CN102519912A - 一种用表面等离子共振生物传感器检测待测物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用表面等离子共振生物传感器检测待测物的方法。本发明采用生物素-链亲和素-磁性微粒作为信号报告分子，可以将杂交结果的信号进行放大，避免了杂交前对探针或者待分析物进行标记，影响生物分子的自然结合，实现提高SPR生物传感器检测灵敏度的要求。且产生的信号既稳定，又易于检测，使结果检测和分析大为简化。本发明是在杂交之后实现放大检测信号，可以更加直观而清晰的观察放大信号前后SPR信号的变化以及变化量。同时，本发明采用的生物素-链亲和素-磁性微粒技术，不需要昂贵的检测仪，降低了提高传感器灵敏度的所需的技术成本和经济成本。

Description

一种用表面等离子共振生物传感器检测待测物的方法

技术领域

本发明涉及一种用表面等离子共振生物传感器检测待测物的方法。

背景技术

SPR(表面等离子共振技术)生物传感器是近几年发展起来的一种先进的生物化学分析方法和技术，是基于物理光学特性的一种分析技术。基于SPR生物传感器的传感芯片技术也应运而生，它是实时信号转导的载体，是将SPR传感技术、生物芯片技术以及分子生物学技术结合起来的一项新技术。目前SPR传感芯片主要包括传感片J1、传感片CM5、传感片SA、传感片NTA、传感片HPA、传感片L1。芯片结构是在玻璃片上覆盖了一层金膜，各种类型的芯片在金膜表面连有不同的多聚物以形成不同的表面环境，利于固定不同性质的生物分子。实验时，先将一种反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上，含分析物的样品(受体)以恒定的速度通过传感芯片，与传感芯片上分子间的相互作用，SPR传感器能跟踪检测配体和受体的结合、解离整个过程的变化，以确定未知物，并通过观察SPR传感器光学参数变化(如折射率的变化等)实现对传感芯片表面结合的分子量相对定量。

SPR传感芯片可实现同时将大量不同的探针固定于芯片表面，所以可以一次性对样品中多种不同物质进行检测和分析，从而解决了传统检测技术操作繁杂、自动化程度低、检测目标序列数量少、检测效率低等不足。因此该技术具有高速度、高通量、高效率、并行地检测与之杂交的生物样品的特点。与传统的诊断技术相比，芯片技术具有明显的优势。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值。目前该技术已经在食品安全，国土安全，疾病诊断，药物研发，环境监测，毒品检测，法医鉴定等多个领域广泛应用。

目前，基于SPR生物传感器的研究处于起步阶段，并未广泛应用。SPR传感技术从诞生到现在只有20多年的历史，因此处于探索发展的初期，还有很多不完善的地方。目前，对SPR生物传感器的研究除了扩大其应用领域，改进和完善仪器外，最重要的是提高SPR生物传感器的灵敏度。这是因为SPR对待测分析物浓度的测定主要与物质的分子量有关，对于分子量＞1000的物质，检测浓度范围为μmol/L-nmol/L，而对于分子量＜1000的物质，检测浓度范围为μmol/L-mmol/L。因此，探索提高SPR生物传感器的灵敏度已经成为SPR技术研究的主要内容。目前大多数研究学者提高SPR传感器灵敏度的方法主要从2个方面入手，第一是改进研究体系，主要是通过改进SPR传感器的表面结构和反应缓冲液。第二是改进仪器装置，主要是改进和完善检测器(主要是改变其物理、光学变量提高其灵敏度和实用性)以及与其他仪器联用，如与质谱联用。但是通过生物物质来提高检测灵敏度的应用较少，尤其是通过生物物质本身特性而提高检测灵敏度的方法更加凤毛麟角。

目前在提高传感器的灵敏度上，研究人员多采用标记法，用一种信号分子标记待检测受体(或者配体)，通过与传感器表面固定的配体特异性杂交，形成稳定的复合物，从而将信号分子固定到传感器表面，通过信号分子引起的光学、电化学等信号的改变，反映被检测物质信息。

