ES2963561T3

ES2963561T3 - Anticuerpo de unión a PSMA y usos del mismo

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Publication number: ES2963561T3
Application number: ES17701290T
Authority: ES
Inventors: Helmut Salih; Fabian Vogt; Gundram Jung; Latifa Zekri-Metref
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2016-01-14
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2024-03-27
Anticipated expiration: 2037-01-16
Also published as: JP6893939B2; EP3192810A1; US20190022205A1; AU2017207947A1; FI3402821T3; WO2017121905A1; US11612646B2; RU2018128414A; JP2019505589A; RU2018128414A3; EP3402821B1; CN108699157A; HUE064205T2; US20230132249A1; CA3011098A1; EP3693396A2; AU2023203041A1; BR112018014215A2; PT3402821T; IL260402B2

Abstract

La presente invención proporciona un nuevo anticuerpo de unión a PSMA denominado 10B3 y usos farmacéuticos y de diagnóstico del anticuerpo 10B3. El anticuerpo PSMA 10B3 no compite de forma cruzada con el anticuerpo de unión a PMSA J591 de última generación y tiene una inducción reducida del cambio de antígeno en comparación con J591 y una reactividad única con células de carcinoma de células escamosas (SCC) de diferente origen. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo de unión a PSMA y usos del mismo

La presente invención proporciona una molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente y homodimérica según el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Antecedentes

Los trabajos científicos iniciados en la década de 1980 han establecido que los anticuerpos biespecíficos dirigidos a un antígeno asociado a un tumor ("tumor associated antigen", TAA) y al complejo receptor de linfocitos T (TCR)/CD3 son capaces de activar los linfocitos T, lo que provoca la lisis de las células tumorales que expresan TAA provocada por los linfocitos T activados (Staerzet al.,Nature, 1985, 314:628-631; Pérezet al.,Nature, 1985, 316:354-356; Junget al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83:4479-4483). Dado que los anticuerpos CD3, unidos a receptores de Fc (FcR) a través de su parte Fc, son extremadamente eficientes en inducir la activación de linfocitos T y la liberación de citocinas como efectos secundarios no deseados, es de vital importancia construir anticuerpos TAAxCD3 biespecíficos con atenuación o reducción de Fc para evitar la unión a FcR y permitir la activación de linfocitos T restringida a la célula diana, en lugar de mediada por FcR (Junget al.,Immunol. Today, 1988; 9:257-260; Junget al.,Eur. J. Immunol., 1991, 21:2431-2435).

La producción de anticuerpos biespecíficos que cumplan este prerrequisito crucial en calidad y cantidad industrial sigue siendo un reto formidable. En fechas recientes, un anticuerpo recombinante biespecífico monocatenario ("bispecific single chain", bssc) con especificidad por CD19xCD3, denominado blinatumomab, ha demostrado una eficacia considerable en el tratamiento de pacientes con LLA (Bargouet al.,Science, 2008, 321:974-977) y ha recibido la aprobación de la FDA. En particular, el fármaco se aplica como infusión continua de 24 horas durante varias semanas debido a su baja semivida sérica y a su toxicidad bastante elevada: las dosis aplicables con seguridad son de aproximadamente 30 |jg por paciente y día, lo que es 10000 veces inferior a las utilizadas para el tratamiento con anticuerpos antitumorales monoespecíficos establecidos (Adams y Weiner, Nat. Biotechnol., 2005, 23:1147-1157). Las concentraciones séricas resultantes del fármaco son inferiores a 1 ng/ml (Toppet al.,J. Clin. Oncol., 2011, 29:2493-2498). Esta grave limitación de la dosis, también observada en ensayos clínicos anteriores con diferentes anticuerpos biespecíficos (Kroesenet al.,Br. J. Cancer, 1994, 70:652-661; Tibben etal.,Int. J. Cancer, 1996, 66:477-483), se debe a la activación inespecífica de linfocitos T que da lugar a la liberación sistémica de citocinas. Obviamente, este fenómeno impide una actividad terapéutica óptima de los anticuerpos biespecíficos que estimulan el complejo TCR/CD3.

En principio, la activación inespecífica de linfocitos T que limita la dosis y el problema de toxicidad resultante pueden ser causados por los problemas P1 y P2 que se analizan con más detalle a continuación; la baja semivida sérica se analiza como el problema P3:

P1: El TAA al que se dirige el anticuerpo biespecífico no es totalmente específico del tumor, lo que da lugar a una activación de linfocitos T mediada por el anticuerpo debido a la unión a células normales que expresan TAA. En un sentido estricto, no se trata de una activación inespecífica, ya que es inducida por células diana que expresan antígenos, aunque sean las "equivocadas", es decir, células normales en lugar de malignas. El blinatumomab, el anticuerpo biespecífico CD19xCD3 mencionado anteriormente, se enfrenta sin duda a este problema, ya que su antígeno diana CD19 se expresa en linfocitos B normales. Obviamente, la especificidad del antígeno selectivo por el tejido maligno es fundamental para evitar este tipo de activación inespecífica de linfocitos T. El PSMA es un antígeno especialmente adecuado a este respecto, ya que una amplia evaluación inmunohistológica ha revelado que la expresión de este antígeno en el tejido normal se limita al epitelio prostático, la glándula mamaria y los túbulos proximales del riñón [atlas de proteínas humanas, http://www.proteinatlas.org]. En el tejido maligno, el antígeno se expresa abundantemente en las células del carcinoma de próstata y en una diversidad de otros tumores sólidos, tales como el carcinoma de colon, mamario y pancreático y el glioblastoma (Changet al.,Cancer Res., 1999, 59:3192; Rosset al.,Cancer Met. Rev., 2005, 24:521). Sin embargo, en estos últimos tumores, la expresión de PSMA está estrictamente restringida a la vasculatura y no afecta a las propias células tumorales. Curiosamente, en el carcinoma de próstata, el único tumor hasta ahora con expresión en las células tumorales, la vasculatura carece de expresión de PSMA en la mayoría de los casos (Changet al.,1999), de modo que la situación óptima, es decir, la expresión tanto en la vasculatura como en las propias células tumorales, rara vez aparece (P1.1).

Aparte de su especificidad, otra propiedad del anticuerpo diana puede ser crucial para su actividad terapéutica: el anticuerpo puede provocar un desplazamiento del antígeno, ya sea por "desprendimiento" o por captación del antígeno al interior de la célula diana. La captación del antígeno es deseable en el caso de una inmunotoxina, que es una construcción que comprende un anticuerpo y una toxina que normalmente requiere la captación al interior de la célula para ejercer su actividad. Sin embargo, si se utilizan anticuerpos para reclutar células efectoras inmunológicas, el desplazamiento del antígeno por cualquier mecanismo puede obstaculizar la actividad de los anticuerpos. De hecho, se ha demostrado que los anticuerpos terapéuticos CD20 inducen un desplazamiento del antígeno en diferentes células de linfoma en un grado variable y que este fenómeno es, al menos en parte, responsable de los efectos terapéuticos variables de estos anticuerpos (Glennieet al.,Mol Immunol., 2007, 44-3823). En cualquier caso, en el contexto de los anticuerpos biespecíficos activadores de linfocitos T, parece deseable seleccionar anticuerpos diana que induzcan un desplazamiento mínimo del antígeno (P1.2).

P2: La activación de linfocitos T no está (como debería estar) restringida a la célula diana, es decir, incluso un sitio de unión efector de CD3 monovalente dentro de una construcción de anticuerpo biespecífico es capaz de inducir cierta activación de linfocitos T en ausencia de células diana a las que el anticuerpo se une con su resto selectivo. Esto representa una activación inespecífica en sentido estricto, ya que no se requieren células portadoras de un antígeno diana para inducir el fenómeno. Los inventores han observado que este fenómeno varía considerablemente si se utilizan diferentes anticuerpos CD3 en distintos formatos y si se añaden determinadas células espectadoras estimuladoras ("stimulating bystander cells", SBC), tales como células de linfoma (SKW6.4) o células endoteliales (HUVEC), que proporcionan coestímulos para la activación de los linfocitos T Por lo tanto, para la construcción de anticuerpos biespecíficos, se debe seleccionar un resto de CD3 que induzca una activación "inespecífica" mínima de los linfocitos T (P2.1).

Además de la activación de linfocitos T inducida por la estimulación de CD3 genuinamente monoméricos, un trabajo reciente sugiere un mecanismo alternativo para la activación inespecífica que implica la parte selectiva de un anticuerpo biespecífico; si esta parte consiste en un fragmento monocatenario que induce la agrupación de la parte efectora del anticuerpo biespecífico en la superficie del linfocito T, puede inducirse la señalización tónica que provoca el agotamiento del linfocito T (Longet al.,Nat. Med., 2015, 6:581), que apenas es detectable mediante ensayos convencionalesin vitrode corta duración, pero que afecta gravemente a la eficaciain vivo.Estas observaciones se han realizado utilizando linfocitos T transfectados con un receptor de antígeno quimérico (linfocitos T CAR). Los receptores quiméricos de linfocitos T incluyen anticuerpos monocatenarios como restos selectivos. Es muy probable que los resultados de Longet al.(2015) se apliquen igualmente a los anticuerpos biespecíficos con dicha parte selectiva, ya que estos reactivos, una vez unidos a un linfocito T, son funcionalmente equivalentes a un linfocito T transfectado con el CAR correspondiente. Es bien sabido en este campo que la mayoría de los anticuerpos monocatenarios tienen tendencia a formar multímeros y agregados (Wornet al.,J. Mol. Biol., 2001, 305:989-1010), por lo que no es de extrañar que todos menos uno de los CAR ensayados por Longet al.(2015) presentase el fenómeno de agrupación y transducción de señales tónica de CD3, aunque en un grado variable (Longet al.,2015). El problema esbozado en este punto (P2.2) exige un formato biespecífico que evite la multimerización de la parte selectiva y su agrupación.

P3: La mayoría de los formatos biespecíficos tienen una semivida sérica muy baja (de 1 a 3 horas) debido a su peso molecular reducido y a la falta de dominios CH3. Así, el anticuerpo prototípico blinatumomab se aplica mediante infusión i.v. continua de 24 horas durante varias semanas. El uso de formatos basados en IgG completas con una mayor semivida sérica, tal como la IgGsc representada en la figura 1B, se ha considerado inadecuado debido al posible aumento de la activación inespecífica inducida por el resto bivalente C-terminal de unión a CD3.

El documento WO 2015/013671 divulga anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos activables multiespecíficos que se unen específicamente a dos o más antígenos o epítopos diferentes.

El documento WO 2015/143033 divulga un ensayo basado en células para ensayar la potencia de moléculas de unión multiespecíficas que se unen específicamente a un antígeno de linfocitos T y a un antígeno diana para la citotoxicidad celular mediada por linfocitos T redirigida.

El documento WO 2015/006749 divulga contratos de unión a antígenos biespecíficos que se unen a antígenos de CD3 y CD19 o CD20.

Weidle U.H.et al.,2013, CANCER GENOMICS & PROTEOMICS, 1 de enero de 2013, analizan las opciones de formatos de anticuerpos multiespecíficos en el tratamiento del cáncer.

Wu Z.et a l,2017, PHARMACOLOGY AND THERAPEUTICS, vol. 182, 1 de febrero de 2018, págs. 161-175, analizan la solicitud internacional de anticuerpos biespecíficos de unión a linfocitos T.

Basándose en lo anterior, existe una necesidad en la técnica de moléculas de anticuerpos mejoradas que aborden al menos uno de los problemas descritos anteriormente.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente y homodimérica que comprende en cada monómero:

(i) un fragmento Fab N-terminal que comprende una región variable que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en la que dicha región variable comprende un primer sitio de unión capaz de unirse a un antígeno;

(ii) un fragmento scFv C-terminal, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de UCHT1 humanizado, y

en la que (i) y (ii) están conectados por un dominio CH2 y CH3.

Breve descripción de los dibujos

La invención se comprenderá mejor con referencia a la descripción detallada cuando se considere conjuntamente con los ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra diversos formatos de moléculas de anticuerpos biespecíficos que se han utilizado en la presente invención. Se muestran los anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 en formato Fabsc (figura 1A) e IgGsc (figura 1B). En ambos formatos se impide la unión del dominio CH2 a los receptores de Fc mediante modificaciones aminoacídicas definidas. También se representa el formato bssc (Fv monocatenario biespecífico) (figura 1C).

La figura 2 muestra la activación inespecífica de linfocitos T por diferentes anticuerpos PSMAxCD3. Se incubaron PBMC con los anticuerpos indicados en ausencia y presencia de células de linfoma SKW6.4. Después de 3 días, se analizó la expresión de CD69 de los linfocitos T mediante citometría de flujo.

En la figura 3 se muestra la activación de los linfocitos T, que se evaluó mediante la captación de timidina 3H. En la figura 3A se muestra la activación inespecífica de linfocitos T en ausencia de células diana, mientras que la figura 3B representa, en comparación, la activación específica de linfocitos T con anticuerpos PSMAxCD3 en formato Fabsc y que contienen los anticuerpos CD3 UCHT1 (NPCU) y OKT3 (NPCO), respectivamente. En la figura 3C se demuestra la lisis de células diana que expresan PSM<a>por linfocitos T activados mediante un ensayo de citotoxicidad Xelligence.

La figura 4 muestra la multimerización y agregación de diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos. En las figuras 4A y 4B se comparan los anticuerpos con especificidad FLT3xCD3 (formato Fabsc frente a bssc), mientras que en las figuras 4C-4F se comparan los anticuerpos con especificidad PSMAxCD3 (formato Fabsc frente a IgGsc). La filtración en gel se realizó en columnas Superdex S200.

La figura 5 representa la unión del anticuerpo PSMA J591 de la técnica anterior y el anticuerpo de la invención 10B3 a células que expresan PSMA. La unión (figura 5A), la ausencia de competencia en la unión (figura 5B) y el desplazamiento del antígeno PSMA tras la unión del anticuerpo (figura 5C) se evaluaron mediante citometría de flujo utilizando células Sp2/0 transfectadas con PSMA. En la figura 5B se demuestra que J591 quimérico (ch), detectado específicamente por un anticuerpo secundario de cabra antihumano, fue superado por J591 murino (mu), pero no por 10B3 murino.

La figura 6 muestra secciones de criostato teñidas con el anticuerpo J591 de la técnica anterior que se une a PSMA y el anticuerpo 10B3 de la invención. En la figura 6A y la figura 6B se tiñó una muestra de carcinoma de próstata con ambos anticuerpos en paralelo y un sistema de polímeros de Zytomed, Berlín, Alemania (POLHRP-100), mientras que en la figura 6C y la figura 6D se tiñó una muestra de carcinoma de células escamosas con los dos anticuerpos de nuevo en paralelo utilizando un sistema de polímeros de Zytomed. Las flechas indican el estroma tumoral (Tu) y los vasos sanguíneos (Ve). Se muestran resultados representativos de 9 de 10 muestras de cáncer de próstata y 7 de 10 muestras de carcinoma de células escamosas. En una diversidad de tejidos humanos normales diferentes (obtenidos en BioCat, Heidelberg, Alemania, T6234701-2), el patrón de tinción de los dos anticuerpos fue idéntico con la excepción de una débil reactividad de 10B3 con células epiteliales en la piel.

La figura 7 muestra la unión de moléculas de anticuerpos 10B3 humanizados y de ratón. Se incubaron moléculas de anticuerpos Fabsc biespecíficos con especificidad PSMAxCD3 (10B3xOKT3) que contenían dominios variables humanizados injertados con CDR (h10B3) o dominios variables de anticuerpos de ratón (m10B3) con células 22RV1 que expresaban PSMA y se analizaron mediante citometría de flujo.

La figura 8 muestra la unión de la parte dirigida a CD3 de diferentes anticuerpos PSMAxCD3. Se incubaron células Jurkat positivas a CD3 con los anticuerpos indicados y se analizaron por citometría de flujo.

La figura 9 muestra la actividad citolítica de los diferentes anticuerpos PSMA. Se incubaron células de carcinoma de próstata 22RV1 que expresaban PSMA con PBMC y los anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 indicados a una proporción PBMC:diana de 5:1. La viabilidad de las células diana adheridas se evaluó mediante un sistema Xelligence. Se muestran los resultados representativos de uno de cuatro experimentos diferentes con PBMC de diferentes voluntarios sanos.

La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 10B3 murino y humanizado. La figura 10A muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 10B3 murino (SEQ ID NO: 01). Las secuencias CDR están subrayadas. La figura 10B muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 murino (SEQ ID NO: 02). Las secuencias CDR están subrayadas. La figura 10C muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 10B3 humanizado en la que los bucles CDR (CDRH1, CDRH2 y CHDR3) de la cadena pesada del anticuerpo murino 10B3 se injertan en el dominio variable de la secuencia de la cadena pesada de la línea germinal IGHV3-11*06 (SEQ ID NO: 09). Las secuencias CDR están subrayadas. Además, el residuo de serina que está presente en la posición 49 de la secuencia de la cadena pesada de la línea germinal IGHV3-11*06 está retromutado en el dominio variable de SEQ ID NO:9 a una alanina que está presente en el anticuerpo murino 10B3. Este residuo de alanina en la posición 49 está resaltado en negrita y cursiva en la figura 10C. La figura 10D muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 humanizado en la que los bucles CDR (CDRL1, CDRL2, CDRL3 de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 se injertan en el dominio variable de la secuencia ligera<k>humana IGKV3-20*02 (SEQ ID NO: 10). Las secuencias CDR están subrayadas. Además, la fenilalanina presente en la posición de secuencia 72 en el dominio variable de la secuencia de la cadena ligera humana de IGKV3-20*02 está retromutada en el dominio variable de SEQ ID NO:10 al residuo de tirosina que está presente en esta posición de secuencia en el anticuerpo murino 10B3. Este residuo de tirosina en la posición 72 está resaltado en negrita y cursiva en la figura 10D.

La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la molécula de anticuerpo biespecífico en formato IgGsc PSMA (h10B3 humanizado) X CD3 (hUCHTI humanizado) (SEQ ID NO: 11). La cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada ("heavy chain", HC) humanizada de 10B3, un dominio CH1 de IgG1, una región bisagra de IgG1, un dominio CH2 de IgG1 modificado, un dominio CH3 de IgG1 y un fragmento Fv monocatenario de CD3 humanizado (UCHT1).

La figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la molécula de anticuerpo biespecífico en formato Fabsc PSMA (h10B3 humanizado) X CD3 (OKT3 murino) (SEQ ID NO: 12). La cadena pesada comprende una región variable HC humanizada de 10B3, un dominio CH1 de IgG1, una región bisagra de IgG1, un dominio CH2 de IgG1 modificado, el principio de un dominio CH3 de IgG1 y un fragmento Fv monocatenario de CD3 murino (OKT3).

La figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa del anticuerpo PSMA (humanizado h10B3) (SEQ ID NO: 13). Esta cadena ligera completa las construcciones de cadena pesada de SEQ ID NO: 11 y S<e>Q ID NO: 12 para formar una molécula IgGsc h10B3xUCHTI y una molécula Fabsc h10B3xOKT3, respectivamente (véase la figura 1).

La figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de los dominios variables del anticuerpo J519, mostrando la figura 14A la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 15) y mostrando la figura 14B la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 16) del anticuerpo J519.

La figura 15 muestra el efecto terapéutico del anticuerpo biespecífico de la invenciónin vitro.La molécula de anticuerpo biespecífico en formato IgGsc PSMA (h10B3 humanizado) X CD3 (hUCHT1 humanizado) de la invención y el anticuerpo biespecífico de control (NG2xCD3) se incubaron en presencia de PBMC con o sin células tumorales.

La figura 16 muestra la actividad antitumoralin vivode la molécula de anticuerpo biespecífico en formato IgGsc PSMA (h10B3 humanizado) X CD3 (hUCHT1 humanizado) de la invención en un modelo de ratón.

La figura 17 muestra la activación de linfocitos T y la inhibición del crecimiento de células tumorales de anticuerpos IgGsc biespecíficos no dirigidos a PSMA con UCHT1 como especificidad anti-CD3.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a un anticuerpo, una molécula de anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que es capaz de unirse al antígeno de membrana específico de la próstata ("prostate specific membrane antigen", PSMA) humano. El anticuerpo, molécula de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la región CDRH1 expuesta en SEQ ID NO: 3 (con la secuencia de aminoácidos GFTFSDFYMY), la región CDRH2 expuesta en SEQ ID NO: 4 (con la secuencia de aminoácidos TISDGGGGYTSYPDSVKG) y la región CDRH3 expuesta en SEQ ID NO: 5 (con la secuencia de aminoácidos GLWLRDALDY) o que comprende una secuencia de CDRH1, CDRH2 o CDRH3 que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia o al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 5. Comprende además (iii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la región CDRL1 expuesta en SEQ ID NO: 6 (con la secuencia de aminoácidos SASSSISSNYLH), la región CDRL2 expuesta en SEQ ID NO: 7 (con la secuencia de aminoácidos RTSNLAS) y la región CDRL3 expuesta en SEQ ID NO: 8 (con la secuencia de aminoácidos QQGSYIPFT) o que comprende una secuencia de CDRL1, CDRL2 o CDRL3 que tiene una identidad de secuencia del 75 % o del 80 % con SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO: 8. La invención contempla una molécula de anticuerpo que comprende la región CDRH1 expuesta en SEQ ID NO: 3, la región CDRH2 expuesta en SEQ ID NO: 4, la región CDRH3 expuesta en SEQ ID NO: 5, la región CDRL1 expuesta en SEQ ID NO: 6, la región VLCDL2 expuesta en SEQ ID NO: 7 y la región VLCDL3 expuesta en SEQ ID<n>O: 8. En este contexto, se observa que la molécula de anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de la misma preferentemente no compite con la unión del anticuerpo J591 (Liuet al.,Cancer Res., 1997, 57: 3629-3634, que es el anticuerpo más desarrollado clínicamente, véase el análisis de Akhtaret al.,"Prostate-Specific Membrane AntigenBased Therapeutics", Advances in Urology, volumen 2012 (2012), artículo ID 973820) contra el PSMA humano. Además, una molécula de anticuerpo de la presente divulgación o un fragmento de unión al antígeno de la misma puede presentar una inducción reducida del desplazamiento de antígeno cuando se une a PSMA en comparación con J591. También puede ejercer una reactividad distintiva con células de carcinoma escamoso de distinto origen.

La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo, una molécula de anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 01 o 09. También se incluye en la divulgación un anticuerpo, una molécula de anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera, en la que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 02 o SEQ ID NO: 10. Se prefiere especialmente un anticuerpo, una molécula de anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo murino anti-PSMA 10B3 (m10B3) según expone en SEQ ID NO: 01 y 02, respectivamente. También se prefiere un anticuerpo, una molécula de anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-PSMA 10B3 (h10B3) según se expone en SEQ ID NO: 09 y 10, respectivamente.

PSMA es un antígeno especialmente atractivo para el transporte dirigido mediado por anticuerpos, y se han desarrollado varios anticuerpos dirigidos a la porción extracelular de esta proteína. El reactivo más avanzado, J591 (Liuet al.,Cancer Res., 1997, 57: 3629-3634), se está evaluando en la actualidad en ensayos clínicos, ya sea radiomarcado o acoplado a la toxina DM1, un derivado de la maytansina, un compuesto inhibidor de la tubulina (Ross J.S.,et al.,Cancer Met. Rev., 2005, 24:521; Akhtaret al.,2012,supra).El anticuerpo PSMA de la divulgación tiene un patrón de reacción idéntico al del tejido humano normal. Sin embargo, el anticuerpo PSMA de la presente divulgación difiere del anticuerpo J591 en su reacción con células de carcinoma escamoso de diferente origen. Sorprendentemente, se ha descubierto que, en estos tumores, así como en el cáncer de próstata, las propias células tumorales y la vasculatura dentro y alrededor del tumor se tiñen con un anticuerpo PMSA, tal como el anticuerpo 10B3 que contiene las secuencias de CDR de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera como se muestra en SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO: 8 (cf. figura 6). Los carcinomas escamosos constituyen la mayoría de los cánceres que surgen en el compartimento otorrinolaringológico, el esófago y el cuello uterino, así como el 20-30 % de los tumores de pulmón, y la expresión de PSMA en dichos tumores no se había descrito antes. Así, la reactividad favorable del anticuerpo de la presente divulgación con estos cánceres ofrece opciones de diagnóstico y tratamiento ampliadas y mejoradas.

El anticuerpo PSMA J591 y el anticuerpo de la presente divulgación difieren en otro aspecto importante: En general, muchos anticuerpos inducen un intenso desplazamiento del antígeno al unirse a una célula diana, una propiedad deseada, por ejemplo, para la construcción de inmunotoxinas que requieren la captación al interior de las células para ejercer su actividad biológica. El anticuerpo de referencia PSMA J591, por ejemplo, se utiliza para tal fin (Rosset al.,2005,supra).Sin embargo, si se desea reclutar células efectoras inmunológicas, es preferible una expresión estable del antígeno en lugar de su rápida captación al interior de la célula. La figura 5 demuestra que la unión de un anticuerpo de la presente divulgación a células Sp2/0 transfectadas con PSMA es comparable a la de J591 (figura 5A) y que los dos anticuerpos no compiten entre sí, lo que indica que se unen a diferentes epítopos de la molécula de PSMA (figura 5B). Lo que es más importante, el anticuerpo de la presente divulgación induce un desplazamiento de antígeno reducido si se compara con J591 (figura 5C). En este contexto, cabe señalar, sin embargo, que aún no se conoce el epítopo de PMSA al que se une el anticuerpo 10B3. También cabe señalar a este respecto que el epítopo al que se une el anticuerpo 10B3 en células de carcinoma escamoso puede no ser necesariamente el mismo que el epítopo en PMSA, en concreto porque la expresión de PMSA no se ha descrito todavía en células de carcinoma escamoso. Así pues, el epítopo o epítopos a los que se une una molécula de anticuerpo de la divulgación en células de carcinoma escamoso sólo pueden estar relacionados con el epítopo en PMSA con respecto a su secuencia de aminoácidos o su confirmación. Sin embargo, la naturaleza del epítopo respectivo en PMSA o en células de carcinoma escamoso no es importante en la presente divulgación, siempre que una molécula de anticuerpo de la presente divulgación se una a células que expresan PMSA o a células de carcinoma escamoso como se describe en el presente documento. También se señala en el presente documento que la unión de una molécula de anticuerpo de la presente divulgación a una célula no tiene que desencadenar necesariamente una respuesta fisiológica. Más bien, basta con que el anticuerpo de la divulgación se una a una célula determinada (al epítopo presente en una célula determinada). Si, por ejemplo, se conjuga con un agente tóxico para las células, tal como una toxina o un ligando radiactivo, el anticuerpo actúa, con fines terapéuticos, como un resto de transporte selectivo o dirigido que conduce el agente tóxico para las células a la célula en la que el agente tóxico para las células debe ejercer su actividad tóxica para las células (destrucción de las células). Del mismo modo, cuando se utiliza con fines de diagnóstico, un anticuerpo de la divulgación puede conjugarse con un resto de obtención de imágenes que proporcione una señal detectable que pueda utilizarse para la detección de la célula a la que se ha unido el anticuerpo.

La presente divulgación también proporciona una versión humanizada de 10B3, que se ha humanizado mediante injerto de CDR, lo que significa que las regiones CDR del anticuerpo murino 10B3 se insertan en la región marco de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano. En principio, cualquier cadena ligera humana variable y/o cadena pesada variable puede servir de andamiaje para el injerto de CDR. En un ejemplo ilustrativo de un anticuerpo humanizado de la divulgación, las regiones CDR de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 (es decir, los bucles CDR de SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8) puede insertarse en (el dominio variable) de la secuencia ligera k humana IGKV3-20*02 que está depositada en la base de datos IMGT/LIGM con el número de registro L37729, véase también Ichiyoshi Y., Zhou M., Casali P., A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin-specific 'germ-line' natural antibody template. Analysis by V gene segment reassortment and site-directed mutagenesis, J. Immunol., 154(1):226-238 (1995). En otro ejemplo ilustrativo de un anticuerpo humanizado de la divulgación, las regiones CDR de la cadena pesada del anticuerpo 10B3 (es decir, los bucles<c>D<r>de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5) pueden incluirse en los (dominios variables) de la secuencia de la cadena pesada IGHV3-11 *06 que está depositada en la base de datos<i>M<g>T/LIGM con el número de registro AF064919 (véase también Watson C.T,et al.,Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copynumber variation, Am. J. Hum. Genet., 92(4):530-546 (2013). En otra realización ilustrativa de un anticuerpo humanizado según se describe en el presente documento, los bucles CDR de la cadena pesada del anticuerpo 10B3 se injertan en el dominio variable de la cadena pesada de la secuencia de la línea germinal IGHV3-11*06 y los bucles CDR de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 se injertan en el dominio variable de la secuencia ligera<k>humana IGKV3-20*02. Para mantener las propiedades de unión del anticuerpo murino originario 10B3, es posible que los residuos del marco humano se muten de nuevo al residuo de aminoácido que está presente en una posición de secuencia concreta del anticuerpo murino 10B3. En un ejemplo ilustrativo de dicho anticuerpo humanizado, en el dominio variable de la cadena pesada de la secuencia de la línea germinal humana de IGHV3-11 *06, la serina en la posición 49 fue retromutada a una alanina que está presente en el anticuerpo murino 10B3 (véase también la figura 10C, en la que el residuo de alanina en la posición 49 está resaltado en negrita y cursiva) mientras que, en el dominio variable de la secuencia de cadena ligera de IGKV3-20*02, la fenilalanina en la posición 72 de la secuencia de línea germinal humana se retromutó a un residuo de tirosina que está presente en esta posición de secuencia en el anticuerpo murino 10B3 (véase también la figura 10D, en la que el residuo de tirosina en la posición 72 está resaltado en negrita y cursiva). Dicho anticuerpo humanizado, incorporado en un anticuerpo Fabsc biespecífico, se une con la misma avidez a la línea celular que expresa PSMA que el anticuerpo originario de ratón (cf. figura 7).

El término "anticuerpo" se refiere, por lo general, a una molécula de unión de tipo proteico basada en una inmunoglobulina. Algunos ejemplos típicos de este tipo de anticuerpos son los derivados o fragmentos funcionales de una inmunoglobulina que conservan la especificidad de unión. Las técnicas para la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. El término "anticuerpo" también incluye inmunoglobulinas (Ig) de diferentes clases (es decir, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) y subclases (tales como IgG1, lgG2, etc.). Tal como también se ha mencionado anteriormente, los ejemplos ilustrativos de un derivado o molécula de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, F(ab')<2>, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), diacuerpos o anticuerpos de dominio (Holt L.J.et al.,Trends Biotechnol., 21(11), 2003, 484-490). Así pues, la definición del término "anticuerpo" también incluye realizaciones tales como los anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados.

Una "molécula de anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, puede portar uno o más dominios que tienen una secuencia con al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con un dominio natural correspondiente de una inmunoglobulina M, una inmunoglobulina G, una inmunoglobulina A, una inmunoglobulina D o una inmunoglobulina E. A este respecto, cabe señalar que el término "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento, significa dentro de una desviación del 20 %, como por ejemplo, dentro de una desviación del 10 % o dentro del 5 % de un valor o intervalo determinado.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia", tal como se utiliza en la presente divulgación, significa el porcentaje de residuos idénticos emparejados (tras el alineamiento por homología de una secuencia de un polipéptido de la presente divulgación con una secuencia en cuestión) con respecto al número de residuos en la más larga de estas dos secuencias. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de las competencias en la técnica, por ejemplo, utilizando un software informático de acceso público, tal como BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluidos los algoritmos necesarios para lograr el máximo alineamiento en toda la longitud de las secuencias comparadas. Lo mismo puede decirse de las secuencias de nucleótidos divulgadas en el presente documento. En este contexto, la identidad de secuencia de al menos el 75 % o al menos el 80 % descrita en el presente documento se ilustra con respecto a la secuencia de CDR de un anticuerpo de la divulgación. Refiriéndose en primer lugar a la CDR H1, un anticuerpo de la divulgación tiene una secuencia de CDRH1 GFTFSDFYMY (SEQ ID NO: 3) o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% con esta secuencia. Dado que esta secuencia CDRH1 tiene una longitud de 10 aminoácidos, 2 de estos 10 residuos pueden sustituirse para tener una identidad de secuencia del 80 % con SEQ ID NO:3. Por ejemplo, es posible que el residuo de treonina en la posición 3 de la CDR H1 se sustituya por una serina (realizando una sustitución conservadora) y que el residuo de serina en la posición 5 de la CDRH1 se sustituya por un residuo de treonina (es decir, también mediante una sustitución conservadora). Así, la secuencia resultante g Fs FTDFYMY (SEQ ID NO: 14) de CDRH1 que porta estos dos intercambios conservadores de aminoácidos en relación con SEQ ID NO: 3 tiene una identidad de secuencia del 80%con la secuencia de SEQ ID NO: 3, mientras que una secuencia CDR H1 en la que sólo se realiza una de estas dos sustituciones conservadoras tiene una identidad de secuencia del 90 % con la secuencia de SEQ ID NO: 3. Del mismo modo, la secuencia CDRH2 expuesta en SEQ ID NO: 04 (TISDGGGGYTSYPDSVKG) contiene 17 residuos de aminoácidos, y una identidad de secuencia del 80 % permite hasta 3 mutaciones con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 04 (ya que el 20 % corresponde teóricamente a 3,4 aminoácidos diferentes). Por ejemplo, el primer residuo de treonina de SEQ ID NO: 4 puede sustituirse por una serina. Del mismo modo, la región c Dr H3 expuesta en SEQ ID NO: 05 (GLWLRDALDY) tiene una longitud de 10 residuos de aminoácidos. Así, una secuencia CDRH3 que tenga un 80 % o un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 05 (GLWLRDALDY) puede comprender dos sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones conservadoras, en comparación con SEQ ID<n>O: 5. La región CDRL1 expuesta en SEQ ID NO: 06 (SASSSISSNYLH) comprende 12 residuos de aminoácidos. Así, una secuencia CDRL1 que porta una o dos sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06 tiene una identidad de secuencia de más del 80 % con la secuencia de SEQ ID NO: 06. La región CDRL2 expuesta en SEQ ID NO: 07 (RTSNLAS) tiene una longitud de 7 residuos de aminoácidos. Así, una secuencia CDRL2 que contiene una sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia CDRL2 de SEQ ID NO: 7 tiene una identidad de secuencia del 84 % con la SEQ ID NO: 07. Por último, la región CDRL3 expuesta en SEQ ID NO: 08 (QQGSYIPFT) tiene una longitud de 9 residuos de aminoácidos. En consecuencia, una secuencia CDRL3 que comprende un aminoácido sustituido en comparación con la secuencia de SEQ NO: 08 tiene una identidad de secuencia del 89 % con SEQ ID NO: 8, y una secuencia CDL3 que comprende dos sustituciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 08 tiene una identidad de secuencia del 78 % con la secuencia de SEQ ID NO: 08. Cabe señalar en este punto que, a partir de la explicación anterior y de las secuencias de las regiones CDR descritas en el presente documento, el experto en la materia entenderá que cualquier secuencia que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de cualquiera de las CDRH1, CDRH2, CDHL3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 descritas en el presente documento (SEQ ID NO: 03 a SEQ ID NO: 08) y que es capaz de unirse a PMSA y preferentemente también a células de carcinoma escamoso como se describe en el presente documento está comprendida en la presente divulgación. Mientras que la secuencia de CDR que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de CDR respectiva de cualquiera de SEQ ID NO: 03 a SEQ ID NO: 08 comprende preferentemente una o más mutaciones conservadoras, también es posible que la desviación a la secuencia de cualquiera de las seis regiones CDR "originarias" (SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 8) del anticuerpo de la divulgación y, por lo tanto, una identidad de secuencia del 75 % o más, se deba a la presencia de mutaciones no conservadoras en las regiones CDR, con la condición de que el anticuerpo conserve la capacidad de unirse a PMSA y, preferentemente, también a células de carcinoma escamoso.

Una "inmunoglobulina", cuando se utiliza en el presente documento, suele ser una proteína glucosilada tetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. En las inmunoglobulinas pueden encontrarse dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda y kappa. En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden clasificarse en cinco grandes clases: A, D, E, G y M, y varias de éstas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, lgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Una inmunoglobulina IgM consta de 5 de las unidades básicas del heterotetrámero junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y contiene 10 sitios de unión al antígeno, mientras que las inmunoglobulinas IgA contienen de 2 a 5 de las unidades básicas de 4 cadenas que pueden polimerizarse para formar conjuntos polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas suele tener aproximadamente 150000 daltons.

