細胞がんを有する哺乳動物)を本明細書に記載するように治療することができる。例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル)、ウマ、ウシ種、ブタ種、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを本明細書に記載するように治療することができる。いくつかの場合に、T細胞がんを有するヒトに、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を投与することができる。
本明細書に記載される材料および方法を使用して、任意の種類のT細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、1つまたは複数の固形腫瘍を含み得る。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、血液がんであり得る。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、原発がんであり得る。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、転移がんであり得る。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、難治性がんであり得る。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、非ホジキンリンパ腫であり得る。いくつかの場合に、本明細書に記載するように治療されるT細胞がんは、ホジキンリンパ腫であり得る。本明細書に記載するように治療することができるT細胞がんの例は、非限定的に、ALL、PTCL、AITL、T-PLL、ATLL、EATL、MEITL、FTCL、節性PTCL、CTCL、ALCL、T-LGL、NKTL、および肝脾T細胞リンパ腫を含む。
いくつかの場合に、本明細書に提供される材料および方法を使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)内に存在するがん細胞の数を減少または排除することができる。例えば、それを必要とする哺乳動物(例えば、T細胞がんを有する哺乳動物)に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を投与して、哺乳動物内に存在するがん細胞の数を減少または排除することができる。例えば、本明細書に記載される材料および方法を使用して、がんを有する哺乳動物内に存在するがん細胞の数を、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のパーセント減少させることができる。例えば、本明細書に記載される材料および方法を使用して、がんを有する哺乳動物内に存在する1つまたは複数の腫瘍のサイズ(例えば、体積)を、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のパーセント減少させることができる。いくつかの場合に、治療を受けている哺乳動物内に存在するがん細胞の数をモニタリングすることができる。任意の適切な方法を使用して、哺乳動物内に存在するがん細胞の数が減少したか否かを判定することができる。例えば、イメージング技術を使用して、哺乳動物内に存在するがん細胞の数を評価することができる。
いくつかの場合に、本明細書に提供される材料および方法を使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)の生存期間を改善することができる。例えば、それを必要とする哺乳動物(例えば、T細胞がんを有する哺乳動物)に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を投与して、哺乳動物の生存期間を改善することができる。例えば、本明細書に記載される材料および方法を使用して、がんを有する哺乳動物の生存期間を、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のパーセント改善することができる。例えば、本明細書に記載される材料および方法を使用して、がんを有する哺乳動物の生存期間を、例えば、少なくとも6ヶ月(例えば、約6ヶ月、約8ヶ月、約10ヶ月、約1年、約1.5年、約2年、約2.5年、約3年、約4年、約5年、またはそれ以上)改善することができる。
いくつかの場合に、それを必要とする哺乳動物(例えば、T細胞がんを有する哺乳動物)に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)が投与されたとき、哺乳動物内の正常T細胞の大部分を保存することができる。例えば、本明細書に記載される材料および方法を使用して、本明細書に記載するようにT細胞がんを有する哺乳動物を、例えば、哺乳動物内の正常(例えば、非がん性)T細胞の50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のパーセントを保存しながら、治療することができる。いくつかの場合に、哺乳動物に本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子が投与されたとき、哺乳動物内の正常(例えば、非がん性)T細胞の約75パーセント~約100パーセント(例えば、約75パーセント~約99パーセント、約75パーセント~約95パーセント、約75パーセント~約93パーセント、約75パーセント~約90パーセント、約75パーセント~約85パーセント、約80パーセント~約100パーセント、約85パーセント~約100パーセント、約90パーセント~約100パーセント、または約95パーセント~約100パーセント)を保存することができる。
いくつかの場合に、本明細書に記載される方法はまた、哺乳動物がT細胞がんを有することを特定する工程を含むこともできる。哺乳動物がT細胞がんを有することを特定するための方法の例は、非限定的に、身体検査、臨床検査(例えば、血液および/または尿)、生検、画像検査(例えば、X線、PET/CT、MRI、および/または超音波検査)、核医学検査(例えば、骨スキャン)、内視鏡検査、および/または遺伝子検査を含む。いったんT細胞がんを有することが特定されたら、哺乳動物に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を投与するかまたは自分で投与するように指示することができる。
任意の適切な二重特異性分子を、本明細書に記載するように哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。いくつかの場合に、二重特異性分子は、第1の抗原結合ドメイン(例えば、第1のscFv)がTRBVポリペプチドに結合でき、第2の抗原結合ドメイン(例えば、第2のscFv)がT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる、少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、または4つ)の抗原結合ドメインを含み得る。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子は、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含み得る。
本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第1の抗原結合ドメインは、任意の適切な種類の抗原結合ドメインであり得る。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第1の抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域(VL)および免疫グロブリン重鎖の可変領域(VH)を含み得る。例えば、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第1の抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖からの第1の相補性決定領域(CDR)(VL CDR1)、免疫グロブリン軽鎖からの第2のCDR(VL CDR2)、および免疫グロブリン軽鎖からの第3のCDR(VL CDR3)、免疫グロブリン重鎖からの第1のCDR(VH CDR1)、免疫グロブリン重鎖からの第2のCDR(VH CDR2)、および免疫グロブリン重鎖からの第3のCDR(VH CDR2)を含み得る。本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインとして使用できる抗原結合ドメインの例は、非限定的に、単鎖可変断片(scFv)、抗原結合断片(Fab)、F(ab')2断片、およびその生物学的に活性な断片(例えば、TRBVポリペプチドなどの標的分子に結合する能力を保持する断片)を含む。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインとして使用できる抗原結合ドメインは、scFvであり得る。
本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第1の抗原結合ドメインは、任意の適切なTRBVに結合することができる。本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインによって標的化できるTRBVの例は、非限定的に、TRBV2ポリペプチド、TRBV3-1ポリペプチド、TRBV4-1ポリペプチド、TRBV4-2ポリペプチド、TRBV4-3ポリペプチド、TRBV5-1ポリペプチド、TRBV5-4ポリペプチド、TRBV5-5ポリペプチド、TRBV5-6ポリペプチド、TRBV5-8ポリペプチド、TRBV6-1ポリペプチド、TRBV6-2ポリペプチド、TRBV6-3ポリペプチド、TRBV6-4ポリペプチド、TRBV6-5ポリペプチド、TRBV6-6ポリペプチド、TRBV6-8ポリペプチド、TRBV6-9ポリペプチド、TRBV7-2ポリペプチド、TRBV7-3ポリペプチド、TRBV7-4ポリペプチド、TRBV7-6ポリペプチド、TRBV7-7ポリペプチド、TRBV7-8ポリペプチド、TRBV7-9ポリペプチド、TRBV9ポリペプチド、TRBV10-1ポリペプチド、TRBV10-2ポリペプチド、TRBV10-3ポリペプチド、TRBV11-1ポリペプチド、TRBV11-2ポリペプチド、TRBV11-3ポリペプチド、TRBV12-2ポリペプチド、TRBV12-3ポリペプチド、TRBV12-4ポリペプチド、TRBV12-5ポリペプチド、TRBV13ポリペプチド、TRBV14ポリペプチド、TRBV15ポリペプチド、TRBV16ポリペプチド、TRBV18ポリペプチド、TRBV19ポリペプチド、TRBV20-1ポリペプチド、TRBV24-1ポリペプチド、TRBV25-1ポリペプチド、TRBV27 TRBV28ポリペプチド、TRBV29-1ポリペプチド、およびTRBV30ポリペプチドを含む。いくつかの場合に、TRBVに結合する第1の抗原結合ドメインは、そのTRBVに特異的である。例えば、TRBVに結合する第1の抗原結合ドメインは、そのTRBVに、約2nM~約30nM(例えば、約2nM~約25nM、約2nM~約20nM、約2nM~約15nM、約2nM~約10nM、約2nM~約5nM、約5nM~約30nM、約10nM~約30nM、約15nM~約30nM、約20nM~約30nM、約25nM~約30nM、約2.6nM~約25.2nM、約5nM~約20nM、約10nM~約15nM、約5nM~約10nM、約15nM~約20nM、または約20nM~約25nM)の解離定数(KD)を有する親和性で結合することができる。いくつかの場合に、TRBVに特異的に結合する第1の抗原結合ドメインは、異なるTRBVに結合しない(または実質的に結合しない)。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインは、他の箇所に記載されているようなものであり得る(例えば、Wang et al., Nat. Genet., 47, 1426-1434 (2015);およびde Masson et al., Sci. Transl. Med., 10, (2018)を参照のこと)。
いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第1の抗原結合ドメインは、TRBV5-5ポリペプチドに結合することができる。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、以下に示すCDRの各々を含み得る:
いくつかの場合に、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。いくつかの場合に、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:39に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。いくつかの場合に、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:39に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第1の抗原結合ドメインは、TRBV12ポリペプチドに結合することができる。例えば、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、以下に示すCDRの各々を含み得る:
いくつかの場合に、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。例えば、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:40に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。いくつかの場合に、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:14に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。例えば、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:41に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。いくつかの場合に、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:14に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、TRBV12ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。例えば、TRBV5-5ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:40に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:41に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第1の抗原結合ドメインは、他の箇所に記載されているようなものであり得る(例えば、Beta Mark TCR Vbeta Repertoire Kit, 25 Tests, RUO, Package insert. Beckman Coulter Life Sciences, Technical Document (2009);および米国特許第5,861,155号、例えば、図1を参照のこと)。
本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第2の抗原結合ドメインは、任意の適切な種類の抗原結合ドメインであり得る。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第2の抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域(VL)および免疫グロブリン重鎖の可変領域(VH)を含み得る。例えば、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第2の抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖からの第1の相補性決定領域(CDR)(VL CDR1)、免疫グロブリン軽鎖からの第2のCDR(VL CDR2)、および免疫グロブリン軽鎖からの第3のCDR(VL CDR3)、免疫グロブリン重鎖からの第1のCDR(VH CDR1)、免疫グロブリン重鎖からの第2のCDR(VH CDR2)、および免疫グロブリン重鎖からの第3のCDR(VH CDR2)を含み得る。本明細書に提供される二重特異性分子中の第2の抗原結合ドメインとして使用できる抗原結合ドメインの例は、非限定的に、scFv、Fab、F(ab')2断片、およびその生物学的に活性な断片(例えば、T細胞共受容体ポリペプチドなどの標的分子に結合する能力を保持する断片)を含む。いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子中の第2の抗原結合ドメインとして使用できる抗原結合ドメインは、scFvであり得る。
