JP2022527481A - 生物活性が改変されたインターロイキン－２バリアント - Google Patents

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Abstract

本発明は、限定されるものではないが、アレルギー疾患、自己免疫疾患、慢性又は急性炎症疾患及び感染症;移植片対宿主疾患;移植片拒絶並びにがんを含む免疫障害の防止又は処置のためのインターロイキン-2(IL-2)バリアントに関する。本発明はまた、プロエフェクターT細胞活性又はプロ調節性T細胞活性を有する抗IL-2抗体のスクリーニングのための前記IL-2バリアントの使用にも関する。

Description

本発明は、限定されるものではないが、急性又は慢性炎症疾患、アレルギー疾患、自己免疫疾患又は感染症、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、及びがん等の免疫障害の防止又は処置のためのインターロイキン-2(IL-2)バリアントに関する。本発明はまた、プロエフェクターT細胞活性又はプロ調節性T細胞活性を有する抗IL-2抗体のスクリーニングのための前記IL-2バリアントの使用にも関する。
インターロイキン-2(IL-2)は、T及びBリンパ球(T及びB細胞)の活性化、増殖及び生存を促進する免疫応答の重要なサイトカインである。IL-2受容体(IL-2R)は、アルファ(IL-2RA又はCD25)、ベータ(IL-2RB又はCD122)及びガンマ(IL-2RG又はガンマc又はCD132)鎖から構成されるヘテロ三量体タンパク質複合体である。アルファ鎖は、低い親和性でIL-2に結合し、シグナル伝達には関与しない。ベータ鎖とガンマ鎖との組合せは、エフェクターT細胞(従来のT細胞(Tconv;CD4+Foxp3-)、細胞媒介性免疫応答を担うCD8+及びNK細胞上で発現される中親和性受容体を形成する;また、3つ全部の受容体鎖は、免疫抑制機能を有する調節性T細胞(T調節細胞又はTreg;CD4+Foxp3+)上で構成的に、並びに活性化エフェクターT細胞及びNK細胞によって短く、又は一過的に発現される高親和性受容体を形成する。
実際、IL-2は、免疫刺激機能と抑制機能との両方を有するサイトカインである。結果として、それは、がんに対する免疫応答を刺激するために高用量で、より最近では、1型糖尿病(T1D)、自己免疫性血管炎等の自己免疫疾患、パーキンソン病等の炎症疾患及びトリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)感染等の寄生虫感染;並びに移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植片拒絶等の様々な生理病理学的状態における免疫応答を遮断するために低用量で診療所において使用されてきた(Rosenbergら、Sci. Transl. Med.、2012、4、127頁～; Grinberg-Bleyer, Y.ら、J. Exp. Med.、2010、207、1871～1878頁; Tangら、Immunity、2008、28、687～697頁; Pilonら、Am. J. Transplant.、2014、14、2874～2882頁; Saadounら、N. Engl. J. Med.、2011、365、2067～2077頁; Korethら、N. Engl. J. Med.、2011、365、2055～2066頁; Kennedy-Nasserら、Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res.、2014、20、2215～2225頁; Baeyensら、Diabetes、2013、62、3120～3131頁; Gonzalezら、Brain. Behav. Immun.、2015、45、219～232頁; Perolら、Immunol. Lett.、2014、162、173～184頁)。
しかしながら、がん療法における高用量のIL-2は、非常に毒性的であり、その効能は、Tregに対するIL-2の望ましくない効果のため、最適ではない(5～20%の応答者)。
ヒトでは、低用量のIL-2は、Tregをブーストし、自己免疫性血管炎患者及び移植片対宿主疾患における炎症を抑制するために上手く投与されてきた(Saadounら; Koreth, J.ら; Kennedy-Nasserら)。しかしながら、IL-2は、非常に短い半減期を有し、反復投与を必要とするため、改善が為される必要がある。
興味深いことに、IL-2を抗IL-2抗体(Ab)と複合体化させる場合、IL-2の薬力学が改善され、その毒性は低下し、Abに応じて、この複合体は、IL-2の作用をエフェクター(プロTeff抗IL-2 Ab)又は調節性(プロTreg抗IL-2 Ab)免疫細胞に向け直し、IL-2に基づく療法と関連する主な問題を解決する(Boymanら、Science、2006、311、1924～1927頁、Letourneauら、Proc. Natl. Acad. Sci.、2010、107、2171～2176頁)。作用メカニズムに関して、プロTeff抗IL-2抗体との複合体の形成は、IL-2とCD25との相互作用を直接遮断することが示された(Levinら、Nature、2012、484、529～533頁; Rojas, G. in Monoclonal Antibodies (Ossipow, V. & Fischer, N.(編)) 1131、447～476頁 (Humana Press、2014))。
Treg指向性IL-2/抗IL-2複合体は、炎症:T1D、喘息、EAE、アテローム性動脈硬化症、慢性腎症及び固形臓器移植を含む移植の異なるマウスモデルにおいて印象的な結果を与えた(Websterら、J. Exp. Med.、2009、206、751～760頁; Dinh, T. N.ら、Circulation、2012、126、1256～1266頁; Polhill, T.ら、J. Am. Soc. Nephrol. JASN、2012、23、1303～1308頁; Satakeら、PLoS ONE、2014、9、e92888頁 ; Vokaerら、Transplant. Proc.、2012、44、2840～2844頁; Goldsteinら、Front. Immunol.、2013、4、155頁)。
IL-2の生物活性を微調整するための別の戦略は、IL-2バリアント又はIL-2突然変異体を生成するためのIL-2分子中での定時的突然変異の実施にある。野生型IL-2と比較してCD122に対する300倍高い親和性を提供する5つの定時的突然変異を含むIL-2タンパク質突然変異体(IL-2スーパーカイン)が開示されている(Levinら、Nature、2012、484、529～533頁)。IL-2RA(CD25)に対するより高い親和性を有する、及び/又はIL-2RBGによるシグナル伝達が変化した免疫抑制性IL-2バリアントも開示されている(WO2010/085495及びUS 2014/0286898)。
WO2010/085495 US2014/0286898 WO2004004771 WO2004056875 WO2006121168 WO2008156712 WO2009014708 WO2009114335 WO2013043569 WO2014047350 米国特許第6,984,720号 米国特許第8,017,114号 米国特許第7,109,003号 米国特許第8,143,379号 WO1997020574 WO2007123737 米国特許第8,491,895号 米国特許出願第20130177557号 米国特許第5,773,578号
Rosenbergら、Sci. Transl. Med.、2012、4、127頁～ Grinberg-Bleyer, Y.ら、J. Exp. Med.、2010、207、1871～1878頁 Tangら、Immunity、2008、28、687～697頁 Pilonら、Am. J. Transplant.、2014、14、2874～2882頁 Saadounら、N. Engl. J. Med.、2011、365、2067～2077頁 Korethら、N. Engl. J. Med.、2011、365、2055～2066頁 Kennedy-Nasserら、Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res.、2014、20、2215～2225頁 Baeyensら、Diabetes、2013、62、3120～3131頁 Gonzalezら、Brain. Behav. Immun.、2015、45、219～232頁 Perolら、Immunol. Lett.、2014、162、173～184頁 Boymanら、Science、2006、311、1924～1927頁 Letourneauら、Proc. Natl. Acad. Sci.、2010、107、2171～2176頁 Levinら、Nature、2012、484、529～533頁 Rojas, G. in Monoclonal Antibodies (Ossipow, V. & Fischer, N.(編)) 1131、447～476頁 (Humana Press、2014) Websterら、J. Exp. Med.、2009、206、751～760頁 Dinh, T. N.ら、Circulation、2012、126、1256～1266頁 Polhill, T.ら、J. Am. Soc. Nephrol. JASN、2012、23、1303～1308頁 Satakeら、PLoS ONE、2014、9、e92888頁 Vokaerら、Transplant. Proc.、2012、44、2840～2844頁 Goldsteinら、Front. Immunol.、2013、4、155頁 Carmenateら、The Journal of Immunology、2018、200、3475～3484頁 De Paulaら、P.N.A.S.、doi/10.1073; March 17、2020 Spanglerら、Immunity、2015、42、815～825頁 Arenas-Ramirezら、Sci. Transl. Med.、2016、8、367ra166 Fraczkiewiczら、J. Comp. Chem、1998、19、319～333頁 Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215、403頁- Bhairavabhotlaら、Human Immunol.、2016、77、201～13頁 van der Veekenら、Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol.、2013、78、215～22頁 Pfoertnerら、Genome Biol.、2006、7、R54 Sugimotoら、Int. Immunol.、2006、18、1197頁～ Smaldini PLら、Allergy、2018、73、885～895頁 Lee-S Yら、Immunology、2012、137、305～16頁 Boyman Oら、Science 2006、311、1921～27頁 Kriegら、PNAS、2010、107、11906～11頁 Caudana Tら、2019、Cancer Immunol Res、7、443～457頁 Newman RGら、Blood、2014、123、3045～55頁 Prezado Y、Jouvion G、Guardiola C、Gonzalez W、Juchaux M、Bergs J、Nauraye C、Labiod D、De Marzi L、Pouzoulet F、Patriarca A、Dendale R.「Tumor Control in RG2 Glioma-Bearing Rats: A Comparison Between Proton Minibeam Therapy and Standard Proton Therapy」、Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2019 Jun 1;104(2):266～271頁、doi: 10.1016/j.ijrobp.2019.01.080 Prezado Y、Jouvion G、Patriarca A、Nauraye C、Guardiola C、Juchaux M、Lamirault C、Labiod D、Jourdain L、Sebrie C、Dendale R、Gonzalez W、Pouzoulet F.「Proton minibeam radiation therapy widens the therapeutic index for high-grade gliomas」、Sci Rep. 2018 Nov 7;8(1):16479頁、doi: 10.1038/s41598-018-34796-8 Favaudon V、Fouillade C、Vozenin MC. The radiotherapy FLASH to save healthy tissues. Med Sci (Paris) 2015 ; 31 : 121～123頁、DOI: 10.1051/medsci/20153102002) Patriarca A.、Fouillade C. M.、Martin F.、Pouzoulet F.、Nauraye C.ら、「Experimental set-up for FLASH proton irradiation of small animals using a clinical system」、Int J Radiat Oncol Biol Phys、102 (2018)、619～626頁、doi: 10.1016/j.ijrobp.2018.06.403. Epub 2018 Jul 11 Kuhlmanら、Science、2003、302、1364～8頁 Aricescuら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.、2006、62、1243～50頁 Gaidot A、Blood、2011、117、2975～2983頁 Shinら、Blood、2011、118、2342～2350頁
IL-2に基づく免疫療法を改善するためには、免疫障害の防止又は処置のためのIL-2バリアントが必要である。
本発明者らは、ヒトIL-2の表面再処理バリアントを操作し、調節性T細胞(Treg)を選択的に刺激するか、又はIL-2と拮抗することができるIL-2バリアントを同定した。
本出願の実施例は、in vitroでTregを選択的に刺激し(図6)、マウスにおいてin vivoで循環Treg細胞を増加させる(図10)、ヒトIL-2の表面再処理バリアント(Tregアゴニストバリアント)を示す。Tregアゴニストバリアントは、Tregを選択的に活性化し、次いで、免疫エフェクター細胞を阻害することによって、免疫活性化を間接的に減少させるのに有用である。本発明のTregアゴニストバリアントはかくして、限定されるものではないが、アレルギー疾患及び自己免疫疾患、並びに特に、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の免疫系の過剰活性を含む疾患等の、免疫モジュレーション又は免疫抑制が有益である疾患を処置するのに有用である。
本出願の実施例はまた、ヒトIL-2の表面再処理バリアントの一部がIL-2アンタゴニストであることも示す(図9)。
特に、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶を含むIL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患の文脈では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアントは、内因性IL-2と競合することによって免疫活性化を直接減少させ、それによって、免疫系のIL-2媒介性過剰活性化を遮断する。
急性GVHDのマウスモデルでは、本発明のIL-2バリアントは、Tregアゴニストであろうと、IL-2アンタゴニストであろうと、GVHDを制御し、臨床的GVHDの発達を遅延させることができる。試験されたIL-2アンタゴニストバリアントは、試験されたTregアゴニストバリアントよりも、体重減少を停止させ、循環ヒトTreg細胞を選択的に増加させるのに有効であった(図7及び図8)。
更に、IL-2アンタゴニストであるIL-2バリアントは、野生型IL-2シグナル伝達からTregを枯渇させることによって、in vitroでTreg分裂を阻害する(抗IL-2抗体の遮断と同様;図12)。in vivoでは、本発明のIL-2アンタゴニストバリアントによるTregの阻害は、他のIL-2アンタゴニストに関して以前に示されたように腫瘍増殖を減少させるであろう(Carmenateら、The Journal of Immunology、2018、200、3475～3484頁)。本発明によるIL-2アンタゴニストバリアントによるTreg阻害は、結果として、Treg抑制から免疫細胞を解放することによって免疫応答(リンパ球(B、NK、CD4+又はCD8+T細胞);樹状細胞(DC);マクロファージその他)を促進するであろう。更に、IL-2アンタゴニストバリアントの使用される用量に応じて、CD8+T細胞機能は保持されるか、又は中程度に影響される(図9;図12)。したがって、IL-2アンタゴニストバリアントは更に、例えば、腫瘍、病原体又はワクチンに対する、CD8+T細胞免疫応答の直接刺激を可能にする。全てのこれらの理由から、がん、感染性因子及びワクチンに対するより良好な免疫応答が、本発明のIL-2アンタゴニストバリアントに関して予想される。
本出願で提示される結果は全体として、in vivoでのIL-2アンタゴニストバリアントの効果は、それが、免疫系が過剰活性であり、過剰のIL-2を産生する場合には免疫活性化を減少させるが(過剰の内因性IL-2を中和することによって)、それが異なる免疫状況では免疫活性化を増加させる(Treg阻害及びCD8+T細胞活性化によって)ため、免疫状況に応じて変化してもよいことを示唆する。これらの理由から、IL-2アンタゴニストバリアントは、限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等のIL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患を処置する、また、がん及び感染症を処置する、並びにワクチンに対する免疫応答を増加させるのに有用である。
本発明者らはまた、それらの作用メカニズムに関するいくらかの洞察を与える一部のバリアントの結晶構造も解析した。本発明者らは、Y31P置換(IL2-V4)が、以後、「アルファ誘導性コンフォメーション」とする、IL2-Rアルファサブユニットとの複合体において観察されるものと同様のコンフォメーションでIL-2を安定化することを観察した。実際、Tyr31が位置する、ループABのコンフォメーション変化が、IL-2Rベータ及びガンマサブユニットとの相互作用にアロステリックに影響することを示唆する、マウスIL-2に由来するいくつかの最近の証拠がある(De Paulaら、P.N.A.S.、doi/10.1073; March 17、2020及びSpanglerら、Immunity、2015、42、815～825頁)。したがって、IL2-V4活性の基礎となる分子メカニズムがこのアロステリック回路を利用すると推測することは魅力的である。実際、本発明者らはまた、IL2-V4の同じ活性を有する、IL2-V1の構造も取得した。このバリアントに存在する突然変異はいずれもABループ中に位置しないにも拘わらず、それもまた同じ「アルファ誘導性コンフォメーション」を示す。
理論によって束縛されないが、本発明者らは、本発明のIL-2アンタゴニストバリアント中に導入された置換が、結合形態を安定化し、IL-2Rベータ及びガンマサブユニットとの相互作用にアロステリックに影響するコンフォメーション変化を誘導すると考えている。
これらの結果は、免疫障害の処置のため、及びワクチンに対する免疫応答を増加させるためのこれらのヒトIL-2バリアントの能力を示す。免疫障害としては、特に、炎症疾患、アレルギー疾患、感染症及び自己免疫疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)、移植片拒絶、並びにがんが挙げられる。ワクチンは、がん又は感染症に向けられてもよい。
