CN113311162B - 用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物和医学技术领域，公开了一种用于鉴别良恶性肺结节的血浆外泌体自身抗体组合及应用，所述用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合包括：P53、PGP9、SOX2、GAGE7、GBU4‑5、MAGE和CAGE；所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括：外周血的血浆和血清分离；外泌体的提取；外泌体的鉴定；肺癌自身抗体的检测；比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力。本发明很好地弥补了缺乏诊断肺结节良恶性标志物的现状，与传统生物标志物相比，大大提高了疾病诊断的敏感性和特异性，具有广阔的市场应用前景。同时，本发明简单快速、经济实用且便于临床开展，具有深远的临床意义和推广性。

Description

用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用

技术领域

本发明属于生物和医学技术领域，尤其涉及一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用。

背景技术

目前，肺癌是我国发病率和死亡率均排名第一位的恶性肿瘤。近年来，随着靶向治疗和细胞免疫治疗的使用，肺癌治疗效果取得了一定进展，但目前我国肺癌患者5年生存率仍不足15％。统计结果显示，当肺癌发现于早期(I-II期)时，五年生存率大于50％，如果肺癌发现于晚期或者已发生转移，五年生存率则只有5％；而现实中只有16％的肺癌患者能在早期被发现。因此，肺癌早期筛查的开展和应用推广具有非常重要的意义。早期肺癌表现通常为肺结节，但肺结节既包含良性肿瘤也包含恶性肿瘤，所以对肺结节良恶性抗体表达的鉴别，对于肺癌早期发现具有非常重要的意义。目前肺结节良恶性鉴别诊断，主要依靠肿瘤标志物(包括癌胚抗原、糖类抗原125、鳞状细胞抗原、神经元特异性烯醇化酶、胃泌素释放肽前体和细胞角蛋白21-1)、低剂量CT(Low-Dose Computed Tomography，LDCT)检查及组织病理活检等。然而这些方法仍然存在一些问题，目前肿瘤标志物单独检测恶性结节的临床敏感性太低，无法满足临床需要；采用胸部低剂量CT对高危人群进行筛查可使肺癌的病死率下降20％，但低剂量螺旋CT仅可识别肺结节，但对肺结节良恶性鉴别诊断敏感性比较低，即高达96.4％的假阳性率，这给患者带来一些困扰。因此探索肺结节良恶性诊断的新方法具有重要的临床意义。

在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞内表达异常的蛋白可刺激机体免疫系统产生抗体，这些抗体称之为肿瘤自身抗体。人体免疫系统如同一个有效的生物信号放大系统，只要存在微量的肿瘤抗原，通过持续的诱导，就可以在血清中检测到相应的抗体，且抗体可以在外周血中长期、稳定的存在。自身抗体的产生可能先于疾病症状，持续数月或数年。因此，循环中肿瘤相关自身抗体的检测或是癌症早期检测的可行方法。1966年，美国科学家Baldwin发现在癌症发展的极早期阶段，人体免疫系统可以产生针对肿瘤细胞的特异性自身抗体。随后，分别在1970年和1995年，科学家Taylor和Wasserman研究团队最早发现了乳腺癌自身抗体和肺癌自身抗体。2015年，肺癌血清七种自身抗体诊断试剂盒(P53、MAGEA1、SOX2、GBU4-5、PGP9.5、CAGE和GAGE7自身抗体)在中国上市。

虽然肺癌七种自身抗体在肺癌早期诊断的敏感性显著优于传统血清学肿瘤标志物(CEA、CA211、SCC、NSE和ProGRP)。但自身抗体检测在肺癌诊断中具有一定的局限性，(1)敏感性较低，不是所有肺癌患者都能检测到相应的自身抗体，特别是单一自身抗体敏感性较低，联合检测敏感性也只有50-60％；(2)准确度不高，阳性结果具有辅助诊断价值，阴性结果却不能排除肺癌；(3)特异性不足，不是所有阳性抗体均能诊断肺癌。(4)目前关于肺癌自身抗体在肿瘤免疫反应中的作用机制有待进一步阐明。