本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第2の抗原結合ドメインは、任意の適切なT細胞共受容体ポリペプチドに結合することができる。本明細書に提供される二重特異性分子中の第2の抗原結合ドメインによって標的化できるT細胞共受容体ポリペプチドの例は、非限定的に、CD3ポリペプチドおよびT細胞受容体ポリペプチドを含む。
いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子において使用できる第2の抗原結合ドメインは、CD3ポリペプチドに結合することができる。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、以下に示すCDRの各々の1つを含み得る:
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:19に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:44に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:48に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:51に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:61に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:45に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:49に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:52に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:63に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:46に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:50に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:53に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:65に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:47に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:48に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:51に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:67に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:56に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:59に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:62に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:56に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:59に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:64に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:55に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:57に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:60に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:66に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:58に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:59に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:68に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:19に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:42に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:43に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:44に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:48に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:51に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:56に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:59に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:61に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:62に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:45に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:49に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:52に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:56に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:59に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:63に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:64に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:46に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:50に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:53に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:55に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:57に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:60に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:65に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:66に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:47に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、SEQ ID NO:48に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR2、およびSEQ ID NO:51に示されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を有する軽鎖を含み得、かつ、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、SEQ ID NO:58に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR2、およびSEQ ID NO:59に示されるアミノ酸配列を含むVH CDR3を有する重鎖を含み得る。例えば、CD3ポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:67に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得、かつSEQ ID NO:68に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第2の抗原結合ドメインは、他の箇所に記載されているようなものであり得る(例えば、Zhu et al., Journal of Immunology, 155:1903-1910 (1995);およびJunttila et al., Cancer Research, 74:5561-5571 (2014)を参照のこと)。
いくつかの場合に、本明細書に提供される二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)中の第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインは、リンカー(例えば、ポリペプチドリンカー)を介して連結することができる。リンカーは、任意の適切な数のアミノ酸を含み得る。例えば、リンカーは、約5個のアミノ酸~約20個のアミノ酸(例えば、約5個のアミノ酸~約18個のアミノ酸、約5個のアミノ酸~約15個のアミノ酸、約5個のアミノ酸~約12個のアミノ酸、約5個のアミノ酸~約10個のアミノ酸、約5個のアミノ酸~約8個のアミノ酸、約7個のアミノ酸~約20個のアミノ酸、約10個のアミノ酸~約20個のアミノ酸、約12個のアミノ酸~約20個のアミノ酸、約16個のアミノ酸~約20個のアミノ酸、約8個のアミノ酸~約16個のアミノ酸、約10個のアミノ酸~約12個のアミノ酸、約8個のアミノ酸~約12個のアミノ酸、約10個のアミノ酸~約15個のアミノ酸、または約12個のアミノ酸~約16個のアミノ酸)を含み得る。いくつかの場合に、リンカーは、二重特異性分子の可動性を変化させることができる。いくつかの場合に、リンカーは、二重特異性分子の溶解性を変化させることができる。リンカーは、任意の適切なアミノ酸を含み得る。いくつかの場合に、リンカーは、グリシンリッチリンカーであり得る。いくつかの場合に、リンカーは、セリンおよび/またはトレオニンリッチリンカーであり得る。リンカーは、本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインを任意の順序で連結することができる。例えば、リンカーは、本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインのN末端を二重特異性分子中の第2の抗原結合ドメインのC末端と接続することができ、またはその反対も同様である。本明細書に提供される二重特異性分子中の第1の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインを接続するために使用できるリンカーの例は、非限定的に、GGGGSリンカー(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)3リンカー(SEQ ID NO:26)、および
を含む。
を含む。
いくつかの場合に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)は、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与するための組成物(例えば、薬学的組成物)に製剤化することができる。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子は、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)に投与するための薬学的に許容される組成物に製剤化することができる。いくつかの場合に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体(添加剤)、賦形剤および/または希釈剤と一緒に製剤化することができる。本明細書に記載される組成物において使用できる薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤の例は、非限定的に、スクロース、ラクトース、デンプン(例えば、グリコール酸デンプン)、セルロース、セルロース誘導体(例えば、変性セルロース、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)およびセルロースエーテルヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)のような微結晶セルロースおよびセルロースエーテル)、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン、ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、架橋ポリビニルピロリドン(クロスポビドン)、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックコポリマー、および架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム(クロスカルメロースナトリウム))、酸化チタン、アゾ染料、シリカゲル、フュームドシリカ、タルク、炭酸マグネシウム、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸、抗酸化物質(例えば、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、パルミチン酸レチニル、およびセレン)、クエン酸、クエン酸ナトリウム、パラベン(例えば、メチルパラベンおよびプロピルパラベン)、ワセリン、ジメチルスルホキシド、鉱油、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、水、塩または電解質(例えば、食塩水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および亜鉛塩)、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリアクリレート、ロウ、羊毛脂、およびレシチンを含む。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を含有する組成物(例えば、薬学的組成物)は、任意の適切な剤形に製剤化することができる。剤形の例は、限定されないが、丸剤、カプセル剤、錠剤、ゲル剤、液体、懸濁液、溶液(例えば、滅菌溶液)、持続放出製剤、および遅延放出製剤を含む固体または液体形態を含む。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を含有する組成物(例えば、薬学的組成物)は、経口または非経口(例えば、局部、皮下、静脈内、腹腔内、髄腔内、および心室内)投与用に設計することができる。経口投与される場合、組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態であり得る。非経口投与に適した組成物は、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤および製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含有できる水性および非水性の滅菌注射用液剤;ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁剤を含む。製剤は、単位用量または多用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけで済むフリーズドライ(凍結乾燥)状態で貯蔵されてよい。滅菌粉剤、顆粒剤および錠剤から即時注射用液剤および懸濁剤が調製されてもよい。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を含有する組成物(例えば、薬学的組成物)は、局所または全身に投与することができる。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物は、静脈内注射によって哺乳動物(例えば、ヒト)に全身投与することができる。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物は、皮下注射によって哺乳動物(例えば、ヒト)に全身投与することができる。