JP2023099206A - Ｃｄ２０結合分子およびその使用方法 - Google Patents

Ｃｄ２０結合分子およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】五量体および六量体CD20結合分子、ならびにCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くためにそのような分子を用いる方法を提供する。【解決手段】少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、特定のアミノ酸配列を有する6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むCD20抗原結合ドメインである、多量体結合分子。【選択図】図１

Description

背景
ヒト化抗体の出現以来、リツキサン(RITUXAN)(登録商標) (リツキシマブ)のような抗体の治療的使用は、B細胞悪性腫瘍の処置に革命をもたらした。CD20特異的キメラモノクローナル抗体であるリツキシマブは、再発性または難治性B細胞非ホジキンリンパ腫の処置のためにFDAによって承認された最初の有効な標的療法である。この科学的成果は、B細胞リンパ腫の実施基準を変えただけでなく、次世代のCD20 mAbへのかなりの関心も刺激した。多くの新規のCD20 mAbが診療所に入り、各々が構造的改変を伴って有効性をさらに改善させている。本出願において、本発明者らは、IgAおよびIgMのような、非IgGの形式で発現されるため、さらなる作用様式を利用して改善された有効性を示すことができる一連のCD20抗体について記述する。
CD20は、排他的にBリンパ球上でおよび90%超のBリンパ球性リンパ腫で発現される36 kDaの非グリコシル化4回膜貫通型の膜タンパク質(MS4A1遺伝子産物)である(図1参照)。CD20は後期プレB細胞段階で発現され、最終分化した形質細胞において下方制御される前に、大部分の正常および悪性B系列細胞で上方制御される。このBリンパ球表面分子は、形質細胞へのB細胞の発生および分化に関与する。
リツキシマブは、B細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者において有意な抗腫瘍活性を示すが、B細胞新生物の処置のための抗体治療薬の有効性を改善する必要がある。リツキシマブは単剤療法として50%の臨床応答率をもたらすが、残り50%の患者が応答しない理由は不明である。さらに、応答性の患者の大部分が、さらなるリツキシマブ療法に対する抵抗性を獲得する。初期抵抗性または獲得抵抗性の1つの機構は、腫瘍細胞上のCD20の下方制御もしくは調節(または低発現腫瘍のクローン増殖)である。CD20発現が最小限に抑えられている難治性腫瘍を有するこれらの難治性患者の処置の改善に対する満たされていない明確な医学的要求が存在している。IgAまたはIgMの多価性によって親和性および結合活性を増加させることにより、これらのより新しい薬剤は、リツキシマブと比較して改善された応答率を達成することを目指している。さらに、抗体アイソタイプを変化させることによってエフェクター機能を改変することにより、CD20抗体の効力および有効性が改善されうる。
リツキシマブの導入以来、CD20 mAbの治療効力の潜在的機序について多くのことが学ばれてきた。リツキシマブは、主に補体依存性溶解(CDC)および抗体依存性細胞傷害(ADCC)エフェクター機構を介して、ならびにそれほどではないが、細胞アポトーシスを介してB細胞死を誘導する。CD20抗体は、CD20を界面活性剤耐性の脂質ラフトに、再分布させるタイプI (リツキシマブ/リツキサン(RITUXAN)(登録商標)またはオファツムマブ/アルゼラ(ARZERRA)(登録商標)のような)、再分布させないトシツムマブ(B1)およびオビヌツズマブ/ガジバ(GAZYVA)(登録商標)のようなタイプIIのいずれかとして記述される。タイプI抗体によるクラスター化は、B細胞受容体(BCR)のような他の細胞表面タンパク質との会合、およびC1qへの結合を促進し、強力な補体依存性細胞傷害(CDC)を引き起こす。IgMは、補体依存性細胞傷害を誘導するのに非常に強力であり、したがってIgM形態のCD20抗体は有意により大きな効力をもたらすことができる。対照的に、トシツモマブ(B1)のような、タイプII抗体は、抗体依存性細胞傷害を誘発するが、しかし補体依存性細胞傷害を誘発しない。タイプII抗体は、抗体誘導同型接着およびリソソーム細胞死を介して細胞死を直接誘発するのに非常に強力である。IgAおよびIgMのような、抗体のオリゴマー形態は、多価性の増加を示し、同型接着および細胞死を誘発するうえで有効性の増強を示すことができる。重要なことに、タイプIとタイプIIの両方の抗体は、抗体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞貪食のような細胞エフェクター機能を媒介するためにFcR発現細胞を動員する。
第二世代のタイプI CD20 mAbは、ヒト用に承認されている。オファツムマブは、リツキシマブと比較した場合、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を示すが、より強力な補体依存性細胞傷害(CDC)を有する完全ヒトIgG1タイプI CD20 mAbである。タイプI抗体として、オファツムマブは細胞死を誘発するのに比較的効果がない。オファツムマブは、慢性リンパ性白血病(CLL)の処置のためにFDA承認されている。オビヌツズマブ/GA101は、改善されたアポトーシス促進活性、増強されたADCCを示すが、補体結合活性を示さない、ヒト化IgG1第二世代タイプII mAbである。オビヌツズマブはCLL処置のためにFDA承認されている。効力を増強するために別の完全ヒトIgG1κ CD20抗体huMAb 1.5.3 (米国特許出願公開第2007-0014720号（特許文献1）を参照のこと)をデザインした。前臨床試験により、huMAb 1.5.3がリツキシマブと比較して多くのアポトーシスを有し、強力なCDC活性およびADCC活性の両方を示すことが明らかにされた。HuMAb 1.5.3は、直接的なアポトーシス誘導、CDCおよびADCCによる効果的な細胞殺傷を含めて、タイプIとタイプIIの両方の活性を組み合わせるように思われる。IgMおよびIgAは、CD20低発現腫瘍細胞に対する感受性および細胞傷害の増強を媒介できる増大した結合活性を有するCD20抗体の効力のさらなる増強に寄与することができる。さらに、タイプIおよびタイプII CD20活性の有効性は、IgAまたはIgMの形式で増大させることができ、直接的アポトーシスの誘発、CDCおよびADCCの増強を含む、最適に組み合わされた作用機序を利用する最も強力な抗腫瘍抗体の開発を可能にする。
米国特許出願公開第2007-0014720号
概要
本開示は、少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子を提供し、ここで各結合単位は、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含む。提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むCD20抗原結合ドメインであり、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 39または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 40または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 41または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含み; LCDR1がSEQ ID NO: 43または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 44または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含み; およびLCDR3がSEQ ID NO: 45または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含む。
本開示は、少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子をさらに提供し、ここで各結合単位は、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含む。提供される結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含むCD20抗原結合ドメインであり、ここでVHがSEQ ID NO: 38と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含み、かつVLがSEQ ID NO: 42と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含む。
特定の局面において、本開示により提供される結合分子は、2つの二価IgA結合単位またはその断片およびJ鎖またはその断片もしくは変種を含む二量体結合分子であり、ここで各結合単位は、抗原結合ドメインと各々会合している2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む。本明細書において提供される二量体IgA結合分子は、分泌成分またはその断片もしくは変種をさらに含むことができる。IgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含むことができ、特定の局面において、Cα1ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、IgA重鎖定常領域は、ヒトIgA定常領域であることができる。特定の局面において、各結合単位は、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む。
特定の局面において、本開示により提供される結合分子は、5つまたは6つの二価IgM結合単位をそれぞれ含む五量体または六量体結合分子であり、ここで各結合単位は、抗原結合ドメインと各々会合している2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む。IgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含むことができ、特定の局面において、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
結合分子が五量体である場合、結合分子は、J鎖、またはその断片、またはその機能的断片、またはその機能的変種をさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO：49またはその機能的断片を含む。特定の局面において、J鎖またはその断片は、異種ポリペプチドをさらに含むことができる。異種ポリペプチドは、J鎖またはその断片に直接的または間接的に融合することができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、J鎖またはその断片に間接的に融合することができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、例えば、少なくとも5つのアミノ酸、しかし25以下のアミノ酸を含むことができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは
Figure 2023099206000002
からなる。異種ポリペプチドは、J鎖もしくはその断片のN末端、J鎖もしくはその断片のC末端にもしくはそれらの近傍に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合することができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、結合ドメイン、例えば抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。抗原結合断片は、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドはCD3εに特異的に結合することができる。例えば、特定の局面において、改変J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含むことができる。さらに特定の局面において、これらの特定の改変J鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができ、ここで改変J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む。
特定の局面において、IgM重鎖定常領域は、ヒトIgM重鎖定常領域であることができる。特定の局面において、各結合単位は、IgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む。
特定の局面において、本明細書において提供される多量体結合分子の少なくとも1つの結合単位は、同じものであっても異なるものであってもよいCD20抗原結合ドメインを2つ含む。特定の局面において、同じCD20抗原結合ドメインを少なくとも3コピー、少なくとも4コピー、少なくとも5コピー、少なくとも6コピー、少なくとも7コピー、少なくとも8コピー、少なくとも9コピー、少なくとも10コピー、少なくとも11コピー、または少なくとも12コピー含む。
結合分子がIgM結合分子である特定の局面において、少なくとも1つの結合単位内の2本のIgM重鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56を含む。
結合分子が免疫グロブリン軽鎖を含む特定の局面において、所与の結合単位の2つの軽鎖定常領域は、ヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域であることができる。特定の局面において、2つの軽鎖定常領域は同一であり、かつアミノ酸配列SEQ ID NO: 58を含む。
特定の局面において、本明細書において提供される多量体結合分子の結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一である。
特定の局面において、上記の結合分子は、結合分子の1つまたは複数のCD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力で、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。特定の局面において、単一特異性二価IgG1抗体は1.5.3であり、これはアミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLを含む。特定の局面において、CD20発現細胞はリンパ腫細胞株、例えばRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である。特定の局面において、CD20発現細胞がRaji細胞株である場合、結合分子は、例えばμg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも4分の1、高くとも10分の1、高くとも50分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、CD20発現細胞がRamos細胞株である場合、結合分子は、例えばモル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、CD20発現細胞は、がん、例えば、CD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫を有する対象における悪性B細胞である。特定の局面において、がんは、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である。特定の局面において、対象はヒトである。
本開示は、上記の結合分子を含む組成物をさらに提供する。
本開示は、本明細書において提供される多量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。特定の局面において、本開示は、本明細書において提供される多量体結合分子の重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで重鎖ポリペプチドサブユニットは、IgM重鎖定常領域もしくはその断片またはIgA重鎖定常領域もしくはその断片と、CD20抗原結合ドメインの少なくとも抗体VH部分とを含む。特定の局面において、重鎖ポリペプチドサブユニットは、(a) SEQ ID NO: 39または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含むHCDR1; SEQ ID NO: 40または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むHCDR2; SEQ ID NO: 41または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むHCDR3; あるいは(b) SEQ ID NO: 38と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含むVHのC末端に融合されたヒトIgM定常領域またはその断片を含むことができる。特定の局面において、提供されるポリヌクレオチドは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56をコードすることができる。本開示は、記述のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物をさらに提供する。
提供されるポリヌクレオチド組成物は、例えば軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含むことができ、ここで軽鎖ポリペプチドサブユニットはCD20抗原結合ドメインの抗体VL部分を含む。特定の局面において、軽鎖ポリペプチドサブユニットは、(a) SEQ ID NO: 43または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むLCDR1; SEQ ID NO: 44または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むLCDR2; およびSEQ ID NO: 45または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むLCDR3; あるいは(b) SEQ ID NO: 42と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含むVLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含むことができる。特定の局面において、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 58をコードすることができる。
提供されるポリヌクレオチド組成物の特定の局面において、重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、別々のベクター上にあってもよく、またはそれらは単一のベクター上に位置していてもよい。
提供されるポリヌクレオチド組成物は、例えば、J鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をコードする核酸配列をさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 49またはその機能的断片を含むことができる。さらに、J鎖またはその断片は、異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であることができる。異種ポリペプチドは、特定の局面において、J鎖またはその断片に直接的または間接的に融合することができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、例えば、CD3εに特異的に結合できるscFvであることができる。特定の局面において、改変J鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含むことができる。改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含むそれらの局面において、改変J鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含むことができる。提供されるポリヌクレオチド組成物の特定の局面において、J鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をコードする核酸配列は、SEQ ID NO: 68またはSEQ ID NO: 69を含むことができる。
提供されるポリヌクレオチド組成物の特定の局面において、重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、およびJ鎖をコードする核酸配列は、単一のベクター上に位置していてもよく、またはそれらは2つもしくは3つの別々のベクター上に位置していてもよい。本開示は、提供されたポリヌクレオチド組成物を単独でまたは共同で含む1つまたは複数のベクターをさらに提供する。本開示は、提供されたポリヌクレオチド、提供されたポリヌクレオチド組成物、または提供されたベクターを含む宿主細胞をさらに提供し、ここで宿主細胞は、本明細書において提供される多価抗CD20結合分子を発現することができる。本開示は、本明細書において提供される多価抗CD20結合分子を産生する方法をさらに提供し、ここで本方法は、提供された宿主細胞を培養する段階、および結合分子を回収する段階を含む。
特定の局面において、本開示はCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法を提供し、ここで本方法は、本明細書において提供される多量体結合分子または提供される結合分子を含む組成物とCD20発現細胞を接触させる段階を含む。これらの局面によれば、結合分子は、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。特定の局面において、単一特異性二価IgG1抗体は1.5.3であり、これは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLを含む。特定の局面において、CD20発現細胞はリンパ腫細胞株、例えばRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株またはDB細胞株である。特定の局面において、CD20発現細胞はRaji細胞株であり、結合分子は、例えばμg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも4分の1、高くとも10分の1、高くとも50分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導く。特定の局面において、CD20発現細胞がRamos細胞株である場合、結合分子は、例えばモル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、CD20発現細胞は、がん、例えば、CD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫を有する対象における悪性B細胞である。特定の局面において、がんは、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である。特定の局面において、対象はヒトである。
他の局面において、本開示はCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法を提供し、ここで本方法は、2つ、5つ、または6つの二価結合単位をそれぞれ含む二量体、五量体、または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含み、ここで各結合単位は、2つのIgAもしくはIgM重鎖定常領域またはその断片および2つの抗原結合ドメインを含み、ここで結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインはCD20抗原結合ドメインであり、かつここで結合分子は、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。
これらの提供される方法によれば、CD20抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むことができ、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 2または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 3または1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 4または1つ、2つ、もしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 10またはSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含み; LCDR1がSEQ ID NO: 6または1つ、2つ、もしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 7または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含み; かつLCDR3がSEQ ID NO: 8または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を含む。
これらの提供される方法によれば、CD20抗原結合ドメインは、(a) SEQ ID NO: 1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 5と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; (b) SEQ ID NO: 9と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 11と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; (c) SEQ ID NO: 15と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 18と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; (d) SEQ ID NO: 22もしくはSEQ ID NO: 23と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、もしくはSEQ ID NO: 29と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; (e) SEQ ID NO: 30と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 32と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; または(f) SEQ ID NO: 35と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 37と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列をそれぞれ含むVHおよびVLを含むことができる。
これらの提供される方法によれば、結合分子のIgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含むことができ、1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片は、Cα1ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、IgA重鎖定常領域はヒトIgA定常領域である。特定の局面において、これらの提供される方法による二量体結合分子は、分泌成分をさらに含むことができる。
これらの提供される方法によれば、結合分子のIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含み、特定の局面において、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。特定の局面において、IgM重鎖定常領域はヒトIgM定常領域である。
これらの提供される方法によれば、結合分子が二量体または五量体である場合、結合分子は、J鎖、またはその機能的断片、またはその機能的変種をさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖またはその断片は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 49またはその機能的断片を含む。特定の局面において、J鎖またはその断片は、異種ポリペプチドをさらに含むことができる。異種ポリペプチドは、J鎖またはその断片に直接的または間接的に融合することができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、J鎖またはその断片に間接的に融合することができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、例えば、少なくとも5つのアミノ酸、しかし25以下のアミノ酸を含むことができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは
Figure 2023099206000003
からなる。異種ポリペプチドは、J鎖もしくはその断片のN末端、J鎖もしくはその断片のC末端にもしくはそれらの近傍に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合することができる。特定の局面において、異種ポリペプチドは、結合ドメイン、例えば抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。抗原結合断片は、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。特定の局面において、異種ポリペプチドはCD3εに特異的に結合することができる。例えば、特定の局面において、改変J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含むことができる。さらに特定の局面において、これらの特定の改変J鎖はシグナルペプチドをさらに含むことができ、ここで改変J鎖はアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む。
これらの提供される方法によれば、結合分子の各結合単位は、IgAもしくはIgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgAもしくはIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含むことができる。特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位は、2つの同一のCD20抗原結合ドメインを含み、およびここで少なくとも1つの結合単位内の2本のIgAまたはIgM重鎖が同一である。いくつかの局面において、少なくとも1つの結合単位内の2本のIgM重鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 52を含む。いくつかの局面において、2つの軽鎖定常領域はヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域であり、これは同一であり、かつアミノ酸配列SEQ ID NO: 54を含みうる。
これらの提供される方法によれば、結合分子は、特定の局面において同一でありうる少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインを含むことができる。これらの提供される方法によれば、結合分子内の結合単位の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個が同一でありうる。
これらの提供される方法によれば、参照基準の単一特異性二価IgG1抗体は、リツキシマブであることができ、これは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 5を有するVLを含む。
これらの提供される方法によれば、CD20発現細胞はリンパ腫細胞株、例えばRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株であることができる。特定の局面において細胞株がGranta細胞株である場合、結合分子はリツキシマブの効力の約6倍の効力で細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、ここで細胞株はRaji細胞株またはRamos細胞株であり、かつここで結合分子はリツキシマブの効力の約3倍の効力で細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる。
これらの提供される方法によれば、CD20発現細胞は、がん、例えば、CD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫を有する対象における悪性B細胞であることができる。特定の局面において、がんは、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である。特定の局面において、対象はヒトである。
[本発明1001]
少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むCD20抗原結合ドメインであり、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 39または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 40または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 41または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含み; LCDR1がSEQ ID NO: 43または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 44または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含み; およびLCDR3がSEQ ID NO: 45または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含む、多量体結合分子。
[本発明1002]
少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含むCD20抗原結合ドメインであり、ここでVHがSEQ ID NO: 38と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含み、かつVLがSEQ ID NO: 42と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含む、多量体結合分子。
[本発明1003]
前記結合分子が、2つの二価IgA結合単位またはその断片およびJ鎖またはその断片もしくは変種を含む二量体結合分子であり、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む、本発明1001または本発明1002の結合分子。
[本発明1004]
分泌成分またはその断片もしくは変種をさらに含む、本発明1003の結合分子。
[本発明1005]
IgA重鎖定常領域またはその断片が各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含む、本発明1003の結合分子。
[本発明1006]
1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片が、Cα1ドメインをさらに含む、本発明1005の結合分子。
[本発明1007]
少なくとも1つの結合単位がCD20抗原結合ドメインを2つ含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本の重鎖が同一である、本発明1003～1006のいずれかの結合分子。
[本発明1008]
IgA重鎖定常領域がヒトIgA定常領域である、本発明1003～1007のいずれかの結合分子。
[本発明1009]
各結合単位が、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、本発明1003～1008のいずれかの結合分子。
[本発明1010]
前記結合分子が、5つまたは6つの二価IgM結合単位をそれぞれ含む五量体または六量体結合分子であり、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む、本発明1001または本発明1002の結合分子。
[本発明1011]
IgM重鎖定常領域またはその断片が各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含む、本発明1010の結合分子。
[本発明1012]
1つまたは複数のIgM重鎖定常領域またはその断片が、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、本発明1010または本発明1011の結合分子。
[本発明1013]