目前比较受到科研人员青睐的是纳米金标记技术，将纳米金标记探针和DNA杂交。虽然金胶粒纳米粒子结合到SPR生物传感器金膜上能够使其信号放大十倍以上，然而，当纳米粒子引起显著的SPR信号的同时，它们也就将SPR无需标记的优点转变成了标记性的技术。也有科研人员采用硅包碲化铬量子点(siLica-coated CdTe QDs)连接靶DNA分子与生物素修饰的探针结合，可使检测信号放大了500倍。也有研究者采用生物素，链霉亲和素-辣根过氧化物酶进行放大检测信号，将生物素标记探针，通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶共聚体(SA-HRP)将酶修饰到传感芯片表面，4-氯萘酚(CN)和双氧水混合液与过氧化物酶相遇时，形成相应的沉淀，覆盖在自组装分子层上，由于沉淀的生成使SPR信号急剧放大，得到比较低的检测限，但是上述方法共有的缺陷就是在分析信号之前对探针进行标记，直接将放大信号分子标记的配体事先固定于传感芯片表面，不能直观比较引入信号放大分子前后检测限的变化。

虽然传感芯片技术已经得到了一定程度的发展，但在传感芯片的修饰、探针的固定、尤其是检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄等问题限制了该技术在生物检测中的应用。而这些问题的核心原因主要在这两个方面：一是检测灵敏度较低，二是即使提高灵敏度，使用的也是杂交前信号放大技术，不能直观比较引入信号放大分子前后检测限的变化。

生物素(biotin)是生物体内广泛分布的一种羧化酶的辅酶，又称为维生素H、维生素B₇和辅酶R(Coenzyme R)，化学式为C₁₀H₁₆N₂O₃S，是一种水溶性维生素B群成员。亲和素(avidin)是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，其每一个亚基含有一个可与生物素结合的位点，二者的亲和常数高达10¹⁵L mol^-1。链霉亲和素是指是一种可以从链霉菌属细菌Streptomyces avidinii中纯化获得的四聚体蛋白，大小为52800Da。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10^-15mol/L数量级。来源于链霉菌(StreptomycesAvidinii)或基因重组技术制备的链亲和素具有4个相同的亚基，每个亚基含有一个与生物素结合的位点，生物素与链亲和素的亲和结合能力在溶液中可达到2.5×10¹³(mol/L)^-1，甚至是抗原抗体亲和力的100万倍。因此，链亲和素与生物素之间具有高度专一的相互作用，生物素-链亲和素系统具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点，而且能够将信号多级放大，并保持大分子物质的原有生物活性。BAS作为现代生物技术领域最有力的工具之一，在免疫分析、核酸杂交检测、药物筛选等领域得到了广泛的应用。

目前，链亲和素-磁性微粒大多在免疫检测，核酸杂交，细胞分选等领域中有所应用。磁性微粒包括金磁微粒和氨基磁粒。金磁微粒是通过金磁微粒表面的纳米金粒子与链亲和素之间的静电作用、疏水相互作用可一步将链亲和素固定在其表面，固定化反应快速、简便，不需任何偶联试剂。金磁微粒兼有磁性微粒在外磁场中的可分离性及胶体金对生物分子快速固定化等特性，这种新型磁性复合微粒固定链亲和素的优势体现在两个方面：其一，金磁微粒表面的胶体金粒子通过静电作用、疏水相互作用可一步反应将链亲和素固定化形成链亲和素-金磁微粒，有效保持了链亲和素的生物学活性；其二，金磁微粒由于表面附着大量纳米级胶体金而具有较大的比表面积，对链亲和素固定化容量高。但是通过物理吸附作用制备的链亲和素金磁微粒，当使用PBST缓冲液(1×PBS，含0.05％Tween-20)冲洗时，由于链亲和素分子中不含半胱氨酸残基，链亲和素与金磁微粒的结合不存在较强的Au-S相互作用，仅限于疏水相互作用和静电相互作用，因此，表面活性剂Tween-20很容易破坏这种作用而使链亲和素几乎全部脱落。氨基磁粒是氨基末端磁性微粒与链亲和素氨基酸残基的侧链氨基通过与PDITC(1，4-苯二异硫氰酸酯)偶联剂的共价结合可将链亲和素固定在其表面，它包括两个步骤，过程包括两步：其一，氨基末端的磁性微粒与PDITC作用，在磁性微粒表面引入活泼的异硫氰酸根；其二，活化的磁性微粒与链亲和素侧链氨基酸残基所带氨基共价结合形成链亲和素-氨基磁粒，虽然氨基磁粒制备过程比较繁琐，但是它不受清洗缓冲液体系的限制，在介质中的稳定性较好，在免疫学检测和核酸杂交检测中通用性强。

