CN104142315A - 一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测肿瘤细胞的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用。所述芯片包括玻璃基片层、金膜层和抗体分子层。其制备方法为：在玻璃基片表面镀一层金膜；在金膜表面修饰一层能特异性识别肿瘤细胞的抗体分子；将修饰好的玻璃基片，用水反复冲洗干净。本发明首次提出利用表面等离子体共振传感技术超灵敏检测PBS溶液或人体体液中肿瘤细胞，与传统的检测肿瘤细胞的方法相比，灵敏度高，在PBS或人体体液中检测肿瘤细胞浓度范围为5×103～106个/ml；金膜表面所修饰的抗体分子结构明确，容易得到；且本发明制备芯片过程中操作步骤简单，成本低廉，芯片的重现性好，满足工业化生产中的批量制备的需求，使其极易实际推广应用。
Description
技术领域
本发明属于表面等离子体共振传感芯片的制备领域，具体涉及一种用于鉴定肿瘤细胞种类和检测肿瘤细胞含量的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用。
背景技术
肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。肿瘤标志物（Tumor Marker TM）在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。自80年代以来，随着应用B淋巴细胞杂交瘤制备肿瘤单克隆技术的不断成熟，出现了大量的抗肿瘤的单克隆抗体族（cluster ofdifferentiation，CD），并与同时出现且日新月异的免疫学检测技术（RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA等）相结合，发展了众多的肿瘤标志物检测项目并不断地应用于临床，已成为肿瘤患者的一个重要检查指标，但免疫学检测技术需要标记并消耗大量的试剂，得到的只是肿瘤标记物检测结果，不能直观确定某种肿瘤的发生，需要多种肿瘤标记物同时检测结果来确定，因此并不直观。
为了有效控制控制和监测肿瘤的发生及其发展情况，科研人员一直都致力于发明一种直观的超灵敏检测水溶液中的肿瘤细胞的方法。到目前为止，临床上常用的肿瘤的确诊方法主要通过血液中肿瘤标记物的检测结果结合CT、核磁等成像等手段来确定，血液中肿瘤标记物的检测过程复杂，所需时间比较长，往往会因此错过最佳用药时间，导致人死亡。此外，这种方法操作步骤繁琐，也会出现假阳性的结果。而光化学传感器虽然具有高选择性，方便快捷等优点，但是其灵敏度受制于荧光信号的局限，无法达到鉴别肿瘤细胞的类别的实际检测要求。因此，迫切需要发展一种直观、快速、超灵敏、成本低廉的检测方法用来检测PBS溶液特别人体体液中肿瘤细胞种类和含量。
表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，简称SPR）是指在光波的作用下，金属和电介质的界面上形成的改变光波传输的谐振波,即当以一特定角度的入射光进入玻璃棱镜内时，会产生全内反射倏逝波，这种波穿透距离约为300nm，可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体。当表面等离子体子与倏逝波的频率相等时，二者将发生共振，入射光被吸收，导致反射光能量急剧下降，因此反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值)。表面介质折射率和构象的任何微小改变都将使入射角度发生迁移，这种变化被探测器捕获，并转化为相应谱图。由于表面等离子波对介质的折射率和构象的微小变化非常敏感，如果让被测样品与发生表面等离子共振的金属薄膜相接触，并发生相互作用，薄膜的介电常数、折射率和构象会发生变化，并因此而影响共振条件，引起共振峰的偏移。SPR传感器的共振原理决定了这种传感器与传统的生物检测手段或者化学检测手段相比，具有明显的优势，如可实现实时、动态、尤其是超灵敏检测，所需试剂良少，可以实现高通量检测。近年来，SPR传感器已经广泛应用于环境卫生，食品安全，疾病诊断等众多领域。因此，探索利用SPR技术来实时高灵敏检测PBS溶液、细胞培养液、人体体液中的肿瘤细胞，确定其种类和含量，具有极其重要的意义。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片的制备方法。利用玻璃基片上的金膜表面产生的表面等离子体共振成像技术，快速、直观、简便、定量、超灵敏地检测肿瘤细胞。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片在用于肿瘤细胞类别鉴定及其含量检测中的应用。
为解决第一个技术问题，本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片，所述芯片包括玻璃基片层、金膜层、以及与肿瘤细胞膜表面抗原特异性结合的抗体分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置抗体分子层；
进一步地，所述抗体分子层包括以下至少一种抗体分子及其对应通道：
CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326的抗体或利妥昔单抗。
进一步地，所述金膜层的厚度为10～60nm；所述抗体分子层的厚度为1～100nm；所述抗体分子层的通道数为1～1000，且一个通道对应一种抗体。
抗体分子覆盖在金膜层上后，会自组装地形成颗粒状结构；抗体分子其表面修饰的巯基与金膜的接触，抗体分子在金膜层上的覆盖率可通过AFM半定量测定。
所有抗体分子，都是可以市售购买。
为解决第二个技术问题，本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
（1)采用真空蒸镀技术或者磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为10-60nm的金膜；
其中，镀膜过程中，设置热蒸发镀膜设备的真空度在1×10-4Pa，通过调节膜厚仪的频率变化（10～60Hz）和蒸发速率为可以精确控制10～60nm金膜的厚度。
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01～1000mmol/L的S1溶液中，室温静置1～24小时，用水反复冲洗干净备用；
其中，化合物S1的结构为：
式中，Z、R分别为氢原子；1～18个碳的烷基、羟基、巯基、羧基、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基，氨基，氰基或聚乙二醇基。
其中，所述的水包括：二次蒸馏水、三次蒸馏水、四次蒸馏水或超纯水。
（3）将1倍量的抗体分子，0.1～100倍量的NHS和0.1～100倍量的EDC溶解在1～1000倍量溶剂中；
其中，所述抗体分子包括CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326的抗体或利妥昔单抗。
其中，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；EDC为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺。
（4）采用微流控技术制备的多通道样品池，将步骤（3）制备的抗体溶液用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成多通道抗体层，在室温静置5分钟～24小时，分别用乙醇、水反复冲洗干净；
其中，所述的水包括二次蒸馏水、三次蒸馏水、四次蒸馏水或超纯水。
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1溶液或BSA溶液中，室温静置1～24小时，用二次蒸馏水反复冲洗至冲洗液检测不到抗体分子，备用。
用水冲洗3-5分钟，检测冲洗液中抗体分子的含量，就可以判断是否冲洗干净。冲洗的目的是为了除去通过物理吸收方式吸附在金膜表面的抗体分子以及其他的一些可能的杂质。用高效液相分析冲洗液，检测不到抗体分子的信号，即证明已经冲洗干净。
最终制得的传感芯片保存于二次蒸馏水中备用。
上述反应在室温下进行即可。
进一步地，所述S1溶液的溶剂为生理盐水、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液；或者为甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺或其组合；或者为甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺或其组合和水以任意比例混合的混合物。
进一步地，所述步骤（3）中抗体分子的溶剂为纯净水、生理盐水、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液或其组合。
本发明还提供一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片的应用，其特征在于，可以用于PBS溶液、细胞培养液、人体体液中肿瘤细胞检测。
进一步地，将此传感芯片装入角度调制型或者波长调制型表面等离子体共振成像传感设备中，在流通池中通入不同种类或不同浓度的肿瘤细胞溶液，进行检测。
进一步地，根据不同抗体通道表面等离子共振成像鉴定肿瘤细胞的种类。
