CN101251541A - 无标记噬菌体展示蛋白质芯片及其制备和检测方法 - Google Patents
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Abstract
无标记噬菌体展示蛋白质芯片及其制备和检测方法，该无标记噬菌体展示蛋白质芯片包括玻璃基片、铬膜、金膜、耦联层和噬菌体，耦联层为一层HS－(CH2)10－COOH自组装分子膜；在丝状噬菌体外壳蛋白pIII或pVIII上展示多肽段或蛋白质。其制备方法是基于噬菌体展示pIII系统或pVIII系统，以镀有金膜的光学玻璃薄片为基底，采用羧基共价结合将其固定在传感芯片表面，并与表面等离子体共振传感结合；本发明还提供了一种无标记的噬菌体展示蛋白质芯片的检测方法。本发明既可方便地获取各种各样特异性识别分子作为探针，又能实现无标记实时检测，为蛋白质组学研究、疾病诊断和药物筛选提供一种强有力的工具。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究、药物发现与开发领域，特别涉及一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片及其制备和检测方法。
背景技术
生命科学已进入后基因组即蛋白质组学时代，对基因表达产物——蛋白质的研究正成为热点，其包括蛋白质的结构与功能及其相互作用的研究，尤其是一个细胞、一种组织乃至一个个体中的全部蛋白质表达谱。一个基因至少可以表达5个蛋白质，最多可以表达20多个，蛋白质的数量要比基因多得多；一个细胞中有成千上万种蛋白质，一种组织中就更多，从而要求有更高的检测通量。基因芯片已成为基因组研究的技术平台，同时也为蛋白质组学的研究提供了借鉴，蛋白质芯片正逐步成为蛋白质组分析的重要技术平台。制备阵列芯片，探针的提供极为重要。基因由4个碱基组成，互补配对，相对稳定，用PCR法就可以获得大量的探针，足以满足制备基因芯片的需要。蛋白质却不然，它由20种氨基酸构成，目前还无法用人工合成的方法获取大量探针，只能从生物体中通过分离和纯化得到，获得的样品不仅种类很有限，而且数量也很小，难以满足制备阵列蛋白质芯片的要求。如何获得丰富的特异识别分子已成为蛋白质芯片制备亟待解决的一个难题。还需强调，蛋白质具有复杂的空间结构，标记法检测有可能会影响蛋白质的活性和结合位点，因而如何实现无标记高灵敏度检测也是蛋白质芯片技术所面临的另一难题。
自然界中最典型的具备特异识别能力的分子是抗体，抗体常被作为蛋白质芯片的探针。20世纪90年代兴起的噬菌体展示技术(phage display)已成为大量获得抗体的一种新手段，其原理是将编码抗体或抗原的基因片段插入编码噬菌体外壳蛋白的基因中，使其与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面。目前，已利用噬菌体展示技术来构建抗体库，库容量可达109以上，还可根据需要从库中淘选出对某种蛋白质特异的噬菌体抗体克隆，用于制备各种噬菌体展示蛋白质芯片。可见，噬菌体展示蛋白质有可能成为制备蛋白质芯片的各种各样探针的来源。噬菌体展示常用pIII和pVIII这2个系统，其中pVIII系统可展示上千个拷贝的蛋白质，常用于作为酶联免疫检测(ELISA enzyme-linked immunosorbent assay)、石英微量天平(QCM，Quartz crystal microbalance)以及荧光标记检测的探针。然而，ELISA和荧光标记法都需要对样本进行标记，QCM法不需标记，但是存在检测可靠性不高的问题，3种检测方法都不理想。pIII展示蛋白只有几个拷贝，但特异性强，可进行高亲和力筛选。因此，能否将pIII展示蛋白作为探针来制备阵列芯片，成为本发明的出发点之一。
