CN112462065A - 一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及肿瘤检测技术领域，具体公开了一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法。抗体组合物包括抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体。试剂盒包括容器，容器内含有抗体组合物。检测方法包括如下步骤：收集细胞；混合检测：将细胞收集液和抗体组合物混合均匀，避光孵育后，加入溶血素混匀，再避光裂解，随后进行离心，去除上清液，再加入PBS缓冲液，重悬；数据分析。本申请是针对游离状态的肿瘤细胞的检测技术，检测血液中的循环肿瘤细胞或实体肿瘤脱落到周围体液中的实体肿瘤细胞，并具有检测快速、高效、可靠、取样方便、适用范围广等优点。

Description

一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法
技术领域
本申请涉及肿瘤检测技术的领域，更具体的说，它涉及一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下局部组织细胞增生所形成的新生物。肿瘤在临床上有实体肿瘤和非实体肿瘤之分，实体瘤是指可通过临床检查(如X线摄片、CT扫描、B超或触诊)扪及到的有形肿块，非实体瘤是指通过临床检查无法看到或扪及到的肿瘤(如白血病)。
实体肿瘤又分为良性和恶性，其中恶性肿瘤具有生长迅速、边界不清、易发生转移等特点，而肿瘤转移是致使大多数的肿瘤患者死亡的主要原因。
肿瘤转移即恶性肿瘤细胞从原发灶脱落后经过循环系统达到其他部位并继续生长的过程。虽然绝大多数的细胞会在循环系统中被迅速清除，但存活的部分细胞会在远处组织或者器官滞留、附着，逃避宿主的免疫机制，然后增殖形成转移灶。
目前实体肿瘤的常规诊断手段具有一定的局限性，如超声、X光、CT等手段，需要在肿瘤达到一定体积后才能被检测到，存在滞后性，容易导致患者错过最佳的治疗时机，且因辐射等原因不能作为实时检测手段。
如组织活检切片、免疫组化等手段，因需要穿刺活检或术后才能获得肿瘤组织，取材困难，不能作为实时监测手段。
而如AFP、CEA、CA125等肿瘤标志物检测手段，只能间接反应肿瘤状态，不能直接提供肿瘤进展信息，与病理相关性差，特异性不足。
发明内容
为了能够实时监测实体肿瘤并实现高特异性，本申请提供一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法。
第一方面，本申请提供一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，采用如下技术方案：
一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，抗体组合物包括抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体，每种抗体均被标记有不同的荧光标记。
通过采用上述技术方案，抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体用于排除白细胞、红细胞和细胞碎片等；抗CD326抗体高表达表示该细胞为上皮源性癌细胞，而大多数实体肿瘤为上皮性肿瘤，如上皮性卵巢肿瘤占所有恶性卵巢肿瘤约90%、非小细胞肺癌（即上皮来源肺癌）占所有肺癌约80%、膀胱尿路上皮癌占所有膀胱癌中约90%；抗CD326抗体阴性且抗CD26抗体为阳性表示该细胞发生了上皮细胞-间充质转化(EMT)；抗CD200抗体的差异表达可以鉴别一系列B细胞肿瘤。
优选上述六种抗体用于检测，该抗体组合物具有高特异性，能够实时监测实体肿瘤，且抗体的选用避免相互之间的干扰，检测高效。
可选的，所述荧光标记选自PE/Cyanine7、PE、FITC、Alexa Fluor®647、APC/Cyanine7和Brilliant Violet 421TM。
通过采用上述技术方案，抗体不限定固定搭配某种荧光标记，选用该范围的荧光标记，检测效率高。
可选的，每种抗体均为单克隆抗体。
通过采用上述技术方案，单克隆抗体相比于多克隆抗体具有高特异性和单一生物学功能的特点，易于标准化，批次间差异小，可避免非特异性反应。
