CN109975548B - IgG4检测试剂在制备结直肠癌诊断剂方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及免疫球蛋白亚型中的IgG4的检测试剂在制备结肠直肠癌诊断或预后试剂/试剂盒中的应用。本发明研究发现，免疫球蛋白亚型中的IgG4在结肠直肠癌中高表达，且具有很大的差异性和可信度。将IgG4作为结直肠癌诊断生物标记物，具有特异性强，灵敏度高的优势，有利于提高结肠直肠癌的诊疗水平，有效防治结直肠癌。

Description

IgG4检测试剂在制备结直肠癌诊断剂方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及IgG4的检测试剂在制备结肠直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用和一种结肠直肠癌诊断的试剂/试剂盒。

发明背景

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤，是世界第二大癌症，其高发病率和致死率分别位于第三位和第四位。近年来随着我国人民生活水平的提高、生活方式的改变以及人口老龄化，结直肠癌在我国的发病率呈现逐渐上升的趋势，居我国恶性肿瘤发病率第三位和死亡率第五位，严重威胁着人们的健康和生命。早发现、早诊断、早治疗是治疗结直肠癌的关键。但是结直肠癌初期多数没有明显症状，随病情进展多以“肠炎”就诊，使得大部分结直肠癌患者确诊时已处于肿瘤进展期，失去了最佳的治疗时机，导致其五年生存率不到20％，预后较差。因此，探索结直肠癌早期、快速、大规模的诊断方法，提高诊疗水平，是目前防治结直肠癌亟待解决的问题。

目前临床上广泛使用的结直肠癌诊断方法主要是排泄物隐血试验(FOBT)、柔性乙状结肠镜检查、结肠镜检查和CT结肠成像等。但是，这些检测方法都存在一定的局限性。如排泄物检查分离过程繁琐，易受细菌、食物及肠道粘液等的干扰，同时它的特异性也相对较低、假阳性率相对较高，另外由于其具有令人不快的性质，限制了它作为筛选工具的有用性；结肠镜检查是现行的金标准，并且具有较高的特异性，但是由于它的侵入性并具有一定的并发症风险，同时对检测设备和检测人员的技术要求较高，使得了结肠镜检查的依从性不高，误诊率较大。相对于粪便、组织或结肠镜侵入而言，血液更易获取，患者更易接受，其作为早期筛查的媒介具有更大的价值。血清肿瘤标志物检测因其取样快速、方便、安全，已成为用于肿瘤早期诊断、鉴别及分期指导、肿瘤复发转移判断的常用手段。

人的血清中含有大量的免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，免疫球蛋白是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等病原体的大型Y形蛋白质，具有多种免疫球蛋白亚型；更重要的是，免疫球蛋白的不同亚型在机体遭受感染时会出现波动变化；且与其他蛋白分子相比，免疫球蛋白具有更稳定的性质及更长的半衰期，这些特点使得血浆中不同免疫球蛋白亚型表达水平在感染及肿瘤等疾病诊断应用上具有广阔的前景。

IgG4是IgG亚型，IgG4在自身免疫性胰腺炎中浓度升高，目前被用作为自身免疫性胰腺炎(autoimmune pancreatitis,AIP)的标志物之一。也有学者发现，IgG4与炎症性肠病(inflammatory bowel diease,IBD)有一定的联系。疾病的发病机制千变万化，不同器官、组织、不同种类型的疾病发生各有不同，往往同一标志物在不同组织中的作用都不一样甚至会相反，没有证据的话不同分子在不同组织间的作用不能简单推论。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的结肠直肠癌的分子标志物，以及该分子标志物的诊断试剂及其应用。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了IgG4的检测试剂在制备结肠直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用。

本发明发明人收集了健康人血液(优选采用血浆样本)和结直肠癌患者的血浆样本进行检测，通过数据处理分析，得到标准化的不同血浆促/抑炎因子丰度，非显而易见地发现，免疫球蛋白亚型-IgG4差异表达，可以作为结直肠癌诊断生物标记物。