本発明者らはまた、IL-2の表面再処理バリアントを使用して、プロTeff又はプロTreg活性を有する抗IL-2抗体をスクリーニングすることもできることも示した。
したがって、本発明は、α受容体と接触する領域の外側のIL-2の表面位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、調節性T細胞を選択的に刺激するか、又はIL-2と拮抗することができるインターロイキン-2(IL-2)バリアントに関する。
一部の実施形態では、本発明によるインターロイキン-2バリアントは、9、12、16、19、23、26、31、87、91及び95からなる群から選択される位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含み、
- 9及び12位のアミノ酸は、D又はE、好ましくはEによって置換される;
- 16、19、26、91及び95位のアミノ酸は、K又はRによって置換される;好ましくは、16及び19位のアミノ酸は、Rによって置換され、26、91及び95位のアミノ酸は、Kによって置換される;
- 23位のアミノ酸は、E、Q、T、N、G、A、V、L又はI、好ましくは、Lによって置換される;
- 31位のアミノ酸は、P又はN、好ましくは、Pによって置換される;
- 87位のアミノ酸は、M、V、E、D、T、C、N又はQ、好ましくは、Nによって置換される;並びに
前記置換が91位にある場合、前記バリアントは、9、12、16、19、23、26、31、49、52、81、84、87、95、119、123、127、131又は132位に少なくとも別の置換を含み、示された位置は、配列番号1とのアラインメントによって決定される。
一部の好ましい実施形態では、本発明によるバリアントは、9、12、16、19、23、26、87、91及び95からなる群から選択される位置に1個又は複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは、31、49、52、81、84、119、123、127、131及び132からなる群から選択される位置に少なくとも1個の更なる置換を含み、
- 31位のアミノ酸は、P又はN、好ましくは、Pによって置換される;
- 49、52、84及び132位のアミノ酸は、M、V、E、D、S、T、C、N及びQから選択される別のアミノ酸によって置換される;好ましくは、49位のアミノ酸はQによって置換される;52及び132位のアミノ酸は、Sによって置換される;84位のアミノ酸はNによって置換される;
- 81位のアミノ酸は、D又はE、好ましくはEによって置換される;
- 119、127及び131位のアミノ酸は、K又はRによって置換される;好ましくは、127位のアミノ酸は、Kによって置換され、131位のアミノ酸は、Rによって置換される;並びに
- 123位のアミノ酸は、E、Q、N、M、G、A、V、L又はI、より好ましくは、Aによって置換される。
一部の他の好ましい実施形態では、本発明によるバリアントは、31位に1個の置換を含み、9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131及び132位にいかなる置換も含まない。
一部の実施形態では、本発明によるバリアントは、好ましくは、
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、N119K、T123A、及びS127K置換を含むバリアント;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S置換を含むバリアント;
- 9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131及び132位にいかなる置換も含まない、Y31P置換を含むバリアント;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、T131R及びL132S置換を含むバリアント;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、N119K、T123A、及びS127K置換を含むバリアント;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S置換を含むバリアント
からなる群から選択されるヒトIL-2バリアントである。
一部の実施形態では、本発明によるバリアントは、配列番号1及び3～8のいずれか1つとの少なくとも70%のアミノ酸同一性を有し、好ましくは、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130及び133位にいかなる置換も含まない。
一部の実施形態では、本発明によるバリアントは、調節性T細胞を選択的に刺激する。
一部の他の実施形態では、本発明によるバリアントは、IL-2アンタゴニストであり、好ましくは、IL-2アンタゴニストは、調節性T細胞を阻害し、その結果として、免疫応答、特に、CD8+T細胞応答を刺激する。
一部の実施形態では、本発明によるバリアントは、分子複合体、粒子、コンジュゲート又は融合タンパク質の形態等にある、目的の薬剤と結合する。一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、抗IL-2抗体、好ましくは、プロ調節性T細胞活性又はプロエフェクターT細胞活性を有する抗IL-2抗体と複合体化される。一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、Tregに特異的な表面分子に対する抗体又は少なくとも1つの抗原結合部位を含むその機能的断片に融合される。Tregに特異的な表面分子に対する抗体は、好ましくは、抗CTLA-4抗体、抗CD25抗体、抗CCR8抗体、抗ICOS抗体、抗IKZF2抗体、抗CD70抗体、抗GARP抗体、抗IL1R1抗体、抗CD39抗体、抗CCR4抗体及び抗CD177抗体を含む群から選択される。
本発明は、発現可能な形態で前記バリアントをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、発現ベクター、及び該ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明は、活性物質として、本発明において開示される目的の薬剤と最終的に結合した、IL-2バリアント、本発明によるポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞と、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明は、免疫障害を処置するための、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞の使用に関する。
一部の実施形態では、本発明による、Tregを選択的に刺激するIL-2バリアント(Tregアゴニストバリアント)、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞は、限定されるものではないが、アレルギー疾患及び自己免疫疾患、並びに特に、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)、及び移植片拒絶を含む免疫系の過剰活性を含む疾患等の、免疫モジュレーション又は免疫抑制が有益である疾患を処置するためにex vivo又はin vivoでTregを拡大するために使用される。
一部の実施形態では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞は、IL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患、特に、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶を処置するために免疫系のIL-2媒介性過剰活性化を遮断するために使用される。
一部の実施形態では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞は、がん若しくは感染症を処置するため、又はワクチン、特に、がん若しくは感染症のためのワクチンに対する免疫応答を増加させるために、Tregを阻害し、結果として、B、NK、CD4+又はCD8+T細胞、DC、マクロファージその他、特に、CD8+T細胞免疫応答を含む免疫応答を刺激するために使用される。
一部の実施形態では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞は、キメラ抗原受容体T細胞療法、免疫調節性モノクローナル抗体療法、又はがん及び感染症に対する治療剤及びワクチンを含む抗がん剤若しくは抗感染剤を用いる療法と組み合わせて使用される。一部の好ましい実施形態では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は細胞は、標的療法、免疫チェックポイント療法及び免疫チェックポイント阻害剤等の免疫療法、共刺激抗体、化学療法並びに/又は放射線療法を含む群から選択される少なくとも更なるがん療法と組み合わせて使用される。
本発明はまた、プロエフェクターT細胞活性又はプロ調節性T細胞活性を有する抗IL-2抗体のスクリーニングのための本発明によるIL-2バリアントの使用にも関する。
進化フィルターにおいて使用された異なる種に由来するIL-2の多重配列アラインメント。ヒト(Homo sapiens)(配列番号1);シロテナガザル(Hylobates lar)(配列番号15);アカゲザル(Macaca mulatta)(配列番号16);ブタオザル(Macaca nemestrina)(配列番号17);カニクイザル(Macaca fascicularis)(配列番号18);シロエリマンガベイ(Cercocebus torquatus)(配列番号19);ヨザル(Aotus vociferans)(配列番号20);マントヒヒ(Papio hamadryas)(配列番号21);ハツカネズミ(Mus musculus)(配列番号22);ドブネズミ(Rattus norvegicus)(配列番号23);スナネズミ(Meriones unguiculatus)(配列番号24;モルモット(Cavia porcellus)(配列番号25);アナウサギ(Oryctolagus cuniculus)(配列番号26);ウシ(Bos taurus)(配列番号27);ヒツジ(Ovis aries)(配列番号28);アカシカ(Cervus elaphus hippelaphus)(配列番号29);ヒマラヤヤギ(Capra hircus)(配列番号30);シロイルカ(Delphinapterus leucas)(配列番号31);オルカ(Orcinus orca)(配列番号32);イノシシ(Sus scrofa)(配列番号33);ウマ(Equus caballus)(配列番号34);イエネコ(Felis catus)(配列番号35);イヌ(Canis lupus familiaris)(配列番号36);ハイイロアザラシ(Halichoerus grypus)(配列番号37);キタゾウアザラシ(Mirounga angustirostris)(配列番号38)及びセキショクヤケイ(Gallus gallus)(配列番号39)。 進化フィルターにおいて使用された異なる種に由来するIL-2の多重配列アラインメント。ヒト(Homo sapiens)(配列番号1);シロテナガザル(Hylobates lar)(配列番号15);アカゲザル(Macaca mulatta)(配列番号16);ブタオザル(Macaca nemestrina)(配列番号17);カニクイザル(Macaca fascicularis)(配列番号18);シロエリマンガベイ(Cercocebus torquatus)(配列番号19);ヨザル(Aotus vociferans)(配列番号20);マントヒヒ(Papio hamadryas)(配列番号21);ハツカネズミ(Mus musculus)(配列番号22);ドブネズミ(Rattus norvegicus)(配列番号23);スナネズミ(Meriones unguiculatus)(配列番号24;モルモット(Cavia porcellus)(配列番号25);アナウサギ(Oryctolagus cuniculus)(配列番号26);ウシ(Bos taurus)(配列番号27);ヒツジ(Ovis aries)(配列番号28);アカシカ(Cervus elaphus hippelaphus)(配列番号29);ヒマラヤヤギ(Capra hircus)(配列番号30);シロイルカ(Delphinapterus leucas)(配列番号31);オルカ(Orcinus orca)(配列番号32);イノシシ(Sus scrofa)(配列番号33);ウマ(Equus caballus)(配列番号34);イエネコ(Felis catus)(配列番号35);イヌ(Canis lupus familiaris)(配列番号36);ハイイロアザラシ(Halichoerus grypus)(配列番号37);キタゾウアザラシ(Mirounga angustirostris)(配列番号38)及びセキショクヤケイ(Gallus gallus)(配列番号39)。 IL-2と、示されたそのα(CD25)、β(CD122)、及びγC(CD132)受容体との四次複合体の構造。IL-2-V2中の表面再処理位置が示される。 IL-2-WT構築物と、表面再処理バリアントIL-2-V1及びIL-2-V2との配列アラインメント。IL-2-WT構築物(配列番号2)。IL-2-V1(配列番号3)。IL-2-V2(配列番号4)。 IL-2の組換え野生型及び表面再処理バリアントのサイズ排除クロマトグラフィー及びSDS-PAGE分析。A. IL-2野生型。B. IL-2-V1。C. IL-2-V2。実験試験のために使用されるピークは、矢頭で示される。D. IL-2野生型(WT);IL-2-V1(V1)及びIL-2-V2(V2)のSDS-PAGE分析。ゲル: Laemli、15%アクリルアミド。試料:WT: 3.4μg。V1: 3.6μg。V2: 2～2.9μg。試料を、還元条件(DTT)下で変性させた。 異なるIL-2バリアントへの異なる抗IL-2抗体の特異的結合を評価するためのELISA。ELISA試験を使用して、プロTエフェクター又はプロTreg機能を有する抗体(Ab)に対するIL-2Vの選択性を評価した。そのために、プロロイキン、IL-2V1、IL-2V2、IL-2V3、IL-2V4、IL-2V5又はIL-2V5(全部6μg/mL)でプレートを被覆することによって、典型的なELISA試験を行った。評価したAbは、MAB605(in vivoでプロTエフェクター活性を有するマウス抗ヒトIL-2 Ab)、5344(in vivoでプロTreg活性を有するマウス抗ヒトIL-2 Ab)及びNARA(Arenas-Ramirezら、Sci. Transl. Med.、2016、8、367ra166に由来する、in vivoでプロTエフェクター活性を有するscFV抗体)であった。抗IL-2 Abを検出するために、抗マウスIgG-HRP Ab又はNARAのための抗M13-HRP Abを使用し、吸光度を450nmで読み取った。対照ウェル(対応する抗IL-2 Ab + 抗マウスIgG-HRP Abと共にインキュベートした非被覆ウェル)の吸光度が差し引かれたOD値が示される。 IL-2V1、IL-2V4、IL-2V5及びIL-2V6ではなく、ヒトIL-2V2及びIL-2V3は、Treg細胞中でSTAT-5リン酸化を選択的に誘導する。CD3+細胞を、ヒトPBMCから精製し、異なる濃度のプロロイキン、IL-2V1、IL-2V2、IL-2V3、IL-2V4、IL-2V5又はIL-2V6(0.0001nM～1000nM)と共にインキュベートした。ヒトTreg細胞(IL-2Rαβγ)、CD4+Teff細胞(IL-2Rβγ)及びCD8+T細胞(IL-2Rβγ)中でのSTAT5のリン酸化(STAT5-P)を、フローサイトメトリーによって測定した。(A～B)プロロイキン、IL-2V1、IL-2V2及びIL-2V3を使用した2人の異なる健康なドナーにおける異なるT細胞集団間でのSTAT5-P+細胞の頻度。(C)プロロイキン、IL-2V4、IL-2V5及びIL-2V6を使用した1人の健康なドナーにおける異なるT細胞集団間でのSTAT5-P+細胞の頻度。2つの独立した実験で得られた結果が示される。 hIL-2Vは臨床GVHD発生を遅延させる。NSG-SGMマウスに、6x106個のCD3+T細胞を含有するヒトPBMCをi.v.経路によって投与し、i.p.経路によって6μg/用量のプロロイキン、IL-2V1及びIL-2V2で5日連続で処置した。(A)異なる処置群の初期体重のパーセンテージ(%)として表した体重変化進化の平均、及び(B)移植されたマウスのKaplan-Meier生存曲線。未処置n=4;プロロイキン、n=4;IL-2V1 n=5;IL-2V2 n=5。 hIL-2Vは、急性GVHDのマウスモデルにおいて循環ヒトTreg細胞を選択的に増加させる。NSG-SGMマウスに、6x106個のCD3+T細胞を含有するヒトPBMCをi.v.経路によって投与し、i.p.経路によって6μg/用量のプロロイキン、IL-2V1及びIL-2V2で5日連続で処置した。血液試料を、PBMC注射後、5、10及び21日目で採取した。(A)ヒトCD8+T細胞;(B)ヒトCD4+Tconv細胞(CD4+Foxp3-エフェクターT細胞)並びにヒトTreg(CD4+CD45RA-Foxp3High)(C)及びCD25+Treg(CD4+Foxp3+CD25High)(D)の頻度。四角:ドナー1、丸:ドナー2、未処置、n=4;プロロイキン、n=4;IL-2V1 n=5;IL-2V2、n=5。 hIL-2Vは、急性GVHDのマウスモデルにおいて循環ヒトTreg細胞を選択的に増加させる。NSG-SGMマウスに、6x106個のCD3+T細胞を含有するヒトPBMCをi.v.経路によって投与し、i.p.経路によって6μg/用量のプロロイキン、IL-2V1及びIL-2V2で5日連続で処置した。血液試料を、PBMC注射後、5、10及び21日目で採取した。(A)ヒトCD8+T細胞;(B)ヒトCD4+Tconv細胞(CD4+Foxp3-エフェクターT細胞)並びにヒトTreg(CD4+CD45RA-Foxp3High)(C)及びCD25+Treg(CD4+Foxp3+CD25High)(D)の頻度。四角:ドナー1、丸:ドナー2、未処置、n=4;プロロイキン、n=4;IL-2V1 n=5;IL-2V2、n=5。 ヒトIL-2V1はプロロイキンと競合してT細胞を刺激する。CD3+細胞を、ヒトPBMCから精製し、異なる濃度のプロロイキンのみ(0.0001nM～1000nM;黒色の曲線)、ヒトIL-2V1のみ(0.0001nM～1000nM;青色の曲線)又は固定濃度のIL-2V1(1000nM、競合曲線、赤色の曲線)の存在下でのプロロイキン(0.0001nM～1000nM)と共にインキュベートした。STAT-5のリン酸化(STAT5-P)を、フローサイトメトリーによって測定した。(A)Treg細胞間のSTAT5-P細胞の頻度(IL-2Rαβγ)。(B)CD4+Foxp3-T細胞間のSTAT5-P細胞の頻度(IL-2Rβγ)。(C)CD8+T細胞間のSTAT5-P細胞の頻度(IL-2Rβγ)。(D)IL-2V1により誘導されたTreg、CD4+Teff及びCD8+T細胞間のSTAT5-P細胞の頻度。IL-2V1と相互作用する高親和性(上部分)及び中親和性(中央)IL-2Rの略図が示される。 IL-2V2及びIL-2V3は、in vivoでエフェクター細胞よりもTreg細胞の頻度を選択的に増加させる。C57BL/6健康マウスを、プロロイキン(4μM)、IL-2V2(40μM)、又はIL-2V3(40μM)のi.p.注射によって処置した。1群のマウスを、未処置のままにした。処置又は未処置マウス1群あたりn=3匹のマウス。マウスが4用量のプロロイキン又はIL-2Vを受けた後、FACS分析のために血液試料を採取した。(A) CD45+細胞間の、Treg(CD4+Foxp3+);エフェクター記憶CD8+T細胞(CD8+CD44high)及びNK細胞;CD45+細胞間の、増殖性(Ki67+)Treg、エフェクター記憶CD8+T細胞(CD44highKi67+)及びNK細胞の頻度;(B)エフェクター記憶CD8+T細胞(CD8+CD44high)の、Tregに対する比;NK細胞のTregに対する比。 IL-2バリアントはIL2Rαβγに結合する。IL-2Rαβγを構成的に発現するIL-2依存的ヒト細胞系Kit225に関する結合アッセイ。2日間にわたってIL-2を枯渇させたKit225細胞を、単独で、又はストレプトアビジンタグと共に産生された10μMのIL-2wt、IL-2V1、V2、V3、V4、V5及びV6と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、抗Strep-Tag抗体(A-488)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 IL-2Vアンタゴニストは、CD4+T細胞活性化についてIL-2と競合し、CD8+T細胞中に活性なシグナル伝達を残す。CTV標識ヒトPBMC及びCD25+T細胞(50:50比で混合)を、抗CD3/抗CD28ビーズ(1:5のビーズ:細胞比) + IL-2V1、4、6、抗hIL-2mAb (Mab602)又はPBS(内因性IL-2対照)と共に96hインキュベートした。CD4+Tconv、Treg及びCD8+T細胞のCTV希釈率を、フローサイトメトリーによって測定した。PBS条件(max)に対するCTVLow細胞(分裂細胞の尺度として)のパーセンテージ(%)が示される。 IL-2Vアンタゴニストは、CD4+T細胞活性化についてIL-2と競合し、CD8+T細胞中に活性なシグナル伝達を残す。CTV標識ヒトPBMC及びCD25+T細胞(50:50比で混合)を、抗CD3/抗CD28ビーズ(1:5のビーズ:細胞比) + IL-2V1、4、6、抗hIL-2mAb (Mab602)又はPBS(内因性IL-2対照)と共に96hインキュベートした。CD4+Tconv、Treg及びCD8+T細胞のCTV希釈率を、フローサイトメトリーによって測定した。PBS条件(max)に対するCTVLow細胞(分裂細胞の尺度として)のパーセンテージ(%)が示される。 IL-2Vアンタゴニストは、CD4+T細胞活性化についてIL-2と競合し、CD8+T細胞中に活性なシグナル伝達を残す。CTV標識ヒトPBMC及びCD25+T細胞(50:50比で混合)を、抗CD3/抗CD28ビーズ(1:5のビーズ:細胞比) + IL-2V1、4、6、抗hIL-2mAb (Mab602)又はPBS(内因性IL-2対照)と共に96hインキュベートした。CD4+Tconv、Treg及びCD8+T細胞のCTV希釈率を、フローサイトメトリーによって測定した。PBS条件(max)に対するCTVLow細胞(分裂細胞の尺度として)のパーセンテージ(%)が示される。