表面等离子体共振(surface plasmon resonance，简称SPR)传感是一种高灵敏度的光学检测方法，可以对分子间的相互作用进行无标记的实时检测，已广泛应用于DNA-DNA，DNA-蛋白质，蛋白质-蛋白质之间的相互作用。可是，目前其传感芯片上固定的探针都是生物分子，噬菌体却很大，常用作噬菌体展示技术的丝状噬菌体长约900nm，直径约6nm，显然现有的小分子或大分子固定方法不适用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种新的无标记噬菌体展示蛋白质芯片及制备和检测方法，可以实时获取噬菌体展示蛋白质与效应物相互作用的信息。
本发明的技术方案如下：
本发明的无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：该蛋白质芯片从下而上依次包括玻璃基片、铬膜、金膜、耦联层和噬菌体，所述耦联层为一层HS-(CH2)10-COOH自组装分子膜，所述的自组装分子膜一端为巯基，以金-硫键与所述金膜共价连接，另一端为羧基，与所述的噬菌体外壳蛋白pVIII上的氨基共价连接；所述的噬菌体为丝状噬菌体，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示多肽段或蛋白质，或在噬菌体的外壳蛋白pVIII上展示多肽段或蛋白质。
本发明所述的铬膜厚度为2～3nm；金膜厚度为40～55nm。
本发明所述的玻璃基片为6×6～20×20mm2的方片，厚度为0.8～1.2mm，材料采用折射率为1.5～1.8的光学玻璃。
本发明提供了一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
1)先在玻璃基片的一个表面上蒸镀或溅射铬膜，再在铬膜上蒸镀或溅射金膜；
2)将玻璃基片放在1～50mM的巯基十一酸乙醇溶液中浸泡至少24h，形成一层均匀致密的带羧基的自组装分子层，作为耦联层；然后取出基片，清洗并吹干；再将基片金膜一面向下，固定在制备芯片的专用装置上；该专用装置由基体、布置在基体内的两个或多个蓄液池以及与每个蓄液池相连的流体通道组成；所述的蓄液池为开口槽，包括检测池和参考池，将芯片覆盖在基体上并加以密封；
3)配制含有盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液作为活化剂，其中盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度为100～200mM，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为25～50mM，将所述的活化剂注入所述专用装置的参考池和检测池中，持续30～60min，活化蓄液池各自所对应的芯片表面的羧基；
4)通过扩增和滴度调整，配制1010～1011cfu/mL的噬菌体悬浮液，然后在检测池中缓慢注入所述的悬浮液，持续30min～60min，使丝状噬菌体与芯片表面的活化位点共价结合，噬菌体便固定在检测池对应的芯片表面上，形成芯片的检测区域；
5)配制0.01～0.02％的磷酸盐-吐温20缓冲液，注入所述的检测池，持续5～10min，清洗掉非特异性吸附；
6)在参考池中注入牛血清白蛋白水溶液，使牛血清白蛋白固定在参考池对应的芯片表面上，形成芯片的参考区域，并清洗掉非特异性吸附；
7)在所述的检测池和参考池内均缓慢注入1～2M乙醇胺溶液，封闭对应的芯片表面上残留的活化位点，持续10～15min，再注入磷酸盐-吐温20缓冲液清洗芯片表面；
上述过程都是在室温下进行。
本发明所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法步骤4)中在检测池中缓慢注入悬浮液的流速为2μL/min；步骤5)中在检测池中注入磷酸盐-吐温20缓冲液的流速、步骤6)中在参考池中注入牛血清白蛋白水溶液的流速和步骤7)中在检测池和参考池中注入乙醇胺和磷酸盐-吐温20缓冲液的流速均为5～10μL/min。