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)の有効量(例えば、有効用量)は、T細胞がんの重症度、投与の経路、対象の年齢および全般的な健康状態、賦形剤の使用、他の薬剤の使用などの他の治療的処置との同時使用の可能性、ならびに/または治療している医師の判断に応じて変動し得る。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を含有する組成物(例えば、薬学的組成物)の有効量は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなくT細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療できる任意の量であり得る。本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子の有効量は、任意の適切な量であり得る。有効量は、一定のままであり得、または哺乳動物の治療に対する応答に応じてスライディングスケールもしくは可変用量として調整することができる。様々な要因が、特定の用途に使用される実際の有効量に影響を及ぼし得る。例えば、投与の頻度、治療の継続期間、複数の治療薬の使用、投与の経路、および病態(例えば、T細胞がん)の重症度により、投与される実際の有効量の増加または減少が必要となり得る。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を含有する組成物(例えば、薬学的組成物)の投与の頻度は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなくT細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療できる任意の頻度であり得る。例えば、投与の頻度は、1日1回、週1回、2週間毎に1回、または4週間毎に1回であり得る。いくつかの場合に、投与は、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物の連続注入を含み得る。投与の頻度は、一定のままであり得、または治療の継続期間の間に変動可能である。本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を含有する組成物を用いた治療コースは、休止期間を含み得る。有効量と同様に、様々な要因が、特定の用途に使用される実際の投与の頻度に影響を及ぼし得る。例えば、有効量、治療の継続期間、複数の治療薬の使用、投与の経路、および病態(例えば、T細胞がん)の重症度により、投与頻度の増加または減少が必要となり得る。
本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を含有する組成物(例えば、薬学的組成物)を投与するための有効継続期間は、哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなくT細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療する任意の継続期間であり得る。例えば、有効継続期間は、数日から数週間、数ヶ月または数年まで変動し得る。いくつかの場合に、哺乳動物の治療のための有効継続期間は、約1ヶ月から約10年までの継続期間範囲にあり得る。複数の要因が、特定の治療に使用される実際の有効継続期間に影響を及ぼし得る。例えば、有効継続期間は、投与の頻度、有効量、複数の治療薬の使用、投与の経路、および治療を受けている病態(例えば、T細胞がん)の重症度と共に変動し得る。
いくつかの場合に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を単一の活性薬剤として使用して、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。
いくつかの場合に、本明細書に記載される方法および材料は、T細胞がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療するために使用される1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上)の追加の治療剤を含み得る。例えば、それを必要とする哺乳動物(例えば、T細胞がんを有する哺乳動物)に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を1つまたは複数の抗がん剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの場合に、抗がん剤は、アルキル化剤であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、白金化合物であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、タキサンであり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)作動薬であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、抗エストロゲン剤であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、アロマターゼ阻害剤であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、血管新生阻害剤であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、ポリ(ADP)-リボースポリメラーゼ(PARP)阻害剤であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、トポイソメラーゼ阻害剤であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、コルチコステロイドであり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、抗体であり得る。いくつかの場合に、抗がん剤は、抗体薬物コンジュゲートであり得る。抗がん剤の例は、非限定的に、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、nab-パクリタキセル、アルトレタミン、カペシタビン、シクロホスファミド、エトポシド(vp-16)、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン(cpt-11)、メルファラン、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、ゴセレリン、ロイプロリド、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、ベバシズマブ、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン(例えば、リポソーマルドキソルビシン)、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、モガムリズマブ、ブレンツキシマブ、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合に、1つまたは複数の追加の治療剤は、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子と一緒に(例えば、単一の組成物で)投与することができる。いくつかの場合に、1つまたは複数の追加の治療剤は、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子と独立して投与することができる。1つまたは複数の追加の治療剤が本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子と独立して投与されるとき、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を1番目に投与し、1つまたは複数の追加の治療剤を2番目に投与することができ、またはその反対も同様である。
いくつかの場合に、本明細書に記載される方法および材料は、T細胞がんを治療するのに有効な1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上)の追加の治療(例えば、治療的介入)を含み得る。例えば、それを必要とする哺乳動物(例えば、T細胞がんを有する哺乳動物)に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を1つまたは複数の治療的介入と組み合わせて投与することができる。T細胞がんを治療するために本明細書に記載するように使用できる治療的介入の例は、非限定的に、がん手術、放射線療法、化学療法、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合に、T細胞がんを治療するのに有効な1つまたは複数の追加の治療は、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子の投与と同時に実施することができる。いくつかの場合に、T細胞がんを治療するのに有効な1つまたは複数の追加の治療は、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子の投与の前および/または後に実施することができる。
いくつかの場合に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を使用して、がん以外の疾患または障害を有する哺乳動物を治療することができる。例えば、クローン性T細胞増大に関連するT細胞がん以外の疾患、障害または病態を有する哺乳動物に、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を投与することができる。いくつかの場合に、クローン性T細胞増大に関連するT細胞がん以外の疾患、障害または病態は、自己免疫疾患であり得る。いくつかの場合に、クローン性T細胞増大に関連するT細胞がん以外の疾患、障害または病態は、移植拒絶反応に関連し得る。本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子を使用して標的化できるクローン性T細胞増大に関連する疾患および障害の例は、非限定的に、移植片対宿主病(GVHD)、セリアック病、および多発性硬化症を含む。
いくつかの場合に、本明細書に記載される材料および方法を使用して、セリアック病を有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療することができる。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数の二重特異性分子(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子)を、セリアック病を有する哺乳動物(例えば、ヒト)に投与して、哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合に、セリアック病に関連するTRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインとT細胞共受容体ポリペプチド(例えば、CD3ポリペプチド)に結合できる第2の抗原結合ドメインとを含む二重特異性分子を、セリアック病を有する哺乳動物(例えば、ヒト)に投与して、哺乳動物を治療することができる。本明細書に提供される二重特異性分子がセリアック病を有する哺乳動物を治療するために使用されるいくつかの場合、二重特異性分子の第1の抗原結合ドメインが、TRBV4、TRBV6、TRBV7、TRBV9、TRBV20、およびTRBV29からなる群より選択されるTRBVポリペプチドに結合でき、かつ第2の抗原結合ドメインが、T細胞共受容体ポリペプチド(例えば、CD3ポリペプチド)に結合できる。本明細書に提供される二重特異性分子がセリアック病を有する哺乳動物を治療するために使用されるいくつかの場合、二重特異性分子の第1の抗原結合ドメインが、TRBV6-1、TRBV7-2、TRBV9-1、TRBV20-1、およびTRBV29-1からなる群より選択されるTRBVポリペプチドに結合でき、かつ第2の抗原結合ドメインが、T細胞共受容体ポリペプチド(例えば、CD3ポリペプチド)に結合できる。
いくつかの場合に、本明細書に記載される第1の抗原結合ドメイン(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメイン)を、T細胞(CAR T細胞)上に存在し得るキメラ抗原受容体(CAR)中に含めることができる。例えば、TRBVポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインを含むCAR T細胞を使用して、T細胞がんを有する哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合に、T細胞がんを有する哺乳動物に、本明細書に提供されるTRBVポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインを含むCAR T細胞を投与して、哺乳動物を治療することができる。TRBVポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインを含むCAR T細胞は、任意の種類のCAR T細胞療法において使用することができる。CAR T細胞療法は、他の箇所に記載されているようなものを含み得る(例えば、Ali et al., Blood, 128(13):1688-700 (2016);Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388-98 (2013);Porter et al., N. Engl. J. Med., 365(8):725-33 (2011);およびMaciocia et al., Nat. Med., 23(12):1416-1423 (2017)を参照のこと)。
いくつかの場合に、本明細書に記載される第1の抗原結合ドメイン(例えば、TRBVポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメイン)を、抗体薬物コンジュゲート(ADC)中に含めることができる。例えば、TRBVポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインを含むADCを使用して、T細胞がんを有する哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合に、T細胞がんを有する哺乳動物に、本明細書に提供されるTRBVポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインを含むADCを投与して、哺乳動物を治療することができる。TRBVポリペプチドに結合できる抗原結合ドメインを含むADCは、任意の種類の薬物を含み得る。ADCにおいて使用できる薬物は、他の箇所に記載されているようなものを含み得る(例えば、Younes et al., Lancet Oncol., 14(13):1348-56 (2013);Hamblett et al., Clin. Cancer. Res., 10(20):7063-70 (2004);およびLewis Phillips et al., Cancer Res., 68(22):9280-90 (2008)を参照のこと)。
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1:T細胞がんの治療のためのTCRベータ鎖指向性二重特異性抗体
この実施例は、T細胞がんの治療のためのTRBC標的化BsAbおよび2つの異なるTRBV標的化BsAbの作製および評価を説明する。TRBC標的化BsAbは、双指向性T細胞殺傷に起因してT細胞がんと圧倒的多数の健康なヒト(正常)T細胞の両方を根絶し得る。TRBV標的化BsAbは、正常T細胞の大部分を保存しながらインビトロおよびインビボでがん性T細胞を枯渇させることができる。
この実施例は、T細胞がんの治療のためのTRBC標的化BsAbおよび2つの異なるTRBV標的化BsAbの作製および評価を説明する。TRBC標的化BsAbは、双指向性T細胞殺傷に起因してT細胞がんと圧倒的多数の健康なヒト(正常)T細胞の両方を根絶し得る。TRBV標的化BsAbは、正常T細胞の大部分を保存しながらインビトロおよびインビボでがん性T細胞を枯渇させることができる。
結果
正常T細胞のBsAb標的化