En la clase IgG de inmunoglobulinas, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" se entiende una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria diferenciada. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen cada uno tres regiones CH: "CH1" se refiere a las posiciones 118-220, "CH2" a las posiciones 237-340, y "CH3" a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabatet al.Por "bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra de anticuerpo" o "región bisagra de inmunoglobulina" o "H" se entiende el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y el segundo dominio constante de un anticuerpo. Desde el punto de vista estructural, el dominio CH1 de IgG termina en la posición EU 220, y el dominio CH2 de IgG comienza en el residuo en la posición EU 237. Así, para IgG, en el presente documento se define la bisagra de forma que incluya las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1), siendo la numeración según el índice EU como en Kabatet al.La cadena pesada constante, tal como se define en el presente documento, significa desde el extremo N-terminal del dominio CH1 hasta el extremo C-terminal del dominio CH3, por lo que comprende las posiciones 118-447, en las que la numeración es conforme al índice EU.

El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de inmunoglobulina que presentan variabilidad en su secuencia y que intervienen en la determinación de la especificidad y la afinidad de unión de un anticuerpo concreto (es decir, los "dominios variables"). La variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos, sino que se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Estos subdominios se denominan "regiones hipervariables", "HVR" o "HV", o "regiones determinantes de la complementariedad" ("complementarity determining regions", CDR). Las partes más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "marco" ("framework", FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales incluyen cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por la FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabatet al.,véase más adelante). Por lo general, las inmunoglobulinas naturales incluyen seis CDR (véase más abajo): tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En las inmunoglobulinas naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis CDR, y se cree que H3 en concreto desempeña un papel único a la hora de conferir especificidad fina a las inmunoglobulinas. Los dominios constantes no participan directamente en la unión al antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como, por ejemplo, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y la activación del complemento.

Los términos "V<h>" (también denominado VH) y "V<l>" (también denominado VL) se utilizan en el presente documento para referirse al dominio variable de cadena pesada y al dominio variable de cadena ligera, respectivamente, de una inmunoglobulina. Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables. Así, la expresión "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable incluye residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR". Hay tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera (o regiones CDR) en la porción variable de una inmunoglobulina. Por lo tanto, "CDR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a las tres CDR de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3), o a las tres CDR de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) o a todas las CDR de cadena pesada y a todas las C<d>R de cadena ligera, si procede. Tres CDR conforman el carácter de unión de una región variable de cadena ligera y tres conforman el carácter de unión de una región variable de cadena pesada. Las CDR determinan la especificidad antigénica de una molécula de inmunoglobulina y están separadas por secuencias de aminoácidos que incluyen regiones de andamiaje o marco. La definición exacta de los límites y longitudes de los CDR está sujeta a diferentes sistemas de clasificación y numeración. La estructura y el plegamiento de las proteínas del anticuerpo pueden hacer que otros residuos se consideren parte de la región de unión al antígeno y así lo entendería un experto. Las CDR proporcionan la mayoría de los residuos de contacto para la unión de la inmunoglobulina al antígeno o epítopo.

La CDR3 suele ser la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. La H3, por ejemplo, puede ser tan corta como dos residuos de aminoácidos o puede tener más de 26 aminoácidos. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para un análisis de la estructura de los anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlowet al.,1988. Un experto en la materia reconocerá que cada estructura de subunidad, por ejemplo, una estructura CH, VH, CL, VL, CDR, FR, incluye fragmentos activos, por ejemplo, la porción de la subunidad VH, VL o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión al antígeno, o, por ejemplo, la porción de la subunidad CH que se une y/o activa, por ejemplo, un receptor de Fc y/o el complemento. Las CDR suelen referirse a las CDR de Kabat, descritas en Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabatet al.Otra norma para caracterizar el sitio de unión del antígeno es referirse a los bucles hipervariables descritos por Chothia. Véase, por ejemplo, Chothia,et al.(1992, J. MoI. Biol., 227:799-817; y Tomlinsonet al.(1995), EMBO J., 14:4628-4638. Otra norma es la definición AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, en general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, en: Antibody Engineering Lab Manual (ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Las realizaciones descritas con respecto a las CDR de Kabat pueden aplicarse también utilizando relaciones similares descritas con respecto a los bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos por AbM.

La correspondiente inmunoglobulina de cadena pesada mu, de cadena pesada gamma, de cadena pesada alfa, de cadena pesada delta, de cadena pesada épsilon, de cadena ligera lambda o de cadena ligera kappa puede ser de cualquier especie, como una especie de mamífero, incluida una especie de roedor, un anfibio, por ejemplo, de la subclaseLissamphibiaque incluye, por ejemplo, ranas, sapos, salamandras o tritones o una especie de invertebrado. Algunos ejemplos de mamíferos son, entre otros, una rata, un ratón, un conejo, una cobaya, una ardilla, un hámster, un erizo, un ornitorrinco, una pica americana, un armadillo, un perro, un lémur, una cabra, un cerdo, una vaca, una zarigüeya, un caballo, un murciélago, una marmota, un orangután, un mono rhesus, un mono lanudo, un macaco, un chimpancé, un tamarino(Saguinus oedipus),un tití o un ser humano.

Tal como se menciona en el presente documento, una inmunoglobulina suele ser una glucoproteína que incluye al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) unidas por enlaces disulfuro, o una porción de unión al antígeno de las mismas. Cada cadena pesada tiene una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como V<h>) y una región constante de cadena pesada. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada incluye tres dominios, Cm, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera tiene una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera incluye un dominio, C<l>. Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Cada V<h>y V<l>tiene tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el amino-terminal al carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un epítopo de un antígeno.

Los residuos de la "región marco" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable distintos de la región hipervariable. Las secuencias de las regiones marco de las diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una misma especie. Así, una "región marco humana" es una región marco sustancialmente idéntica (aproximadamente un 85 % o más, habitualmente un 90-95 % o más) a la región marco de una inmunoglobulina humana natural. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno.

El término "Fab" y las expresiones "región Fab", "porción Fab" o "fragmento Fab" se usan para definir un polipéptido que incluye un dominio de inmunoglobulina Vh, Ch<1>, Vl y Cl. Fab puede referirse a esta región de forma aislada, o a esta región en el contexto de una molécula de anticuerpo, así como a una inmunoglobulina de longitud completa o a un fragmento de inmunoglobulina. Normalmente, una región Fab contiene una cadena ligera completa de un anticuerpo. Se puede considerar que una región Fab define "un brazo" de una molécula de inmunoglobulina. Contiene la porción de unión al epítopo de esa Ig. La región Fab de una inmunoglobulina natural puede obtenerse como un fragmento proteolítico mediante digestión con papaína. Una "porción F (abV es el fragmento proteolítico de una inmunoglobulina digerida con pepsina. Una "porción Fab'" es el producto resultante de reducir los enlaces disulfuro de una porción F(ab')<2>. Tal como se utilizan en el presente documento, el término "Fab" y las expresiones "región Fab", "porción Fab" o "fragmento Fab" pueden incluir además una región bisagra que define el extremo C-terminal del brazo del anticuerpo. Esta región bisagra corresponde a la región bisagra que se encuentra en posición C-terminal del dominio CH1 dentro de una inmunoglobulina de longitud completa en la que los brazos de la molécula de anticuerpo pueden tomarse para definir una Y La expresión región bisagra se utiliza en la técnica porque una inmunoglobulina tiene cierta flexibilidad en esta región. Una "cadena pesada de Fab", tal como se utiliza en el presente documento, significa la porción o polipéptido del fragmento Fab que comprende un V<h>y un C<h1>, mientras que una "cadena ligera de Fab" significa la porción o polipéptido del fragmento Fab que comprende un V<l>y un C<l>.

La expresión "región Fc" o "fragmento Fc" se utiliza en el presente documento para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. La parte Fc media en la función efectora de los anticuerpos, por ejemplo, la activación del sistema del complemento y de las células efectoras inmunitarias portadoras de receptores de Fc, tales como las células NK. En las moléculas de IgG humana, la región Fc se genera por escisión con papaína N-terminal a Cys226. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, se suele considerar que la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el carboxiloterminal de la misma. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación de la molécula de anticuerpo, o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada de la molécula de anticuerpo. Las regiones Fc de secuencia nativa incluyen IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 de mamífero, por ejemplo, ser humano o murino. La región Fc contiene dos o tres dominios constantes, en función de la clase del anticuerpo. En las realizaciones en las que la inmunoglobulina es una IgG, la región Fc tiene un dominio CH2 y un dominio<c>H3.

La expresión "fragmento variable monocatenario" (scFv) se utiliza en el presente documento para definir un fragmento de anticuerpo, en el que las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de una inmunoglobulina están fusionadas, conectadas por un péptido conector corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. El conector suele ser rico en glicina para mayor flexibilidad, así como en serina o treonina para mayor solubilidad, y puede conectar el N-terminal del VH con el C-terminal del VL, o conectar el N-terminal del VL con el C-terminal del VH. El fragmento scFv conserva un sitio específico de unión al antígeno, pero carece de los dominios constantes de las inmunoglobulinas.

El término "epítopo", también conocido como "determinante antigénico", se refiere a la porción de un antígeno a la que se une específicamente un anticuerpo o un receptor de linfocitos T, formando así un complejo. Así pues, el término "epítopo" incluye cualquier molécula o determinante proteico capaz de unirse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o de linfocitos T El sitio o sitios de unión (parátopos) de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento pueden unirse/interactuar específicamente con epítopos conformacionales o continuos, que son exclusivos para la estructura diana. Los determinantes epitópicos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. En algunas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Con respecto a los antígenos polipeptídicos, un epítopo conformacional o discontinuo se caracteriza por la presencia de dos o más residuos de aminoácidos discretos, separados en la secuencia primaria, pero que se ensamblan en una estructura coherente en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega para formar la proteína/antígeno nativo (SeIa, M., Science (1969), 166, 1365-1374; Laver, W.G,et al.,Cell (1990), 61, 553-556). Los dos o más residuos de aminoácidos discretos que contribuyen al epítopo pueden estar presentes en secciones separadas de una o más cadenas polipeptídicas. Estos residuos se juntan en la superficie de la molécula cuando la cadena o las cadenas polipeptídicas se pliegan en una estructura tridimensional para constituir el epítopo. En cambio, un epítopo continuo o lineal consiste en dos o más residuos de aminoácidos discretos, que están presentes en un único segmento lineal de una cadena polipeptídica.

El término "específico" en este contexto, o la expresión "se une específicamente", también utilizado como "dirigido a", significa, de acuerdo con la presente invención, que el anticuerpo o un fragmento de receptor inmunitario es capaz de interactuar específicamente con un antígeno o ligando específico o con un conjunto de antígenos o ligandos específicos y/o de unirse a los mismos, pero no se une prácticamente a otros antígenos o ligandos. Dicha unión puede ilustrarse mediante la especificidad de un "principio de llave y cerradura". Se dice que los anticuerpos "se unen al mismo epítopo" si los anticuerpos compiten entre sí de modo que sólo uno de ellos puede unirse al epítopo en un momento determinado, es decir, un anticuerpo impide la unión o el efecto modulador del otro.

Generalmente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es superior a 10-6 M o 10-7 M. En especial, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10-8a 10-11 M (K<d>), o de aproximadamente 10-9 a 10-11 M o incluso superior. Si es necesario, la unión inespecífica de un sitio de unión puede reducirse sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión.

La expresión "molécula de anticuerpo aislada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de anticuerpo que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son sustancias que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo se purifica hasta más del 95 % en peso de anticuerpo según lo determinado por el procedimiento Lowry, tal como más del 99 % en peso. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purifica hasta alcanzar la homogeneidad evaluada por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo aislada puede estar presente dentro de células recombinantes sin que estén presentes uno o más componentes del entorno natural del anticuerpo. Normalmente, un anticuerpo aislado se prepara mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula de anticuerpo (recombinante) de la invención que se une a PMSA y/o a células de carcinoma escamoso como se describe en el presente documento puede utilizarse en cualquier formato de anticuerpo recombinante adecuado, por ejemplo, como un fragmento Fv, un scFv, un anticuerpo univalente que carece de una región bisagra, un minicuerpo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')<2>. Una molécula de anticuerpo recombinante de la invención también puede comprender dominios (regiones) constantes, tales como una región constante de IgG humana, un dominio CH1 (como los fragmentos Fab) y/o una región Fc completa. Como alternativa, una molécula de anticuerpo de la invención también puede ser un anticuerpo de longitud completa (entero).

Existen varios mecanismos posibles por los que los anticuerpos median en los efectos celulares, incluida la antiproliferación mediante el bloqueo de las vías de crecimiento necesarias, la transducción de señales intracelular que conduce a la apoptosis, la potenciación de la regulación a la baja y/o el recambio de receptores, la citotoxicidad dependiente del complemento ("complement-dependent cytotoxicity", CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos ("antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity", ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos ("antibody-dependent cell-mediated phagocytosis", ADCP) y la estimulación de una respuesta inmunitaria adaptativa (Cragget al.,1999, Curr. Opin. Immunol., 11 541-547, Glennieet al.,2000, Immunol. Today, 21,403-410). La eficacia de los anticuerpos puede deberse a una combinación de estos mecanismos, y su importancia relativa en la terapia clínica oncológica parece depender del cáncer.

La importancia de las funciones efectoras mediadas por FcyR para la actividad de algunos anticuerpos se ha demostrado en ratones (Clyneset al.,1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 652-656, Clyneset al.,2000, Nat. Med., 6 443-446), y de las correlaciones observadas entre la eficacia clínica en seres humanos y su alotipo de formas polimórficas de alta (V158) o baja (F158) afinidad de FcyRIIIa (Cartronet al.,2002, Blood, 99754-758, Weng y Levy, 2003, Journal of Clinical Oncology, 21, 3940-3947). En conjunto, estos datos sugieren que un anticuerpo optimizado para unirse a determinados FcyR podría desempeñar mejor las funciones efectoras y, por tanto, destruir las células diana con mayor eficacia en los pacientes. Así pues, un medio prometedor para aumentar la potencia antitumoral de los anticuerpos es mejorar su capacidad para mediar en funciones efectoras citotóxicas, tales como ADCC, ADCP y CDC. Además, los anticuerpos pueden mediar en el mecanismo antitumoral a través de la transducción de señales inhibidora del crecimiento o apoptótica que puede producirse cuando un anticuerpo se une a su diana en las células tumorales. Dicha transducción de señales puede potenciarse cuando se presentan anticuerpos a las células tumorales unidos a células inmunitarias a través de FcyR. Por lo tanto, el aumento de la afinidad de los anticuerpos por los FcyR puede dar lugar a un aumento de los efectos antiproliferativos.

Se ha logrado cierto éxito en la modificación de anticuerpos con unión selectivamente mejorada a FcyR para proporcionar una función efectora mejorada. La modificación de anticuerpos para optimizar la función efectora se ha logrado mediante modificaciones de aminoácidos.

Por lo tanto, la presente invención también contempla que la molécula de anticuerpo de la invención o un fragmento de unión al antígeno de la misma se modifique para que tenga una afinidad mejorada por el receptor FcyRIIIa o para que tenga una función efectora ADCC mejorada en comparación con el anticuerpo original. Una forma de conseguir la ADCC mejorada es introduciendo las sustituciones de aminoácidos 239D y 332e en el dominio CH2 de la parte Fc de la molécula de anticuerpo, por ejemplo, en el anticuerpo murino o humanizado 10B3. La actividad de destrucción celular de estos anticuerpos puede entonces incrementarse significativamente o incluso detectarse y generarse por primera vez. En una realización, las sustituciones de aminoácidos son S239D e I332E.

Una molécula de anticuerpo de la divulgación es capaz de unirse al PSMA humano. La expresión "antígeno de membrana específico de la próstata" o el término "PSMA" se utilizan indistintamente en el presente documento, e incluyen variantes, isotermas y especies homólogas del PSMA humano. El PSMA también se denomina glutamatocarboxipeptidasa II, NAALADasa I = N-acetil-L-aspartil-L-glutamatopeptidasa I, folatohidrolasa I (FOLH1). El PSMA humano tiene el número de registro UniProt Q04609 (versión 175 del 9 de diciembre de 2015). En consecuencia, los anticuerpos de la invención pueden, en ciertos casos, presentar reacciones cruzadas con PSMA de especies distintas de la humana u otras proteínas que estén estructuralmente relacionadas con el PSMA humano (por ejemplo, homólogos del PSMA humano). Tal como se ha mencionado anteriormente, una realización preferida de la presente invención es el anticuerpo 10B3 o una versión humanizada del mismo. Sin embargo, también otras moléculas de anticuerpos que se unen al mismo epítopo que 10B3 están dentro del alcance de la invención.

Para determinar el epítopo, se pueden utilizar procedimientos convencionales de cartografiado de epítopos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse fragmentos (péptidos) de PMSA (por ejemplo, péptidos sintéticos) que se unen al anticuerpo para determinar si un anticuerpo candidato o un fragmento de unión al antígeno del mismo se une al mismo epítopo. Para los epítopos lineales, se sintetizan péptidos solapantes de una longitud definida (por ejemplo, 8 o más aminoácidos). Los péptidos pueden estar desplazados en 1 aminoácido, de forma que se prepara una serie de péptidos que cubren cada fragmento de 8 aminoácidos de la secuencia de la proteína de PSMA. Se pueden preparar menos péptidos utilizando desplazamientos mayores, por ejemplo, de 2 o 3 aminoácidos. Además, pueden sintetizarse péptidos más largos (por ejemplo, de 9-, 10- u 11-meros). La unión de péptidos a anticuerpos o a fragmentos de unión al antígeno puede determinarse mediante metodologías convencionales, tales como la resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y los ensayos ELISA. Para examinar los epítopos conformacionales, pueden utilizarse fragmentos de PSMA de mayor tamaño. Se han descrito otros procedimientos que utilizan la espectrometría de masas para definir epítopos conformacionales (véase, por ejemplo, Baerga-Ortizet al.,Protein Science, 11:1300-1308, 2002 y las referencias allí citadas). Existen otros procedimientos para la determinación de epítopos en obras de referencia de laboratorio convencionales, tales como la unidad 6.8 ("Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes") y la unidad 9.8 ("Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries") de Current Protocols in Immunology, Coliganet al.,eds., John Wiley & Sons. Los epítopos pueden confirmarse introduciendo mutaciones puntuales o deleciones en un epítopo conocido, y ensayando después la unión con uno o más anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno para determinar qué mutaciones reducen la unión de los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno.