可选的，所述抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体的体积比为(1-5):(1-5): (1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。
通过采用上述技术方案，该体积比范围内检测效果好。
可选的，抗体组合物由抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体等体积比混合而成。
通过采用上述技术方案，优选体积比相等，检测效果好。
第二方面，本申请提供一种用于检测实体肿瘤的试剂盒
一种用于检测实体肿瘤的试剂盒，包括容器，所述容器内含有抗体组合物。
通过采用上述技术方案，该试剂盒使用方便，无需临时配制。
第三方面，本申请提供一种用于检测实体肿瘤的检测方法。
一种用于检测实体肿瘤的检测方法，包括如下步骤：
收集细胞：采集样本，先进行离心，再去除上清液，收集底层细胞，接着加入PBS缓冲液洗涤，然后继续离心，去除上清液，得到细胞收集液；
混合检测：将50μl细胞收集液和6-20μl抗体组合物混合均匀，避光孵育10-30min后，加入2-5ml溶血素混匀，再避光裂解10-30min，随后进行离心，去除上清液，再加入200-400μlPBS缓冲液，重悬，得到待检测液；
数据分析：采用流式细胞术对待检测液进行测试及分析，判断肿瘤情况。
通过采用上述技术方案，实体瘤细胞和正常细胞表面所表达的抗原不同，使用特定抗体对细胞进行染色，经激光照射下发出不同波长的可被检测的荧光，再进行分析可区分正常细胞与实体瘤细胞，以此来判断样本中是否有实体肿瘤细胞及相关情况。
该检测方法具有取样方便、检测快速准确的优点。
可选的，所述样本为外周血、胸水、腹水、脑脊液、尿液或骨髓。
通过采用上述技术方案，取样方便，适用范围广。本申请用于胸水、腹水等体液，可明确这些体液里面是否存在实体肿瘤细胞，进而判断胸腹水是不是癌性；本申请用于脑脊液，可了解肿瘤是否发生中枢神经系统转移；本申请用于尿液，可了解膀胱癌的发生或复发；本申请可检测实体肿瘤的骨髓转移；本申请可检测外周血循环肿瘤细胞。
可选的，所述收集细胞步骤中，细胞需收集至少100万个。
可选的，检测方法中离心步骤的转速为1000-2000rpm，时间为3-10min。
综上所述，本申请是针对游离状态的肿瘤细胞的检测技术，检测血液中的循环肿瘤细胞或实体肿瘤脱落到周围体液中的实体肿瘤细胞，并具有以下有益效果：
1、快速：在接收到样本后，数小时内可完成检测和数据分析；
2、优质：灵敏度和特异度高，最低检测限可达万分之一；
3、简便：取材简单方便，便于像血常规一样实时检测；
4、可靠：流式细胞术可轻易获取数十万至上百万细胞，并且能够区分完整细胞和细胞碎片，从而实现高特异性；
5、经济：性价比高，更有利于科室DRGs的实施；
6、适用范围广：实体肿瘤细胞流式筛查可准确、快速检测体液、外周血、骨髓等样本中上皮来源的实体肿瘤细胞，在取材良好的情况下灵敏度可达96.7%，特异度可达99.3%，从而可帮助临床评估上皮来源的实体肿瘤的转移情况，并避免上皮细胞肿瘤发生EMT导致漏诊的情况。
附图说明
图1是本申请应用例1的检测结果图；
图2是本申请应用例2的检测结果图；
图3是本申请应用例3的检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明，予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
本申请中的荧光标记包括但不限于以下类型：AlexaFluor 488、ECD、PerCP、PerCP-cy5.5、PerCP-cy7、APC、Alexa Fluor 680、APC-Alexa Fluor700、APC-AlexaFluor750、APC-cy7、APC-H7、PacificBlue、Horizon V450、AmCyan、PE/Cyanine7、PE、FITC、Alexa Fluor®647、APC/Cyanine7和Brilliant Violet 421TM等，该些荧光标记及带有荧光标记的抗体可通过商业渠道购买获得。具体地，荧光标记具体选用见各实施例所述。
本申请中的PBS缓冲液为1XPBS缓冲液。