抗TRBV5-5および抗TRBV12 scFv配列を使用して、それぞれTRBV5-5+またはTRBV12+ T細胞の選択的標的化のための抗TRBV5-5および抗TRBV12 BsAb(以降「α-V5」および「α-V12」と表わされる)を作製した(図1B、図7A、および表1)。同様に、TRBC1+ T細胞の選択的標的化のための抗TRBC1 BsAb(以降「α-C1」と表わされる)を作製した(図1Bおよび表1)。分析クロマトグラフィーは、>99%の純度の単量体BsAbを示した(図7B、C)。α-V12およびα-V5の熱安定性を、示差走査蛍光定量法を使用して評価した。α-V5は、78℃の単一の融解温度(Tm)を提示し、α-V12は、59℃および77℃の2つのTmを示した(図7D、E)。これらのデータは、α-V5について、抗TRBV5-5 scFvと抗CD3 scFvの両方が78℃で変性する一方で、α-V12について、抗TRBV12 scFvが59℃で変性し、抗CD3 scFvが77℃で変性することを示唆している。正常ヒトT細胞の1.5~2%および3.5%~5%が、それぞれTRBV5-5およびTRBV12を発現することが見いだされた(図1C、D)。およそ35~45%のヒトT細胞がTRBC1を発現し、残りがTRBC2を発現する(図1C、E)。健常者由来のT細胞のα-V5およびα-V12処置へのインビトロ曝露は、それぞれ、TRBV5-5+およびTRBV12+細胞の完全な喪失をもたらした(図1C、Dおよび図8A)。同様に、健常者由来のT細胞のα-C1への曝露は、TRBC1+ T細胞の実質的な喪失をもたらした(図1C、Eおよび図8B)。しかしながら、TRBVおよびTRBC特異的BsAbによって媒介される非標的T細胞の喪失には大きな違いがあった。α-V5 BsAbは、TRBV5-5を発現しないT細胞の14.1%(平均)を枯渇させ、α-V12は、TRBV12を発現しないT細胞の13.3%(平均)を根絶した(図1C)。これに対して、α-C1は、TRBC1を発現しないT細胞の80.0%(平均)を根絶した(図1C)。結果として、α-C1は、全T細胞の大部分の枯渇をもたらした一方で、α-V5またはα-V12は、T細胞の大部分を保存した(図1C)。BsAb媒介性のTCR内在化またはTCRエピトープブロッキングが、その後の異なるT細胞亜型の抗体に基づく解析を妨害しないことを確認するために、CellTrace Violetで染色した標的細胞(TRBV5+、TRBV12+またはTRBC1+ T細胞)を利用した。α-V5およびα-V12曝露は、CellTrace Violetで染色したTRBV5+およびTRBV12+細胞の枯渇を導き(図8C)、α-C1は、TRBC1+細胞とTRBC2+細胞の両方の実質的な喪失を引き起こした(図8D、E)。
正常T細胞のBsAb標的化
抗TRBV5-5および抗TRBV12 scFv配列を使用して、それぞれTRBV5-5+またはTRBV12+ T細胞の選択的標的化のための抗TRBV5-5および抗TRBV12 BsAb(以降「α-V5」および「α-V12」と表わされる)を作製した(図1B、図7A、および表1)。同様に、TRBC1+ T細胞の選択的標的化のための抗TRBC1 BsAb(以降「α-C1」と表わされる)を作製した(図1Bおよび表1)。分析クロマトグラフィーは、>99%の純度の単量体BsAbを示した(図7B、C)。α-V12およびα-V5の熱安定性を、示差走査蛍光定量法を使用して評価した。α-V5は、78℃の単一の融解温度(Tm)を提示し、α-V12は、59℃および77℃の2つのTmを示した(図7D、E)。これらのデータは、α-V5について、抗TRBV5-5 scFvと抗CD3 scFvの両方が78℃で変性する一方で、α-V12について、抗TRBV12 scFvが59℃で変性し、抗CD3 scFvが77℃で変性することを示唆している。正常ヒトT細胞の1.5~2%および3.5%~5%が、それぞれTRBV5-5およびTRBV12を発現することが見いだされた(図1C、D)。およそ35~45%のヒトT細胞がTRBC1を発現し、残りがTRBC2を発現する(図1C、E)。健常者由来のT細胞のα-V5およびα-V12処置へのインビトロ曝露は、それぞれ、TRBV5-5+およびTRBV12+細胞の完全な喪失をもたらした(図1C、Dおよび図8A)。同様に、健常者由来のT細胞のα-C1への曝露は、TRBC1+ T細胞の実質的な喪失をもたらした(図1C、Eおよび図8B)。しかしながら、TRBVおよびTRBC特異的BsAbによって媒介される非標的T細胞の喪失には大きな違いがあった。α-V5 BsAbは、TRBV5-5を発現しないT細胞の14.1%(平均)を枯渇させ、α-V12は、TRBV12を発現しないT細胞の13.3%(平均)を根絶した(図1C)。これに対して、α-C1は、TRBC1を発現しないT細胞の80.0%(平均)を根絶した(図1C)。結果として、α-C1は、全T細胞の大部分の枯渇をもたらした一方で、α-V5またはα-V12は、T細胞の大部分を保存した(図1C)。BsAb媒介性のTCR内在化またはTCRエピトープブロッキングが、その後の異なるT細胞亜型の抗体に基づく解析を妨害しないことを確認するために、CellTrace Violetで染色した標的細胞(TRBV5+、TRBV12+またはTRBC1+ T細胞)を利用した。α-V5およびα-V12曝露は、CellTrace Violetで染色したTRBV5+およびTRBV12+細胞の枯渇を導き(図8C)、α-C1は、TRBC1+細胞とTRBC2+細胞の両方の実質的な喪失を引き起こした(図8D、E)。
関連するTRBVまたはTRBCを発現しないT細胞のBsAb標的化の根拠
BsAbが、関連するTRBVまたはTRBC鎖を発現しないT細胞の殺傷をもたらすかどうかを調べるために、TRBC1+細胞をヒトT細胞から枯渇させ、次いで、枯渇T細胞をα-C1に曝露させた。TRBC1を発現するT細胞の枯渇後、α-C1への曝露は、残存するT細胞の統計的に有意な殺傷をもたらさなかった(図8F)。同様に、TRBV5またはTRBV12のいずれかを発現するT細胞の枯渇後、α-V5またはα-V12の曝露は、残存するT細胞の統計的に有意な殺傷をもたらさなかった(図8G)。加えて、TRBV5+またはTRBV12+ T細胞の純粋集団は、それぞれ、α-V5およびα-V12への曝露後にほぼ完全な細胞喪失を経験した(図8H)。これらの結果は、3つすべてのBsAbの効果が、処理したT細胞中に関連するTRBVまたはTRBC鎖が存在することに依存することを示唆した。
BsAbが、関連するTRBVまたはTRBC鎖を発現しないT細胞の殺傷をもたらすかどうかを調べるために、TRBC1+細胞をヒトT細胞から枯渇させ、次いで、枯渇T細胞をα-C1に曝露させた。TRBC1を発現するT細胞の枯渇後、α-C1への曝露は、残存するT細胞の統計的に有意な殺傷をもたらさなかった(図8F)。同様に、TRBV5またはTRBV12のいずれかを発現するT細胞の枯渇後、α-V5またはα-V12の曝露は、残存するT細胞の統計的に有意な殺傷をもたらさなかった(図8G)。加えて、TRBV5+またはTRBV12+ T細胞の純粋集団は、それぞれ、α-V5およびα-V12への曝露後にほぼ完全な細胞喪失を経験した(図8H)。これらの結果は、3つすべてのBsAbの効果が、処理したT細胞中に関連するTRBVまたはTRBC鎖が存在することに依存することを示唆した。
例示的なBsAb分子(図1B)は、TRBCまたはTRBV領域(標的T細胞サブセットによってのみ発現される)と相互作用する1つのscFvアームと、CD3εサブユニット(すべてのT細胞上に発現される)と相互作用するもう1つのscFvアームとから構成され得る。次に、そのような例示的なBsAb分子が、双指向性殺傷を誘導する(この場合、BsAbによる架橋が、「エフェクター」T細胞と「標的」T細胞の両方の活性化を誘導し、それにより、架橋された「エフェクター」T細胞(任意のTCRを発現する;図2A)を殺傷する)ことができるかどうかを調べた。例えば、α-C1架橋は、TRBC1+ T細胞を活性化し、コンジュゲートされたTRBC2+ T細胞を殺傷できるだろう。これは、観察された完全に近いT細胞枯渇につながる、TRBC1発現T細胞とTRBC2発現T細胞の両方の殺傷をもたらすだろう(図1C)。同様に、α-V5またはα-V12は、TCRV5-5またはV12を発現しないT細胞の双指向性殺傷をもたらすだろう。これに対して、非T細胞がんを標的とする戦略において使用されるBsAbは、がん細胞表面抗原に対して指向され、標的がん細胞を活性化せず、単一指向性殺傷をもたらす。3つの追加のBsAbを作製した。これらは、上述した同一のTRBVまたはTRBC scFvを使用したが、α-CD3 scFvをα-CD19 scFvで置換した(図2Bおよび表1)。このことで、本発明者らは、TRBC1、TRBV5-5またはTRBV12エンゲージメントがT細胞活性化およびその後のCD19+ B細胞の殺傷に十分であるかどうかを試験できるようになった(図2C)。CD3に対するscFvがCD19特異的scFvにつながれているCD19を標的とする従来のBsAbを、陽性対照として使用した。4つのBsAbのいずれかの存在下で、CD19+標的NALM6 B細胞と正常T細胞との共培養は、インターフェロンガンマ(IFNγ)、インターロイキン2(IL-2)、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)およびインターロイキン10(IL-10)を含むサイトカイン産生をもたらした(図2Dおよび図9B)。それはまた、様々なレベルであるが、標的NALM6 B細胞殺傷(図2E)と一緒に、CD25、誘導性T細胞共刺激(ICOS)、4-1BBを含むT細胞活性化マーカーの発現、およびリンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)、プログラム死1(PD-1)を含む疲弊マーカーの発現をもたらした(図9C)。T細胞のサイトカイン産生およびNALM6 B細胞の細胞傷害性は、NALM6 CD19ノックアウト(図9A)がこれらの効果を取り消したように、NALM6 CD19発現に依存していた(図2D、図9B、および図2E)。BsAbありの場合、野生型NALM6 B細胞とより低レベルのCD19を発現するNALM6 B細胞との間で、IFNγ産生またはNALM6 B細胞の細胞傷害性に違いは観察されなかった(図9A、DおよびE)。これらの効果の特異性を実証するために、BsAbの存在下でNALM6 B細胞と共培養する前に、T細胞プールからTRBC1+、TRBV5+またはTRBV12+ T細胞を枯渇させた。これらの枯渇T細胞は、α-V5-CD19およびα-V12-CD19の存在下でNALM6 B細胞との共培養後にIFNγを生成できないことによって示されるように、不活化されたままであった(図2F)。同様に、枯渇T細胞は、NALM6 B細胞を殺傷できなかった(図2H)。TRBV5およびTRBV12濃縮ヒトT細胞へのα-V5-CD19およびα-V12-CD19の添加は、IFNγ産生および殺傷能をα-CD3-CD19およびα-C1-CD19処理条件のものまで回復させた(図2、GおよびI)。
α-CD3-CD19およびα-C1-CD19への曝露は、α-V5-CD19およびα-V12-CD19への曝露よりもかなり高いIFNγレベルおよびNALM6細胞の細胞傷害性をもたらした。この観察には、2つの考えられる要因がある。第1に、およそ35~45%のヒトT細胞がTRBC1を発現する一方、正常T細胞の1.5%~5%がTRBV5-5またはTRBV12を発現する(図1C、D)。結果として生じるエフェクター対標的(E:T比)は、それゆえ、α-V5-CD19およびα-V12-CD19よりもα-CD3-CD19およびα-C1-CD19を用いたほうがはるかに高い。また、α-CD3およびα-TRBC1 scFvのT細胞活性化能が、α-TRBV5-5またはα-TRBV12 scFvのものよりも高い可能性もあった。この後者の可能性は、α-V5またはα-V12の存在下でTRBV5+またはTRBV12+濃縮T細胞と共培養したNALM6細胞が、α-CD3およびα-C1 BsAbで観察されたものと同程度のIFNγ産生および細胞傷害性をもたらしたという証拠によって排除された(図2、GおよびI)。
同様の実験を実施して、TRBC2を発現するクローン性新生T細胞がTRBC1を発現しなくても、α-C1が、双指向性殺傷を通じてこれらの新生T細胞の死を媒介できることを立証した(図10A~D)。α-C1曝露は、TRBC1+(Jurkat)細胞とTRBC2+(HPB-ALL)細胞の両方に対してIFNγ産生を誘導した(図10C)。TRBC1+ T細胞サブセットの枯渇は、HPB-ALL細胞に対するα-C1誘導性IFNγ産生を制限した(図10C)。フローサイトメトリー解析はまた、非枯渇T細胞を使用してα-C1媒介性のHPB-ALL細胞死を示した一方で、TRBC1+ T細胞枯渇はその効果を減弱した(図10D)。α-C1は、Jurkat細胞上のTRBC1と正常TRBC2+ T細胞上のCD3の架橋によって、残存する正常TRBC2+ T細胞を活性化したので、正常TRBC1+ T細胞の枯渇は、Jurkat細胞に対するα-C1誘導性IFNγ応答(図10C)またはα-C1媒介性Jurkat細胞殺傷(図10D)に影響を与えなかった。強力な双指向性殺傷は、TRBC1、TRBV5-5またはTRBV12を標的とするBsAbによって媒介され得ると結論付けた。TRBV5-5またはV12を標的とするBsAbを使用して、T細胞の大部分を枯渇させることなくこれらの受容体を発現するT細胞を標的化できる理由は、正常T細胞集団中のTRBV5-5+またはTRBV12+細胞の数がTRBC1+細胞の数よりもはるかに少ないからである。
TRBV指向性BsAbは、インビトロでがん細胞に対するT細胞サイトカイン応答を誘導する
ヒトT細胞がん由来細胞株は、再構成されたTCRβ遺伝子を有し、クローン性TRBVを発現する。T-ALL由来Jurkat、HPB-ALLおよびCCRF-CEM T細胞株は、抗CD3抗体で評価されたように細胞表面TCR発現を保持していた一方で、MOLT3細胞はそうでなかったことが観察された(図11A)。JurkatおよびHPB-ALL細胞はまた、表面TRBV12およびTRBV5-5をそれぞれ発現した(図11B)。T細胞悪性腫瘍に対するBsAbの活性を評価するために、正常T細胞を、異なるBsAbの存在下または非存在下でT細胞がん細胞株と共培養した。
ヒトT細胞がん由来細胞株は、再構成されたTCRβ遺伝子を有し、クローン性TRBVを発現する。T-ALL由来Jurkat、HPB-ALLおよびCCRF-CEM T細胞株は、抗CD3抗体で評価されたように細胞表面TCR発現を保持していた一方で、MOLT3細胞はそうでなかったことが観察された(図11A)。JurkatおよびHPB-ALL細胞はまた、表面TRBV12およびTRBV5-5をそれぞれ発現した(図11B)。T細胞悪性腫瘍に対するBsAbの活性を評価するために、正常T細胞を、異なるBsAbの存在下または非存在下でT細胞がん細胞株と共培養した。
いかなるがん細胞も存在しない基準IFNγ産生の増加が、α-C1への曝露後に認められ、α-V5およびα-V12ではより少ない程度に認められた(図3A)。α-V5およびα-V12は、それぞれHPB-ALL(TRBV5-5+)およびJurkat(TRBV12-3)細胞の存在下で、T細胞のIFNγ分泌を基準値より高く増加させた。標的がん細胞の非存在下の基準IFNγ産生が、正常T細胞中に存在するTRBV5-5+およびTRBV12+ T細胞の割合が少ないことによるものであるかを確認するために、BsAbへの曝露前にこれらの細胞を枯渇させた。TRBV5およびTRBV12枯渇T細胞は、それぞれα-V5およびα-V12に応答してIFNγを産生できなかった(図3B)。この実験の対照として、TRBV5-5+およびTRBV12+ T細胞の枯渇が、α-C1 BsAbの存在下でIFNγ産生に影響を与えなかったことが示された(図3B)。加えて、TRBV5枯渇T細胞は、α-V5の存在下でHPB-ALL(TRBV5-5+)細胞と共培養したときにIFNγを分泌した。同様に、α-V12の存在下でJurkat(TRBV12-3+)細胞と共培養したTRBV12枯渇T細胞も、IFNγを分泌した。このことはまた、TRBV枯渇プロセスそれ自体が、正常T細胞の機能喪失をもたらさなかったことを示した。α-V5およびα-V12を介したT細胞活性化は、多機能性であり、IFNγに加え、TNF-α、IL-2、インターロイキン-5(IL-5)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む複数のサイトカインの放出を伴った(図3、CおよびD)。
これらのBsAbの特異性のさらなる対照として、JurkatとHPB-ALLの両細胞株においてCRISPRに基づくTCRアルファおよびベータ定常領域の破壊を使用して同質遺伝子がん細胞を作った。結果として生じたTCRノックアウト(KO)は、細胞表面TRBV12またはTRBV5-5(図11B)および細胞表面CD3発現(図4、CおよびD)の喪失によって確認された。TCR-KO後、HPB-ALL細胞をα-V5の存在下で正常T細胞と共培養したところ、IFNγまたは試験した他の4つのサイトカインの有意な増加は観察されなかった(図3C)。同様に、TCR-KO Jurkat細胞をα-V12の存在下で正常T細胞と共培養した後も、サイトカインの増加はほとんど観察されなかった(図3D)。
TRBV指向性BsAbは、インビトロでがん細胞株を殺傷する