本发明所述的制备芯片的专用装置的基体采用光学玻璃、有机玻璃或PDMS制成。
本发明所述的活化剂中盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度为200mM，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为50mM。
本发明还提供了一种噬菌体展示蛋白质芯片的表面等离子体共振无标记检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)将噬菌体展示蛋白质芯片浸泡在磷酸盐缓冲液中孵育1～2h，然后用缓冲液清洗；
2)将噬菌体展示蛋白质芯片上的耦联有噬菌体的一面向下，放置在检测样本池12上，固定并密封；
3)将固定有噬菌体展示蛋白质芯片的检测样本池放置在检测装置中，没有金膜的一面与棱镜9接触，中间加折射率匹配油，使玻璃基片2与棱镜无气隙贴合；使由光源8发出的会聚光透过棱镜射到芯片的玻璃基片与金膜的界面上，通过探测器10接收反射光；
4)选择流速5～10μL/min，先将磷酸盐缓冲液注入到检测样本池中，记录测量基线，然后再注入检测样本溶液，使检测样本溶液与噬菌体展示蛋白质芯片充分反应，随后注入缓冲液，清洗非特异性吸附，通过探测器记录芯片上反射的光强变化，通过计算机处理，得到样本与所述芯片相互作用的实时变化曲线；
5)在检测样本池中注入甘氨酸-盐酸洗脱液，持续2～3min，洗脱掉结合的样本，至此，完成了一次全过程检测。
本发明所述的洗脱液浓度为10mM，pH值为2.5。
基于噬菌体展示技术，可以解决大量获取特异性识别分子的问题；采用羧基共价结合法，能有效地将噬菌体固定在芯片表面，制备无标记噬菌体展示蛋白质芯片。同时，将噬菌体展示蛋白质芯片与表面等离子体共振传感结合，又可实现无标记实时检测，获得蛋白质-蛋白质相互作用的特异性、亲和力以及动力学参数等信息，这正是目前蛋白质组学研究所期待的。该发明可为蛋白质组学研究、疾病诊断和药物筛选提供一种强有力的工具。
附图说明
图1为本发明所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片的结构示意图。
图2为本发明所述的展示有多肽段或蛋白质的噬菌体示意图。
图3为本发明所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备流程图。
图4为本发明所述的制备芯片的专用装置示意图。
图5为本发明所述的噬菌体展示蛋白质芯片的无标记检测系统示意图。
图6为本发明所述的实现噬菌体展示蛋白质芯片阵列检测示意图。
图7为本发明所述的噬菌体展示蛋白质芯片的无标记检测流程图。
图8为本发明所述的样本与芯片相互作用的实时检测曲线图。
附图标号说明：
1-噬菌体展示蛋白质芯片；2-玻璃基片；3-铬膜；4-金膜；5-耦联层；6-噬菌体；601-噬菌体外壳蛋白pVIII；602-噬菌体外壳蛋白pIII；603-所展示的多肽段或蛋白质；7-制备芯片的专用装置基体；701-检测蓄液池；702-参考蓄液池；703-流体通道；8-光源；9-棱镜；10-探测器；11-检测样本溶液；12-检测样本池；121-多通道检测样本池；122-多通道芯片；123-阵列检测单元；13-计算机；14-流速控制器。
具体实施方式
本发明提出基于噬菌体pIII展示系统，以镀有金膜的光学玻璃薄片为基底，采用羧基共价结合法来固定，制备无标记噬菌体展示蛋白质芯片，并与表面等离子体共振传感法结合，实现无标记实时检测，获取蛋白质-蛋白质以及蛋白质与其它分子相互作用的信息。需要强调，pVIII系统可展示的蛋白拷贝数是pIII系统所展示数的100倍以上，因此，只要用这种传感方法能灵敏地检测噬菌体pIII系统展示的蛋白质芯片，自然可以更灵敏地无标记检测噬菌体pVIII系统展示的蛋白质芯片。
