CN109470859A

CN109470859A - 一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用

Info

Publication number: CN109470859A
Application number: CN201811304655.2A
Authority: CN
Inventors: 匡牧宇; 孙艺华; 张辉标; 周子琅; 李多; 邓超
Original assignee: Huadong Hospital
Current assignee: Huadong Hospital
Priority date: 2018-11-04
Filing date: 2018-11-04
Publication date: 2019-03-15

Abstract

本发明属于癌症分子诊断技术技术领域，尤其为一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，包括以下步骤：S1、寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白；S2、筛选差异蛋白；S3、验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用；S4、相对表达量进行分析。本发明中利用非侵入性的液态活检手段寻找到鉴别良恶性肺结节的分子标志物，通过质谱检测以及后续生信分析，表明本发明所述分子标记FGB为肺结节的诊断及临床疗效观察提供了新的分子靶标。

Description

一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用

技术领域

本发明属于癌症分子诊断技术技术领域，具体涉及一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用。

背景技术

目前，肺癌的发病率以及肿瘤致死率已经居于全球恶性肿瘤的前列。美国每年大约有17万人死于肺癌，占整体癌症死亡人数的30％。随着经济的快速发展和空气污染的日益加重，我国的肺癌发病率也呈现逐年上升的趋势。低剂量CT被广泛的用于肺癌的筛查，每年有大量的患者被影像学诊断为肺结节，而其中大部分被证实是良性肺结节，因此，对于已发现的肺结节正确判别其良恶性就成为关键。除了凭借临床经验之外，临床医生常用的评估和管理肺结节良恶性的方法有：美国胸科医师学会(ACCP)制定的肺结节评估指南，VA模型，斯文森模型等。但是上述方法在鉴别肺结节良恶性的临床实践中仍然未达到满意的效果。临床低剂量CT对肺结节良恶性的判断能力也有限，术前诊断肺结节良恶性的主要手段为肺组织穿刺活检，但是该侵入性的检查不仅会对患者的身体造成损伤，增加肿瘤转移风险，还存在一定的假阴性率。基于这些检测的手段的局限性，我们急需寻找一种检测准确并且对身体损伤小的方法来鉴别肺结节的良恶性。

近年来组学技术和液体活检技术的飞速发展为我们提供了新的方向。液体活检的出现补充了组织活检的不足，开辟了肿瘤检测的新纪元，成为精准医疗代表性的诊断技术之一。在获取相同信息的情况下，液体活检除了具有无创性之外，还具有快速、简便等优势，同时还能避免组织活检样本量缺乏的困扰；另外，研究人员还能通过液体活检来连续性监测疾病。对于病人而言，液体活检还可以使他们暴露在更少的辐射中，例如CT或PET扫描会带来大量的辐射，而液体活检能让患者避免这种辐射，使得研究人员能够在伤害最小的情况下监测及辨别肿瘤。液态活检主要分为循环肿瘤细胞，循环DNA 或者外泌体等检测手段，其中外泌体可以携带大量其宿主细胞的核酸，脂质以及蛋白等信息，游离在循环系统中。可以实时全面地反映患者体内病变部位的特征变化，可重复性高。

本发明通过蛋白质谱分析了良性以及恶性肺结节患者的血浆外泌体蛋白后，发现FGB在恶性肺结节患者的血浆外泌体中呈现相对高表达。FGB最广为人知的功能是参与聚合形成不溶性纤维蛋白基质。除此之外，近年来研究者们发现，FGB作为IL-6以及STAT3信号通路的靶基因，在细胞生物学方面发挥着重要的功能。更重要的是，关于FGB在肿瘤中的作用也逐渐被揭示。有研究表明，FGB可以作为诊断膀胱癌的生物学标志物。此外，FGB在喉癌中也被检测到高表达。但是，目前的研究尚未报道肺结节患者血浆外泌体中FGB 的表达情况以及FGB对良恶性肺结节的鉴别作用。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，具有利用非侵入性的液态活检手段寻找到鉴别良恶性肺结节的分子标志物，通过质谱检测以及后续生信分析，表明本发明所述分子标记FGB为肺结节的诊断及临床疗效观察提供了新的分子靶标特点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，包括以下步骤：

S1、寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白；

S2、筛选差异蛋白；

S3、验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用；

S4、相对表达量进行分析。

优选的，所述寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白步骤中，收集了肺结节患者手术前的全血样本，离心后取上清液提取外泌体，所有患者的最终诊断以术后病理切片诊断为准。