IL-2バリアント
本発明は、α受容体と接触する領域の外側のIL-2の表面位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、調節性T細胞を選択的に刺激するか、又はIL-2と拮抗することができるインターロイキン-2(IL-2)バリアントに関する。
TCGF又はリンホカインとしても知られる、インターロイキン-2又はIL-2という用語は、哺乳動物ゲノム中でIL-2遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。IL-2は、N末端シグナルペプチド(20アミノ酸)を含有する前駆体として発現され、切断されて、成熟タンパク質(IL-2)をもたらす。IL-2の代表例は、図1に示され、限定されるものではないが、ヒト(Gene ID: 3558)、ラット(Gene ID: 116562)、ネコ(Gene ID: 751114)、及びマウス(Gene ID: 16183)形態が挙げられる。本明細書で使用される場合、IL-2とは、野生型IL-2を指す。ヒトIL-2前駆体は、153アミノ酸の配列UniProtKB/Swiss-Prot: P60568.1を有する。成熟IL-2は、前駆体の21～153位に由来する133アミノ酸の配列を有し、配列番号1に対応する。
以下の説明において、残基は標準的な1文字アミノ酸コードで指定され、示される位置は、配列番号1とのアラインメントによって決定される。例えば、K9は、配列番号1の9位のリシン残基である。置換は、本明細書では1文字アミノ酸コード、次いで、1文字アミノ酸コードの置換残基で指定される;K9Eは、配列番号1の9位のリシン(K)残基の、グルタミン酸(E)残基による置換である。
「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、本文が別途明確に指摘しない限り、複数の指示対象を含む。そのようなものとして、用語「1つの(a)」(若しくは「1つの(an)」)、「1又は複数(one or more)」又は「少なくとも1(at least one)」は、本明細書では互換的に使用することができる;別途特定しない限り、「又は(or)」は、「及び/又は(and/or)」を意味する。
本発明は、免疫障害の処置にとって有用である、調節性T細胞(Treg)を選択的に刺激するか、又はIL-2と拮抗することができるインターロイキン-2(IL-2)バリアントを提供する。
本明細書で使用される場合、「免疫障害」とは、免疫機能障害又は免疫調節異常を含む疾患を指す。免疫機能障害は、免疫系の阻害、機能障害又は過剰活性を含んでもよい。免疫障害は、免疫調節剤、免疫抑制剤、及び/又は免疫刺激剤を使用する免疫モジュレーションによって防止又は処置することができる疾患を含む。免疫モジュレーションは、Tregを選択的に刺激すること、又はTregを阻害することを含んでもよい。免疫抑制は、Tregを選択的に刺激し、次いで、免疫エフェクター細胞を阻害すること、又は免疫エフェクター細胞を直接阻害することを含んでもよい。同様に、免疫刺激は、Tregを阻害し、次いで、免疫抑制から免疫細胞を解放すること、又はエフェクター免疫細胞を直接刺激することを含んでもよい。Tregを阻害する免疫調節剤及び免疫刺激剤は、限定されるものではないが、感染症及びがんの処置並びにワクチンに対する免疫応答の増加を含む、感染症及びがん等の、Tregの阻害及び/又は免疫応答の刺激が有益である疾患を防止又は処置するのに有用である。ワクチンは、特に、がん又は感染症に対して向けられたワクチンである。Tregを刺激する免疫調節剤及び免疫抑制剤は、限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、急性GVHD及び移植片拒絶を含む移植片対宿主疾患(GVHD)等の、限定されるものではないが、アレルギー疾患及び自己免疫疾患及び免疫系の過剰活性と関連する疾患等の免疫機能障害を含む疾患を処置するのに有用である。
調節性T細胞を選択的に刺激する本発明によるIL-2バリアント(Tregアゴニストバリアント)は、ex vivo又はin vivoでTregを拡大するのに有用である。IL-2と拮抗する本発明によるIL-2バリアント(IL-2アンタゴニストバリアント)は、免疫系のIL-2媒介性過剰活性化を遮断するのに、又はTregをIL-2シグナル伝達から枯渇させ、結果として、抗腫瘍免疫応答又はワクチン若しくは病原体に対する免疫応答等の、B、NK、CD4+若しくはCD8+T細胞、DC、マクロファージその他、特に、in vivoでのCD8+T細胞免疫応答を含む免疫応答を刺激することによってTregを阻害するのに有用である。本明細書で使用される場合、「調節性T細胞を選択的に刺激すること」とは、IL-2バリアントが、非調節性T細胞よりも、調節性T細胞の増殖又は活性化を促進することを意味する。本明細書で使用される場合、「調節性T細胞」、「Treg」又は「Tregs」とは、CD3+CD4+Foxp3+CD25+及びCD3+CD4+Foxp3+CD25-細胞を含む、CD3+CD4+Foxp3+ T細胞を指す。本明細書で使用される場合、「エフェクターT細胞」、「Teff」又は「Teffs」とは、Tconv細胞(CD3+CD4+Foxp3-); CD8+ T細胞(CD3+CD8+)及びNK細胞(CD3-CD16+)のうちの1つ又は複数を指す。本明細書で使用される場合、「Tregを阻害する」とは、IL-2バリアントが、Treg細胞をIL-2シグナル伝達から枯渇させることによってTreg細胞の増殖、活性化、又は抑制機能を阻害することができることを意味する。Tregの阻害は、Treg機能の阻害又はTreg機能、特に、Treg免疫抑制機能の喪失及びTregの除去を含む。本発明のIL-2バリアントが調節性T細胞を選択的に刺激する能力を、限定されるものではないが、in vivoで処置された対象又はin vitroで処理された末梢血試料に由来するT細胞集団に対するSTAT5リン酸化アッセイ又はフローサイトメトリー分析を含む、当業界で周知であり、本出願の実施例に開示される標準的なアッセイによって測定することができる。IL-2バリアントがIL-2と拮抗する能力を、in vitroで処理された末梢血試料上のプロロイキンと競合するSTAT5リン酸化アッセイ又はCellTrace Violet(CTV)希釈アッセイを使用する増殖の定量化等の、当業界で周知であり、本出願の実施例に開示される標準的なアッセイによって決定することができる。
Tregアゴニストバリアントは、Tregを選択的に活性化し、次いで、免疫エフェクター細胞を阻害することによって、免疫活性化を間接的に減少させるのに有用である。本発明のTregアゴニストバリアントはかくして、限定されるものではないが、アレルギー疾患及び自己免疫疾患、並びに限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の免疫系の過剰活性を含む疾患等の、免疫モジュレーション又は免疫抑制が有益である疾患を処置するのに有用である。
IL-2アンタゴニストである本発明によるIL-2バリアントは、Tregを阻害し、結果として、免疫応答(B、NK、CD4+又はCD8+T細胞、DC、マクロファージその他)を刺激するのに有用である。本発明によるIL-2アンタゴニストバリアントは、抗腫瘍免疫応答又は病原体又はがん若しくは感染症に対するワクチンを含むワクチンに対する免疫応答、特に、抗腫瘍CD8+T細胞応答及び病原体又はワクチンに対する抗CD8+T細胞応答を刺激するのに有用である。更に、本出願の結果は、in vivoでのIL-2アンタゴニストの効果が、免疫状況に応じて変化してもよいことを示唆するため、IL-2アンタゴニストは、限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の、IL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患の状況にある患者に存在する過剰のIL-2を遮断することによって、免疫活性化を減少させるのにも有用である。
本発明は、α受容体と接触する領域の外側のIL-2の表面位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、インターロイキン-2(IL-2)バリアントを提供する。α受容体と接触する残基は、α受容体のいずれかの原子から8Å又はそれ未満の距離に少なくとも1個の原子を有するIL-2の残基と定義される。表面残基は、当業界で周知である標準的な方法(Fraczkiewiczら、J. Comp. Chem、1998、19、319～333頁)に従って決定した場合、50%を超える側鎖表面積が露出しているものと定義される。
一部の実施形態では、IL-2バリアントは、9、12、16、19、23、26、31、87、91及び95からなる群から選択される位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含み、示される位置は、配列番号1とのアラインメントによって決定される。
「少なくとも1個の置換を含む」とは、IL-2バリアントが、アミノ酸配列である配列番号1に関して示される1個又は複数のアミノ酸置換を有するが、限定されるものではないが、アミノ酸残基の置換、欠失又は付加を含む、他の改変を有してもよいことを意味する。IL-2バリアントは、上に列挙された置換のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。
一部の実施形態では、IL-2バリアントは、9、12、16、19、23、26、87、91及び95からなる群から選択される位置に1個又は複数のアミノ酸置換を含む。IL-2バリアントは、上に列挙された置換のうちの1、2、3、4、5、6、7、8個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。
一部の実施形態では、IL-2バリアントは、31、49、52、81、84、119、123、127、131及び132からなる群から選択される位置に少なくとも1個の更なる置換を含み、示される位置は、配列番号1とのアラインメントによって決定される。IL-2バリアントは、上に列挙された更なる置換のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。
一部のより好ましい実施形態では、前記バリアントは、119、123及び127位;31、119、123及び127位;31、49、52、81、84、119、123、131及び132位;31、49、52、81、84、131及び132位;又は49、52、81、84、119、123、131及び132位に更なる置換を含む。
一部の好ましい実施形態では、前記置換が91位にある場合、前記バリアントは、9、12、16、19、23、26、31、49、52、81、84、87、95、119、123、127、131又は132位に少なくとも別の置換を含む。IL-2バリアントは、上に列挙された更なる置換のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。好ましくは、バリアントは、9、12、16、19、23、26、87、91及び95位に置換を含み、最終的には、31、49、52、81、84、119、123、127、131及び132からなる群から選択される位置に少なくとも1個の更なる置換も含む。IL-2バリアントは、上に列挙された更なる置換のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。一部のより好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、119、123及び127位;31、119、123及び127位;31、49、52、81、84、119、123、131及び132位;31、49、52、81、84、131及び132位;又は49、52、81、84、119、123、131及び132位に更なる置換を含む。
一部の他の実施形態では、IL-2バリアントは、31位に1個の置換を含む;IL-2バリアントは、前記置換のうちの1個のみを含み、これは、IL-2バリアントが他の示された位置(9、12、16、19、23、26、87、91、95及び49、52、81、84、119、123、127、131及び132)にいかなる置換も含まないことを意味する。
一部の好ましい実施形態では、9、12及び81位のアミノ酸は、D又はE、好ましくはEによって置換される。
一部の好ましい実施形態では、16、19、26、91、95、119、127及び131位のアミノ酸は、K又はRによって置換される;好ましくは、16、19及び131位のアミノ酸は、Rによって置換され、26、91、95及び127位のアミノ酸は、Kによって置換される。
一部の好ましい実施形態では、23及び123位のアミノ酸は、E、Q、T、N、G、A、V、L、I及びMから選択される別のアミノ酸によって置換される;より好ましくは、23位のアミノ酸は、Lによって置換され、123位のアミノ酸は、Aによって置換される。
一部の好ましい実施形態では、31位のアミノ酸は、N又はP、好ましくはPによって置換される。
一部の好ましい実施形態では、49、52、84、87及び132位のアミノ酸は、M、V、E、D、S、T、C、N及びQから選択される別のアミノ酸によって置換される;好ましくは、87及び84位のアミノ酸は、Nによって置換される;49位のアミノ酸は、Qによって置換され、52及び132位のアミノ酸は、Sによって置換される。
IL-2バリアントは、上に列挙された置換のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。
一部の好ましい実施形態では、前記IL-2バリアントは、K9E又はK9D、L12E又はL12D、H16R又はH16K、L19R又はL19K、M23L、N26K又はN26R、S87N、V91K又はV91R、E95K又はE95R置換から選択される少なくとも1個又は複数(すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8又は9個)の置換;好ましくは、K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K及びE95Kから選択される1個又は複数(すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8又は9個)の置換を含む。好ましくは、前記IL-2バリアントは、上に列挙された置換の全部を含む。一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、N119K又はN119R、T123A、及びS127K又はS127R;Y31P、N119K又はN119R、T123A、及びS127K又はS127R;Y31P、K49Q、E52S、R81E又はR81D、D84N、N119K又はN119R、T123A、T131R又はT131K及びL132S;Y31P、K49Q、E52S、R81E又はR81D、D84N、T131R又はT131K及びL132S;又はK49Q、E52S、R81E又はR81D、D84N、N119K又はN119R、T123A、T131R又はT131K及びL132Sからなる群から選択される更なる置換を含む。好ましくは、N119K、T123A、及びS127K;Y31P、N119K、T123A、及びS127K;Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S;Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、T131R及びL132S;又はK49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132Sからなる群から選択される。
一部の好ましい実施形態では、前記IL-2バリアントは、ヒトIL-2バリアントである。
前記好ましい実施形態によれば、前記IL-2バリアント、好ましくは、ヒトIL-2バリアントは、
a) K9E又はK9D、L12E又はL12D、H16R又はH16K、L19R又はL19K、M23L、N26K又はN26R、S87N、V91K又はV91R、E95K又はE95R置換;好ましくは、K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K及びE95K置換;並びに
a1) N119K又はN119R、T123A、及びS127K又はS127R;好ましくは、N119K、T123A、及びS127K;
a2) Y31P、N119K又はN119R、T123A、及びS127K又はS127R;好ましくは、Y31P、N119K、T123A、及びS127K;
a3) Y31P、K49Q、E52S、R81E又はR81D、D84N、N119K又はN119R、T123A、T131R又はT131K及びL132S;好ましくは、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S;
a4) K49Q、E52S、R81E又はR81D、D84N、N119K又はN119R、T123A、T131R又はT131K及びL132S;好ましくは、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S;並びに
a5) Y31P、K49Q、E52S、R81E又はR81D、D84N、T131R又はT131K及びL132S;好ましくは、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、T131R及びL132S
からなる群から選択される更なる置換;又は
b)Y31P又はY31N、好ましくは、Y31P置換
を含み、