細胞傷害性を評価するために、正常ヒトT細胞を、増加濃度のα-V12またはα-V5 BsAbの存在下でJurkatまたはHPB-ALL細胞と共培養した(図4A、B)。ほぼ完全なJurkatおよびHPB-ALL細胞傷害性が、0.01nM(0.57ng/mL)の濃度のα-V12およびα-V5の両方で観察された。また、がん細胞株を、GFPを発現するように操作した。GFPを発現するJurkat細胞は、α-V12の存在下で正常T細胞と共培養したときに排除された(図4C、Eおよび図12A)。α-V12および正常T細胞への曝露は、TCR-KO Jurkat細胞に対して有意な効果はなかった(図4C、Eおよび図12A)。同様に、GFPを発現するHPB-ALL細胞も、α-V5の存在下で正常T細胞と共培養したときに排除され、この排除は、TCR-KO HPB-ALL細胞では取り消された(図4D、Fおよび図12A)。この実験の別の対照として、α-CD19 BsAbは、正常T細胞とインキュベートしたときに、Jurkat細胞またはHPB-ALL細胞のいずれに対しても効果がなかったことが示された(図4、C~Fおよび図12A)。α-V12はまた、標的Jurkat細胞の存在下で正常ヒトT細胞上の活性化および疲弊マーカーの発現を誘導した(図12B)。同様に、α-V5も、標的HPB-ALL細胞の存在下で正常ヒトT細胞上の活性化および疲弊マーカーの発現を媒介した(図12C)。正常ヒトT細胞からCD4ヘルパーT細胞を枯渇してもα-V12およびα-V5活性の喪失は観察されなかった(図12D、E)。加えて、α-V12およびα-V5の細胞傷害機能は、共培養前にBsAbをヒト血清と96時間インキュベーションした後も保存されていた(図12F)。
細胞傷害性を評価するために、正常ヒトT細胞を、増加濃度のα-V12またはα-V5 BsAbの存在下でJurkatまたはHPB-ALL細胞と共培養した(図4A、B)。ほぼ完全なJurkatおよびHPB-ALL細胞傷害性が、0.01nM(0.57ng/mL)の濃度のα-V12およびα-V5の両方で観察された。また、がん細胞株を、GFPを発現するように操作した。GFPを発現するJurkat細胞は、α-V12の存在下で正常T細胞と共培養したときに排除された(図4C、Eおよび図12A)。α-V12および正常T細胞への曝露は、TCR-KO Jurkat細胞に対して有意な効果はなかった(図4C、Eおよび図12A)。同様に、GFPを発現するHPB-ALL細胞も、α-V5の存在下で正常T細胞と共培養したときに排除され、この排除は、TCR-KO HPB-ALL細胞では取り消された(図4D、Fおよび図12A)。この実験の別の対照として、α-CD19 BsAbは、正常T細胞とインキュベートしたときに、Jurkat細胞またはHPB-ALL細胞のいずれに対しても効果がなかったことが示された(図4、C~Fおよび図12A)。α-V12はまた、標的Jurkat細胞の存在下で正常ヒトT細胞上の活性化および疲弊マーカーの発現を誘導した(図12B)。同様に、α-V5も、標的HPB-ALL細胞の存在下で正常ヒトT細胞上の活性化および疲弊マーカーの発現を媒介した(図12C)。正常ヒトT細胞からCD4ヘルパーT細胞を枯渇してもα-V12およびα-V5活性の喪失は観察されなかった(図12D、E)。加えて、α-V12およびα-V5の細胞傷害機能は、共培養前にBsAbをヒト血清と96時間インキュベーションした後も保存されていた(図12F)。
α-V12が、TRBV12以外のTRBVファミリーを発現するT細胞に影響を与えるかどうかを判定するために、Jurkat細胞と正常T細胞を、上に述べたようにα-CD19またはα-V12の存在下で共培養した。次いで、TRBV遺伝子配列決定を行って、生存している細胞におけるTRBV枯渇の割合を測定した。α-CD19への曝露と比較して、α-V12への曝露後にTRBV12-3レベルの劇的な低下(98.9%)が検出された(図13A)。当然ながら、圧倒的多数のTRBV12-3シグナルは、正常T細胞ではなくJurkat細胞から派生した。36.5%低下したTRBV12-4を除いて、他のTRBVファミリーメンバーは影響を受けなかった(図13A)。HPB-ALL細胞を用いて同様の分析を実施した。α-CD19への曝露後と比較して、α-V5への曝露後にTRBV5-5レベルの劇的な低下(98.3%)が検出された(図13B)。圧倒的多数のTRBV5-5シグナルは、正常T細胞ではなくHPB-ALL細胞から派生した。ここでも91.6%低下したTRBV5-6(図13B)を除いて、他のTRBVファミリーメンバーは依然として影響を受けなかった。α-V5 BsAbにおいて使用されるTRBV5-5指向性scFvの配列は、TRBV5-5抗原に対して最初に生じた抗体に由来し、したがって、TRBV5-5およびTRBV5-6がTRBV5ファミリーメンバー間で最も似ていることを考慮すれば、TRBV5-6発現T細胞がα-V5曝露に影響を受けたことは驚くことではなかった(図14A、B)。TRBV5ファミリーメンバーの配列アラインメントは、アミノ酸残基D20、D81およびL101が、TRBV5-5とTRBV5-6の両方に共通しているが他のTRBV5メンバーとは異なること、および他のTRBV5ファミリーメンバーにおける残基81および101での相違がまた主な電荷差をもたらしたことを明らかにした(図14C)。
TRBV指向性BsAbは、インビトロで患者由来T-ALL細胞を殺傷する
初代悪性細胞をT-ALL患者から収集した。フローサイトメトリーは、2名の患者(患者1および2)が、単クローン性がん細胞の存在を示唆するかなりのTRBV12+集団を有することを特定した(図5A)。α-V12の存在下で正常T細胞と共培養した患者1および2由来のT-ALL細胞は、有意なIFNγ分泌(図5B)、ならびに正常ヒトドナーT細胞上の活性化および疲弊マーカーの発現を導いた(図5C)。HLA-A3発現を使用して、2名の健康なヒトドナーに由来する正常T細胞と患者由来T-ALL細胞とを区別した(図5D)。ドナー2のT細胞(HLA-A3+)と患者1(HLA-A3-)悪性細胞およびα-V12との共培養は、患者由来悪性細胞の枯渇を示した(図5E、F)。同様に、ドナー1(HLA-A3-)T細胞と患者2(HLA-A3+)悪性細胞との共培養もまた、悪性細胞の枯渇を示した。いずれの場合も、正常T細胞の中でTRBV12発現細胞の割合が低いので(図1C、D)、正常ヒトT細胞は、α-V12への曝露に比較的影響を受けなかった(図5E、F)。
初代悪性細胞をT-ALL患者から収集した。フローサイトメトリーは、2名の患者(患者1および2)が、単クローン性がん細胞の存在を示唆するかなりのTRBV12+集団を有することを特定した(図5A)。α-V12の存在下で正常T細胞と共培養した患者1および2由来のT-ALL細胞は、有意なIFNγ分泌(図5B)、ならびに正常ヒトドナーT細胞上の活性化および疲弊マーカーの発現を導いた(図5C)。HLA-A3発現を使用して、2名の健康なヒトドナーに由来する正常T細胞と患者由来T-ALL細胞とを区別した(図5D)。ドナー2のT細胞(HLA-A3+)と患者1(HLA-A3-)悪性細胞およびα-V12との共培養は、患者由来悪性細胞の枯渇を示した(図5E、F)。同様に、ドナー1(HLA-A3-)T細胞と患者2(HLA-A3+)悪性細胞との共培養もまた、悪性細胞の枯渇を示した。いずれの場合も、正常T細胞の中でTRBV12発現細胞の割合が低いので(図1C、D)、正常ヒトT細胞は、α-V12への曝露に比較的影響を受けなかった(図5E、F)。
TRBV指向性BsAbは、インビボでがん細胞を殺傷する
インビボ有効性を評価するために、ルシフェラーゼ発現JurkatまたはHPB-ALLがん細胞をNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスに静脈内注射して、2つの播種性異種移植モデルを確立した(図6、A~C)。また、すべてのマウスに、静脈内注射を介してヒトT細胞を与えた。Jurkatモデルについて、Jurkatおよび正常ヒトT細胞の接種後4日目を開始として腹腔内ポンプを通じα-V12 BsAbを送達したが、そのときすでにJurkat細胞が広範囲に広まっていた(図6、AおよびB)。腹腔内ポンプは、埋め込み後少なくとも2週間、α-V12およびα-V5の有意な血清濃度を維持することができた(図15A)。生物発光イメージング(BLI)は、α-V12で処置したマウスにおいて顕著な腫瘍量低下を示した(図6、BおよびD)。1つはBsAbに対する、1つは細胞に対する、2つの対照を使用して、この低下の特異性を実証した。BsAb対照:Jurkatがんを保有するマウスをα-V12の代わりにα-CD19で処置したとき、BLIによって評価されたように腫瘍量は有意に高かった(図6、BおよびD)。細胞対照:Jurkat TCR-KO細胞に由来する播種性がんを有するマウスの場合、腫瘍量は、α-V12での処置後、WT Jurkat細胞を有するマウスと比較して顕著に高かった(図6、BおよびD)。第2の播種性がんモデルを使用して、これらのインビボ結果の再現性を実証した。実験アプローチは、Jurkat細胞の代わりにHPB-ALL細胞を用い、α-V12の代わりにα-V5を用いた以外は、Jurkat細胞モデルについて記載したものと同一であった(図6A、C)。ここでも、BLIは、α-V5で処置したマウスにおいて顕著な発光減少を示した(図6、CおよびD)。α-CD19またはHPB-ALL TCR-KO細胞に由来する播種性がんを有するマウスでの同様の処置も、Jurkatモデルで観察されたものと似た腫瘍成長を示した(図6、CおよびD)。がん細胞の接種の19日後(BsAb処置を開始した15日後)、マウス血液のフローサイトメトリー解析は、すべての処置群が、正常ヒトT細胞を保持していたことを明らかにした(図6、EおよびF)。加えて、α-CD19処置マウスにおいて循環JurkatおよびHPB-ALL白血病細胞が豊富にあった(図6、EおよびF)。これとは著しく対比して、α-V12およびα-V5処置マウスは、これらの実験において循環白血病細胞の劇的な減少を有していた(図6、EおよびF)。循環白血病細胞のこの減少は、α-V12およびα-V5の両処置マウスの有意な生存有益性に関連していた(図6、GおよびH)。α-CD19処置マウスは、後脚麻痺を発症し、安楽死が必要となった。それぞれα-V12またはα-V5で処置したJurkatまたはHPP-ALLがんを有するマウスは、後脚麻痺を発症しなかった。これらのマウスは最終的に死亡し(図6、GおよびH)、死亡時に典型的な移植片対宿主病(GVHD)の特徴を示した。しかしながら、そのようなアプローチをヒトにおいて使用した場合、T細胞ではなくBsAbのみが投与される必要があるだろう。ヒトT細胞がんにおいて、さらなる課題は、悪性T細胞がしばしば健康なエフェクターT細胞よりも数が多いという点である。より少ない数のヒトエフェクターT細胞がインビボでT細胞腫瘍を十分に根絶できるかどうかを確かめるために、NSGマウスに、0.5×106個のヒトT細胞を2.5×106個の腫瘍細胞(JurkatまたはHPB-ALL細胞)と一緒に注射した(図15B)。BLIは、α-V12とα-V5の両処置で有意な腫瘍量低下を示した(図15C~E)。α-V12およびα-V5処置はまた、上昇したIFNγおよびTNFαサイトカイン産生(図15F、G)を、正常ヒトT細胞上のT細胞活性化および疲弊マーカーの発現と一緒に導いた(図15H、I)。
インビボ有効性を評価するために、ルシフェラーゼ発現JurkatまたはHPB-ALLがん細胞をNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスに静脈内注射して、2つの播種性異種移植モデルを確立した(図6、A~C)。また、すべてのマウスに、静脈内注射を介してヒトT細胞を与えた。Jurkatモデルについて、Jurkatおよび正常ヒトT細胞の接種後4日目を開始として腹腔内ポンプを通じα-V12 BsAbを送達したが、そのときすでにJurkat細胞が広範囲に広まっていた(図6、AおよびB)。腹腔内ポンプは、埋め込み後少なくとも2週間、α-V12およびα-V5の有意な血清濃度を維持することができた(図15A)。生物発光イメージング(BLI)は、α-V12で処置したマウスにおいて顕著な腫瘍量低下を示した(図6、BおよびD)。1つはBsAbに対する、1つは細胞に対する、2つの対照を使用して、この低下の特異性を実証した。BsAb対照:Jurkatがんを保有するマウスをα-V12の代わりにα-CD19で処置したとき、BLIによって評価されたように腫瘍量は有意に高かった(図6、BおよびD)。細胞対照:Jurkat TCR-KO細胞に由来する播種性がんを有するマウスの場合、腫瘍量は、α-V12での処置後、WT Jurkat細胞を有するマウスと比較して顕著に高かった(図6、BおよびD)。第2の播種性がんモデルを使用して、これらのインビボ結果の再現性を実証した。実験アプローチは、Jurkat細胞の代わりにHPB-ALL細胞を用い、α-V12の代わりにα-V5を用いた以外は、Jurkat細胞モデルについて記載したものと同一であった(図6A、C)。ここでも、BLIは、α-V5で処置したマウスにおいて顕著な発光減少を示した(図6、CおよびD)。α-CD19またはHPB-ALL TCR-KO細胞に由来する播種性がんを有するマウスでの同様の処置も、Jurkatモデルで観察されたものと似た腫瘍成長を示した(図6、CおよびD)。がん細胞の接種の19日後(BsAb処置を開始した15日後)、マウス血液のフローサイトメトリー解析は、すべての処置群が、正常ヒトT細胞を保持していたことを明らかにした(図6、EおよびF)。加えて、α-CD19処置マウスにおいて循環JurkatおよびHPB-ALL白血病細胞が豊富にあった(図6、EおよびF)。これとは著しく対比して、α-V12およびα-V5処置マウスは、これらの実験において循環白血病細胞の劇的な減少を有していた(図6、EおよびF)。循環白血病細胞のこの減少は、α-V12およびα-V5の両処置マウスの有意な生存有益性に関連していた(図6、GおよびH)。α-CD19処置マウスは、後脚麻痺を発症し、安楽死が必要となった。それぞれα-V12またはα-V5で処置したJurkatまたはHPP-ALLがんを有するマウスは、後脚麻痺を発症しなかった。これらのマウスは最終的に死亡し(図6、GおよびH)、死亡時に典型的な移植片対宿主病(GVHD)の特徴を示した。しかしながら、そのようなアプローチをヒトにおいて使用した場合、T細胞ではなくBsAbのみが投与される必要があるだろう。ヒトT細胞がんにおいて、さらなる課題は、悪性T細胞がしばしば健康なエフェクターT細胞よりも数が多いという点である。より少ない数のヒトエフェクターT細胞がインビボでT細胞腫瘍を十分に根絶できるかどうかを確かめるために、NSGマウスに、0.5×106個のヒトT細胞を2.5×106個の腫瘍細胞(JurkatまたはHPB-ALL細胞)と一緒に注射した(図15B)。BLIは、α-V12とα-V5の両処置で有意な腫瘍量低下を示した(図15C~E)。α-V12およびα-V5処置はまた、上昇したIFNγおよびTNFαサイトカイン産生(図15F、G)を、正常ヒトT細胞上のT細胞活性化および疲弊マーカーの発現と一緒に導いた(図15H、I)。
これらの結果をまとめると、TRBV標的化BsAbは、正常T細胞の大部分を保存しながら、インビトロおよびインビボでクローン性がん性T細胞を枯渇させることができることが示された。したがって、TRBV標的化BsAbを使用して、治療に関係する免疫抑制を回避しながらT細胞がんを治療することができる。
方法
細胞株および初代ヒトT細胞
Jurkat(Clone E6-1)、CCRF-CEM、MOLT-3(ATCC, Manassas, VA)、HPB-ALL(DSMZ, Germany)およびNALM6細胞を、10% HyCloneウシ胎児血清(FBS, GE Healthcare SH30071.03, Chicago, IL)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を補充したRPMI-1640(ATCC, 30-2001)中で培養した。HEK293FT(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を、10% FBS、2mM GlutaMAX(ThermoFisher Scientific, 35050061)、0.1mM MEM非必須アミノ酸(ThermoFisher Scientific, 11140050)、1%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび500μg/mL ジェネティシン(ThermoFisher Scientific, 10131027)を補充したDMEM(ThermoFisher Scientific, 11995065)中で培養した。白血球アフェレーシス試料(Stem Cell Technologies, Vancouver, BCまたはAstarte Biologics, Bothell, WA)から、Ficoll Paque Plus(GE Healthcare, GE17-1440-02)密度勾配遠心分離法によってPBMCを単離した。15ng/mLの抗ヒトCD3抗体(clone OKT3, BioLegend, San Diego, CA, 317325)またはHuman T-Activator CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher Scientific, 11131D)のいずれかをビーズ:細胞比1:5で3日間添加して、PBMCからヒトT細胞を増大させた。T細胞を、10% FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、100IU/mL組換えヒトIL-2(aldesleukin, Prometheus Therapeutics and Diagnostics, San Diego, CA)および5ng/mL組換えヒトIL-7(BioLegend, 581906)を含むRPMI-1640中で培養した。
細胞株および初代ヒトT細胞