También dentro del alcance de la divulgación se encuentran moléculas de anticuerpo que compiten con una molécula de anticuerpo de la divulgación, tal como 10B3, por la unión a PSMA, por ejemplo, para inhibir competitivamente la unión de 10B3 a PSMA. Para determinar la inhibición competitiva, pueden emplearse diversos ensayos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos de competición cruzada para determinar si un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe competitivamente la unión al PSMA por otro anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Entre ellos se incluyen los procedimientos basados en células que emplean la citometría de flujo o el análisis de unión en fase sólida. También pueden utilizarse otros ensayos que evalúen la capacidad de los anticuerpos o de sus fragmentos de unión a antígenos para competir de forma cruzada por moléculas de PSMA que no se expresan en la superficie de las células, en fase sólida o en fase de solución. En el ejemplo 10 se presenta un ensayo mediante el cual puede comprobarse la competición cruzada.

Tal como se menciona en el presente documento, la divulgación incluye anticuerpos que presentan un desplazamiento de antígeno reducido en comparación con J591 cuando se unen a PSMA. Dicho desplazamiento reducido del antígeno puede evaluarse, por ejemplo, utilizando el procedimiento descrito fundamentalmente en el ejemplo 10. En una realización preferida, se detecta un desplazamiento reducido del antígeno en células Sp2/0 transfectadas con PMSA.

Una molécula de anticuerpo según la invención puede tener dos cadenas, una cadena más corta, que, en algunas realizaciones, puede ser una cadena ligera, y una cadena principal, que, en algunas realizaciones, también puede indicarse como la cadena pesada. La molécula de anticuerpo suele ser un dímero de estas dos cadenas.

Una molécula de anticuerpo de la invención es una molécula de anticuerpo biespecífico. La molécula de anticuerpo biespecífico puede comprender (i) una región variable que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha región variable comprende un primer sitio de unión capaz de unirse al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) humano y (ii) una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo que comprende un segundo sitio de unión. Se entiende que el sitio de unión para PSMA es preferentemente un sitio de unión de un anticuerpo de unión a PSMA de la invención descrito en el presente documento.

Una molécula de anticuerpo "biespecífica" o "bifuncional" es una molécula de anticuerpo que tiene dos sitios de unión al epítopo/antígeno diferentes y, en consecuencia, tiene especificidades de unión para dos epítopos diana diferentes. Estos dos epítopos pueden ser epítopos del mismo antígeno o de antígenos diferentes. Por el contrario, un "anticuerpo bivalente" puede tener sitios de unión de idéntica especificidad antigénica.

Un "anticuerpo biespecífico" puede ser una molécula de anticuerpo que se une a un antígeno o epítopo con uno de dos o más brazos de unión, definidos por un primer par de cadena pesada y ligera o de cadena principal y cadena más corta/pequeña, y que se une a un antígeno o epítopo diferente en un segundo brazo, definido por un segundo par de cadena pesada y ligera o de cadena principal y cadena más pequeña. Dicha forma de realización de un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión al antígeno distintos, tanto en especificidad como en secuencias de CDR. Normalmente, un anticuerpo biespecífico es monovalente para cada antígeno al que se une, es decir, se une con un solo brazo al antígeno o epítopo respectivo. Sin embargo, los anticuerpos biespecíficos también pueden dimerizarse o multimerizarse. Por ejemplo, en el formato IgGsc dimérico descrito en el presente documento, el anticuerpo puede tener dos sitios de unión para cada antígeno. Un anticuerpo biespecífico puede ser una molécula de anticuerpo híbrida, que puede tener una primera región de unión definida por una primera región variable de cadena ligera y una primera región variable de cadena pesada, y una segunda región de unión definida por una segunda región variable de cadena ligera y una segunda región variable de cadena pesada. La invención prevé que una de estas regiones de unión pueda estar definida por un par de cadenas pesada/ligera. En el contexto de la presente invención, la molécula de anticuerpo biespecífico puede tener un primer sitio de unión, definido por regiones variables de una cadena principal y de una cadena más pequeña, y un segundo sitio de unión diferente definido por una región variable de un fragmento scFv que está incluido en la cadena principal de la molécula de anticuerpo.

Los procedimientos para preparar una molécula de anticuerpo biespecífico son conocidos en la técnica, por ejemplo, la conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes o, por ejemplo, también la conjugación química de dos fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, de dos fragmentos Fab. Como alternativa, las moléculas de anticuerpos biespecíficos se preparan mediante la tecnología del cuadroma, es decir, por fusión de los hibridomas que producen los anticuerpos originarios. Debido al reordenamiento aleatorio de cadenas H y L, se produce una mezcla potencial de diez estructuras de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la especificidad de unión deseada.

La molécula de anticuerpo biespecífico de la invención puede actuar como un anticuerpo monoclonal (MAb) con respecto a cada diana. En algunas realizaciones, el anticuerpo es quimérico, humanizado o totalmente humano. Una molécula de anticuerpo biespecífico puede ser, por ejemplo, un Fv monocatenario en tándem biespecífico, un Fab<2>biespecífico o un diacuerpo biespecífico.

Basándose en los dominios incluidos en una molécula de anticuerpo de la divulgación, la molécula de anticuerpo biespecífico de la invención puede comprender un fragmento Fab, que generalmente puede incluir una región bisagra, un dominio CH2 y un fragmento Fv monocatenario. Dichas moléculas de anticuerpos biespecíficos se denominan moléculas de anticuerpos "Fabsc" y se han descrito por primera vez en la solicitud de patente internacional WO 2013/092001. Más concretamente, una molécula de anticuerpo en formato "Fabsc", tal como se utiliza en el presente documento, se suele referir a una molécula de anticuerpo biespecífico de la invención que tiene un fragmento Fab, que generalmente incluye una región bisagra, que está en el C-terminal del fragmento Fab unido al N-terminal de un dominio CH2, del cual el C-terminal está a su vez unido al N-terminal de un fragmento scFv. Dicho "Fabsc" no comprende o no comprende fundamentalmente un dominio CH3. En este contexto, "no comprende" o "no comprende fundamentalmente" significa que la molécula de anticuerpo no comprende un dominio CH3 de longitud completa. Preferentemente significa que la molécula de anticuerpo comprende 10 o menos, preferentemente 5 o menos, preferentemente 3 o incluso menos aminoácidos del dominio<c>H3. En la figura 1A se muestra un ejemplo ilustrativo de una molécula de anticuerpo en formato Fabsc y en la figura 12 se muestra otro ejemplo ilustrativo de una molécula de anticuerpo en formato Fabsc. En realizaciones ilustrativas (cf. también la figura 1<a>a este respecto), una molécula de anticuerpo Fabsc de la invención puede comprender un dominio CH2 que carece de capacidad para dimerizarse por los enlaces disulfuro que se forman por el residuo de cisteína en la posición de secuencia 226 de la región bisagra y/o el residuo de cisteína en la posición de secuencia 229 de uno de los dominios bisagra, según la numeración de Kabat [índice EU]. Así, en estas realizaciones, los residuos de cisteína en la posición de secuencia 226 y/o 229 se eliminan o sustituyen, por ejemplo, por un residuo de serina. Además, o como alternativa, una molécula de anticuerpo "Fabsc" de la invención también puede tener un dominio CH2 "con Fc atenuado" (que incluye la región bisagra). Esta "atenuación de Fc" se consigue suprimiendo y/o sustituyendo (mutando) al menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionados en el dominio CH2 que pueden mediar en la unión a un receptor de Fc. En realizaciones ilustrativas, dicho al menos un residuo de aminoácido de la región bisagra o del dominio CH2 que puede mediar en la unión a receptores de Fc y que falta o está mutado, se selecciona del grupo que consiste en las posiciones de secuencia 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 y 330 (numeración de posiciones de secuencia según el índice EU). En un ejemplo ilustrativo, dicha molécula de anticuerpo con Fc atenuado puede contener al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en una deleción del aminoácido 228, una deleción del aminoácido 229, una deleción del aminoácido 230, una deleción del aminoácido 231, una deleción del aminoácido 232, una deleción del aminoácido 233, una sustitución Glu233^Pro, una sustitución Leu234^Val, una deleción del aminoácido 234, una sustitución Leu235^Ala, una deleción del aminoácido 235, una deleción del aminoácido 236, una deleción del aminoácido 237, una deleción del aminoácido 238, una sustitución Asp265^Gly, una sustitución Asn297^Gln, una sustitución Ala327^Gln y una sustitución Ala330^-Ser (numeración de las posiciones de secuencia según el índice EU, véanse al respecto, por ejemplo, también las figuras 1O y 1P de la solicitud de patente internacional WO 2013/092001). En el caso de anticuerpos biespecíficos que activan linfocitos T, por ejemplo, contra células tumorales, puede ser deseable la atenuación de Fc para evitar la unión de los anticuerpos a células portadoras de receptores de Fc, que puede conducir a una activación inespecífica no deseada de linfocitos T.

De acuerdo con la publicación de Coloma y Morrison (Nat. Biotechnol., 15:159-163, 1997), una molécula de anticuerpo biespecífico de la invención también puede tener un dominio CH3, generalmente dispuesto C-terminalmente del dominio CH2. Dicha molécula también se denomina en el presente documento molécula de anticuerpo en formato "IgGsc" y significa una molécula de anticuerpo biespecífico de la invención que tiene un fragmento Fab, que generalmente incluye una región bisagra, que está en el C-terminal del fragmento Fab generalmente unido al N-terminal de un dominio CH2, del cual el C-terminal está a su vez generalmente unido al N-terminal de un dominio CH3, del cual el C-terminal está a su vez generalmente unido al N-terminal de un fragmento scFv. Un ejemplo ilustrativo de una molécula de anticuerpo en formato IgGsc se muestra en la figura 1B, y las secuencias de cadena pesada y ligera para dicha molécula se muestran en las figuras 11 y 13, respectivamente.

Los formatos de anticuerpo Fabsc e IgGsc tienen en común que la parte selectiva N-terminal consiste en regiones "fisiológicas" Fab- o Fab<2>, respectivamente, evitando así el uso de restos monocatenarios en esta parte de la molécula. Si estos formatos se van a utilizar para la activación de linfocitos T restringida a células diana, se puede emplear la atenuación de la unión al receptor de Fc (FcR) (si se desea o es necesario) para evitar la activación mediada por FcR. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la introducción de mutaciones definidas y bien conocidas en el dominio CH2 de la molécula, tal como se describió anteriormente y se describe también en la solicitud de patente internacional WO 2013/092001 y en Armouret al.,Eur. J. Immunol., 1999; 29:2613. En consecuencia, también una molécula de anticuerpo IgGsc de la invención puede tener un dominio CH2 (incluida la región bisagra) en el que falta o está mutado al menos un residuo de aminoácido de la región bisagra o del dominio CH2 que es capaz de mediar en la unión a receptores de Fc. Tal como se ha explicado anteriormente, este residuo en la región CH2 y bisagra, respectivamente, puede seleccionarse del grupo que consiste en las posiciones de secuencia 228, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 y 330 (numeración de las posiciones de secuencia según el índice EU). Sin embargo, debido a la presencia del dominio CH3 en la molécula IgGsc, dos moléculas individuales se homodimerizarán (espontáneamente) a través del dominio CH3 para formar una molécula tetravalente (véase de nuevo la figura 1B a este respecto). Por lo tanto, no es necesario eliminar o mutar los residuos de cisteína en la posición de secuencia 226 y/o en la posición de secuencia 229 de la región bisagra. Así, dicha molécula tetramérica de anticuerpo IgGsc de la invención puede tener un residuo de cisteína en la posición de secuencia 226 y/o en la posición de secuencia 229 de uno de los respectivos dominios bisagra, de acuerdo con la numeración Kabat [índice EU].

Una molécula de anticuerpo de la invención comprende un segundo sitio de unión que corresponde al sitio de unión al antígeno del anticuerpo anti-CD3 UCHT1. Las secuencias VH y VL de un anticuerpo UCHT1 humanizado se representan en la figura 11 y, por ejemplo, también se describen en la solicitud de patente internacional WO 2013/092001.

Por consiguiente, la molécula de anticuerpo biespecífico de la invención puede ser una molécula de anticuerpo biespecífico, tal como una molécula Fabsc- e IgGsc que comprende un fragmento Fab y un fragmento scFv como se describe en el presente documento. En esta molécula, el primer sitio de unión puede unirse al PSMA y puede estar comprendido en un fragmento Fab como se describe en el presente documento. y el segundo sitio de unión (que puede unirse a un receptor inmunitario) puede estar comprendido en un fragmento scFv. Como alternativa, el primer sitio de unión que se une al PMSA está comprendido en un fragmento Fv monocatenario. y el segundo sitio de unión (que puede unirse a un receptor inmunitario) está comprendido en un fragmento Fab.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo biespecífico de la invención no activa por sí misma la célula inmunitaria, por ejemplo, el linfocito T, tras la unión, tal como la unión a CD3. En cambio, sólo cuando ambos sitios de unión, por ejemplo, el sitio de unión específica al PMSA y el sitio de unión específica al CD3, están unidos al receptor en el linfocito T y al PMSA en la célula diana, el primero puede entrecruzar el receptor activador, provocando que las células efectoras destruyan a la célula diana específica. Pueden establecerse ensayos funcionales convencionales para evaluar la capacidad de destrucción de la célula diana por los linfocitos en presencia y ausencia de una molécula de anticuerpo biespecífico de la invención para evaluar y/o cribar la capacidad de la molécula de anticuerpo para activar el receptor al que se une.

Sin querer ceñirse a ninguna teoría concreta, por lo general se sostiene que los anticuerpos biespecíficos de unión a CD3 de la invención no activan los linfocitos T en ausencia de células diana, ya que un estímulo de CD3 monovalente no es suficiente para iniciar una activación eficaz de los linfocitos T Sin embargo, en algunos casos, puede haber alguna desviación de este comportamiento supuesto. Cuando se utilizó UCHT1 como anticuerpo CD3 dentro de una construcción de Fabsc biespecífico, se observó cierta activación de linfocitos T en ausencia de células diana que expresan PSMA. Estos resultados fueron considerablemente más pronunciados cuando los experimentos se realizaron en presencia de células espectadoras estimulantes, tales como las células de linfoma SKW6.4. En contraste con ello, los inventores sorprendentemente también han descubierto que los anticuerpos que contienen OKT3 y (sorprendentemente) también el anticuerpo IgGsc que comprende UCHT1 inducen una activación inespecífica de linfocitos T marcadamente atenuada. La activación inespecífica inesperadamente baja del anticuerpo IgGsc que comprende UCHT1 se explica, al menos en parte, por las mediciones de avidez utilizando células Jurkat que expresan CD3. Estos experimentos demuestran que UCHT1 pierde avidez y OKT3 gana avidez si se expresa en el formato IgGsc (en lugar de Fabsc) (cf. figura 8). Cuando utilizaron un ensayo citotóxico a largo plazo (Xelligence) contra células 22RV1 que expresan PSMA, los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente la siguiente clasificación para la actividad citolítica: IgGsc(UCHT1) ~ Fabsc(UCHT1) > Fabsc(OKT3) > IgGsc(OKT3). Así, dentro del formato IgGsc, UCHT1 puede ser el anticuerpo CD3 preferido (activación inespecífica y actividad citolítica favorables), mientras que, dentro del formato Fabsc, OKT3 puede ser preferido debido a la activación inespecífica indeseablemente alta por el UCHT1 que contiene Fabsc (cf. figura 9).

Independientemente del anticuerpo CD3 concreto utilizado, la agrupación de anticuerpos biespecíficos en la superficie de un linfocito T, inducida por la interacción entre los fragmentos monocatenarios selectivos, también puede conducir a la activación inespecífica de linfocitos T en ausencia de una célula diana. Para evitar este fenómeno, puede ser conveniente utilizar un resto Fab o Fab<2>, tal como el contenido en el formato Fabsc o IgGsc, respectivamente, en lugar de un anticuerpo monocatenario como parte selectiva dentro de una construcción biespecífica. La multimerización y agregación de anticuerpos biespecíficos expresados en tales formatos se reduce notablemente en comparación con la observada con anticuerpos biespecíficos monocatenarios. Las figuras 4A y 4B muestran que la agregación de un formato biespecífico monocatenario con especificidad FLT3xCD3 es menos pronunciada que la de un anticuerpo por lo demás idéntico en el formato biespecífico monocatenario ("bispecific single chain", bssc) o BiTE, según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las figuras 4C-F demuestran que, igualmente, la tendencia de los cuatro anticuerpos PSMAxCD3 en el formato Fabsc, así como en el formato IgGsc, a formar multímeros o agregados se reduce notablemente. En particular, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la formación de multímeros es incluso considerablemente menos pronunciada en las dos construcciones que contienen el anticuerpo UCHT1, en comparación con las construcciones que comprenden el anticuerpo OKT3. En cualquier caso, se cree que la agregación, si se produce, se debe a que la parte efectora de CD3 se expresa como una cadena monocatenaria. Se cree y se ha descubierto en el presente documento que los restos Fab- y Fab<2>fisiológicas en la parte selectiva N-terminal no se agregan y, por lo tanto, se cree que la agrupación monocatenaria de la parte selectiva N-terminal, que posiblemente de como resultado el agotamiento de linfocitos Tin vivo,no puede producirse en una molécula de anticuerpo respectiva de la invención.