本申请中的溶血素是指任何能使红细胞溶解并释放出血红蛋白的物质。具体地，本申请实施例中的溶血素包括0.15M氯化铵、10mM碳酸氢钠、1mMEDTA·2Na·2H2O。
本申请中的检测样本包括但不限于以下类型：外周血、胸水、腹水、脑脊液、尿液或骨髓。具体地，检测样本的选择见各实施例所述。
本申请中的容器是指能任何能实现容纳并保存抗体组合物的容器，可以是管、瓶，其材质可以是塑料或玻璃。具体地，本申请实施例中的容器为棕色避光玻璃瓶或棕色避光塑料瓶。容器的容量大小不做限定，容器的容量可以为0-10ml，具体可以为1ml、2ml、5ml、10ml等，本申请实施例中的容器容量为2ml。
实施例1：
一种用于检测实体肿瘤的试剂盒，包括棕色避光塑料瓶，瓶内含有2ml抗体组合物。抗体组合物由100μlCD45-Alexa Fluor®647单克隆抗体、500μlCD33-APC单克隆抗体、100μlCD71-APC-cy7单克隆抗体、500μlCD26-PE单克隆抗体、400μlCD326-AlexaFluor 488单克隆抗体、400μlCD200-FITC单克隆抗体混合制得。
一种用于检测实体肿瘤的检测方法，包括如下步骤：
收集细胞：采集3ml骨髓样本，先进行离心，转速为2000rpm，时间为3min，再去除上清液，收集底层细胞，接着加入6mlPBS缓冲液洗涤，然后继续离心，转速为2000rpm，时间为3min，去除上清液，得到细胞收集液；
混合检测：将50μl细胞收集液和20μl抗体组合物在一支流式管中混合均匀，避光孵育10min后，加入5ml溶血素混匀，再避光裂解10min，随后进行离心，转速为2000rpm，时间为3min，去除上清液，再加入400μlPBS缓冲液，重悬，得到待检测液；
数据分析：根据流式细胞术，采用流式细胞仪对待检测液进行测试及分析，判断肿瘤情况。
实施例2：
与实施例1的区别仅在于，抗体组合物由500μlCD45-Alexa Fluor®647单克隆抗体、100μlCD33-APC单克隆抗体、400μlCD71-APC-cy7单克隆抗体、400μlCD26-PE单克隆抗体、500μlCD326-AlexaFluor 488单克隆抗体、100μlCD200-FITC单克隆抗体混合制得。
实施例3：
与实施例1的区别仅在于，抗体组合物由400μlCD45-Alexa Fluor®647单克隆抗体、400μlCD33-APC单克隆抗体、500μlCD71-APC-cy7单克隆抗体、100μlCD26-PE单克隆抗体、500μlCD326-AlexaFluor 488单克隆抗体、100μlCD200-FITC单克隆抗体混合制得。
实施例4：
一种用于检测实体肿瘤的试剂盒，包括棕色避光玻璃瓶，瓶内含有1ml抗体组合物。抗体组合物由100μlCD45-APC-cy7单克隆抗体、200μlCD33-PerCP-cy5.5单克隆抗体、100μlCD71-FITC单克隆抗体、200μlCD26-PE单克隆抗体、300μlCD326-APC-Alexa Fluor700单克隆抗体、100μlCD200-PacificBlue单克隆抗体混合制得。
一种用于检测实体肿瘤的检测方法，包括如下步骤：
收集细胞：采集10ml胸水样本，先进行离心，转速为1000rpm，时间为10min，再去除上清液，收集底层细胞，接着加入10mlPBS缓冲液洗涤，然后继续离心，转速为1000rpm，时间为10min，去除上清液，得到细胞收集液；
混合检测：将50μl细胞收集液和10μl抗体组合物在一支流式管中混合均匀，避光孵育20min后，加入3ml溶血素混匀，再避光裂解20min，随后进行离心，转速为1000rpm，时间为10min，去除上清液，再加入300μlPBS缓冲液，重悬，得到待检测液；
数据分析：根据流式细胞术，采用流式细胞仪对待检测液进行测试及分析，判断肿瘤情况。
实施例5：
一种用于检测实体肿瘤的试剂盒，包括棕色避光玻璃瓶，瓶内含有0.6ml抗体组合物。抗体组合物由150μlCD45-APC-cy7单克隆抗体、50μlCD33-PerCP-cy5.5单克隆抗体、50μlCD71-Alexa Fluor 680单克隆抗体、100μlCD26-PE单克隆抗体、150μlCD326-APC单克隆抗体、100μlCD200-Horizon V450单克隆抗体混合制得。
一种用于检测实体肿瘤的检测方法，包括如下步骤：
