CN108169182A - 一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用 - Google Patents

一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用。本发明所述芯片包括玻璃基片层、金膜层和探针分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置探针分子层；所述探针分子层的探针分子包含以下至少一种药物分子：硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、庆大‑小诺霉素、硫酸威他霉素、新霉素、多黏菌素B、利福平、氯霉素或磷霉素。本发明还公开了所述芯片的制备方法和应用。本发明首次提出利用表面等离子体共振传感技术检测革兰氏阴性菌，灵敏度高，选择性好，在溶液中的检测革兰氏阴性菌浓度线性范围为10～106CFU/mL，可用于检测水、饮用水或人体体液等溶液中的革兰氏阴性菌。

Description

一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片及 其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及表面等离子体传感芯片制备领域。更具体地，涉及一种可用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法、应用。
背景技术
细菌对环境，人类和动物既有用处又有危害。一些细菌成为病原体，导致了破伤风、伤寒、肺炎、梅毒、霍乱和肺结核。在植物中，细菌导致叶斑病、火疫病和萎蔫。感染方式包括接触、空气传播、食物、水和带菌微生物。细菌也对人类活动有很大的影响。一方面，细菌是许多疾病的病原体，包括肺结核、淋病、炭疽病、梅毒、鼠疫、砂眼等疾病都是由细菌所引发。革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌，把众多的细菌分为两大类，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数的肠道菌多属于革兰氏阴性菌，包括变形杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌等，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病，引发败血病。
由于革兰氏阴性菌的高毒性，为了有效控制微生物污染且同时控制革兰氏阴性菌在食物及饮用水中的含量，以确保食品和水质安全。因此科研人员一直都致力于寻找一种高选择性，超灵敏检测水溶液中的革兰氏阴性菌的方法。到目前为止，临床上常用的革兰氏阴性菌的检测方法主要是经过分离培养，再染色后在显微镜观察革兰氏阴性菌形貌，但这些方法过程复杂，所需时间比较长，特别是对于深度真菌感染的患者，往往会因此错过最佳用药时间，导致病人死亡。另一种凝胶法是临床上最常用的检测革兰氏阴性菌的方法，它能够定性、半定量、高灵敏度的检测革兰氏阴性菌，即检测革兰氏阴性菌的代谢产物脂多糖，但是这种方法必须用到一种古生物(鲎)的血液，因此，长期大量的使用必定受到一定的限制。此外，这种方法操作步骤繁琐，对环境的温度及pH都很敏感，并且对其它的一些糖类物质也显示阳性。而光化学传感器虽然具有高选择性，方便快捷等优点，但是其灵敏度受制于荧光信号的局限，无法达到革兰氏阴性菌的实际检测要求(100CFU/mL)。因此，迫切需要发展一种高灵敏度、高选择性、成本低廉的检测方法用来检测水溶液中或深度真菌感染的肺部盥洗液中的革兰氏阴性菌含量。
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)是指在光波的作用下，金属和电介质的界面上形成的改变光波传输的谐振波，即当以一特定角度的入射光进入玻璃棱镜内时，会产生全内反射倏逝波，这种波穿透距离约为300nm，可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体。当表面等离子体子与倏逝波的频率相等时，二者将发生共振，入射光被吸收，导致反射光能量急剧下降，因此反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值)。表面介质折射率和构象的任何微小改变都将使入射角度发生迁移，这种变化被探测器捕获，并转化为相应谱图。由于表面等离子波对介质的折射率和构象的微小变化非常敏感，如果让被测样品与发生表面等离子共振的金属薄膜相接触，并发生相互作用，薄膜的介电常数、折射率和构象会发生变化，并因此而影响共振条件，引起共振峰的偏移。SPR传感器的共振原理决定了这种传感器与传统的生物检测手段或者化学检测手段相比，具有明显的优势，如可实现实时、动态、尤其是超灵敏检测。近年来，SPR传感器已经广泛应用于环境卫生，食品安全，疾病诊断等众多领域。主要是应用在检测生物分子和其他物质之间的相互作用及动力学分子等。但还没有出现适用于检测革兰氏阴性菌的SPR传感器，也没有使用SPR技术来实时、快速、简便、定量、超灵敏地检测水溶液中的革兰氏阴性菌含量，特别是注射用水中的革兰氏阴性菌含量的方法。
因此，提供一种利用SPR技术来检测水、饮用水、注射液或人体体液等溶液中革兰氏阴性菌的含量，具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片，该芯片以小分子药物作为敏感膜表面。
本发明的第二个目的在于提供一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片在革兰氏阴性菌含量检测中的应用。利用探针分子引起的玻璃基片上的金膜表面产生的表面等离子体共振光谱变化，快速、简便、定量、超灵敏地检测水、饮用水、注射液或人体体液等溶液中的革兰氏阴性菌的含量。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片，所述芯片包括玻璃基片层、金膜层和探针分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置探针分子层；所述探针分子层的探针分子包含以下至少一种药物分子：
硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、庆大-小诺霉素、硫酸威他霉素、新霉素、多黏菌素B、利福平、氯霉素或磷霉素。
本发明中所述药物分子具备以下特征：
1、药物分子上有氨基或者羧基，能够通过一端带有巯基的分子链，经EDC/NHS胶连在金膜表面形成药物敏感膜层；
2、药物分子可与菌膜上的物质发生作用。
所述药物分子可以市售购买或者通过现有技术常规方法合成。
进一步，所述金膜层的厚度为10～60nm；所述探针分子层的厚度为1～100nm。