上述IgG4的检测试剂为检测IgG4的mRNA的表达量；或者检测IgG4蛋白的表达量，或者检测IgG4蛋白的生物活性中的一种或几种几种。作为本发明中一种优选的实施方式，所述的IgG4的检测试剂为检测IgG4蛋白的表达量。

作为优选的实施方式IgG4的表达量即表示IgG4在检测样品中的浓度；作为更优选的实施方式，表示IgG4在血浆中的浓度。

作为优选的实施方式，所述的检测试剂为抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体。

其中，所述的抗体可能是单克隆抗体，多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体(例如：双特异性抗体)，和/或连接在蛋白酶体上的抗体片段。该抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或人型抗体。抗体片段可以是，例如，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fd，单链Fv(scFv)，具二硫键的Fv(sdFv)，或VL、VH结构域。抗体可能是一个共轭的形式，例如，结合一个标签、一个可检测标记，或一种细胞毒性剂。

作为优选的实施方式，所述试剂盒为ELISA试剂盒，进一步地，是基于抗人IgG4偶联抗体的ELISA试剂盒，该检测试剂盒用于检测IgG4蛋白的表达量。

所述的检测试剂的检测方法为ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、免疫比浊法、流式细胞法中的任意一种或几种；作为优选的实施方式，所述的检测试剂的检测方法为蛋白芯片法、ELISA法或免疫比浊法中的一种或几种。

当检测到IgG4蛋白的表达量≥604.1μg/ml，则结直肠癌高风险，当检测到IgG4蛋白的表达量≤591.4μg/ml，则结肠致癌低风险。当IgG4蛋白的表达量介于这两者之间，为不定风险，建议补充其他的现有的或者新开发的诊断方式进行疾病的筛查。

作为本发明一种示范性的实施方式，IgG4的表达量的计算方法可以采用标准曲线法。

作为优选的实施方式，检测试剂所检测样品为血液；作为优选的实施方式，所述的检测样品为血浆。

另一方面，本发明还提供了一种直肠癌诊断的试剂/试剂盒，所述的试剂/试剂盒含有IgG4的检测试剂。IgG4的检测试剂如上所述。

另一方面，本发明还提供了一种结肠直肠癌诊断的芯片，该芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的生物标志物IgG4的探针。作为优选的实施方式，所述的芯片为蛋白芯片。

另一方面，本发明还提供了一种肠直肠癌诊断系统，该检测系统含有：

a)检测构件：所述的检测构件用以检测诊断对象的IgG4的表达量；

b)结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的IgG4的表达量得出结肠直肠癌的患病的可能性或者风险值；

作为优选的实施方式，所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪、流式细胞仪、液相色谱仪中的一种或几种；作为优选的实施方式，所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪中的一种或两种；

作为优选的实施方式，所述的结果判断构件为软件，其含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入IgG4的表达量；分析模块用于根据IgG4的表达量，分析出结肠直肠癌患病可能性或者风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果；

其中，所述的系统中，IgG4的表达量为IgG4的mRNA的表达量；或者为IgG4蛋白的表达量。作为优选的实施方式，所述的检测构件检测的是IgG4蛋白的表达量。

作为优选的实施方式，所述的结构判断构件中，当IgG4蛋白的表达量≥604.1μg/ml，则结直肠癌高风险，当检测到IgG4蛋白的表达量≤591.4μg/ml，则结肠致癌低风险。

其中，所述的诊断系统的诊断样品为血液；更优选为血浆。

本发明的有益效果：

(1)本发明发现，在众多的免疫球蛋白亚型中，IgG4差异表达，其可作为结肠直肠的生物标志物，且具有良好的特异性、灵敏度。

(2)本发明检测试剂的检测对象为血液，相比于现有的排泄物隐血试验(FOBT)，排泄物检查分离过程繁琐，易受细菌、食物及肠道粘液等的干扰，同时它的特异性也相对较低、假阳性率相对较高其具有令人不快的性质，血液更易获取，患者更易接受，其作为早期筛查的媒介具有更大的价值。