下面结合附图，对本发明所述的噬菌体展示蛋白质芯片及制备和无标记检测方法进行详细说明。
本发明的噬菌体展示蛋白质芯片1，从下向上依次包括玻璃基片2、铬膜3、金膜4、耦联层5和噬菌体6，如图1所示。所述的耦联层5为一层HS-(CH2)10-COOH自组装分子膜，其一端为巯基，以金-硫键与所述的金膜4共价连接，另一端为羧基，与所述的噬菌体的外壳蛋白上的氨基共价连接；
所述的噬菌体为丝状噬菌体，如图2所示，其所展示的外壳蛋白主要有pVIII601和pIII602，在所述的pIII602蛋白上展示有多肽段或蛋白质603。也可以在pVIII蛋白上展示有多肽段或蛋白质。
本发明所述的玻璃基片2是折射率为1.5～1.8的光学玻璃，厚度为0.8～1.2mm，大小为6×6～20×20mm2的方片，在其一面先蒸镀或溅射2～3nm厚的铬膜3，再蒸镀或溅射蒸镀或溅射40～55nm厚的金膜4。接着，在金膜上是通过化学自组装制备一层HS-(CH2)10-COOH有机分子膜，作为耦联层5。所述的展示有多肽段或蛋白质的噬菌体6通过外壳蛋白上的氨基与耦联层5的羧基共价结合，固定在上，作为芯片的探针。
噬菌体展示蛋白质芯片1的制备流程如图3所示。首先，清洗光学玻璃基片，并在基片的一面依次蒸镀或溅射铬膜和金膜；接着将玻璃基片放在1～50mM的巯基十一酸乙醇溶液中浸泡至少24h，形成一层均匀致密的带羧基的自组装分子层，作为耦联层；然后取出基片，充分清洗并用氮气吹干；再将玻璃基片金膜一面向下，固定在制备芯片的专用装置上，以备进行所述耦联层的活化和噬菌体的固定。
本发明所述的芯片制备流体装置7可由光学玻璃、有机玻璃或弹性膜PDMS(poly，dimethylsiloxane)制成，如图4所示。该专用装置由基体7、布置在基体内的2个或多个蓄液池以及与每个蓄液池相连的流体通道703组成；所述的蓄液池为开口槽，具有2个蓄液池的专用装置可分为检测池701和参考池702，用于制备双通道芯片；具有多个蓄液池的专用装置可选用一个作为参考池，其余作为检测池，用于制备多通道或阵列型芯片，提高检测通量；将芯片金膜面向下，覆盖在专用装置的基体上并加以密封，构成图7箭头所述的液体通路，使从流体通道和蓄液池中流过的溶液与芯片表面直接接触，从而能够进行耦联层的制备和噬菌体的固定。
配制含有盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合水溶液作为活化剂，其中EDC的摩尔浓度为100～200mM，NHS的摩尔浓度为25～50mM，将所述的活化剂注入所述专用装置的参考池和检测池中，持续30～60min，活化蓄液池各自所对应的芯片表面的羧基；当混合水溶液中EDC和NHS的摩尔浓度分别为200mM和50mM时，该活化剂可以达到最佳活化效果。
通过扩增和滴度调整，配制1010～1011cfu/mL的展示有多肽段和蛋白质的噬菌体的悬浮液。接着，在检测池中缓慢注入此悬浮液，持续30～60min，使噬菌体通过它的外壳蛋白上的氨基与芯片表面的羧基共价结合，固定在检测池对应的芯片表面上，形成芯片的检测区域。为节约样品和使噬菌体与芯片的结合更加充分，可选择最佳流速2μL/min。共价耦联时，需要所述的噬菌体外壳蛋白pVIII601上的氨基和芯片表面活化的羧基靠得足够近才能进行共价结合。可是，噬菌体很大，且为长丝状，其转动非常缓慢，降低了氨基和活化羧基接触的几率，较难耦联得到更高密度。正因为如此，通过延长耦联时间或增大噬菌体悬浮液的浓度，就可进一步提高噬菌体在芯片表面固定的数量。