优选的，所述筛选差异蛋白步骤中，共纳入30例恶性肺结节患者以及10 例良性肺结节患者的血浆外泌体样本，将两组样本进行了蛋白质谱分析，数据整理分析后筛选出一系列差异表达蛋白质，其中FGB在恶性结节组比良性结节组明显高表达。

优选的，所述验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用步骤中，收集了在43例恶性肺结节以及20例良性肺结节患者的血浆外泌体，提取其蛋白质，进行FGB表达量的检测。

优选的，所述相对表达量进行分析步骤中，结果表明，恶性肺结节患者血浆外泌体中FGB的表达水平显著高于良性肺结节患者(p<0.05),并且分析其鉴别诊断的敏感性、特异性以及曲线下面积，表明血浆外泌体FGB蛋白有良好的鉴别诊断能力(AUC＝0.741)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中利用非侵入性的液态活检手段寻找到鉴别良恶性肺结节的分子标志物，通过质谱检测以及后续生信分析，表明本发明所述分子标记FGB为肺结节的诊断及临床疗效观察提供了新的分子靶标。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明良恶性肺结节患者血浆外泌体提取办法以及外泌体特性的鉴定示意图；

图2为本发明良恶性肺结节患者血浆外泌体蛋白质谱的差异表达蛋白热图；

图3为本发明样本中FGB表达量以及CD63表达量的western检测示意图；

图4为本发明验证组中，血浆外泌体FGB表达量在良恶性肺结节患者中相对表达量的检测示意图；

图5为本发明血浆外泌体中FGB表达量对良恶性肺结节诊断的ROC曲线示意图。

图中：A：样品处理过程。在收集了患者全血后，离心去除血细胞的影响，然后利用试剂盒提取其中的外泌体，使用洗脱液离心并收集外泌体进行研究； B：所提取患者的血浆外泌体的透射电镜图像，可见囊泡直径在100nm左右，符合外泌体颗粒形态大小；C：外泌体标志蛋白的Western鉴定。包括CD9以及CD63；红色表示相对高表达，蓝色表示相对低表达；*表示p<0.05；曲线下面积AUC＝0.741，灵敏度＝0.628，特异度＝0.800。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1-3，本发明提供以下技术方案：一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，包括以下步骤：

S1、寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白；

S2、筛选差异蛋白；

S3、验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用；

S4、相对表达量进行分析

本发明中利用非侵入性的液态活检手段寻找到鉴别良恶性肺结节的分子标志物，通过质谱检测以及后续生信分析，表明本发明所述分子标记FGB为肺结节的诊断及临床疗效观察提供了新的分子靶标，本发明中的目标蛋白FGB，通过PRECOG网站对其在肺癌与正常肺组织中的表达量进行分析，发现其Zscore分别为2.82，表明FGB以在肺癌组织中相对正常肺组织是存在高表达的，血浆外泌体所携带的信息与发病灶息息相关，这也对本发明的研究结果进行了佐证。有研究通过TCGA数据库的运算，筛选出一系列对肺腺癌患者预后相关的基因，其中FGB可以作为肺腺癌临床实践中的预后标记。通过前期的研究，首次发现血浆外泌体中FGB蛋白的表达量对肺结节的良恶性具有良好的鉴别能力。综合可见，无论是在肺结节良恶性的鉴别还是肺腺癌预后估计中，FGB都具有不可忽视的重要意义。

具体的，所述寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白步骤中，收集了肺结节患者手术前的全血样本，离心后取上清液提取外泌体，所有患者的最终诊断以术后病理切片诊断为准。

具体的，所述筛选差异蛋白步骤中，共纳入30例恶性肺结节患者以及10 例良性肺结节患者的血浆外泌体样本，将两组样本进行了蛋白质谱分析，数据整理分析后筛选出一系列差异表达蛋白质，其中FGB在恶性结节组比良性结节组明显高表达。

具体的，所述验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用步骤中，收集了在43例恶性肺结节以及20例良性肺结节患者的血浆外泌体，提取其蛋白质，进行FGB表达量的检测。

具体的，所述相对表达量进行分析步骤中，结果表明，恶性肺结节患者血浆外泌体中FGB的表达水平显著高于良性肺结节患者(p<0.05),并且分析其鉴别诊断的敏感性、特异性以及曲线下面积，表明血浆外泌体FGB蛋白有良好的鉴别诊断能力(AUC＝0.741)。