示された位置は、配列番号1とのアラインメントによって決定される。
本発明によれば、a)の置換及びa3)又はa5)の更なる置換を有するIL-2バリアントは、調節性T細胞を選択的に刺激することができるが(Tregアゴニストバリアント)、a)の置換及びa1)、a2)又はa4)の更なる置換を有するIL-2バリアント、並びにb)の置換を有するIL-2バリアントは、IL-2と拮抗することができる(IL-2アンタゴニストバリアント)。
一部のより好ましい実施形態では、ヒトIL-2バリアントは、
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、N119K、T123A、及びS127K置換を含むバリアント;このバリアントは、実施例ではIL2-v1(IL2V1、IL2-V1、IL-2V1、IL-2-V1又はIL-2 V1)と命名される;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S置換を含むバリアント;このバリアントは、実施例ではIL2-v2(IL2V2、IL2-V2、IL-2V2、IL-2-V2又はIL-2 V2)と命名される;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、T131R及びL132S置換を含むバリアント;このバリアントは、実施例ではIL2-v3(IL2V3、IL2-V3、IL-2V3、IL-2-V3又はIL-2 V3)と命名される;
- 他の示された位置(9、12、16、19、23、26、87、91、95及び49、52、81、84、119、123、127、131及び132)にいかなる置換も含まない、Y31P置換を含むバリアント;このバリアントは、実施例ではIL2-v4 (IL2V4、IL2-V4、IL-2V4、IL-2-V4又はIL-2 V4)と命名される;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、N119K、T123A、及びS127K置換を含むバリアント;このバリアントは、実施例ではIL2-v5(IL2V5、IL2-V5、IL-2V5、IL-2-V5又はIL-2 V5)と命名される;
- K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S置換を含むバリアント;このバリアントは、実施例ではIL2-v6(IL2V6、IL2-V6、IL-2V6、IL-2-V6又はIL-2 V6)と命名される;
からなる群から選択される。
様々な実施形態では、IL-2バリアント(Tregアゴニストバリアント又はIL-2アンタゴニスト)は、少なくとも1個の更なるアミノ酸突然変異(挿入、欠失、置換)を含んでも、含まなくてもよい。一部の実施形態では、IL-2バリアントは、更なるアミノ酸突然変異を含まない。一部の他の実施形態では、IL-2バリアントは、少なくとも1個の更なるアミノ酸突然変異(挿入、欠失、置換)を含む。IL-2バリアントは、好ましくは、少なくとも1個のアミノ酸欠失を、より好ましくは、S4、S5又はS6から選択される位置に含み、示された位置は、配列番号1とのアラインメントによって決定される。IL-2バリアントは、上に列挙された置換と共に、上に列挙された欠失のうちの1、2個又は全部を含んでもよい。これらの可能な組合せの全部が、具体的に企図される。
様々な実施形態では、IL-2バリアントは、野生型IL-2又は野生型IL-2構築物に由来してもよい。一部の実施形態では、IL-2バリアントは、配列番号2の野生型ヒトIL-2構築物に由来する。一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、配列番号3～8のいずれか1つを含むか、又はそれからなる。
IL-2バリアントは、少なくとも125アミノ酸のサイズである。好ましくは、IL-2バリアントは、少なくとも130アミノ酸以上のサイズである。
一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、配列番号1との少なくとも70%のアミノ酸同一性を有する。好ましくは、前記IL-2バリアントは、前記配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する。より好ましくは、前記IL-2バリアント配列は、前記配列との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性、更により好ましくは、前記配列との少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する。
アミノ酸配列同一性パーセントは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性を達成し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない後、参照配列と同一である比較配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義される。配列同一性は、参照配列の全長にわたって算出される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントを、当業者には公知の様々な方法で、例えば、BLAST(Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215、403頁-)等の公共利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。そのようなソフトウェアを使用する場合、好ましくは、例えば、ギャップペナルティ及び伸長ペナルティに関するデフォルトパラメーターが使用される。BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長(W)及び10の期待値(E)を使用する。
一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130及び133位又は4、8、10、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、38、42、45、48、62、67、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、90、92、110、125、126、128、129、130及び133位にいかなる置換も含まない。
一部の好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、配列番号3～8の配列及び前記配列との少なくとも70%のアミノ酸同一性を有する配列からなる群から選択される。好ましくは、前記IL-2バリアントは、前記配列との少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する。より好ましくは、前記IL-2バリアントは、前記配列との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性、更により好ましくは、前記配列との少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する;より好ましくは、前記IL-2バリアントは、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130及び133位又は4、8、10、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、38、42、45、48、62、67、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、90、92、110、125、126、128、129、130及び133位にいかなる置換も含まない。
一部の実施形態では、IL-2バリアントは、調節性T細胞(Treg)を選択的に刺激することができる。そのようなバリアントの非限定例としては、上で定義されたバリアントIL-2V2及びIL-2V3が挙げられる。一部の好ましい実施形態では、前記IL-2バリアントは、配列番号4及び配列番号5の配列、並びに上で定義された、前記配列との少なくとも70%のアミノ酸同一性を有する配列からなる群から選択される;より好ましくは、前記IL-2バリアントは、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130及び133位又は4、8、10、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、38、42、45、48、62、67、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、90、92、110、125、126、128、129、130及び133位にいかなる置換も含まない。本発明のTregを選択的に刺激することができるIL-2バリアント(Tregアゴニスト)は、限定されるものではないが、アレルギー疾患及び自己免疫疾患、並びに限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の免疫系の過剰活性を含む疾患等の、免疫モジュレーション又は免疫抑制が有益である疾患を処置するのに有用である。
一部の実施形態では、IL-2バリアントは、IL-2アンタゴニストである。そのようなバリアントの非限定例としては、上で定義されたバリアントIL-2V1、IL-2V4、IL-2V5及びIL-2V6、好ましくは、IL-2V1又はIL-2V4、より好ましくは、IL-2V4が挙げられる。一部の好ましい実施形態では、前記IL-2バリアントは、配列番号3、6、7及び8の配列、並びに上で定義された、前記配列との少なくとも70%のアミノ酸同一性を有する配列、好ましくは、配列番号3又は前記配列との少なくとも70%のアミノ酸同一性を有する配列からなる群から選択される;より好ましくは、前記IL-2バリアントは、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130及び133位又は4、8、10、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、38、42、45、48、62、67、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、90、92、110、125、126、128、129、130及び133位にいかなる置換も含まない。本発明によるIL-2アンタゴニストを使用して、in vivoで有害な免疫応答を抑制するか、又はin vivoで有益な免疫応答を刺激することができる。したがって、本発明によるIL-2アンタゴニストは、限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の、IL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患を処置するのに有用である。IL-2アンタゴニストはまた、内因性野生型IL-2シグナル伝達からTregを枯渇させることによって、Tregを阻害し、その結果として、免疫応答(B、NK、CD4+又はCD8+T細胞、DC、マクロファージその他)、特に、CD8+T細胞免疫応答を刺激するのに有用である。したがって、IL-2アンタゴニストバリアントはまた、限定されるものではないが、がん、感染症及びワクチン接種等の、Treg阻害及び/又は免疫応答、特に、CD8+T細胞免疫応答の刺激が有益である免疫障害を防止又は処置するのに有用である。
本発明は、改変バリアントが機能的である(すなわち、Tregを選択的に刺激するか、又はIL-2と拮抗することができる)限り、1つ又は複数のアミノ酸残基、ペプチド結合、N及び/又はC末端中に1つ又は複数の改変を有するIL-2バリアントを包含する。好ましい改変は、本発明によるIL-2バリアントの安定性又はバイオアベイラビリティを増大させるもの、特に、in vivoでのその半減期を増加させる;その免疫原性を低下させる;又はその精製、検出若しくは特定の細胞型若しくは組織への標的化を容易にするものである。当業者には公知の従来の方法によってバリアント中に導入されるこれらの改変としては、非限定的な様式で、アミノ酸配列中の1個又は複数のアミノ酸の突然変異(挿入、欠失、置換);目的のアミノ酸部分(治療的使用のための目的のタンパク質若しくは精製、検出(抗体エピトープ若しくは標識)のためのタグとの融合又は目的の分子若しくは薬剤へのカップリング;非タンパク質原性アミノ酸(Dアミノ酸又はアミノ酸アナログ)による天然アミノ酸の置換;特に、retro型若しくはretro-inverso型の結合又はペプチド結合とは異なる結合による、ペプチド結合の改変;特に、目的の分子又は薬剤のバリアントへのカップリングのための、環化、並びにバリアントのアミノ酸側鎖又はN及び/若しくはC末端への化学基の付加が挙げられる。改変としては、非限定的な様式で、エステル化、グリコシル化、アセチル化又はミリスチン酸の連結等のアシル化、アミド化、リン酸化、ビオチン化、PEG化、ファルネシルのカップリング及び当業界で周知である同様の改変が挙げられる。改変を、IL-2バリアントのN末端(アセチル化)、C末端(アミド化)に導入するか、又は好適であると考えられる場合、末端アミノ酸以外のアミノ酸にも導入することができる(例えば、システイン側鎖へのファルネシルカップリング)。C末端上のアミノ酸機能の、システイン残基のチオール機能のアルデヒド及びアルキル化への変換が、化学選択的ライゲーション又は還元型ペプチド結合の形成のために使用される。
特に、本発明は、ペプチド結合を介して連結された天然アミノ酸(L及び/又はD配置にある20種の遺伝子によりコードされたアミノ酸(A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、X及びY))の鎖を含むか、又はそれからなるIL-2バリアントを包含し、更に、アミノ酸、ペプチド結合、N及び/又はC末端が機能的アナログによって置き換えられたそのようなバリアントのペプチド模倣体を含む。アミノ酸のそのような機能的アナログは、前記20種の遺伝子によりコードされたアミノ酸以外の全ての公知のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、IL-2バリアントは、それが少なくとも目的の薬剤と結合している形態で、例えば、分子複合体又は粒子;コンジュゲート又は融合タンパク質等の複合体の形態で提供される。目的の薬剤としては、限定されるものではないが、患者のキメラ抗原受容体(CAR)T細胞等の細胞を含む任意の治療剤、本発明によるIL-2バリアントの安定性若しくはバイオアベイラビリティを増加させる、特に、in vivoでのその半減期を増加させる任意の薬剤;その免疫原性を低下させる任意の薬剤;又はその精製、検出若しくは特定の細胞型若しくは組織へのその標的化を容易にする任意の薬剤が挙げられる。目的の薬剤は、小さい、又は大きい化合物、高分子又は粒子であってもよい。粒子としては、限定されるものではないが、リポソーム、ミセル並びにナノ担体等の活性薬剤を担持するリポソーム、ミセル及びナノ粒子を含むナノ粒子が挙げられる。例えば、IL-2バリアント、及び最終的には、目的の他の薬剤を、粒子中に封入するか、又は当業界で周知の手段によって前記粒子上に移植することができる。好ましい実施形態では、目的の薬剤は、ペプチド;抗体を含むタンパク質;ヒト又は動物の疾患の処置のための薬物のような生物活性物質;標識、タグ及び粒子からなる群から選択される。
一部のより好ましい実施形態では、目的の薬剤は、抗IL-2抗体、好ましくは、プロTreg若しくはプロTエフェクター機能を有する抗IL-2抗体又は少なくとも抗原結合部位を含むその機能的断片;より好ましくは、ヒト又はヒト化抗IL-2抗体である。プロTreg機能を有する抗IL-2抗体又はその断片は、限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の、免疫系の過剰活性と関連する疾患の処置にとって有用である。プロTエフェクター機能を有する抗IL-2抗体又はその断片は、限定されるものではないが、がん、感染症及びワクチン接種等の、Treg阻害及び/又はCD8+T細胞応答の刺激が有益である免疫障害を防止又は処置するのに有用である。一部の実施形態では、抗IL-2抗体、好ましくは、プロTreg又はプロTエフェクター機能を有する抗IL-2抗体は、全抗体分子である。
一部のより好ましい実施形態では、目的の薬剤は、Tregに特異的な表面分子のリガンドを含むか、又はそれからなる。Tregに特異的な表面分子は、当業界で公知であり、例えば、Bhairavabhotlaら、Human Immunol.、2016、77、201～13頁; van der Veekenら、Cold Spring Harb. Symp. Quant Biol.、2013、78、215～22頁; Pfoertnerら、Genome Biol.、2006、7、R54; Sugimotoら、Int. Immunol.、2006、18、1197頁～に開示されている。本発明において使用することができるTregに特異的な表面分子の非限定例としては、CD25、CTLA-4、CCR8、ICOS、IKZF2、CD70、GARP、IL1R1、CD39、CCR4、及びCD177が挙げられる。
目的の薬剤は、好ましくは、Tregに特異的な前記表面分子に対する抗体又は少なくとも抗原結合部位を含むその機能的断片;好ましくは、抗CTLA-4抗体、抗CD25抗体、抗CCR8抗体、抗ICOS抗体、抗IKZF2抗体、抗CD70抗体、抗GARP抗体、抗IL1R1抗体、抗CD39抗体、抗CCR4抗体又は抗CD177抗体;より好ましくは、ヒト又はヒト化抗体である。一部の実施形態では、Treg特異的表面分子に対する抗体は、全抗体分子、好ましくは、全ヒト又はヒト化抗体分子である。
一部のより好ましい実施形態では、目的の薬剤は、全抗体又は抗体Fc領域、好ましくは、全ヒト抗体又はヒトFc領域;二重特異性抗体等の多重特異性抗原結合タンパク質;Ankyrin and Designed Ankyrin Repeat Protein(DARPin);クラスI又はクラスII MHC-ペプチド四量体等のMHC-ペプチド多量体、特に、MHC-ペプチド多量体からなる群から選択される。MHC-ペプチド多量体中のペプチドは、自己抗原等の自己免疫若しくは同種免疫応答を誘導することができる抗原又は病原体若しくは腫瘍に由来する抗原等の外来抗原、特に、病原体若しくは腫瘍に対するワクチン抗原に由来してもよい。
複合体、コンジュゲート又は融合タンパク質が、本発明による1より多いIL-2バリアント、すなわち、複数のそのようなバリアントを含み、それによって、複数のバリアントが複数の同じか、又は異なるバリアントを含んでもよいことは、本発明の範囲内にある。また、本発明による複合体、コンジュゲート又は融合タンパク質は、1より多い目的の薬剤を含んでもよく、それによって、複数の薬剤は、複数の同じか、又は異なる薬剤を含んでもよい。
目的の薬剤は、本発明のIL-2バリアントに共有的に、又は非共有的に連結される。目的の薬剤を、IL-2バリアントに、直接的又は間接的にカップリングすることができる。目的の薬剤のIL-2バリアントへの間接的カップリングは、本発明のIL-2バリアントに結合したリンカーを介するものであってよい。本発明のIL-2バリアントと、目的の薬剤とを物理的に隔てるために使用することができる、スペーサーとも命名されるリンカーは、当業界で公知であり、ペプチド結合、アミノ酸、適切な長さのペプチド又は所望の特徴を提供する異なる分子が挙げられる。リンカーを、IL-2バリアントのN末端、C末端に結合させるか、又は好適であると考えられる場合、末端アミノ酸以外の任意のアミノ酸にも結合させることができる。本発明のIL-2バリアントは、標準的なコンジュゲーション技術を使用して、共有結合によって目的の薬剤に化学的に連結することができる。目的の薬剤を、IL-2バリアントのN末端、C末端に、又は適用可能な場合、末端アミノ酸以外の任意のアミノ酸に連結することができる。官能基、誘導体化とも呼ばれる改変又はリンカーを、IL-2バリアントを、目的の薬剤にコンジュゲートさせるためにIL-2バリアント中に導入することもできる。そのような共有結合は、好ましくは、IL-2バリアントの好適な反応基と目的の薬剤との間、より好ましくは、本発明によるIL-2バリアントの末端と目的の薬剤との間で形成される。目的の薬剤の化学的性質に応じて、そのような共有結合が形成される部分、基又はラジカルは変化し、そのような結合を作出することは当業者の技術の範囲内にある。化学的結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル、チオール-マレイミド又はアミド結合によるものであってもよい。IL-2バリアントをカーゴに連結する他の方法としては、オキシムを形成させるためのC末端アルデヒドの使用、クリック反応の使用又はペプチド上での塩基性アミノ酸とのモルホリノ結合の形成が挙げられる。