所述的噬菌体固定完成后，将配制的0.01％～0.02％的磷酸盐-吐温20缓冲液(PBS-T)注入检测池，持续5～10min，清洗掉非特异性吸附。以同样的方法，在参考池中注入牛血清白蛋白(BSA)溶液，使BSA固定在参考池对应的芯片表面，形成芯片的参考区域；接着再注入PBS-T缓冲液，持续5～10min，清洗掉非特异性吸附。BSA水溶液的浓度可根据需要选择1～10mg/mL，流速选择5～10μL/min，注入持续时间选择15～30min，以其在芯片上的结合量和噬菌体在芯片上的结合量基本相近为最佳条件。最后，在检测池和参考池中同时缓慢注入1～2M乙醇胺，封闭芯片表面上检测及参考区域内残留的活化位点，流速为5～10μL/min，持续10～15min。完成后，将其放置在磷酸盐缓冲液(PBS)中保存备用，便完成了无标记噬菌体展示蛋白质芯片的整个制备过程。
上述过程都是在室温下进行。
下面以实施例进一步说明本发明所述的噬菌体展示蛋白质芯片的制备过程：
实施例1：
清洗光学玻璃基片，并在基片的一面依次蒸镀2nm铬膜和40nm金膜；接着将玻璃基片放在1mM的巯基十一酸乙醇溶液中浸泡48h；清洗并吹干后，将芯片金膜面向下固定在制备芯片的专用装置上；配制EDC和NHS的摩尔浓度分别为100mM和25mM的混合水溶液，注入到专用装置的检测池和参考池中，持续60min，活化两蓄液池对应的芯片表面的羧基；配制1010cfu/mL的展示有多肽段或蛋白质的丝状噬菌体的悬浮液，以2μL/min的流速注入检测池，持续60min；接着在检测池中注入0.01％的PBS-T溶液，清洗非特异性吸附；配制1mg/mL的BSA水溶液，以10μL/min的流速注入参考池持续30min，再用0.01％的PBS-T溶液注入参考池，清洗非特异性吸附；最后，在检测池和参考池中以10μL/min的流速同时注入1M乙醇胺，持续10min，封闭芯片表面上检测及参考区域内残留的活化位点。完成后，将芯片保存在PBS中备用。
实施例2：
清洗光学玻璃基片，并在基片的一面依次蒸镀3nm铬膜和55nm金膜；接着将玻璃基片放在50mM的巯基十一酸乙醇溶液中浸泡24h；清洗并吹干后，将芯片金膜面向下固定在制备芯片的专用装置上；配制EDC和NHS的摩尔浓度分别为200mM和50mM的混合水溶液，注入到专用装置的检测池和参考池中，持续30min，活化两蓄液池对应的芯片表面的羧基；配制1011cfu/mL的展示有多肽段或蛋白质的丝状噬菌体的悬浮液，以2μL/min的流速注入检测池，持续30min；接着在检测池中注入0.02％的PBS-T溶液，清洗非特异性吸附；配制10mg/mL的BSA水溶液，以5μL/min的流速注入参考池持续15min，再用0.02％的PBS-T溶液注入参考池，清洗非特异性吸附；最后，在检测池和参考池中以5μL/min的流速同时注入2M乙醇胺，持续15min，封闭芯片表面上检测及参考区域内残留的活化位点。完成后，将芯片保存在PBS中备用。
本发明所述的噬菌体展示蛋白质芯片的无标记检测方法是基于表面等离子体共振传感，检测系统示意图如图5所示。检测系统为棱镜耦合结构，芯片1耦联有噬菌体的一面与样本池12直接接触，另一面通过折射率匹配油与棱镜9接触，棱镜9的材料与所述芯片玻璃基片的材料相同。固定波长的会聚光由光源8发出，透过棱镜9，射到噬菌体展示蛋白质芯片1的玻璃基片与金膜的界面上，并由此反射。当入射角为共振角时，发生表面等离子体共振，反射光的光强发生激烈变化，几乎下降为0。当抗体溶液11从检测样本池12的微流体通道中流过时，与噬菌体6上展示的蛋白质603发生结合反应，传感芯片1表面的介质折射率随之变化，反射光中光强最低点的角度位置由图4中的I变到II，探测器10接收到反射光强，并由计算机13实时读入，计算光强最低点对应的角度变化值。反应不断进行，变化不断发生，探测器10不断传感，计算机13实时读入并进行处理，从而可实时得到抗体与蛋白质相互作用的反应曲线，经解析后还可得到特异性、亲和力以及有关动力学常数等。