实施例1：本发明样本的获取及鉴定

为了寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白，发明人收集了肺结节患者手术前的全血样本，离心后取上清液(血浆)提取外泌体。为了进行质量检测，对所提取的血浆来源的外泌体进行了透射电镜的观察。发现所抽提的外泌体形态多为圆形，外泌体囊泡直径符合预期，约为100nm，并且外泌体的形态在良恶性结节组无明显差异。此外，还对外泌体的标志性蛋白进行了Western分析，研究结果表明所提取的囊泡为外泌体。所有患者的最终诊断以病理切片诊断为准。

实验步骤如下：

(1)血液样本的处理：

患者的全血样本均于术前采集，每位患者抽取8mL全血，并且使用含有EDTA的试管收集，在取血1小时内将血浆离心，离心条件为3000g，4℃， 5min，然后取其上清用于提取外泌体。

(2)血浆外泌体提取：

本发明所使用的外泌体抽提试剂盒为exoEasyMaxiKit(Qiagen)。按照试剂盒说明书进行操作：

1)将血浆样本使用水平转子离心15min，离心条件为：3,000g，4℃，取上清，将其置于一个新的离心管中；

2)使用0.8μm滤器过滤，将其置于一个新的离心管中；

3)加入1倍体积的BufferXBP，充分混匀；

4)将混合液转移到离心柱中(exoEasyspincolumn)，然后离心500g，1min. 弃去废液，将离心柱放回；

5)加入10mlBufferXWP，离心5000g，5min，弃去废液；

6)将离心柱放入新的收集管中；

7)加入400μLBufferXE用于洗脱外泌体。

(3)透射电镜实验：

20μL外泌体被用于透射电镜检查。将样本滴加在200目的铜网上，然后使用2％醋酸双氧铀染色处理。使用配备有热离子Lab6灯丝的FEITecnaiG2Spirit透射电子显微镜对样品成像，并以80kV的加速度操作。

(4)外泌体标志蛋白Western检测：

为了验证所提取物为外泌体，对所提取的样品进行了Western检测。5μ g外泌体被用于此步实验。SDS-PAGE用于分离外泌体蛋白，并使用半干转移将其转移至PVDF膜。将膜在TBST中的5％脱脂奶粉中封闭并用抗体检测。最后使用X射线胶片和增强的化学发光试剂(ThermoPierceECLWesternBlottingSubstrate)检测蛋白质。

实施例2：本发明目标标志物的筛选

为了筛选良恶性肺结节患者外泌体蛋白的差异，进行了蛋白质谱的研究，从而筛选出一系列差异蛋白(图2)。

实验步骤如下：

(1)蛋白质的裂解和定量：

将收集到的外泌体标号，分别加100μLSDT裂解液，沸水浴10min，超声处理(100W，工作10s，间歇10s，循环10次)。13400rpm离心30min，取上清。BCA法进行蛋白质定量。

(2)蛋白质的蛋白质的SDS-PAGE实验

每组样品各取20μg蛋白质样品5:1(v/v)加入5X上样缓冲液，沸水浴 5min，14000g离心10min取上清，进行12.5％SDS-PAGE电泳。条件：恒流15mA，电泳时间60min。考马斯亮蓝染色。

(3)蛋白质的FASP酶解

每份样品各取72μg，分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μLUAbuffer(8MUrea，150mMTris-HClpH8.0)混匀，转入30kd超滤离心管，离心14000g，15min。加入200μLUAbuffer离心 14000g15min，弃滤液。加入100μLIAA(50mMIAAinUA)，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g10min。加入100μLUAbuffer，离心14000g10min 重复2次。加入100μLNH4HCO3buffer，离心14000g10min重复2次。加入 40μLTrypsinbuffer(2μgTrypsinin40μLNH4HCO3buffer)，600rpm振荡 1min，37℃16-18h。换新收集管，离心14000g10min，收集滤液，滤液 C18-SDExtractionDiskCartridge脱盐处理，OD280定量。

(4)酶解产物的LC-MS/MS分析

按照定量结果各取2μg酶解后产物进行LC-MS/MS分析，每个样品进进一次采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为2％)，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱ThermoEASYcolumnSC200150μm*100mm(RP-C18)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上到ThermoEASYcolumnSC001traps150μ m*20mm(RP-C18)(Thermo)，再经色谱柱分离，流速为400nL/min。相关液梯度如下：0分钟-100分钟，B液线性梯度从0％到45％；100分钟-108分钟，B液线性梯度从45％到100％；108分钟-120分钟，B液维持在100％。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(ThermoFinnigan)进行质谱分析。时长：120min，检测方式正离子，母扫描范围300-1800m/z，多肽和的碎片质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集20个碎片图谱(MS2scan，HCD)。MS1在M/Z200时分辨率为70,000，MS2在M/Z200时分辨率为17,500。