五量体であり、かつJ鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をさらに含む、本発明1010～1012のいずれかの結合分子。
[本発明1014]
J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO：49またはその機能的断片を含む、本発明1013の結合分子。
[本発明1015]
J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であり、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、本発明1013または本発明1014の結合分子。
[本発明1016]
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合されている、本発明1015の結合分子。
[本発明1017]
ペプチドリンカーが少なくとも5つのアミノ酸、しかし25以下のアミノ酸を含む、本発明1016の結合分子。
[本発明1018]
ペプチドリンカーが
Figure 2023099206000004
からなる、本発明1017の結合分子。
[本発明1019]
前記異種ポリペプチドが、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合されている、本発明1015～1018のいずれかの結合分子。
[本発明1020]
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、本発明1016～1019のいずれかの結合分子。
[本発明1021]
前記異種ポリペプチドの結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1020の結合分子。
[本発明1022]
抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1021の結合分子。
[本発明1023]
抗原結合断片がscFv断片である、本発明1022の結合分子。
[本発明1024]
前記異種ポリペプチドがCD3εに特異的に結合することができる、本発明1020～1023のいずれかの結合分子。
[本発明1025]
改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含む、本発明1024の結合分子。
[本発明1026]
改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、本発明1025の結合分子。
[本発明1027]
改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む、本発明1026の結合分子。
[本発明1028]
IgM重鎖定常領域がヒトIgM定常領域である、本発明1010～1027のいずれかの結合分子。
[本発明1029]
各結合単位が、IgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、本発明1010～1028のいずれかの結合分子。
[本発明1030]
少なくとも1つの結合単位がCD20抗原結合ドメインを2つ含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本の重鎖が同一である、本発明1010～1029のいずれかの結合分子。
[本発明1031]
少なくとも1つの結合単位内の前記2本のIgM重鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56を含む、本発明1030の結合分子。
[本発明1032]
2つの軽鎖定常領域が、ヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である、本発明1030または本発明1031の結合分子。
[本発明1033]
2つの軽鎖定常領域が、同一であり、かつアミノ酸配列SEQ ID NO: 58を含む、本発明1032の結合分子。
[本発明1034]
CD20抗原結合ドメインを少なくとも3コピー、少なくとも4コピー、少なくとも5コピー、少なくとも6コピー、少なくとも7コピー、少なくとも8コピー、少なくとも9コピー、少なくとも10コピー、少なくとも11コピー、または少なくとも12コピー含む、本発明1010～1033のいずれかの結合分子。
[本発明1035]
結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一である、本発明1034の結合分子。
[本発明1036]
CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力で、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる、本発明1034または本発明1035の結合分子。
[本発明1037]
単一特異性二価IgG1抗体が、1.5.3であり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHとアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLとを含む、本発明1036の結合分子。
[本発明1038]
CD20発現細胞がリンパ腫細胞株である、本発明1036または本発明1037の結合分子。
[本発明1039]
細胞株がRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である、本発明1038の結合分子。
[本発明1040]
CD20発現細胞がRaji細胞株であり、かつ前記結合分子が、μg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも4分の1、高くとも10分の1、高くとも50分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる、本発明1036～1039のいずれかの結合分子。
[本発明1041]
CD20発現細胞がRamos細胞株であり、かつ前記結合分子が、モル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる、本発明1036～1039のいずれかの結合分子。
[本発明1042]
CD20発現細胞が、がんを有する対象における悪性B細胞である、本発明1036の結合分子。
[本発明1043]
がんがCD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、本発明1042の結合分子。
[本発明1044]
がんが、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である、本発明1042または本発明1043のいずれかの結合分子。
[本発明1045]
対象がヒトである、本発明1042～1044のいずれかの結合分子。
[本発明1046]
本発明1001～1045のいずれかの結合分子および担体を含む、組成物。
[本発明1047]
IgM重鎖定常領域もしくはその断片またはIgA重鎖定常領域もしくはその断片と、CD20抗原結合ドメインの少なくとも抗体VH部分とを含む、本発明1001～1045のいずれかの結合分子の重鎖ポリペプチドサブユニット
をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1048]
重鎖ポリペプチドサブユニットが、
(a) SEQ ID NO: 39または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含むHCDR1; SEQ ID NO: 40または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むHCDR2; SEQ ID NO: 41または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むHCDR3; あるいは
(b) SEQ ID NO: 38と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列
を含むVHのC末端に融合されたヒトIgM定常領域またはその断片を含む、本発明1047のポリヌクレオチド。
[本発明1049]
アミノ酸配列SEQ ID NO: 56をコードする、本発明1048のポリヌクレオチド。
[本発明1050]
本発明1047～1049のいずれかのポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1051]
CD20抗原結合ドメインの抗体VL部分を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、本発明1050の組成物。
[本発明1052]
軽鎖ポリペプチドサブユニットが、
(a) SEQ ID NO: 43または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むLCDR1; SEQ ID NO: 44または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むLCDR2; およびSEQ ID NO: 45または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むLCDR3; あるいは
(b) SEQ ID NO: 42と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列
を含むVLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 58をコードする、本発明1052の組成物。
[本発明1054]
重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列が、別々のベクター上にある、本発明1051～1053のいずれかの組成物。
[本発明1055]
重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列および軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列が、単一のベクター上にある、本発明1051～1053のいずれかの組成物。
[本発明1056]
J鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をコードする核酸配列をさらに含む、本発明1050～1055のいずれかの組成物。
[本発明1057]
J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 49またはその機能的断片を含む、本発明1056の組成物。
[本発明1058]
J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であり、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、本発明1056または本発明1057の組成物。
[本発明1059]
前記異種ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明1056～1058のいずれかの組成物。
[本発明1060]
前記異種ポリペプチドが、CD3εに特異的に結合できるscFvを含む、本発明1059の組成物。
[本発明1061]
J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含む、本発明1060の組成物。
[本発明1062]
J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、本発明1061の組成物。
[本発明1063]
改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む、本発明1062の組成物。
[本発明1064]
J鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をコードする核酸配列が、SEQ ID NO: 68またはSEQ ID NO: 69を含む、本発明1056～1062のいずれかの組成物。
[本発明1065]
重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、およびJ鎖をコードする核酸配列が、単一のベクター上にある、本発明1056～1064のいずれかの組成物。
[本発明1066]
重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、およびJ鎖をコードする核酸配列が各々、別々のベクター上にある、本発明1056～1064のいずれかの組成物。
[本発明1067]
本発明1055または本発明1065のベクター。
[本発明1068]
本発明1054または本発明1066のベクター。
[本発明1069]
本発明1047～1049のいずれかのポリヌクレオチド、本発明1050～1066のいずれかの組成物、または本発明1067もしくは本発明1068のベクターを含み、本発明1001～1045のいずれかの結合分子またはそのサブユニットを発現することができる、宿主細胞。
[本発明1070]
本発明1069の宿主細胞を培養する段階、および結合分子を回収する段階を含む、本発明1001～1045のいずれかの結合分子を産生する方法。
[本発明1071]
本発明1001～1045のいずれかの結合分子または本発明1046の組成物とCD20発現細胞を接触させる段階を含む、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法であって、前記結合分子が、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷を導くことができる、方法。
[本発明1072]
単一特異性二価IgG1抗体が、1.5.3であり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHとアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLとを含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
CD20発現細胞がリンパ腫細胞株である、本発明1071または本発明1072の方法。
[本発明1074]
細胞株がRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である、本発明1073の方法。
[本発明1075]
CD20発現細胞がRaji細胞株であり、かつ前記結合分子が、μg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも4分の1、高くとも10分の1、高くとも50分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導く、本発明1071～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
CD20発現細胞がRamos細胞株であり、かつ前記結合分子が、モル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる、本発明1071～1074のいずれかの方法。
[本発明1077]
CD20発現細胞が、がんを有する対象における悪性B細胞である、本発明1071または本発明1072の方法。
[本発明1078]
がんがCD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、本発明1077の方法。
[本発明1079]
がんが、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である、本発明1077～1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
2つ、5つ、または6つの二価結合単位をそれぞれ含む二量体、五量体、または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含む、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法であって、各結合単位が、2つのIgAもしくはIgM重鎖定常領域またはその断片および2つの抗原結合ドメインを含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインがCD20抗原結合ドメインであり、かつ前記結合分子が、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷を導くことができる、方法。
[本発明1081]
CD20抗原結合ドメインが、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 2または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 3または1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 4または1つ、2つ、もしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 10またはSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含み; LCDR1がSEQ ID NO: 6または1つ、2つ、もしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 7または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含み; かつLCDR3がSEQ ID NO: 8または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を含む、本発明1080の方法。
[本発明1082]
CD20抗原結合ドメインが、
(a) SEQ ID NO: 1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 5と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
(b) SEQ ID NO: 9と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 11と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
(c) SEQ ID NO: 15と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 18と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
(d) SEQ ID NO: 22もしくはSEQ ID NO: 23と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、もしくはSEQ ID NO: 29と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
(e) SEQ ID NO: 30と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 32と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; または
(f) SEQ ID NO: 35と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 37と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列
をそれぞれ含むVHおよびVLを含む、本発明1080の方法。
[本発明1083]
IgA重鎖定常領域またはその断片が各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含む、本発明1080～1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片が、Cα1ドメインをさらに含む、本発明1083の方法。
[本発明1085]
IgA重鎖定常領域がヒトIgA定常領域である、本発明1083または本発明1084の方法。
[本発明1086]
前記結合分子が分泌成分をさらに含む、本発明1083～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記結合分子のIgM重鎖定常領域またはその断片が各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含む、本発明1080～1082のいずれかの方法。
[本発明1088]
前記結合分子の1つまたは複数のIgM重鎖定常領域またはその断片が、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記結合分子が、五量体であり、かつJ鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をさらに含む、本発明1083～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO：49またはその機能的断片を含む、本発明1089の方法。
[本発明1091]
J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含み、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、本発明1089または本発明1090の方法。
[本発明1092]
前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合されている、本発明1091の方法。
[本発明1093]
ペプチドリンカーが少なくとも5つのアミノ酸、しかし25以下のアミノ酸を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
ペプチドリンカーが
Figure 2023099206000005
からなる、本発明1093の方法。
[本発明1095]
前記異種ポリペプチドが、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合されている、本発明1091～1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、本発明1091～1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
前記異種ポリペプチドの結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1096の方法。
[本発明1098]
抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1097の方法。
[本発明1099]
抗原結合断片がscFv断片である、本発明1098の方法。
[本発明1100]
前記異種ポリペプチドがCD3εに特異的に結合することができる、本発明1097～1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、本発明1101の方法。
[本発明1103]
改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
IgM重鎖定常領域がヒトIgM定常領域である、本発明1087～1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
前記結合分子の各結合単位が、IgAもしくはIgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgAもしくはIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、本発明1083～1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
前記結合分子の少なくとも1つの結合単位が、2つの同一のCD20抗原結合ドメインを含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本のIgAまたはIgM重鎖が同一である、本発明1105の方法。
[本発明1107]
少なくとも1つの結合単位内の前記2本のIgM重鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 52を含む、本発明1106の方法。
[本発明1108]
2つの軽鎖定常領域がヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である、本発明1107の方法。
[本発明1109]
軽鎖が、同一であり、かつアミノ酸配列SEQ ID NO: 54を含む、本発明1108の方法。
[本発明1110]
前記結合分子が、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインを含む、本発明1080～1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインが同一である、本発明1110の方法。
[本発明1112]
前記結合分子内の結合単位の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個が同一である、本発明1110または本発明1111の方法。
[本発明1113]
単一特異性二価IgG1抗体が、リツキシマブであり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を有するVHとアミノ酸配列SEQ ID NO: 5を有するVLとを含む、本発明1080～1112のいずれかの方法。
[本発明1114]
CD20発現細胞がリンパ腫細胞株である、本発明1080～1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
細胞株がRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である、本発明1114の方法。
[本発明1116]
細胞株がGranta細胞株であり、かつ前記結合分子が、リツキシマブの効力の約6倍の効力で該細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる、本発明1115の方法。
[本発明1117]
細胞株がRaji細胞株またはRamos細胞株であり、かつ前記結合分子が、リツキシマブの効力の約3倍の効力で該細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる、本発明1115の方法。
[本発明1118]
CD20発現細胞が、がんを有する対象における悪性B細胞である、本発明1080～1112のいずれかの方法。
[本発明1119]
がんがCD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、本発明1118の方法。
[本発明1120]
がんが、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である、本発明1118または本発明1119のいずれかの方法。
[本発明1121]
対象がヒトである、本発明1118～1120のいずれかの方法。
CD20分子の分子図。CD20は、抗体結合の際に内部移行なしに主としてB細胞の膜上にとどまる4回膜貫通型の膜タンパク質である。CD20モノクローナル抗体リツキシマブおよびオファツムマブの結合部位が示されている。膜貫通(TM)、細胞外ドメイン(ECD)および細胞質領域の配向を示すために、CD20の線図が含まれている。 IgG、IgM六量体およびIgM五量体の模式図。IgGは、重鎖および軽鎖が示された150 kDaタンパク質として表示されている。J鎖を含むIgMは、およそ915 kDaの五量体として示されている。J鎖を有しないIgMは、およそ1080 kDaの分子量を有する六量体として示されている。 IgGおよびIgMの非還元SDS-PAGE。リツキシマブに基づくIgGおよびIgM CD20抗体は、非還元SDS変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳動する。最初と最後のレーンは分子量標準物質である。マウスおよびヒトIgG1抗体(それぞれ2番目および3番目のレーン)は、およそ150 kDaの分子量を示す。IgM + J鎖型(Invivogenから入手できる市販のCD20 IgM抗体)は、約1050 kDaの分子量(4番目のレーン)を示す。比較用の別のIgMとして抗CDIM抗体IGM-55.5 (PCT公開番号WO 2013/120012を参照のこと) (5番目のレーン)を含めている。 抗CD20 IgMオリゴマーのアセンブリ。非還元SDS-PAGEにより、リツキシマブおよび1.5.3の可変ドメインを含む抗CD20抗体がIgMとしてアセンブリしうることが示される。リツキシマブIgMは第1のパネルに、J鎖なし(レーン2)およびJ鎖あり(レーン3)で示されている。1.5.3 IgMは第2のパネルに、J鎖なし(レーン2)およびJ鎖あり(レーン3)で示されている。 図5A: 高抗原密度(10 μg/ml)でのCD20への1.5.3 IgMおよび1.5.3 IgGの結合を示すELISA結果。図5B: 低抗原密度(0.3 μg/ml)でのCD20への1.5.3 IgMおよび1.5.3 IgGの結合を示すELISA結果。 抗CD20 IgMは、補体依存性細胞傷害において抗CD20 IgGよりも強力である。ヒト培養白血病細胞またはリンパ腫細胞を、市販の抗CD20 IgMまたはIgGに加えて10%ヒト補体とともにインキュベートした。代謝指標色素(CCK8)を用いて4時間後に細胞生存を測定した。リンパ腫細胞株(Granta (図6A)、Raji (図6B)およびRamos (図6C))の大部分において、抗CD20のIgMアイソタイプは、補体の存在下において、対応するIgGアイソタイプよりも強力であった。比較のため、最小限のCD20発現を示すNamalwa細胞(図6E)、およびCD20発現のないNalm-6細胞(図6D)においてもアッセイを行った。 抗CD20 IgMは、μg/ml単位で測定して、Raji細胞株における補体依存性細胞傷害においてリツキシマブよりも強力である。 抗CD20 IgMは、補体依存性細胞傷害において、リツキシマブIgGよりも有効である。Ramos細胞を、漸増濃度の抗CD20 IgMまたはIgGおよび10%ヒト補体とともにインキュベートした。4時間後に細胞生存を測定した。リツキシマブ(IgG)およびリツキシマブ様IgM+J鎖を比較する。各パネル中の表は、EC50の結果をモル濃度で示す。 抗CD20 IgMは、補体依存性細胞傷害において、1.5.3 IgGよりも有効である。Ramos細胞を、漸増濃度の抗CD20 IgMまたはIgGおよび10%ヒト補体とともにインキュベートした。4時間後に細胞生存を測定した。1.5.3 (IgG)、1.5.3 IgMおよび1.5.3 IgM+J鎖を比較する。各パネル中の表は、EC50の結果をモル濃度で示す。 DOHH2およびZ138細胞に対するリツキシマブIgG1 (白丸)、リツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+J (黒丸)、1.5.3 IgG1 (白四角)および1.5.3抗CD20 IgM+J (黒四角)の補体依存性細胞傷害(CDC)活性。 ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによる1.5.3 IgM抗体の特徴付け。レーン凡例: 1: マーカー; 2: 1.5.3 IgM+V15J; 3: 1.5.3 IgM+wtJ; 4: 1.5.3 IgM (六量体); 5: マーカー。図10A: ハイブリッドゲル上の六量体および五量体形態を示す。図10B: 非還元SDS-PAGEによって分析された抗体を示す。図10C: 還元SDS-PAGEによって分析された抗体を示す。図10C中のゲルを膜に転写し、J鎖を、図10Dに示したウエスタンブロッティングにより検出した。 1.5.3 IgM + V15J (黒四角)は、CD20+ RPMI8226細胞および操作されたJurkat T細胞の同時培養でのT細胞活性化を、ブリナツモマブ(黒丸)または1.5.3 IgM + wt J (白四角)よりも高い程度まで誘発する。 (平均蛍光強度またはMFIとして表した)異なるレベルのCD20抗原を各々発現する一連の腫瘍細胞株を用いた、CD20発現に応じての1.5.3 IgM V15JによるT細胞活性化。 KILR(商標)検出アッセイ法を用いたヒト血液中での腫瘍細胞殺傷。凡例: ひし形: 1.5.3 IgM + V15J; 四角: 1.5.3 IgM + 野生型J; 黒丸: 1.5.3 IgG; 白丸 リツキサンIgG; 三角: ブリナツモマブ。 ヒト造血系を作出するためにCD34+細胞を移植したNSGマウスにおけるインビボでのT細胞依存性(directed)のB細胞殺傷。マウスに単一特異性または二重特異性1.5.3 IgMを投薬し、投薬前および投薬後6時間の時点でヒトB細胞の数を測定した。図14A: 野生型J鎖を有する単一特異性抗体の結果を示し、図14B: V15J抗CD3 J鎖を有する二重特異性抗体の結果を示す。 1.5.3+V15J (上列)とリツキシマブ(下列)との間のB細胞殺傷および回復(投薬後10日時点)の比較。
詳細な説明
定義
用語「1つの(a)」または「1つの(an)」の実体は、その実体の1つまたは複数をいう; 例えば、「1つの結合分子(a binding molecule)」は、1つまたは複数の結合分子(one or more binding molecules)を表すと理解される。したがって、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換的に用いることができる。
さらに、「および/または」は、本明細書において用いられる場合、2つの指定された特徴または成分の各々を、他方とともにまたは他方を伴わずに明確に開示することと解釈されるべきである。したがって、本明細書において「Aおよび/またはB」のような句において用いられる「および/または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(のみ)および「B」(のみ)を含むことが意図される。同様に、「A、Bおよび/またはC」のような句において用いられる「および/または」という用語は、以下の態様の各々を包含することが意図される: A、BおよびC; A、BまたはC; AまたはC; AまたはB; BまたはC; AおよびC; AおよびB; BおよびC; A (のみ); B (のみ); ならびにC (のみ)。
特に定義されない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示において用いられる用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、および記号は国際単位系(SI)に認められている形式で表される。数の範囲は、その範囲を規定している数字を含む。特に定めのない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれる。本明細書において提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本開示のさまざまな局面の限定ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってさらに完全に定義される。
本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結された単量体(アミノ酸)から構成される分子をいう。「ポリペプチド」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖をいい、特定の長さの産物をいうのではない。したがって、「ポリペプチド」の定義には、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または2つもしくはそれ以上のアミノ酸の鎖をいうように用いられる任意の他の用語が含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと互換的に用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、および既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾を非限定的に含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物をいうことが意図される。ポリペプチドは、生物学的供給源に由来することができ、または組換え技術によって産生されうるが、しかし必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは、化学合成を含めて、任意の方法で生成することができる。
本明細書において開示されるポリペプチドは、約3もしくはそれ以上、5もしくはそれ以上、10もしくはそれ以上、20もしくはそれ以上、25もしくはそれ以上、50もしくはそれ以上、75もしくはそれ以上、100もしくはそれ以上、200もしくはそれ以上、500もしくはそれ以上、1,000もしくはそれ以上または2,000もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズのものであることができる。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有する必要はない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれているといわれ、規定された三次元構造を保有するのではなく、むしろ多数の異なる立体配座をとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないといわれる。本明細書において用いられる場合、糖タンパク質という用語は、少なくとも1つの炭水化物部分と連結されたタンパク質をいい、炭水化物部分はそのタンパク質にアミノ酸、例えば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してつながれる。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変種または誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。組換えにより産生されたポリペプチドおよび宿主細胞中で発現されたタンパク質は、任意の適当な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、本明細書において開示されるように単離されたとみなされる。