如图6所示，所述的噬菌体展示蛋白质芯片的阵列检测可按如下方法实现：利用具有多个蓄液池的芯片制备专用装置制备多通道芯片122，将多通道芯片耦联有噬菌体的一面向下放置在多通道检测样本池121上，且保证芯片122上的探针的排列方向与多通道检测样本池121的流体通道方向互相垂直，分别见6(b)和(a)。这样，就可构成了2×2或n×n个检测单元123，见6(c)。检测时，各条样本通道同时或按时序注入样本，样本就与对应检测单元上噬菌体展示的蛋白结合，探测器10可实时探测结合情况，计算机13实时读入并进行处理，解析后可同时得到各个单元上蛋白质-蛋白质相互作用的特异性、亲和力以及有关动力学常数等。
噬菌体展示蛋白质芯片的表面等离子体共振无标记检测流程如图7所示。先将所述的制备好的噬菌体展示蛋白质芯片浸泡在PBS中，孵育2h，然后用0.01％～0.02％PBS-T缓冲液清洗，准备用于检测；将噬菌体展示蛋白质芯片上的耦联有噬菌体的一面向下，放置在检测样本池上，固定并密封；将固定有噬菌体展示蛋白质芯片的检测样本池按前面所述方法放置在检测装置中，通过计算机13控制流速控制器14，选择流速为5～10μL/min，在检测样本池中先注入0.01％～0.02％的PBS-T缓冲液，记录测量基线；接着，注入可以与噬菌体展示的蛋白质或多肽段特异性结合的检测样本溶液，使它与噬菌体展示的蛋白质发生相互作用。随后，注入0.01％～0.02％PBS-T缓冲液，清洗非特异性结合，实时记录和检测芯片上检测区域和参考区域各自对应的变化曲线，得到检测信号和参考信号，用检测信号减去参考信号后即得到整个反应的变化曲线，如图8所示，检测过程中溶液注入持续时间可根据需要进行调整。最后，注入10mM甘氨酸-盐酸(pH2.5)洗脱液，持续2～3min，洗脱掉结合的样本，以便进行芯片的重复使用。至此，完成了一次全过程操作。
接着，使用专用软件对所记录的反应曲线进行解析，就可得到生物分子与噬菌体展示蛋白质芯片相互作用的特异性、亲和力以及动力学参数等信息。
Claims (8)
1.一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：该蛋白质芯片从下而上依次包括玻璃基片、铬膜、金膜、耦联层和噬菌体，所述耦联层为一层HS-(CH2)10-COOH自组装分子膜，所述的白组装分子膜一端为巯基，以金-硫键与所述金膜共价连接，另一端为羧基，与所述的噬菌体外壳蛋白pVIII上的氨基共价连接；所述的噬菌体为丝状噬菌体，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示多肽段或蛋白质，或在噬菌体的外壳蛋白pVIII上展示多肽段或蛋白质。
2.按照权利要求1所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：所述的铬膜厚度为2～3nm；金膜厚度为40～55nm。
3.按照权利要求1所述的无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：所述的玻璃基片为6×6～20×20mm2的方片，厚度为0.8～1.2mm，材料采用折射率为1.5～1.8的光学玻璃。
4.一种如权利要求1所述无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
1)先在玻璃基片的一个表面上蒸镀或溅射铬膜，再在铬膜上蒸镀或溅射金膜；
2)将玻璃基片放在1～50mM的巯基十一酸乙醇溶液中浸泡至少24h，形成一层均匀致密的带羧基的自组装分子层，作为耦联层；然后取出基片，清洗并吹干；再将基片金膜一面向下，固定在制备蛋白质芯片的专用装置上；该专用装置由基体(7)、布置在基体内的两个或多个蓄液池以及与每个蓄液池相连的流体通道(703)组成；所述的蓄液池为开口槽，包括检测池(701)和参考池(702)，将蛋白质芯片覆盖在基体(7)上并加以密封；