Además, los inventores prevén que la semivida sérica de una molécula de anticuerpo está determinada en gran medida por la interacción de los dominios CH3 con el receptor FcRn. Dado que la mayoría de los anticuerpos biespecíficos carecen de este dominio, su semivida sérica puede ser bastante corta (varias horas en el mejor de los casos). En cambio, las moléculas de IgG enteras suelen tener una semivida sérica de varios días. Aunque los formatos biespecíficos basados en IgG han estado disponibles durante varios años, rara vez se han utilizado para la construcción de anticuerpos estimulantes de CD3 porque se creía que un estímulo de CD3 bivalente podría conducir a la activación inespecífica de linfocitos T Sin embargo, los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que lo contrario es cierto para dos formatos diferentes que contienen el anticuerpo UCHT1: la activación inespecífica de linfocitos T por el formato Fabsc es notablemente mayor que por el anticuerpo en el formato IgGsc. Sin querer ceñirse a ninguna teoría concreta, se cree que esto se debe a que la avidez del resto CD3 en este último formato está alterada (véase de nuevo la figura 8). Esto significa que, en el caso de una molécula de anticuerpo que comprende la región variable de UCHT1, el formato IgGsc- proporciona sorprendentemente no sólo una semivida sérica notablemente mejorada, sino también una activación inespecífica de linfocitos T reducida. Por lo tanto, si se desea una semivida sérica prolongada, por ejemplo, para evitar la infusión continua a largo plazo, puede preferirse un anticuerpo biespecífico 10B3xUCHT1 en formato IgGsc, en el que el resto Fab comprende el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo derivado de 10B3 y en el que el resto scFv comprende el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo derivado de UCHT1. Si no se desea una semivida sérica prolongada, puede preferirse el anticuerpo biespecífico 10B3xOKT3 en formato Fabsc, en el que el resto Fab comprende el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo derivado de 10B3 y en el que el resto scFv comprende el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo derivado de OKT3.

Por lo tanto, en otras palabras, la presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente y homodimérica (un anticuerpo biespecífico en el formato IgGsc descrito en el presente documento) de acuerdo con las reivindicaciones anexas, que comprende en cada monómero: (i) un fragmento Fab N-terminal que comprende una región variable que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en la que dicha región variable comprende un primer sitio de unión capaz de unirse a un antígeno; (ii) un fragmento scFv C-terminal, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de UCHT1 humanizada, y en la que (i) y (ii) están conectados por un dominio CH2 y CH3

En algunas realizaciones se prefiere la molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de la invención, en la que falta o está mutado al menos un residuo de aminoácido del dominio CH2 que es capaz de mediar en la unión a receptores de Fc (véase también el presente documento en otro punto).

En algunas realizaciones, se prefiere la molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de la invención, en la que el fragmento Fab no es un fragmento Fab de un anticuerpo 10B3 o J591 no humanizado, quimerizado o humanizado, preferentemente en la que el primer sitio de unión no es capaz de unirse a PSMA. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas, el primer sitio de unión proporcionado por el fragmento Fab N-terminal no es específico para PSMA, sino para un antígeno que no sea PSMA, preferentemente un antígeno asociado a un tumor excepto PSMa . La expresión "antígeno asociado a un tumor" se refiere a proteínas que, en condiciones normales, es decir, en un sujeto sano, se expresan específicamente en un número limitado de órganos y/o tejidos o en fases de desarrollo específicas, por ejemplo, el antígeno asociado a un tumor puede expresarse en condiciones normales específicamente en el tejido estomacal, preferentemente en la mucosa gástrica, en órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y expresarse o expresarse aberrantemente en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa preferentemente no más de 3, más preferentemente no más de 2 o 1. Los antígenos asociados a un tumor en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferentemente antígenos de diferenciación específicos del tipo celular, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un determinado tipo celular en una determinada fase de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que, en condiciones normales, se expresan específicamente en los testículos y a veces en la placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a un tumor preferentemente no se expresa o sólo se expresa raramente en los tejidos normales o está mutado en las células tumorales. Preferentemente, el antígeno asociado a un tumor o la expresión aberrante del antígeno asociado a un tumor identifica células cancerosas. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a un tumor que es expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa, es preferentemente una proteína propia de dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno asociado a un tumor en el contexto de la presente invención se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es crucial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunitario no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son accesibles o lo son muy poco por el sistema inmunitario. Preferentemente, un antígeno asociado a un tumor es presentado en el contexto de moléculas del MHC por una célula cancerosa en la que se expresa.

Algunos ejemplos de TAA que pueden ser útiles en la presente invención y que no son PSMA (según realizaciones preferidas del presente aspecto) son p53, ART-4, Ba GE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDINA-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferentemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUCl", MUM-1, -2, -3, NA88-A, NFl, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 BCR-abL menor, Pml/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVINA, TEL/AML1, TPl/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT.

De acuerdo con el presente aspecto de la invención, una UCHT1 humanizada es preferentemente un fragmento scFv que comprende la secuencia de región variable de cadena ligera y la secuencia de región variable de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 11 empezando por la secuencia de aminoácidos DIQMT... y terminando por...VTVSS (como se indica en la figura 11). Preferentemente, la secuencia de la región variable de cadena ligera y la secuencia de la región variable de cadena pesada en el fragmento scFv están conectadas mediante un conector, tal como se muestra en la figura 11 ("región conectora").

En este contexto, se señala que se incluye en el alcance de la invención el hecho de que una molécula de anticuerpo pueda comprender uno o más residuos de aminoácidos mutados. Los términos "mutado", "mutante" y "mutación" en referencia a un ácido nucleico o un polipéptido se refieren al intercambio, deleción o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en comparación con el ácido nucleico o polipéptido que aparece "en la naturaleza", es decir, con una secuencia de referencia que pueda considerarse que defina el tipo salvaje. Por ejemplo, los dominios variables de la molécula de anticuerpo 10B3 obtenidos por inmunización y descritos en el presente documento pueden considerarse una secuencia de tipo salvaje.

Se entiende a este respecto que el término "posición", cuando se utiliza de acuerdo con la presente invención, significa la posición de un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en el presente documento. Esta posición puede indicarse en relación con una secuencia nativa similar, por ejemplo, una secuencia de un dominio o cadena de IgG natural. El término "correspondiente", tal como se utiliza en el presente documento, también incluye que una posición no está necesariamente, o no sólo, determinada por el número de nucleótidos/aminoácidos precedentes. Así, la posición de un aminoácido determinado de acuerdo con la presente invención que puede ser sustituido puede variar debido a la deleción o la adición de aminoácidos en otras partes de la cadena del anticuerpo.

Por lo tanto, con una "posición correspondiente", de acuerdo con la presente invención, debe entenderse que los aminoácidos pueden diferir en el número indicado, pero aún puede haber aminoácidos vecinos similares. Dichos aminoácidos que pueden intercambiarse, delecionarse o añadirse también se engloban en el término "posición correspondiente". Para determinar si un residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos determinada corresponde a una determinada posición en la secuencia de aminoácidos de un dominio o cadena de inmunoglobulina natural, el experto puede utilizar medios y procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos, ya sea manualmente o utilizando programas informáticos, tales como BLAST2.0, que significa Basic Local Alignment Search Tool, o ClustalW o cualquier otro programa adecuado para generar alineamientos de secuencias.

En algunas realizaciones una sustitución (o reemplazo) es una sustitución conservadora. Las sustituciones conservadoras son generalmente las siguientes sustituciones, enumeradas según el aminoácido a mutar, cada una seguida de una o más sustituciones que pueden considerarse conservadoras: Ala ^ Gly, Ser, Val; Arg ^ Lys; Asn ^ Gln, His; Asp ^ Glu; Cys ^ Ser; Gln ^ Asn; Glu ^ Asp; Gly ^ Ala; His ^ Arg, Asn, Gln; Ile ^ Leu, Val; Leu -> Ile, Val; Lys -> Arg, Gln, Glu; Met -> Leu, Tyr, Ile; Phe -> Met, Leu, Tyr; Ser -> Thr; Thr -> Ser; Trp -> Tyr; Tyr -> Trp, Phe; Val -> Ile, Leu. También se permiten otras sustituciones, que pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con otras sustituciones conservadoras o no conservadoras conocidas. Como orientación adicional, cada uno de los ocho grupos siguientes contiene aminoácidos que pueden considerarse sustituciones conservadoras entre sí:

Alanina (Ala), Glicina (Gly);

Ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu);

Asparagina (Asn), Glutamina (Gln);

Arginina (Arg), Lisina (Lys);

Isoleucina (Ile), Leucina (Leu), Metionina (Met), Valina (Val);

Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr), Triptófano (Trp);

Serina (Ser), Treonina (Thr); y

Cisteína (Cys), Metionina (Met)

Si tales sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, pueden introducirse cambios más sustanciales, tales como los siguientes, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y los productos pueden cribarse en busca de una característica deseada. Algunos ejemplos de estos cambios más sustanciales son: Ala ^ Leu, Ile; Arg ^ Gln; Asn ^ Asp, Lys, Arg, His; Asp ^ Asn; Cys ^ Ala; Gln ^ Glu; Glu ^ Gln; His ^ Lys; Ile ^ Met, Ala, Phe; Leu ^ Ala, Met, Norleucina; Lys ^ Asn; Met ^ Phe; Phe ^ Val, Ile, Ala; Trp -> Phe; Tyr ^ Thr, Ser; Val ^ Met, Phe, Ala.

En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo según la invención incluye uno o más residuos de aminoácidos, incluidos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho residuos de aminoácidos, que están mutados para impedir la dimerización por medio de residuos de cisteína o para modular la función de Fc (véase más arriba). En algunas de estas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos del dominio CH2 y/o de la región bisagra que pueden mediar en la unión a receptores de Fc están mutados. Si están presentes, uno o más residuos de aminoácidos capaces de mediar en la unión a receptores de Fc pueden ser residuos de aminoácidos capaces de activar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC). En algunas realizaciones, un residuo de aminoácido respectivo capaz de mediar en la unión a receptores de Fc se sustituye por otro aminoácido, generalmente al comparar la secuencia con la secuencia de un dominio natural correspondiente en una inmunoglobulina, tal como una IgG. En algunas realizaciones, dicho residuo de aminoácido capaz de mediar en la unión a receptores de Fc se deleciona, generalmente en relación con la secuencia de un dominio natural correspondiente en una inmunoglobulina, tal como una IgG

En algunas realizaciones, dichos uno o más residuos de aminoácido mutados, por ejemplo, sustituidos o delecionados, son un aminoácido situado en una de las posiciones 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 297, 327 y 330. De nuevo, la numeración de los aminoácidos utilizada corresponde a las posiciones de secuencia según la numeración de Kabat [índice EU]. Una deleción correspondiente de un aminoácido puede ser, por ejemplo, una deleción del aminoácido 228, generalmente una prolina en IgG, una deleción del aminoácido 229, generalmente una cisteína en IgG, una deleción del aminoácido 230, generalmente una prolina en IgG, una deleción del aminoácido 231 generalmente una alanina en IgG, una deleción del aminoácido 232, generalmente una prolina en IgG, una deleción del aminoácido 233, generalmente un ácido glutámico en IgG, una deleción del aminoácido 234, generalmente una leucina en IgG, una deleción del aminoácido 235, generalmente una leucina en IgG, una deleción del aminoácido 236, generalmente una glicina en IgG, una deleción del aminoácido 237, generalmente una glicina en IgG, una deleción del aminoácido 238, generalmente una prolina en IgG y una deleción del aminoácido 265, generalmente un ácido aspártico en IgG. Una sustitución correspondiente de un aminoácido puede ser, por ejemplo, una sustitución del aminoácido 226, generalmente una cisteína en IgG, una sustitución del aminoácido 228, generalmente una prolina en IgG, una sustitución del aminoácido 229, generalmente una cisteína en IgG, una sustitución del aminoácido 230, generalmente una prolina en IgG, una sustitución del aminoácido 231, generalmente una alanina en IgG, una sustitución del aminoácido 232, generalmente una prolina en IgG, una sustitución del aminoácido 233, generalmente un ácido glutámico en IgG, una sustitución del aminoácido 234, generalmente una leucina en IgG, una sustitución del aminoácido 235, generalmente una leucina en IgG, una sustitución del aminoácido 265, generalmente un ácido aspártico en IgG, una sustitución del aminoácido 297, generalmente una asparagina en IgG, una sustitución del aminoácido 327, generalmente una alanina en IgG y una sustitución del aminoácido 330, generalmente una alanina en IgG. Una sustitución respectiva puede ser una de las siguientes: sustitución Cys226^Ser, sustitución Cys229^-Ser, sustitución Glu233^Pro, sustitución Leu234^Val, sustitución Leu235^Ala, sustitución Asp265^-Gly, sustitución Asn297^-Gln, sustitución Ala327^Gln, sustitución Ala327^-Gly y sustitución Ala330^Ser. Como puede deducirse de lo anterior, en algunas realizaciones, uno o dos de los residuos de cisteína en las posiciones 226 y 229 en la región bisagra están siendo sustituidos por otro aminoácido, por ejemplo, sustituidos por un residuo de serina. De este modo se puede evitar la formación de un enlace disulfuro con otra cadena principal. Además, y como también se explica más adelante, la deleción y/o sustitución (mutación) de residuos de aminoácidos seleccionados en el dominio c H2 que es capaz de mediar en la unión a los receptores de Fc puede hacer que una molécula de anticuerpo de la invención tenga una actividad menor o no tenga actividad por lo que se refiere a la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y la fijación del complemento.

Otro tipo de variante de aminoácidos de un anticuerpo altera el patrón de glucosilación original (si existe) de la molécula de anticuerpo. Por alterar se entiende delecionar uno o más restos carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de los anticuerpos suele ser N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente la serina o la treonina, aunque también pueden utilizarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glucosilación N-enlazados). La alteración también puede realizarse mediante la adición de uno o más residuos de serina o treonina o la sustitución por estos residuos en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación O-enlazados).

En el contexto de la presente invención, en algunas realizaciones, la porción de la cadena principal de la molécula de anticuerpo de la invención, que representa la región Fc de una inmunoglobulina, suele ser inerte, o al menos fundamentalmente de baja influencia, con respecto a la unión a receptores de Fc. Tal como se ha comentado, esto se consigue delecionando y/o sustituyendo (mutando) al menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionados en el dominio CH2 que son capaces de mediar en la unión a un receptor de Fc. Dichas moléculas también se denominan en el presente documento moléculas de anticuerpos "con atenuación de Fc" o moléculas de anticuerpos "Fcko". La porción de una cadena de anticuerpo según la invención que puede considerarse que representa una porción de un fragmento Fc, es decir, el dominio CH2 y, cuando esté presente, el dominio CH3, podría así definir un "andamiaje" sin proporcionar una función biológica concreta, tal como una función efectora, por ejemplo. Sin embargo, se ha descubierto en la presente invención que este andamiaje puede proporcionar ventajas significativas por lo que respecta a la purificación, la eficiencia de producción y/o la estabilidad de las moléculas de anticuerpo de la invención en comparación con las moléculas de anticuerpo conocidas.

En algunas realizaciones, el reconocimiento y, en consecuencia, la unión de esta porción correspondiente a Fc a un receptor de Fc determinado es de aproximadamente 2 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 12 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces o inferior que la de una la región Fc de una inmunoglobulina natural. En algunas realizaciones, esta porción correspondiente a Fc carece por completo de capacidad de unión a receptores de Fc. La unión de un anticuerpo a los receptores de Fc, incluida la determinación de una constante de disociación, puede ser determinada con facilidad por los expertos utilizando técnicas convencionales, tales como la resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando una medición Biacore™. También puede utilizarse cualquier otro procedimiento de medición de la unión biomolecular, que puede basarse, por ejemplo, en medios espectroscópicos, fotoquímicos, fotométricos o radiológicos. Algunos ejemplos de los procedimientos de detección correspondientes son la espectroscopia de correlación de fluorescencia, la reticulación fotoquímica y el uso de marcadores fotoactivos o radiactivos, respectivamente. Algunos de estos procedimientos pueden incluir técnicas de separación adicionales, tales como la electroforesis o la HPLC.

Cuando sea necesario, puede llevarse a cabo una sustitución o deleción de residuos de aminoácidos, tal como se ha explicado anteriormente, a tal efecto. Las mutaciones adecuadas pueden extraerse de Armouret al.(Eur. J. Immunol.

[1999], 29, 2613-2624), por ejemplo. Otras posiciones adecuadas para las mutaciones de una secuencia de una cadena de anticuerpo pueden extraerse de los datos de la estructura cristalina publicados sobre el complejo entre FcyRIII y el fragmento Fc de IgG1 humana (Sondermannet al.,Nature [2000], 406, 267-273). Además de medir la afinidad de unión como se ha descrito anteriormente para evaluar el nivel de "atenuación de Fc" o la pérdida de afinidad de unión, también es posible evaluar funcionalmente la capacidad o la falta de capacidad de mediar en la unión a un receptor de Fc. En el caso de moléculas de anticuerpos que se unen a CD3 como una diana, es posible, por ejemplo, evaluar la unión a través de la mitogenicidad de dichas moléculas de anticuerpos que se unen a CD3 en las células. La mitogenicidad está mediada por la unión de los anticuerpos CD3 a los receptores de Fc de células accesorias, tales como monocitos. Si una molécula de anticuerpo de la invención que tiene un sitio de unión para CD3 no muestra ningún efecto mitogénico, mientras que el anticuerpo monoclonal anti-CD3 originario que tiene una parte Fc funcional induce una fuerte mitosis en los linfocitos T, es evidente que, debido a la falta de mitosis, la molécula de anticuerpo de la invención carece de la capacidad de unión de Fc y, por lo tanto, puede considerarse como una molécula "con Fc inactivado". Algunos ejemplos ilustrativos de un procedimiento de evaluación de la mitogenicidad mediada por anti-CD3 han sido descritos por Davis, Vida y Lipsky (J. Immunol. (1986), 137, 3758) y por Ceuppens, J.L. y van Vaeck, F. (véase J. Immunol. (1987), 139, 4067, o Cell. Immunol. (1989) 118, 136). Otros ejemplos ilustrativos adecuados de un ensayo para evaluar la mitogenicidad de un anticuerpo han sido descritos por Rosenthal-Allieriet al.(Rosenthal-Allieri M.A., Ticcioni M., Deckert M., Breittmeyer J.P, Rochet N., Rouleaux M. y Senik A., Bernerd A., Cell Immunol., 1995, 163(1):88-95) y Grosse-Hovestet al.(Grosse-Hovest L., Hartlapp I., Marwan W., Brem G., Rammensee H.-G., y Jung G., Eur. J. Immunol. [2003], mayo, 33(5):1334-1340). Además, la falta de unión Fc puede evaluarse mediante la capacidad de una molécula de anticuerpo de la invención para mediar en una o más de las funciones efectoras bien conocidas de la parte Fc.