进一步地，在流通池中通入含有肿瘤细胞的溶液，会引表面等离子体共振峰的偏移，其偏移量与通入的肿瘤细胞的浓度呈一定的关系。
本发明具有以下优点：
（1）本发明首次提出利用表面等离子体共振传感技术检测并鉴别PBS溶液、细胞培养液、人体体液中的肿瘤细胞的种类，与传统的检测方法相比，直观、灵敏度高，肿瘤细胞浓度的检测范围为5×103～106个/ml；
（2）本发明所用的修饰在金膜表面的抗体分子明确，抗体易得到；
（3）本发明的表面等离子体共振芯片，制备过程步骤简单，成本低廉，且制备的芯片重现性好，满足工业化生产中的批量制备的需求，极易实际推广应用。
附图说明
图1为本发明所制备的芯片的结构示意图；
图2为本发明中通过磁控溅射技术，在玻璃基片上镀的金膜的原子力显微镜（AFM）成像图。
图3为本发明所制备的3通道芯片在波长型表面等离子体共振传感设备对PBS溶液中肿瘤细胞的鉴定结果。
图4为本发明所制备的芯片在波长型表面等离子体共振成像传感设备中对PBS溶液中人肺腺癌A549细胞的浓度滴定图，纵坐标是共振波长处的相对光强值，横坐标为肿瘤细胞的浓度。
图5为实施例涉及的化合物S1的分子结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本发明提供一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片，包括玻璃基片层、金膜层、以及与肿瘤细胞膜表面抗原特异性结合的抗体分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置抗体分子层；
所述抗体分子层包括以下至少一种抗体分子及其对应通道：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326的抗体或利妥昔单抗。
所述金膜层的厚度为10～60nm；所述抗体分子层的厚度为1～100nm；所述抗体分子层的通道数为1～1000，且一个通道对应一种抗体。
本发明的用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振芯片的结构如图1所示。
实施例2
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
（1)采用真空蒸镀技术，在玻璃基片表面上蒸镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的已镀上金膜的玻璃基片浸泡在10mmol/L的S1水溶液中，室温静置20小时，用水反复冲洗干净备用；
其中，化合物S1的结构是为：
式中，Z、R分别为氢原子；1～18个碳的烷基、羟基、巯基、羧基、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基，氨基，氰基或聚乙二醇基；
（3）分别将10mg CD13、CD95或CD9的抗体，与10倍量的NHS和10倍量的EDC溶解在100ml纯水中；
（4）采用微流控技术制备的3通道样品池，将步骤（3）制备的3种抗体混合溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成3通道抗体层，在室温静置5小时，分别用乙醇、水反复冲洗干净。
其中，制备的3通道抗体层，每一个通道分别对应CD13、CD95、CD9抗体。
（5）将步骤（4）制得的芯片浸泡在BSA溶液中，室温静置4小时，用水反复冲洗干净备用；
重复上述步骤，共制备3个相同的等离子共振传感芯片。
图2为在玻璃基片表面上镀的金膜的原子力显微镜（AFM）成像图；其中，(a)为金膜表面，5um范围；(b)为金膜表面，1um范围；(c)中的白色颗粒即为抗体分子，其覆盖率大约在20%。
将制得的表面等离子体共振传感芯片分别装入波长调制型表面等离子体共振成像传感设备中，在第一个芯片的3个通道中通入105个/ml人肺腺癌A549细胞的PBS缓冲液，在第二个芯片的3个通道中通入浓度为105个/ml人大细胞肺癌H460细胞的PBS缓冲液，检测不同通道反射峰强度的变化值。
检测结果如图3，其中，（a）为通入人肺腺癌A549细胞后，不同通道的反射峰强度检测结果，（b）为通入人大细胞肺癌H460细胞后，不同通道的反射峰强度检测结果，通过不同通道的反射峰强度可以鉴别肿瘤细胞的肿瘤。
在第三个芯片的同一个通道内与通入不同浓度的肺腺癌A549细胞的PBS，测定共振波长处的相对光强值，结果如图4。由图可知，当肿瘤细胞浓度在5×103～106个/ml范围时，随着肿瘤细胞浓度的增大，表面等离子体共振峰的偏移量也增大。
实施例3
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-1的水溶液中，室温静置1小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将10mg CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9或CD10的抗体，与10mgNHS和10mgEDC溶解在50mL纯水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的10通道样品池，将步骤（3）制备的10种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通入步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成10通道抗体层，在室温静置10小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片浸泡在S1-1溶液中10小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例4
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的S1-2四氢呋喃溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mgCD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27或CD28的抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL磷酸缓冲液中；
（4）采用微流控技术制备的20通道样品池，将步骤（3）制备的20种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通入步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成20通道抗体层，在室温静置8小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片浸泡在S1-2溶液20小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例5
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-3二甲亚砜溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55或CD56的抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL生理盐水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的30通道样品池，将步骤（3）制备的30种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成30通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片浸泡在S1-3溶液20小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例6
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的S1-4乙腈溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134或CD135的抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL磷酸盐缓冲水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的40通道样品池，将步骤（3）制备的40种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成40通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-4溶液15小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例7