目的の薬剤が抗体又はその機能的断片を含むペプチド又はタンパク質である場合、IL-2バリアントは、有利には、直接的に、又は上記のペプチドスペーサーを介して、本発明のIL-2バリアントのN末端若しくはC末端に融合された、又はそのアミノ酸配列中に挿入された、目的の異種薬剤(IL-2又はIL-2断片とは異なる)を含むキメラ融合タンパク質として提供される。融合タンパク質は、本発明のIL-2バリアントをコードするヌクレオチド配列が、標準的な組換えDNA技術を使用して目的のペプチド/タンパク質をコードするヌクレオチド配列に読み枠を合わせて融合されたキメラ構築物から発現される。得られる融合タンパク質/ペプチドは、異種起源のものである、すなわち、それは、IL-2又は同じファミリーの他のサイトカイン等の天然に存在するペプチド又はタンパク質とは異なる。
IL-2バリアントを、イオン結合、水素結合若しくは疎水性相互作用又はそのような結合の組合せ等の非共有結合によって目的の薬剤(分子又は分子を担持する粒子)に連結することもできる。非限定例としては、IL-2バリアントと抗IL-2抗体との間の抗原-抗体相互作用;ビオチン化IL-2バリアントと、ストレプトアビジンにコンジュゲートされた目的の薬剤(例えば、量子ドットのようなナノ粒子)との間又はビオチン化された薬剤と、ストレプトアビジンにコンジュゲートされたIL-2バリアントとの間のストレプトアビジン-ビオチン相互作用が挙げられる。
好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、直接的に、又はペプチドスペーサーを介して、本発明のIL-2バリアントのN末端若しくはC末端に融合された、又はそのアミノ酸配列中に挿入された目的の異種タンパク質又はペプチドを含むキメラ融合タンパク質として提供される。目的のタンパク質又はペプチドは、好ましくは、全抗体又は抗体Fc領域、好ましくは、全ヒト抗体又はヒトFc領域;二重特異性抗体等の多重特異性抗原結合タンパク質;Ankyrin and Designed Ankyrin Repeat Protein(DARPin);クラスI又はクラスII MHC-ペプチド四量体等のMHC-ペプチド多量体、特に、ペプチドが自己抗原等の自己免疫又は同種免疫応答を誘導することができる抗原に由来するMHC-ペプチド多量体からなる群から選択される。一部のより好ましい実施形態では、抗体は、Tregに特異的な表面分子に対する抗体又は少なくとも抗原結合部位を含むその機能的断片、好ましくは、抗CTLA-4抗体、抗CD25抗体、抗CCR8抗体、抗ICOS抗体、抗IKZF2抗体、抗CD70抗体、抗GARP抗体、抗IL1R1抗体、抗CD39抗体、抗CCR4抗体又は抗CD177抗体;より好ましくは、ヒト若しくはヒト化抗体又は全抗体分子、更により好ましくは、全ヒト又はヒト化抗体分子である。
目的のタンパク質又はペプチドは、有利には、直接的に、又はペプチドスペーサーを介して、本発明のIL-2バリアントのN末端又はC末端に融合される。
好ましい実施形態では、上に開示されたIL-2バリアント又は由来する融合タンパク質は、抗IL-2抗体と複合体化される。一部のより好ましい実施形態では、抗IL-2抗体は、プロTreg機能を有する、すなわち、IL-2RB/IL-2相互作用を遮断し、IL-2上の構造改変を誘導するIL-2抗体である。そのような抗体は、当業界で周知であり、例えば、クローンJES6-1A12(ラットIgG2A抗マウスIL-2抗体)及びクローン5344.111(マウスIgG1抗ヒトIL-2抗体)を含む。これらのAbは、糖尿病(Tang Qら、Immunity、2008、28、687～97頁; Grinberg-Bleyer Yら、J Exp Med、2010、207、1871～8頁)、アレルギー(Smaldini PLら、Allergy、2018、73、885～895頁)、多発性硬化症(Webster K.E.ら、J Exp Med、2009、206、751～60頁)、関節リウマチ(Lee-S Yら、Immunology、2012、137、305～16頁)及び移植(Vokaer Bら、Transplant Proc.、2012、44、2840～4頁)の前臨床モデルにおいてTregを拡大する能力in vivoで示した。一部の他のより好ましい実施形態では、抗IL-2抗体は、プロTeff機能を有するIL-2抗体である。そのような抗体は、当業界で周知であり、例えば、クローンS4B6(ラットIgG2A抗マウスIL-2抗体)及びクローンMab602(マウスIgG2a抗ヒトIL-2抗体)を含む。これらのAbは、メラノーマ(単一処置又は組合せとして)(Boyman Oら、Science 2006、311、1921～27頁、Kriegら、PNAS、2010、107、11906～11頁、Caudana Tら、2019、Cancer Immunol Res、7、443～457頁)及びリンパ腫(Newman RGら、Blood、2014、123、3045～55頁)における腫瘍増殖を制御する、IL-2より良好な能力をin vivoで示した。抗IL-2抗体は、有利には、上記のマウス又はラットモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体を含む、ヒト又はヒト化抗IL-2抗体である。
好ましい実施形態では、上に開示されたIL-2バリアント又は由来する融合タンパク質は、上で定義されたTreg特異的表面分子に対する抗体、好ましくは、全抗体、より好ましくは、全ヒト抗体と複合体化される。
好ましい実施形態では、IL-2バリアントは、CAR T細胞、特に、患者のCAR T細胞に連結される。
本明細書で使用される用語「IL-2バリアント」は、上で開示された複合体、コンジュゲート又は融合タンパク質の形態の少なくとも目的の薬剤で改変された、又は改変されていない、結合した、又は結合していないIL-2バリアント等の、本明細書に開示される異なる形態のIL-2バリアントを包含する。
本発明によるIL-2バリアントを、当業界における日常的な技術によって、特に、好適な細胞系(真核又は原核)における組換えDNAの発現によって作製し、本明細書に記載のアッセイ又は他の同様のアッセイを使用して、活性(すなわち、調節性T細胞を選択的に刺激することができること)についてスクリーニングすることができる。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、発現可能な形態のIL-2バリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
発現可能な形態のIL-2バリアントをコードするポリヌクレオチドとは、細胞系又は無細胞系における発現の際に、機能的タンパク質をもたらす核酸分子を指す。
合成又は組換えであるポリヌクレオチドは、一本鎖及び/又は二本鎖のDNA、RNA又はその組合せであってもよい。ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの転写調節配列及び必要に応じて、少なくとも1つの翻訳調節配列に作動可能に連結される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、IL-2バリアントが発現される宿主のために最適化されたコード配列を含む;より好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号3～8のIL-2バリアントをコードする、配列番号9～14からなる群から選択される。
本発明によるポリヌクレオチドは、当業界で公知の従来の方法によって調製される。例えば、それは、PCR若しくはRT-PCRによる核酸配列の増幅、相同プローブとのハイブリダイゼーションによるゲノムDNAライブラリーのスクリーニング、又はその他、全体的若しくは部分的化学合成によって生産される。
本発明の別の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。組換えベクターは、有利には、原核又は真核細胞、例えば、哺乳動物又は細菌細胞等の宿主細胞中に送達された場合、前記ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。組換えベクターは、例えば、プラスミド及びウイルスベクターを含む遺伝子操作及び遺伝子療法において使用される通常のベクターを含む。
組換えベクターは、当業界で公知である、従来の組換えDNA、遺伝子操作及び遺伝子療法技術によって構築され、宿主細胞中に導入される。
かくして、本発明の更なる態様は、前記ポリヌクレオチド又は組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
一部の実施形態では、宿主細胞は、例えば、養子T細胞療法のための使用のために、本発明によるポリヌクレオチド又はベクターによって改変された、T細胞、NK細胞又はCAR T細胞等の患者細胞である。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、寄託番号CNCM I-5377(IL2-V1)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された宿主細胞である。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、寄託番号CNCM I-5378(IL2-V2)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された宿主細胞である。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、寄託番号CNCM I-5379(IL2-V3)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された宿主細胞である。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、寄託番号CNCM I-5380(IL2-V4)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された宿主細胞である。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、寄託番号CNCM I-5381(IL2-V5)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された宿主細胞である。
一部の実施形態では、本発明の宿主細胞は、寄託番号CNCM I-5382(IL2-V6)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された宿主細胞である。
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞は、周知の組換えDNA技術を使用する本発明のバリアントの生産にとって有用である。
医薬組成物及び治療的使用
本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞は、免疫障害を処置するために使用される。
本明細書で使用される場合、用語「処置」又は「処置する」とは、予防的処置又は防止的処置と、疾患に罹患するリスクがあるか、又は疾患に罹患していることが疑われる患者並びに病気であるか、又は疾患若しくは医学的状態に罹患していると診断された患者の処置を含む、治癒的処置又は疾患改変処置との両方を指し、臨床的再発の抑制を含む。処置を、障害若しくは再発障害を防止する、治癒させる、その開始を遅延させる、その重症度を低下させる、若しくはその1つ若しくは複数の症状を改善するために、又はそのような処置の非存在下で予想されるものを超えて患者の生存を延長させるために、医学的障害を有するか、又は最終的には障害を獲得するかもしれない患者に投与することができる。
一部の実施形態では、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞は、免疫系の機能障害又は過剰活性と関連する疾患を含む、免疫モジュレーション又は免疫抑制が有益である免疫調節異常と関連する疾患を処置するために、ex vivo若しくはin vivoでTregを拡大するため、又は免疫系のIL-2媒介性過剰活性化を遮断するために使用される。特に、調節性T細胞を選択的に刺激することができるIL-2バリアント(Tregアゴニスト)は、アレルギー疾患及び自己免疫疾患並びに急性又は慢性炎症疾患、GVHD及び移植片拒絶等の免疫系の過剰活性と関連する免疫障害等の免疫系の機能障害と関連する免疫障害を処置するために使用される。IL-2アンタゴニストバリアントは、GVHD、特に、急性GVHD及び急性又は慢性炎症疾患及び移植片拒絶のような他の疾患のようなIL-2の過剰産生を含む免疫系の過剰活性と関連する疾患を処置するために使用される。
ex vivoでの療法のために、末梢血試料を患者から収集する;T細胞を、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド及び/又はベクターを使用してin vitroで拡大した後、拡大されたTregを患者に再注入する。in vivoでの療法のために、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド及び/又はベクターを患者に投与し、Tregを患者中、in vivoで拡大する。或いは、又は更に、患者に既に存在するIL-2を、IL-2バリアントによって拮抗させる。
一部の実施形態では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞は、がん若しくは感染症を処置するため、又はワクチン、特に、がん若しくは感染症のためのワクチンに対する免疫応答を増加させるために、TregをIL-2から枯渇させ、かくして、B、NK、CD4+又はCD8+T細胞、DC、マクロファージその他を含む免疫応答の刺激を可能にすることによって、Tregを阻害するために使用される。一部の好ましい実施形態では、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞は、抗腫瘍CD8+T細胞応答又は病原体又はがん若しくは感染症に対するワクチンを含むワクチンに対するCD8+T細胞応答を刺激するために使用される。
in vivo療法のために、本発明によるIL-2アンタゴニストバリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞は、患者に投与され、Tregは患者においてin vivoで阻害又は除去され、Treg抑制から免疫細胞(B、NK、CD4+又はCD8+T細胞;DC;マクロファージその他)を解放する。
本発明は、活性物質としての、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞と、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。
医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、非経口及び局部を含む、いくつかの経路による投与のために製剤化される。薬学的ビヒクルは、当業界で周知である、計画された投与経路にとって適切なものである。
医薬組成物は、担体を更に含んでもよい。本発明の組成物における使用にとって好適な担体の非限定例としては、単層又は多層リポソーム、ISCOMS、ビロソーム、ウイルス偽粒子、サポニンミセル、サッカリド(ポリ(ラクチド-コ-グリコリド))又は金ミクロスフェア、及びナノ粒子が挙げられる。
医薬組成物は、それが投与される個体において肯定的な医学的応答を示すのに十分な、治療有効量のIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞を含む。肯定的な医学的応答とは、その後の(防止的処置)又は確立された(治療的処置)疾患症状の低減を指す。肯定的な医学的応答は、疾患の症状の部分的又は全体的阻害を含む。肯定的な医学的応答を、疾患の客観的臨床兆候及び/又は生存の増加等の様々な客観的パラメーター又は基準を測定することによって決定することができる。本発明による組成物に対する医学的応答を、当業界で周知であり、本出願の実施例に例示される疾患の適切な動物モデルにおいて容易に検証することができる。
薬学的有効用量は、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物の型(ヒト又は動物)、考慮する特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬剤、及び医学界の当業者が認識する他の因子に依存する。
「治療レジメン」とは、病気の処置のパターン、例えば、療法中に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含んでもよい。語句「誘導レジメン」又は「誘導期間」とは、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間中に患者に対して高レベルの薬物を提供することである。誘導レジメンは、(部分的又は全体的に)医師が維持レジメン中に用いるよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメン中に薬物を投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含んでもよい、「負荷レジメン」を用いてもよい。語句「維持レジメン」又は「維持期間」とは、例えば、患者を長期間(数ヶ月又は数年)にわたる寛解に保持するために、病気の処置中に患者の維持のために使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。維持レジメンは、持続的療法(例えば、規則的な間隔で、例えば、毎週、毎月、毎年等で薬物を投与すること)又は間欠的療法(例えば、中断された処置、間欠的処置、再発時の処置、若しくは特定の所定の基準[例えば、疼痛、疾患兆候等]の達成時の処置)を用いてもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒト又は動物における疾患を防止、処置又は改善することができる医薬品又は治療剤である、別の活性薬剤を含む。活性薬剤は、抗体を含むタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)、低分子干渉RNA、ロックド核酸(LNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)及びデコイDNA分子、プラスミド、DNA、RNA若しくはペプチドアプタマーを含むアプタマー、低分子若しくは高分子化学薬品、又はその混合物であってもよい。特に、活性薬剤は、例えば、ラパマイシン又はコルチコイド等の抗炎症剤又は免疫調節剤であってもよい。活性薬剤はまた、抗がん剤若しくは抗感染剤又は腫瘍抗原若しくは病原体の抗原等の抗原であってもよい。
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は医薬組成物も提供する。
本発明はまた、免疫障害の防止又は処置における使用のための、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は医薬組成物も提供する。