本明細書において用いられる場合、用語「非天然ポリペプチド」またはその任意の文法的異形は、裁判官または行政機関もしくは裁判機関により「天然(に存在する)」と判定もしくは解釈され、または判定もしくは解釈されうるポリペプチドのそれらの形態を明示的に除外するが、しかし除外するだけである条件付きの定義である。
本明細書において開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変種、およびそれらの任意の組み合わせである。本明細書において開示される「断片」、「変種」、「誘導体」および「類似体」という用語は、例えば、抗原に特異的に結合する、対応する天然抗体またはポリペプチドの少なくともいくつかの特性を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、例えば、本明細書の他の箇所で論じられている特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片が含まれる。例えばポリペプチドの変種は、上記のような断片、およびアミノ酸の置換、欠失または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。特定の局面において、変種は非天然に存在することができる。非天然に存在する変種は、当技術分野で公知の突然変異誘発技法を用いて産生することができる。変種ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元のポリペプチドには見られない追加の特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変種ポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」ということができる。本明細書において用いられる場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された1つまたは複数のアミノ酸を有する対象ポリペプチドをいうこともできる。「誘導体」としては、20種の標準アミノ酸の1つまたは複数の誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、プロリンの代わりに4-ヒドロキシプロリンを用いることができ; リジンの代わりに5-ヒドロキシリジンを用いることができ; ヒスチジンの代わりに3-メチルヒスチジンを用いることができ; セリンの代わりにホモセリンを用いることができ; およびリジンの代わりにオルニチンを用いることができる。
「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含めて、当技術分野において定義されている。例えば、フェニルアラニンのチロシンへの置換は保存的置換である。特定の態様において、本開示のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、結合分子が結合する抗原への、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の結合を抑止しない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を識別する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); およびBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)を参照のこと)。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸および複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築体、例えば、メッセンジャーRNA (mRNA)、cDNAまたはプラスミドDNA (pDNA)をいう。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるような、アミド結合)を含むことができる。「核酸」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNA断片をいう。
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から分離された核酸またはポリヌクレオチドの任意の形態を意図する。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチドまたはベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離されて」いると考えられる。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されたポリヌクレオチドセグメント、例えばPCR産物は、「単離されて」いると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは生理食塩水のような非天然溶液中の(部分的にもしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたRNA分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写産物が含まれ、ここで転写産物は自然界に見出されるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位もしくは転写ターミネーターのような調節エレメントであってもよく、またはそれらを含んでもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「非天然ポリヌクレオチド」またはその任意の文法的異形は、裁判官または行政機関もしくは裁判機関により「天然(に存在する)」と判定もしくは解釈され、または判定もしくは解釈されうる核酸またはポリヌクレオチドのそれらの形態を明示的に除外するが、しかし除外するだけである条件付きの定義である。
本明細書において用いられる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)はアミノ酸に翻訳されないとはいえ、コード領域の一部であるとみなすことができるが、しかし任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。2つまたはそれ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築体中に、例えば単一のベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築体中に、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターが単一のコード領域を含有することができ、または2つもしくはそれ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。さらに、ベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、別のコード領域に融合されているかまたは融合されていないかのいずれかの、異種コード領域を含むことができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインのような、特殊なエレメントまたはモチーフをコードするものを非限定的に含む。
特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1つまたは複数のコード領域に機能的に結合されたプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含むことができる。機能的な結合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に配するように1つまたは複数の調節配列と結合している場合である。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、および2つのDNA断片間の連結の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨害しないか、または転写されるDNA鋳型の能力を妨害しない場合、2つのDNA断片(ポリペプチドコード領域およびそれに結合したプロモーターのような)は「機能的に結合して」いる。したがって、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸と、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができたなら、機能的に結合されている。プロモーターは、所定の細胞においてDNAの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであることができる。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に結合させて、細胞特異的な転写を指令することができる。
種々の転写制御領域が当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス(イントロン-Aと組み合わせた、前初期プロモーター)、シミアンウイルス40 (初期プロモーター)およびレトロウイルス(ラウス肉腫ウイルスのような)由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントのような、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が非限定的に含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ-グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適当な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター)が含まれる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント(特に、内部リボソーム侵入部位またはIRES、CITE配列ともいわれる)が含まれるが、これらに限定されることはない。
他の態様において、ポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNA (mRNA)、転移RNAまたはリボソームRNAの形態の、RNAであることができる。
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書において開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合されうる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、粗面小胞体を横切る伸長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドが、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有することができ、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドを産生することを承知している。特定の態様において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、またはそれに機能的に結合されているポリペプチドの分泌を指令する能力を保持するその配列の機能的誘導体が用いられる。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を用いることができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
本明細書において用いられる場合、「CD20」という用語は、Bリンパ球の表面上に発現される膜タンパク質をいう。CD20タンパク質は文献中で、他の名称、例えば、Bリンパ球抗原CD20、Bリンパ球細胞表面抗原B1、Bp35、CVID5、LEU-16、膜貫通4ドメインサブファミリーAメンバー1、または MS4A2によって言及される。ヒトCD20 (GenBank Accession No. NP_690605.1)のアミノ酸配列は、本明細書においてSEQ ID NO: 50 (表2)として開示されている。
本明細書において特定の結合分子、またはその抗原結合断片、変種もしくは誘導体が開示される。完全サイズの抗体に特に言及しない限り、「結合分子」という用語は、完全サイズの抗体ならびにそのような抗体の抗原結合サブユニット、断片、変種、類似体または誘導体、例えば、抗体分子と同じように抗原に結合するが、しかし異なるスキャフォールドを用いる操作された抗体分子または断片を包含する。
本明細書において用いられる場合、「結合分子」という用語はその最も広い意味において、標的または分子決定基、例えば、エピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子をいう。本明細書においてさらに記述されるように、結合分子は、本明細書において記述される1つまたは複数の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定的な例は、抗体または抗原特異的結合を保持するその断片である。
本明細書において用いられる場合、「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」という用語は、エピトープに特異的に結合するのに十分な結合分子の領域をいう。例えば「Fv」、例えば、抗体の可変重鎖および可変軽鎖は、2つの別個のポリペプチドサブユニットまたは単一鎖のいずれかとして、「結合ドメイン」であると考えられる。他の抗原結合ドメインには、非限定的に、ラクダ科の動物種に由来する抗体の可変重鎖(VHH)、またはフィブロネクチンスキャフォールドで発現される6つの免疫グロブリン相補性決定領域(CDR)が含まれる。本明細書において記述される「結合分子」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に用いることができる。抗体(または本明細書において開示されるその断片、変種もしくは誘導体)は少なくとも重鎖の可変ドメイン(ラクダ科の動物種の場合)または少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている(例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988を参照のこと)。特に指定のない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さな抗原結合断片から完全サイズの抗体、例えば、2本の完全な重鎖および2本の完全な軽鎖を含むIgG抗体、4本の完全な重鎖および4本の完全な軽鎖を含み、かつJ鎖および/もしくは分泌成分を含むことができるIgA抗体、または10本もしくは12本の完全な重鎖および10本もしくは12本の完全な軽鎖を含み、かつJ鎖を含むことができるIgM抗体に及ぶいかなるものも包含する。
以下でさらに詳細に論じられるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)として分類され、その中にいくつかのサブクラス(例えば、γ1～γ4 またはα1～α2)があることを認識するであろう。抗体の「アイソタイプ」をそれぞれIgG、IgM、IgA IgGまたはIgEとして決定するのがこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス(サブタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2は、十分に特徴付けられており、機能的特化を付与することが知られている。これらの免疫グロブリンの各々の改変型は、本開示を考慮して当業者に容易に認識され、したがって、本開示の範囲内である。
軽鎖はカッパまたはラムダ(κ、λ)のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンが、例えばハイブリドーマ、B細胞または遺伝子操作された宿主細胞によって発現される場合、2本の重鎖の「尾部」部分が共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Y配置のフォーク端のN末端から各鎖の下部のC末端まで伸びる。特定の抗体、例えば、IgG抗体の基本構造は、ジスルフィド結合を介して共有結合した2つの重鎖サブユニットおよび2つの軽鎖サブユニットを含んで、本明細書において「H2L2」構造ともいわれる「Y」構造または「結合単位」を形成する。
「結合単位」という用語は、標準的な免疫グロブリン構造、例えば、2本の重鎖もしくはその断片および2本の軽鎖もしくはその断片、または、例えばラクダ科の動物もしくは軟骨魚類(condricthoid)の抗体に由来する、2本の重鎖もしくはその断片に対応する、結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の一部分をいうように本明細書において用いられる。特定の局面において、例えば、結合分子が二価IgG抗体またはその抗原結合断片である場合、「結合分子」および「結合単位」という用語は同義である。他の局面において、例えば、結合分子がIgA二量体、IgM五量体またはIgM六量体である場合、結合分子は2つまたはそれ以上の「結合単位」を含む。IgA二量体の場合は2つ、またはIgM五量体もしくは六量体の場合はそれぞれ5つもしくは6つである。結合単位は、完全長の抗体重鎖および軽鎖を含む必要はないが、しかし典型的には二価であり、すなわち、以下に定義されるような2つの「抗原結合ドメイン」を含む。本開示において提供される特定の結合分子は、二量体、五量体または六量体であり、IgAもしくはIgM定常領域またはその断片を含む2つ、5つまたは6つの二価結合単位を含む。本明細書において用いられる場合、2つまたはそれ以上の結合単位、例えば、2つ、5つまたは6つの結合単位を含む結合分子は、「多量体」ということができる。
本明細書において用いられる「天然配列J鎖」または「天然J鎖」という用語は、成熟ヒトJ鎖を含む任意の動物種の天然配列IgMまたはIgA抗体のJ鎖をいい、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 49として提示される。
「改変J鎖」という用語は、異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えば天然配列に導入された外来結合ドメインを含む天然配列J鎖ポリペプチドの変種をいうように本明細書において用いられる。導入は、異種ポリペプチドもしくは他の部分の直接的もしくは間接的な融合を含む任意の手段によって、またはペプチドもしくは化学的リンカーを通じた結合によって達成することができる。「改変ヒトJ鎖」という用語は、非限定的に、SEQ ID NO: 49のアミノ酸配列の天然配列ヒトJ鎖または異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えば外来結合ドメインの導入によって改変されたその機能的断片を包含する。特定の局面において、異種部分は、IgMの五量体へのまたはIgAの二量体への効率的な重合およびそのような重合体の標的への結合を妨害しない。例示的な改変J鎖は、例えば、PCT公開番号WO 2015/153912のなかで見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
用語「結合価」、「二価」、「多価」および文法上の同義語は、所定の結合分子または結合単位中の抗原結合ドメインの数をいう。したがって、所与の結合分子、例えばIgM抗体またはその断片に関して「二価」、「四価」および「六価」という用語は、それぞれ、2つの抗原結合ドメイン、4つの抗原結合ドメインおよび6つの抗原結合ドメインの存在を示す。各結合単位が二価である典型的なIgM由来結合分子では、結合分子それ自体が10または12の結合価を有することができる。各結合単位が二価である典型的なIgA由来結合分子では、結合分子それ自体が4の結合価を有することができる。二価または多価の結合分子は、単一特異性であることができ、すなわち、抗原結合ドメインの全てが同じものであり、または例えば2つもしくはそれ以上の抗原結合ドメインが異なる、例えば、同一抗原上の異なるエピトープに結合するか、もしくは完全に異なる抗原に結合する場合、二重特異性または多重特異性であることができる。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合ができる任意の分子決定基を含む。特定の局面において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面基(surface grouping)を含むことができ、特定の局面において、三次元構造特性、およびまたは特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体によって結合される標的の領域である。
「多特異的結合分子もしくは抗体」または「二重特異性結合分子もしくは抗体」とは、同一または異なる標的上の2つまたはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する結合分子、抗体またはその抗原結合断片をいう。「単一特異性」は、1つのエピトープにのみ結合する能力をいう。
「標的」という用語はその最も広い意味で、結合分子によって結合されうる物質を含むように用いられる。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であることができる。さらに、「標的」は、例えば、結合分子によって結合されうるエピトープを含む細胞、臓器または生物であることができる。
軽鎖と重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に用いられる。これに関して、可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖(CL)および重鎖(例えば、CH1、CH2、CH3またはCH4)の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などのような生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの付番は、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。N末端部分は可変領域であり、C末端部分は定常領域であり; CH3(またはIgMの場合はCH4)およびCLドメインはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端にある。
「完全長IgM抗体重鎖」は、N末端からC末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体重鎖定常ドメイン1 (CM1またはCμ1)、抗体重鎖定常ドメイン2 (CM2またはCμ2)、抗体重鎖定常ドメイン3 (CM3またはCμ3)、および尾部を含みうる抗体重鎖定常ドメイン4 (CM4またはCμ4)を含むポリペプチドである。
「完全長IgA抗体重鎖」は、N末端からC末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体重鎖定常ドメイン1 (CA1またはCα1)、抗体重鎖定常ドメイン2 (CA2またはCα2)、尾部を含みうる抗体重鎖定常ドメイン3 (CA3またはCα3)を含むポリペプチドである。単量体IgAおよび分泌IgAの構造は、例えば、Woof, JM and Russell, MW, Mucosal Immunology 4:590-597 (2011)に記述されている。
上記のように、可変領域(すなわち、「抗原結合ドメイン」)は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、結合分子、例えば抗体の、VLドメインおよびVHドメイン(またはラクダ科の動物もしくは軟骨魚類の抗体の場合VHドメインだけ(VHH)と表される)、または相補性決定領域(CDR)のサブセットが組み合わさって、抗原結合ドメインを形成することができる。より具体的には、抗原結合ドメインは、VHおよびVL鎖の各々の3つのCDR (またはVHHの3つのCDR)によって定義することができる。特定の抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、IgAは、ジスルフィド結合を介して共有結合した2つのH2L2結合単位、J鎖および分泌成分を含む分子を形成することができ; IgMは、ジスルフィド結合を介して共有結合した2つ、5つ、または6つのH2L2結合単位および任意でJ鎖を含む二量体、五量体または六量体分子を形成することができる。
抗体抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体が水性環境においてその3次元配置をとる場合に抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される短い、不連続的なアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域といわれる、抗原結合ドメイン中のアミノ酸残部は、さらに低い分子間変動性を示す。フレームワーク領域は主にβシート立体配座をとり、CDRがループを形成し、これがβシート構造をつなぎ、場合によってはβシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってCDRを正しい配向に位置付けるスキャフォールドを形成するように作用する。配置されたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、その同族エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、さまざまな異なる方法で定義されているため、当業者により、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に識別されうる(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
当技術分野のなかで使用されかつ/または許容されている用語の定義が2つまたはそれ以上ある場合、本明細書において用いられる用語の定義は、明示的に反対の記載がない限り、そのような意味の全てを含むことが意図される。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続的な抗原結合部位を記述するための「相補性決定領域」(「CDR」)という用語の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)により、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)により記述されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。KabatおよびChothiaの定義には、互いに比較した場合にアミノ酸の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変種のCDRをいうためのいずれかの定義(または当業者に公知の他の定義)の適用は、別段の指示がない限り、本明細書において定義および使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記の参考文献の各々によって定義されるようなCDRを包含する適切なアミノ酸は、以下の表1に比較として記載される。特定のCDRを包含する正確なアミノ酸番号は、CDRの配列およびサイズに依って変化するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考えてどのアミノ酸が特定のCDRを構成するかを日常的に決定することができる。
（表１）CDR定義＊
Figure 2023099206000006
＊表1中の全てのCDR定義の付番は、Kabatらにより記載された付番の規則によるものである(下記参照)。
CDRを含む、可変領域セグメントを識別するために、例えば、IMGT情報システム(www://imgt.cines.fr/) (IMGT(登録商標)/V-Quest)を用いて、免疫グロブリン可変ドメインを分析することもできる。例えば、Brochet, X. et al., Nucl. Acids Res. 36:W503-508 (2008)を参照されたい。
Kabatらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の付番システムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えたいずれの実験データにも依らず、この「Kabat付番」システムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書において用いられる場合、「Kabat付番」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)により記載されている付番システムをいう。しかしながら、Kabat付番システムの使用が明示されていない限り、本開示ではアミノ酸配列に連続付番が用いられる。
結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種または誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばFab、Fab'およびF(ab')2、Fd、Fv、一本鎖Fv (scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv (sdFv)、VLドメインまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーによって産生された断片を含むが、これらに限定されることはない。ScFv分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記述されている。
「特異的に結合する」とは、一般に、結合分子、例えば抗体またはその断片、変種もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、およびその結合には抗原結合ドメインとエピトープとの間にいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、結合分子は、その抗原結合ドメインを介して、無作為な、関連のないエピトープに結合するよりも容易に、あるエピトープに結合する場合にそのエピトープに「特異的に結合する」といわれる。「特異性」という用語は本明細書において、特定の結合分子が特定のエピトープに結合する相対的親和性を修飾する(qualify)ために用いられる。例えば、結合分子「A」は、結合分子「B」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「A」は、関連するエピトープ「D」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合するということができる。
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、5×10-2秒-1、10-2秒-1、5×10-3秒-1、10-3秒-1、5×10-4秒-1、10-4秒-1、5×10-5秒-1もしくは10-5秒-1 5×10-6秒-1、10-6秒-1、5×10-7秒-1もしくは10-7秒-1以下の解離速度(k(off))で標的抗原に結合するということができる。
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種または誘導体は、103 M-1秒-1、5×103 M-1秒-1、104 M-1秒-1、5×104 M-1秒-1、105 M-1秒-1、5×105 M-1秒-1、106 M-1秒-1もしくは5×106 M-1秒-1または107 M-1秒-1以上の結合速度(k(on))で標的抗原に結合するということができる。
結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を、ある程度まで、遮断する範囲内でそのエピトープに選択的に結合する場合に、そのエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を競合的に阻害するといわれる。競合的阻害は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば競合ELISAアッセイ法によって判定することができる。結合分子は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%、競合的に阻害するということができる。
本明細書において用いられる場合、「親和性」という用語は、例えば免疫グロブリン分子の、1つまたは複数の抗原結合ドメインとの個々のエピトープの結合強度の尺度をいう。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) 27～28頁を参照されたい。本明細書において用いられる場合、「結合活性」という用語は、抗原結合ドメインの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性をいう。例えば、Harlow 29～34頁を参照されたい。結合活性は、集団における個々の抗原結合ドメインの、特定のエピトープとの親和性と、また、抗原および免疫グロブリンの結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と、重合体のような、高度に反復性のエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合活性の1つであろう。細胞表面上に高い密度で存在する受容体との二価モノクローナル抗体の間の相互作用も、高い結合活性のものであろう。
本明細書において開示される結合分子またはその抗原結合断片、変種または誘導体はまた、その交差反応性に関して記述または特定することができる。本明細書において用いられる場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な、結合分子、例えば抗体またはその断片、変種もしくは誘導体が第2の抗原と反応する能力; 2つの異なる抗原性物質間の関連性の尺度をいう。したがって、結合分子は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に、誘導性エピトープと同じ多くの相補的な構造特性を含み、場合によっては、現に元のものよりも良好に適合することができる。
結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、抗原に対するそれらの結合親和性に関して記述または特定することもできる。例えば、結合分子は、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 Mまたは10-15 M以下の解離定数またはKDで抗原に結合することができる。
一本鎖抗体または他の抗原結合ドメインを含む抗体断片は、単独で、またはヒンジ領域、CH1、CH2、CH3もしくはCH4ドメイン、J鎖、または分泌成分のうちの1つもしくは複数との組み合わせで存在することができる。ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3もしくはCH4ドメイン、J鎖、または分泌成分のうちの1つまたは複数と可変領域との任意の組み合わせを含みうる抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば抗体、またはその抗原結合断片は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物由来であることができる。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体であることができる。別の態様において、可変領域は、起源が軟骨魚類(例えば、サメ由来)であることができる。本明細書において用いられる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、以下におよび例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記述されるように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または1つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな、かつ場合によっては内因性免疫グロブリンを発現でき、一部のものでは発現できない、動物から単離された抗体を含む。
本明細書において用いられる場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、結合分子、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上方、中央および/または下方のヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、またはその変種もしくは断片の少なくとも1つを含むことができる。例えば、結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、VHドメインに加えて、非限定的に、CH1ドメイン; CH1ドメイン、ヒンジおよびCH2ドメイン; CH1ドメインおよびCH3ドメイン; CH1ドメイン、ヒンジおよびCH3ドメイン; またはCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むことができる。特定の局面において、結合分子、例えば抗体またはその断片、変種もしくは誘導体は、VHドメインに加えて、CH3ドメインおよびCH4ドメイン; またはCH3ドメイン、CH4ドメインおよびJ鎖を含むことができる。さらに、本開示で用いるための結合分子は、一定の定常領域部分、例えば、CH2ドメインの全部または一部を欠くことができる。これらのドメイン(例えば、重鎖サブユニット)は、元の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されうることが、当業者によって理解されるであろう。