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-5二甲亚砜溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326的抗体或利妥昔单抗，分别与50mgNHS,和100mgEDC溶于90mL生理盐水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的30通道样品池，将步骤（3）制备的30种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成30通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-5溶液15小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例8
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的S1-6乙腈溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55或CD56的抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL磷酸盐缓冲水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的30通道样品池，将步骤（3）制备的30种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成30通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-6溶液15小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例9
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的S1-6乙腈溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326抗体或利妥昔单抗，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）用微流控技术制备的50通道样品池，将步骤（3）制备的50种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片，表面形成50通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-2溶液10小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例10
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的S1-6溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55或CD56抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL HEPES缓冲液；
（4）采用微流控技术制备的60通道样品池，将步骤（3）制备的60种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成60通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-3溶液7小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例11
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在50mmol/L的S1-6的含20%乙腈和80%HEPES缓冲液液的混合溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mgCD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55或CD56的抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在HEPES缓冲液中；
（4）采用微流控技术制备的60通道样品池，将步骤（3）制备的60种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成60通道抗体层，在室温静置8小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-4溶液10小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例12
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在20mmol/L的化合物S1-5含20%乙腈和80%磷酸盐缓冲液的混合溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26或CD27、CD28抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的30通道样品池，将步骤（3）制备的30种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成30通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-4溶液9小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例13
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-4的20%乙腈和80%磷酸盐缓冲液的混合溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28的抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL含磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的30通道样品池，将步骤（3）制备的30种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成30通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-2溶液3小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例14
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在30mmol/L的化合物S1-6含20%二氯甲烷—80%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置3小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD24、CD25、CD26、CD27或CD28抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的5通道样品池，将步骤（3）制备的5种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成5通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-2溶液4小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例15
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-1含10%三氯甲烷和80%磷酸盐缓冲液的混合溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13或CD14抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的6通道样品池，将步骤（3）制备的6种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（3）制备的玻璃基片表面，形成6通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-2溶液5小时，用水反复冲洗干净备用；
实施例16
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在40mmol/L的化合物S1-3含10%乙醇和80%HEPES缓冲液的混合溶液中，室温静置2小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将30mg CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20或CD21抗体，与40mgNHS和40mgEDC溶解在80mL HEPES缓冲液中；
（4）采用微流控技术制备的30通道样品池，将步骤（3）制备的30种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成8通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在S1-2溶液5小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例17