本发明所述探针分子覆盖在金膜层上后，会自组装地形成颗粒状结构；探针分子表面修饰的巯基与金膜层进行接触，探针分子在金膜层上的覆盖率可通过AFM半定量测定。
本发明进一步提供一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为10～60nm；
2)将步骤1)中得到的玻璃基片浸泡在0.01～1000mmol/L的化合物S1溶液中，静置1～24小时，用水反复冲洗干净备用；其中，化合物S1的结构为：
式中，Z为氨基、聚乙二醇基或1～18个碳的烷基、羟基、巯基、、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基；
式中，R为氢原子、氨基、氰基、聚乙二醇基或1～18个碳的烷基、羟基、巯基、羧基、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基；
3)将药物分子、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、溶剂混合，得到混合溶液；将步骤2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置5分钟～24小时；
4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到表面等离子体共振传感芯片。
上述反应在室温下进行即可。
在本发明具体的实施方式中，步骤1)中，镀膜是采用真空蒸镀或磁控溅射技术，采用真空蒸镀时，镀膜过程中的真空度控制在1×10-4Pa；通过调节膜厚仪的频率变化(10～60Hz)和蒸发速率为精确控制10～60nm金膜的厚度。
在本发明具体的实施方式中，步骤2)中，所述化合物S1溶液的溶剂为生理盐水、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种的混合物；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种与水的混合物；所述静置时间优选的为8-12小时。
在本发明具体的实施方式中，步骤3)中，所述药物分子、NHS、EDC、溶剂的摩尔比为1：0.1～100：0.1～100：1～1000；在本发明优选的实施方式中，所述药物分子、NHS、EDC、溶剂的优选摩尔比为1：10～100：10～100：100～1000；所述静置时间优选的为2-24个小时；
所述溶剂为生理盐水、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种的混合物；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种与水的混合物。
在本发明具体的实施方式中，步骤2)与步骤4)中，所述的水包括：二次蒸馏水、三次蒸馏水、四次蒸馏水或超纯水。步骤2)通过检测冲洗液中S1的含量来判断是否冲洗干净。冲洗不干净会影响探针分子在金膜上的覆盖率。步骤4)浸泡后的玻璃基片先用乙醇冲洗，然后再用水冲洗。通过检测冲洗液探针分子信号判断是否冲洗干净，如果用高效液相色谱检测不到探针分子的信号，即证明已经冲洗干净。
本发明由于药物分子上的功能基团(羧基和氨基)数目不多，为了提高药物分子在金膜表面的覆盖度，尝试了多种反应条件，如在纯水和生理盐水条件下进行偶联实验；筛选偶联反应的时间和药物及偶联试剂的用量；选择具有合适敏感膜覆盖度的制备条件制备芯片；控制一端带有巯基的分子链的长度以调节药物分子与金膜间几何距离，使药物分子保持很好的自由度，能够与菌膜上的物质充分发生作用，实现探针分子作为表面等离子共振芯片敏感膜检测革兰氏阴性菌。
本发明还提供一种革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片在革兰氏阴性菌含量检测中的应用。例如可以用于检测水、饮用水或人体体液等溶液中的革兰氏阴性菌的含量。
进一步，所述应用是将所述的革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片装入角度调制型或者波长调制型表面等离子体共振成像传感设备中，在流通池中通入不同浓度的革兰氏阴性菌溶液，通过检测表面等离子体共振峰的偏移来检测革兰氏阴性菌。
进一步，所述表面等离子体共振峰的偏移的量与通入的革兰氏阴性菌的浓度在相应范围呈线性关系。
在本发明中所述革兰氏阴性菌包括但不限于变形杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、类志贺吡邻单胞菌。
另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果如下：
1)本发明首次提出利用表面等离子体共振传感技术检测革兰氏阴性菌，与传统的检测方法相比，灵敏度高，选择性好，在溶液中的检测革兰氏阴性菌浓度线性范围为10～106CFU/mL，可用于检测水、饮用水或人体体液等溶液中的革兰氏阴性菌；
2)本发明用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片所用的修饰在金膜表面的探针分子结构明确，分子易合成，结构可控；
3)本发明制备用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片操作步骤简单，成本低廉，使得制备的芯片重现性好，满足工业化生产中的批量制备的需求，使得其极易实际推广应用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明所制备的芯片的结构示意图。
图2示出玻璃基片表面上镀的金膜的原子力显微镜(AFM)成像图；其中，(a)为金膜表面，5um范围；(b)为金膜表面，1um范围；(c)中的大颗粒即为探针分子。
图3示出实施例11所制备的芯片在波长型表面等离子体共振传感设备对水溶液中革兰氏阴性菌的选择性测试。
图4示出实施例11制备的芯片在波长型表面等离子体共振传感设备中对水溶液中大肠杆菌的浓度滴定图；纵坐标是共振波长处的相对光强值，横坐标为大肠杆菌的浓度。
图5示出实施例12制备的经过新霉素修饰的芯片在波长型表面等离子体共振传感设备中对水溶液中变形杆菌的浓度滴定图；纵坐标是共振波长处的相对光强值，横坐标为变形杆菌的浓度。
图6为实施例13制备的磷霉素和硫酸链霉素两种药物作为探针的芯片在波长型表面等离子体共振传感设备中对人体体液中百日咳杆菌的浓度滴定图；纵坐标是共振波长处的相对光强值，横坐标为百日咳杆菌的浓度。
图7为实施例14制备的通过长链S1-2偶联物质偶联的磷霉素和硫酸链霉素两种药物作为探针的芯片在波长型表面等离子共振传感器设备中对人体体液中布氏杆菌的浓度滴定图；纵坐标是共振波长处的相对光强值，横坐标为布氏杆菌的浓度。
图8为实施例15制备的通过长链S1-3偶联物质偶联的硫酸庆大霉素药物作为探针的芯片在波长型表面等离子共振传感器设备中对人体体液中霍乱弧菌的浓度滴定图；纵坐标是共振波长处的相对光强值，横坐标为霍乱弧菌的浓度