Tal como se ha indicado anteriormente, pueden llevarse a cabo sustituciones o deleciones de residuos de cisteína para introducir o eliminar uno o más enlaces disulfuro, incluidas la introducción o eliminación de un enlace disulfuro potencial o previamente existente. De este modo, el enlace entre una cadena principal y una cadena de menor peso/longitud más corta de una molécula de anticuerpo según la invención se puede controlar, lo cual incluye establecer, fortalecer o abolir. Mediante la introducción o la eliminación de uno o más residuos de cisteína, se puede introducir o eliminar un puente disulfuro. Como ejemplo ilustrativo, una molécula de anticuerpo tetramérica según la invención tiene generalmente uno o más enlaces disulfuro que unen dos moléculas de anticuerpo diméricas. Uno de estos enlaces disulfuro está generalmente definido por una cisteína en la cadena principal de una primera molécula de anticuerpo dimérica y una cisteína en la región bisagra de una segunda molécula de anticuerpo dimérica. A este respecto, en algunas realizaciones, un anticuerpo según la invención puede incluir una sustitución aminoacídica de un residuo nativo de cisteína en las posiciones 226 y/o 229, en relación con la secuencia de una inmunoglobulina IgG humana según la numeración de Kabat [índice EU], por otro residuo aminoacídico.

También pueden llevarse a cabo sustituciones o deleciones de residuos de aminoácidos, tales como arginina, asparagina, serina, treonina o tirosina, para modificar el patrón de glucosilación de un anticuerpo. Como ejemplo ilustrativo, una molécula de IgG tiene un único carbohidrato biantenario N-enlazado en Asn297 del dominio CH2. En el caso de las IgG procedentes de suero o producidasex vivoen hibridomas o células manipuladas, las IgG son heterogéneas con respecto al carbohidrato enlazado en Asn297. En el caso de la IgG humana, el oligosacárido central suele estar formado por GlcNAc<2>Man<3>GlcNAc, con un número diferente de residuos externos.

Tal como se ha indicado, además de la unión de antígenos/epítopos, se sabe que una inmunoglobulina tiene otras "funciones efectoras", actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de una inmunoglobulina, y varían en función del isotipo de la inmunoglobulina. Algunos ejemplos de funciones efectoras de los anticuerpos son la unión a Clq y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la unión a receptores de Fc; la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); la fagocitosis; la regulación a la baja de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptores de linfocitos B); y la activación de linfocitos B. El ejercicio de las funciones efectoras de un anticuerpo suele implicar el reclutamiento de células efectoras. Varias funciones efectoras de las inmunoglobulinas están mediadas por receptores de Fc (FcR), que se unen a la región Fc de un anticuerpo. Los FcR se definen por su especificidad para los isotipos de inmunoglobulina; los receptores de Fc para anticuerpos IgG se denominan FcyR, para IgE se denominan F<ce>R, para IgA se denominan FcaR y así sucesivamente. Cualquiera de estas funciones efectoras (o la pérdida de tales funciones efectoras), tales como CDC o ADCC, puede utilizarse para evaluar si una molécula de anticuerpo de la invención carece de la capacidad de unión del Fc.

En este contexto, cabe señalar que la expresión "receptor de Fc" o el término "FcR" define un receptor, por lo general una proteína capaz de unirse a la región Fc de un anticuerpo. Los receptores de Fc se encuentran en la superficie de determinadas células del sistema inmunitario de un organismo, por ejemplo, los linfocitos citolíticos, los macrófagos, los neutrófilos y los mastocitos.In vivo,los receptores de Fc se unen a inmunoglobulinas inmovilizadas en células infectadas o presentes en patógenos invasores. Su actividad estimula a las células fagocíticas o citotóxicas para que destruyan los microbios o las células infectadas mediante la fagocitosis mediada por anticuerpos o la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Algunos virus, tales como los flavivirus, utilizan receptores de Fc para ayudarles a infectar células, mediante un mecanismo conocido como potenciación de la infección dependiente de anticuerpos. Los FcR se han analizado en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991); Capelet al.,Immunomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haaset al.,J. Lab. Clin. Med., 126: 330-341 (1995).

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase adecuada) que están unidos a su antígeno correspondiente. Para evaluar la activación del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoroet al.,J. Immunol. Methods, 202: 163 (1997).

La expresión "sistema del complemento" se utiliza en la técnica para referirse a una serie de proteínas pequeñas (llamadas factores del complemento) que se encuentran en la sangre, por lo general circulando como precursores inactivos (proproteínas). La expresión se refiere a la capacidad de este sistema inalterable y no adaptable para "complementar" la capacidad de los anticuerpos y las células fagocíticas para eliminar patógenos, tales como las bacterias, así como complejos antígeno-anticuerpo, de un organismo. Un ejemplo de factores del complemento es el complejo C1, que incluye C1q y dos serina protasas, C1r y C1s. El complejo C1 es un componente de la vía de la CDC. La C1q es una molécula hexavalente con un peso molecular de aproximadamente 460000 y una estructura parecida a un ramo de tulipanes, en la que seis "tallos" colagenosos están conectados a seis regiones de cabeza globulares. Para activar la cascada del complemento, C1q debe unirse al menos a dos moléculas de IgG1, IgG2 o IgG3.

La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que las moléculas de inmunoglobulina, unidas a los receptores de Fc (FcR), presentes en ciertas células citotóxicas (tales como los linfocitos citolíticos ["natural killers", (NK)], neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora del antígeno y posteriormente destruir la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son necesarios para matar a la célula diana mediante este mecanismo. Las células primarias para la mediación en la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCCin vitro,tal como el descrito en patente de EE. UU. n.° 5500362 o 5821 337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen, entre otras, las células mononucleares de sangre periférica ("peripheral blood mononuclear cells", PBMC) y los linfocitos citolíticos (NK). En algunas realizaciones, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarsein vivo,por ejemplo, en un modelo animal como el descrito en Clyneset al.,PNAS USA, 95: 652-656 (1998).

Una molécula de anticuerpo de la invención puede producirse utilizando cualquier sistema de expresión y cualquier tecnología de cultivo de células recombinantes conocidos y bien establecidos, por ejemplo, mediante expresión en hospedadores bacterianos (sistemas procariotas), o sistemas eucariotas, tales como levaduras, hongos, células de insecto o células de mamífero. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo de la invención, cuando se utiliza en el formato "IgGsc", puede (por supuesto) producirse como se describe en Coloma y Morrison (Nat. Biotechnol., 15:159-163, 1997) o como se describe en la sección de ejemplos de la presente solicitud. Asimismo, una molécula de anticuerpo de la invención empleada en el formato "Fabsc" puede producirse como se describe en la solicitud de patente internacional WO 2013/092001 o como se describe aquí en la sección de ejemplos. Una molécula de anticuerpo de la presente invención también puede producirse en organismos transgénicos, tales como una cabra, una planta o un ratón transgénico XENOMOUSE, una raza de ratón genéticamente modificada que contenga grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y sea deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Un anticuerpo también puede producirse mediante síntesis química.

Para la producción de una molécula de anticuerpo recombinante de la invención, normalmente se aísla un polinucleótido que codifica el anticuerpo y se inserta en un vector replicable, tal como un plásmido, para su posterior clonación (amplificación) o expresión. Un ejemplo ilustrativo de un sistema de expresión adecuado es un sistema de glutamato sintetasa (como el comercializado por Lonza Biologics), siendo la célula hospedante, por ejemplo, CHO o NS0. El polinucleótido que codifica el anticuerpo se aísla y secuencia con facilidad mediante procedimientos convencionales. Los vectores que pueden utilizarse incluyen plásmidos, virus, fagos, transposones, minicromosomas, de los cuales los plásmidos son una realización típica. Por lo general, dichos vectores incluyen además una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias de terminación de la transcripción unidas operativamente al polinucleótido de cadena ligera y/o pesada para facilitar la expresión. Los polinucleótidos que codifican las cadenas ligera y pesada pueden insertarse en vectores separados y transfectarse en la misma célula hospedadora o, si se desea, tanto la cadena pesada como la cadena ligera pueden insertarse en el mismo vector para su transfección en la célula hospedadora. Ambas cadenas pueden disponerse, por ejemplo, bajo el control de un operón dicistrónico y expresarse para dar lugar a la molécula de anticuerpo funcional y correctamente plegada descrita en Skerra, A. (1994), Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment inEscherichia coli,Gene, 151, 131-135, o Skerra, A. (1994), A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments, Gene, 141, 79-8. Así, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso de construcción de un vector que codifica las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, incluyendo dicho procedimiento insertar en un vector un polinucleótido que codifica una cadena ligera y/o una cadena pesada de una molécula de anticuerpo de la invención.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, la molécula de anticuerpo puede producirse de modo intracelular, en el espacio periplásmico o secretarse directamente hacia el medio (cf. también Skerra, 1994,supra).Si el anticuerpo se produce de modo intracelular, como primera etapa se eliminan los restos en partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carteret al.,Bio/Technology, 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico deE. coli.El anticuerpo también puede producirse en cualquier entorno oxidante. Dicho entorno oxidante puede estar proporcionado por el periplasma de bacterias gramnegativas, tales comoE. coli, en el medio extracelular de bacterias grampositivas o en el lumen del retículo endoplásmico de células eucariotas (incluidas células animales, tales como células de insecto o mamífero) y suele favorecer la formación de enlaces disulfuro estructurales. Sin embargo, también es posible producir una molécula de anticuerpo de la invención en el citosol de una célula hospedadora, tal comoE. coli. En este caso, el polipéptido puede obtenerse directamente en estado soluble y plegado o recuperarse en forma de cuerpos de inclusión, seguido de una renaturalizaciónin vitro.Otra opción es el uso de cepas hospedadoras específicas que tengan un medio intracelular oxidante, lo que puede permitir la formación de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi M., Seifert C., Hunte C. (2002), "High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm", J. Mol. Biol., 315, 1-8).

La molécula de anticuerpo producida por las células puede purificarse utilizando cualquier tecnología de purificación convencional, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una técnica de purificación preferida. Las moléculas de anticuerpo pueden purificarse mediante purificación por afinidad con proteínas/ligandos que se unen específica y reversiblemente a dominios constantes, tales como los dominios CH1 o CL. Algunos ejemplos de tales proteínas son las proteínas bacterianas de unión a inmunoglobulinas, tales como la proteína A, la proteína G, la proteína A/G o la proteína L, en la que la unión a la proteína L está restringida a moléculas de anticuerpos que contienen cadenas ligeras kappa. Un procedimiento alternativo para la purificación de anticuerpos con cadenas ligeras x es el uso de anticuerpos antikappa acoplados a microesferas (KappaSelect). La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos (Lindmarket al.,J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la gamma3 humana (Gusset al.,EMBO J., 5: 1567-1575 (1986)).

La elección del procedimiento de purificación que se utiliza para una molécula de anticuerpo concreta de la invención está dentro del conocimiento de la persona con un nivel de conocimiento intermedio en la técnica.

También es posible equipar una de las cadenas de la molécula de anticuerpo de la invención con uno o más marcadores de afinidad. Los marcadores de afinidad, tales como Strep-tag® o Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M.et al.(1996), J. Mol. Biol., 255, 753-766), el marcador myc, el marcador FLAG™, el marcador His6 o el marcador HA permiten una detección fácil y también una purificación sencilla de la molécula de anticuerpo recombinante.

Volviendo en este punto a los ácidos nucleicos de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica una o más cadenas de un anticuerpo según la invención puede ser cualquier ácido nucleico en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos de ADN o ARN generados mediante análogos de nucleótidos o mediante química de ácidos nucleicos, moléculas de ácidos nucleicos bloqueados ("locked nucleic acid", LNA) y moléculas de ácidos nucleicos peptídicos ("protein nucleic acids molecules", PNA). El ADN o ARN puede ser de origen genómico o sintético y puede ser monocatenario o bicatenario. Dicho ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADN sintético de ADNc, un copolímero de ADN y ARN, oligonucleótidos, etc. Un ácido nucleico respectivo puede contener además análogos de nucleótidos no naturales y/o estar unido a un marcador de afinidad o a un detector.

En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena, tal como una cadena principal y/o una cadena más pequeña de un anticuerpo según la invención, se incluye en un vector, tal como un plásmido. Cuando deba incluirse una sustitución o una deleción en una cadena de anticuerpo, en comparación con un dominio o región natural de un anticuerpo, la secuencia codificante del dominio/región nativo respectivo, por ejemplo, incluida en la secuencia de una inmunoglobulina, puede utilizarse como punto de partida para la mutagénesis. Para la mutagénesis de posiciones de aminoácidos seleccionadas, el experto en la materia tiene a su disposición los diversos procedimientos convencionales establecidos para la mutagénesis dirigida específica de sitio. Una técnica utilizada habitualmente es la introducción de mutaciones mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando mezclas de oligonucleótidos sintéticos, que incluyen una composición de bases degenerada en las posiciones de secuencia deseadas. Por ejemplo, el uso del codón NNK o NNS (en el que N = adenina, guanina o citosina o timina; K = guanina o timina; S = adenina o citosina) permite la incorporación de los 20 aminoácidos más el codón de terminación ámbar durante la mutagénesis, mientras que el codón VVS limita el número de aminoácidos que pueden incorporare a 12, ya que impide que los aminoácidos Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val se incorporen en la posición seleccionada de la secuencia polipeptídica; el uso del codón NMS (en el que M = adenina o citosina), por ejemplo, restringe el número de aminoácidos posibles a 11 en una posición seleccionada de la secuencia, ya que impide que los aminoácidos Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val se incorporen en una posición seleccionada de la secuencia. A este respecto, cabe señalar que, en el ácido nucleico de una molécula de anticuerpo, también pueden incorporarse codones para otros aminoácidos (distintos de los 20 aminoácidos naturales habituales), tales como la selenocisteína o la pirrolisina. También es posible utilizar, como describen Wang, L.,et al.(2001), Science, 292, 498-500, o Wang, L. y Schultz, PG. (2002), Chem. Comm., 1, 1-11, codones "artificiales", tales como UAG, que normalmente se reconocen como codones de terminación, para insertar otros aminoácidos poco habituales, tales como la o-metil-L-tirosina o la p-aminofenilalanina.

El uso de bloques de construcción de nucleótidos con especificidad de par de bases reducida, tales como, por ejemplo, inosina, 8-oxo-2'-desoxiguanosina o 6-(2-desoxi-p-D-ribofuranosil)-3,4-dihidro-8H-pirimina-do-1,2-oxazin-7-ona (Zaccoloet al.(1996), J. Mol. Biol., 255, 589-603), es otra opción para la introducción de mutaciones en un segmento de secuencia elegido. Otra posibilidad es la denominada mutagénesis de tripletes. Este procedimiento utiliza mezclas de diferentes tripletes de nucleótidos, cada uno de los cuales codifica un aminoácido, para su incorporación a la secuencia codificante (Virnekas B,et al.,1994, Nucleic Acids Res., 22, 5600-5607).

Una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena, tal como una cadena principal y/o una cadena más pequeña de un anticuerpo según la invención puede expresarse utilizando cualquier sistema de expresión adecuado, por ejemplo, en una célula hospedadora adecuada o en un sistema sin células. La molécula de anticuerpo obtenida puede enriquecerse mediante selección y/o aislamiento.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye una molécula de anticuerpo de la invención y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo según la invención puede administrarse por cualquier vía parenteral o no parenteral (enteral) que sea terapéuticamente eficaz para fármacos proteicos. Los procedimientos de aplicación parenteral incluyen, por ejemplo, las técnicas de inyección e infusión intracutánea, subcutánea, intramuscular, intratraqueal, intranasal, intravítrea o intravenosa, por ejemplo, en forma de soluciones inyectables, soluciones para infusión o tinturas, así como la instalación e inhalación en aerosol, por ejemplo, en forma de mezclas en aerosol, pulverizados o polvos. Se ofrece una visión general sobre la administración pulmonar de fármacos, es decir, a través de la inhalación de aerosoles (que también se pueden utilizar en la administración intranasal) o la instilación intratraqueal en J.S. Pattonet al.,The lungs as a portal of entry for systemic drug delivery, Proc. Amer. Thoracic Soc., 2004, vol. 1, pág. 338-344, por ejemplo). Los modos de administración no parenteral son, por ejemplo, por vía oral, por ejemplo, en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones, o por vía rectal, por ejemplo, en forma de supositorios.

Las moléculas de anticuerpos de la invención pueden administrarse por vía sistémica o tópica en formulaciones que contengan excipientes o portadores, aditivos y vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables, según se desee.

En una realización de la presente invención, el producto farmacéutico se administra por vía parenteral a un mamífero y, en especial, a seres humanos. Los procedimientos de administración correspondientes incluyen, entre otros, por ejemplo, las técnicas de inyección e infusión intracutánea, subcutánea, intramuscular, intratraqueal o intravenosa, por ejemplo, en forma de soluciones inyectables, soluciones para infusión o tinturas, así como la instalación e inhalación en aerosol, por ejemplo, en forma de mezclas de aerosoles, pulverizados o polvos. Una combinación de infusión y/o inyección intravenosa y subcutánea podría ser lo más conveniente en el caso de compuestos con una semivida sérica relativamente corta. La composición farmacéutica puede ser una solución acuosa, una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite.

A este respecto, cabe señalar que también pueden utilizarse las tecnologías de administración transdérmica, por ejemplo, la iontoforesis, la sonoforesis o la administración potenciada por microagujas, descritas en Meidan V.M. y Michniak B.B., 2004, Am. J. Ther., 11(4): 312-316, para la administración transdérmica de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. Los modos de administración no parenteral son, por ejemplo, la administración oral, por ejemplo, en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas, soluciones o suspensiones, o la administración rectal, por ejemplo, en forma de supositorios. Las moléculas de anticuerpos de la invención pueden administrarse por vía sistémica o tópica en formulaciones que contienen una diversidad de excipientes o portadores, aditivos y vehículos convencionales no tóxicos farmacéuticamente aceptables.