(3)和血浆中其他蛋白相比，免疫球蛋白半衰期较长，性质稳定，更适于作为疾病诊断的标志物。

附图说明

图1为差异免疫球蛋白亚型火山图。

图2为25例健康人及35例结直肠癌病人血浆中IgG4浓度比较。

图3为免疫球蛋白标准品梯度稀释图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1差异免疫球蛋白亚型的表达分析

实验方法：

本发明首先收集中山大学附属第六医院25例健康人及35例结直肠癌患者血浆，通过以下步骤获得筛选出差异免疫球蛋白亚型：

1.通过枸橼酸钠抗凝采血管收取3-5cm健康人或结直肠癌患者全血；

2.500g转速下离心10分钟，血细胞沉淀后吸取得到血浆上层；

3.收集血浆上层清液再通过2000g转速下离心15min的到去除沉淀后血浆样本；

4.分装冻存于-80℃冰箱；

5.对血浆样本进行瑞博奥蛋白芯片(型号QAH-ISO-1)检测；

(1)玻片芯片的完全干燥

将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

(2)标准品的配置

免疫球蛋白亚型标准品梯度稀释见图3.

添加500μL的样品稀释液(sample diluent)到免疫球蛋白亚型标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为Std 1。

分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μL的样品稀释液到每个小管中。

抽取100μL的Std 1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std 2中抽取100μL加入到Std3中，如此梯度稀释至Std7。

抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。

注：因为每种免于球蛋白亚型的起始浓度是不同的，所以Std1到Std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的。

(3)芯片操作流程

(a)每个孔中加100μL的样品稀释液，室温摇床上孵育1h，封闭定量抗体芯片。

(b)抽去每个孔中的缓冲液，添加100μL的标准液和样品到孔中，4℃过夜孵育。(样品4万倍稀释)

(c)使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II。

(d)检测抗体混合物的孵育,离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的检测抗体到每个孔中，RT摇床上孵育2小时。

(e)清洗，同步骤(c)

(f)Cy3-链霉亲和素的孵育,离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，RT摇床上孵育1个小时。

(g)清洗，同步骤(c)

(h)荧光检测,采用激光扫描仪例如InnoScan 300扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm),仪器型号：InnoScan 300 Microarray Scanner,厂家:Innopsys,扫描参数：WaveLengh：532nm；Resolution：10μm,采用QAH-ISO-1的数据分析软件来进行数据分析。

6.对检测数据进行标准化处理，对比分析各个免疫球蛋白亚型在两组样本中的表达情况。

分析数据：

1.数据质量控制

绘制不同抗体类型的标准曲线后我们得到每个抗体亚型的可信检测范围(Bestcofident range)，超过最大值(％above Max)或者低于检测限(％Below LOD)的样品会影响可信度(％in best cofidence)。下表代表着一个稀释倍数(40000)下不同抗体亚型读值得质量。

表1不同抗体亚型浓度检测的质量控制

由表1可知：整体血浆检测中，IgE水平较低，约有38.3％样品浓度低于检测限，可信度较低。其他抗体亚型可信度较高(大于90％)。

2.健康人及肠癌患者血浆IgG4浓度比较

比较25例健康人及35例结直肠癌病人血浆IgG浓度比较(见图2)。

健康人组均值＝503.6μg/ml，SEM＝51.26，置信区间(403.1—604.1)

结直肠癌组均值＝686.4μg/ml，SEM＝48.48,置信区间(591.4-781.4)

P采用T检验计算得到。

3.差异免疫球蛋白火山图分析

差异免疫球蛋白火山图分析的结果见表2和图1。

差异表达蛋白(DEPs)