收集细胞：采集5ml外周血样本，先进行离心，转速为1500rpm，时间为5min，再去除上清液，收集底层细胞，接着加入1mlPBS缓冲液洗涤，然后继续离心，转速为1500rpm，时间为5min，去除上清液，得到细胞收集液；
混合检测：将50μl细胞收集液和6μl抗体组合物在一支流式管中混合均匀，避光孵育30min后，加入2ml溶血素混匀，再避光裂解30min，随后进行离心，转速为1500rpm，时间为5min，去除上清液，再加入300μlPBS缓冲液，重悬，得到待检测液；
数据分析：根据流式细胞术，采用流式细胞仪对待检测液进行测试及分析，判断肿瘤情况。
实施例6：
一种用于检测实体肿瘤的试剂盒，包括棕色避光玻璃瓶，瓶内含有1.2ml抗体组合物。
抗体组合物由200μl CD45-PE/Cyanine7单克隆抗体、200μl CD33-Alexa Fluor®647单克隆抗体、200μl CD71-APC/Cyanine7单克隆抗体、200μl CD26-PE单克隆抗体、200μlCD326-FITC单克隆抗体、200μl CD200-Brilliant Violet421TM单克隆抗体混合制得，本实施例的抗体均从达科为生物技术有限公司购买。
一种用于检测实体肿瘤的检测方法，包括如下步骤：
收集细胞：采集5ml脑脊液样本，先进行离心，转速为1500rpm，时间为5min，再去除上清液，收集底层细胞，接着加入3mlPBS缓冲液洗涤，然后继续离心，转速为1500rpm，时间为5min，去除上清液，得到细胞收集液；
混合检测：将50μl细胞收集液和7.8μl抗体组合物混合均匀，避光孵育15min后，加入4ml溶血素混匀，再避光裂解15min，随后进行离心，转速为1500rpm，时间为5min，去除上清液，再加入200μlPBS缓冲液，重悬，得到待检测液；
数据分析：根据流式细胞术，采用流式细胞仪对待检测液进行测试及分析，判断肿瘤情况。
实施例7：
与实施例6的区别仅在于，样本为10ml腹水样本。
实施例8：
与实施例6的区别仅在于，样本为20ml尿液样本。
应用例1：
采用实施例6中的检测方法对患者A进行肿瘤筛查，患者A性别女，年龄45岁，筛查结果如图1所示，具体表现为：异常细胞占总数的27.897%(4326/15507)、SSC中等偏大、FSC大、CD45-、EpCAM(CD326)+、CD26+、CD71 dim。
图1中各检测分布点图由左至右，由上至下依次为[H]FSC-A/CD45表，[Non-Debris]SSC-A/CD45表、[A]CD33/CD71表、[B]CD326/CD26表。
由[H]FSC-A/CD45表和[Non-Debris]SSC-A/CD45表可得：排除细胞碎片和淋巴细胞的干扰，并由于正常人的样本中CD45-对应的是红细胞，但红细胞的FSC和SSC是偏小的，而该检测过程中SSC中等偏大，FSC大，故考虑是实体肿瘤细胞
由[A]CD33/CD71表可得：排除红细胞、粒细胞和单核细胞的干扰。
由[B]CD326/CD26表可得：异常细胞占总数的27.897%(4326/15507)，CD326+表明该细胞是癌细胞，CD26+表明存在发生EMT的细胞的可能。
综上所述，脑脊液中含有大量实体瘤细胞，结合病史考虑胃印戒细胞癌转移可能，临床诊断为脑转移瘤、胃印戒细胞癌。
应用例2：
采用实施例7中的检测方法对患者B进行肿瘤筛查，患者B性别男，年龄63岁，筛查结果如图2所示，具体表现为：
EpCAM++CD26-细胞数占0.0599%(80/133524)，EpCAM-/dimCD26+细胞数占总数的45.6734%(60986/133524)。
图2中各检测分布点图由左至右依次为[Non-Debris]SSC-A/CD45表、[A]CD33/CD71表、[B]CD326/CD26表。
由[Non-Debris]SSC-A/CD45表可得：排除淋巴细胞的干扰，并由于正常人的样本中CD45-对应的是红细胞，但红细胞的FSC和SSC是偏小的，而该检测过程中SSC中等偏大，FSC大，故考虑是实体肿瘤细胞。
由[A]CD33/CD71表可得：排除红细胞、粒细胞和单核细胞的干扰。
由[B]CD326/CD26表可得：肿瘤细胞占总细胞0.0599%，发生EMT的细胞占总细胞的45.6734%。
综上所述，检测结果提示膀胱癌腹水侵犯。
应用例3:
采用实施例8中的检测方法对患者B进行肿瘤筛查，患者B性别男，年龄63岁，筛查结果如图3所示，具体表现为：EpCAM++CD26-细胞数占0.0014%(4/282821)，EpCAM-/dimCD26+占总数的0.2906%(822/282821)。
图3中各检测分布点图由左至右依次为[Non-Debris]SSC-A/CD45表、[A]CD33/CD71表、[B]CD326/CD26表。
由[Non-Debris]SSC-A/CD45表可得：排除淋巴细胞的干扰，并由于正常人的样本中CD45-对应的是红细胞，但红细胞的FSC和SSC是偏小的，而该检测过程中SSC中等偏大，FSC大，故考虑是实体肿瘤细胞。
由[A]CD33/CD71表可得：排除红细胞、粒细胞和单核细胞的干扰。
由[B]CD326/CD26表可得：尿液中肿瘤细胞占总细胞的0.0014%，结合病史，考虑为膀胱癌细胞，发生EMT的细胞占总细胞的0.2906%，考虑为尿路间质细胞可能。
综上所述，检测结果提示膀胱癌。
应用例2和应用例3中的患者B为同一人，分别取腹水和尿液样本检测，经检测患者B的尿液与腹水样本中均发现膀胱癌细胞。
患者B因“膀胱癌术后9月余，发现血小板减少2周”入院。入院检查结果为：膀胱前、后、顶壁黏膜均可见伴有腺样分化生物非浸润性尿路上皮癌（原位腺癌）；左侧盆腔淋巴结1/5见有癌转移；其涂片内查见大量高级别尿路上皮癌细胞。
从应用例1-3可以看出，通过本申请的实体肿瘤检测方法检测得到的可能结果与临床结果一致，故本申请具有检测快速、优质、简便、可靠、经济、适用范围广的优点，适于临床推广应用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，其特征在于：抗体组合物包括抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体，每种抗体均被标记有不同的荧光标记。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，其特征在于：所述荧光标记选自PE/Cyanine7、PE、FITC、Alexa Fluor®647、APC/Cyanine7和Brilliant Violet421TM。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，其特征在于：每种抗体均为单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，其特征在于：所述抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体的体积比为(1-5):(1-5):(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物，其特征在于：抗体组合物由抗CD45抗体、抗CD33抗体、抗CD71抗体、抗CD26抗体、抗CD326抗体和抗CD200抗体等体积比混合而成。
6.一种用于检测实体肿瘤的试剂盒，包括容器，其特征在于：所述容器内含有权利要求1-5任一项所述的抗体组合物。
7.一种用于检测实体肿瘤的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集细胞：采集样本，先进行离心，再去除上清液，收集底层细胞，接着加入PBS缓冲液洗涤，然后继续离心，去除上清液，得到细胞收集液；
混合检测：将50μl细胞收集液和6-20μl权利要求1-5任一项所述的抗体组合物混合均匀，避光孵育10-30min后，加入2-5ml溶血素混匀，再避光裂解10-30min，随后进行离心，去除上清液，再加入200-400μlPBS缓冲液，重悬，得到待检测液；
数据分析：采用流式细胞术对待检测液进行测试及分析，判断肿瘤情况。
8.根据权利要求7所述的一种用于检测实体肿瘤的检测方法，其特征在于：所述样本为外周血、胸水、腹水、脑脊液、尿液或骨髓。
9.根据权利要求7所述的一种用于检测实体肿瘤的检测方法，其特征在于：所述收集细胞步骤中，细胞需收集至少100万个。
10.根据权利要求7所述的一种用于检测实体肿瘤的检测方法，其特征在于：检测方法中离心步骤的转速为1000-2000rpm，时间为3-10min。
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