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为40nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在0.01mmol/L的化合物S1溶液中，静置1小时，用水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1的结构是为：
式中，Z、R分别为酯基和氨基；所述化合物S1溶液的溶剂为生理盐水。
(3)将硫酸链霉素、硫酸卡那霉素和硫酸庆大霉素探针分子、NHS、EDC、HEPES缓冲液按照摩尔比为1：10：10：1混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置2小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例2
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1-1溶液中，静置24小时，用蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-1的结构是为：
式中，所述化合物S1-1溶液的溶剂为乙腈
(3)将硫酸庆大霉素探针分子、NHS、EDC、乙醇按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例3
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为50nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在500mmol/L的化合物S1-2溶液中，静置12小时，用蒸馏水反复冲洗干净，备用；
其中，化合物S1-2的结构是为：
所述化合物S1-2溶液的溶剂为三氯甲烷；
(3)将庆大-小诺霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：10：10：100混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置12小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例4
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为45m；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在300mmol/L的化合物S1-3溶液中，静置4小时，用蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-3的结构是为：
所述化合物S1-3溶液的溶剂为二甲亚砜；
(3)将硫酸威他霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基甲酰胺按照摩尔比为1：100：100：100混合，得到混合溶液；将步骤(2)制得的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置6小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例5
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为50nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在600mmol/L的化合物S1-4溶液中，静置16小时，用超纯水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-4的结构是为：
所述化合物S1-4溶液的溶剂为四氢呋喃；
(3)将新霉素探针分子、NHS、EDC、二甲亚砜按照摩尔比为1：10：50：500混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置8小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、超纯水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例6
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在800mmol/L的化合物S1-5溶液中，静置20小时，用超纯水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-5的结构是为：
所述化合物S1-5溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液；
(3)将硫酸威他霉素探针分子、NHS、EDC、甲醇按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置6小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、超纯水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例7
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在600mmol/L的化合物S1-6溶液中，静置14小时，用四次蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-6的结构是为：
所述化合物S1-6溶液的溶剂为四氢呋喃；
(3)将多黏菌素B探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置5小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、四次蒸馏反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例8
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1-5溶液中，静置24小时，用蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-5的结构是为：
所述化合物S1-5溶液的溶剂为乙醇和二次蒸馏水的混合物；
(3)将利福平探针分子、NHS、EDC、二氯甲烷按照摩尔比为1：100：100：100混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置10小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例9