本明細書において用いられる場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、少なくともVLを含み、CL (例えば、CκまたはCλ)ドメインをさらに含むことができる。
結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、変種もしくは誘導体は、それらが認識または特異的に結合する抗原のエピトープまたは部分に関して記述または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも2つのエピトープを含むことができ、抗原のサイズ、立体配座およびタイプに依って、任意の数のエピトープを含むことができる。
本明細書において用いられる場合、「ジスルフィド結合」という用語は、2つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインはチオール基を構成し、これは第2のチオール基とジスルフィド結合を形成することができまたは架橋することができる。
本明細書において用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第1の種から得られまたは導出され、かつ定常領域(これはインタクトであっても、部分的であってもまたは改変されていてもよい)が第2の種から得られる抗体をいう。いくつかの態様において、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源(例えばマウスまたは霊長類)由来であり、定常領域はヒトのものである。
用語「多重特異性抗体」、例えば「二重特異性抗体」は、単一の抗体分子内に2つまたはそれ以上の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する抗体をいう。標準的な抗体構造に加えて他の結合分子は、2つの結合特異性で構築することができる。二重特異性抗体または多重特異性抗体によるエピトープ結合は、同時または逐次的であることができる。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌できる細胞株の2つの例である。二重特異性抗体は、組換え手段によっても構築することができる(Strohlein and Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010))。二重特異性抗体はダイアボディであることもできる。
本明細書において用いられる場合、「操作された抗体」という用語は、CDRまたはフレームワーク領域のいずれかにおける1つまたは複数のアミノ酸の少なくとも部分的な置換によって重鎖および軽鎖のいずれかまたはその両方における可変ドメインが改変されている抗体をいう。特定の局面において、既知の特異性の抗体由来のCDR全体を、異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。代替CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはサブクラスの抗体に由来することができるが、CDRはまた、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種由来の抗体に由来することができる。既知の特異性の非ヒト抗体由来の1つまたは複数の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植されている操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」といわれる。特定の局面において、CDRの全てがドナー可変領域由来の完全なCDRで置換されているわけではないが、それにもかかわらず、ドナーの抗原結合能力をレシピエント可変ドメインに移すことができる。例えば、米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号および同第6,180,370号に記載されている説明を考慮すれば、日常的な実験を行うことによって、または試行錯誤による試験によって機能的に操作されたまたはヒト化された抗体を得ることは十分に当業者の能力の範囲内であろう。
本明細書において用いられる場合、「操作された」という用語は、合成手段による(例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリングまたはこれらの技法のいくつかの組み合わせによる)核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
本明細書において用いられる場合、用語「連結された」、「融合された」もしくは「融合」または他の文法上の同義語は、互換的に用いることができる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含む何らかの手段による、2つ以上のエレメントまたは成分の結合をいう。「インフレーム融合」は、元のORFの翻訳読み枠を維持する形で、連続的なさらに長いORFを形成させるための2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド読み取り枠(ORF)の結合をいう。したがって、組換え融合タンパク質は、元のORFによってコードされるポリペプチドに対応する2つまたはそれ以上のセグメントを含んだ単一のタンパク質である(このセグメントは、通常、自然界ではそのように結合されていない)。したがって、読み枠は融合セグメントの全体にわたって連続的とされるが、セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって、物理的にまたは空間的に分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合することができるが、「融合された」CDRが連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるCDR領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接するアミノ酸が、ポリペプチドの一次構造において隣接している、アミノ末端からカルボキシル末端の方向へのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端」または「N末端」であるポリペプチドの部分は、連続ポリペプチド鎖において初めの方に来るその部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシ末端」または「C末端」であるポリペプチドの部分は、連続ポリペプチド鎖において後の方に来るその部分である。例えば、典型的な抗体では、可変ドメインは定常領域に対して「N末端」であり、定常領域は可変ドメインに対して「C末端」である。
本明細書において用いられる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスをいう。このプロセスは、非限定的に、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の現れを含む。これには、非限定的に、RNA、例えばメッセンジャーRNA (mRNA)への遺伝子の転写、およびそのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆物質の作出が含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を産生する。本明細書において用いられる場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書において記述される遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化を伴う核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解的切断などを伴うポリペプチドをさらに含む。
「処置する」もしくは「処置」もしくは「処置すること」または「緩和する」もしくは「緩和すること」のような用語は、診断された既存の病的状態または障害を治癒させる、遅らせる、その症状を軽減する、および/またはその進行を止めるもしくは遅くする治療手段をいう。「予防する」、「予防」、「回避する」、「抑止」などのような用語は、診断未確定の標的とされる病的状態または障害の発症を予防する予防的(prophylactic)または予防的(preventative)手段をいう。したがって、「処置を必要としている者」は、既に障害を有する者; 障害を有する傾向がある者; および障害が予防されるべきである者を含むことができる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、農場動物、動物園の動物、スポーツ動物、またはイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどのようなペット動物が含まれる。
本明細書において用いられる場合、「治療から恩恵を受ける対象」および「処置を必要としている動物」のような語句には、1つまたは複数の抗原結合ドメインを含む、抗体のような結合分子の投与から恩恵を受ける、哺乳動物対象のような、対象が含まれる。そのような結合分子、例えば抗体は、例えば、診断手順のためにおよび/または疾患の処置もしくは予防のために用いることができる。
IgM結合分子
IgMは、抗原による刺激に応答してB細胞により産生される最初の免疫グロブリンであり、半減期5日間で血清中に1.5 mg/ml前後で存在する。IgMは二量体、五量体、または六量体分子である。IgM結合単位は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含む。IgGは3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3)を含むが、IgMの重(μ)鎖は、C末端「尾部」を含む第4の定常ドメイン(CH4)をさらに含む。ヒトIgM定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO：47を含む。ヒトCμ1領域はSEQ ID NO: 47のおよそアミノ酸番号5～およそアミノ酸番号102に及び; ヒトCμ2領域はSEQ ID NO: 47のおよそアミノ酸番号114～およそアミノ酸番号205に及び、ヒトCμ3領域はSEQ ID NO: 47のおよそアミノ酸番号224～およそアミノ酸番号319に及び、Cμ4領域はSEQ ID NO: 47のおよそアミノ酸番号329～およそアミノ酸番号430に及び、および尾部はSEQ ID NO: 47のおよそアミノ酸番号431～およそアミノ酸番号453に及ぶ(表2)。
5つのIgM結合単位は、さらなる小さなポリペプチド鎖(J鎖)と複合体を形成してIgM抗体を形成することができる。ヒトJ鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 49を含む(表2)。典型的なIgM五量体が図2に描かれている。J鎖がなければ、IgM結合単位は典型的には六量体にアセンブリする。典型的なIgM六量体が図2に描かれている。理論によって束縛されることを望むわけではないが、六量体または五量体結合分子へのIgM結合単位のアセンブリは、Cμ3およびCμ4ドメインを含むと考えられる。したがって、本開示において提供される六量体または五量体結合分子は、典型的には、少なくともCμ3およびCμ4ドメインを含むIgM定常領域を含む。非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるIgG抗体とIgM抗体の比較を図3に示す。
IgM重鎖定常領域は、Cμ2ドメインもしくはその断片、Cμ1ドメインもしくはその断片、および/または他のIgM重鎖ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、完全IgM重(μ)鎖定常ドメイン(例えば、SEQ ID NO: 47)、またはその変種、誘導体もしくは類似体を含むことができる。
五量体または六量体CD20結合分子
本開示は、六量体または五量体結合分子、すなわち、CD20、例えばヒトCD20に特異的に結合できる、本明細書において定義される5つまたは6つの「結合単位」を有する結合分子を提供する。本明細書において提供される結合分子は、単一の結合単位、例えば、二価IgG抗体から構成される結合分子と比較して、改善された結合特性または生物学的活性を保有することができる。特定の局面において、本開示は、それぞれ、5つまたは6つの二価結合単位を含む五量体または六量体結合分子を提供し、ここで各結合単位は2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgM重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
本明細書において提供される結合分子が五量体である場合、結合分子はJ鎖、またはその機能的断片、またはその変種をさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖は、1つの異種部分または1つもしくは複数の異種部分、例えば異種ポリペプチド配列、例えば天然配列に導入された外来結合ドメインを含む改変J鎖である。特定の局面において、外来結合ドメインはCD3、例えばCD3εに特異的に結合する。特定の局面において、改変J鎖は、V15J (SEQ ID NO: 64)またはJ15V (SEQ ID NO: 66)を含む。
IgM重鎖定常領域は、定常領域が結合分子において所望の機能を果たすことができる、例えば、第2のIgM定常領域と会合して抗原結合ドメインを形成できる、または他の結合単位と会合して六量体または五量体を形成できるならば、Cμ1ドメイン、Cμ2ドメイン、Cμ3ドメイン、および/またはCμ4ドメインのうちの1つまたは複数を含むことができる。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ3ドメインもしくはその断片、Cμ4ドメインもしくはその断片、尾部(TP)もしくはその断片、またはCμ3ドメイン、CμドメインおよびTPもしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ2ドメインもしくはその断片、Cμ1ドメインもしくはその断片、またはCμ1ドメインもしくはその断片およびCμ2ドメインもしくはその断片をさらに含む。
特定の局面において、所与の結合単位における2つのIgM重鎖定常領域の各々は、抗原結合ドメイン、例えば抗体のFv部分、例えばヒトまたはマウス抗体のVHおよびVLと会合している。本明細書において提供される結合分子において、結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、抗CD20抗原結合ドメイン、すなわちCD20、例えばヒトCD20に特異的に結合できる抗原結合ドメインである。
IgA結合分子
IgAは粘膜免疫の一翼を担い、産生される全免疫グロブリンの約15%を構成する。IgAは単量体または二量体分子である。IgA結合単位は、典型的には、2本の軽鎖および2本の重鎖を含む。IgAは、3つの重鎖定常ドメイン(Cα1、Cα2およびCα3)を含み、C末端「尾部」を含む。ヒトIgAは2つのサブタイプ、IgA1およびIgA2を有する。ヒトIgA1定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO: 59を含む。ヒトCα1領域はSEQ ID NO: 59のおよそアミノ酸番号6～およそアミノ酸番号98に及び; ヒトCα2領域はSEQ ID NO: 59のおよそアミノ酸番号125～およそアミノ酸番号220に及び、ヒトCα3領域はSEQ ID NO: 59のおよそアミノ酸番号228～およそアミノ酸番号330に及び、および尾部はSEQ ID NO: 59のおよそアミノ酸番号331～およそアミノ酸番号352に及ぶ(表2)。ヒトIgA2定常領域は、典型的には、アミノ酸配列SEQ ID NO: 60を含む。ヒトCα1領域はSEQ ID NO: 60のおよそアミノ酸番号6～およそアミノ酸番号98に及び(表2); ヒトCα2領域はSEQ ID NO: 60のおよそアミノ酸番号112～およそアミノ酸番号207に及び、ヒトCα3領域はSEQ ID NO: 60のおよそアミノ酸番号215～およそアミノ酸番号317に及び、および尾部はSEQ ID NO: 60のおよそアミノ酸番号318～およそアミノ酸番号340に及ぶ。
2つのIgA結合単位は、2本のさらなるポリペプチド鎖、J鎖(SEQ ID NO: 49)および分泌成分(SEQ ID NO: 62)との複合体を形成して、分泌IgA (sIgA)抗体を形成することができる。理論によって束縛されることを望むわけではないが、IgA結合単位の二量体sIgA結合分子へのアセンブリは、Cα3および尾部ドメインを含むと考えられる。したがって、本開示において提供される二量体sIgA結合分子は、典型的には、少なくともCα3および尾部ドメインを含むIgA定常領域を含む。
IgA重鎖定常領域は、Cα2ドメインもしくはその断片、Cα1ドメインもしくはその断片、および/または他のIgA重鎖ドメインをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される結合分子は、完全IgA重(α)鎖定常ドメイン(例えば、SEQ ID NO: 59もしくはSEQ ID NO: 60)、またはその変種、誘導体もしくは類似体を含むことができる。
二量体CD20結合分子
本開示は、二量体結合分子、例えばCD20、例えばヒトCD20に特異的に結合できる、本明細書において定義される2つのIgA「結合単位」を有する結合分子を提供する。本明細書において提供される二量体結合分子は、単一の結合単位、例えば、二価IgG抗体から構成される結合分子と比較して、改善された結合特性または生物学的活性を保有することができる。例えば、IgA結合分子は粘膜部位に到達し、本明細書において提供される結合分子に対してさらに大きな組織分布をもたらすことができる。特定の局面において、本開示は、2つの二価結合単位を含む二量体結合分子を提供し、ここで各結合単位は2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む。特定の局面において、2つのIgA重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
本明細書において提供される二量体IgA結合分子は、J鎖、またはその断片、またはその変種をさらに含むことができる。本明細書において提供される二量体IgA結合分子は、分泌成分、またはその断片、またはその変種をさらに含むことができる。特定の局面において、J鎖は、1つの異種部分または1つもしくは複数の異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えば天然配列に導入された外来結合ドメインを含む改変J鎖である。特定の局面において、外来結合ドメインはCD3、例えばCD3εに特異的に結合する。特定の局面において、改変J鎖は、V15J (SEQ ID NO: 64)またはJ15V (SEQ ID NO: 66)を含む。
IgA重鎖定常領域は、定常領域が結合分子において所望の機能を果たすことができる、例えば、軽鎖定常領域と会合して抗原結合ドメインの形成を促進できる、または別のIgA結合単位と会合して二量体結合分子を形成できるならば、Cα1ドメイン、Cα2ドメイン、および/またはCα3ドメインのうちの1つまたは複数を含むことができる。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα3ドメインもしくはその断片、尾部(TP)もしくはその断片、またはCα3ドメイン、TPもしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgA重鎖定常領域またはその断片は各々、Cα2ドメインもしくはその断片、Cα1ドメインもしくはその断片、またはCα1ドメインもしくはその断片およびCα2ドメインもしくはその断片をさらに含む。
特定の局面において、所与の抗原結合ドメインにおける2つのIgA重鎖定常領域の各々は、抗原結合ドメイン、例えば抗体のFv部分、例えばヒトまたはマウス抗体のVHおよびVLと会合している。本明細書において提供される結合分子において、結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、CD20抗原結合ドメイン、例えばヒトCD20抗原結合ドメインであることができる。
改変J鎖
特定の局面において、本明細書において提供されるCD20結合分子は、改変J鎖を組み入れて、二重特異性であることができる。本明細書においておよびPCT公開番号WO 2015/153912において提供されるように、改変J鎖は異種部分、例えば異種ポリペプチド、例えば外来結合ドメインを含むことができ、これは、例えば、ある標的に特異的に結合できるポリペプチド結合ドメインを含むことができる。結合ドメインは、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、抗体-薬物結合体もしくはその抗原結合断片、または抗体様分子であることができる。ポリペプチド結合ドメインは、付加の位置およびタイプを適切に選択すること(例えば直接的または間接的な融合、化学的連結など)によって、J鎖に導入することができる。
特定の局面において、結合ドメインは、単一特異性、二重特異性および多重特異性抗体および抗体断片を含む、抗体または抗体の抗原結合断片であることができる。抗体断片は、非限定的に、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、scFv、(scFv)2断片、一本鎖抗体分子、ミニボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であることができる。特定の局面において、抗体断片はscFvである。
他の局面において、結合ドメインは、抗体様分子、例えば、ヒトドメイン抗体(dAb)、二重親和性再標的（DART）分子、ダイアボティ、ジ・ダイアボティ、二重可変ドメイン抗体、スタックド可変ドメイン(Stacked Variable Domain)抗体、小分子免疫製剤(Small Modular Immuno Pharmaceutical; SMIP)、サロボディ(Surrobody)、鎖交換操作ドメイン(SEED)-ボディ、またはTandAbであることができる。
結合ドメインは、レシピエントIgMもしくはIgA分子のその結合標的への結合またはIgA二量体もしくはIgM五量体に効果的に組み入れられるJ鎖の能力を妨害することなく、その結合標的への結合ドメインの結合を可能にする任意の位置で天然J鎖配列に導入することができる。特定の局面において、結合ドメインは、C末端の位置もしくは近傍に、成熟N末端(すなわち、シグナルペプチド切断後のSEQ ID NO: 49のアミノ酸番号23)の位置もしくは近傍に、またはJ鎖の三次元構造に基づき、アクセス可能である内部位置に挿入することができる。特定の局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO: 49のヒトJ鎖の、C末端からの約10残基なしでまたは成熟N末端からの約10アミノ酸残基なしで天然配列J鎖に導入することができる。別の局面において、結合ドメインはSEQ ID NO: 49の天然配列ヒトJ鎖へSEQ ID NO: 49のシステイン残基114と123の間に、または別の天然配列J鎖の等価な位置に導入することができる。さらなる局面において、結合ドメインは、SEQ ID NO: 49のJ鎖のような、天然配列J鎖へ、グリコシル化部位の位置または近傍に導入することができる。特定の局面において、結合ドメインはSEQ ID NO: 49の天然配列ヒトJ鎖へC末端からの約10アミノ酸残基以内に導入することができる。
導入は、直接的または間接的な融合により、すなわちペプチドリンカー有りまたは無しで、コードヌクレオチド配列のインフレームでの組み合わせによる、1本のポリペプチド鎖におけるJ鎖および結合ドメインの組み合わせにより達成することができる。ペプチドリンカー(間接的な融合)は、使用される場合、長さが約1～50アミノ酸、または約1～40アミノ酸、または約1～30アミノ酸、または約1～20アミノ酸、または約1～10アミノ酸、または約10～20アミノ酸であることができ、J鎖配列に導入させたい結合ドメインの一端または両端に存在することができる。特定の局面において、ペプチドリンカーは、約10～20、または10～15アミノ酸長である。特定の局面において、ペプチドリンカーは15アミノ酸長である。特定の局面において、ペプチドリンカーは、(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 67)である。
2つ以上の異種ポリペプチド、例えば2つ以上の結合ドメインをJ鎖に導入することも可能である。
改変J鎖は組換えDNA技術の周知の技法により、適当な原核または真核宿主生物において改変J鎖をコードする核酸を発現させることにより産生することができる。
改変J鎖はまた、本明細書の他の箇所に記述されるように、レシピエントIgMまたはIgA結合分子の重鎖および軽鎖と同時発現させることもできる。レシピエント結合分子は、改変J鎖の組み入れの前に、単一特異性、二重特異性または多重特異性、例えば、単一特異性、二重特異性または多重特異性IgAまたはIgM抗体であることができる。抗体を含む、二重特異性および多重特異性IgMおよびIgA結合分子は、例えば、米国特許出願第61/874,277号および同第61/937,984号に記述されており、それらの内容全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
特定の局面において、本明細書において記述される抗CD20 IgMまたはIgA結合分子は、T細胞、NK細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫エフェクター細胞に対する結合特異性を有する改変J鎖を含むことができる。特定の局面において、エフェクター細胞はT細胞であり、結合標的はCD3である(以下で論じられる)。エフェクター細胞、例えばエフェクターT細胞を活性化させ、CD20発現B細胞、例えば悪性B細胞に再配向させることにより、本明細書において提供される二重特異性抗CD20×抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、標的に対して増強された免疫応答、例えば、補体媒介性細胞傷害および/または抗体依存性細胞傷害(ADCC)を含む応答をもたらし、それによって効力および効能を増加させることができる。特定の局面において、改変J鎖を含む本明細書において提供される二重特異性抗CD20×抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、B細胞に関連するがんの処置のために用いることができる。
T細胞の場合、分化クラスター3 (CD3)は、歴史的にT3複合体として知られている多量体タンパク質複合体であり、3組の二量体(εγ, εδ, ζζ)としてアセンブリかつ機能する4本の異なるポリペプチド鎖(ε, γ, δ, ζ)から構成される。CD3複合体は、T細胞受容体(TCR)と非共有結合的に会合するT細胞共受容体として働く。このCD3複合体の成分、特にCD3εは、本明細書において提供される二重特異性IgMまたはIgA結合分子の改変J鎖の標的でありうる。
特定の局面において、二重特異性抗CD20×抗CD3 IgMまたはIgA結合分子は、抗体結合ドメインを介してCD20に結合するが、J鎖はCD3εに結合するように改変される。
特定の局面において、本明細書において提供される改変J鎖の抗CD3ε結合ドメインは、scFvである。抗CD3ε scFvは直接的にまたはscFvとJ鎖配列の間に導入される合成リンカー、例えば、(GGGGS)3リンカー(SEQ ID NO: 67)により間接的にJ鎖のN末端の位置もしくは近傍に、またはJ鎖のC末端の位置もしくは近傍に融合することができる。特定の局面において、scFvはビシリズマブ(ヌビオン(Nuvion))のVHおよびVL領域を含む。特定の局面において、改変J鎖は、ビシリズマブのVH、(GGGGS)3リンカーおよびビシリズマブのVLを含むscFvを含む。
特定の局面において、改変J鎖、つまり本明細書においてV15Jといわれる改変J鎖は、15アミノ酸の(GGGGS)3リンカーを通じてヒトJ鎖のN末端に融合されたビシリズマブのscFvを含む。V15Jは、IgMまたはIgA結合分子への輸送およびアセンブリを促進するためのシグナルペプチドをさらに含むことができる。成熟V15Jタンパク質はSEQ ID NO: 64として提示されており、19アミノ酸の免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドを含む前駆体型がSEQ ID NO: 63として提示されている。特定の局面において、改変J鎖、つまり明細書においてJ15Vといわれる改変J鎖は、15アミノ酸の(GGGGS)3リンカーを通じてヒトJ鎖のC末端に融合されたビシリズマブのscFvを含む。J15Vは、IgMまたはIgA結合分子への輸送およびアセンブリを促進するためのシグナルペプチドをさらに含むことができる。成熟J15Vタンパク質はSEQ ID NO: 65として提示されており、22アミノ酸のヒトJ鎖シグナルペプチドを含む前駆体型がSEQ ID NO: 66として提示されている。特定の局面において、他のシグナルペプチドを用いることができる。本明細書において提供される抗CD20 IgMまたはIgA結合分子への改変J鎖の発現、分泌および組み入れを促進するのに適したシグナルペプチドの選択および包含は、十分に当業者の能力の範囲内である。
CD20結合ドメイン
特定の局面において、CD20抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここで少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCDRが、米国特許出願公開第2007-0014720号に開示される1.5.3の対応するCDRに関連する。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 39または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含むHCDR1を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 40または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むHCDR2を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 41または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むHCDR3を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 43または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むLCDR1を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 44または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むLCDR2を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 45または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むLCDR3を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、上記のようにCDRアミノ酸配列のいずれか1つ、いずれか2つ、いずれか3つ、いずれか4つ、いずれか5つまたは全6つを含むことができる。特定の局面において、CD20抗原結合ドメインは、アミノ酸配列SEQ ID NO：39を含むHCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO：40を含むHCDR2、アミノ酸配列SEQ ID NO：41を含むHCDR3、アミノ酸配列SEQ ID NO: 43を含むLCDR1、アミノ酸配列SEQ ID NO: 44を含むLCDR2、およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 45を含むLCDR3を含む。
特定の局面において、CD20抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、ここでVH領域、VL領域、またはVH領域とVL領域の両方が、米国特許出願公開第2007-0014720号に開示される1.5.3の対応するVHおよびVLに関連する。特定の局面において、VHはSEQ ID NO: 38と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含むことができる。特定の局面において、VLはSEQ ID NO: 42と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含むことができる。特定の局面において、VHはアミノ酸配列SEQ ID NO: 38を含み、VLはアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を含む。
種々の異なる二量体、五量体または六量体の結合分子は、本開示に基づき当業者によって企図されることができ、したがって本開示に含まれるが、特定の局面において、IgAもしくはIgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgAもしくはIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを各結合単位が含む、上記の結合分子が提供される。
さらに、特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位、または結合分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位が、上記のCD20抗原結合ドメインを2つ含む。特定の局面において、結合分子の結合単位、または結合分子の2つ、3つ、4つ、5つもしくは6つの結合単位における2つのCD20抗原結合ドメインは、互いに異なっていてもよく、またはそれらは同一であってもよい。
特定の局面において、結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位内の2本のIgM重鎖は同一である。特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位内の2本の同一のIgM重鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56を含む。
特定の局面において、結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位内の2本の軽鎖は同一である。特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位内の2本の同一の軽鎖は、κ軽鎖、例えば、ヒトκ軽鎖、またはλ軽鎖、例えばヒトλ軽鎖である。特定の局面において、結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位内の2本の同一の軽鎖は各々、アミノ酸配列SEQ ID NO: 58を含む。
特定の局面において、本開示により提供される二量体、五量体または六量体結合分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つの結合単位は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56を各々含む2本の同一のIgM重鎖と、アミノ酸配列SEQ ID NO: 58を各々含む2本の同一の軽鎖とを含む、または各々含む。この局面によれば、結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位におけるCD20抗原結合ドメインは、同一であることができる。さらにこの局面によれば、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体結合分子は、上記のCD20抗原結合ドメインを少なくとも1コピー、少なくとも2コピー、少なくとも3コピー、少なくとも4コピー、少なくとも5コピー、少なくとも6コピー、少なくとも7コピー、少なくとも8コピー、少なくとも9コピー、少なくとも10コピー、少なくとも11コピー、または少なくとも12コピー含むことができる。特定の局面において、結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一であることができ、特定の局面において、結合単位は同一の抗原結合ドメインを含むことができ、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインが同一であることができる。特定の局面において、同一のCD20抗原結合ドメインは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVH、およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLを含むことができる。