一部の実施形態では、免疫機能障害又は調節異常と関連する疾患は、限定されるものではないが、アレルギー疾患、自己免疫疾患、及び限定されるものではないが、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)又は移植片拒絶等の免疫系の過剰活性と関連する疾患等の、免疫抑制が有益である疾患である。自己免疫疾患の非限定例としては、1型糖尿病、関節リウマチ、乾癬及び乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(狼瘡)、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン病、円形脱毛症、橋本甲状腺炎等の自己免疫性甲状腺疾患、重症筋無力症、HVC関連血管炎及び全身性血管炎を含む血管炎、ブドウ膜炎、筋炎、悪性貧血、セリアック病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、強皮症、溶血性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性脳炎、線維筋痛症、再生不良性貧血その他が挙げられる。炎症疾患及びアレルギー疾患の非限定例としては、パーキンソン病等の神経変性障害、寄生虫感染又はトリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)感染のような疾患等の慢性感染、喘息等のアレルギー、アテローム性動脈硬化症、慢性腎症その他が挙げられる。疾患は、移植拒絶、移植片対宿主疾患(GVHD)及び自然流産を含む同種移植片拒絶であってもよい。
一部の実施形態では、免疫調節異常又は機能障害と関連する疾患は、限定されるものではないが、がん及び感染症等の、Tregの阻害及び/又は免疫応答、特に、CD8+T細胞免疫応答の刺激が有益である疾患である。本発明は、感染症及びがんの処置並びにワクチン、特に、がん若しくは感染症のためのワクチンに対する免疫応答の増加を含む。
本明細書で使用される場合、用語「がん」とは、未制御の細胞分裂及び侵入による隣接組織中での直接増殖又は転移による遠隔部位への移植によって、これらの細胞が他の組織に侵入する能力を特徴とする任意数の疾患又は障害クラスを指す。転移は、がん細胞が血流又はリンパ系を通って輸送されるステージと定義される。本発明によるがんという用語はまた、がん転移及びがんの再発も含む。がんは、腫瘍が類似し、したがって、組織が腫瘍の起源であると推定される細胞の型によって分類される。例えば、癌腫は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この群は、一般的な形態の乳がん、前立腺がん、肺がん、及び結腸がんを含む、最も一般的ながんである。リンパ腫及び白血病は、血液及び骨髄細胞に由来する悪性腫瘍を含む。肉腫は、結合組織又は間葉細胞に由来する悪性腫瘍である。中皮腫は、腹膜及び胸膜を補強する中皮細胞に由来する腫瘍である。グリオーマは、最も一般的な型の脳細胞であるグリアに由来する腫瘍である。胚細胞腫は、通常は精巣及び卵巣に見出される、生殖細胞に由来する腫瘍である。絨毛癌は、胎盤に由来する悪性腫瘍である。
本明細書で使用される場合、用語「がん」とは、以下の組織又は臓器:乳房;肝臓;腎臓;心臓、縦隔、胸膜;口腔底;口唇;唾液腺;舌;歯肉;口腔;口蓋;扁桃腺;喉頭;気管;気管支、肺;咽頭、下咽頭、口腔咽頭、鼻咽頭;食道;胃、肝内胆管、胆管、膵臓、小腸、結腸等の消化器;直腸;膀胱、胆嚢、尿管等の泌尿器;直腸S状結腸移行部;肛門、肛門管;皮膚;骨;関節、四肢の関節軟骨;眼及び付属器;脳;末梢神経、自律神経系;脊髄、脳神経、髄膜;及び中枢神経系の様々な部分;結合組織、皮下組織及び他の軟組織;後腹膜、腹膜;副腎;甲状腺;内分泌腺及び関連構造;卵巣、子宮、子宮頸部等の女性器;子宮体部、膣、外陰部;陰茎、精巣及び前立腺等の男性器;造血及び網膜内皮系;血液;リンパ節;胸腺のうちのいずれか1つに影響し得る任意のがんを指す。
本発明による用語「がん」は、白血病、精上皮腫、メラノーマ、奇形腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、グリオーマ、腺癌、中皮腫(胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫及び末期中皮腫)、直腸がん、子宮内膜がん、甲状腺がん(甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌、未分化甲状腺がん、多発性内分泌腺腫2A型、多発性内分泌腺腫2B型、家族性甲状腺髄様がん、褐色細胞腫及び傍神経節腫を含む)、皮膚がん(悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、角化棘細胞腫、ほくろ、異形成母斑、脂肪腫、血管腫及び皮膚線維腫を含む)、神経系がん、脳腫瘍(星状細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、低悪性度グリオーマ、上衣腫、胚細胞腫(松果体腫)、多形成グリア芽細胞腫、オリゴデンドログリオーマ、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍、脊髄神経繊維腫、グリオーマ又は肉腫)、頭蓋がん(骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫又は変形性骨炎を含む)、髄膜がん(髄膜腫、髄膜肉腫又は神経膠腫症を含む)、頭頸部がん(頭頸部扁平上皮癌及び口腔(oral)がん(例えば、口腔(buccal cavity)がん、口唇がん、舌がん、口腔(mouth)がん又は咽頭がん等)を含む)、リンパ節がん、胃腸がん、肝臓がん(肝がん、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫及び血管腫を含む)、結腸がん、胃(stomach又はgastric)がん、食道がん(扁平上皮癌、喉頭、腺癌、平滑筋肉腫又はリンパ腫を含む)、結腸直腸がん、腸がん、小腸(small bowel又はsmall intestine)がん(例えば、腺癌リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫又は線維腫等)、大腸(large bowel又はlarge intestine)がん(例えば、腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫又は平滑筋腫等)、膵がん(膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍又はビポーマを含む)、耳、鼻及び喉(ENT)がん、乳がん(HER2富化乳がん、ルミナルA型乳がん、ルミナルB型乳がん及びトリプルネガティブ乳がんを含む)、子宮がん(子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫及び悪性混合ミュラー管腫瘍等の子宮内膜がん、子宮肉腫、平滑筋肉腫及び妊娠性絨毛性疾患を含む)、卵巣がん(未分化胚細胞腫、顆粒膜卵胞膜細胞腫及びSertoli-Leydig細胞腫瘍を含む)、子宮頸がん、膣がん(膣扁平上皮癌、膣腺癌、膣明細胞腺癌、膣胚細胞腫瘍、膣ブドウ状肉腫及び膣メラノーマを含む)、外陰部がん(外陰部扁平上皮癌、外陰部いぼ状癌、外陰部メラノーマ、外陰部基底細胞癌、バルトリン腺癌、外陰部腺癌及びケイラー赤色肥厚症を含む)、尿生殖路がん、腎臓がん(腎明細胞癌、嫌色素細胞性腎癌、乳頭状腎細胞癌、腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫、リンパ腫又は白血病を含む)、副腎がん、膀胱がん、尿道がん(例えば、扁平上皮癌、移行細胞癌又は腺癌等)、前立腺がん(例えば、腺癌又は肉腫等)及び精巣がん(例えば、精上皮腫、奇形腫、胚性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍又は脂肪腫)、肺がん(小細胞肺癌(SCLC)、肺扁平上皮癌を含む非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌(LUAD)、及び大細胞肺癌、気管支性癌、肺胞癌、気管支癌、気管支腺腫、肺肉腫、軟骨性過誤腫及び胸膜中皮腫を含む)、肉腫(アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む)、軟部組織肉腫(胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍(GIST)、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)、神経線維肉腫、網状線維組織球腫瘍、横紋筋肉腫、滑膜肉腫及び未分化多形性肉腫、心臓がん(例えば、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫又は脂肪肉腫等の肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫を含む)、骨がん(骨原性肉腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫及び網膜細胞肉腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫(osteochronfroma)、骨軟骨腫、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫瘍を含む)、血液及びリンパがん、血液がん(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫及び骨髄異形成症候群を含む)、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫並びにヘアリー細胞及びリンパ障害、並びにそれらの転移
を含む。
感染症としては、例えば、HIV/AIDS、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎等のウイルス肝炎、麻疹、マラリア、及びシャーガス病等のウイルス、細菌、真菌及び寄生虫疾患が挙げられる。
本発明はまた、治療有効量の本発明による医薬組成物を患者に投与する工程を含む、免疫機能障害又は調節異常と関連する疾患を処置するための方法も提供する。
本発明の医薬組成物は一般に、公知の手順に従って、個体における有益な効果を誘導するのに有効な用量で、及び期間にわたって投与される。投与は、注射又は経口、舌下、鼻内、直腸若しくは経膣投与、吸入、又は経皮適用によるものであってもよい。注射は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内又はその他であってもよい。
本発明の医薬組成物は、別の療法、特に、CAR-T細胞療法等の免疫療法;免疫調節剤、特に、免疫調節性モノクローナル抗体又はその機能的誘導体を用いた療法;がん及び感染症に対する治療剤及びワクチンを含む、抗がん剤又は抗感染剤を用いた療法と組み合わせて有利に使用される。併用療法は、別々、同時、及び/又は連続であってもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトの防止又は処置のために使用される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、動物の処置のために使用される。
一部の実施形態では、本発明によるIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び/又は医薬組成物は、更なるがん療法と組み合わせて投与される。特に、本発明のIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び/又は医薬組成物を、標的療法、免疫チェックポイント療法及び免疫チェックポイント阻害剤等の免疫療法、共刺激抗体、化学療法並びに/又は放射線療法と組み合わせて投与することができる。
チェックポイント阻害剤等の免疫チェックポイント療法としては、限定されるものではないが、プログラム細胞死-1(PD-1)阻害剤、プログラム細胞死リガンド-1(PD-L1)阻害剤、プログラム細胞死リガンド-2(PD-L2)阻害剤、リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)阻害剤、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質3(TIM-3)阻害剤、Ig及びITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)阻害剤、B及びTリンパ球アテニュエータ(BTLA)阻害剤、T細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)阻害剤、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)阻害剤、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)阻害剤、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR)阻害剤、KIR2L3阻害剤、KIR3DL2阻害剤並びに癌胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM-1)阻害剤が挙げられる。特に、チェックポイント阻害剤としては、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体が挙げられる。共刺激抗体は、限定されるものではないが、ICOS、CD137、CD27、OX-40及びGITRを含む免疫調節受容体を介して正のシグナルを送達する。
抗PD1抗体の例としては、限定されるものではないが、ニボルマブ、セミプリマブ(REGN2810又はREGN-2810)、チスレリズマブ(BGB-A317)、スパルタリズマブ(PDR001又はPDR-001)、ABBV-181、JNJ-63723283、BI 754091、MAG012、TSR-042、AGEN2034、ピジリズマブ、ニボルマブ(ONO-4538、BMS-936558、MDX1106、GTPL7335又はオプジーボ)、ペンブロリズマブ(MK-3475、MK03475、ランブロリズマブ、SCH-900475又はキイトルーダ)並びに国際特許出願WO2004004771、WO2004056875、WO2006121168、WO2008156712、WO2009014708、WO2009114335、WO2013043569及びWO2014047350に記載された抗体が挙げられる。
抗PL-L1抗体の例としては、限定されるものではないが、LY3300054、アテゾリズマブ、デュルバルマブ及びアベルマブが挙げられる。
抗CTLA-4抗体の例としては、限定されるものではないが、イピリムマブ(例えば、米国特許第6,984,720号及び第8,017,114号を参照されたい)、トレメリムマブ(例えば、米国特許第7,109,003号及び第8,143,379号を参照されたい)、単鎖抗CTLA4抗体(例えば、国際特許出願WO1997020574及びWO2007123737を参照されたい)及び米国特許第8,491,895号に記載の抗体が挙げられる。
抗VISTA抗体の例は、米国特許出願第20130177557号に記載されている。
LAG3受容体の阻害剤の例は、米国特許第5,773,578号に記載されている。
KIR阻害剤の例は、KIR3DL2を標的とするIPH4102である。
標的療法は、腫瘍増殖及び進行にとって必要な特定の分子を妨げるように設計された薬物である。例えば、治療的モノクローナル抗体は、膜貫通受容体又は細胞外増殖因子等の、細胞表面上に見出される特定の抗原を標的とする。一部の場合、モノクローナル抗体は、放射性アイソトープ又は毒素にコンジュゲートされて、これらの細胞傷害剤の意図されるがん細胞標的への特異的送達を可能にする。低分子は、細胞膜を貫通して、細胞内の標的と相互作用することができる。低分子は通常、例えば、プロテアソーム阻害剤、チロシンキナーゼ又はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤等の標的タンパク質の酵素活性を妨げるように設計される。標的療法はまた、サイトカインを使用してもよい。そのような標的療法の例としては、限定されるものではないが、アド-トラスツズマブエムタンシン(HER2)、アファチニブ(EGFR(HER1/ERBB1)、HER2)、アルデスロイキン(プロロイキン)、アレクチニブ(ALK)、アレムツズマブ(CD52)、アキシチニブ(kit、PDGFRベータ、VEGFR1/2/3)、ベリムマブ(BAFF)、ベリノスタット(HDAC)、ベバシズマブ(VEGF ligand)、ブリナツモマブ(CD19/CD3)、ボルテゾミブ(プロテアソーム)、ブレンツキシマブベドチン(CD30)、ボスチニブ(ABL)、ブリガチニブ(ALK)、カボザンチニブ(FLT3、KIT、MET、RET、VEGFR2)、カナキヌマブ(IL-1ベータ)、カルフィルゾミブ(プロテアソーム)、セリチニブ(ALK)、セツキシマブ(EGFR)、コフィメチニブ(MEK)、クリゾチニブ(ALK、MET、ROS1)、ダブラフェニブ(BRAF)、ダラツムマブ(CD38)、ダサチニブ(ABL)、デノスマブ(RANKL)、ジヌツキシマブ(B4GALNT1(GD2))、エロツズマブ(SLAMF7)、エナシデニブ(IDH2)、エルロチニブ(EGFR)、エベロリムス(mTOR)、ゲフィニチブ(EGFR)、イブリツモマブチウキセタン(CD20)、ソニデギブ(スムーズンド)、シプリューセル-T、シルツキシマブ(IL-6)、ソラフェニブ(VEGFR、PDGFR、KIT、RAF)、(トシリズマブ(IL-6R)、テムシロリムス(mTOR)、トファシチニブ(JAK3)、トラメチニブ(MEK)、トシツモマブ(CD20)、トラスツズマブ(HER2)、バンデタニブ(EGFR)、ベムラフェニブ(BRAF)、ベネトクラクス(BCL2)、ビスモデギブ(PTCH、スムーズンド)、ボリノスタット(HDAC)、Ziv-アフリベルセプト(PIGF、VEGFA/B)が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明のIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び/又は医薬組成物は、化学療法と組み合わせて患者に投与される。本明細書で使用される場合、用語「化学療法」は、当業界におけるその一般的な意味を有し、患者に化学療法剤を投与することにある処置を指す。化学療法剤としては、限定されるものではないが、チオテパ及びシクロホスファミド等のアルキル化剤;ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホン酸;ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、及びウレドパ等のアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン;アセトゲニン(特に、ブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(合成アナログトポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む);クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成アナログ、KW-2189及びCB1-TM1を含む);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチイン;スポンギスタチン;クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン(ranimnustine)等のニトロソウレア(nitrosurea)、エネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマール及びカリケアマイシンオメガール)等の抗生物質;ジネマイシンAを含むジネマイシン;クロドロネート等のビスホスホネート;エスペラマイシン;並びにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン(authrarnycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマ
イシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンC等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;メトトレキサート及び5-フルオロウラシル(5-FU)等の代謝拮抗剤;デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸アナログ;フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリンアナログ;アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジンアナログ;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン剤;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の副腎皮質ホルモン合成阻害薬(anti-adrenal);フォリン酸(frolinic acid)等の葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デフォファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルフォルニチン;酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;メイタンシン及びアンサミトシン等のメイタンシノイド;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;N-メチルヒドラジン(MIH)及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体;PSK多糖複合体);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA及びアナグイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル;クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン等の白金配位錯体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロナート;イリノテカン(例えば、CPT-11);トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオミチン(DMFO);レチノイン酸等のレチノイド;カペシタビン;アントラサイクリン、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、エピポドフィロトキシン、L-アスパラギナーゼ等の酵素;アントラセンジオン;プレドニゾン及び等価物等の副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト;カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール等のプロゲスチン;ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物等のエストロゲン剤;タモキシフェン等の抗エストロゲン剤;プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン/等価物等のアンドロゲン剤;フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド等の抗アンドロゲン剤;並びにフルタミド等の非ステロイド性抗アンドロゲン剤;並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明のIL-2バリアント、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び/又は医薬組成物は、放射線療法と組み合わせて患者に投与される。放射線療法の好適な例としては、限定されるものではないが、外部放射線療法(表在X線療法、常用電圧X線療法、超高圧X線療法、放射線外科手術、定位放射線療法、分画定位放射線療法、コバルト療法、電子療法、高速中性子療法、中性子捕捉療法、プロトン療法、強度変調放射線療法(IMRT)、3次元原体放射線療法(3D-CRT)等);小線源療法;非密封線源放射線療法;トモセラピー等が挙げられる。ガンマ線は、放射線療法において使用される別の形態の光子である。ガンマ線は、ある特定の元素(ラジウム、ウラン、及びコバルト60等)が分解又は崩壊する時に、それらの放出放射線として自発的に産生される。一部の実施形態では、放射線療法は、プロトン放射線療法又はプロトンミニビーム放射線療法であってもよい。プロトン放射線療法は、プロトンビームを使用する超精密形態の放射線療法である(Prezado Y、Jouvion G、Guardiola C、Gonzalez W、Juchaux M、Bergs J、Nauraye C、Labiod D、De Marzi L、Pouzoulet F、Patriarca A、Dendale R.「Tumor Control in RG2 Glioma-Bearing Rats: A Comparison Between Proton Minibeam Therapy and Standard Proton Therapy」、Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2019 Jun 1;104(2):266～271頁、doi: 10.1016/j.ijrobp.2019.01.080; Prezado Y、Jouvion G、Patriarca A、Nauraye C、Guardiola C、Juchaux M、Lamirault C、Labiod D、Jourdain L、Sebrie C、Dendale R、Gonzalez W、Pouzoulet F.「Proton minibeam radiation therapy widens the therapeutic index for high-grade gliomas」、Sci Rep. 2018 Nov 7;8(1):16479頁、doi: 10.1038/s41598-018-34796-8)。放射線療法はまた、FLASH放射線療法(FLASH-RT)又はFLASHプロトン照射であってもよい。FLASH放射線療法は、現在日常的な臨床実務におけるものよりも数桁高い線量率(超高線量率)での放射線処置の超高速送達を含む(Favaudon V、Fouillade C、Vozenin MC. The radiotherapy FLASH to save healthy tissues. Med Sci (Paris) 2015 ; 31 : 121～123頁、DOI: 10.1051/medsci/20153102002); Patriarca A.、Fouillade C. M.、Martin F.、Pouzoulet F.、Nauraye C.ら、「Experimental set-up for FLASH proton irradiation of small animals using a clinical system」、Int J Radiat Oncol Biol Phys、102 (2018)、619～626頁、doi: 10.1016/j.ijrobp.2018.06.403. Epub 2018 Jul 11)。
抗体スクリーニングのための使用
本発明のIL-2バリアントを、当業界で周知の標準的なイムノアッセイを使用するプロTeff又はプロTreg活性を有する抗IL-2抗体のスクリーニングのために使用することができる。
これに関して、本発明は、プロTeff又はプロTreg活性を有する抗IL-2抗体をスクリーニングする方法であって、少なくとも、a)抗IL-2抗体と、本発明によるバリアントとを接触させる工程、及びb)工程a)に由来する結合抗体のレベルを測定する工程を含み、結合抗体のレベルが、参照値の70%(好ましくは、80%、90%、又はそれ以上)を超える場合、抗IL-2抗体がプロTeff活性を有する可能性が高く、結合抗体のレベルが参照値よりも50%(好ましくは、40%、30%、20%、10%又はそれ未満)よりも低い場合、抗IL-2抗体がプロTreg活性を有する可能性が高い、方法に関する。
プロTeff活性を有する抗体は、特に、CD25ミモトープ結合を有する抗体である。
参照値は、通常、同じ条件で抗体と野生型IL-2とを接触させることによって決定される。工程a)は、有利には、固相表面(プレート、ビーズ)上に固定されたIL-2バリアントを使用して実施される。工程b)は、標識された一次又は二次抗体を使用して実施される。アッセイは、使用される標識に応じて、ELISA、蛍光イムノアッセイ(FIA)又は化学発光イムノアッセイ(CLIA)であってもよい。アッセイは、例えば、マイクロ流体デバイスを使用する高効率アッセイであってもよい。
本発明はまた、本発明によるIL-2バリアントを含む、本発明のスクリーニング方法を実施するためのキットにも関する。
様々な実施形態では、キットは、使用のための使用説明書、及び/又は標識された抗体を更に含んでもよい。
本発明の実施は、別途指摘しない限り、当業界の技術の範囲内にある従来の技術を用いるであろう。そのような技術は、文献中で完全に説明されている。
ここで、本発明を、添付の図面を参照しながら、限定的ではない以下の実施例と共に説明する。
(実施例1)
IL-2の表面再処理バリアントのコンピューター設計
IL-2と、そのα(CD25としても知られる)、β(CD122)、及びγc(CD132)受容体(PDBコード2B5I)との四次複合体の原子構造を使用して、α受容体と接触する残基を維持するが、この領域外で表面を改変する新しいIL-2バリアントのコンピューター設計を指導した(図2)。表面再処理設計の一般的パイプラインは以下の通りであった: 第1に、α受容体と接触する残基は、α受容体のいずれかの原子から8Å又はそれ未満の距離に少なくとも1個の原子を有するIL-2の残基と定義された。CD25と接触するアミノ酸を廃棄したら、突然変異させる候補位置のセットを、接近性基準を使用して同定し、50%を超える側鎖表面積が露出した残基のみを選択した(Fraczkiewiczら、J. Comp. Chem、1998、19、319～333頁)。
この手順を使用して、28個の候補位置をIL-2表面上で同定した。次に、それぞれの位置で突然変異のセットが許容されるか決定するために、オーソログ配列分析を、溶解度基準と組み合わせた。進化情報を含有させるために、26の異なる種に由来するIL-2配列の複数配列アラインメントを行って(図1)、所与の位置でいずれかのオーソログ中に存在する残基に対する突然変異のみを許容した。この元の突然変異のセットを、溶解度を考慮することによって更にフィルタリングし、可能な場合、疎水性残基の存在を廃棄し、IL-2の全ての極性及び天然残基を許容した。最後に、Rosettaの「固定骨格設計適用」を使用して、低エネルギー配列を選択し、全ての非露出残基中の天然回転異性体を維持した(Kuhlmanら、Science、2003、302、1364～8頁)。表面再処理位置の特定の組合せのための最低エネルギー設計を、実験的試験のために選択した。この手順を使用して、IL-2-V1～IL-2-V6と呼ばれる異なるバリアントを設計した(Table I(表1))。精製を容易にするために、C末端Strepタグを構築物に付加した。C末端Strepタグ及び由来するIL-2バリアント(IL-2-V1～IL-2-V6)を有する野生型ヒトIL-2構築物は、171アミノ酸の配列(配列番号2～8;図3)を有する。
Figure 2022527481000001
(実施例2)
タンパク質の発現及び精製
ヒトIL-2、及びIL-2バリアントをコードする遺伝子を、哺乳動物細胞中での発現のためにコドン最適化し、GenScript(Piscataway、NJ、USA)によってC末端Strepタグを用いて合成した。次いで、対応するDNA配列(配列番号9～14)を、高収率でのタンパク質生産にとって好適な哺乳動物発現ベクターであるプラスミドpHL-secのAgeIとXhoI制限部位との間にクローニングした(Aricescuら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.、2006、62、1243～50頁)。それぞれのIL-2バリアントをコードする異なるpHL-sec組換えプラスミドを形質転換した大腸菌(E.coli)トップ10を、寄託番号CNCM I-5377～CNCM I-5382 (IL-2-V1～IL-2-V6)の下で、2018年11月15日にInstitut Pasteur、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris、FRのCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託した。寄託番号CNCM I-5377～CNCM I-5382(IL-2-V1～IL-2-V6)の下でCNCMに寄託された形質転換細菌を、37℃、160rpmを超える撹拌下で100μg/mLアンピシリンを補充したLuria-Bertani(LB)培地中等の標準条件で増殖させる。形質転換細菌の生存能力を、100μg/mLのアンピシリンを補充したLB寒天プレート上に細菌培養物を塗布し、細菌コロニーの存在を検出する等の標準的なアッセイによって検証することができる。形質転換細菌を、2mLのエッペンドルフチューブ中で、0.5mLの細菌培養物と、0.5mLの50%(V/V)グリセロールとの混合物を-80℃で凍結することによる等の標準的な条件下で保存することができる。タンパク質を、無血清培地(Free Style 293発現培地)中で維持したHEK293 FreeStyle細胞(Thermo Scientific社)の一過的トランスフェクションによって生産した。細胞上清をトランスフェクションの3日後に収獲し、Tris pH8.0を100mMの最終濃度まで添加した。タンパク質を、StrepTrapカラム(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)を使用するStreptactinアフィニティクロマトグラフィーによって最初に精製し、溶出画分を、Superdex75カラム(GE Healthcare社、Piscataway、NJ)を使用するゲル濾過によって更に精製したところ、一方が単量体タンパク質に対応し、他方がおそらく二量体であるオリゴマーに対応する、2つのピークを有するプロファイルが得られた(図4)。単量体ピークを含有する画分を濃縮し、実験的試験のために使用した。
(実施例3)
IL-2Vは、プロTeff又はプロTreg活性を有する抗IL-2Abを特異的に選択するための新しい手段である
ELISA試験を使用して、プロTエフェクター又はプロTreg機能を有する抗体(Ab)に対するIL-2バリアントの選択性を評価した。そのために、プロロイキン、IL-2V1、IL-2V2、IL-2V3、IL-2V4、IL-2V5又はIL-2V6(全部6μg/mL)でプレートを被覆することによって、典型的なELISA試験を行った。評価したAbは、MAB605(in vivoでプロTエフェクター活性を有するマウス抗ヒトIL-2 Ab)、5344(in vivoでプロTreg活性を有するマウス抗ヒトIL-2 Ab)及びNARA(Arenas-Ramirezら、Sci. Transl. Med.、2016、8、367ra166に由来する、in vivoでプロTエフェクター活性を有するscFV抗体)であった。抗IL-2 Abを検出するために、抗マウスIgG-HRP Ab又はNARAのための抗M13-HRP Abを使用し、吸光度を450nmで読み取った。対照ウェル(対応する抗IL-2 Ab + 抗マウスIgG-HRP Abと共にインキュベートした非被覆ウェル)の吸光度が差し引かれたOD値が示される。
図5は、プロTeff作用を有するAbであるMAB605が、全てのIL-2形態に結合し、プロTeff作用も有するものであるNARAもIL-2V1及びIL-2V2に結合することを示す(これらの予備実験では、NARA AbはIL-2V1及びIL-2V2に対してのみ試験された)。対照的に、プロTreg作用を有するAbである5344は、IL-2バリアントへの結合の減少を示す/結合を示さない。これらの結果は、設計されたIL-2Vを、プロTeff活性を有するAb並びにプロTreg活性を有するAbを含む、CD25ミモトープ活性を有する抗IL-2 Abをスクリーニングするための強力な手段として使用することができることを確認するものである。
(実施例4)
IL-2バリアントの生物活性のin vitroでの評価
異なるIL-2バリアントが、中親和性のIL-2R(CD4+若しくはCD8+エフェクターT細胞中に存在する)、又は高親和性のIL-2R(Treg細胞中に存在する)のいずれかを発現するT細胞集団に対する異なる親和性/選択性を示すかどうかを評価した。
したがって、CD3陽性T細胞を、製造業者の使用説明書(Miltenyi社)に従って、健康なドナーに由来するPBMCから富化した。CD3富化細胞を、異なる濃度のプロロイキン(Novartis社)又はIL-2V1、IL-2V2、IL-2V3、IL-2V4、IL-2V5及びIL-2V6(0.0001nM～1000nM)を含有するSVF非含有RPMI培地(GIBCO社、France)中、75μL/ウェルで96ウェルプレート中で培養した。ヒトTreg細胞(IL-2Rαβγ)、CD4+Teff細胞(IL-2Rβγ)及びCD8+T細胞(IL-2Rβγ)中でのSTAT5のリン酸化(STAT5-P)を、以下のように、フローサイトメトリーによって測定した。刺激の15min後、培養物を室温で10minにわたって200μL/ウェルのPBS/2%パラホルムアルデヒドで固定した。PBS/0.2%BSAで洗浄した後、氷上で10minにわたって100μL/ウェルの氷冷メタノールを用いて細胞を透過処理した。次いで、細胞を、PBS/0.2%BSAで洗浄し、4℃で45minにわたって抗CD3 PE-Cy7(クローンUCHT1;1:200;BD BIOSCIENCES社)、抗CD4 PE-CF594(クローンRPA-T4 1:100;OZYME社),抗CD25 PE(クローンM-A251;1:5;BD Biosciences社)、抗Foxp3 Alexa488(クローン236A/E7;1:20;EBIOSCIENCES社)及び抗pSTAT5 Alexa647(クローン47/Stat5(pY694);1:20;BD BIOSCIENCES社)で染色した。細胞を、LSRIIフローサイトメーター上で獲得し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
結果は、ヒトIL-2V2及びIL-2V3が、市販のヒトIL-2プロロイキンと比較して、エフェクターT細胞中ではなく、Treg細胞中でSTAT-5リン酸化を選択的に誘導することを示している。IL-2V1、IL-2V4、IL-2V5及びIL-2V6は、評価された用量でTreg又はエフェクターT細胞を刺激しない(図6)。
(実施例5)
IL-2バリアントの生物活性のin vivoでの評価
IL-2Vのin vivoでの効果を評価するために、ヒト末梢血単核細胞が免疫欠損宿主マウス中に注入された、移植片対宿主疾患(GVHD)モデルを使用した。ヒトT細胞は、マウス抗原の認識時に、活性化され、異種GVHDを誘導する。臨床的には、GVHDは、マウスの体重減少によって評価される。Treg細胞はGVHDを制御することができることが以前に示されている(Gaidot A、Blood、2011、117、2975～2983頁)。更に、低用量IL-2投与は、Treg細胞を刺激し、かくして、炎症を抑制し、疾患症状を低減させることが報告された(Shinら、Blood、2011、118、2342～2350頁)。IL-2Vがin vivoでTregを特異的に刺激する場合、Treg細胞は、CD4及びCD8+T細胞よりも選択的に拡大し、疾患症状を低減させるはずであると仮定された。
急性GVHDを誘導するために、NSG-SGM3メスマウスに、i.v.経路により、6x106個のヒトCD3-T細胞を含有するPBMCを投与した。同じ日に、マウスを、プロロイキン(6μg、100,000IUに等しい)、IL-2V1(6μg)、又はIL-2V2(6μg)のi.p.注射によって処置した。1群のマウスは未処置のままであった。免疫モニタリングの処置後、5、10及び21日目に血液試料を採取し、GVHDの進行を検出するための実験に沿って体重をモニタリングした。