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在600mmol/L的化合物S1-4溶液中，静置24小时，用三次蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-4的结构是为：
所述化合物S1-4溶液的溶剂为三氯甲烷；
(3)将氯霉素探针分子、NHS、EDC、甲醇和乙醇的混合物按照摩尔比为1：50：50：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、三次蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例10
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在100mmol/L的化合物S1-3溶液中，静置24小时，用超纯水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-3的结构是为：
所述化合物S1-3溶液的溶剂为二甲亚砜；
(3)将磷霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、超纯水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例11
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1溶液中，静置24小时，用四次蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1的结构是为：
式中，Z为氰基，R为聚乙二醇基；所述化合物S1溶液的溶剂为二甲亚砜。
(3)将硫酸链霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、四次蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片。
图2为在玻璃基片表面上镀的金膜的原子力显微镜(AFM)成像图；其中，(a)为金膜表面，5um范围；(b)为金膜表面，1um范围；(c)中的大颗粒即为探针分子；从图中可以看出探针分子的覆盖率大约在20％。
将此传感芯片装入波长型表面等离子体共振传感设备中，在流通池中分别通入3.3×104CFU/ml的大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌并检测，结果如图3。大肠杆菌、绿脓杆菌和肺炎杆菌引起共振波长处光强的变化较大，其它几种是革兰氏阳性菌或者真菌，引起共振波长处光强的变化较小。因此，可以看出，本发明的共振传感芯片对革兰氏阴性菌具有选择性。
将制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体共振传感设备中，在流通池中通入不同浓度的大肠杆菌水溶液，会引起共振峰位置的变化，通过检测共振波长处的强度变化值与通入的大肠杆菌的浓度呈线性关系，结果如图4。表明表面等离子体共振波长处的强度与通入的大肠杆菌的浓度在102～106CFU/ml范围呈线性关系。
实施例12
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1-6溶液中，静置24小时，用四次蒸馏水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-6的结构是为：
所述化合物S1-6溶液的溶剂为二甲亚砜。
(3)将新霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、四次蒸馏水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
将制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体共振传感设备中，在流通池中通入不同浓度的变形杆菌水溶液，会引起反射角的变化，检测角度的变化值与通入的变形杆菌的浓度呈线性关系，结果如图5表面等离子体共振峰的偏移量与通入的变形杆菌的浓度在3.3×103～106CFU/mL范围呈线性关系。
实施例13
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1-1溶液中，静置24小时，用超纯水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-1的结构是为：
所述化合物S1-1溶液的溶剂为二甲亚砜。
(3)将磷霉素和硫酸链霉素探针分子(磷霉素和硫酸链霉素的摩尔比为1:1)、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时，取出玻璃基片，用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体共振传感设备中，在流通池中通入含有不同浓度的百日咳杆菌的人体体液，会引起反射角的变化，检测角度的变化值与通入的百日咳杆菌的浓度呈线性关系，结果如图6。表面等离子体共振峰的偏移量与通入的百日咳杆菌的浓度在3.3×103～106CFU/mL范围呈线性关系。
实施例14
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1-2溶液中，静置24小时，用水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-2的结构是为：
所述化合物S1-2溶液的溶剂为二甲亚砜。
(3)将磷霉素和硫酸链霉素探针分子(磷霉素和硫酸链霉素的摩尔比为1:1)、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置24小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体共振传感设备中，在流通池中通入含有不同浓度的布氏杆菌的人体体液，会引起反射角的变化，检测角度的变化值与通入的布氏杆菌的浓度呈线性关系，结果如图7。表面等离子体共振峰的偏移量与通入的布氏杆菌的浓度在3.3×103～106CFU/mL范围呈线性关系。
实施例15
一种用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的玻璃基片浸泡在1000mmol/L的化合物S1-3溶液中，静置24小时，用水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-3的结构是为：
所述化合物S1-3溶液的溶剂为二甲亚砜。
(3)将硫酸庆大霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：0.1：0.1：1混合，得到混合溶液；将步骤(2)制得的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置5分钟；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