特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、他の結合分子と比較して有利な構造的または機能的特性を保有することができる。例えば、二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、対応する結合分子、例えば米国特許出願公開第2007-0014720号に開示されるIgG1 1.5.3よりも、インビトロまたはインビボのいずれかで、生物学的アッセイ法において改善された活性を保有することができる。生物学的アッセイ法には、補体依存性細胞傷害(CDC)および抗体依存性細胞傷害(ADCC)が含まれるが、これらに限定されることはない。
特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体結合分子は、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片、例えば、ヒトIgG1ならびにアミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLを含むIgG1型の1.5.3よりも高い効力で、CD20発現細胞、例えばCD20発現B細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体結合分子は、例えばリツキシマブ(Genentech)、オファツムマブ(Glaxo SmithKline)、ベルツズマブ(Takeda)、オカラツズマブ(Lilly)、トシツモマブ(tositumumab) (Glaxo SmithKline)またはオビヌツズマブ(Roche/Genentech)と同じVHおよびVL領域であるか、またはそれを含む等量の単一特異性二価CD20モノクローナル抗体またはその断片よりも高い効力で、CD20発現細胞、例えばCD20発現B細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。
「効力」とは、所与の生物学的結果、例えば所定のアッセイ法、例えばCDCまたはADCCアッセイ法での細胞50%の殺傷(IC50)を達成するのに必要な所与の結合分子の最少量を意味する。効力は、細胞の生存%がY軸上にあり、結合分子濃度(例えば、μg/mlまたはμM単位の)がX軸上にある曲線として表すことができる。
特定の局面において、CDCはインビトロで測定することができ、CD20発現細胞は不死化細胞株、例えばB細胞リンパ腫細胞株、例えばRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、 Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株であることができる。同様の細胞株が公知であり、当業者によって容易に得られる。
特定の局面において、CDCはインビトロまたはインビボで測定または実証することができ、CD20発現細胞株は、がん、例えばB細胞に関連するリンパ腫、白血病または骨髄腫を有する対象、例えばヒト患者から得られる、またはそれらにおける悪性B細胞である。特定の局面において、がんは、従来の治療法、例えば化学療法、または、例えばリツキシマブ(Genentech)、オファツムマブ(Glaxo SmithKline)、ベルツズマブ(Takeda)、オカラツズマブ(Lilly)、トシツモマブ(tositumumab) (Glaxo SmithKline)またはオビヌツズマブ(Roche/Genentech)のうちの1つもしくは複数を用いたモノクローナル抗体療法に最小応答性または非応答性である。特定の局面において、本明細書に、例えば表5に記述される結合ドメインのいずれか1つまたは複数を含む二量体、五量体または六量体結合分子が提供される。
特定の局面において、ADCCは、T細胞活性化アッセイ法により、例えば、本明細書において提供される二重特異性抗CD20×抗CD3 IgM結合分子の存在下でCD20発現B細胞および操作されたCD3発現T細胞を同時培養し、サイトカイン放出、標的細胞溶解または他の検出方法を通じてT細胞活性化を測定することによりインビトロで測定することができる。特定の局面において、ADCCは、T細胞依存性のB細胞殺傷によって測定することができる。特定の局面において、CD20発現細胞は不死化細胞株、例えばB細胞リンパ腫細胞株、例えばRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、 Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株であることができる。同様の細胞株が公知であり、当業者によって容易に得られる。特定の局面において、CD20発現細胞株は、B細胞に関連するがんに罹患している患者に由来することができる。
特定の局面において、例えばCDC、ADCCおよび他の殺傷の様式、例えばアポトーシスによる、CD20+細胞の殺傷の全体を、T細胞および補体の両方を含む全血を用いたアッセイ法においてインビトロで試験することができる。
特定の局面において、例えば、結合分子が、例えばCD20発現Raji細胞株を用いCDCアッセイ法において試験された、例えば1.5.3のVHおよびVL、を有する2つの同一のCD20結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合単位を含む五量体結合分子である場合、結合分子は、例えばμg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体、例えば1.5.3またはリツキシマブのIC50の高くとも1分の1、高くとも2分の1、高くとも3分の1、高くとも4分の1、高くとも5分の1、高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも100分の1、高くとも150分の1、高くとも200分の1の、またはそれより低いIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、CD20発現細胞がRamos細胞株である場合、結合分子は、例えばモル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。
特定の局面において、例えば1.5.3のVHおよびVL、またはリツキシマブのVHおよびVLに加えて、本明細書において提供される改変J鎖または野生型J鎖、を有する2つの同一の結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合単位を含む五量体結合分子は、より低いCD20発現レベルを示す細胞において行ったCDCアッセイ法において効力の増大を示すことができる。例えば、D20発現DoHH2 (CD20高発現)およびZ138 (CD20低発現)細胞株を用いたCDCアッセイ法で試験された、リツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+Jまたは1.5.3抗CD20 IgM+Jは、例えばモル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体等価体、例えばリツキシマブ(IgG1)または1.5.3 (IgG1)のIC50の高くとも1分の1、高くとも2分の1、高くとも3分の1、高くとも4分の1、高くとも5分の1、高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも100分の1、高くとも150分の1、高くとも200分の1の、またはそれより低いIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、Z138 (CD20低発現)細胞株を用いたCDCアッセイ法で試験された、リツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+Jまたは1.5.3抗CD20 IgM+Jは、100 nMの濃度でさえも等価なIgG分子を用いて50%殺傷(EC50)を達成できないような条件の下で、補体媒介性の細胞株殺傷を導くことができる。
特定の局面において、例えば1.5.3のVHおよびVL、またはリツキシマブのVHおよびVLに加えて、本明細書において提供される、ヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えばV15JまたはJ15V、を有する2つの同一のCD20結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合単位を含む二重特異性の五量体結合分子は、ADCCアッセイ法において効力の増大を示すことができる。例えば、例えば操作されたJurkat T細胞と同時培養されたCD20発現DB細胞株を用い、T細胞活性化アッセイ法において試験された、リツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+ V15JもしくはJ15V、または1.5.3抗CD20 IgM+ V15JもしくはJ15Vは、B細胞およびT細胞に結合する等量の一価二重特異性結合分子、例えば二重特異性抗CD19(一価)×抗CD3(一価)分子ブリナツモマブのIC50の高くとも1分の1、高くとも2分の1、高くとも3分の1、高くとも4分の1、高くとも5分の1、高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも100分の1、高くとも150分の1、高くとも200分の1の、またはそれより低いIC50でT細胞媒介性殺傷を促進することができる。
特定の局面において、例えば1.5.3のVHおよびVL、またはリツキシマブのVHおよびVLに加えて、本明細書において提供される、ヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えばV15JもしくはJ15Vまたは野生型J鎖、を有する2つの同一の結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合単位を含む単一特異性または二重特異性の五量体結合分子は、全血インビトロ細胞傷害アッセイ法において効力の増大を示すことができる。例えば、ヒルジン抗凝固ヒト血液と同時培養されたCD20発現KILR(商標) ARH-77細胞株を用いKILR(商標)インビトロ細胞傷害アッセイ法で試験された、1.5.3 抗CD20 IgM+ V15JもしくはJ15V、または1.5.3抗CD20 IgM+Jは、等量の単一特異性二価抗CD20結合分子、例えば1.5.3 IgG、またはB細胞およびT細胞に結合する一価二重特異性結合分子、例えば二重特異性抗CD19 (一価)×抗CD3 (一価)分子ブリナツモマブのIC50の高くとも1分の1、高くとも2分の1、高くとも3分の1、高くとも4分の1、高くとも5分の1、高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも100分の1、高くとも150分の1、高くとも200分の1の、またはそれより低いIC50でKILR(商標) ARH-77細胞株の殺傷を達成することができる。
特定の局面において、例えば1.5.3のVHおよびVL、またはリツキシマブのVHおよびVLに加えて、本明細書において提供される、ヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えばV15JもしくはJ15Vまたは野生型J鎖、を有する2つの同一の結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合単位を含む単一特異性または二重特異性の五量体結合分子は、インビボで、例えば本明細書の他の箇所に記述されるヒト化マウスモデルで、有意なB細胞殺傷を示すことができる。
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本開示は、上記の二量体、五量体または六量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換えおよび/または非天然のポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳されうる結合分子、結合単位または抗原結合ドメインの一部分を意味する。例としては、非限定的に、抗体可変ドメイン、例えばVHもしくはVL、一本鎖Fv、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、および/またはそれらの任意の断片が挙げられる。
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、IgAまたはIgM重鎖定常領域および少なくともCD20抗原結合ドメインの抗体VH部分を含むことができる。特定の局面において、ポリヌクレオチドは、VHのC末端に融合されたヒトIgAもしくはIgM定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、ここでVHはHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 39または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 40または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 41または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含み; あるいはVHはSEQ ID NO: 38と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含む。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56を含む。
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、上記のCD20抗原結合ドメインの抗体VL部分を含むことができる。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、VLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含むことができ、ここでVLはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここでLCDR1がSEQ ID NO: 43または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 44または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含み; かつLCDR3がSEQ ID NO: 45または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含み; あるいはVLはSEQ ID NO: 42と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含む。特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 58を含む。
特定の局面において、ポリペプチドサブユニットは、上記におよび/または表5に記述したVHまたはVLアミノ酸配列のいずれか1つまたは複数を含むCD20抗原結合ドメインの抗体VH部分または抗体VL部分を含むことができる。
本開示は、上記の二量体、五量体または六量体結合分子を共同でコードしうる、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む組成物をさらに提供する。特定の局面において、組成物は、IgAもしくはIgM重鎖またはその断片、例えば、少なくともCD20抗原結合ドメインVHを含む上記のヒトIgAもしくはIgM重鎖をコードするポリヌクレオチド、および軽鎖またはその断片、例えば、少なくともCD20抗原結合ドメインVLを含むヒトκまたはλ軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。提供されるポリヌクレオチド組成物は、J鎖、例えばヒトJ鎖またはその断片またはその変種をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される組成物を構成するポリヌクレオチドは、2つまたは3つの別々のベクター、例えば発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。特定の局面において、本明細書において提供される組成物を構成する2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、単一のベクター、例えば発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。
本開示は、本明細書において提供される二量体、五量体もしくは六量体CD20結合分子、またはそのいずれかのサブユニットをコードする1つのポリヌクレオチドまたは2つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド、本明細書において提供されるポリヌクレオチド組成物、あるいは本明細書において提供される二量体、五量体もしくは六量体CD20結合分子、またはそのいずれかのサブユニットをコードする1つのベクターまたはそれらを共同でコードする2つ、3つもしくはそれ以上のベクターを含む、宿主細胞、例えば原核生物または真核生物の宿主細胞をさらに提供する。特定の局面において、本開示により提供される宿主細胞は、本開示により提供される二量体、五量体もしくは六量体CD20結合分子、またはそのサブユニットを発現することができる。
関連する局面において、本開示は、本開示により提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子を産生する方法を提供し、ここで本方法は、上記の宿主細胞を培養する段階、および結合分子を回収する段階を含む。
使用方法
本開示は、二量体、五量体または六量体IgAまたはIgMに基づくCD20結合分子を用いて、CD20を発現する細胞、例えばB細胞、例えば悪性または不死化B細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための改善された方法を提供する。以下に記述される方法では、米国特許出願公開第2007-0014720号に開示される1.5.3、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブまたはその変種、誘導体もしくは類似体を非限定的に含む、任意のCD20抗体に由来するCD20抗原結合ドメインを含む結合分子を利用することができ、ここで二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、同じ抗原結合ドメインを含む、等価なIgG抗体、その断片、変種、誘導体または類似体と比較してCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方の改善を提供することができる。特定の局面において、IgAまたはIgMに基づくCD20結合分子は、野生型J鎖またはヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えば、本明細書において提供されるV15JもしくはJ15VのいずれかのJ鎖をさらに含む。本開示に基づいた、関心対象の任意のCD20抗原結合ドメインを含む二量体、五量体または六量体のIgAまたはIgMに基づくCD20結合分子の構築は、十分に当業者の能力の範囲内である。活性の改善により、例えば、用いられる用量の低減を可能とすることができ、または元の抗体による殺傷に抵抗性を示す細胞のさらに効果的な殺傷を引き起こすことができる。「抵抗性」とは、CD20発現細胞上でのCD20抗体、例えばリツキシマブの活性の任意の程度の低減を意味する。IgAに基づく結合分子を用いることで、例えば、本明細書において提供される結合分子のさらに大きな組織分布を可能にすることができる。
特定の局面において、本開示はCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法を提供し、ここで本方法は、本明細書において記述される二量体、五量体または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含み、ここで結合分子は、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG、例えばIgG1抗体またはその断片、例えば、ヒトIgG1ならびにアミノ酸配列SEQ ID NO: 1を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 5を有するVLを含むリツキシマブよりも高い効力で、CD20発現細胞、例えばCD20発現B細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。二量体または五量体結合分子は、野生型J鎖またはヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えば、本明細書において提供されるV15JもしくはJ15Vをさらに含むことができる。特定の局面において、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体結合分子は、例えばオファツムマブ、ベルツズマブ、オカラツズマブまたはオビヌツズマブと同じVHおよびVL領域であるか、またはそれを含む等量の単一特異性二価CD20モノクローナル抗体またはその断片よりも高い効力で、CD20発現細胞、例えばCD20発現B細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。
本開示はしたがって、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法を提供し、ここで本方法は、各結合単位が2つのIgAもしくはIgM重鎖定常領域またはその断片および2つの抗原結合ドメインを含む2つ、5つまたは6つの二価結合単位をそれぞれ含む二量体、五量体または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含む。適当な結合分子の非限定的な例としては、本開示により提供される1.5.3に基づく二量体、五量体もしくは六量体結合分子、または本開示の他の箇所に記述される他の結合分子が挙げられる。二量体または五量体結合分子は、野生型J鎖またはヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えば、本明細書において提供されるV15JもしくはJ15Vをさらに含むことができる。本方法によれば、結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、CD20抗原結合ドメインである。さらに、本方法によれば、結合分子は、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG、例えばIgG1抗体またはその断片、例えば、本開示により提供される二量体、五量体または六量体結合分子のCD20抗原結合ドメインと同様の、例えば同一の、CD20抗原結合ドメインを含む二価IgG1抗体よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。
例えば、本開示は、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法を提供し、ここで本方法は、本明細書の他の箇所に記述されるように、1.5.3に関連する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む二量体、五量体または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含み、ここで結合分子は、1.5.3に関連するCD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる。二量体または五量体結合分子は、野生型J鎖またはヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えば、本明細書において提供されるV15JもしくはJ15Vをさらに含むことができる。特定の局面において、単一特異性二価IgG1抗体は1.5.3であり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLを含む。
特定の局面において、例えば、結合分子が、CD20発現Raji細胞株を用いCDCアッセイ法において試験された、1.5.3のVHおよびVLを有する2つの同一の結合ドメインを各々が含む5つの同一の結合単位を含む五量体結合分子である場合、結合分子は、例えばμg/ml単位でまたはモル当量単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体、例えば1.5.3のIC50の高くとも1分の1、高くとも2分の1、高くとも3分の1、高くとも4分の1、高くとも5分の1、高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも100分の1、高くとも150分の1、高くとも200分の1の、またはそれより低いIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる。
特定の局面において、CD20発現細胞は不死化細胞株、例えばB細胞白血病細胞株またはリンパ腫細胞株である。細胞株は、非限定的に、Ramos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株またはDB細胞株であることができる。当業者は、本明細書において提供される方法において有用でありうる他の細胞株を、容易に識別することができる。
特定の局面において、細胞株はGranta細胞株であり、二量体、五量体または六量体結合分子は、μg/ml単位で測定して、リツキシマブの効力の約6倍の効力で細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる。特定の局面において、細胞株はRamos細胞株であり、二量体、五量体または六量体結合分子は、モル当量単位で測定して、リツキシマブの効力の約30～40倍の効力で細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる。
特定の局面において、細胞株はRaji細胞株またはRamos細胞株であり、二量体、五量体または六量体結合分子は、リツキシマブの効力の約3倍の効力で細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる。
特定の局面において、CD20発現細胞は、がんを有する対象、例えばヒト患者における悪性B細胞である。がんは、例えば、CD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫であることができる。特定の局面において、CD20発現細胞株または悪性B細胞は、市販のCD20モノクローナル抗体による殺傷に対して抵抗性、例えば最小応答性または非応答性であり、例えば、がんを有する対象におけるCD20発現細胞株または悪性B細胞は、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である。
別の局面において、本開示はCD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法を提供し、ここで本方法は、CD20 mAbリツキシマブ、またはその断片、変種、誘導体もしくは類似体に関連する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む二量体、五量体または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含む。二量体または五量体結合分子は、野生型J鎖またはヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えば、本明細書において提供されるV15JもしくはJ15Vをさらに含むことができる。
特定の局面において、二量体、五量体または六量体結合分子のCD20抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここで少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCDRがCD20 mAbリツキシマブの対応するCDRに関連する。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 2または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含むHCDR1を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 3または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むHCDR2を含むことができる。例えば、HCDR2はアミノ酸配列SEQ ID NO: 16を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 4または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つ、2つもしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含むHCDR3を含むことができる。例えば、HCDR3はアミノ酸配列SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 31またはSEQ ID NO: 36を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、他の局面において、アミノ酸配列SEQ ID NO: 10または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 10を含むHCDR3を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、他の局面において、アミノ酸配列SEQ ID NO: 31または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 31を含むHCDR3を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 6または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つ、2つもしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含むLCDR1を含むことができる。例えば、LCDR1はアミノ酸配列SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27またはSEQ ID NO: 33を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 7または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含むLCDR2を含むことができる。例えば、LCDR2はアミノ酸配列SEQ ID NO: 13またはSEQ ID NO: 20を含むことができる。CD20抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 8または1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの単一アミノ酸置換、例えば1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を含むLCDR3を含むことができる。例えば、LCDR3はアミノ酸配列SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 21またはSEQ ID NO: 34を含むことができる。
特定の局面において、二量体、五量体または六量体結合分子のCD20抗原結合ドメインは、VHおよびVLを含み、ここでVH領域、VL領域、またはVH領域とVL領域の両方が、リツキシマブの対応するVHおよびVLに関連する。特定の局面において、CD20抗原結合ドメインはSEQ ID NO: 1と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 5と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVLアミノ酸配列を含むことができる。
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第7,679,900号に記述されているCD20 mAbに由来することができる。例えば、CD20抗原結合ドメインはSEQ ID NO: 9と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 11と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVLアミノ酸配列を含むことができる。
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第8,153,125号に記述されているCD20 mAbに由来することができる。例えば、CD20抗原結合ドメインはSEQ ID NO: 15と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 18と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVLアミノ酸配列を含むことができる。
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第8,337,844号に記述されているCD20 mAbに由来することができる。例えば、CD20抗原結合ドメインはSEQ ID NO: 22またはSEQ ID NO: 23と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28またはSEQ ID NO: 29と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVLアミノ酸配列を含むことができる。
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第8,337,844号に記述されているCD20 mAbに由来することができる。例えば、CD20抗原結合ドメインはSEQ ID NO: 30と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 32と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVLアミノ酸配列を含むことができる。
特定の局面において、VHおよびVLは、米国特許第7,151,164号に記述されているCD20 mAbに由来することができる。例えば、CD20抗原結合ドメインはSEQ ID NO: 35と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 37と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なVLアミノ酸配列を含むことができる。
本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体または六量体結合分子は、CD20、例えばヒトCD20に特異的に結合できる、本明細書において定義される2つ、5つまたは6つの「結合単位」を有する結合分子である。特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体または六量体結合分子は、それぞれ、各結合単位が2つのIgAもしくはIgM重鎖定常領域またはその断片を含む、2つ、5つまたは6つの二価結合単位を含む。特定の局面において、2つのIgAまたはIgM重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
本明細書において提供される方法で用いるための結合分子が五量体である場合、結合分子は、J鎖、またはその断片、またはその変種をさらに含むことができる。J鎖は、野生型J鎖またはヒトCD3に結合できる改変J鎖、例えば、本明細書において提供されるV15JもしくはJ15Vであることができる。
本明細書において提供される方法で用いるための結合分子のIgM重鎖定常領域は、定常領域が結合分子において所望の機能を果たすことができる、例えば、第2のIgM定常領域と会合して抗原結合ドメインを形成できる、または他の結合単位と会合して六量体または五量体を形成できるならば、Cμ1ドメイン、Cμ2ドメイン、Cμ3ドメイン、および/またはCμ4ドメインのうちの1つまたは複数を含むことができる。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ3ドメインもしくはその断片、Cμ4ドメインもしくはその断片、尾部(TP)もしくはその断片、またはCμ3ドメイン、CμドメインおよびTPもしくはその断片の任意の組み合わせを含む。特定の局面において、個々の結合単位内の2つのIgM重鎖定常領域またはその断片は各々、Cμ2ドメインもしくはその断片、Cμ1ドメインもしくはその断片、またはCμ1ドメインもしくはその断片およびCμ2ドメインもしくはその断片をさらに含む。
本明細書において提供される方法で用いるための種々の異なる二量体、五量体または六量体の結合分子は、本開示に基づき当業者によって企図されることができ、したがって本開示に含まれるが、特定の局面において、IgAもしくはIgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgAもしくはIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを各結合単位が含む、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子が提供される。