Jurkat(Clone E6-1)、CCRF-CEM、MOLT-3(ATCC, Manassas, VA)、HPB-ALL(DSMZ, Germany)およびNALM6細胞を、10% HyCloneウシ胎児血清(FBS, GE Healthcare SH30071.03, Chicago, IL)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を補充したRPMI-1640(ATCC, 30-2001)中で培養した。HEK293FT(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を、10% FBS、2mM GlutaMAX(ThermoFisher Scientific, 35050061)、0.1mM MEM非必須アミノ酸(ThermoFisher Scientific, 11140050)、1%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび500μg/mL ジェネティシン(ThermoFisher Scientific, 10131027)を補充したDMEM(ThermoFisher Scientific, 11995065)中で培養した。白血球アフェレーシス試料(Stem Cell Technologies, Vancouver, BCまたはAstarte Biologics, Bothell, WA)から、Ficoll Paque Plus(GE Healthcare, GE17-1440-02)密度勾配遠心分離法によってPBMCを単離した。15ng/mLの抗ヒトCD3抗体(clone OKT3, BioLegend, San Diego, CA, 317325)またはHuman T-Activator CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher Scientific, 11131D)のいずれかをビーズ:細胞比1:5で3日間添加して、PBMCからヒトT細胞を増大させた。T細胞を、10% FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、100IU/mL組換えヒトIL-2(aldesleukin, Prometheus Therapeutics and Diagnostics, San Diego, CA)および5ng/mL組換えヒトIL-7(BioLegend, 581906)を含むRPMI-1640中で培養した。
細胞染色、フローサイトメトリー、および細胞ソーティング
細胞をフロー染色緩衝液(0.5% BSA、2mM EDTA、0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS)またはフローソーティング緩衝液(4% FBSを含有するPBS)中に1×106個の細胞/mLで懸濁し、適切な抗体と氷上で30分間インキュベートした。使用した抗体は以下であった:Brilliant Violet(BV)-711抗ヒトCD3(clone OKT3 BioLegend# 317328);APC-抗ヒトCD45(clone HI30 BioLegend# 304012);APC-抗ヒトCD19(clone HIB19、Biolegend# 302212)、PE-抗ヒトCD4(clone RPA-T4、Biolegend# 300508)、APC-抗ヒトCD8(clone SK1、Biolegend# 344722)、PE-抗ヒトCβ1 TCR(clone JOVI.1 BD# 565776)、PE-抗ヒトHLA-A3(clone GAP.A3 BD# 566605)、PE-TCR vβ5.1(clone ImmU157)、PE-TCR Vβ5.3(clone 3D11)、PE-TCR Vβ5.2(clone 36213)、FITC-TCR Vβ8(clone 56C5.2 Beckman Coulter)、BV-421-抗ヒトCD25(Biolegend# 302630)、APC-抗ヒトICOS(Biolegend# 313510)、BV-750-抗ヒト-41BB(Biolegend# 309844)、BV-421-抗ヒトLAG3(Biolegend# 369314)、およびAPC-抗ヒト-PD1(Biolegend# 329908)。染色した細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用して解析するか、またはBD FACSAria II(Becton Dickinson, Mansfield, MA)を使用してソーティングした。生死判定色素(LIVE/DEAD Fixable Near-IR, L10119;Aqua Dead Cell Stain Kit L34957 Invitrogen)と前方および側方散乱特性を使用して、単一生細胞のゲーティングを実施した。CellTrace Violet染色(ThermoFisher C34557)を製造業者の説明書に従って実施した。
細胞をフロー染色緩衝液(0.5% BSA、2mM EDTA、0.1%アジ化ナトリウムを含有するPBS)またはフローソーティング緩衝液(4% FBSを含有するPBS)中に1×106個の細胞/mLで懸濁し、適切な抗体と氷上で30分間インキュベートした。使用した抗体は以下であった:Brilliant Violet(BV)-711抗ヒトCD3(clone OKT3 BioLegend# 317328);APC-抗ヒトCD45(clone HI30 BioLegend# 304012);APC-抗ヒトCD19(clone HIB19、Biolegend# 302212)、PE-抗ヒトCD4(clone RPA-T4、Biolegend# 300508)、APC-抗ヒトCD8(clone SK1、Biolegend# 344722)、PE-抗ヒトCβ1 TCR(clone JOVI.1 BD# 565776)、PE-抗ヒトHLA-A3(clone GAP.A3 BD# 566605)、PE-TCR vβ5.1(clone ImmU157)、PE-TCR Vβ5.3(clone 3D11)、PE-TCR Vβ5.2(clone 36213)、FITC-TCR Vβ8(clone 56C5.2 Beckman Coulter)、BV-421-抗ヒトCD25(Biolegend# 302630)、APC-抗ヒトICOS(Biolegend# 313510)、BV-750-抗ヒト-41BB(Biolegend# 309844)、BV-421-抗ヒトLAG3(Biolegend# 369314)、およびAPC-抗ヒト-PD1(Biolegend# 329908)。染色した細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用して解析するか、またはBD FACSAria II(Becton Dickinson, Mansfield, MA)を使用してソーティングした。生死判定色素(LIVE/DEAD Fixable Near-IR, L10119;Aqua Dead Cell Stain Kit L34957 Invitrogen)と前方および側方散乱特性を使用して、単一生細胞のゲーティングを実施した。CellTrace Violet染色(ThermoFisher C34557)を製造業者の説明書に従って実施した。
TRBC、TRBV、およびCD4の枯渇または濃縮
TRBC1 T細胞の枯渇のために、1×108個の正常T細胞をPE-マウス抗ヒトCβ1 TCR(終濃度1μg/ml)で染色し、続いて、PE陰性(TRBC1枯渇)細胞をソーティングした。TRBV5 T細胞の枯渇または濃縮のために、1×108個の正常T細胞をPE-TCR Vβ5.3(TRBV5-5に結合する)およびPE-TCR Vβ5.2(TRBV5-6に結合する)で染色し、続いて、PE陰性(TRBV5枯渇)またはPE陽性(TRBV5濃縮)細胞をソーティングした。TRBV12 T細胞の枯渇または濃縮のために、1×108個の正常T細胞をFITC-TCR Vβ8(TRBV12-3およびTRBV12-4 T細胞に結合する)で染色し、続いて、FITC陰性(TRBV12枯渇)またはFITC陽性(TRBV12濃縮)細胞をソーティングした。あるいは、EasySep PE Positive Selection Kit II(StemCell Technologies, 17684)を細胞単離に使用した。CD4 T細胞の枯渇のために、正常T細胞をPE-抗ヒトCD4で染色し、続いて、EasySep PE Positive Selection Kit IIをCD4陰性(CD4枯渇)細胞の単離に使用した。
TRBC1 T細胞の枯渇のために、1×108個の正常T細胞をPE-マウス抗ヒトCβ1 TCR(終濃度1μg/ml)で染色し、続いて、PE陰性(TRBC1枯渇)細胞をソーティングした。TRBV5 T細胞の枯渇または濃縮のために、1×108個の正常T細胞をPE-TCR Vβ5.3(TRBV5-5に結合する)およびPE-TCR Vβ5.2(TRBV5-6に結合する)で染色し、続いて、PE陰性(TRBV5枯渇)またはPE陽性(TRBV5濃縮)細胞をソーティングした。TRBV12 T細胞の枯渇または濃縮のために、1×108個の正常T細胞をFITC-TCR Vβ8(TRBV12-3およびTRBV12-4 T細胞に結合する)で染色し、続いて、FITC陰性(TRBV12枯渇)またはFITC陽性(TRBV12濃縮)細胞をソーティングした。あるいは、EasySep PE Positive Selection Kit II(StemCell Technologies, 17684)を細胞単離に使用した。CD4 T細胞の枯渇のために、正常T細胞をPE-抗ヒトCD4で染色し、続いて、EasySep PE Positive Selection Kit IIをCD4陰性(CD4枯渇)細胞の単離に使用した。
二重特異性抗体の産生、精製、および安定性
α-TRBV5-5、α-TRBV12、α-TRBC1およびα-CD19 scFv配列(表1)は、GeneArt(ThermoFisher Scientific)によって合成された。scFv配列は、以下のNからC末端へのフォーマット:IL-2シグナル配列、抗TRBV/TRBC/CD19可変軽鎖(VL)、GGGGSリンカー(SEQ ID NO:25)、α-CD3可変重鎖(VH)、(GGGGS)3リンカー(SEQ ID NO:26)、α-CD3 VL、GGGGSリンカー(SEQ ID NO:25)、抗TRBV/TRBC/CD19 VH、および6×HIS tagを使用した単鎖ダイアボディフォーマットとして発現させ、pcDNA3.4ベクター(ThermoFisher Scientific)にクローニングした。BsAbは、JHU Eukaryotic Tissue Culture Core FacilityによってまたはGeneArtによって発現かつ精製された。JHU Eukaryotic Tissue Culture Core FacilityからのBsAb発現では、プラスミド1mgをポリエチレンイミン(PEI)と1:3比で、HEK293F細胞の1L懸濁培養液に2×106個の細胞/mLの密度でトランスフェクトした。新たにトランスフェクトされたHEK293F細胞を、Freestyle293発現培地中、37℃、170rpmおよび5% CO2で5日間成長させた。その後、培地を遠心により収集して、0.22μmユニットで濾過し、Nickel親和性クロマトグラフィーを使用してBsAbを精製した。このために、2mLのNi-NTA His-Bind(Millipore Sigma, 70666-6)樹脂を、濾過した上清に加え、オービタルシェーカーにて4℃で一晩インキュベートした。上清-樹脂混合物を重力クロマトグラフィーカラム(Econo-Pac Chromatography Columns 7321010, Bio-Rad, Hercules, CA)によって捕捉し、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の20mMイミダゾール(GE Healthcare, 45-000-007)で洗浄した。所望のBsAbを500mMイミダゾールで溶離させ、7k MWCO Zeba Spin脱塩カラム(ThermoFisher Scientific, 89883)を使用してPBS中に脱塩させた。SDS-PAGEゲル電気泳動(Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gel, Bio-Rad, 4568095)を介しておよび/またはBCAタンパク質アッセイ(Pierce, ThermoFisher, 23225)を使用して、タンパク質を定量した。タンパク質を7%グリセロールと共に-80℃で貯蔵した。あるいは、BsAbは、GeneArtによりExpi293で生産され、HisTrapカラム(GE Healthcare, 17-5255-01)、続いて、HiLoad Superdex 200 26/600カラム(GE Healthcare, 28989336)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。TSKgel G3000SWxlカラム(TOSOH Bioscience)を使用し、pH 7の50mM リン酸ナトリウムおよび300mM 塩化ナトリウムの泳動用緩衝液を使用して、1.0mL/分の流速で、分析クロマトグラフィーを実施した。BsAbのクマシーブルー染色(ThermoFisher Scientific, 20278)および抗ヒスチジンウエスタンブロットは、GeneArtによって抗6x-Hisタグ抗体(ThermoFisher Scientific, MA1-21315)を使用して実施された。
α-TRBV5-5、α-TRBV12、α-TRBC1およびα-CD19 scFv配列(表1)は、GeneArt(ThermoFisher Scientific)によって合成された。scFv配列は、以下のNからC末端へのフォーマット:IL-2シグナル配列、抗TRBV/TRBC/CD19可変軽鎖(VL)、GGGGSリンカー(SEQ ID NO:25)、α-CD3可変重鎖(VH)、(GGGGS)3リンカー(SEQ ID NO:26)、α-CD3 VL、GGGGSリンカー(SEQ ID NO:25)、抗TRBV/TRBC/CD19 VH、および6×HIS tagを使用した単鎖ダイアボディフォーマットとして発現させ、pcDNA3.4ベクター(ThermoFisher Scientific)にクローニングした。BsAbは、JHU Eukaryotic Tissue Culture Core FacilityによってまたはGeneArtによって発現かつ精製された。JHU Eukaryotic Tissue Culture Core FacilityからのBsAb発現では、プラスミド1mgをポリエチレンイミン(PEI)と1:3比で、HEK293F細胞の1L懸濁培養液に2×106個の細胞/mLの密度でトランスフェクトした。新たにトランスフェクトされたHEK293F細胞を、Freestyle293発現培地中、37℃、170rpmおよび5% CO2で5日間成長させた。その後、培地を遠心により収集して、0.22μmユニットで濾過し、Nickel親和性クロマトグラフィーを使用してBsAbを精製した。このために、2mLのNi-NTA His-Bind(Millipore Sigma, 70666-6)樹脂を、濾過した上清に加え、オービタルシェーカーにて4℃で一晩インキュベートした。上清-樹脂混合物を重力クロマトグラフィーカラム(Econo-Pac Chromatography Columns 7321010, Bio-Rad, Hercules, CA)によって捕捉し、リン酸緩衝食塩水(PBS)中の20mMイミダゾール(GE Healthcare, 45-000-007)で洗浄した。所望のBsAbを500mMイミダゾールで溶離させ、7k MWCO Zeba Spin脱塩カラム(ThermoFisher Scientific, 89883)を使用してPBS中に脱塩させた。SDS-PAGEゲル電気泳動(Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gel, Bio-Rad, 4568095)を介しておよび/またはBCAタンパク質アッセイ(Pierce, ThermoFisher, 23225)を使用して、タンパク質を定量した。タンパク質を7%グリセロールと共に-80℃で貯蔵した。あるいは、BsAbは、GeneArtによりExpi293で生産され、HisTrapカラム(GE Healthcare, 17-5255-01)、続いて、HiLoad Superdex 200 26/600カラム(GE Healthcare, 28989336)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。TSKgel G3000SWxlカラム(TOSOH Bioscience)を使用し、pH 7の50mM リン酸ナトリウムおよび300mM 塩化ナトリウムの泳動用緩衝液を使用して、1.0mL/分の流速で、分析クロマトグラフィーを実施した。BsAbのクマシーブルー染色(ThermoFisher Scientific, 20278)および抗ヒスチジンウエスタンブロットは、GeneArtによって抗6x-Hisタグ抗体(ThermoFisher Scientific, MA1-21315)を使用して実施された。
