JP2021516351A - 結腸直腸がん診断試薬の製造におけるIgG4検出試薬の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
診断対象のIgG4の発現量を検出するa)検出機構と、
検出機構によって検出されたIgG4の発現量に基づいて結腸直腸がんに罹患する可能性又はリスク値を得るb)結果判断機構と、を含む。
2、500gの回転速度下で10分間遠心分離し、血液細胞が沈殿した後、血漿上清を吸い取る。
3、血漿上清を収集し、さらに2000gの回転速度下で15分間遠心分離し、沈殿を除去した後の血漿サンプルを得る。
4、小分けして−80℃の冷蔵庫で冷凍保存する。
5、RayBioプロテインチップ(型番:QAH−ISO−1)により血漿サンプルを検出する。
スライドチップを箱から取り出し、室温で20−30分間平衡化した後、包装袋を開き、シーリングストリップを剥がし、そしてチップを真空乾燥機又は室温で1−2時間乾燥させた。
免疫グロブリンのサブタイプの標準品の段階希釈を図3に示す。
500μLのサンプル希釈液(sample diluent)を免疫グロブリンのサブタイプの標準混合物のチューブに添加し、標準品を新たに溶解した。
チューブを開ける前に、すばやく遠心分離し、ゆっくりと上下にピペッティングして、粉末を溶解した。最後に、この小さなチューブをStd 1としてマークした。
(a)各ウェルに100μLのサンプル希釈液を加え、室温でシェーカー上で1時間インキュベートし、抗体チップを密閉した定量する。
(b)各ウェル中の干渉液を除去し、100μLの標準液及びサンプルをウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートする(サンプルを4万倍希釈する)。
検出抗体混合物チューブを遠心し、その後、1.4mlのサンプル希釈液を加え、均一に混合した後、すぐに再度遠心分離する。80μLの検出抗体を各ウェルに加え、RTシェーカーで2時間インキュベートした。
Cy3−ストレプトアビジンチューブを遠心分離し、その後、1.4mlのサンプル希釈液を加え、均一に混合した後、すぐに再度遠心分離した。80μLのCy3−ストレプトアビジンを各ウェルに加え、アルミ箔でスライドを包み、暗所でインキュベートし、RTシェーカーで1時間インキュベートした。
レーザースキャナー(Cy3又はグリーンチャンネル(励起周波数=532nm)、機器型番:InnoScan 300Microarray Scanner、製造業者:Innopsys、走査パラメータ:WaveLengh:532nm;Resolution:10μm)、例えば、InnoScan 300により信号を走査する。QAH−ISO−1のデータ分析ソフトウェアによりデータを分析する。
1、データ品質制御
異なる抗体の標準曲線を作成した後、各抗体サブタイプの信頼できる検出範囲(Best confident range)を得た。最大値(%above Max)を超えたサンプル又は検出限界(%Below LOD)未満なサンプルは、信頼性(%in best cofidence)に影響を与える。同一の希釈倍数(40000)での異なる抗体サブタイプの品質値を下表に示す。
25例の健常者と35例の結腸直腸がん患者の血漿IgG濃度を比較する(図2)。
健常者群の平均値=503.6μg/ml、SEM=51.26、信頼区間(403.1−604.1)
結腸直腸がん群の平均値=686.4μg/ml,SEM=48.48,信頼区間(591.4−781.4)
PはTテストにより算出される。
示差的に発現する免疫グロブリンのボルケーノプロット分析の結果を表2及び図1に示す。
示差発現タンパク質(DEP)
示差発現タンパク質を検出するために、40000倍希釈されたサンプルの異なる抗体サブタイプの濃度値を比較し、2群の各抗体サブタイプの変化倍数(log2fold change,log2FC)及びTテスト後のP値(−log10P value、p value)を得た。