さらに、特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の少なくとも1つの結合単位、または本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位が、上記のCD20抗原結合ドメインを2つ含む。特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位における2つのCD20抗原結合ドメインは、互いに異なっていてもよく、またはそれらは同一であってもよい。
特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位内の2本のIgM重鎖は同一である。特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位内の2本の同一のIgM重鎖は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 52を含む。
特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位内の2本の軽鎖は同一である。特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位内の2本の同一の軽鎖は、κ軽鎖、例えば、ヒトκ軽鎖、またはλ軽鎖、例えばヒトλ軽鎖である。特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための結合分子の少なくとも1つの結合単位内、または少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つもしくは少なくとも6つの結合単位内の2本の同一の軽鎖は各々、アミノ酸配列SEQ ID NO: 54を含む。
特定の局面において、本明細書において提供される方法で用いるための五量体または六量体結合分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つの結合単位は、アミノ酸配列SEQ ID NO: 52を各々含む2本の同一のIgM重鎖と、アミノ酸配列SEQ ID NO: 54を各々含む2本の同一の軽鎖とを含む、または各々含む。この局面によれば、結合分子の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの結合単位におけるCD20抗原結合ドメインは、同一であることができる。さらにこの局面によれば、本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体または六量体結合分子は、上記のCD20抗原結合ドメインを少なくとも1コピー、少なくとも2コピー、少なくとも3コピー、少なくとも4コピー、少なくとも5コピー、少なくとも6コピー、少なくとも7コピー、少なくとも8コピー、少なくとも9コピー、少なくとも10コピー、少なくとも11コピー、または少なくとも12コピー含むことができる。特定の局面において、結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一であることができ、特定の局面において、結合単位は同一の抗原結合ドメインを含むことができ、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインが同一であることができる。特定の局面において、同一のCD20抗原結合ドメインは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を有するVH、およびアミノ酸配列SEQ ID NO: 5を有するVLを含むことができる。
本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、他の結合分子と比較して有利な構造的または機能的特性を保有することができる。例えば、本明細書において提供される方法で用いるための二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、対応する結合分子、例えばリツキシマブまたはその変種、類似体もしくは誘導体よりも、インビトロまたはインビボのいずれかで、生物学的アッセイ法において改善された活性を保有することができる。生物学的アッセイ法には、補体依存性細胞傷害(CDC)および/または抗体依存性細胞傷害(ADCC)が含まれるが、これらに限定されることはない。
薬学的組成物および投与方法
本明細書において提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子を調製し、それを必要としている対象に投与する方法は、当業者に周知であり、または本開示を考慮して当業者により容易に決定される。CD20結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入または局所によるものであることができる。本明細書において用いられる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与を含む。これらの投与形態は適当な形態として企図されるが、投与のための形態の別の例は、注射のための、特に静脈内または動脈内注射または点滴のための溶液であろう。適当な薬学的組成物は、緩衝液(例えば酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝液)、界面活性剤(例えばポリソルベート)、任意で安定剤(例えばヒトアルブミン)を含むことができる。
本明細書において論じられるように、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、B細胞を枯渇させることが望ましい疾患または障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。これに関して、開示される結合分子は、投与を容易にし、活性剤の安定性を促進するように処方されうることが理解されよう。薬学的組成物はしたがって、生理学的食塩水、無毒性緩衝液、保存料などのような薬学的に許容される無毒性の無菌担体を含むことができる。本明細書において提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子の薬学的に有効な量は、標的への有効な結合を達成するのに、および治療的利益を達成するのに十分な量を意味する。適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)に記述されている。
本明細書において提供される特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む許容される剤形で経口投与することができる。特定の薬学的組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存料、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、および/または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を利用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
単一剤形を作出するために担体材料と組み合わせることができる二量体、五量体または六量体CD20結合分子の量は、例えば、処置される対象および特定の投与様式に依って変化するであろう。組成物は、単回用量、複数回用量として、または確立された期間にわたり輸液中で投与することができる。投薬レジメンを調整して、最適な所望の応答(例えば、治療的または予防的応答)をもたらすこともできる。
本開示の範囲にしたがって、本明細書において提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、治療効果を生じるのに十分な量で治療を必要としている対象に投与することができる。本明細書において提供される二量体、五量体または六量体CD20結合分子は、本開示の抗体またはその抗原結合断片、変種または誘導体を、従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と既知の技法にしたがって組み合わせることにより調製される従来の剤形で対象に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および性質は、組み合わされるべき活性成分の量、投与の経路および他の周知の変量によって左右されうる。
「治療的に有効な用量または量」または「有効な量」とは、投与されると、処置されるべき疾患または状態を有する患者の処置に関して肯定的な治療的応答をもたらす二量体、五量体または六量体CD20結合分子の量を意図する。
B細胞枯渇が望まれる疾患または障害の処置のための、本明細書において開示される組成物の治療的に有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物(medication)、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因に依って変化しうる。特定の局面において、対象または患者はヒトであるが、しかしトランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために、当業者に公知の日常的な方法を用いて用量設定することができる。
投与される二量体、五量体または六量体CD20結合分子の量は、本開示を考慮して過度の実験なしに当業者によって容易に決定される。投与様式および二量体、五量体または六量体CD20結合分子のそれぞれの量に影響を及ぼす因子には、疾患の重篤度、疾患の病歴、ならびに治療を受けている個体の年齢、身長、体重、健康状態および身体状態が含まれるが、これらに限定されることはない。同様に、投与される二量体、五量体または六量体CD20結合分子の量は、投与様式および対象がこの薬剤の単回用量または複数回用量を受けるかどうかに依存するであろう。
本開示はまた、B細胞枯渇が望ましい疾患または障害、例えばB細胞リンパ腫、白血病または骨髄腫を処置、予防または管理するための薬物(medicament)の製造における二量体、五量体または六量体CD20結合分子の使用を提供する。
本開示は、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来技法を利用するものであり、これらは当技術分野の技術の範囲内である。そのような技法は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)中を参照されたい。
抗体工学の一般原理は、Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)に記載されている。抗体および抗体-ハプテン結合の一般原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); およびSteward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)に記載されている。さらに、当技術分野において公知であり、具体的には記述されていない免疫学における標準的方法は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)およびMishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)にあるように従うことができる。
免疫学の一般原理を記載している標準的な参考文献には、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) 「Monoclonal Antibody Technology」 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freeman & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)が含まれる。
上記で引用した参考文献の全て、および本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は、例示する目的で提供されるものであり、限定する目的で提供されるものではない。
実施例1: CD20-hIgMの発現用DNA構築体の作出
CD20に特異的に結合できる五量体または六量体IgM結合分子を発現できるプラスミド構築体は、以下の方法によって産生された。
リツキシマブのVHおよびVL領域(それぞれSEQ ID NO 1および5)または1.5.3のVHおよびVL領域(それぞれSEQ ID NO 38および42)をコードするDNA断片は市販業者(Genescript)により、重鎖および軽鎖発現ベクターへのサブクローニングのためにEcoRV制限部位を5'末端におよびXbaI制限部位を3'末端に付して合成された。合成されたDNA構築体をトリス-EDTA緩衝液に1 μg/mlで再懸濁した。DNAサンプル(1 μg)をEcoRVおよびXbaIで消化し、合成されたVHおよびVLを電気泳動により担体プラスミドDNAから分離した。消化されたDNAを、標準的な分子生物学技法によって予め消化されたプラスミドDNA (μ鎖の場合にはpFUSEss-CHIg-hM＊03、κ鎖の場合にはpFUSE2ss-CLIg-hk、Invivogenから入手)にライゲーションした。ライゲーションされたDNAをコンピテント細菌へ形質転換し、複数の選択的抗生物質を有するLBプレート上にプレーティングした。いくつかの細菌コロニーを採取し、DNA調製物を標準的な分子生物学技法によって作出した。重鎖および軽鎖をコードする構築体を、配列決定によって確認した。リツキシマブIgM重鎖のDNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO: 51およびSEQ ID NO: 52として提示されており、リツキシマブ軽鎖のDNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO: 53およびSEQ ID NO: 54として示されている。1.5.3 IgM重鎖のDNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO: 55およびSEQ ID NO: 56として提示されており、1.5.3軽鎖のDNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO: 57およびSEQ ID NO: 58として提示されている。ヒトJ鎖のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 49として提示されている。
IgM重鎖および軽鎖または重鎖、軽鎖およびJ鎖をコードするプラスミド構築体をCHO細胞に同時トランスフェクションし、J鎖を有するか有しないかのいずれかの、CD20 IgM抗体を発現する細胞を、全て標準的な方法にしたがって選択した。
細胞上清中に存在する抗体を、製造元のプロトコルにしたがってCapture Select IgM (カタログ2890.05, BAC, Thermo Fisher)を用い回収した。抗体を非還元条件下のSDS PAGEにて評価し、五量体および六量体のアセンブリを示した。NuPage LDSサンプル用緩衝液(Sample Buffer) (Life Technologies)をサンプルに添加した後に、NativePage Novex 3～12%ビス-トリスゲル(bis-Tris Gel) (Life Technologies Catalog #BN1003)へ負荷した。Novexトリス-酢酸SDS泳動用緩衝液(Tris-Acetate SDS Running Buffer) (Life Technologies Catalog #LA0041)をゲル電気泳動に用いた。色素の最前部がゲルの最下部に達するまでゲル泳動した。電気泳動後、ゲルをColloidal Blue Stain (Life Technologies Catalog #LC6025)で染色した。結果を図4に示す。非還元条件の下で、五量体1.5.3 IgM (5つのH2L2 IgM単位に加えてJ鎖、図4、第2のパネル、レーン3)および五量体リツキシマブIgM (第1のパネル、レーン3)は、分子量およそ1,000,000のタンパク質バンドをもたらし、六量体1.5.3 IgM (6つのH2L2 IgM単位、図4、第2のパネル、レーン2)は、およそ1,180,000のタンパク質バンドをもたらした。
実施例2: CD20-hIgMの結合および活性
CD20 ELISAアッセイによる結合の検出
96ウェル白色ポリスチレンELISAプレート(Pierce 15042)を1ウェルあたり、N-Fc融合(AcroBiosystems, CD0-H526a)を有する10 μg/mLまたは0.3 μg/mLのヒトCD20 100 μLにより4℃で終夜コーティングした。プレートを次に0.05% PBS-Tweenで洗浄し、2% BSA-PBSでブロッキングした。ブロッキング後、1.5.3 IgM、1.5.3 IgG、標準物質および対照の連続希釈液100 μLをウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、30分間HRP結合マウス抗ヒトκ(Southern Biotech, 9230-05. 2% BSA-PBS中で6000分の1希釈した)とともにインキュベートした。0.05% PBS-Tweenを用いた10回の最終洗浄の後、SuperSignal化学発光基質(ThermoFisher, 37070)を用いてプレートを読み取った。発光データをEnVisionプレートリーダー(Perkin-Elmer)で収集し、4パラメータロジスティックモデルを用いGraphPad Prismで分析した。
モル濃度でIgM vs. IgGを比較している、図5Aおよび図5Bに結果を示す。抗CD20 IgM抗体は、CD20抗原密度の両方で、特に低いCD20抗原濃度で、より効果的な結合を示した(図5B)。
補体依存性細胞傷害 - 比色アッセイ
Granta (DSMZカタログ番号ACC 342)、Raji (ATCCカタログ番号CCL-86)、Ramos (ATCCカタログ番号CRL-1596)、Nalm-6 (DSMZカタログ番号ACC 128)およびNamalwa (ATCCカタログ番号CRL-1432)細胞株は、ATCCおよびDSMZ由来であった。各細胞株の細胞50,000個を96ウェルプレートに播種した。細胞を、連続希釈した市販の抗ヒトCD20 IgM (Invivogenカタログ番号hcd20-mab5)または抗ヒトCD20 IgG1 (Invivogenカタログ番号hcd20-mab1)で処理した。ヒト血清補体(Quidelカタログ番号A113)を各ウェルに10%の最終濃度で添加した。反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。細胞計数キット-SK試薬(CCK-SK) (Dojindoカタログ番号CK04-13)を全反応容量の1/10で加え、プレートを37℃でさらに3時間インキュベートした。450 nmでの吸光度を分光光度計で測定した。
結果を図6A～Eに示す。IgM CD20抗体はIgGよりも細胞殺傷で、Granta細胞(図6A)において6倍強力であり、Raji細胞(図6B)において3倍強力であり、Ramos細胞(図6C)において3倍強力であった。それぞれCD20を発現しないか、または低レベルのCD20を発現するかのNalm-6細胞(図6D)またはNamalwa細胞(図6E)を殺傷させるうえで、どちらの抗体も有効ではなかった。
補体依存性細胞傷害 - 発光アッセイ
(a) CD20発現Raji細胞株(ATCCカタログ番号CCL-86)を用いた。細胞50,000個を96ウェルプレートに播種した。以下の連続希釈した抗体で細胞を処理した: リツキシマブ(IgG1)、実施例1において産生されたリツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+J、または実施例1に記述されているように産生された1.5.3抗ヒトCD20 IgM+J。ヒト血清補体(Quidelカタログ番号A113)を各ウェルに10%の最終濃度で添加した。反応混合物を37℃で4時間インキュベートした。Cell Titer Glo試薬(Promega cat. #G7572)を、各ウェルに存在する培地の容量に等しい容量で加えた。プレートを2分間振盪し、室温で10分間インキュベートし、ルミノメータで発光を測定した。
結果を図7および表2に示す。IgG (リツキシマブ)としての抗CD20は補体によるおよそ最大半数のRaji細胞殺傷を達成したが、IgMアイソタイプ(リツキシマブ)はほぼ最大の補体依存性細胞傷害を達成した。どちらのIgM抗体もリツキシマブより補体依存性細胞傷害において強力であり、この実験では、1.5.3様IgM抗体はリツキシマブVHおよびVLを保有する抗ヒトIgM CD20抗体より強力であった。1.5.3様IgM抗体は、タイプ1抗CD20 (IgMとしてのリツキシマブ)の効力と比べて4倍の効力増加を示した。
（表２）Raji細胞に対するCDC (IC50) (μg/ml)
Figure 2023099206000007
(b) 以下の連続希釈した抗体とともにCD20発現Ramos細胞株を用いて、上記のCDCアッセイを繰り返した: リツキシマブ(IgG1)、実施例1において産生されたリツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+J、1.5.3 (IgG1)、1.5.3抗CD20 IgM、または実施例1に記述されているように産生された1.5.3抗CD20 IgM+J。
結果を図8A (リツキシマブおよびリツキシマブ様IgM)ならびに図8B (1.5.3、1.5.3 IgM+JおよびhuMAb様 IgMに示す。この実験では、IgGおよびIgM型をモル当量単位で比較した。IgM型のIC50は補体依存性細胞傷害においてIgG型より全て約30～40倍有効であった。
(c) 次に、抗体を、CD20発現レベルの低下を伴う異なる細胞株でのCDC活性について比較した。アッセイは、以下の連続希釈した抗体で行った: リツキシマブ(IgG1)、実施例1において産生されたリツキシマブ由来抗ヒトCD20 IgM+J、1.5.3 (IgG1)、および実施例1に記述されているように産生された1.5.3抗CD20 IgM+J。使用した細胞はDoHH2細胞(DSMZ番号ACC 47)であり、Z138細胞(ATCC CRL-3001)を本アッセイにおいて用いた。Z138細胞は、以下の表4に示すように、DoHH2細胞よりも低いCD20発現レベルを示す。標的細胞を洗浄し、細胞1.0×106個/mLの密度でCDCアッセイ培地(RPMI 1640, 10%熱不活性化FBS)に再懸濁し、10 μL/ウェルをNunc 384ウェル組織培養処理白色ポリスチレンプレートに添加した。試験抗体の連続3倍希釈液をアッセイ培地中にて調製し、10 μL/ウェルをアッセイプレートに添加し、プレートを5% CO2インキュベータ中37℃で2時間インキュベートして、オプソニン化を生じさせた。正常ヒト血清補体(Quidel)をアリコットで凍結し、使用の場合には一度融解し、アッセイ培地中で30%に希釈し、10 μL/ウェルをアッセイプレートに添加した。プレートを5% CO2インキュベータ中37℃で4時間インキュベートした。Cell Titer-Glo試薬(Promega)を使用のため融解し、15 μL/ウェルをアッセイプレートに添加した。プレートをプレート振盪機上で2分間穏やかに混合して細胞を溶解させ、次にEnVisionプレート読取機(Perkin-Elmer)で発光を測定する前に室温でさらに10分間混合した。バックグラウンドシグナルを差し引いた後に、抗体濃度に対して生存率をプロットし、GraphPad Prismを用いてEC50値を決定した。
結果を図9および表3に示す。両方の細胞株で、抗体のIgM型はIgG型よりも大きなCDC殺傷を示した。よりCD20低発現のZ-138細胞で、IgM型のCDC活性はIgG型に比べて100倍超、改善された。
（表３）CDC活性はCD20抗原発現レベルに依存する
Figure 2023099206000008
実施例3: 改変J鎖結合CD3を含む二重特異性抗CD20 IgMの調製
リツキサン様抗ヒトCD20 IgMおよび1.5.3抗CD20 IgMを実施例1に記述されるように産生した。
2つの異なるJ鎖変種を、別個の融合部位に抗CD3抗体ビシリズマブ(Nuvion)由来の可変領域を組み入れて構築した。ビシリズマブ(V)に対応するscFv (VH-(GGGGS)3-VL, 二重下線)が15アミノ酸を含む(GGGGS)3リンカー(SEQ ID NO: 67, 下線)を通じて2つの異なる方向でJ鎖(斜体)に融合された2つのJ鎖 - V15JおよびJ15Vに対する配列を以下に示す。各配列は、下線または斜体なしで示されているN末端シグナルペプチドを含む。特定の局面において、ここで示したシグナルペプチドの代わりに、他のシグナルペプチド配列を用いることができる。
SEQ ID NO: 63: V15J (DNA配列: SEQ ID NO: 68)の前駆体改変J鎖配列:
Figure 2023099206000009
SEQ ID NO: 64: V15Jの成熟改変J鎖配列:
Figure 2023099206000010
SEQ ID NO: 65: J15V (DNA配列: SEQ ID NO: 69)の前駆体改変J鎖配列:
Figure 2023099206000011
SEQ ID NO: 66: J15Vの成熟改変J鎖配列:
Figure 2023099206000012
成熟構築体は各々、約45 kDの分子量を有し、CD3の可溶性ε鎖(Sino Biological)、またはT細胞に結合することができる(データは示していない)。
抗CD20重鎖および軽鎖に対応するDNA構築体、ならびに野生型(wt) J鎖、V15JまたはJ15V J鎖配列のいずれかに対応するDNA構築体を、哺乳動物細胞、例えばHEK293またはCHO細胞に同時トランスフェクションし、タンパク質を発現させ、標準的な方法によって精製した。例えば、PCT公開番号WO 2015/153912を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。15アミノ酸のリンカーで抗CD3 scFvに融合されたJ鎖は、抗CD20重鎖および軽鎖と組み合わさって、二重特異性IgMの五量体型を産生することができた。
アガロース-アクリルアミドハイブリッドゲル
IgM構築体を、既述の方法(Chugai Seiyaki Kabushiki Kaisha, 2010, Pub. No.: US 2010/0172899 A1)から適合させた非還元SDS-PAGEにより分離した。手短に言えば、ハイブリッドゲルを、0.375 Mトリス緩衝液, pH 8.8および15%グリセロール中で、それぞれ3.6%および0.5%の終濃度まで40%アクリルアミド/ビス-アクリルアミド, 37.5:1 (Sigma-Aldrich)およびUltrapure Agarose (Invitrogen)と混合した。得られた混合物を50℃に加熱し、0.08% TEMEDおよび0.08%の過硫酸アンモニウムの添加によって重合を開始した。得られた溶液を2枚のプレートの間に注ぎ、アクリルアミドを37℃で1時間重合させた後、室温で30分間放置して完全な重合を確実にした。タンパク質サンプルを、得られたハイブリッドゲルへ負荷し、ゲルをトリス-酢酸SDS泳動用緩衝液(Novex)中800 Vhで泳動した。次に、ゲルを40%メタノール、10%酢酸中で10分間固定し、コロイドブルー染色キット(Colloidal Blue Staining Kit) (Novex)を用いて少なくとも3時間染色し、その後に水中で脱染色した。
非還元SDS未変性PAGE
タンパク質サンプルを未変性PAGE(NativePAGE) 3～12%ビス-トリス(Bis-Tris)ゲル(Novex)へ負荷した。トリス-酢酸SDS泳動用緩衝液(Novex)を添加し、ゲルを40Vで15分間、その後90Vで2時間泳動した。次に、ゲルを40%メタノール、10%酢酸中で10分間固定し、コロイドブルー染色キット(Novex)を用いて少なくとも3時間染色し、その後に水中で脱染色した。
J鎖ウエスタンブロット
還元条件下で泳動させたアクリルアミドゲルを20%エタノール溶液中で10分間洗浄し、次いでiBlotドライブロッティングシステム(Dry Blotting System) (Invitrogen)を用い10分間20Vでタンパク質をiBlot PVDF膜(Invitrogen)に転写した。転写後、2%ウシ血清アルブミン、0.05% Tween 20を用いてPVDF膜を少なくとも12時間ブロッキングした。Pierce J鎖抗体(ThermoFisher)の1/500希釈液を膜に添加し、1時間インキュベートし、次いでペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG (Jackson ImmunoResearch)の1/5000希釈液を添加し、暗所で30分間インキュベートさせた。最後に、Super Signal West Pico化学発光基質(Chemiluminescent Substrate) (ThermoFisher)をブロットに添加し、得られたシグナルを、ChemiDoc-It HR410イメージングシステム(UVP)を用いて、またはブロットをX線フィルムに露光することによって可視化した。
図10Aおよび図10Bに示されるように、1.5.3 IgM+wt Jおよび1.5.3 IgM+V15Jタンパク質は、ハイブリッドゲル上で、J鎖を含まない移動が遅い方の六量体型とは区別可能な、移動が速い方の五量体として目に見える。J鎖の組み込みは還元ゲル(図10C)およびJ鎖に対する抗体を用いたウエスタンブロット(図10D)で確認される。
実施例4: T細胞活性化アッセイ
二重特異性抗CD20/抗CD3抗体がCD20標的への結合時にT細胞を活性化しうることを実証するために、以下のアッセイを行った。操作されたJurkat T細胞(Promega CS176403)およびRPMI8226細胞(ATCC CCL-155)を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を補充したRPMI (Invitrogen)中で培養した。精製された1.5.3 IgM + V15J、ブリナツモマブ(二重特異性CD19×CD3)、および単一特異性1.5.3 IgMの連続希釈液を白色384ウェルアッセイプレート中、20 μL中で7500 RPMI8226細胞とともに37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。操作されたJurkat細胞(25000個)を混合物に添加して40 μLの最終容量とした。混合物を37℃、5% CO2で5時間インキュベートした。次いで、ルシフェリン(Promega, Cell Titer Glo)を含有する溶解用緩衝液20 μLと細胞混合物を混合して、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。光出力をEnVisionプレート読取機により測定した。Prismソフトウェアを用いて4パラメータ曲線適合によりEC50を決定した。
結果を図11に示す。1.5.3-V15J抗体によるT細胞活性化は、RPMI8226細胞株に対しブリナツモマブで見られたものよりも大きかった。T細胞活性化の最大レベルは、異なるレベルのCD20抗原を各々発現する一連の腫瘍細胞株を用いて図12に示した細胞表面上のCD20発現レベルと良好な相関関係を示した。
実施例5: T細胞依存性のB細胞殺傷 - LDH放出アッセイ
二重特異性CD20×CD3 IgM結合分子がCD8+ T細胞急性リンパ芽球性白血病(TALL)細胞の存在下で標的細胞を殺傷できることを実証するために、本発明者らは同時培養実験を行った。384ウェル黒色組織培養プレートの1ウェルあたり10%熱不活性化FBSを補充したRPMI 1640培地の総容量45 μL中、異なる濃度の試験化合物(Rituxan IgM + V15Jおよび1.5.3 IgM +V15J)の存在下で、がん性B細胞6×103個をTALL細胞(ATCC CRL-11386) 3×104個と同時培養した。5% CO2インキュベータ中37℃で24時間のインキュベーション後、CytoTox-ONE基質試薬(Promega, G7891) 15 μLを各ウェルに添加して、死細胞から放出されたLDHのレベルを測定した。プレートを短時間振盪して試薬を混合し、その後、EnVisionプレート読取機(Perkin-Elmer)で蛍光シグナル(励起用485 nmおよび発光用615 nm)を測定する前に室温で90分間インキュベートした。次に、データをGraphPad Prismで分析してEC50を決定した。表4に示されるように、細胞殺傷のEC50は1.5.3 IgM V15JおよびリツキシマブIgM V15Jの両方を用いて、DB細胞株に対するEC50が0.4 ng/mL (0.4 pM)ほどの低さで、細胞表面上のCD20抗原の発現レベルと相関していた。
（表４）T細胞依存性のB細胞殺傷
Figure 2023099206000013
実施例6: KILR(商標)検出キットを用いたインビトロ細胞傷害アッセイ
1.5.3 IgM + V15Jが全血中(すなわち、T細胞および補体を含む)でCD20+腫瘍細胞を殺傷する能力を調べるために、KILR(商標)インビトロ細胞傷害検出キットを用いた。KILR(商標) ARH-77細胞株(CD20+)は、標的細胞としてDiscoverX (97-1001C017)から購入された。KILR(商標) ARH-77細胞5～10×103個を96ウェルU底非組織培養処理ポリスチレンプレート(Corning Falcon)上で10%熱不活性化FBSを補充したRPMI 1640培地の総容量200 μL中(ヒト血液を同時培養に用いた場合、全血が容量の20～50%を占めたため、より少ない培地を用いた)、異なる濃度の試験化合物(1.5.3 IgM+V15J、1.5.3 IgM+wtJ、1.5.3 IgG、リツキシマブIgGおよびブリナツモマブ)の存在下においてヒトCD8+ T細胞(Precision for Medicine)、PBMC (AllCellsもしくはPrecision for Medicine)またはヒルジン抗凝固ヒト血液(AllCells)のいずれかと同時培養した。5% CO2インキュベータ中37℃で4～48時間のインキュベーション後、プレートを27×gで5分間遠心分離した。上清50 μLを96ウェル平底白色ポリスチレンプレート(Greiner Bio-One)に移し、室温で1時間のインキュベーションの間KILR検出使用液(KILR(商標)検出キット: DiscoverX 97-0001M) 25 μLと混合した後にEnVisionプレート読取機(Perkin-Elmer)で発光を測定した。KILR(商標)検出キットに同梱されていた溶解用緩衝液で標的細胞を溶解して、全溶解対照を樹立した。殺傷率を抗体濃度に対してプロットし、GraphPad Prismを用いてEC50値を決定した。
全血(ヒルジン含有)中の正常ヒト補体の存在下での結果を図13に示す。1.5.3 IgM+wtJ (ひし形)およびIgM+V15J (四角)の抗体は両方とも、4時間の時点で非常に強力な殺傷を示した。リツキサンIgG (白丸)およびブリナツモマブ(三角)は、少なくとも30倍強力ではなかった。
実施例7: ヒト化NOD/SCIDγノックアウト(NSG)マウスモデルを用いたインビボ有効性試験
CD34+ヒト化NSGマウス試験は、In-Vivo Technologies, Inc.によって実施された。これらのマウスは、多系統ヒト免疫細胞を保有・発生させるという点で、ヒト免疫腫瘍学研究の代用品である。マウスをJackson Laboratoryから購入し、尾静脈注射によって試験物質を投与した。ビヒクル対照に加えて、試験物質にはマウス1匹あたり3 μg、1 μgおよび0.3 μgの1.5.3 IgM+V15Jならびにマウス1匹あたり1 μgおよび0.3 μgのリツキシマブを含めた。投薬後6時間、24時間および10日の時点で顔面静脈を通じて血液サンプルを収集した。PBMCヒト化NSGマウス試験の場合、AllCellsから得た凍結PBMCを注射のためJackson Laboratoryに送った。各NSGマウスに100 cGyの全身照射後1,000万個のPBMCを注射した。指定された時点での後眼窩出血を介して試験物質(上記の通り)の尾静脈投薬の前後に血液サンプルを収集した。CD34+およびPBMCマウス試験の両方の血液サンプルを、リンパ球分析のためIGM Biosciences Inc.に送り返した。血液サンプルをヒトCD56、CD3、CD19およびCD45マーカーについて染色し、異なるヒトリンパ球集団を識別した。CountBright Absolute Counting Beads (LifeTechnologies, C36950)を用いて、血液サンプル中のリンパ球の絶対数を定量した。リンパ球レベルをプロットし、GraphPad Prismを用いて分析した。
投薬前B細胞レベルに対して規準化された、野生型Jを有する1.5.3 IgMおよびV15Jを有する1.5.3 IgMの投薬後6時間の時点の結果を、それぞれ図14Aおよび図14Bに示す。二重特異性1.5.3 IgM×V15J抗体は、移植されたNSGマウスにおいて、マウス1匹あたりわずか3 μgで強力なT細胞依存性のB細胞殺傷を示した。
1.5.3 IgM×V15Jとリツキシマブとの間の全アッセイ期間にわたる結果の比較を図15に示す。
（表５）開示における配列
Figure 2023099206000014
Figure 2023099206000015
Figure 2023099206000016
Figure 2023099206000017
Figure 2023099206000018
Figure 2023099206000019
Figure 2023099206000020
本開示の広さおよび範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても制限されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されるべきである。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> IGM BIOSCIENCES, INC.
<120> CD20 BINDING MOLECULES AND USES THEREOF
<150> US 62/128,284
<151> 2015-03-04
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5