外泌体(exosome)是一种可由多种细胞分泌的微小囊泡，直径为40-120nm，具有脂质双分子层结构。外泌体可以通过血液、脑脊液等在机体内传递，介导细胞与细胞间的信息通信，从而促进细胞的多种生物功能发生改变，并参与癌症的发生和转移。来自首都医科大学宣武医院神经疾病高创中心贾建平教授课题组在一项临床研究中提示了外泌体突触蛋白具有在无症状阶段预测AD(阿尔兹海默症)的能力，外泌体GAP43、神经颗粒蛋白，SNAP25和突触结合蛋白1可在发生认知障碍之前的5至7年预测AD并作为有效生物标志物。此外，来自美国MD Anderson癌症中心的SamirM.Hanash教授团队研究了肿瘤相关外泌体对胰腺癌中自身抗体库的贡献。该研究证明了肿瘤来源的外泌体与血浆中的循环免疫球蛋白结合，特别是肿瘤外泌体的膜表面具有作为自身抗体靶标的大量肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens,TAAs)库。该研究发现外泌体TAAs可能发挥免疫原的作用，诱导机体产生抗体；同时，肿瘤来源外泌体与血浆中的循环免疫球蛋白(抗体)结合，减弱补体依赖的细胞毒作用，发挥协助免疫逃逸的作用。更重要的是，外泌体可以从众多体液中获得(血液、尿液等)，这使得外泌体检测在肿瘤诊疗中极具前途，成为一种较为理想的“液体活检”方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)目前肿瘤标志物单独检测恶性结节的临床敏感性太低，无法满足临床需要；采用胸部LDCT对高危人群进行筛查的方法，经LDCT筛查出的早期肺癌多呈肺结节表现，针对1cm以下的微小肺结节，单纯依靠影像学判断结节的良恶性非常困难，LDCT假阳性率较高，给患者带来一些困扰。

(2)自身抗体检测在肺癌诊断中敏感性较低，不是所有肺癌患者都能检测到相应的自身抗体，特别是单一自身抗体敏感性较低，联合检测敏感性也只有50-60％。

(3)自身抗体检测在肺癌诊断中准确度不高，阳性结果具有辅助诊断价值，阴性结果却不能排除肺癌；特异性不足，不是所有阳性抗体均能诊断肺癌。

解决以上问题及缺陷的难度为：LDCT适用于肺癌早期筛查，但特异性不足，特别是针对1cm以下的微小肺结节，穿刺漏检率高，单纯依靠影像学判断结节的良恶性非常困难，缺少客观的判别标准，容易造成患者恐慌。肺癌自身抗体检测虽然能够满足部分患者需求，但敏感性和特异性不足，目前临床上缺少肺癌早期诊断血液标志物。

解决以上问题及缺陷的意义为：不同医院以及不同医生在肺癌影像诊断经验上差异很大，结果有的良性结节可能被误诊为肺癌，给患者造成不必要的恐慌，同时带来过度的检查和治疗；另一方面恶性结节也存在被姑息的可能，错过肺癌的最佳治疗阶段。如何进行肺结节的正确分类和处理成为肺癌早筛成功实施的关键，准确鉴别肺结节特别是微小肺结节性质，才能真正实现“早防早治”。因此，临床上亟需一种更加精确的检测技术辅助LDCT对良恶性肺结节做更精准的判别。

与传统肺癌血清自身抗体相比，血浆外泌体自身抗体在良恶性肺结节鉴别诊断方面具有更高的敏感性和特异性，血浆外泌体自身抗体可作为肺癌早期诊断的标志物。本发明有望成为辅助肺结节特别是微小肺结节的良恶性精准判别的有效手段，结合LDCT影像结果为临床医生提供更加客观的判断标准。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用，旨在解决临床肺结节良恶性诊断困难且有创的问题。

本发明是这样实现的，一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合，所述用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合包括：P53、PGP9、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE和CAGE。采用1ml血浆标本提取外泌体，所提外泌体全部溶解于545μL样本稀释液中，一次性完成七种抗体检测。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法，所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括：

(1)收集初次诊断肺结节的患者血清和血浆标本，采用超速离心法提取血浆外泌体，使用纳米跟踪分析系统检测外泌体粒径大小和颗粒数，采用WB检测外泌体特异性蛋白TSG101和CD63指标；同时检测同一患者的血浆外泌体和血清自身抗体表达水平，统计分析两种标本类型的自身抗体表达水平在肺癌良恶性结节鉴别诊断效率，制定血浆外泌体自身抗体的阈值和判断标准。