タンパク質の疎水性領域は、温度誘導変性によって露出することになるので、その領域に結合する色素の蛍光をモニタリングする示差走査蛍光定量法によって、α-V12およびα-V5 BsAbの熱安定性を評価した。反応混合物(20μL)を、白色ロープロファイル96ウェルのノンスカートポリメラーゼ連鎖反応プレート(Bio-Rad, MLL9651)中、pH 7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS, Gibco, 10010023)中で1mg/mL濃度の2μLの精製α-V12またはα-V5 BsAbと2μLの50X SYPRO橙色色素(Invitrogen S6650)とを混合することによって準備した。光透過フィルムでプレートを密閉し、1000×gで30秒間遠心にかけた。CFX9 Connectリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応装置(Bio-Rad)を使用して、25から100℃まで(1℃/分の温度勾配)熱スキャンを実施した。CFX Manager Software(Bio-Rad)を使用して、融解曲線の負の一次導関数の最大値からタンパク質アンフォールディング/融解温度(Tm)を算出した。BsAbを0.05μg/mL濃度のヒト血清(Millipore Sigma #H4522)と37℃のインキュベーター中で0、24、および96時間インキュベートすることによって、血清安定性を評価した。各時点で、ヒト血清BsAb混合物を回収し、共培養アッセイによるBsAb機能分析まで-80℃で凍結した。
CRISPR遺伝子編集
Alt-R CRISPRシステム(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)を使用して、TCRノックアウトJurkatおよびHPB-ALL細胞株、ならびにCD19ノックアウトおよびCD19低発現NALM6クローンを作製した。TCRのノックアウトのために、TRA定常領域
、TRB定常領域
を標的とするAlt-R CRISPR Cas9 crRNA、およびAlt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA(IDT, 1072533)を、Nuclease-Free Duplex Buffer中に100μMで再懸濁した。製造業者の説明書に従って、crRNAとtracrRNAとを、1:1のモル比で、95℃にて5分間かけて二重鎖にし、続いて、室温までゆっくり冷ました。次いで、二重鎖RNAをCas9ヌクレアーゼと1.2:1のモル比で15分間混合した。合計40pmoleのgRNAと複合体化したCas9 RNPを、20μLのOptiMEM(ThermoFisher, 51985091)中の500,000個の細胞と混合した。この混合物を0.1cmのキュベット(Bio-Rad)にロードし、ECM 2001(BTX, Holliston, MA)を使用して90Vで15ミリ秒エレクトロポレーションした。細胞を直ちに完全増殖培地に移し、7日間培養した。限界希釈によって単一細胞クローンを確立し、Quick-DNA 96 Kit(Zymo Research, Irvine, CA, D3010)を使用してゲノムDNAを単離した。CRISPR切断部位に隣接する領域をPCR増幅させ(TCRαフォワードプライマー:
、リバースプライマー:
;TCRβフォワードプライマー:
、リバースプライマー:
)、サンガーシーケンシングを行ってTCRα-/β-クローンを選択した。TRAおよびTRB鎖遺伝子破壊を表面CD3発現の喪失によって確認した。
Alt-R CRISPRシステム(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)を使用して、TCRノックアウトJurkatおよびHPB-ALL細胞株、ならびにCD19ノックアウトおよびCD19低発現NALM6クローンを作製した。TCRのノックアウトのために、TRA定常領域
、TRB定常領域
を標的とするAlt-R CRISPR Cas9 crRNA、およびAlt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA(IDT, 1072533)を、Nuclease-Free Duplex Buffer中に100μMで再懸濁した。製造業者の説明書に従って、crRNAとtracrRNAとを、1:1のモル比で、95℃にて5分間かけて二重鎖にし、続いて、室温までゆっくり冷ました。次いで、二重鎖RNAをCas9ヌクレアーゼと1.2:1のモル比で15分間混合した。合計40pmoleのgRNAと複合体化したCas9 RNPを、20μLのOptiMEM(ThermoFisher, 51985091)中の500,000個の細胞と混合した。この混合物を0.1cmのキュベット(Bio-Rad)にロードし、ECM 2001(BTX, Holliston, MA)を使用して90Vで15ミリ秒エレクトロポレーションした。細胞を直ちに完全増殖培地に移し、7日間培養した。限界希釈によって単一細胞クローンを確立し、Quick-DNA 96 Kit(Zymo Research, Irvine, CA, D3010)を使用してゲノムDNAを単離した。CRISPR切断部位に隣接する領域をPCR増幅させ(TCRαフォワードプライマー:
、リバースプライマー:
;TCRβフォワードプライマー:
、リバースプライマー:
)、サンガーシーケンシングを行ってTCRα-/β-クローンを選択した。TRAおよびTRB鎖遺伝子破壊を表面CD3発現の喪失によって確認した。
CD19ノックアウトおよびCD19低NALM6クローンを作製するために、Alt-R CRISPR sgRNA
をCas9ヌクレアーゼ(IDT)と2:1のモル比で室温にて15分間複合体化した。次いで、50pmoleのCas9 RNPを、SF緩衝液(Lonza)20μL中に再懸濁した200,000個のNALM6細胞と混合し、4D Nucleofector X-unit(Lonza)を用いて16ウェルキュベットストリップ中でパルスコードCV-104を使用してエレクトロポレーションした。細胞を、完全増殖培地中で7日間培養した後、希釈プレーティングを行って個々のクローンを選択した。クローンの細胞表面CD19レベルを、抗ヒトCD19抗体を用いたフローサイトメトリー染色によって特性評価した。
をCas9ヌクレアーゼ(IDT)と2:1のモル比で室温にて15分間複合体化した。次いで、50pmoleのCas9 RNPを、SF緩衝液(Lonza)20μL中に再懸濁した200,000個のNALM6細胞と混合し、4D Nucleofector X-unit(Lonza)を用いて16ウェルキュベットストリップ中でパルスコードCV-104を使用してエレクトロポレーションした。細胞を、完全増殖培地中で7日間培養した後、希釈プレーティングを行って個々のクローンを選択した。クローンの細胞表面CD19レベルを、抗ヒトCD19抗体を用いたフローサイトメトリー染色によって特性評価した。
レトロウイルス形質導入
非組織培養処理プレートに、PBS中20μg/mLのRetroNectin(Clontech Takara, Mountain View, CA, T202)100μLを4℃で一晩被覆し、次いで、10% FBSで室温にて1時間ブロッキングした。レトロウイルス(RediFect Red-FLuc-GFP, PerkinElmer CLS960003)および2×105個の標的細胞を各ウェルに加え、20℃にて2000×gで1時間遠心にかけた。プレートを37℃で2日間インキュベートし、その後、細胞を6ウェルプレートに増大させた。形質導入細胞をFACS(BD FACSAria II)によってGFP発現に基づき単離した。
非組織培養処理プレートに、PBS中20μg/mLのRetroNectin(Clontech Takara, Mountain View, CA, T202)100μLを4℃で一晩被覆し、次いで、10% FBSで室温にて1時間ブロッキングした。レトロウイルス(RediFect Red-FLuc-GFP, PerkinElmer CLS960003)および2×105個の標的細胞を各ウェルに加え、20℃にて2000×gで1時間遠心にかけた。プレートを37℃で2日間インキュベートし、その後、細胞を6ウェルプレートに増大させた。形質導入細胞をFACS(BD FACSAria II)によってGFP発現に基づき単離した。
TCRシーケンシング
試料からQiagen AllPrep DNA/RNA Micro kits(Qiagen, 80284)によりトータルRNAを単離した。Agilent TapeStation systemを使用してRNA品質を検証した。TCRシーケンシングライブラリーを、cDNA合成工程とそれに続くTCRβ定常領域に対する遺伝子特異的プライマーを用いた2つのPCR工程とからなる5' RACE(cDNA端の迅速増幅)法を使用して調製した。Illumina MiSeqプラットフォームを使用してライブラリーを配列決定した。リードをMIGEC、MiXCRおよびVDJツールで分析した。試料中の全UIDに占めるクローン型を表すUID(ユニーク分子識別子バーコード)の割合として、クローン型の頻度を算出した。以下の非機能的TRBV(IMGTにおいて偽遺伝子としてまたはオープンリーディングフレームとして列記される)を分析から除外した;TRBV1、TRBV3-2、TRBV5-2、TRBV5-3、TRBV5-7、TRBV6-7、TRBV7-1、TRBV7-5、TRBV8、TRBV12-1、TRBV12-2、TRBV21、TRBV22、TRBV23-1、TRBV26。
試料からQiagen AllPrep DNA/RNA Micro kits(Qiagen, 80284)によりトータルRNAを単離した。Agilent TapeStation systemを使用してRNA品質を検証した。TCRシーケンシングライブラリーを、cDNA合成工程とそれに続くTCRβ定常領域に対する遺伝子特異的プライマーを用いた2つのPCR工程とからなる5' RACE(cDNA端の迅速増幅)法を使用して調製した。Illumina MiSeqプラットフォームを使用してライブラリーを配列決定した。リードをMIGEC、MiXCRおよびVDJツールで分析した。試料中の全UIDに占めるクローン型を表すUID(ユニーク分子識別子バーコード)の割合として、クローン型の頻度を算出した。以下の非機能的TRBV(IMGTにおいて偽遺伝子としてまたはオープンリーディングフレームとして列記される)を分析から除外した;TRBV1、TRBV3-2、TRBV5-2、TRBV5-3、TRBV5-7、TRBV6-7、TRBV7-1、TRBV7-5、TRBV8、TRBV12-1、TRBV12-2、TRBV21、TRBV22、TRBV23-1、TRBV26。
TRBV配列および構造アラインメント
PDB ID 5BRZ、6EH5、4P4Kおよび4QRRの構造を構造アラインメントして、TRBV 5.1のTCRベータ可変領域に対応する残基2~95を5BRZから抽出した。TRBV 5.4、5.5、5.6および5.8をモデル化するために、Cootを使用して81および101位でインシリコ変異を実施した。図をPyMOL(v2.2.3, Schrodinger, LLC, New York, NY)でレンダリングした。関連するTRBV配列のアラインメントを、ClustalOmegaを使用して実施し、Espriptを使用して表示した。
PDB ID 5BRZ、6EH5、4P4Kおよび4QRRの構造を構造アラインメントして、TRBV 5.1のTCRベータ可変領域に対応する残基2~95を5BRZから抽出した。TRBV 5.4、5.5、5.6および5.8をモデル化するために、Cootを使用して81および101位でインシリコ変異を実施した。図をPyMOL(v2.2.3, Schrodinger, LLC, New York, NY)でレンダリングした。関連するTRBV配列のアラインメントを、ClustalOmegaを使用して実施し、Espriptを使用して表示した。
共培養
共培養を、96ウェル平底組織培養処理プレートを使用して、各ウェルが合計100μL容量のRPMI培地中に5×104個の正常ヒトT細胞(エフェクター細胞)、5×104個の標的細胞(文中に表示)およびBsAb(文中に指定する濃度)を含有するように設定した。共培養物を37℃で17時間インキュベートした。Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, SIF50C)、Human IL-2 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, S2050)、Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, STA00D)、Human IL-10 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, S1000B)、またはBio-Plex 200システム(Bio-Rad)で実施されるLuminexアッセイ(13-plex-Immunology Multiplex Assay, Millipore Sigma, USA, HMHEMAG-34K)を使用して、上清をサイトカインについてアッセイした。ルシフェラーゼ発現標的細胞について、Steady-Gloルシフェラーゼアッセイ(E2510, Promega, Madison, WI)により製造業者の説明書に従って細胞生存率をアッセイした。生存率は、抗体なしまたは対照抗体条件に対する発光シグナルの比:(抗体ウェルの発光)/(抗体なしまたは対照抗体ウェルの発光)として算出した。あるいは、腫瘍細胞を、フローサイトメトリーに基づくGFP発現(GFP発現腫瘍細胞株について)または別個のHLA発現(患者由来腫瘍細胞について)によって定量した。標的腫瘍細胞の非存在下での健康なT細胞に対するBsAbの効果を検出するための実験では、1×106個の正常ヒトT細胞をBsAb(文中に指定する濃度)と合計1mL容量のRPMI培地中でインキュベートし、37℃で17時間インキュベートした。血球計算盤上でトリパンブルー染色細胞を計数することによって生T細胞を定量した。
共培養を、96ウェル平底組織培養処理プレートを使用して、各ウェルが合計100μL容量のRPMI培地中に5×104個の正常ヒトT細胞(エフェクター細胞)、5×104個の標的細胞(文中に表示)およびBsAb(文中に指定する濃度)を含有するように設定した。共培養物を37℃で17時間インキュベートした。Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, SIF50C)、Human IL-2 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, S2050)、Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, STA00D)、Human IL-10 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, S1000B)、またはBio-Plex 200システム(Bio-Rad)で実施されるLuminexアッセイ(13-plex-Immunology Multiplex Assay, Millipore Sigma, USA, HMHEMAG-34K)を使用して、上清をサイトカインについてアッセイした。ルシフェラーゼ発現標的細胞について、Steady-Gloルシフェラーゼアッセイ(E2510, Promega, Madison, WI)により製造業者の説明書に従って細胞生存率をアッセイした。生存率は、抗体なしまたは対照抗体条件に対する発光シグナルの比:(抗体ウェルの発光)/(抗体なしまたは対照抗体ウェルの発光)として算出した。あるいは、腫瘍細胞を、フローサイトメトリーに基づくGFP発現(GFP発現腫瘍細胞株について)または別個のHLA発現(患者由来腫瘍細胞について)によって定量した。標的腫瘍細胞の非存在下での健康なT細胞に対するBsAbの効果を検出するための実験では、1×106個の正常ヒトT細胞をBsAb(文中に指定する濃度)と合計1mL容量のRPMI培地中でインキュベートし、37℃で17時間インキュベートした。血球計算盤上でトリパンブルー染色細胞を計数することによって生T細胞を定量した。
T-ALL患者試料の収集
T細胞がん患者試料は、Johns Hopkins Institutional Review Board(IRB:NA_00028682、およびNA_00028682)により認可されたHematologic Malignancy Cell Bank Protocol(J0969)またはJohns Hopkins Pediatric Leukemia Bank Protocol(J0968)を遵守して収集した。
T細胞がん患者試料は、Johns Hopkins Institutional Review Board(IRB:NA_00028682、およびNA_00028682)により認可されたHematologic Malignancy Cell Bank Protocol(J0969)またはJohns Hopkins Pediatric Leukemia Bank Protocol(J0968)を遵守して収集した。
動物実験