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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Gly

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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
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Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
195 200

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Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
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Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser
50 55 60
Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120

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Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser Lys
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Leu

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
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Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser
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Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Thr
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Thr Ser Ala Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Thr Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ser Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Thr Ser Val Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Thr Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ser Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
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Arg Ala Ser Thr Ser Val Ser Tyr Ile His
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 28
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Thr Ser Val Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ser Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 29
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ser Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10

<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Ile Thr Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
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Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
1 5 10

<210> 34
<211> 9
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Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
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Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
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Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
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Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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<210> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
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<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly

<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr
1 5 10

<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 43
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15

<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 44
Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5

<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 45
Val Gln Ala Thr Gln Phe Pro Leu Thr
1 5

<210> 46
<211> 1347
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
gccccaaccc ttttccccct cgtctcctgt gagaattccc cgtcggatac gagcagcgtg 60
gccgttggct gcctcgcaca ggacttcctt cccgactcca tcactttctc ctggaaatac 120
aagaacaact ctgacatcag cagcacccgg ggcttcccat cagtcctgag agggggcaag 180
cacgcagcca cctcacaggt gctgctgcct tccaaggacg tcatgcaggg cacagacgaa 240
cacgtggtgt gcaaagtcca gcaccccaac ggcaacaaag aaaagaacgt gcctcttcca 300
gtgattgctg agctgcctcc caaagtgagc gtcttcgtcc caccccgcga cggcttcttc 360
ggcaaccccc gcaagtccaa gctcatctgc caggccacgg gtttcagtcc ccggcagatt 420
caggtgtcct ggctgcgcga ggggaagcag gtggggtctg gcgtcaccac ggaccaggtg 480
caggctgagg caaaggagtc tgggaccacg acctacaagg tgaccagcac actgaccatc 540
aaagagagcg actggctcag ccagagcatg ttcacctgcc gcgtggatca caggggcctg 600
accttccagc agaatgcgtc ctccatgtgt ggccccgatc aagacacagc catccgggtc 660
ttctccatcc ccccatcctt tgccagcatc ttcctcacca agtccaccaa gttgacctgc 720
ctggtcacag acctgaccac ctatgacagc gtgaccatct cctggacccg ccagaatggc 780
gaagctgtga aaacccacac caacatctcc gagagccacc ccaatgccac tttcagcgcc 840
gtgggtgagg ccagcatctg cgaggatgac tggaattccg gggagaggtt cacgtgcacc 900
gtgacccaca cagacctgcc ctcgccactg aagcagacca tctcccggcc caagggggtg 960
gccctgcaca ggcccgatgt ctacttgctg ccaccagccc gggagcagct gaacctgcgg 1020
gagtcggcca ccatcacgtg cctggtgacg ggcttctctc ccgcggacgt cttcgtgcag 1080
tggatgcaga gggggcagcc cttgtccccg gagaagtatg tgaccagcgc cccaatgcct 1140
gagccccagg ccccaggccg gtacttcgcc cacagcatcc tgaccgtgtc cgaagaggaa 1200
tggaacacgg gggagaccta cacctgcgtg gtggcccatg aggccctgcc caacagggtc 1260
accgagagga ccgtggacaa gtccaccggt aaacccaccc tgtacaacgt gtccctggtc 1320
atgtccgaca cagctggcac ctgctac 1347

<210> 47
<211> 453
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala
405 410 415
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr
435 440 445
Ala Gly Thr Cys Tyr
450

<210> 48
<211> 480
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 48
atgaagaacc atttgctttt ctggggagtc ctggcggttt ttattaaggc tgttcatgtg 60
aaagcccaag aagatgaaag gattgttctt gttgacaaca aatgtaagtg tgcccggatt 120
acttccagga tcatccgttc ttccgaagat cctaatgagg acattgtgga gagaaacatc 180
cgaattattg ttcctctgaa caacagggag aatatctctg atcccacctc accattgaga 240
accagatttg tgtaccattt gtctgacctc tgtaaaaaat gtgatcctac agaagtggag 300
ctggataatc agatagttac tgctacccag agcaatatct gtgatgaaga cagtgctaca 360
gagacctgct acacttatga cagaaacaag tgctacacag ctgtggtccc actcgtatat 420
ggtggtgaga ccaaaatggt ggaaacagcc ttaaccccag atgcctgcta tcctgactaa 480

<210> 49
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
1 5 10 15
Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp
20 25 30
Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser
35 40 45
Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Ile Ile Val Pro
50 55 60
Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr
65 70 75 80
Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr
85 90 95
Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile
100 105 110
Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn
115 120 125
Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys
130 135 140
Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
145 150 155

<210> 50
<211> 297
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295

<210> 51
<211> 1725
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 51
caggttcagc tgcagcagcc cggagccgag ctggtcaaac ctggcgctag tgtgaaaatg 60
tcatgcaagg catccggata cacattcact agctataaca tgcactgggt gaagcagacc 120
cccggcaggg gtctggagtg gatcggagct atctaccccg gcaacggaga cacatcttat 180
aatcagaagt ttaaaggcaa ggccaccctg acagctgata agtccagctc taccgcatac 240
atgcagctga gttcactgac aagcgaggac tccgccgtgt actattgcgc ccggtccact 300
tactatggcg gagattggta tttcaatgtg tggggagcag gcaccacagt caccgtctcg 360
agcggcagtg ctagcgcccc aacccttttc cccctcgtct cctgtgagaa ttccccgtcg 420
gatacgagca gcgtggccgt tggctgcctc gcacaggact tccttcccga ctccatcact 480
ttctcctgga aatacaagaa caactctgac atcagcagca cccggggctt cccatcagtc 540
ctgagagggg gcaagtacgc agccacctca caggtgctgc tgccttccaa ggacgtcatg 600
cagggcacag acgaacacgt ggtgtgcaaa gtccagcacc ccaacggcaa caaagaaaag 660
aacgtgcctc ttccagtgat tgctgagctg cctcccaaag tgagcgtctt cgtcccaccc 720
cgcgacggct tcttcggcaa cccccgcaag tccaagctca tctgccaggc cacgggtttc 780
agtccccggc agattcaggt gtcctggctg cgcgagggga agcaggtggg gtctggcgtc 840
accacggacc aggtgcaggc tgaggccaaa gagtctgggc ccacgaccta caaggtgacc 900
agcacactga ccatcaaaga gagcgactgg ctcagccaga gcatgttcac ctgccgcgtg 960
gatcacaggg gcctgacctt ccagcagaat gcgtcctcca tgtgtgtccc cgatcaagac 1020
acagccatcc gggtcttcgc catcccccca tcctttgcca gcatcttcct caccaagtcc 1080
accaagttga cctgcctggt cacagacctg accacctatg acagcgtgac catctcctgg 1140
acccgccaga atggcgaagc tgtgaaaacc cacaccaaca tctccgagag ccaccccaat 1200
gccactttca gcgccgtggg tgaggccagc atctgcgagg atgactggaa ttccggggag 1260
aggttcacgt gcaccgtgac ccacacagac ctgccctcgc cactgaagca gaccatctcc 1320
cggcccaagg gggtggccct gcacaggccc gatgtctact tgctgccacc agcccgggag 1380
cagctgaacc tgcgggagtc ggccaccatc acgtgcctgg tgacgggctt ctctcccgcg 1440
gacgtcttcg tgcagtggat gcagaggggg cagcccttgt ccccggagaa gtatgtgacc 1500
agcgccccaa tgcctgagcc ccaggcccca ggccggtact tcgcccacag catcctgacc 1560
gtgtccgaag aggaatggaa cacgggggag acctacacct gcgtggtggc ccatgaggcc 1620
ctgcccaaca gggtcaccga gaggaccgtg gacaagtcca ccggtaaacc caccctgtac 1680
aacgtgtccc tggtcatgtc cgacacagct ggcacctgct actga 1725

<210> 52
<211> 574
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr
115 120 125
Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser
130 135 140
Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr
145 150 155 160
Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly
165 170 175
Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val
180 185 190
Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val
195 200 205
Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu
210 215 220
Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro
225 230 235 240
Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln
245 250 255
Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu
260 265 270
Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu
275 280 285
Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val
305 310 315 320
Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val
325 330 335
Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe
340 345 350
Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr
355 360 365
Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn
370 375 380
Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn
385 390 395 400
Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp
405 410 415
Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro
420 425 430
Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His
435 440 445
Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu
450 455 460
Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala
465 470 475 480
Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu
485 490 495
Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg
500 505 510
Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr
515 520 525
Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg
530 535 540
Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr
545 550 555 560
Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
565 570

<210> 53
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 53
caaattgtgc tgtctcagag tccagctatc ctgagcgcat ctcccggaga gaaggtgacc 60
atgacatgca gagcctccag ctctgtctcc tacatccact ggttccagca gaagcccggc 120
tcctccccaa aaccctggat ctacgccacc tctaacctgg ctagtggtgt gcctgtcagg 180
tttagtggat cagggtccgg caccagctac tctctgacaa tcagccgggt ggaggctgaa 240
gacgccgcta catactattg ccagcagtgg acttctaatc cccctacctt cggcggaggg 300
acaaagctgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642

<210> 54
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 55
<211> 1728
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 55
gaggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgagtc cctgaagatc 60
tcctgcaagg gctccggcta ctccttcacc tcctactgga tcggctgggt gaggcagatg 120
cccggcaagg gcctggagtg gatgggcatc atctaccccg gcgactccga caccaggtac 180
tccccctcct tccagggcca ggtgaccatc tccgccgaca agtccatcac caccgcctac 240
ctgcagtggt cctccctgaa ggcctccgac accgccatgt actactgcgc caggcacccc 300
tcctacggct ccggctcccc caacttcgac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360
tcctccggca gtgctagcgc cccaaccctt ttccccctcg tctcctgtga gaattccccg 420
tcggatacga gcagcgtggc cgttggctgc ctcgcacagg acttccttcc cgactccatc 480
actttctcct ggaaatacaa gaacaactct gacatcagca gcacccgggg cttcccatca 540
gtcctgagag ggggcaagta cgcagccacc tcacaggtgc tgctgccttc caaggacgtc 600
atgcagggca cagacgaaca cgtggtgtgc aaagtccagc accccaacgg caacaaagaa 660
aagaacgtgc ctcttccagt gattgctgag ctgcctccca aagtgagcgt cttcgtccca 720
ccccgcgacg gcttcttcgg caacccccgc aagtccaagc tcatctgcca ggccacgggt 780
ttcagtcccc ggcagattca ggtgtcctgg ctgcgcgagg ggaagcaggt ggggtctggc 840
gtcaccacgg accaggtgca ggctgaggcc aaagagtctg ggcccacgac ctacaaggtg 900
accagcacac tgaccatcaa agagagcgac tggctcagcc agagcatgtt cacctgccgc 960
gtggatcaca ggggcctgac cttccagcag aatgcgtcct ccatgtgtgt ccccgatcaa 1020
gacacagcca tccgggtctt cgccatcccc ccatcctttg ccagcatctt cctcaccaag 1080
tccaccaagt tgacctgcct ggtcacagac ctgaccacct atgacagcgt gaccatctcc 1140
tggacccgcc agaatggcga agctgtgaaa acccacacca acatctccga gagccacccc 1200
aatgccactt tcagcgccgt gggtgaggcc agcatctgcg aggatgactg gaattccggg 1260
gagaggttca cgtgcaccgt gacccacaca gacctgccct cgccactgaa gcagaccatc 1320
tcccggccca agggggtggc cctgcacagg cccgatgtct acttgctgcc accagcccgg 1380
gagcagctga acctgcggga gtcggccacc atcacgtgcc tggtgacggg cttctctccc 1440
gcggacgtct tcgtgcagtg gatgcagagg gggcagccct tgtccccgga gaagtatgtg 1500
accagcgccc caatgcctga gccccaggcc ccaggccggt acttcgccca cagcatcctg 1560
accgtgtccg aagaggaatg gaacacgggg gagacctaca cctgcgtggt ggcccatgag 1620
gccctgccca acagggtcac cgagaggacc gtggacaagt ccaccggtaa acccaccctg 1680
tacaacgtgt ccctggtcat gtccgacaca gctggcacct gctactga 1728

<210> 56
<211> 575
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro
115 120 125
Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser
130 135 140
Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile
145 150 155 160
Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg
165 170 175
Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln
180 185 190
Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val
195 200 205
Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro
210 215 220
Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro
225 230 235 240
Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys
245 250 255
Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg
260 265 270
Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala
275 280 285
Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu
290 295 300
Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg
305 310 315 320
Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys
325 330 335
Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser
340 345 350
Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln
370 375 380
Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro
385 390 395 400
Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu
420 425 430
Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu
435 440 445
His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn
450 455 460
Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro
465 470 475 480
Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro
485 490 495
Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly
500 505 510
Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn
515 520 525
Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn
530 535 540
Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu
545 550 555 560
Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
565 570 575

<210> 57
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 57
gacatcgtga tgacccagac ccccctgtcc tcccccgtga ccctgggcca gcccgcctcc 60
atctcctgca ggtcctccca gtccctggtg tactccgacg gcaacaccta cctgtcctgg 120
ctgcagcaga ggcccggcca gccccccagg ctgctgatct acaagatctc caacaggttc 180
tccggcgtgc ccgacaggtt ctccggctcc ggcgccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcg tgcaggccac ccagttcccc 300
ctgaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660

<210> 58
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

<210> 59
<211> 353
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr

<210> 60
<211> 340
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr
1 5 10 15
Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro
100 105 110
Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser
115 120 125
Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly
130 135 140
Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly
145 150 155 160
Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu
165 170 175
Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr
180 185 190
Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser
210 215 220
Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg
225 230 235 240
Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro
260 265 270
Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala
275 280 285
Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His
290 295 300
Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp
325 330 335
Gly Thr Cys Tyr
340

<210> 61
<211> 764
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile
1 5 10 15
Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu
20 25 30
Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn
35 40 45
Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys
50 55 60
Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn
85 90 95
Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu
100 105 110
Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser
115 120 125
Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu
130 135 140
Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln
145 150 155 160
Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val
165 170 175
Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg
180 185 190
Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn
195 200 205
Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp
210 215 220
Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His
245 250 255
Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg
260 265 270
Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys
275 280 285
Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala
305 310 315 320
Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly
325 330 335
Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile
340 345 350
Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala
355 360 365
Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp
370 375 380
Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp
385 390 395 400
Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu
405 410 415
Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr
420 425 430
Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu
435 440 445
Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu
450 455 460
Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val
465 470 475 480
Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys
485 490 495
Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly
500 505 510
Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser
515 520 525
Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys
530 535 540
Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val
545 550 555 560
Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala
565 570 575
Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg
580 585 590
Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu
595 600 605
Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser
610 615 620
Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu
625 630 635 640
Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val
645 650 655
Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val
660 665 670
Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn
675 680 685
Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr
690 695 700
Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu
705 710 715 720
Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys
725 730 735
Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr
740 745 750
Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala
755 760

<210> 62
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu Gly Asn
1 5 10 15
Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn Arg His
20 25 30
Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys Ile Thr
35 40 45
Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly Arg Ala
50 55 60
Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn Ile Ala
65 70 75 80
Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu Gly Ile
85 90 95
Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser Gln Gly
100 105 110
Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu Gly Arg
115 120 125
Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln Lys Arg
130 135 140
Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val Ile Asp
145 150 155 160
Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg Leu Asp
165 170 175
Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn Gln Leu
180 185 190
Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp Asp Ser
195 200 205
Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro Glu Pro
210 215 220
Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His Cys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg Gln Ser
245 250 255
Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys Arg Ala
260 265 270
Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys Asp Gly
275 280 285
Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala Gly Arg
290 295 300
Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly Ser Pro
305 310 315 320
Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile Pro Arg
325 330 335
Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala Val Leu
340 345 350
Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp Cys Leu
355 360 365
Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp Ser Glu
370 375 380
Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu Glu Glu
385 390 395 400
Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg
405 410 415
Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu Trp Arg
420 425 430
Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu Lys Val
435 440 445
Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val Pro Cys
450 455 460
His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys Lys Trp
465 470 475 480
Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly Pro Ser
485 490 495
Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser Leu Thr
500 505 510
Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys Gly Val
515 520 525
Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val Ala Val
530 535 540
Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala Lys Ala
545 550 555 560
Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg Glu Ile
565 570 575
Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg
580 585

<210> 63
<211> 412
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 63
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser
85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr
115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
195 200 205
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
245 250 255
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys
275 280 285
Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro
290 295 300
Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn
305 310 315 320
Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe
325 330 335
Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val
340 345 350
Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp
355 360 365
Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys
370 375 380
Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val
385 390 395 400
Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
405 410

<210> 64
<211> 393
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala
260 265 270
Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp
275 280 285
Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu
290 295 300
Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His
305 310 315 320
Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp
325 330 335
Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser
340 345 350
Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala
355 360 365
Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala
370 375 380
Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
385 390

<210> 65
<211> 415
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 65
Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
1 5 10 15
Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp
20 25 30
Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser
35 40 45
Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val
50 55 60
Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg
65 70 75 80
Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro
85 90 95
Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg
115 120 125
Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr
130 135 140
Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
165 170 175
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
180 185 190
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Thr Met
195 200 205
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr
210 215 220
Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu Lys Asp
225 230 235 240
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
245 250 255
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
260 265 270
Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
275 280 285
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
305 310 315 320
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
325 330 335
Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
340 345 350
Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
355 360 365
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
370 375 380
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser
385 390 395 400
Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
405 410 415