La dosis de la molécula de anticuerpo aplicada puede variar dentro de límites amplios para lograr el efecto preventivo o la respuesta terapéutica deseados. Dependerá, por ejemplo, de la afinidad de la molécula de anticuerpo por una diana elegida, así como de la semivida del complejo entre la molécula de anticuerpo y el ligandoin vivo.Además, la dosis óptima dependerá de la biodistribución de la molécula de anticuerpo o de un conjugado de la misma, del modo de administración, de la gravedad de la enfermedad/trastorno que se esté tratando, así como del estado médico del paciente. Por ejemplo, cuando se utiliza en una pomada para aplicaciones tópicas, puede emplearse una concentración elevada de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, si se desea, la molécula de anticuerpo también puede administrarse en una formulación de liberación sostenida, por ejemplo, dispersiones liposómicas o microesferas poliméricas basadas en hidrogeles, tales como PolyActiveTM u OctoDEXTM (cf. Boset al.,Business Briefing: Pharmatech, 2003: 1-6). Otras formulaciones de liberación sostenida disponibles son, por ejemplo, los polímeros basados en PLGA (PR pharmaceuticals), los hidrogeles basados en PLA-PE<g>(Medincell) y los polímeros basados en PEA (Medivas).

Por consiguiente, las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden formularse en composiciones utilizando ingredientes farmacéuticamente aceptables, así como procedimientos de preparación establecidos (Gennaro, A.L. y Gennaro, A.R. (2000), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA). Para preparar las composiciones farmacéuticas, pueden utilizarse excipientes inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente inertes. Para preparar, por ejemplo, píldoras, polvos, cápsulas de gelatina o supositorios, pueden utilizarse, por ejemplo, lactosa, talco, ácido esteárico y sus sales, grasas, ceras, polioles sólidos o líquidos, aceites naturales e hidrogenados. Entre los excipientes adecuados para la producción de soluciones, suspensiones, emulsiones, mezclas en aerosol o polvos para la reconstitución en soluciones o mezclas de aerosol antes de su uso se incluyen el agua, los alcoholes, el glicerol, los polioles y las mezclas adecuadas de los mismos, así como los aceites vegetales.

La composición farmacéutica también puede contener aditivos, tales como, por ejemplo, cargas, aglutinantes, agentes humectantes, deslizantes, estabilizantes, conservantes, emulsionantes y, además, disolventes o solubilizantes o agentes para lograr un efecto de liberación lenta ("depot"). En este último caso, las proteínas de fusión pueden incorporarse a sistemas de liberación lenta o sostenida o de administración dirigida, tales como liposomas y microcápsulas.

Las formulaciones pueden esterilizarse por numerosos medios, incluida la filtración a través de un filtro que retenga bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio estéril justo antes de su uso.

La molécula de anticuerpo puede ser adecuada para el tratamiento o la prevención de una enfermedad y puede utilizarse para ello. En consecuencia, en algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo según la invención puede utilizarse en un procedimiento de tratamiento y/o de prevención de una afección médica, tal como un trastorno o enfermedad. Del mismo modo, la molécula de anticuerpo de la presente invención puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad. La enfermedad a tratar o prevenir puede ser una enfermedad proliferativa. Dicha enfermedad proliferativa puede ser preferentemente un tumor o un cáncer. Debido a la capacidad de la molécula de anticuerpo de la invención para unirse al PSMA, esta molécula de anticuerpo puede utilizarse para tratar un cáncer que consista en células que expresan PSMA, tales como las células de cáncer de próstata primario y metastásico (cf.) y la neovasculatura de un amplio espectro de neoplasias malignas, tales como el carcinoma renal convencional (de células claras), el carcinoma de células transicionales de la vejiga urinaria, el carcinoma embrionario testicular, el adenocarcinoma colónico, el carcinoma neuroendocrino, el glioblastoma multiforme, el melanoma maligno, el carcinoma del conducto pancreático, el carcinoma pulmonar no microcítico, el sarcoma de tejidos blandos y el carcinoma de mama (véase, en este contexto, Chang S.S.etal.,Five different anti prostate specific membrane antigen (PSMA) antibodies confirm PSMA expression in tumor associated neovasculature, Cancer Res., 1999, 59:3192). Así, la molécula de anticuerpo de la invención puede utilizarse, en un aspecto, en el tratamiento de un cáncer sólido, tal como el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de mama, el cáncer de páncreas o el glioblastoma. Sin embargo, debido al sorprendente hallazgo de que el anticuerpo de la invención también se une a células escamosas, la molécula de anticuerpo de la invención también preferentemente puede utilizarse, en otro aspecto, en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de diferente origen, incluido, entre otros, carcinoma de piel, cabeza y cuello, esófago, pulmón y cuello uterino.

El sujeto a tratar con la proteína de fusión puede ser un animal humano o no humano. Dicho animal es preferentemente un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un cerdo, ganado vacuno, un conejo, un ratón, una rata, un primate, una cabra, una oveja, un pollo o un caballo, más preferentemente un ser humano.

La molécula de anticuerpo de la invención también puede utilizarse en el diagnóstico de una enfermedad, tal como una enfermedad como se describe en el presente documento. Para ello, la molécula de anticuerpo puede marcarse con un marcador de señalización detectable adecuado. Dicha molécula de anticuerpo marcada puede permitir la detección o la cuantificación del nivel de PSMA o de un cáncer, tal como el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de mama, el cáncer de páncreas, el glioblastoma o el carcinoma de células escamosas, así como los carcinomas de células escamosas de distinto origen enumerados anteriormente en una muestra o un sujeto. Cuando se emplea para un usoin vivo,dicho marcador de señalización detectable es preferentemente detectablein vivo.

La molécula de anticuerpo marcada puede utilizarse en una técnica de obtención de inmunoimágenes. El marcador de señalización detectable puede entonces seleccionarse, por ejemplo, en función de la técnica de inmunoimagen empleada para el diagnóstico, por ejemplo, radionúclido que emite rayos gamma (o emisor de rayos gamma) en el caso de la obtención de imágenes por cámara de rayos gamma/SPECT, emisor metálico o de positrones en el caso de las técnicas de imagen por resonancia magnética o PET, respectivamente. A este respecto, uno o más marcadores de señalización detectables de la divulgación incluyen agentes de obtención de imágenes con cámara de rayos gamma, agentes de obtención de imágenes con PET y agentes de obtención de imágenes con RM, tales como radionúclidos, compuestos fluorescentes, fluorógenos, cromóforos, cromógenos, compuestos fosforescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes.

Un marcador de señalización detectable adecuado puede ser un radionucleido. Dicho radionucleido puede seleccionarse del grupo que consiste en formado por3H, 14C, 35S, 99Tc, 1231, 1251, 131I, mIn, 97Ru, 67Ga, 68Ga, y 201T1.

Un marcador de señalización detectable adecuada también puede ser fluoróforo o un fluorógeno. Dicho fluoróforo o fluorógeno puede seleccionarse del grupo que consiste en fluoresceína, rodamina, dansilo, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, fluorescamina, derivado de fluoresceína, verde de Oregón, verde de rodamina, verde rodol o rojo Texas.

La molécula de anticuerpo marcada puede acoplarse directa o indirectamente a un marcador de señalización detectable. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede acoplarse directamente (por ejemplo, a través de residuos de tirosina de la molécula de anticuerpo) o indirectamente (por ejemplo, a través de un conector, tal como un agente quelante de metales) a un marcador de señalización detectable. En algunas otras realizaciones, la molécula de anticuerpo puede acoplarse a una molécula capaz de acoplarse(in vitrooin vivo)a el marcador de señalización detectable en el momento y lugar del uso.

Un marcador de señalización detectable puede unirse a la molécula de anticuerpo a través de uno o más residuos de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) que están acoplados a la molécula de anticuerpo.

También se contempla en la invención un procedimientoin vitropara detectar o diagnosticar una enfermedad definida en el presente documento. Dicho procedimiento puede comprender poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto con una molécula de anticuerpo preferentemente marcada de la invención. La muestra puede ser una muestra de sangre, orina o líquido cefalorraquídeo, pero preferentemente puede ser una muestra de tejido o una muestra de biopsia. La enfermedad a detectar o diagnosticar es preferentemente cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de páncreas, glioblastoma o carcinoma de células escamosas, más preferentemente carcinoma de células escamosas.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 01: dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 02: dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 03: CDRH1 del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 04: CDRH2 del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 05: CDRH3 del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 06: CDRL1 del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 07: CDRL2 del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 08: CDRL3 del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 09: dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo 10B3 humanizado (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 10: dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo 10B3 humanizado (secuencia de aminoácidos).

SEQ ID NO: 11: cadena pesada de la molécula de anticuerpo biespecífico en formato IgGsc h10B3 humanizado X hUCHT1humanizado

SEQ ID NO: 12: cadena pesada de la molécula de anticuerpo biespecífico en formato Fabsc h10B3 humanizado X OKT3 murino

SEQ ID NO: 13: cadena ligera kappa del anticuerpo 10B3 humanizado

SEQ ID NO: 14: ejemplo ilustrativo de una CDRH1 mutada del anticuerpo 10B3 murino (secuencia de aminoácidos) que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con<s>E<q>ID NO: 3.

SEQ ID NO: 15: secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo J519.

SEQ ID NO: 16: secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo J519.

Ejemplos experimentales

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Generación, identificación y producción del anticuerpo 10B3

El anticuerpo 10B3 se generó tras la inmunización de ratones BALB/c hembra con células Sp2/0 Ag14 transfectadas con PSMA irradiado (las células Sp2/0-Ag14 se obtuvieron de ATCC, donde se pueden comprar con el nombre ATCC® CRL-1581™). Cuatro días después de la última inmunización, las células del bazo se fusionaron con las células Sp2/0 transfectadas y se cultivaron en medio de selección HAT. Se cribaron los sobrenadantes de las células de hibridoma en crecimiento para detectar la producción de anticuerpos PSMA mediante citometría de flujo utilizando células Sp2/0 no transfectadas y transfectadas con PSMA. Tras la subclonación por dilución limitante se obtuvo una línea celular estable de hibridoma monoclonal. Para la producción de anticuerpos, las células de hibridoma se adaptaron a un medio DMEM avanzado (Gibco,Thermo Scientific, Waltham, MA, USA02451), suplementado con FCS al 1 % (Biochrom GmbH, Berlín, Alemania) para evitar la contaminación con IgG bovina durante la purificación. El anticuerpo se aisló de los sobrenadantes de los cultivos celulares mediante cromatografía de afinidad con proteína A y el isotipo del anticuerpo purificado se identificó como IgG2b/kappa (kit Rapid Mouse-Monoclonal Isotyping Kit, BioAssay Works, Ijamsville, MD, 21754). La secuencia de la cadena pesada variable (mostrada en SEQ ID NO: 1 y figura 10a ) y de la cadena ligera variable mostrada (mostrada en SEQ ID NO: 2 y figura 10B) fue determinada por Alvedron GmbH, Friburgo, Alemania.

Ejemplo 2: Generación de un anticuerpo 10B3 humanizado

El anticuerpo 10B3 se humanizó injertando las regiones CDR en las secuencias de la línea germinal de la secuencia de cadena ligera variable k humana IGKV3-20*02 (esta secuencia está depositada en la base de datos IMGT/LIGM con el número de registro L37729, véase también Ichiyoshi Y., Zhou M., Casali P, A human anti-insulin IgG autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin-specific 'germ-line' natural antibody template. Analysis by V gene segment reassortment and site-directed mutagenesis, J. Immunol., 154(1):226-238 (1995) y la secuencia de cadena pesada variable IGHV3-11*06 (esta secuencia está depositada en la base de datos IMGT/LIGM con el número de registro AF064919, véase también Watson C.T.,et al.,Complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy-chain variable, diversity, and joining genes and characterization of allelic and copynumber variation, Am. J. Hum. Genet., 92(4):530-546 (2013). Cabe señalar en este punto que la IMGT/LIGM-DB es la base de datos completa del IMGT de secuencias de nucleótidos de inmunoglobulinas (IG) y receptores de linfocitos T (TR) de seres humanos y otras especies vertebradas; véase Nucleic Acids Res., 1 de enero de 2006, 34(número de base de datos):D781-4.

Para mantener las propiedades de unión del anticuerpo murino originario, se introdujeron las dos retromutaciones siguientes en la región marco de los dominios variables humanos. En el dominio variable de la cadena pesada IGHV311 *06 de la línea germinal humana, la serina en la posición 49 fue retromutada a una alanina que está presente en el anticuerpo murino 10B3 (véase también la figura 10<c>, en la que el residuo de alanina en la posición 49 está resaltado en negrita y cursiva). En el dominio variable de la secuencia de cadena ligera IGKV3-20*02, la fenilalanina en la posición 72 de la secuencia de la línea germinal humana fue retromutada a un residuo de tirosina que está presente en esta posición de la secuencia en el anticuerpo murino 10B3 (véase también la figura 10D, en la que el residuo de tirosina en la posición 72 está resaltado en negrita y cursiva).

Ejemplo 3: Producción de moléculas de anticuerpos recombinantes y activación inespecífica de linfocitos T por diferentes anticuerpos PSMAxCD3

Para la construcción de moléculas de anticuerpos biespecíficos recombinantes, los dominios variables de los anticuerpos PSMA J591 y 10B3 se fusionaron a regiones constantes humanas y regiones variables de los anticuerpos CD3 OKT3 o UCHT1 en el siguiente orden. VL-CL para los formatos Fabsc e IgGsc. Las cadenas pesadas se construyeron de la siguiente manera: VH-CH1-CH2mod-scFv(OKT3/UCHT1) para el formato Fabsc, VH-CH1-CH2mod-CH3-scFv(OKT3/UCHT1) para el formato IgGsc (cf. también figura 1A y 1B). En estas moléculas de anticuerpo, el sitio de unión al PMSA está presente como fragmento Fab, mientras que el sitio de unión a CD3 está presente como fragmento scFv (cf. de nuevo figura 1A y 1B). Para anular la unión al FcR, los sitios de glucosilación y la formación de enlaces disulfuro, se introdujeron las siguientes modificaciones en la región bisagra y en el dominio CH2 del formato Fabsc (índice EU): C226S; C229S; E233P; L234V; L235A; AG236; D265G; N297Q; A327Q; A330S (véase a este respecto también la solicitud de patente internacional WO 2013/092001). Las modificaciones de los formatos IgGsc eran idénticas, salvo por las dos mutaciones de cisteína en las posiciones 226 y 229 de la secuencia en la región bisagra que faltan en el formato IgGsc. Las construcciones se clonaron en un vector de expresión derivado de pcDNA3.1 (InVitrogen, Thermo Fisher) y se transfectaron en células Sp2/0 mediante electroporación, como también se describe en la solicitud de patente internacional WO 2013/092001. Las moléculas de anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes de las células transfectadas mediante cromatografía de afinidad con resinas kappaSelect (Fabsc) o de proteína A (IGGsc). Ambas resinas de afinidad se adquirieron en GE Health Care Freiburg, Alemania.

Para la caracterización de la activación inespecífica de linfocitos T, se incubaron PBMC con las moléculas de anticuerpos indicadas de J519 y 10B3 en ausencia y presencia de células de linfoma espectadoras SKW6.4. Tras 2 días, se analizó la expresión de CD69 de los linfocitos T CD4 mediante citometría de flujo. Para ello, las PMBC se incubaron con anticuerpos de detección dirigidos a CD4 (clon HP2/6 marcado con FITC), CD8 (clon HIT8a marcado con APC) y CD69 (clon FN50 marcado con PE) para identificar los linfocitos T que expresan el marcador de activación CD69. Las células se analizaron utilizando un FACS Canto II de BD Biosciences.

Conclusión: Como se muestra en la figura 2 (que muestra los resultados de las moléculas de anticuerpos biespecíficos que contienen los dominios variables del anticuerpo J519), la molécula de anticuerpo Fabsc que contiene el fragmento scFv del anticuerpo de unión a CD3 UCHT1 induce la activación de linfocitos T en ausencia de células que expresen PSMA (activación inespecífica de linfocitos T), mientras que la molécula de anticuerpo IgGsc que comprende la misma diana, es decir, el sitio de unión a PMSA y el sitio de unión al anticuerpo efector (es decir, el fragmento scFv del anticuerpo de unión a CD3 UCHT1) no lo hace.

Ejemplo 4: Activación específica de linfocitos T con anticuerpos PSMAxCD3 en formato Fabsc

En la figura 3, la activación de linfocitos T se evaluó mediante la captación de 3H-timidina. En la figura 3A se muestra, a modo de comparación, la activación inespecífica de linfocitos T. En la figura 3C se demuestra la lisis de células diana que expresan PSMA por linfocitos T activados mediante un ensayo de citotoxicidad Xelligence. Para el ensayo de captación de 3H-timidina, se sembraron PBMC (205/pocillo) por triplicado en placas de 96 pocillos y se incubaron con diversas concentraciones de moléculas de anticuerpos biespecíficos con (figura 3B) o sin (figura 3A) células 22RV1 que expresaban PSMA irradiadas (100Gy) (105/pocillo). Después de 72 horas, las células se pulsaron durante 20 horas más con 3H-timidina(0,5 pCi/pocillo) y se recolectaron sobre tejido filtrante. La radiactividad incorporada se determinó mediante recuento por centelleo líquido en un contador de microplacas 2450 (Perkin Elmer).

Para el ensayo Xelligence se añadieron 50 pl de medio de cultivo a placas E de 96 pocillos (Roche) para determinar los valores de fondo. Posteriormente, se sembraron células diana (22RV1) a una densidad de 40000 células por pocillo. Durante las siguientes 20 a 24 horas se dejó que las células se adhirieran a los pocillos. A continuación, las PBMC, aisladas por centrifugación en gradiente de densidad, se añadieron a las células diana. La proporción efector/diana (E:T) fue de 5:1 y la concentración del anticuerpo biespecífico fue de 1 pg/ml. La impedancia se controló cada 15 minutos durante varios días como medida de la viabilidad de las células diana adherentes.

Conclusión: El anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 que contiene OKT3 (NP-CO) es ligeramente menos eficaz en la mediación de la activación "específica" de linfocitos T y en la destrucción de las células diana que el reactivo que contiene UCHT1 (NP-CU).

Ejemplo 5: Multimerización y agregación de diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos

En la figura 4A y figura 4B se comparan moléculas de anticuerpos con especificidad FLT3xCD3 (formato Fabsc frente a bscc), mientras que en la figura 4C-F se comparan moléculas de anticuerpos con especificidad PSMAxCD3 (formato Fabsc frente a IgGsc). La filtración en gel que se utilizó para analizar el comportamiento de multimerización se realizó en columnas Superdex S200.