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在50mmol/L的化合物S1-2磷酸缓冲液中，室温静置1小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100或CD103抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL磷酸缓冲液中；
（4）采用微流控技术制备的20通道样品池，将步骤（3）制备的20种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成20通道抗体层，在室温静置8小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液20小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例18
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-3含5%四氢呋喃—95%生理盐水溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309或CD326抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL生理盐水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的70通道样品池，将步骤（3）制备的70种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成多通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液4小时，用水反复冲洗干净备用；
实施例19
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-1含5%乙腈—95%磷酸盐缓冲水溶液中，室温静置10小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309或CD326抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL磷酸盐缓冲水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的80通道样品用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别，将步骤（3）制备的80种抗体溶液分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成80通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液15小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例20
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-2含5%二甲亚砜—95%生理盐水溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309或CD326抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在90mL生理盐水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的90通道样品池，将步骤（3）制备的90种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成90通道抗体层，在室温静置6小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液15小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例21
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在5mmol/L的化合物S1-3含5%乙腈—95%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置7小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将50mg CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309或CD326抗体，与50mgNHS和100mgEDC溶解在100mL磷酸盐缓冲水溶液中；
（4）采用微流控技术制备的100通道样品池，将步骤（3）制备的100种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成100通道抗体层，在室温静置10小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液15小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例22
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在2mmol/L的化合物S1-4含20%乙腈和80%磷酸盐缓冲液的混合溶液中，室温静置20小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326抗体或妥昔单抗，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的91通道样品池，将步骤（3）制备的91种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成91通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液10小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例23
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-5含20%乙腈—80%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326抗体或妥昔单抗，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL HEPES缓冲液；
（4）采用微流控技术制备的81通道样品池，将步骤（3）制备的81种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成81通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。
（5）将步骤（4）制备的芯片浸泡在BSA溶液7小时，用水反复冲洗干净备用；
实施例24
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在200mmol/L的化合物S1-6含20%乙腈—80%HEPES缓冲液中，室温静置1小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156或CD158抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL含10%乙腈和80%HEPES缓冲液的混合溶液中；
（4）采用微流控技术制备的15通道样品池，将步骤（3）制备的15种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成15通道抗体层，在室温静置8小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液4小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例25
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在500mmol/L的化合物S1-5含20%乙腈—80%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置1小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158抗体或妥昔单抗，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的16通道样品池，将步骤（3）制备的16种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成16通道抗体层，在室温静置15小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液9小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例26