发明内容

本发明的目的是提供一种用表面等离子共振生物传感器检测待测物质A和待测物质B是否结合的方法。

本发明所提供的用表面等离子共振生物传感器检测待测物质A和待测物质B是否结合的方法，包括以下步骤：

(1)将待测物质A固定到表面等离子共振生物传感器的传感芯片上，读取光强信号值，记为初始RU值；

(2)将阴性对照加入到固定有待测物质A的传感芯片上，读取光强信号值，记为阴性对照RU值；阴性对照RU值减去初始RU值，即得到阴性对照RU变化值；重复测量阴性对照RU值三次以上，将得到的阴性对照RU变化值的最大值作为阈值；

(3)将生物素标记的待测物质B加入到结合有待测物质A的传感芯片上，使所述生物素标记的待测物质B与所述结合在传感芯片上的待测物质A杂交，再将链霉亲和素与磁性微粒的复合物加入到所述传感芯片上，使链霉亲和素与磁性微粒的复合物与所述生物素结合；读取所述传感芯片上的光强信号值，记为待测物质B的RU值；待测物质B的RU值减去初始RU值，即得到待测物质B的RU变化值；若待测物质B的RU变化值大于所述阈值，则确定所述待测物质A和所述待测物质B结合了。

所述待测物质A为蛋白或核酸；所述待测物质B为蛋白或核酸。

所述待测物质A具体为巯基修饰的DNA探针，其序列如下，生物合成得到：

5′-HSC6-TTTTTTTTTTTTTTT-CCATGAGAGCCTCAAGATCTGTGTTCTTCCCT-3′。

所述待测物质B具体为甲型流感病毒DNA片段。

所述生物素标记的待测物质为生物素标记的核酸或生物素标记的蛋白。

所述生物素标记的核酸可通过包括如下步骤的方法得到：

(a)通过生物素标记寡核苷酸接头实现对核酸的标记；

(b)通过生物素标记引物实现对核酸的标记。

所述(a)中通过生物素标记寡核苷酸接头实现对核酸的标记，包括以下步骤：

(1)将生物素10nmol溶解在在0.02mLDMSO中，去离子水稀释至0.2mL。

(2)生物素溶液与寡核苷酸磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl和1mMEDTA，pH 5-8)，生物素与寡核苷酸分子数比为1-100∶1，4-37℃共育2-24小时，制备得到含生物素的寡核苷酸接头。

(3)超声断裂标本核酸长链后，在微量离心管中分别加入下面的反应液，全量为50μL：核酸片段在TE buffer 1-20pmol，10×ALkaLine Phosphatase buffer 5μL，CIAP(10-30U/μL)1-2μL，灭菌水加至50μL。37-50℃、15-120分钟保温。苯酚/氯仿(1∶1)抽提1-3次。添加3M的NaCl 2.5μL(终浓度150mM)。添加125μL(2.5倍)冷乙醇，在-20℃保冷30-60分钟。离心回收沉淀，用200μL70％冷乙醇洗净后，减压干燥。用20μL以下的TE buffer溶解沉淀。

(4)标本核酸加热至90-100℃，5-20分钟后，将其迅速冷却到4℃以下。

(5)在反应Tube管中调制以下反应液，全量50μL。单链的样本核酸1-2μL，生物素标记的寡核苷酸接头5-10μL，10×T4 RNA Ligase Buffer 10μL，0.1％BSA 3μL，T4 RNA Ligase 40-100U，PEG #6000终浓度25％，灭菌水加至50μL。在5℃反应12-24小时。加入2μL的0.5M EDTA终止反应。所述生物素标记的寡核苷酸接头浓度与单链的样本核酸的浓度比例不低于5∶1。