(2)采用美国MD安德森癌症中心肺癌早期筛查项目和国家癌症中心肺癌队列研究标本，所有筛查人群均有完整的流行病学资料，LDCT影像学资料和后期随访结果；比较血浆外泌体自身抗体与血清自身抗体在肺癌早期筛查中的敏感性和诊断效率。

(3)通过常用肺癌细胞株，提取细胞上清液外泌体，通过WB鉴定外泌体表面抗原的存在；通过提取血浆外泌体，采用荧光标记和免疫金微球标记，通过共聚焦显微镜和电镜观察血浆外泌体抗原表面是否结合自身抗体。

进一步，所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括以下步骤：

步骤一，外周血的血浆和血清分离；

步骤二，外泌体的提取；

步骤三，外泌体的鉴定；

步骤四，肺癌自身抗体的检测；

步骤五，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力。

进一步，步骤一中，所述外周血的血浆和血清分离，包括：

收集每位患者或体检者的抗凝及非抗凝血，于4℃，水平离心机3000r/min离心10min，分离血浆和血清；以微量移液器将上层血清或血浆转移并分装至1.5mL进口EP管中，-80℃保存备用或4℃放置立即使用。

进一步，步骤二中，所述外泌体的提取，包括：

(1)将血清或血浆样本自-80℃取出并置4℃复融；以4℃，3000r/min离心10min去除残余细胞碎片；

(2)微量移液器转移1mL血清或血浆至干净的超速离心管；

(3)采用Beckman台式超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，吸弃上清，并留50μL，用1mL PBS溶液重悬沉淀；

(4)超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，小心的吸弃上清，不要完全吸干净，用50μL PBS重悬沉淀，4℃保存。

进一步，步骤三中，所述外泌体的鉴定，包括：

通过纳米颗粒跟踪分析法NTA分析细胞上清及血浆外泌体的粒径，细胞上清外泌体粒径范围在40-150nm，血浆外泌体的粒径范围在35-135nm；采用蛋白印迹法检测其表面的外泌体标志物TSG101和CD63指标。

通过所述外泌体的鉴定方法获得的血浆外泌体的粒径不均一，NTA显示平均粒径主要分布在102nm附近；外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在30-150nm之间；表达CD9外泌体的特异性标志分子。

进一步，步骤四中，所述肺癌自身抗体的检测的准备工作，包括：

(1)实验前所有试剂应平衡至室温，即18-25℃，混匀；

(2)洗液工作液：将10倍洗液用纯化水或蒸馋水稀释10倍，配制洗液工作液；洗液工作液在4℃可保存一周；

(3)待测样本稀释：在1.5mL EP管中加入545μL样本稀释液，再将5μL待测样本加入样本稀释液中；

其中，所述校准品/质控品/上样控制品包括：试剂盒试的校准品浓度分别为0、3.75、7.5、15、30、60U/mL，分别标记为①②③④⑤⑥，质控品I靶值范围为6.0-9.0U/mL，质控品II靶值范围为24.0-36.0U/mL，标记为⑦和⑧；上样控制品：30U/mL，浓度标记为⑨；

(4)酶结合工作液：以1：19的比例混合“酶结合物浓缩液”和“酶结合物稀释液”至实验所需体积，标记为酶结合物工作液，并于使用前15min配制；

(5)显色剂：以1：19的比例混合“显色剂A液”和“显色剂B叫”至实验所需体积，标记为显色剂。

进一步，步骤四中，所述肺癌自身抗体的检测，包括：

采用ELISA试剂盒对各组患者的血清和血浆外泌体标本进行集中检测，读取酶标仪位于450nm处的吸光度值，包括：

(1)取出固相板，每孔加入200-300μL PBS缓冲液，洗板1次，最后在干净的吸水纸上拍干；

(2)加样：依次加入50μL质控品，校准品，上样控制品，稀释好的待测样本在相应微孔中，轻轻震荡固相板，确保所有微孔底部都被溶液覆盖，贴封板膜，将固相板置室温震荡孵育60min；