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.1mmol/L的S1-420%乙腈—80%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133、CD95、CD77、CD103、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326或CD64的抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的19通道样品池，将步骤（3）制备的19种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成19通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液3小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例27
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.02mmol/LS1-6的20%二氯甲烷—80%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133、CD95、CD77、CD103或CD64的抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的12通道样品池，将步骤（3）制备的12种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成12通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液4小时，用水反复冲洗干净备用；
实施例28
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-120%三氯甲烷—80%磷酸盐缓冲溶液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将15mg CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69或CD71的抗体，与20mgNHS和20mgEDC溶解在40mL磷酸盐缓冲溶液中；
（4）采用微流控技术制备的35通道样品池，分别将步骤（3）制备的35种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成35通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液5小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例29
一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，具体步骤为：
（1)采用磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为50nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1-3含20%乙醇—80%HEPES缓冲液中，室温静置5小时，用二次蒸馏水反复冲洗干净；
（3）分别将30mg CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309或CD326的抗体，与40mgNHS和40mgEDC溶解在80mL HEPES缓冲液中；
（4）采用微流控技术制备的65通道样品池，将步骤（2）制备的65种抗体溶液分别用注射泵（Harvard33Twin Syringe Pump,USA）以100ul/min的流速分别通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成65通道抗体层，在室温静置4小时，分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片，再浸泡在BSA溶液5小时，用水反复冲洗干净备用。
实施例30
测定抗体分子溶液浓度、浸泡时间对抗体分子在金膜上的覆盖率的影响，以CD20抗体为例，见下表：
由上表可见，随着浸泡时间的增加，抗体分子在金膜上的覆盖率也随着增加，随着抗体分子浓度的增加，抗体分子在金膜上的覆盖率也增加。抗体分子在金膜上的覆盖率范围为5%～100%。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种用于肿瘤细胞检测的表面等离子体共振传感芯片，其特征在于：包括玻璃基片层、金膜层、以及与肿瘤细胞膜表面抗原特异性结合的抗体分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置抗体分子层。
2.根据权利要求1所述的表面等离子体共振传感芯片，其特征在于，所述抗体分子层包括以下至少一种抗体分子及其对应通道：
CD1、CD2、CD3，CD4、，CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326的抗体或利妥昔单抗。
3.根据权利要求1所述的表面等离子体共振传感芯片，其特征在于，所述金膜层的厚度为10～60nm；所述抗体分子层的厚度为1～100nm；所述抗体分子层的通道数为1～1000，且一个通道对应一种抗体。
4.一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1)采用真空蒸镀技术或者磁控溅射技术，在玻璃基片表面上镀一层厚度为10-60nm的金膜；
（2）将步骤（1）中得到的玻璃基片浸泡在0.01～1000mmol/L的S1溶液中，室温静置1～24小时，用水反复冲洗干净备用；
其中，化合物S1的结构为：
式中，Z、R分别为氢原子；1～18个碳的烷基、羟基、巯基、羧基、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基，氨基，氰基或聚乙二醇基；
（3）将1倍量的抗体分子，0.1～100倍量的NHS和0.1～100倍量的EDC溶解在1～1000倍量溶剂中；
其中，抗体分子包括以下至少一种抗体分子：CD1、CD2、CD3，CD4、，CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD13、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49、CD49b、CD49c、、CD49d、CD49e、CD49f、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD61、CD62e、CD62l、CD62p、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD73、CD74、CD80、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD107、CD107a、CD107b、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD144、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD165、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD197、CD209、CD202a、CD220、CD221、CD235a、CD271、CD303、CD304、CD309、CD326的抗体或利妥昔单抗；
（4）采用微流控技术，将步骤（3）制备的抗体溶液通过步骤（2）制备的玻璃基片表面，形成多通道抗体层，在室温静置5分钟～24小时，分别用乙醇、水反复冲洗干净；
（5）将步骤（4）制备的芯片浸泡在S1溶液或BSA溶液中，室温静置1～24小时，用二次蒸馏水反复冲洗至检测不到抗体分子，备用。
5.根据权利要求4所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法，其特征在于，所述S1溶液的溶剂为生理盐水、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液；或者为甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺或其组合；或者为甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺或其组合和水以任意比例混合的混合物。
6.根据权利要求4所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中抗体分子的溶剂为纯净水、生理盐水、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液或其组合。
7.权利要求1、2或3所述的表面等离子体共振传感芯片在检测肿瘤细胞种类和含量中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种表面等离子体共振传感芯片的应用，其特征在于，用于PBS溶液、细胞培养液、人体体液中肿瘤细胞的检测。
9.根据权利要求7所述的一种表面等离子体共振传感芯片的应用，其特征在于，将此传感芯片装入角度调制型或者波长调制型表面等离子体共振成像传感设备中，在流通池中通入不同浓度或不同种类的肿瘤细胞溶液，进行检测。
10.根据权利要求7所述的一种表面等离子体共振传感芯片的应用，其特征在于，根据不同抗体通道表面等离子共振成像鉴定肿瘤细胞的种类。
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