所述(b)通过生物素标记引物实现对核酸的标记，包括以下步骤：

(1)溶解生物素10nmol在DMSO中，去离子水稀释至0.2mL。

(2)生物素溶液分别与待检核酸特异的PCR引物1和引物2的磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液的浓度为0.01M，含有150mMNaCl和1mMEDTA，pH 5-8)，生物素与引物分子数比为1-100∶1，4-37℃共育2-24小时。制备含生物素标记的待检DNA特异的PCR引物1和引物2。

(3)反应Tube管中加入以下组份(100μL反应体系)：Taq酶(5U/μL)0.5L，10×Taq酶Buffer 10μL，MgCL₂(25mM)8μL，dNTP(每种各2.5mM)8μL，样品核酸1μg，生物素标记引物1(20μM)1-5μL，生物素标记引物2(20M)1-5μL，加灭菌ddH₂O至100μL。

(4)放到预热的PCR仪中，程序如下：95℃30秒，50℃30秒，72℃45-60秒，进行30-40个循环。最后72℃延伸10分钟。

所述(b)通过生物素标记引物实现对核酸的标记，包括以下步骤：

(1)将生物素溶解在DMSO中，去离子水稀释至0.2mL。

(2)生物素溶液与聚T引物磷酸钠缓冲液混合(最终反应体系中磷酸钠缓冲液浓度为的0.01M，含有150mMNaCl和1mM EDTA，pH 5-8)，生物素与随机引物分子数比为1-100∶1，4-37℃共育2-24小时。制备成含生物素标记的聚T引物。

(3)在反应Tube管中加以下反应液：dNTP(每种各2.5mmol/L)2.5μL，0.1mol/L巯基乙醇2.0μL，RNasin(40，000U/mL)0.5μL，生物素标记的聚T引物(20-40U/mL)2.0μL，3.0μg RNA(去离子水稀释)18.8μL。加热混合物5分钟至70℃，冰上冷却。简短离心样品。

(4)反应Tube管中再加入：反转录酶缓冲液5.0μL，反转录酶200U 1.2μL。致反应终体积为2.5μL。37℃保温60分钟后，90℃变性5分钟，冰上冷却5分钟。

所述生物素标记的蛋白可通过包括如下步骤的方法得到：

(1)溶解蛋白0.15mg在0.1M磷酸钠缓冲液(含有5mM EDTA、0.131mM MEA)，pH 6.0，室温孵育1小时。

(2)凝胶过滤层析法分离还原的蛋白。洗脱液使用0.02M磷酸钠缓冲液(含有150mM NaCl、1mM EDTA，pH 6.5)。还原的蛋白在第一个高峰洗脱液中。

(3)溶解生物素6nmol在0.02mLDMSO中，去离子水稀释至0.2mL。

(4)生物素溶液加入到还原的蛋白中，4-37℃共育2-12小时；

(5)从抗体复合物分离未标记的生物素，洗脱液(0.02M磷酸钠pH 7.4、150mMNaCl)洗脱。重复一次能进一步得到纯化效果。

本发明采用生物素-链亲和素-磁性微粒作为信号报告分子，可以将杂交结果的信号进行放大，避免了杂交前对探针或者待分析物进行标记，影响生物分子的自然结合，实现提高SPR生物传感器检测灵敏度的要求。且产生的信号既稳定，又易于检测，使结果检测和分析大为简化。本发明是在杂交之后实现放大检测信号，可以更加直观而清晰的观察放大信号前后SPR信号的变化以及变化量。同时，本发明采用的生物素-链亲和素-磁性微粒技术，不需要昂贵的检测仪，降低了提高传感器灵敏度的所需的技术成本和经济成本。

附图说明

图1为本发明中的SPR传感器基本结构模式图。

图2为SPR芯片系统模式图，图中1.激光，2.偏振片，3.棱镜，4.载玻片，5.传感芯片，6.探针，7.反应池，8.检测器。

图3为PCR产物做梯度稀释后(0.5pM-50μM)与探针杂交后RU值结果。

图4为加入链霉亲和素-磁性微粒前后PCR产物光强信号值的变化曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

RNA提取试剂盒购自天泽基因科技有限公司；cDNA合成试剂盒购自AppLiedBiosystems公司；PCR扩增试剂盒购自大连宝生生物公司；传感芯片J1购买于中国科学院电子研究所。