3)配制含有盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液作为活化剂，其中盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度为100～200mM，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为25～50mM，将所述的活化剂注入所述专用装置的参考池和检测池中，持续30～60min，活化蓄液池各自所对应的芯片表面的羧基；
4)通过扩增和滴度调整，配制1010～1011cfu/mL的噬菌体悬浮液，然后在检测池中缓慢注入所述的悬浮液，持续30min～60min，使噬菌体与芯片表面的活化位点共价结合，噬菌体便固定在检测池对应的芯片表面上，形成芯片的检测区域；
5)配制0.01～0.02％的磷酸盐-吐温20缓冲液，注入所述的检测池(701)，持续5～10min，清洗掉非特异性吸附；
6)在参考池中注入牛血清白蛋白水溶液，使牛血清白蛋白固定在参考池对应的芯片表面上，形成芯片的参考区域，并清洗掉非特异性吸附；
7)在所述的检测池和参考池内均缓慢注入1～2M乙醇胺溶液，封闭对应的芯片表面上残留的活化位点，持续10～15min，再注入磷酸盐-吐温20缓冲液进行清洗，完成无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备；
上述过程都是在室温下进行。
5.按照权利要求4所述的一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中在检测池中缓慢注入悬浮液的流速为2μL/min；所述步骤5)中在检测池中注入磷酸盐-吐温20缓冲液的流速、所述步骤6)中在参考池中注入牛血清白蛋白水溶液的流速和所述步骤7)中在检测池和参考池中注入乙醇胺和磷酸盐-吐温20缓冲液的流速均为5～10μL/min。
6.按照权利要求4所述的一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于：制备芯片的专用装置的基体采用光学玻璃、有机玻璃或PDMS制成。
7.按照权利要求4所述的一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于：活化剂中盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度为200mM，N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为50mM。
8.一种如权利要求1所述噬菌体展示蛋白质芯片的表面等离子体共振无标记检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)将噬菌体展示蛋白质芯片(1)浸泡在磷酸盐缓冲液中孵育1～2h，然后用缓冲液清洗；
2)将噬菌体展示蛋白质芯片上的耦联有噬菌体的一面向下，放置在检测样本池(12)上，固定并密封；
3)将固定有噬菌体展示蛋白质芯片(1)的检测样本池放置在检测装置中，没有金膜的一面与棱镜(9)接触，中间加折射率匹配油，使玻璃基片(2)与棱镜无气隙贴合；使由光源(8)发出的会聚光透过棱镜射到芯片的玻璃基片与金膜的界面上，通过探测器(10)接收反射光；
4)选择流速5～10μL/min，先将磷酸盐缓冲液注入到检测样本池中，记录测量基线，然后再注入检测样本溶液，使检测样本溶液与噬菌体展示蛋白质芯片充分反应，随后注入缓冲液，清洗非特异性吸附，通过探测器记录芯片上反射的光强变化，通过计算机处理，得到样本与所述芯片相互作用的实时变化曲线；
5)在检测样本池中注入甘氨酸-盐酸洗脱液，持续2～3min，洗脱掉结合的样本，至此，完成了一次全过程检测。
9.按照权利要求8所述的噬菌体展示蛋白质芯片的表面等离子体共振无标记检测方法，其特征在于：步骤5)中所述洗脱液浓度为10mM，pH值为2.5。
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