2における健常者及び腸がん患者の血漿IgG4濃度の信頼区間から分かるように、IgG4タンパク質の発現量が604.1μg/ml以上である場合、結腸直腸がんのリスクは高く、IgG4タンパク質の発現量が591.4μg/ml以上である場合、結腸にがんが発生するリスクが低い。25例の健常者及び35例の結腸直腸がん患者のIgG4濃度と前記範囲とを比較したところ、IgG4の感度:23/35=65.7%、特異性:15/25=60%を得た。
Claims (10)
- 結腸直腸がん診断試薬/キットの製造におけるIgG4の検出試薬の使用。
- 前記IgG4の検出試薬は、IgG4のmRNAの発現量、IgG4タンパク質の発現量、又はIgG4タンパク質の生理活性を検出するものであり、好ましくは、前記IgG4タンパク質の発現量を検出するものである、請求項1に記載の使用。
- 前記検出試薬は、IgG4を検出する抗体、抗体の機能性断片又は結合抗体であり、
好ましくは、前記結合抗体は、フルオレセイン結合抗体又は酵素結合抗体である、請求項1に記載の使用。 - 前記キットは、ELISAキットである、請求項1に記載の使用。
- 前記検出試薬の検出方法は、ELISA法、プロテインチップ法、液体クロマトグラフィー法、免疫比濁法、フローサイトメトリー法のうちのいずれか1種又は複数種であり、好ましくは、プロテインチップ法又はELISA法である、請求項1に記載の使用。
- 前記検出試薬の検出結果がIgG4タンパク質の発現量≧604.1μg/mlである場合、結腸直腸がんのリスクが高く、
前記検出試薬の検出結果がIgG4タンパク質の発現量≦591.4μg/mlである場合、結腸直腸がんのリスクが低い、請求項1に記載の使用。 - 前記検出試薬の検出サンプルは血液であり、好ましくは血漿である、請求項1に記載の使用。
- 結腸直腸がん診断試薬/キットであって、
前記試薬/キットは、IgG4の検出試薬を含み、
好ましくは、前記試薬/キットは、IgG4を検出する抗体、抗体の機能性断片又は結合抗体を含み、
より好ましくは、前記結合抗体は、フルオレセイン結合抗体又は酵素結合抗体である、結腸直腸がん診断試薬/キット。 - 結腸直腸がん診断チップであって、
前記チップは、固相担体と、固相担体に固定されたバイオマーカーIgG4のプローブとを含み、
好ましくは、前記チップはプロテインチップである、結腸直腸がん診断チップ。 - 結腸直腸がん診断システムであって、
前記検出システムは、
診断対象のIgG4の発現量を検出するa)検出機構と、
検出機構によって検出されたIgG4の発現量に基づいて結腸直腸がんに罹患する可能性又はリスク値を得るb)結果判断機構と、
を含み、
好ましくは、前記検出機構は、マイクロプレートリーダー、レーザースキャナー、フローサイトメーター、液体クロマトグラフィーのうちの1種又は複数種であり、
より好ましくは、前記検出機構は、レーザースキャナー、マイクロプレートリーダーのうちの1種又は2種であり、
好ましくは、前記結果判断機構は、入力モジュール、分析モジュール及び出力モジュールを含むソフトウェアであり、
前記入力モジュールは、IgG4の発現量を入力するものであり、
前記分析モジュールは、IgG4の発現量に基づいて結腸直腸がんに罹患する可能性又はリスク値を分析するものであり、
前記出力モジュールは、分析モジュールの分析結果を出力するものであり、
好ましくは、前記IgG4の発現量はIgG4のmRNAの発現量、又はIgG4タンパク質の発現量であり、より好ましくはIgG4タンパク質の発現量であり、
好ましくは、前記診断システムの診断サンプルは血液サンプル、より好ましくは血漿サンプルであり、
好ましくは、前記結果判断機構において、IgG4タンパク質の発現量≧604.1μg/mlである場合、結腸直腸がんのリスクが高く、IgG4タンパク質の発現量≦591.4μg/mlである場合、結腸直腸がんのリスクが低い、結腸直腸がん診断システム。
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