实施例1、利用生物素-链霉亲和素-磁性微粒提高SPR生物传感器的检测灵敏度

一、探针固定

(1)首先用2mL 98％H₂SO₄水溶液：30％H₂O₂水溶液(体积比7∶3)混合溶液冲洗传感芯片J1上的裸金膜，去离子水冲洗，氮气吹干。

(2)巯基修饰的DNA探针溶液滴加到传感芯片J1表面；巯基修饰的DNA探针序列如下，生物合成得到：

5′-HSC6-TTTTTTTTTTTTTTT-CCATGAGAGCCTCAAGATCTGTGTTCTTCCCT-3′(DNA探针序列如序列表中序列1所示)。

(3)室温下，包被24小时，生成探针的自组装阵列。

(4)去离子水洗净，氮气吹干。

(5)室温下，6-巯基乙醇封闭液封闭1小时。

二、链霉亲和素-磁性微粒复合物

链霉亲和素-磁性微粒复合物购自Bangs Laboratories，产品目录号为BM568。

三、通过PCR引物实现核酸的生物素标记

1、提取标本中的RNA(具体方法参考RNA提取试剂盒的说明，该试剂盒购自北京天泽基因科技有限公司，产品目录号为71001-50)，具体方法如下：

(1)在1.5mL的离心管中加入200μL的甲型流感病毒咽拭子样品(来源于深圳口岸入境发热病人)。

(2)加入0.6mL的溶液A(RNA提取试剂盒自带)，振荡30s后混匀室温放置10分钟(注意：溶液A在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水中使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用)。

(3)将溶液全部转移到离心吸附柱上，室温放置2分钟。

(4)12,000rmp室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。

(5)加入0.8mL的通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000rmp室温离心1分钟。

(6)12,000rmp室温离心半分钟。

(7)在离心吸附柱滤膜的中部加入70μL的通用洗脱液，然后将离心吸附柱套入一新的1.5mL离心管中，室温放置2分钟。

(8)12,000rmp室温离心1分钟，离心管中收集的样品即为甲型流感病毒RNA溶液。

2、RNA逆转录成cDNA(具体方法参考cDNA合成试剂盒的说明)

将上述甲型流感病毒RNA溶液使用TaqMan Reverse Transcription Reagents试剂盒(购自AppLied Biosystems公司，产品目录号为N8080234)逆转录成cDNA，反应体系如下所示：

将上述反应体系混匀，瞬时离心。反应条件是：室温10分钟；42℃，30分钟；95℃，5分钟，即得到甲型流感病毒cDNA溶液。

3、对cDNA进行PCR扩增

具体方法参考PCR扩增试剂盒的说明，PCR扩增试剂盒购自大连宝生生物公司。

(1)溶解生物素10nmol在0.02mL DMSO中，去离子水稀释至0.2mL，得到生物素溶液。

(2)将生物素溶液分别与含有待检DNA特异的PCR上游引物的磷酸钠缓冲液(0.2g KCl，8.0g NaCl，0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄，溶解于1000mL容量瓶中，加超纯水至刻度，用pH计测量其pH值为5)混合，生物素与引物分子数比为50∶1，37℃共育12小时。制备得到含生物素标记的待检DNA特异的PCR上游引物：

5′-生物素-AAGCCGAGATCGCGCAGAGAC-3′。

(3)反应Tube管中加如下组份(100μL反应体系)：Taq酶(5U/μL)0.5uL，10×Taq酶Buffer 10μL，MgCl₂(25mM)8μL，dNTP(每种各2.5mM)8μL，样品DNAlμg，生物素标记上游引物(20M)1-5μL，下游引物(5′-CCTTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC-3′)(20M)1-5μL，加灭菌ddH₂O至100μL。

(4)放到预热的PCR仪中，程序如下：95℃30秒，50℃30秒，72℃45-60秒进行30-40个循环。最后72℃延伸10分钟，得到生物素标记的PCR产物，即得到生物素标记的甲型流感病毒DNA片段。

四、利用SPR传感器检测生物素标记核酸

1、将步骤一中固定了探针的传感芯片J1(图2)组装到SPR传感器(图1)棱镜表面，向流通池中注入Tris-NaCl水溶液(Tris 10m M，NaCl 100m M)200μL，读取此时的初始RU值(固定探针的光强信号值)。初始RU值为15500。RU值的定义为：SPR光强信号的响应单位。