(3)洗板：甩去孔内液体，在干净的吸水纸上拍干；每孔加洗液工作液200-300μL，甩干，重复洗板3次，最后在干净的吸水纸上拍干；

(4)每孔加入稀释好的酶结合物工作液50μL，轻轻振荡，贴封板膜，将固相板置室温震荡孵育30min；

(5)洗板，重复步骤(3)；

(6)显色：每孔加入混合好的显色剂100μL，室温避光振荡孵育15min；与加入显色剂相同的顺序，每孔加入终止液50μL，轻轻震荡；

(7)读数：反应结束30min内用酶标仪读取OD450值。

血清自身抗体正常参考范围为：P53：0-13.1U/mL、PGP9.5：0-11.1U/mL、SOX2：0-10.3U/mL、GAGE7：0-14.4U/mL、GBU4-5：0-7.0U/mL、MAGE：0-11.9U/mL、CAGE：0-7.2U/mL，任意一种自身抗体浓度超过其参考范围即为阳性，七种自身抗体浓度均在参考值范围内即为阴性。

进一步，步骤五中，所述比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力，包括：

采用受试者工作特征曲线，即ROC曲线，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别诊断良恶性肺结节的能力。

本发明的另一目的在于提供一种所述的用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合在制备用于鉴别肺结节良恶性的诊断试剂盒中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合，采用血浆外泌体自身抗体组合作为辅助肺结节特别是微小肺结节的良恶性精准判别的有效手段，通过检测良恶性肺结节组患者血清和血浆外泌体中七种自身抗体组合的表达水平，采用受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,ROC曲线)评价七种自身抗体组合的诊断效率。结果发现与血清自身抗体相比，血浆外泌体自身抗体在良恶性肺结节鉴别诊断方面具有显著优势。本发明中血浆外泌体自身抗体组合作为一种稳定、微创、实时监测的生物标志物，提高了良恶性肺结节鉴别的准确性，具有深远的临床意义和推广性。

同时，本发现很好的弥补了缺乏诊断肺结节良恶性标志物的现状，与传统生物标志物相比，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，并有广阔的市场应用前景。该方法简单快速、经济实用且便于临床开展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法流程图。

图2是本发明实施例提供的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法原理图。

图3是本发明实施例提供的采用血浆外泌体和血清标本检测自身抗体单项指标在肺结节良恶性鉴别诊断效率示意图。

图4是本发明实施例提供的血浆外泌体和血清标本联合检测七个自身抗体在肺癌鉴别诊断效率示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合包括：P53、PGP9、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE和CAGE。

如图1所示，本发明实施例提供的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括以下步骤：

S101，外周血的血浆和血清分离；

S102，外泌体的提取；

S103，外泌体的鉴定；

S104，肺癌自身抗体的检测；

S105，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力。

本发明实施例提供的肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法原理图如图2所示。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、本发明的首要目的在于解决临床肺结节良恶性诊断困难且有创的问题，采用血浆外泌体自身抗体组合作为辅助肺结节特别是微小肺结节的良恶性精准判别的有效手段。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

收集初次诊断肺结节的患者血清和血浆标本，采用超速离心法提取血浆外泌体，使用纳米跟踪分析系统检测外泌体粒径大小和颗粒数，采用WB检测外泌体特异性蛋白TSG101，CD63等指标。同时检测同一患者的血浆外泌体和血清自身抗体表达水平，统计分析两种标本类型的自身抗体表达水平在肺癌良恶性结节鉴别诊断效率，制定血浆外泌体自身抗体的阈值和判断标准。

采用美国MD安德森癌症中心(MD Anderson)肺癌早期筛查项目和国家癌症中心肺癌队列研究标本，所有筛查人群均有完整的流行病学资料，LDCT影像学资料和后期随访结果。比较血浆外泌体自身抗体与血清自身抗体在肺癌早期筛查中的敏感性和诊断效率。

通过常用肺癌细胞株，提取细胞上清液外泌体，通过WB鉴定外泌体表面抗原的存在。然后通过提取血浆外泌体，采用荧光标记和免疫金微球标记，通过共聚焦显微镜和透射电镜观察血浆外泌体抗原表面是否结合自身抗体。

通过补体依赖的细胞毒实验阐明外泌体递呈肿瘤抗原，诱导肺癌自身抗体产生，同时，肿瘤来源外泌体与血浆中的循环免疫球蛋白(抗体)结合，减弱补体依赖的细胞毒作用，发挥协助免疫逃逸的作用。