为了检测差异表达蛋白，我们对40000倍稀释后样品不同抗体亚型浓度值进行比较，比较后得到两组间每个抗体亚型变化倍数(log2 fold change,log2FC)和T检验后P值(-log10P value,p value)

差异表达蛋白是指P值小于0.05(-log10 P value大于1.3)，并且变化倍数大于1.2倍或小0.83倍的蛋白。

表2差异免疫球蛋白浓度值

	Mean-E	Mean-C	log2FC	p value
					IgG4	17160.89	12590.72	0.4467327	0.012285

由表2和说明：和健康人组(C组)相比均值＝12590.72pg/ml，IgG4免疫球蛋白亚型在结直肠癌患者组(E组)中显著高表达均值＝17160.89pg/ml，p值约为0.012。

由图1可知，各种免疫球蛋白亚型中，IgG4(三角形)免疫球蛋白亚型的血浆浓度在健康人有很显著的差异。其余的免疫球蛋白亚型除IgE外，虽然也具有很高的可信度，但在健康组和结直肠癌患者组无差异(见图1火山图)，不能作为结直肠癌的诊断的标志物。

4.灵敏度和特异性

根据2中，健康人及肠癌患者血浆IgG4浓度的置信区间，可知，IgG4蛋白的表达量≥604.1μg/ml，则结直肠癌高风险，当检测到IgG4蛋白的表达量≤591.4μg/ml，则结肠致癌低风险。我们把25例健康人及35例结直肠癌患者的IgG4浓度与该范围比较，得到IgG4的灵敏度：23/35＝65.7％，特异度：15/25＝60％。

相比于现有技术中单一血清学因子检测来说，和结直肠癌常见的CEA、CA50相比，IgG4具有更高的灵敏度更高，具有更高临床实用意义。

本发明发现了IgG4可以作为存在于血浆的标记物，以血液采样的方式即可实现较好的预诊效果，这对减轻待测人群的取样痛苦，以及实现较为普及性的预诊筛查，具有非常重大的意义。

Claims (14)

1.IgG4的检测试剂在制备结肠直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂的检测样品为血液；所述的检测试剂为检测IgG4蛋白的表达量。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂为检测IgG4的抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的偶联抗体为荧光素偶联抗体或生物酶偶联抗体。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为ELISA试剂盒。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂的检测方法为ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、免疫比浊法、流式细胞法中的任意一种或几种。

6.根据权利要求5所述的应用，所述的检测试剂的检测方法为蛋白芯片法或ELISA法。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂的检测结果为：IgG4蛋白的表达量≥604.1μg/ml，则结直肠癌高风险；所述的检测试剂的检测结果为：IgG4蛋白的表达量≤591.4μg/ml，则结直肠癌低风险。

8.根据权利要求1所述的应用，所述的检测试剂的检测样品为血浆。

9.如权利要求1所述应用的诊断系统，其特征在于，所述的检测系统含有：

a)检测构件：所述的检测构件用以检测诊断对象的IgG4的表达量；

b)结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的IgG4的表达量得出结肠直肠癌的患病的可能性或者风险值；

所述IgG4的表达量为IgG4蛋白的表达量；

所述的诊断系统的诊断样品为血液样本。

10.如权利要求9所述的诊断系统，所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪、流式细胞仪、液相色谱仪中的一种或几种。

11.如权利要求10所述的诊断系统，所述的检测构件为激光扫描仪、酶标仪中的一种或两种。

12.如权利要求9所述的诊断系统，所述的结果判断构件为软件，其含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入IgG4的表达量；分析模块用于根据IgG4的表达量，分析出结肠直肠癌患病可能性或者风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果。

13.如权利要求9所述的诊断系统，所述的诊断系统的诊断样品为血浆样本。

14.如权利要求9所述的诊断系统，所述的结果判断构件中，当IgG4蛋白的表达量≥604.1μg/ml，则结直肠癌高风险，当IgG4蛋白的表达量≤591.4μg/ml，则结直肠癌低风险。

Images