2、将步骤三得到的生物素标记的PCR产物用Tris-NaCl水溶液稀释成不同浓度(0.5pM、5pM、0.05nM、0.5nM、5nM、50nM、500nM、5μM、50μM)的核酸溶液，对不同浓度值进行Ln转换。分别将200μL不同浓度(从低到高)的核酸溶液注入流通池中，每个浓度杂交10分钟。观察SPR检测信号，记录各个浓度的RU值。通过扣除探针的光强信号变化值(即用各个浓度的RU值减去初始RU值)，观察并计算得到各个浓度的光强信号值，其对应浓度的变化RU值为291.2，432.8，612.4，721.7，881.3，1018.8，1167.6，1188.5，1194.6，其最小的检测浓度为0.5pM。

最小的检测浓度的测定方法如下：

重复测量阴性对照(B型流感扩增产物)3次，B型流感扩增产物来源于乙型流感病毒核酸测定试剂盒的阳性对照品(购自上海之江生物科技有限公司，货号为RR-0053-02)，PCR扩增产物的制备按照试剂盒说明书操作，取18μL的B型流感核酸荧光PCR混合溶液，与1μL的DEPC-H₂O，以及1μL的RT-PCR酶，震荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，加入5μL的B型流感阳性对照品。45℃，10min；95℃，15min；95℃，

，1min。循环40次。将得到的PCR扩增产物纯化，按照TaKaRa PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0，大连宝生，货号：D822A)说明书进行操作。重复测量3次，阴性对照的RU值分别为15525，15545和15580。阴性对照的RU值减去初始RU值，即得到阴性对照的ΔRU值分别为25，45，80，取最大值ΔRU＝80作为阈值，可以避免假阳性错误。将ΔRU＞阈值确定为阳性，将ΔRU≤阈值确定为阴性，即将ΔRU＞80确定为阳性，将ΔRU≤80确定为阴性。观察探针的光强信号值(探针光强信号值25519.3)，注入核酸溶液之后，观察并计算得到不同核酸浓度(0.5pM-50μM)的光强信号值，分别为25810.5，25952.1，26131.7，26241，26400.6，26538.1，26686.9，26707.8。不同核酸浓度的光强信号值减去探针光强信号值，即得到不同核酸浓度(0.5pM-50μM)的光强信号变化值(ΔRU值)，即可扣除由于仪器本底光强信号带来的误差影响，其对应浓度的变化RU值(ΔRU值)为291.2，432.8，612.4，721.7，881.3，1018.8，1167.6，1188.5，1194.6。0.05pMPCR扩增产物光强信号变化值为63，明显低于阈值。因此检测的灵敏度为0.5pM。

3、信号放大试验

(1)向流通池中注入Tris-NacL溶液(Tris 10mM，NaCl 100mM)200μL，读取此时的RU值，RU值为35539。

(2)将步骤一中巯基修饰的DNA探针通过液相固定到传感芯片上，其RU值为37719，记为初始RU值。

(3)将200μL上述步骤2中的最小检测浓度的生物素标记的核酸溶液(0.5pM)注入流通池中，反应35分钟，此时RU值为37817，光强信号变化值为98。

(4)向流通池中注入0.2mL链霉亲和素-磁性微粒复合物，观察此时的曲线变化及RU值。将上述实验重复测量3次，观察实验结果。结果如图4所示，RU值可达到38682。该RU值减去初始RU值，即得到光强信号变化值(ΔRU值)为963，该ΔRU值＞阈值(80)，确定为阳性，即可检测到浓度0.5pM的生物素标记的核酸溶液与探针结合。

(5)继续降低生物素标记的核酸溶液浓度分别为0.05pM，5fM，观察其注入链霉亲和素-磁性微粒复合物之前的光强信号变化值，分别为63、13，ΔRU值＜阈值(80)。注入链霉亲和素-磁性微粒复合物之后，光强信号变化值为727、413，ΔRU值＞阈值(80)。继续降低生物素标记的核酸溶液浓度为0.5fM，此时的核酸溶液开始洗脱掉已固定到传感芯片的巯基修饰的DNA探针，超出了仪器自身的检测限。因此，受到仪器自身检测限的影响，采用链霉亲和素磁性微粒放大方法，其检测下限可达5fM(5×10^-15mol)。