本发明的有益效果在于：本发现很好的弥补了缺乏诊断肺结节良恶性标志物的现状，与传统生物标志物相比，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，并有广阔的市场应用前景。该方法简单快速、经济实用且便于临床开展。

本领域技术人员应当理解，凡是以检测血浆外泌体自身抗体组合的表达量为目的，用于判断待测样品是否来自肺癌患者的诊断试剂盒、评价体系、诊断方法都属于本发明的保护范围。

2、发明内容

2.1定义

本文所使用的“良性肺结节”指孤立性肺结节是指四周被含气肺组织包围的、单发的、圆形或类圆形的、直径≤3cm的不透明病灶。根据胸部CT表现，肺结节分为实性结节及磨玻璃结节内均一的高密度软组织影，磨玻璃结节定义为CT上表现为圆形或类圆形的密度增高区，边界清晰，而不影响肺间质结构的显示。

本发明所用的“肺恶性肿瘤”，是指肺部的恶性肿瘤，特征为肺部组织中的细胞不受控制地生长。肺癌包括小细胞肺癌(small-cell lung carcinoma，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)。

2.2研究对象

选取2020年9月至2021年1月中国科学技术大学附属第一医院西区初次诊断肺结节的患者，收集他们的血清和血浆标本，病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。根据病理结果将患者分为良性病变组和恶性病变组。另选同时期健康体检者的血清或血浆作为正常对照组。研究组和健康对照组在性别、年龄间无统计学差异(P＞0.05)。

2.3实验过程

1.外周血的血浆和血清分离：

收集每位患者或体检者的抗凝及非抗凝血，于4℃，水平离心机3000r/min离心10min，分离血浆和血清。以微量移液器将上层血清或血浆转移并分装至1.5ml进口EP管中，-80℃保存备用或4℃放置立即使用。

2.外泌体的提取：

1)将血清或血浆样本自-80℃取出并置4℃复融；以4℃，3000r/min离心10min去除残余细胞碎片等；

2)微量移液器转移1mL血清或血浆至干净的超速离心管；

3)采用Beckman台式超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，小心的吸弃上清，不要完全吸干净，留约50μL，用1mL PBS溶液重悬沉淀；

4)超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，小心的吸弃上清，不要完全吸干净，用50μL PBS重悬沉淀，4℃保存；

3.外泌体鉴定：

通过NTA法(Nanoparticle Tracking Analysis：纳米颗粒跟踪分析法)分析细胞上清及血浆外泌体的粒径，细胞上清外泌体粒径范围在40-150nm，血浆外泌体的粒径范围在35-135nm。并采用蛋白印迹法检测其表面的外泌体标志物TSG101，CD63等指标。

本实验通过该方法获得的血浆外泌体的粒径不均一，NTA显示平均粒径主要分布在102nm附近；外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在30-150nm之间；表达CD63外泌体的特异性标志分子。

4.肺癌自身抗体的检测

采用ELISA试剂盒(杭州凯保罗生物技术有限公司)对各组患者的血清和血浆外泌体标本进行集中检测，读取酶标仪位于450nm处的吸光度值。

具体步骤如下：

准备工作：

1)实验前所有试剂应平衡至室温(18-25℃)，混匀。

2)洗液工作液：将10倍洗液用纯化水或蒸馋水稀释10倍，配制洗液工作液。洗液工作液在4℃可保存一周。

3)待测样本稀释：在1.5mL EP管中加入545μL样本稀释液，再将5μL待测样本加入样本稀释液中。

校准品/质控品/上样控制品：试剂盒试的校准品浓度分别为0、3.75、7.5、15、30、60U/mL，分别标记为①②③④⑤⑥，质控品I靶值范围为6.0-9.0U/mL，质控品II靶值范围为24.0～36.0U/mL，标记为⑦和⑧；上样控制品：30U/mL，浓度标记为⑨。