(5)Maxquant的非标记分析

6个LCMS/MS原始文件导入Maxquant软件(版本号、1.3.0.5)进行查库，进行LFQ非标定量分析。本发明中数据库使用的是 Uniprot_HomoSapiens_154578_20160822.fasta(收录序列154578条，下载于 2016-08-22)。主要参数如下：

Mainsearchppm：6，Missedcleavage：2

MS/MStoleranceppm：20De-Isotopic：TRUE

enzyme：Trypsin

database：Uniprot_HomoSapiens_154578_20160822.fasta

Fixedmodification：Carbamidomethyl(C)

Variablemodification:Oxidation(M)，Acetyl(ProteinN-termterm)

Decoydatabasepattern:reverse

LFQ：TRUE

LFQmin.ratiocount：1

Matchbetweenruns：2min

PeptideFDR：0.01

ProteinFDR：0.01

(6)Perseus的统计学和生物信息分析

Maxquant所得的查库文件使用Perseus软件进行分析，Perseus软件版本号为1.3.0.4。

实施例3：筛选标志物的验证

在筛选差异蛋白阶段，共纳入30例恶性肺结节患者以及10例良性肺结节患者的血浆外泌体样本。

患者的纳入标准为：

1、2016年4月到7月影像学诊断为肺结节的患者；

2、患者同意接受手术治疗，切除病灶；

排除标准：

1、排除其它组织系统肿瘤患者；

2、排除其它非肺实质性病变的肺部疾病患者。

对符合上述标准的患者进行血样采集，抽取外周血5-8mL，置于EDTA 抗凝管中，两次离心后取上清，进行外泌体的抽提。

发明人将两组样本进行了蛋白质谱分析，数据整理后筛选出一系列差异表达蛋白质，其中FGB在恶性结节组比良性结节组明显高表达。随后发明人对FGB进行了western验证。

实施例4：临床鉴别能力的验证

前期通过质谱检测发现了一系列在良恶性肺结节组中差异表达的蛋白质。在当前的研究中，针对在恶性结节组相对良性结节组高表达的两个蛋白质进行进一步验证分析FGB(差异倍数>1.5，p<0.05)。在验证阶段，共纳入了43例恶性肺结节患者以及20例良性肺结节患者，并且提取了他们的血浆外泌体蛋白，针对FGB，以及外泌体内参CD63进行了Western检测。通过对条带灰度进行分析，发现在恶性肺结节患者的血浆外泌体中，FGB的表达量较良性结节组高(图4)。

为了验证这两个生物学标志物的临床鉴别能力，使用ROC曲线针对这两个蛋白进行独立及合并分析。ROC曲线被用于评估FGB对肺结节良恶性的诊断能力(图5)。FGB在当前队列中的诊断灵敏度＝0.628，特异度＝0.800， AUC＝0.741，95％CI：0.616-0.866，p＝0.002。以上数据表明，血浆外泌体FGB 表达量具有很好的临床鉴别能力。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，包括以下步骤：

S1、寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白；

S2、筛选差异蛋白；

S3、验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用；

S4、相对表达量进行分析。

2.根据权利要求1所述的一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，其特征在于：所述寻找良恶性肺结节患者血浆外泌体差异表达的蛋白步骤中，收集了肺结节患者手术前的全血样本，离心后取上清液提取外泌体，所有患者的最终诊断以术后病理切片诊断为准。

3.根据权利要求1所述的一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，其特征在于：所述筛选差异蛋白步骤中，共纳入30例恶性肺结节患者以及10例良性肺结节患者的血浆外泌体样本，将两组样本进行了蛋白质谱分析，数据整理分析后筛选出一系列差异表达蛋白质，其中FGB在恶性结节组比良性结节组明显高表达。

4.根据权利要求1所述的一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，其特征在于：所述验证FGB对良恶性肺结节的鉴别诊断作用步骤中，收集了在43例恶性肺结节以及20例良性肺结节患者的血浆外泌体，提取其蛋白质，进行FGB表达量的检测。

5.根据权利要求1所述的一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用，其特征在于：所述相对表达量进行分析步骤中，结果表明，恶性肺结节患者血浆外泌体中FGB的表达水平显著高于良性肺结节患者(p<0.05),并且分析其鉴别诊断的敏感性、特异性以及曲线下面积，表明血浆外泌体FGB蛋白有良好的鉴别诊断能力(AUC＝0.741)。