未処置のマウスは、プロロイキン処置マウスと同様、PBMC注射後、20日目までに体重減少を示し始めた。使用された用量で、IL-2V2は体重減少をわずかに遅延させ、IL-2V1は停止させたが、これは、マウス生存のわずかに延長された増加と関連するIL-2V1の臨床効果である(図7)。更に、IL-2V1は、循環ヒトTreg、及びまたCD4+CD25+Tregの頻度の持続的増加を誘導し、これは抑制機能が増大したTregと記載された(図8)。これらの結果は、IL-2VがGVHDを制御することができること;及びIL-2V1がin vivoで体重減少の停止及びCD25+Tregの増加においてより有効であることを示している。
IL-2V2及びIL-2V3のin vivoでの効果を評価するために、C57BL/6健康マウスを、プロロイキン(4μM)、IL-2V2(40μM)、又はIL-2V3(40μM)のi.p.注射によって4日連続で処置した。1群のマウスは未処置のままであった。FACS分析のためにプロロイキン又はIL-2Vの最後の用量の次の日に血液試料を採取した。
IL-2V2及びIL-2V3処置マウスは、未処置のマウスと比較して循環Tregの頻度の増加を示したが、プロロイキン処置マウスよりも程度は低かった(図10)。しかしながら、プロロイキンと違って、IL-2V2(40μM)及びIL-2V3(両方の濃度)は、エフェクター細胞(CD8+T細胞及びNK細胞)の頻度も増加させず、これらの細胞の増殖も誘導しなかった(Ki67発現によって測定)。これは、未処置及びプロロイキン処置マウスと比較して、IL-2-Vで処置したマウスにおいてCD8及びNK細胞のTregに対する比の減少によって強調される。これらのデータは、IL-2V2及びIL-2V3もまた、in vivoでマウスにおいてTregを選択的に刺激することを示している(種間で保存された機能)。これらのデータは、プロロイキンと比較した、in vitroでのTreg細胞のSTAP-5-Pの選択的誘導を介して、in vitroとin vivoとの両方で、Treg細胞を選択的に刺激する新規薬物としてのIL-2V2及びIL-2V3の可能性を補強する。
(実施例6)
IL-2V1、IL-2V4、IL-2V5及びIL-2V6は、IL-2アンタゴニストとして作用する
GVHDモデルにおいて観察された結果を考慮して、IL-2-V1がIL-2アンタゴニストとして作用することができると仮定された。この仮説を更に調査するために、中親和性IL-2R(CD4+エフェクター細胞及びCD8+エフェクターT細胞)、又は高親和性IL-2R(Treg細胞)を発現するT細胞中でのSTAT5リン酸化の誘導についてプロロイキンと競合するIL-2V1の能力を、in vitroで評価した。このために、上記のin vitro生物アッセイを使用して、異なる濃度のプロロイキン及び一定の高濃度のIL-2V1(1000nM)で細胞を刺激した。IL-2-V1は、IL-2Rαβγ及びIL-2Rβγに結合するWT IL-2と競合し、IL-2-V1アンタゴニスト機能の基礎となることを、図9で観察することができる。
IL-2バリアントの、IL-2Rαβγへの結合を、IL-2Rαβγを構成的に発現するIL-2依存的ヒト細胞系Kit225においてアッセイした。検出を容易にするために、抗ストレプトアビジン-タグ抗体(a-Strep-Tag Ab)を使用するFACSによって分子の検出を可能にするストレプトアビジンタグを用いてIL-2バリアントを生産した。実験のために、Kit225細胞から2日間にわたってIL-2を枯渇させた。その後、氷上で20minにわたって、0.2x106個の細胞を単独で、又は10μMのIL-2wt、IL-2V1、V2、V3、V4、V5及びV6と共にインキュベートした。PBS/0.2%BSA緩衝剤で洗浄した後、細胞を、4℃で20minにわたってa-Strep-Tag Ab(Strep-Tactin-A488、Iba)で染色した。細胞を、LSRIIフローサイトメーター上で獲得し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。図11に提示されるデータは、全てのIL-2バリアントが、異なる程度でIL-2Rαβγに結合することを示し、図6及び図9に示されるものと共に、IL-2V1及びIL-2V4-6がIL-2アンタゴニストとして作用するという仮説を支持する。
この仮説は、IL-2VアンタゴニストがCD4+T細胞活性化についてIL-2と競合し(Tconv及びTreg細胞)、それらを野生型IL-2シグナル伝達から枯渇させることによってin vitroでTreg分裂を阻害し(抗IL-2抗体の遮断と同様)、CD8+T細胞中に活性なIL-2シグナル伝達を残すことを示すin vitroでのデータによって確認された。簡単に述べると、CellTrace Violet(CTV)標識ヒトPBMC及びCD25+T細胞(50:50比で混合)を、抗CD3/抗CD28ビーズ(1:5のビーズ:細胞比) + IL-2V1、4、6、抗hIL-2mAb(Mab602)又はPBS(内因性IL-2対照)と共に96hインキュベートした。CD4+Tconv、Treg及びCD8+T細胞のCTV希釈率(T細胞分裂の尺度として)を、フローサイトメトリーによって測定した。図12は、PBS条件(最大)に対するCTVLow細胞のパーセンテージ(%)を示す。このデータは、IL-2 V1、V4及びV6が、CD4+T細胞上で内因性IL-2と競合することによってIL-2シグナル伝達と拮抗し、それらを野生型IL-2シグナル伝達から枯渇させることによってin vitroでTreg分裂を阻害し(抗IL-2抗体の遮断と同様)、CD8+T細胞中に活性なIL-2シグナル伝達を残すことを示している。これらのデータは、図6、図9及び図11に示されるデータと共に、IL-2V1及びIL-2V4～6が、WT IL-2シグナル伝達からTregを枯渇させるか、又は飢餓させることによってTregを武装解除し、それによって、エフェクターCD8+T細胞機能を保持しながら、Treg機能を阻害し、Treg機能喪失を誘導するか、又はTregを除去するために使用することができるIL-2アンタゴニストとして作用することを示す。
in vivoでは、本発明のIL-2アンタゴニストバリアントによるTregの阻害は、他のIL-2アンタゴニストに関して以前に示されたように腫瘍増殖を減少させるであろう(Carmenateら、The Journal of Immunology、2018、200、3475～3484頁)。したがって、IL-2アンタゴニストである本発明のIL-2Vは、in vivoで抗腫瘍効果を有すると予想される。本発明によるIL-2アンタゴニストバリアントによるTreg阻害は、結果として、Treg抑制から免疫細胞を解放することによって免疫応答(リンパ球(B、NK、CD4+又はCD8+T細胞);樹状細胞(DC);マクロファージその他)を促進するであろう。更に、IL-2Vsアンタゴニストの使用される用量に応じて、CD8+T細胞機能は保持されるか、又は中程度に影響される(図9;図12)。したがって、本発明のIL-2アンタゴニストバリアントは更に、例えば、腫瘍、病原体又はワクチンに対する、CD8+T細胞免疫応答の直接刺激を可能にする。全てのこれらの理由から、がん、感染性因子及びワクチンに対するより良好な免疫応答が、本発明のIL-2アンタゴニストバリアントに関して予想される。
本出願で提示される結果は全体として、in vivoでのIL-2アンタゴニストバリアントの効果は、それが免疫系が過剰活性であり、過剰のIL-2を産生する場合には免疫活性化を減少させるが(過剰の内因性IL-2を中和することによって)、それが異なる免疫状況では免疫活性化を増加させる(Treg阻害及びその後のCD8+T細胞活性化によって)ため、免疫状況に応じて変化してもよいことを示唆する。これらの理由から、IL-2アンタゴニストバリアントは、慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等のIL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患を処置する、また、がん及び感染症を処置する、並びにワクチンに対する免疫応答を増加させるのに有用である。
(実施例7)
IL-2バリアントの結晶構造
実験手順
IL-2バリアントを、改変pMT/BiPプラスミド(Invitrogen社)中にクローニングし、ショウジョウバエ(Drosophila)S2細胞の安定なトランスフェクタントを得るために使用した。アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、上清からタンパク質を精製した。IL-2 V1の結晶を、30%(w/v)PEG8000、0.1MイミダゾールpH8.0、0.2M NaCl中で取得し、IL-2 V4の結晶を、15%(w/v)PEG3350、0.1M Hepes 7、5mM NiCl2、及び10mM MgCl2中で取得し、液体窒素中で簡易凍結した。モデルとして野生型IL-2の構造を使用する分子置換によって構造を解析した。
結果
本発明者らはまた、それらの作用メカニズムに関するいくらかの洞察を与える一部のバリアントの結晶構造も解析した。本発明者らは、Y31P置換(IL2-V4)が、以後、「アルファ誘導性コンフォメーション」とする、IL2-Rアルファサブユニットとの複合体において観察されるものと同様のコンフォメーションでIL-2を安定化することを観察した。実際、Tyr31が位置する、ループABのコンフォメーション変化が、IL-2Rベータ及びガンマサブユニットとの相互作用にアロステリックに影響することを示唆する、マウスIL-2に由来するいくつかの最近の証拠がある((De Paulaら、P.N.A.S.、doi/10.1073; March 17、2020及びSpanglerら、Immunity、2015、42、815～825頁)。したがって、IL2-V4活性の基礎となる分子メカニズムがこのアロステリック回路を利用すると推測することは魅力的である。実際、本発明者らはまた、IL2-V4の同じ活性を有する、IL2-V1の構造も取得した。このバリアントに存在する突然変異はいずれもABループ中に位置しないにも拘わらず、それもまた同じ「アルファ誘導性コンフォメーション」を示す。
理論によって束縛されないが、本発明者らは、本発明のIL-2アンタゴニストバリアント中に導入された置換が、結合形態を安定化し、IL-2Rベータ及びガンマサブユニットとの相互作用にアロステリックに影響するコンフォメーション変化を誘導すると考えている。
結論
全体として、これらの結果は、IL-2VがTreg細胞を選択的に刺激するか、IL-2と拮抗する新規薬物であることを示している。かくして、IL-2Vを使用して、ex vivo若しくはin vivoでTregを拡大するか、又は免疫系のIL-2媒介性過剰活性化を遮断し、in vivoでの有害な免疫応答を抑制することができる。特に、in vivoでTreg細胞を選択的に刺激するIL-2Vは、アレルギー疾患及び自己免疫疾患並びに慢性又は急性炎症疾患、移植片対宿主疾患(GVHD)及び移植片拒絶等の免疫系の過剰活性と関連する疾患等の免疫機能障害を含む疾患を処置するのに有用である。IL-2アンタゴニストバリアントは、GVHD、移植片拒絶及び慢性又は急性炎症疾患のようなIL-2の過剰産生を含む免疫系の過剰活性と関連する疾患を処置するのに有用である。
IL-2アンタゴニストであるIL-2Vはまた、Tregを阻害するのに有用であり、かくして、免疫応答(B、NK、CD4+又はCD8+T細胞、DC、マクロファージその他)、特に、がん処置における抗腫瘍免疫応答及びワクチン又は病原体に対する免疫応答を増加させる。

Claims (23)

  1. 9、12、16、19、23、26、31、87、91及び95からなる群から選択される位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、免疫障害の防止又は処置のためのインターロイキン-2バリアントであって、
    - 9及び12位のアミノ酸が、D又はE、好ましくはEによって置換される;
    - 16、19、26、91及び95位のアミノ酸が、K又はRによって置換される;好ましくは、16及び19位のアミノ酸が、Rによって置換され、26、91及び95位のアミノ酸が、Kによって置換される;
    - 23位のアミノ酸が、E、Q、T、N、G、A、V、L又はI、好ましくは、Lによって置換される;
    - 31位のアミノ酸が、P又はN、好ましくは、Pによって置換される;
    - 87位のアミノ酸が、M、V、E、D、T、C、N又はQ、好ましくは、Nによって置換される;並びに
    前記置換が91位にある場合、前記バリアントが、9、12、16、19、23、26、31、49、52、81、84、87、95、119、123、127、131又は132位に少なくとも別の置換を含み、示された位置が、配列番号1とのアラインメントによって決定される、インターロイキン-2バリアント。
  2. 9、12、16、19、23、26、87、91及び95からなる群から選択される位置に1個又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のバリアント。
  3. 31、49、52、81、84、119、123、127、131及び132からなる群から選択される位置に少なくとも1個の更なる置換を含み、
    - 31位のアミノ酸が、P又はN、好ましくは、Pによって置換される;
    - 49、52、84及び132位のアミノ酸が、M、V、E、D、S、T、C、N及びQから選択される別のアミノ酸によって置換される;好ましくは、49位のアミノ酸が、Qによって置換される;52及び132位のアミノ酸が、Sによって置換される;84位のアミノ酸が、Nによって置換される;
    - 81位のアミノ酸が、D又はE、好ましくはEによって置換される;
    - 119、127及び131位のアミノ酸が、K又はRによって置換される;好ましくは、127位のアミノ酸が、Kによって置換され、131位のアミノ酸が、Rによって置換される;並びに
    - 123位のアミノ酸が、E、Q、N、M、G、A、V、L又はI、より好ましくは、Aによって置換される、請求項2に記載のバリアント。
  4. 31位に1個の置換を含み、9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131及び132位にいかなる置換も含まない、請求項1に記載のバリアント。
  5. ヒトIL-2バリアントである、請求項1から4のいずれか一項に記載のバリアント。
  6. - K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、N119K、T123A、及びS127K置換を含むバリアント;
    - K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S置換を含むバリアント;
    - 9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131及び132位にいかなる置換も含まない、Y31P置換を含むバリアント;
    - K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、K49Q、E52S、R81E、D84N、T131R及びL132S置換を含むバリアント;
    - K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、Y31P、N119K、T123A、及びS127K置換を含むバリアント;
    - K9E、L12E、H16R、L19R、M23L、N26K、S87N、V91K、E95K、K49Q、E52S、R81E、D84N、N119K、T123A、T131R及びL132S置換を含むバリアント
    からなる群から選択される、請求項5に記載のヒトIL-2バリアント。
  7. 配列番号1及び3～8のいずれか1つとの少なくとも70%のアミノ酸同一性を有し、好ましくは、11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130及び133位にいかなる置換も含まない、請求項1から6のいずれか一項に記載のバリアント。
  8. 調節性T細胞を選択的に刺激する、請求項1から7のいずれか一項に記載のバリアント。
  9. IL-2アンタゴニストである、請求項1から7のいずれか一項に記載のバリアント。
  10. IL-2アンタゴニストが、調節性T細胞を阻害し、その結果として、免疫応答、特に、CD8+T細胞応答を刺激する、請求項9に記載のバリアント。
  11. 分子複合体、粒子、コンジュゲート又は融合タンパク質の形態で、目的の薬剤と結合している、請求項1から10のいずれか一項に記載のバリアント。
  12. 抗IL-2抗体、好ましくは、プロ調節性T細胞活性又はプロエフェクターT細胞活性を有する抗IL-2抗体と複合体化している、請求項11に記載のバリアント。
  13. Tregに特異的な表面分子に対する抗体又は少なくとも抗原結合部位を含むその機能的断片に融合される、請求項11に記載のバリアント。
  14. 抗体が、抗CTLA-4抗体、抗CD25抗体、抗CCR8抗体、抗ICOS抗体、抗IKZF2抗体、抗CD70抗体、抗GARP抗体、抗IL1R1抗体、抗CD39抗体、抗CCR4抗体及び抗CD177抗体を含む群から選択される、請求項13に記載のバリアント。
  15. 発現可能な形態の、好ましくは、発現ベクター中に含有される、請求項1から14のいずれか一項に記載のバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  16. 活性物質として、請求項11から14のいずれか一項に規定の目的の薬剤と最終的に結合した、請求項8に記載の調節性T細胞を選択的に刺激するIL-2バリアント、請求項15に記載の前記バリアントをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドで改変された細胞と、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル及び/又は担体とを含む、医薬組成物。
  17. 急性又は慢性炎症疾患、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患及び移植片拒絶を含む群から選択される疾患の防止又は処置における使用のための、請求項16に記載の医薬組成物。
  18. 活性物質として、請求項11から14のいずれか一項に規定の目的の薬剤と最終的に結合した、請求項9若しくは10に記載のIL-2バリアントアンタゴニスト、請求項15に記載の前記バリアントをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドで改変された細胞と、少なくとも1つの薬学的に許容されるビヒクル及び/又は担体とを含む、医薬組成物。
  19. 感染症及びがんの処置並びにがん又は感染症に対するワクチンに対する免疫応答の増加を含む、がん及び感染症を含む群から選択される疾患の防止又は処置における使用のための、請求項10に記載のIL-2バリアントアンタゴニストを含む、請求項18に記載の医薬組成物。
  20. 急性又は慢性炎症疾患、移植片対宿主疾患及び移植片拒絶を含む群から選択されるIL-2の過剰産生と関連する免疫系の過剰活性を含む疾患の防止又は処置における使用のための、請求項9に記載のIL-2バリアントアンタゴニストを含む、請求項18に記載の医薬組成物。
  21. キメラ抗原受容体T細胞療法、免疫調節性モノクローナル抗体療法、又はがん及び感染症に対する治療剤及びワクチンを含む、抗がん剤若しくは抗感染剤を用いた療法と組み合わせた、請求項17、19又は20に規定の使用のための医薬組成物。
  22. 標的療法、免疫チェックポイント療法及び免疫チェックポイント阻害剤等の免疫療法、共刺激抗体、化学療法及び/又は放射線療法を含む群から選択される少なくとも更なるがん療法と組み合わせた、請求項19に記載のがんの処置における使用のための医薬組成物。
  23. プロ調節性T細胞活性又はプロエフェクターT細胞活性を有する抗IL-2抗体のスクリーニングのための、請求項1から11のいずれか一項に記載のバリアントの使用。
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