4)酶结合工作液：以1：19的比例混合“酶结合物浓缩液”和“酶结合物稀释液”至实验所需体积，标记为酶结合物工作液。建议使用前15min配制。

5)显色剂：以1：19的比例混合“显色剂A液”和“显色剂B叫”至实验所需体积，标记为显色剂。

具体步骤

1)取出固相板，每孔加入200-300μL PBS缓冲液，洗板1次，最后在干净的吸水纸上拍干。

2)加样：依次加入50μL质控品，校准品，上样控制品，稀释好的待测样本在相应微孔中，轻轻震荡固相板，确保所有微孔底部都被溶液覆盖，贴封板膜，将固相板置室温震荡孵育60min。

3)洗板：甩去孔内液体.在干净的吸水纸上拍干。每孔加洗液工作液200-300μL，甩干，重复上述歩骤一共洗板3次，最后在干净的吸水纸上拍干。

4)每孔加入稀释好的酶结合物工作液50μL，轻轻振荡，贴封板膜，将固相板置室温震荡孵育30min。

5)洗板，重复步骤3。

6)显色：每孔加入混合好的显色剂100μL，室温避光振荡孵育15min。与加入显色剂相同的顺序，每孔加入终止液50μL，轻轻震荡。

7)读数：反应结束30min内用酶标仪读取OD450值。

血清自身抗体正常参考范围：P53：0-13.1U/mL、PGP9.5：0-11.1U/mL、SOX2：0-10.3U/mL、GAGE7：0-14.4U/mL、GBU4-5：0-7.0U/mL、MAGE：0-11.9U/mL、CAGE：0-7.2U/mL，任意一种自身抗体浓度超过其参考范围即为阳性，七种自身抗体浓度均在参考值范围内即为阴性。

5.比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力

采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别诊断良恶性肺结节的能力。如图3所示，与血清自身抗体相比，血浆外泌体自身抗体鉴别肺结节良恶性的敏感性较高，诊断效率也较高。AUC值是ROC曲线线下面积，区间范围在0-1，值越接近1，说明鉴别良恶性肺结节的效率越高。p value(AUC)是指FHL1能够区分两组样本的可信度，值小于0.05即代表可信。值越小可信度越高。敏感性和特异性两个数值是根据AUC值计算出来的，敏感性代表血浆外泌体自身抗体检出肺癌的真阳性概率。特异性代表血浆外泌体自身抗体检出肺癌真阴性的概率。

此外，如图4所示，七种自身抗体联合检测时血浆外泌体自身抗体的敏感性更高，诊断效率更高。本实施例中证明采用血浆外泌体自身抗体作为鉴别肺结节良恶性的生物标志物具有非常大的优势。

表1血清标本和血浆外泌体标本检测肺癌自身抗体鉴别肺癌组和健康最对照组

表2血清标本和外泌体标本检测肺癌自身抗体鉴别肺癌组和肺良性结节组

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合在制备用于鉴别肺结节良恶性的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述用于鉴别肺结节良恶性的血浆外泌体自身抗体组合包括：P53、PGP9、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE和CAGE；采用1ml血浆标本提取外泌体，所提外泌体全部溶解于545μL样本稀释液中，一次性完成七种抗体检测；

所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括：

(1)收集初次诊断肺结节的患者血清和血浆标本，采用超速离心法提取血浆外泌体，使用纳米颗粒跟踪分析系统检测外泌体粒径大小和颗粒数，采用WB检测外泌体特异性蛋白TSG101和CD63指标；同时检测同一患者的血浆外泌体和血清自身抗体表达水平，统计分析两种标本类型的自身抗体表达水平在肺癌良恶性结节鉴别诊断效率，制定血浆外泌体自身抗体的阈值和判断标准；

(2)比较血浆外泌体自身抗体与血清自身抗体在肺癌早期筛查中的敏感性和诊断效率；

(3)通过常用肺癌细胞株，提取细胞上清液外泌体，通过WB鉴定外泌体表面抗原的存在；通过提取血浆外泌体，采用荧光标记和免疫金微球标记，通过共聚焦显微镜和透射电镜观察血浆外泌体抗原表面是否结合自身抗体；

所述肺结节良恶性抗体表达的鉴别方法包括以下步骤：

步骤一，外周血的血浆和血清分离：所述外周血的血浆和血清分离，包括：收集抗凝及非抗凝血，于4℃，水平离心机3000r/min离心10min，分离血浆和血清；以微量移液器将上层血清或血浆转移并分装至1.5mL进口EP管中，-80℃保存备用或4℃放置立即使用；