Conclusiones: (i) Tal como se muestra en la figura 4B, los anticuerpos dentro del formato bssc (véase la figura 1C para el formato biespecífico monocatenario utilizado en el experimento de la figura 4B) tienen una marcada tendencia a formar multímeros y agregados. Esta tendencia es mucho menor en el caso de los formatos Fabsc e IGsc (figura 4A, figura 4C-F). (ii) La cantidad moderada de multímeros formados por las construcciones Fabsc/IgGsc es mayor para los anticuerpos que contienen OKT3 (figura 4C, 4E) en comparación con los que comprenden UCHT1 (figura 4D, 4F). Mientras que los resultados mostrados en las figuras 4C a 4F se han obtenido con moléculas Fabsc/IgGsc que contienen los dominios variables del anticuerpo J591 como sitio de unión al PMSA, se ha observado un comportamiento análogo para las respectivas moléculas Fabsc del anticuerpo 10B3 (datos no mostrados).

Ejemplo 6: Unión de los anticuerpos PSMA J591 y 10B3 a células que expresan PSMA

La unión (figura 5A), la ausencia de competencia de unión (figura 5B) y el desplazamiento del antígeno PSMA tras la unión del anticuerpo (figura 5C) se evaluaron mediante citometría de flujo utilizando células Sp2/0 transfectadas con PSMA. Para ello se incubaron diferentes anticuerpos a-PSMA con estas células en placas de 96 pocillos durante 30 a 45 min a 4 °C. A continuación, se lavaron las células y se incubaron con un anticuerpo de cabra antifragmento F(ab<)2>de ratón conjugado con PE (figura 5A, 5C) (Jackson ImmunoResearch) o con un anticuerpo de cabra específico antifragmento FC-<y>humano conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch) (B). Las células se analizaron en un FACSCalibur (BD Biosciences). En la figura 5B se demuestra que el anticuerpo quimérico (ch) de unión a PMSA J591, detectado específicamente por un anticuerpo secundario de cabra antihumano, fue superado por el anticuerpo murino (mu) J591, pero no por el anticuerpo murino 10B3, es decir, un anticuerpo de la presente invención. Para la determinación del desplazamiento del antígeno (figura 5C), se incubaron células que expresan PSMA con los anticuerpos indicados al inicio del experimento y de nuevo tras 24 horas y antes del análisis FACS con una cantidad saturante (10 pg/ml) del anticuerpo respectivo. La expresión de PSMA por las células no tratadas sirvió de referencia (el 100 % de expresión de PSMA)

Conclusiones: (i) La unión de ambos anticuerpos, J591 y 10B3, es comparable, (ii) los anticuerpos no compiten entre sí, es decir, se unen a epítopos diferentes y (iii) el desplazamiento de antígeno inducido por el anticuerpo 10B3 se reduce notablemente en comparación con el que provoca el anticuerpo J591.

Ejemplo 7: Secciones cortadas con criostato teñidas con los anticuerpos PSMA J591 y 10B3

En la figura 6A, B una muestra de células de carcinoma de próstata se tiñó con ambos anticuerpos, mientras que en la figura 6C y figura 6D, una muestra de carcinoma de células escamosas se tiñó con ambos anticuerpos. En ambos experimentos la tinción se realizó en paralelo y utilizando un sistema polimérico de Zytomed, Berlín, Alemania (POLHRP-100). Las flechas indican el estroma tumoral (Tu) y los vasos sanguíneos (Ve). Se muestran resultados representativos de 9 de 10 muestras de cáncer de próstata y 7 de 10 muestras de carcinoma de células escamosas.

En una diversidad de diferentes humanos normales diferentes (obtenidos de BioCat, Heidelberg, Alemania, T6234701-2), el patrón de tinción de los dos anticuerpos fue idéntico con la excepción de una débil reactividad del anticuerpo 10B3 con células epiteliales de la piel.

Conclusiones: (i) La tinción de muestras de carcinoma de próstata y tejido normal es comparable con ambos anticuerpos, (ii) en muestras de carcinoma de células escamosas, el anticuerpo J5191 tiñe sólo las células vasculares, mientras que el anticuerpo 10B3 tiñe las células vasculares (más exhaustivamente que J591) y las propias células tumorales.

Ejemplo 8: Unión de anticuerpos 10B3 humanizados y de ratón

Se incubaron anticuerpos Fabsc biespecíficos con especificidad PSMAxCD3 (10B3xOKT3) que contenían los dominios variables del anticuerpo humanizado injertado con CDR (h10B3) o de ratón (m10B3) con células 22RV1 que expresaban PSMA y se analizaron por citometría de flujo (figura 7). Para ello, las células se incubaron con los anticuerpos indicados en placas de 96 pocillos durante 30 a 45 min a 4 °C. Tras la incubación, las células se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra específico antifragmento FC-<y>humano conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch). Las células se analizaron en un FACSCalibur (BD Biosciences).

Conclusión: La unión de las versiones de ratón y humanizada de 10B3 (incorporado como un resto Fab de los dominios variables de 10B3 dentro de una molécula de anticuerpo Fabsc) a células que expresan PSMA es idéntica.

Ejemplo 9: Unión de diferentes anticuerpos PSMAxCD3 a CD3

Se incubaron células Jurkat con las moléculas de anticuerpo (Fabsc (UCHT1) = una molécula Fabsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo UCHT1 y los dominios variables del anticuerpo J591; IgGsc (UCHT1) = molécula IgGsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo UCHT1 y los dominios variables del anticuerpo J591, Fabsc (OKT3) = molécula Fabsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo OKT3 y los dominios variables del anticuerpo<j>591, IgGsc (OKT3) = molécula IgGsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo OKT3 y los dominios variables del anticuerpo J591) en placas de 96 pocillos durante 30 a 45 min a 4 °C. A continuación, se lavaron las células y se incubaron con un anticuerpo de cabra específico antifragmento F(ab<')2>de IgG humana conjugado con biotina (Jackson ImmunoResearch) y estreptavidina-PE (Life Technologies). Las células se analizaron en un FACSCalibur (BD Biosciences).

Conclusión: Tal como se muestra en la figura 8, la avidez por CD3 es mayor para el anticuerpo Fabsc que contiene UCHT1 y menor para el que contiene OKT3. En el formato IgGsc, la construcción UCHT1 pierde avidez y la construcción OKT3 gana avidez. Dado que la avidez a de las moléculas de anticuerpos biespecíficos por CD3 depende obviamente sólo de la unión (sitio) a CD3, debe suponerse que la clasificación de la avidez de las moléculas de anticuerpos biespecíficos que contienen el sitio de unión del anticuerpo 10B3 será la misma que la determinada en el presente documento utilizando los dominios variables del anticuerpo J591 como sitio de unión a PMSA representativo (sitio de unión a la diana).

Ejemplo 10: Actividad citolítica de los diferentes anticuerpos PSMA

Se incubaron células de carcinoma de próstata 22RV1 que expresan PSMA con PBMC y las moléculas de anticuerpos biespecíficos PSMAxCD3 indicadas (Fabsc (UCHT1) = una molécula Fabsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo UCHT1 y los dominios variables del anticuerpo J591; IgGsc (UCHT1) = molécula IgGsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo UCHT1 y los dominios variables del anticuerpo J591, Fabsc (OKT3) = molécula Fabsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo OKT3 y los dominios variables del anticuerpo J591, IgGsc (OKT3) = molécula IgGsc que comprende los dominios variables de unión a CD3 del anticuerpo OKT3 y los dominios variables del anticuerpo J591) a una proporción PBMC:diana de 5:1. La viabilidad de las células diana adheridas se evaluó utilizando un sistema Xelligence como se describe en el ejemplo 4. La proporción efector/diana (E:T) fue de 5:1 y la concentración de anticuerpos se ajustó en 5 nM.

En la figura 9 se muestran resultados representativos de uno de cuatro experimentos diferentes con PBMC de diferentes voluntarios sanos.

Conclusión: La clasificación de la actividad lítica es: Fabsc (UCHT1) = IgGsc (UCHT1) > Fabsc (OKT3) > IgGsc (OKT3). Dado que la actividad lítica de las moléculas de anticuerpos biespecíficos depende de la unión (sitio) a CD3, cabe suponer que la clasificación de la actividad lítica de las moléculas de anticuerpos biespecíficos que contienen el sitio de unión del anticuerpo 10B3 será la misma que la determinada en el presente documento utilizando los dominios variables del anticuerpo J591 como sitio de unión a PMSA representativo (sitio de unión a la diana).

Ejemplo 11: Efecto terapéutico de PSMAxCD3 IgGsc (CC-1)in vitro

El anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 (h10B3xUCHT1)-IgGsc (CC-1) de la invención y un anticuerpo biespecífico de control (NG2xCD3) se incubaron con o sin células tumorales (células 22Rv1, células de carcinoma de próstata humano; véase Sramkoski R.M.et al.,In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., julio-agosto de 1999, 35(7):403-409.). La activación de linfocitos T CD4 y CD8 se analizó mediante FACS utilizando CD69 y CD25 como marcadores de superficie celular tras tres días de incubación. Ambos tipos de linfocitos T se activaron (figura 15A), y aumentaron los niveles de interferón gamma (figura 15B) y la proliferación de linfocitos T (figura 15C). El ensayo de liberación de cromo (después de 20 h, proporción E:T 10:1) y FACS (durante 72 h, proporción E:T 1:1) mostraron además una fuerte lisis de células tumorales utilizando CC-1 (figura 15D y E). El tratamiento con CC-1 de la invención también inhibió el crecimiento tumoralin vitro.A una proporción E:T de 2:1, el crecimiento de las células tumorales en presencia de CC-1 se ve significativamente afectado, tal como se analiza con un sistema Xelligence (figura 15F, izquierda) y mediante inspección visual con un microscopio (figura 15F, derecha).

Conclusión: El CC-1 induce una activación de los linfocitos T restringida a las células tumorales y la producción de citocinas que dan lugar a la proliferación de los linfocitos T y a una actividad antitumoral.

Ejemplo 12: Efecto terapéutico de PSMAxCD3 IgGsc (CC-1)in vivo

A continuación, se ensayó la actividad antitumoralin vivodel CC-1 (el anticuerpo biespecífico IgGsc de la invención) en un modelo de ratón. Se inyectaron 1,5 * 106 células 22Rv1 en ratones NSG ((NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)) por vía intravenosa (n = 4/grupo). Después de tres días se inyectaron 3 x 106 PBMC humanas y, en los días 3 y 5, 10 pg de CC-1 o PBS como control negativo. Tras 8 días se analizó la formación de metástasis en el pulmón mediante FAC<s>. Se descubrió una reducción significativa del número de metástasis formadas en el grupo tratado con CC-1 (figura 16A). A continuación, se inyectaron ratones NSG (n=3/grupo) con 2 * 107 PBMC por ratón y se trataron con dosis "supraterapéuticas" de CC-1 a 2 * 20 pg en un intervalo de 4 días y un anticuerpo de control (UCHT1 como control positivo, que activa los linfocitos T de forma inespecífica) o PBS como control negativo. Se analizó la liberación de IFNgamma y el peso corporal como marcador de la actividad autoinmunitaria (figura 16B). El CC-1 comparado con el UCHT1 no indujo la producción de IFNgamma y no se observó una reducción del peso corporal en los ratones tratados con CC-1, al contrario que en el grupo tratado con UCHT1. En otro experimento se inyectaron ratones NOS/SCID con células 22Rv1 (células tumorales positivas a PSMA) o con células DU145 (células de tumoral de próstata humano negativas a PSMA) y, tras el establecimiento de tumores después de 35 días, los ratones fueron tratados con un anticuerpo CC-1 marcado con radioisótopo (50 pCi) y sacrificados después de 24 h para medir la radiactividad en diferentes órganos. Sólo en los tumores de los ratones tratados con 22Rv1 se pudo observar un aumento significativo de la radiactividad (figura 16C). Para analizar la diferencia de la semivida sérica de los anticuerpos biespecíficos en formato BiTE o IgGsc de la invención, se inyectaron ratones Balb/C con 50 |jg de CC-1 (formato IgGsc) o del anticuerpo biespecífico PSMAxCD3 en formato BiTE. La concentración sérica se midió a lo largo del tiempo. Los anticuerpos biespecíficos en formato BiTE no fueron detectables después de 2 a 4 h de la inyección, mientras que CC-1 seguía siendo detectable en el suero después de 24 h (figura 16D). Por lo tanto, el formato IgGsc de la invención proporciona una mayor estabilidad sérica en comparación con otros formatos de anticuerpos biespecíficos.

Conclusión: CC-1 suprime el crecimiento tumoralin vivosin inducir respuestas inmunitarias inespecíficas. CC-1 se dirige específicamente al tejido tumoral que expresa PSMA y tiene, en comparación con otros formatos biespecíficos, una mayor semivida sérica.

Ejemplo 13: Comparación de UCHT1 y OKT3

Para dilucidar aún más la supremacía demostrada en el presente documento de UCHT1 sobre OKT3 como sitio de unión a CD3 en el formato de anticuerpo biespecífico IgGsc (ver arriba), se ensayaron por comparación las versiones Fab e IgG de ambos anticuerpos monoespecíficos. OKT3 y UCHT1 se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Los fragmentos Fab se generaron mediante digestión con pepsina, seguida de reducción y modificación de los enlaces disulfuro de la región bisagra, tal como se ha descrito previamente (Junget al.,Target cell induced T cell activation with bi- and trispecific antibody fragments, Eur. J. Immunol., 1991, 21:2431-2435). Los fragmentos Fab se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex S200.

A continuación, las células Jurkat que expresaban CD3 se incubaron con concentraciones crecientes de los anticuerpos indicados, un anticuerpo de detección marcado con biotina (anti-Fab humano) seguido de estreptavidina conjugada con PE. A continuación, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo (tabla 1). Se indican las concentraciones a las que se observó una unión semimáxima (nM).

Tabla 1: Avidez de las versiones Fab e IgG de los anticuerpos anti-CD3

Conclusión:

OKT3 pierde avidez si se utiliza como fragmento Fab univalente en lugar de como molécula IgG intacta bivalente. En cambio, la avidez del fragmento UCHT1 no cambia. Sin querer ceñirse a ninguna teoría concreta, esto apunta a una unión univalente del anticuerpo UCHT1 intacto, cuya avidez es comparable a la del anticuerpo OKT3 de unión bivalente. La marcada diferencia en la unión de los fragmentos Fab univalentes a favor de UCHT1 explica la correspondiente diferencia en la unión de los dos anticuerpos dentro del formato Fabsc (figura 8, ejemplo 9). En este formato, los anticuerpos se presentan como una molécula monovalente monocatenaria unida al extremo C-terminal de un anticuerpo selectivo (figura 1). La unión univalente de UCHT1 también explica por qué este anticuerpo pierde avidez, mientras que OKT3 gana avidez si se presenta dentro del formato IgGsc, en lugar de Fabsc (figura1 y figura 8, ejemplo 9).

Aunque en el formato IgG, la avidez de la molécula que contiene UCHT1 (IgGsc-UCHT1) es comparable o incluso ligeramente inferior a la de IgGsc-OKT3, la actividad de IgGsc-UCHT1 frente a células tumorales es notablemente (e inesperadamente) superior (figura 9, ejemplo 10).

En resumen, IgGsc-UCHT1 es un formato con propiedades optimizadas que combina una baja activación inespecífica (figura 2, ejemplo 3) con una actividad lítica óptima contra células tumorales (figura 9, ejemplo 10).

Ejemplo 14: UCHT1 es eficaz en otros anticuerpos biespecíficos de formato IgGsc

El uso preferido de UCHT1 como anticuerpo anti-CD3 en un formato de anticuerpo basado en IgGsc también se analizó para otros anticuerpos no específicos de PSMA. Se incubaron células de melanoma M21 irradiadas que expresaban el gangliósido GD2, así como una forma O-acetilada de este antígeno (oaGD2) con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de la sangre periférica de donantes humanos normales y anticuerpos IgGsc biespecíficos con las especificidades indicadas. Los anticuerpos monoespecíficos originarios utilizados en estas construcciones fueron hu14.18 (anti-GD2), 8B6 (anti-oaGD2), J591 (anti-PSMA) y UCHT1 (anti-CD3), respectivamente. Después de 3 días, se evaluó la activación de los linfocitos T mediante un ensayo de incorporación de 3H-timidina. Además, se incubaron células M21 con PBMC y los anticuerpos IgGsc biespecíficos indicados (50nM). A continuación, se supervisó el crecimiento de las células tumorales mediante un sistema Xelligence. Se utilizó como control un anticuerpo IgGsc biespecífico con una especificidad de diana no relacionada (MOPC).

Conclusión:

En presencia de células tumorales que expresan GD2 y oaGD2 y anticuerpos biespecíficos dirigidos a estos antígenos se observó una activación eficaz de los linfocitos T dentro de la población de PBMC. Un anticuerpo de control dirigido a PSMA fue ineficaz, ya que las M21 no expresan PSMA (figura 17A).

Los anticuerpos IgGsc biespecíficos dirigidos a GD2 u oaGD2 como especificidad diana y a CD3 como especificidad efectora eliminan eficazmente las células tumorales que expresan estos antígenos (figura 17B). Los anticuerpos específicos GD2- y CD3 utilizados se enumeran en la leyenda de la figura 17A.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente y homodimérica que comprende en cada monómero:

(ii) un fragmento scFv C-terminal que se une a CD3 que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de UCHT1 humanizado, y en el que (i) y (ii) están conectados por un dominio CH2 y CH3.

2. La molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de la reivindicación 1, en la que falta o está mutado al menos un residuo de aminoácido del dominio CH2 capaz de mediar en la unión a receptores de Fc.

3. La molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de la reivindicación 1 o 2, en la que el fragmento Fab no es un fragmento Fab de un anticuerpo 10B3 o J591 no humanizado, quimerizado o humanizado.

4. La molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el primer sitio de unión no es capaz de unirse al PSMA.

5. La molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente y homodimérica de un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de UCHT1 humanizado comprenden la secuencia de UCHT1 mostrada en SEQ ID NO: 11.

6. La molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el fragmento Fab se une a un antígeno asociado a un tumor.

7. La molécula de anticuerpo biespecífico tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el UCHT1 humanizado tiene una orientación de N- a C- que comienza con la secuencia de aminoácidos DIQMT... y termina con.... VTVSS.