4、SPR仪参数分析以及结果分析

(1)SPR仪参数分析

实验检测采用角度调制方式，角度调制范围从40-70度；角度分辨率高于0.001度，测量折射率范围：1.04～1.47。

(2)结果分析

将PCR产物做梯度稀释后(0.5pM-50μM)与探针杂交，并对浓度做ln x转换，散点图如3中A所示。PCR扩增产物的浓度与其响应值在0.5pM-500nM范围内，呈良好的线性关系，R²值＞0.99，结果如图3中B所示。其检测灵敏度可达0.5pM(0.5×10^-12mol)。采用链霉亲和素磁性微粒放大方法，其检测下限可达5fM(5×10^-15mol)。如图4所示，当生物素标记的PCR产物与固定在传感芯片上的探针结合之后，向流通池中继续注入链霉亲和素-磁性微粒溶液，可以明显观察到曲线在生物素标记的PCR产物光强信号值基础上开始慢慢上升，这部分慢慢上升的曲线即为放大后的信号。可以直观地看到信号放大前后的变化情况。

五、与纳米金标记探针技术进行比较

1、纳米金标记探针的固定

将由TaKaRa公司合成的纳米金标记的探针采用自主装的方法固定到传感芯片上，将纳米金标记的探针滴加到传感芯片上，湿盒中室温过夜孵育24小时。

2、将PCR产物用Tris-NaCl稀释成不同浓度(0.5pM-50μM)的核酸溶液，对不同浓度值进行Ln转换。分别将200μL不同浓度(从低到高)的核酸溶液注入流通池中，每个浓度杂交10分钟。观察SPR检测信号，记录各个浓度的RU值。阈值的确定同步骤四中的2。

3、信号放大试验

(1)向流通池中注入Tris-NaCl溶液(Tris 10mM，NaCl 100mM)200μL，读取此时的RU值，RU值为35539。

(2)将纳米金标记的探针固定到传感芯片上，其RU值为40175。

(3)将不同浓度的核酸溶液注入到流通池中，分别反应35分钟，读取不同浓度的核酸溶液的光强值。

4、SPR仪参数分析及结果分析

(1)SPR仪参数分析

实验检测采用角度调制方式，角度调制范围从40-70度；角度分辨率高于0.001度，测量折射率范围：1.04～1.47。

(2)结果分析

未用纳米金标记探针之前，检测灵敏度可达0.5pM，我们根据仪器自身的检测限5fM，将5fM的核酸溶液注入流通池中，观察其信号变化，其RU值可达40262，光强信号变化值增加约87RU。

将5fM的核酸溶液注入流通池中其RU值可达40262，经纳米金标记光强信号变化值增加约200RU。但是与链霉亲和素-磁性微粒放大法相比，光强信号变化量降低了2×10²RU，因此，本研究建立的链霉亲和素-磁性微粒放大法比纳米金放大法的信号增强效果要高。

Claims (2)

1.一种用表面等离子共振生物传感器检测待测物质A和待测物质B是否结合的方法，包括以下步骤：

(1)将待测物质A固定到表面等离子共振生物传感器的传感芯片上，读取光强信号值，记为初始RU值；

(2)将阴性对照加入到固定有待测物质A的传感芯片上，读取光强信号值，记为阴性对照RU值；阴性对照RU值减去初始RU值，即得到阴性对照RU变化值；重复测量阴性对照RU值三次以上，将得到的阴性对照RU变化值的最大值作为阈值；

(3)将生物素标记的待测物质B加入到结合有待测物质A的传感芯片上，使所述生物素标记的待测物质B与所述结合在传感芯片上的待测物质A杂交，再将链霉亲和素与磁性微粒的复合物加入到所述传感芯片上，使链霉亲和素与磁性微粒的复合物与所述生物素结合；读取所述传感芯片上的光强信号值，记为待测物质B的RU值；待测物质B的RU值减去初始RU值，即得到待测物质B的RU变化值；若待测物质B的RU变化值大于所述阈值，则确定所述待测物质A和所述待测物质B结合了。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测物质A为蛋白或核酸；所述待测物质B为蛋白或核酸。

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