步骤二，外泌体的提取：

(1)将血清或血浆样本自-80℃取出并置4℃复融；以4℃，3000r/min离心10min去除残余细胞碎片；

(2)微量移液器转移1mL血清或血浆至干净的超速离心管；

(3)采用Beckman台式超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，吸弃上清，并留50μL，用1mLPBS溶液重悬沉淀；

(4)超速离心机于4℃条件下100000g离心1h，小心的吸弃上清，不要完全吸干净，用50μLPBS重悬沉淀，4℃保存；

步骤三，外泌体的鉴定：通过纳米颗粒跟踪分析法NTA分析细胞上清及血浆外泌体的粒径，细胞上清外泌体粒径范围在40-150nm，血浆外泌体的粒径范围在35-135nm；采用蛋白印迹法检测其表面的外泌体标志物TSG101和CD63指标；通过所述外泌体的鉴定方法获得的血浆外泌体的粒径不均一，NTA显示平均粒径主要分布在102nm附近；外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在30-150nm之间；表达CD9外泌体的特异性标志分子；

步骤四，肺癌自身抗体的检测，包括肺癌自身抗体的检测的准备工作以及肺癌自身抗体的检测过程；其中，所述肺癌自身抗体的检测的准备工作包括：

(1)实验前所有试剂应平衡至室温，即18-25℃，混匀；

(2)洗液工作液：将10倍洗液用纯化水或蒸馋水稀释10倍，配制洗液工作液；洗液工作液在4℃可保存一周；

(3)待测样本稀释；在1.5mLEP管中加入545μL样本稀释液，再将5μL待测样本加入样本稀释液中；其中，校准品/质控品/上样控制品包括：试剂盒试的校准品浓度分别为0、3.75、7.5、15、30、60U/mL，分别标记为①②③④⑤⑥，质控品I靶值范围为6.0-9.0U/mL，质控品II靶值范围为24.0-36.0U/mL，标记为⑦和⑧；上样控制品：30U/mL，浓度标记为⑨；

(4)酶结合工作液：以1∶19的比例混合“酶结合物浓缩液”和“酶结合物稀释液”至实验所需体积，标记为酶结合物工作液，并于使用前15min配制；

(5)显色剂：以1∶19的比例混合“显色剂A液”和“显色剂B液”至实验所需体积，标记为显色剂；

所述肺癌自身抗体的检测包括：采用ELISA试剂盒对各组患者的血清和血浆外泌体标本进行集中检测，读取酶标仪位于450nm处的吸光度值，包括：

(1)取出固相板，每孔加入200-300μLPBS缓冲液，洗板1次，最后在干净的吸水纸上拍干；

(2)加样：依次加入50μL质控品，校准品，上样控制品，稀释好的待测样本在相应微孔中，轻轻震荡固相板，确保所有微孔底部都被溶液覆盖，贴封板膜，将固相板置室温震荡孵育60min；

(3)洗板：甩去孔内液体，在干净的吸水纸上拍干；每孔加洗液工作液200-300μL，甩干，重复洗板3次，最后在干净的吸水纸上拍干；

(4)每孔加入稀释好的酶结合物工作液50μL，轻轻振荡，贴封板膜，将固相板置室温震荡孵育30min；

(5)洗板，重复步骤(3)；

(6)显色：每孔加入混合好的显色剂100μL，室温避光振荡孵育15min；与加入显色剂相同的顺序，每孔加入终止液50μL，轻轻震荡；

(7)读数：反应结束30min内用酶标仪读取0D450值；其中，所述血清自身抗体正常参考范围为：P53：0-13.1U/mL、PGP9.5：0-11.1U/mL、SOX2：0-10.3U/mL、GAGE7：0-14.4U/mL、GBU4-5：0-7.0U/mL、MAGE：0-11.9U/mL、CAGE：0-7.2U/mL，任意一种自身抗体浓度超过其参考范围即为阳性，七种自身抗体浓度均在参考值范围内即为阴性；

步骤五，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别良恶性肺结节的诊断能力，包括：采用受试者工作特征曲线，即ROC曲线，比较血清自身抗体与血浆外泌体自身抗体鉴别诊断良恶性肺结节的能力。