Johns Hopkins Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Animal Resources facilityから取得した6~8週齢の雌のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスを、JHU Animal Care and Use Committee approved research protocol MO18M79に従って維持した。がん細胞株およびヒトT細胞を尾静脈を介して注射した。2週間用マイクロ浸透圧ポンプ(Model 1002, ALZET, Cupertino, CA)に、30Gニードルを使用して文中に表示のとおりBsAbを充填した。無菌手術を使用して、各マウスの腹膜腔内にポンプを設置した。生存研究のために、動物を、80日目まで追跡するか、または麻痺もしくはGVHD(円背位、立毛、皮膚落屑または皮膚剥離、活動低下)の証拠が現れたときに屠殺した。マウスの生物発光を、IVISシステム(PerkinElmer, USA)を使用して測定した。イメージングの前に、誘導室内で吸入イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけた。誘導後、マウスに、ルシフェリン(150μl、RediJect D-Luciferin Ultra Bioluminescent Substrate, PerkinElmer, 770505)の腹腔内注射を施行し、5分間後にイメージング室に入れた。Living Image software(version 4.7.2, PerkinElmer)を使用して、発光イメージを解析した。マウス血液由来の腫瘍細胞および正常ヒトT細胞のフローベース検出のために、マウスの頬採血により血液100μLをEDTA処理microvettes(Sarstedt Inc, NC9299309)中に収集し、続いて、ACK溶解緩衝液(Quality Biological, 118-156-721)1mLと10分間インキュベーションし、マウスおよびヒトTrueStain FcX Fc受容体ブロッキング溶液(BioLegend, 101320, 422302)と細胞表面染色抗体と共にフロー染色緩衝液に再懸濁した。10μLの計数ビーズ(Precision Count Beads, BioLegend, 424902)を、各チューブ内の等量(300μL)の細胞懸濁液に加えた。各試料500個のビーズ取得に基づいて、腫瘍細胞(GFP+、CD3+)またはT細胞(GFP-、CD3+)の数を計数した。サイトカインおよびBsAbの検出のために、マウス由来の血液をエッペンドルフチューブに収集し、室温で30分間凝血させ、続いて、4℃にて1000×gで5分間遠心にかけた。血清を収集し、サイトカインELISA(製造業者の説明書に従う)またはBsAb ELISAまで-80℃で貯蔵した。BsAb ELISAについて、マウス血清を、ビオチン化組換えヒトCD3イプシロン&CD3デルタ(Acro Biosystems, DE, USA, # CDD-H52W4)被覆ストレプトアビジンプレート(R&D Systems, #CP004)中でインキュベートし、続いて、HRPコンジュゲート抗ヒトカッパ軽鎖抗体(ThermoFisher Scientific, #A18853)を使用して検出した。
Johns Hopkins Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Animal Resources facilityから取得した6~8週齢の雌のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスを、JHU Animal Care and Use Committee approved research protocol MO18M79に従って維持した。がん細胞株およびヒトT細胞を尾静脈を介して注射した。2週間用マイクロ浸透圧ポンプ(Model 1002, ALZET, Cupertino, CA)に、30Gニードルを使用して文中に表示のとおりBsAbを充填した。無菌手術を使用して、各マウスの腹膜腔内にポンプを設置した。生存研究のために、動物を、80日目まで追跡するか、または麻痺もしくはGVHD(円背位、立毛、皮膚落屑または皮膚剥離、活動低下)の証拠が現れたときに屠殺した。マウスの生物発光を、IVISシステム(PerkinElmer, USA)を使用して測定した。イメージングの前に、誘導室内で吸入イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけた。誘導後、マウスに、ルシフェリン(150μl、RediJect D-Luciferin Ultra Bioluminescent Substrate, PerkinElmer, 770505)の腹腔内注射を施行し、5分間後にイメージング室に入れた。Living Image software(version 4.7.2, PerkinElmer)を使用して、発光イメージを解析した。マウス血液由来の腫瘍細胞および正常ヒトT細胞のフローベース検出のために、マウスの頬採血により血液100μLをEDTA処理microvettes(Sarstedt Inc, NC9299309)中に収集し、続いて、ACK溶解緩衝液(Quality Biological, 118-156-721)1mLと10分間インキュベーションし、マウスおよびヒトTrueStain FcX Fc受容体ブロッキング溶液(BioLegend, 101320, 422302)と細胞表面染色抗体と共にフロー染色緩衝液に再懸濁した。10μLの計数ビーズ(Precision Count Beads, BioLegend, 424902)を、各チューブ内の等量(300μL)の細胞懸濁液に加えた。各試料500個のビーズ取得に基づいて、腫瘍細胞(GFP+、CD3+)またはT細胞(GFP-、CD3+)の数を計数した。サイトカインおよびBsAbの検出のために、マウス由来の血液をエッペンドルフチューブに収集し、室温で30分間凝血させ、続いて、4℃にて1000×gで5分間遠心にかけた。血清を収集し、サイトカインELISA(製造業者の説明書に従う)またはBsAb ELISAまで-80℃で貯蔵した。BsAb ELISAについて、マウス血清を、ビオチン化組換えヒトCD3イプシロン&CD3デルタ(Acro Biosystems, DE, USA, # CDD-H52W4)被覆ストレプトアビジンプレート(R&D Systems, #CP004)中でインキュベートし、続いて、HRPコンジュゲート抗ヒトカッパ軽鎖抗体(ThermoFisher Scientific, #A18853)を使用して検出した。
統計分析
平均値±平均値の標準誤差を使用して、データをまとめた。スチューデントのt検定を使用して、通常分布変数について2つの試料間の平均の差を比較した。3群以上については、一元配置ANOVAとテューキーの多重比較検定(全群を比較するとき)またはダネットの検定(試験群を1つの対照群と比較するとき)またはシダック検定(2つの選択群を比較するとき)をα=0.05で使用した。カプラン・マイヤー法を利用して、生存期間中央値を生成し、ハザード比をログランク検定によって推定した。統計分析およびグラフ作成にPrism version 8.0ソフトウェア(GraphPad, La Jolla, CA)を使用した。
平均値±平均値の標準誤差を使用して、データをまとめた。スチューデントのt検定を使用して、通常分布変数について2つの試料間の平均の差を比較した。3群以上については、一元配置ANOVAとテューキーの多重比較検定(全群を比較するとき)またはダネットの検定(試験群を1つの対照群と比較するとき)またはシダック検定(2つの選択群を比較するとき)をα=0.05で使用した。カプラン・マイヤー法を利用して、生存期間中央値を生成し、ハザード比をログランク検定によって推定した。統計分析およびグラフ作成にPrism version 8.0ソフトウェア(GraphPad, La Jolla, CA)を使用した。
他の態様
本発明は、その詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の説明は、本発明を例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義されるその範囲を限定するものではないと理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、その詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の説明は、本発明を例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義されるその範囲を限定するものではないと理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (26)
- T細胞受容体β鎖可変(TRBV)ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチドと;
T細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインを含む第2のポリペプチドと
を含む、二重特異性分子。 - 第1のポリペプチドが、単鎖可変断片(scFv)、抗原結合断片(Fab)、F(ab')2断片、およびその生物学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項1記載の二重特異性分子。
- TRBVポリペプチドが、TRBV2ポリペプチド、TRBV3-1ポリペプチド、TRBV4-1ポリペプチド、TRBV4-2ポリペプチド、TRBV4-3ポリペプチド、TRBV5-1ポリペプチド、TRBV5-4ポリペプチド、TRBV5-5ポリペプチド、TRBV5-6ポリペプチド、TRBV5-8ポリペプチド、TRBV6-1ポリペプチド、TRBV6-2ポリペプチド、TRBV6-3ポリペプチド、TRBV6-4ポリペプチド、TRBV6-5ポリペプチド、TRBV6-6ポリペプチド、TRBV6-8ポリペプチド、TRBV6-9ポリペプチド、TRBV7-2ポリペプチド、TRBV7-3ポリペプチド、TRBV7-4ポリペプチド、TRBV7-6ポリペプチド、TRBV7-7ポリペプチド、TRBV7-8ポリペプチド、TRBV7-9ポリペプチド、TRBV9ポリペプチド、TRBV10-1ポリペプチド、TRBV10-2ポリペプチド、TRBV10-3ポリペプチド、TRBV11-1ポリペプチド、TRBV11-2ポリペプチド、TRBV11-3ポリペプチド、TRBV12-2ポリペプチド、TRBV12-3ポリペプチド、TRBV12-4ポリペプチド、TRBV12-5ポリペプチド、TRBV13ポリペプチド、TRBV14ポリペプチド、TRBV15ポリペプチド、TRBV16ポリペプチド、TRBV18ポリペプチド、TRBV19ポリペプチド、TRBV20-1ポリペプチド、TRBV24-1ポリペプチド、TRBV25-1ポリペプチド、TRBV27 TRBV28ポリペプチド、TRBV29-1ポリペプチド、およびTRBV30ポリペプチドからなる群より選択される、請求項1~2のいずれか一項記載の二重特異性分子。
- TRBVポリペプチドが、TRBV5-5ポリペプチドである、請求項3記載の二重特異性分子。
- TRBV5-5ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む、軽鎖と;
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む、重鎖と
を含む、請求項4記載の二重特異性分子。 - 前記軽鎖が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む、請求項5記載の二重特異性分子。
- 前記軽鎖が、SEQ ID NO:38に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、SEQ ID NO:39に示されるアミノ酸配列を含む、請求項5記載の二重特異性分子。
- TRBVポリペプチドが、TRBV12ポリペプチドである、請求項3記載の二重特異性分子。
- TRBV12ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む、軽鎖と;
SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR2、およびSEQ ID NO:14に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む、重鎖と
を含む、請求項8記載の二重特異性分子。 - 前記軽鎖が、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含む、請求項9記載の二重特異性分子。
- 前記軽鎖が、SEQ ID NO:40に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、SEQ ID NO:41に示されるアミノ酸配列を含む、請求項9記載の二重特異性分子。
- 第2のポリペプチドが、単鎖可変断片(scFv)、抗原結合断片(Fab)、F(ab')2断片、およびその生物学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項1記載の二重特異性分子。
- T細胞共受容体ポリペプチドが、分化抗原群3(CD3)ポリペプチドである、請求項1または請求項12記載の二重特異性分子。
- CD3ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインが、
SEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR2、およびSEQ ID NO:19に示されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む、軽鎖と;
SEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR2、およびSEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む、重鎖と
を含む、請求項13記載の二重特異性分子。 - 前記軽鎖が、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記重鎖が、SEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含む、請求項14記載の二重特異性分子。
- T細胞がんを有する哺乳動物を治療するための方法であって、前記哺乳動物に、
T細胞受容体β鎖可変(TRBV)ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチドと;
T細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインを含む第2のポリペプチドと
を含む二重特異性分子を投与する段階を含む、方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項16記載の方法。
- T細胞がんが、クローン性T細胞がんである、請求項16~17のいずれか一項記載の方法。
- T細胞がんが、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、末梢T細胞リンパ腫(PTCL)、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、腸症関連T細胞リンパ腫(EATL)、単形性上皮向性腸管T細胞リンパ腫(MEITL)、濾胞性T細胞リンパ腫(FTCL)、節性末梢性T細胞リンパ腫(節性PTCL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、T細胞大型顆粒リンパ球白血病(T-LGL)、節外性NK/T細胞リンパ腫(NKTL)、および肝脾T細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項16~17のいずれか一項記載の方法。
- 前記哺乳動物内の前記がん細胞が、少なくとも95パーセント減少する、請求項16~19のいずれか一項記載の方法。
- 前記哺乳動物の生存期間を改善するのに有効である、請求項16~19のいずれか一項記載の方法。
- 前記哺乳動物の生存期間が、少なくとも37.5パーセント改善する、請求項21記載の方法。
- セリアック病を有する哺乳動物を治療するための方法であって、前記哺乳動物に、
T細胞受容体β鎖可変(TRBV)ポリペプチドに結合できる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチドと;
T細胞共受容体ポリペプチドに結合できる第2の抗原結合ドメインを含む第2のポリペプチドと
を含む二重特異性分子を投与する段階を含む、方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項23記載の方法。
- TRBVポリペプチドが、TRBV4、TRBV6、TRBV7、TRBV9、TRBV20、およびTRBV29からなる群より選択され、かつT細胞共受容体ポリペプチドが、CD3ポリペプチドである、請求項23または請求項24記載の方法。
- TRBVポリペプチドが、TRBV6-1、TRBV7-2、TRBV9-1、TRBV20-1、およびTRBV29-1からなる群より選択され、かつT細胞共受容体ポリペプチドが、CD3ポリペプチドである、請求項23または請求項24記載の方法。
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2021
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