<210> 66
<211> 393
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 66
Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala
1 5 10 15
Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp
20 25 30
Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu
35 40 45
Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His
50 55 60
Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp
65 70 75 80
Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser
85 90 95
Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala
100 105 110
Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala
115 120 125
Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
165 170 175
Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala
180 185 190
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly
195 200 205
Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala
210 215 220
Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr
245 250 255
Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
275 280 285
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
290 295 300
Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
305 310 315 320
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp
325 330 335
Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
340 345 350
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
355 360 365
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe
370 375 380
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
385 390

<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

<210> 68
<211> 1239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 68
atgggctggt cctacatcat cctcttcctc gtggccacag ccacaggcgt ccatagccag 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cgccgaagtg aagaagcctg gcgccagcgt gaaggtgagc 120
tgcaaggctt ccggctacac cttcatctcc tacaccatgc actgggtgag gcaagctcct 180
ggccagggcc tggagtggat gggatacatc aaccctcggt ccggctatac ccactacaat 240
cagaagctga aggacaaggc caccctgacc gctgacaagt ccgcctccac cgcttacatg 300
gagctgtcct ccctgaggtc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag gtccgcctac 360
tacgactacg acggattcgc ttactggggc cagggcaccc tggtgacagt gagctccgga 420
ggaggaggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcgatatcca gatgacccag 480
agcccttcca gcctgtccgc ttccgtgggc gacagggtga ccatcacctg cagcgcttcc 540
tcctccgtgt cctacatgaa ctggtaccag cagaagcctg gcaaggcccc caagaggctg 600
atctacgaca cctccaagct ggcctccgga gtgccttcca ggttcagcgg ctccggctcc 660
ggaaccgact tcaccctgac cattagctcc ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac 720
tgccagcagt ggtccagcaa ccctcccacc ttcggcggcg gcacaaagct ggagatcaag 780
ggaggaggag gatccggtgg tggtggttct ggcggaggtg gatcccaaga agatgaaagg 840
attgttcttg ttgacaacaa atgtaagtgt gcccggatta cttccaggat catccgttct 900
tccgaagatc ctaatgagga cattgtggag agaaacatcc gaattattgt tcctctgaac 960
aacagggaga atatctctga tcccacctca ccattgagaa ccagatttgt gtaccatttg 1020
tctgacctct gtaaaaaatg tgatcctaca gaagtggagc tggataatca gatagttact 1080
gctacccaga gcaatatctg tgatgaagac agtgctacag agacctgcta cacttatgac 1140
agaaacaagt gctacacagc tgtggtccca ctcgtatatg gtggtgagac caaaatggtg 1200
gaaacagcct taaccccaga tgcctgctat cctgactga 1239

<210> 69
<211> 1248
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 69
atgaagaacc atttgctttt ctggggagtc ctggcggttt ttattaaggc tgttcatgtg 60
aaagcccaag aagatgaaag gattgttctt gttgacaaca aatgtaagtg tgcccggatt 120
acttccagga tcatccgttc ttccgaagat cctaatgagg acattgtgga gagaaacatc 180
cgaattattg ttcctctgaa caacagggag aatatctctg atcccacctc accattgaga 240
accagatttg tgtaccattt gtctgacctc tgtaaaaaat gtgatcctac agaagtggag 300
ctggataatc agatagttac tgctacccag agcaatatct gtgatgaaga cagtgctaca 360
gagacctgct acacttatga cagaaacaag tgctacacag ctgtggtccc actcgtatat 420
ggtggtgaga ccaaaatggt ggaaacagcc ttaaccccag atgcctgcta tcctgacgga 480
ggaggaggat ccggtggtgg tggttctggc ggaggtggat cccaggtgca gctggtgcag 540
tccggcgccg aagtgaagaa gcctggcgcc agcgtgaagg tgagctgcaa ggcttccggc 600
tacaccttca tctcctacac catgcactgg gtgaggcaag ctcctggcca gggcctggag 660
tggatgggat acatcaaccc tcggtccggc tatacccact acaatcagaa gctgaaggac 720
aaggccaccc tgaccgctga caagtccgcc tccaccgctt acatggagct gtcctccctg 780
aggtccgagg acaccgccgt gtactactgt gccaggtccg cctactacga ctacgacgga 840
ttcgcttact ggggccaggg caccctggtg acagtgagct ccggaggagg aggcagcggt 900
ggtggcggaa gcggtggagg tggcagcgat atccagatga cccagagccc ttccagcctg 960
tccgcttccg tgggcgacag ggtgaccatc acctgcagcg cttcctcctc cgtgtcctac 1020
atgaactggt accagcagaa gcctggcaag gcccccaaga ggctgatcta cgacacctcc 1080
aagctggcct ccggagtgcc ttccaggttc agcggctccg gctccggaac cgacttcacc 1140
ctgaccatta gctccctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcca gcagtggtcc 1200
agcaaccctc ccaccttcgg aggcggcaca aagctggaga tcaagtga 1248

Claims (121)

  1. 少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインは、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むCD20抗原結合ドメインであり、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 39または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 40または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 41または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含み; LCDR1がSEQ ID NO: 43または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 44または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含み; およびLCDR3がSEQ ID NO: 45または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含む、多量体結合分子。
  2. 少なくとも2つの二価結合単位またはその変種もしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している少なくとも2つの重鎖定常領域またはその断片を含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域(VH)および抗体軽鎖可変領域(VL)を含むCD20抗原結合ドメインであり、ここでVHがSEQ ID NO: 38と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含み、かつVLがSEQ ID NO: 42と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列を含む、多量体結合分子。
  3. 前記結合分子が、2つの二価IgA結合単位またはその断片およびJ鎖またはその断片もしくは変種を含む二量体結合分子であり、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している2つのIgA重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項1または請求項2に記載の結合分子。
  4. 分泌成分またはその断片もしくは変種をさらに含む、請求項3に記載の結合分子。
  5. IgA重鎖定常領域またはその断片が各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含む、請求項3に記載の結合分子。
  6. 1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片が、Cα1ドメインをさらに含む、請求項5に記載の結合分子。
  7. 少なくとも1つの結合単位がCD20抗原結合ドメインを2つ含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本の重鎖が同一である、請求項3～6のいずれか一項に記載の結合分子。
  8. IgA重鎖定常領域がヒトIgA定常領域である、請求項3～7のいずれか一項に記載の結合分子。
  9. 各結合単位が、IgA定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgA重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項3～8のいずれか一項に記載の結合分子。
  10. 前記結合分子が、5つまたは6つの二価IgM結合単位をそれぞれ含む五量体または六量体結合分子であり、各結合単位が、抗原結合ドメインと各々会合している2つのIgM重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項1または請求項2に記載の結合分子。
  11. IgM重鎖定常領域またはその断片が各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含む、請求項10に記載の結合分子。
  12. 1つまたは複数のIgM重鎖定常領域またはその断片が、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項10または請求項11に記載の結合分子。
  13. 五量体であり、かつJ鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をさらに含む、請求項10～12のいずれか一項に記載の結合分子。
  14. J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO：49またはその機能的断片を含む、請求項13に記載の結合分子。
  15. J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であり、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、請求項13または請求項14に記載の結合分子。
  16. 前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合されている、請求項15に記載の結合分子。
  17. ペプチドリンカーが少なくとも5つのアミノ酸、しかし25以下のアミノ酸を含む、請求項16に記載の結合分子。
  18. ペプチドリンカーが
    Figure 2023099206000021
    からなる、請求項17に記載の結合分子。
  19. 前記異種ポリペプチドが、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合されている、請求項15～18のいずれか一項に記載の結合分子。
  20. 前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項16～19のいずれか一項に記載の結合分子。
  21. 前記異種ポリペプチドの結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項20に記載の結合分子。
  22. 抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項21に記載の結合分子。
  23. 抗原結合断片がscFv断片である、請求項22に記載の結合分子。
  24. 前記異種ポリペプチドがCD3εに特異的に結合することができる、請求項20～23のいずれか一項に記載の結合分子。
  25. 改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含む、請求項24に記載の結合分子。
  26. 改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、請求項25に記載の結合分子。
  27. 改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む、請求項26に記載の結合分子。
  28. IgM重鎖定常領域がヒトIgM定常領域である、請求項10～27のいずれか一項に記載の結合分子。
  29. 各結合単位が、IgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項10～28のいずれか一項に記載の結合分子。
  30. 少なくとも1つの結合単位がCD20抗原結合ドメインを2つ含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本の重鎖が同一である、請求項10～29のいずれか一項に記載の結合分子。
  31. 少なくとも1つの結合単位内の前記2本のIgM重鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 56を含む、請求項30に記載の結合分子。
  32. 2つの軽鎖定常領域が、ヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である、請求項30または請求項31に記載の結合分子。
  33. 2つの軽鎖定常領域が、同一であり、かつアミノ酸配列SEQ ID NO: 58を含む、請求項32に記載の結合分子。
  34. CD20抗原結合ドメインを少なくとも3コピー、少なくとも4コピー、少なくとも5コピー、少なくとも6コピー、少なくとも7コピー、少なくとも8コピー、少なくとも9コピー、少なくとも10コピー、少なくとも11コピー、または少なくとも12コピー含む、請求項10～33のいずれか一項に記載の結合分子。
  35. 結合単位の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つが同一である、請求項34に記載の結合分子。
  36. CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力で、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くことができる、請求項34または請求項35に記載の結合分子。
  37. 単一特異性二価IgG1抗体が、1.5.3であり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHとアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLとを含む、請求項36に記載の結合分子。
  38. CD20発現細胞がリンパ腫細胞株である、請求項36または請求項37に記載の結合分子。
  39. 細胞株がRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である、請求項38に記載の結合分子。
  40. CD20発現細胞がRaji細胞株であり、かつ前記結合分子が、μg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも4分の1、高くとも10分の1、高くとも50分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる、請求項36～39のいずれか一項に記載の結合分子。
  41. CD20発現細胞がRamos細胞株であり、かつ前記結合分子が、モル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる、請求項36～39のいずれか一項に記載の結合分子。
  42. CD20発現細胞が、がんを有する対象における悪性B細胞である、請求項36に記載の結合分子。
  43. がんがCD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項42に記載の結合分子。
  44. がんが、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である、請求項42または請求項43のいずれか一項に記載の結合分子。
  45. 対象がヒトである、請求項42～44のいずれか一項に記載の結合分子。
  46. 請求項1～45のいずれか一項に記載の結合分子および担体を含む、組成物。
  47. IgM重鎖定常領域もしくはその断片またはIgA重鎖定常領域もしくはその断片と、CD20抗原結合ドメインの少なくとも抗体VH部分とを含む、請求項1～45のいずれか一項に記載の結合分子の重鎖ポリペプチドサブユニット
    をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  48. 重鎖ポリペプチドサブユニットが、
    (a) SEQ ID NO: 39または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含むHCDR1; SEQ ID NO: 40または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むHCDR2; SEQ ID NO: 41または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むHCDR3; あるいは
    (b) SEQ ID NO: 38と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列
    を含むVHのC末端に融合されたヒトIgM定常領域またはその断片を含む、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
  49. アミノ酸配列SEQ ID NO: 56をコードする、請求項48に記載のポリヌクレオチド。
  50. 請求項47～49のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
  51. CD20抗原結合ドメインの抗体VL部分を含む軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列をさらに含む、請求項50に記載の組成物。
  52. 軽鎖ポリペプチドサブユニットが、
    (a) SEQ ID NO: 43または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むLCDR1; SEQ ID NO: 44または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 44のアミノ酸配列を含むLCDR2; およびSEQ ID NO: 45または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 45のアミノ酸配列を含むLCDR3; あるいは
    (b) SEQ ID NO: 42と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一なアミノ酸配列
    を含むVLのC末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項51に記載の組成物。
  53. 軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 58をコードする、請求項52に記載の組成物。
  54. 重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列と軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列が、別々のベクター上にある、請求項51～53のいずれか一項に記載の組成物。
  55. 重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列および軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列が、単一のベクター上にある、請求項51～53のいずれか一項に記載の組成物。
  56. J鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をコードする核酸配列をさらに含む、請求項50～55のいずれか一項に記載の組成物。
  57. J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 49またはその機能的断片を含む、請求項56に記載の組成物。
  58. J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含む改変J鎖であり、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、請求項56または請求項57に記載の組成物。
  59. 前記異種ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項56～58のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記異種ポリペプチドが、CD3εに特異的に結合できるscFvを含む、請求項59に記載の組成物。
  61. J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含む、請求項60に記載の組成物。
  62. J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、請求項61に記載の組成物。
  63. 改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む、請求項62に記載の組成物。
  64. J鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をコードする核酸配列が、SEQ ID NO: 68またはSEQ ID NO: 69を含む、請求項56～62のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、およびJ鎖をコードする核酸配列が、単一のベクター上にある、請求項56～64のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 重鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、軽鎖ポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列、およびJ鎖をコードする核酸配列が各々、別々のベクター上にある、請求項56～64のいずれか一項に記載の組成物。
  67. 請求項55または請求項65に記載のベクター。
  68. 請求項54または請求項66に記載のベクター。
  69. 請求項47～49のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項50～66のいずれか一項に記載の組成物、または請求項67もしくは請求項68に記載のベクターを含み、請求項1～45のいずれか一項に記載の結合分子またはそのサブユニットを発現することができる、宿主細胞。
  70. 請求項69に記載の宿主細胞を培養する段階、および結合分子を回収する段階を含む、請求項1～45のいずれか一項に記載の結合分子を産生する方法。
  71. 請求項1～45のいずれか一項に記載の結合分子または請求項46に記載の組成物とCD20発現細胞を接触させる段階を含む、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法であって、前記結合分子が、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷を導くことができる、方法。
  72. 単一特異性二価IgG1抗体が、1.5.3であり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 38を有するVHとアミノ酸配列SEQ ID NO: 42を有するVLとを含む、請求項71に記載の方法。
  73. CD20発現細胞がリンパ腫細胞株である、請求項71または請求項72に記載の方法。
  74. 細胞株がRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である、請求項73に記載の方法。
  75. CD20発現細胞がRaji細胞株であり、かつ前記結合分子が、μg/ml単位で測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも4分の1、高くとも10分の1、高くとも50分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導く、請求項71～74のいずれか一項に記載の方法。
  76. CD20発現細胞がRamos細胞株であり、かつ前記結合分子が、モル当量として測定して、等量の単一特異性二価IgG1抗体のIC50の高くとも10分の1、高くとも20分の1、高くとも30分の1、高くとも40分の1、高くとも50分の1、高くとも60分の1、高くとも70分の1、高くとも80分の1、高くとも90分の1、または高くとも100分の1のIC50で補体媒介性殺傷を導くことができる、請求項71～74のいずれか一項に記載の方法。
  77. CD20発現細胞が、がんを有する対象における悪性B細胞である、請求項71または請求項72に記載の方法。
  78. がんがCD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項77に記載の方法。
  79. がんが、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である、請求項77～78のいずれか一項に記載の方法。
  80. 2つ、5つ、または6つの二価結合単位をそれぞれ含む二量体、五量体、または六量体結合分子とCD20発現細胞を接触させる段階を含む、CD20発現細胞の補体媒介性殺傷、T細胞媒介性殺傷、または補体媒介性殺傷とT細胞媒介性殺傷の両方を導くための方法であって、各結合単位が、2つのIgAもしくはIgM重鎖定常領域またはその断片および2つの抗原結合ドメインを含み、前記結合分子の少なくとも1つの抗原結合ドメインがCD20抗原結合ドメインであり、かつ前記結合分子が、CD20抗原結合ドメインと同じCD20エピトープに特異的に結合する等量の単一特異性二価IgG1抗体またはその断片よりも高い効力でCD20発現細胞の補体媒介性殺傷を導くことができる、方法。
  81. CD20抗原結合ドメインが、6つの免疫グロブリン相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここでHCDR1がSEQ ID NO: 2または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含み; HCDR2がSEQ ID NO: 3または1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含み; HCDR3がSEQ ID NO: 4または1つ、2つ、もしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 10またはSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含み; LCDR1がSEQ ID NO: 6または1つ、2つ、もしくは3つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含み; LCDR2がSEQ ID NO: 7または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含み; かつLCDR3がSEQ ID NO: 8または1つもしくは2つの単一アミノ酸置換を有するSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を含む、請求項80に記載の方法。
  82. CD20抗原結合ドメインが、
    (a) SEQ ID NO: 1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 5と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
    (b) SEQ ID NO: 9と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 11と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
    (c) SEQ ID NO: 15と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 18と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
    (d) SEQ ID NO: 22もしくはSEQ ID NO: 23と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、もしくはSEQ ID NO: 29と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列;
    (e) SEQ ID NO: 30と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 32と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列; または
    (f) SEQ ID NO: 35と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 37と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一なアミノ酸配列
    をそれぞれ含むVHおよびVLを含む、請求項80に記載の方法。
  83. IgA重鎖定常領域またはその断片が各々、Cα2ドメインまたはCα3-tpドメインを含む、請求項80～82のいずれか一項に記載の方法。
  84. 1つまたは複数のIgA重鎖定常領域またはその断片が、Cα1ドメインをさらに含む、請求項83に記載の方法。
  85. IgA重鎖定常領域がヒトIgA定常領域である、請求項83または請求項84に記載の方法。
  86. 前記結合分子が分泌成分をさらに含む、請求項83～85のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記結合分子のIgM重鎖定常領域またはその断片が各々、Cμ3ドメインおよびCμ4-tpドメインを含む、請求項80～82のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記結合分子の1つまたは複数のIgM重鎖定常領域またはその断片が、Cμ2ドメイン、Cμ1ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項87に記載の方法。
  89. 前記結合分子が、五量体であり、かつJ鎖またはその機能的断片またはその機能的変種をさらに含む、請求項83～88のいずれか一項に記載の方法。
  90. J鎖またはその断片が、アミノ酸配列SEQ ID NO：49またはその機能的断片を含む、請求項89に記載の方法。
  91. J鎖またはその断片が、異種ポリペプチドをさらに含み、該異種ポリペプチドがJ鎖またはその断片に直接的または間接的に融合されている、請求項89または請求項90に記載の方法。
  92. 前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介してJ鎖またはその断片に融合されている、請求項91に記載の方法。
  93. ペプチドリンカーが少なくとも5つのアミノ酸、しかし25以下のアミノ酸を含む、請求項92に記載の方法。
  94. ペプチドリンカーが
    Figure 2023099206000022
    からなる、請求項93に記載の方法。
  95. 前記異種ポリペプチドが、J鎖もしくはその断片のN末端に、J鎖もしくはその断片のC末端に、またはJ鎖もしくはその断片のN末端とC末端の両方に融合されている、請求項91～94のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項91～95のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記異種ポリペプチドの結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項96に記載の方法。
  98. 抗原結合断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv (scFv)断片、ジスルフィド結合Fv (sdFv)断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項97に記載の方法。
  99. 抗原結合断片がscFv断片である、請求項98に記載の方法。
  100. 前記異種ポリペプチドがCD3εに特異的に結合することができる、請求項97～99のいずれか一項に記載の方法。
  101. 改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 64 (V15J)またはSEQ ID NO: 66 (J15V)を含む、請求項100に記載の方法。
  102. 改変J鎖がシグナルペプチドをさらに含む、請求項101に記載の方法。
  103. 改変J鎖がアミノ酸配列SEQ ID NO: 63 (V15J)またはSEQ ID NO: 65 (J15V)を含む、請求項102に記載の方法。
  104. IgM重鎖定常領域がヒトIgM定常領域である、請求項87～103のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記結合分子の各結合単位が、IgAもしくはIgM定常領域またはその断片のアミノ末端に位置するVHを各々含む2本のIgAもしくはIgM重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するVLを各々含む2本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項83～104のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記結合分子の少なくとも1つの結合単位が、2つの同一のCD20抗原結合ドメインを含み、かつ該少なくとも1つの結合単位内の2本のIgAまたはIgM重鎖が同一である、請求項105に記載の方法。
  107. 少なくとも1つの結合単位内の前記2本のIgM重鎖が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 52を含む、請求項106に記載の方法。
  108. 2つの軽鎖定常領域がヒトλ定常領域またはヒトκ定常領域である、請求項107に記載の方法。
  109. 軽鎖が、同一であり、かつアミノ酸配列SEQ ID NO: 54を含む、請求項108に記載の方法。
  110. 前記結合分子が、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインを含む、請求項80～109のいずれか一項に記載の方法。
  111. 少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または少なくとも12個のCD20抗原結合ドメインが同一である、請求項110に記載の方法。
  112. 前記結合分子内の結合単位の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個が同一である、請求項110または請求項111に記載の方法。
  113. 単一特異性二価IgG1抗体が、リツキシマブであり、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を有するVHとアミノ酸配列SEQ ID NO: 5を有するVLとを含む、請求項80～112のいずれか一項に記載の方法。
  114. CD20発現細胞がリンパ腫細胞株である、請求項80～113のいずれか一項に記載の方法。
  115. 細胞株がRamos細胞株、Raji細胞株、Daudi細胞株、Namalwa細胞株、Granta細胞株、Z138細胞株、DoHH2細胞株、またはDB細胞株である、請求項114に記載の方法。
  116. 細胞株がGranta細胞株であり、かつ前記結合分子が、リツキシマブの効力の約6倍の効力で該細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる、請求項115に記載の方法。
  117. 細胞株がRaji細胞株またはRamos細胞株であり、かつ前記結合分子が、リツキシマブの効力の約3倍の効力で該細胞株の補体媒介性殺傷を導くことができる、請求項115に記載の方法。
  118. CD20発現細胞が、がんを有する対象における悪性B細胞である、請求項80～112のいずれか一項に記載の方法。
  119. がんがCD20陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項118に記載の方法。
  120. がんが、リツキシマブ療法に対して最小応答性または非応答性である、請求項118または請求項119のいずれか一項に記載の方法。
  121. 対象がヒトである、請求項118～120のいずれか一項に記載の方法。
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