制得的表面等离子体共振传感芯片装入波长调制型表面等离子体共振传感设备中，在流通池中通入含有不同浓度的霍乱弧菌的人体体液，会引起反射角的变化，检测角度的变化值与通入的霍乱弧菌浓度呈线性关系，结果如图8。表面等离子体共振峰的偏移量与通入的霍乱弧菌的浓度在3.3×103～106CFU/mL范围呈线性关系。
实施例16
一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)取三块玻璃基片，将金分别镀在玻璃基片表面，金膜的厚度为60nm；
(2)将步骤(1)得到的3块玻璃基片分别浸泡在1000mmol/L的化合物S1-1、S1-2和S1-3溶液中，静置24小时，用水反复冲洗干净，备用；其中，化合物S1-1、S1-2和S1-3的结构分别为：
所述化合物S1-1、S1-2和S1-3溶液的溶剂均为二甲亚砜。
(3)将硫酸链霉素探针分子、NHS、EDC、N,N-二甲基乙酰胺按照摩尔比为1：100：100：1000混合，得到混合溶液；将步骤(2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置18小时；
(4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到用于革兰氏阴性菌检测表面等离子体共振传感芯片，具体结构如图1所示。
实施例17
本实施例与实施例16的区别在于将步骤(1)得到的3块玻璃基片分别浸泡在1000mmol/L的化合物S1-1、S1-2和S1-3溶液中，分别静置不同的时间，最终得到的不同链长的偶联化合物S1的表面等离子体共振传感芯片用于纯水液中大肠杆菌的检测，检出率见下表1：
表1不同静置时间对于不同链长的偶联化合物S1芯片对大肠杆菌的检出率的影响
从表中可以看到，在12小时左右不同链长的偶联化合物的表面等离子体共振传感芯片对菌的检出率都可以达到99％，因此，最佳的静置时间为8-12小时。
实施例18
本实施例与实施例16的区别在于：将步骤2)在1000mmol/L浓度S1-2溶液静置24小时得到的玻璃基片浸泡在探针分子浓度不同的混合溶液中，分别静置不同的时间，测定混合溶液中不同浓度的探针分子的和浸泡时间对探针分子在金膜上的覆盖率的影响，以探针分子为例，见下表2：
表2混合溶液中不同浓度的探针分子的和浸泡时间对探针分子在金膜上的覆盖率的影响
由上表可见，在化合物S1种类、浓度和浸泡时间固定情况下，随着浸泡时间的增加，探针分子在金膜上的覆盖率也随着增加；随着探针分子浓度的增加，探针分子在金膜上的覆盖率也增加。探针分子在金膜上的覆盖率范围为5％～100％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种用于革兰氏阴性菌检测的表面等离子体共振传感芯片，其特征在于，所述芯片包括玻璃基片层、金膜层和探针分子层；玻璃基片层上设置金膜层，金膜层上设置探针分子层；所述探针分子层的探针分子包含以下至少一种药物分子：
硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、庆大-小诺霉素、硫酸威他霉素、新霉素、多黏菌素B、利福平、氯霉素或磷霉素。
2.根据权利要求1所述的表面等离子体共振传感芯片，其特征在于，所述金膜层的厚度为10～60nm；所述探针分子层的厚度为1～100nm。
3.一种如权利要求1或2所述的表面等离子体共振传感芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将金镀在玻璃基片表面；
2)将步骤1)中得到的玻璃基片浸泡在0.01～1000mmol/L的化合物S1溶液中，静置，用水反复冲洗干净；其中，化合物S1的结构为：
式中，Z为氨基、聚乙二醇基或1～18个碳的烷基、羟基、巯基、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基；
式中，R为氢原子、氨基、氰基、聚乙二醇基或1～18个碳的烷基、羟基、巯基、羧基、酰胺、酸酐、烯基、炔基、芳基、酯基、醚基；
3)将药物分子、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、溶剂混合，得到混合溶液；将步骤2)得到的玻璃基片浸泡在混合溶液中，静置；
4)取出玻璃基片，用乙醇、水反复冲洗玻璃基片，得到表面等离子体共振传感芯片。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述药物分子、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、溶剂的摩尔比为1：0.1～100：0.1～100：1～1000；优选的，所述药物分子、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、溶剂的摩尔比为1：10～100：10～100：100～1000。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)所述溶剂生理盐水、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种的混合物；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种与水的混合物。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化合物S1溶液的溶剂为生理盐水、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种的混合物；或甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺中一种或几种与水的混合物。
7.权利要求1或2所述的表面等离子体共振传感芯片在革兰氏阴性菌含量检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为用于检测水、饮用水或人体体液中的革兰氏阴性菌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述表面等离子体共振传感芯片装入角度调制型或者波长调制型表面等离子体共振成像传感设备中，在流通池中通入不同浓度的革兰氏阴性菌溶液，通过检测表面等离子体共振峰的偏移来检测革兰氏阴性菌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述表面等离子体共振峰的偏移的量与通入的革兰氏阴性菌的浓度在相应范围呈线性关系。
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