JP3937020B2 - 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 - Google Patents
表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3937020B2 JP3937020B2 JP2004030700A JP2004030700A JP3937020B2 JP 3937020 B2 JP3937020 B2 JP 3937020B2 JP 2004030700 A JP2004030700 A JP 2004030700A JP 2004030700 A JP2004030700 A JP 2004030700A JP 3937020 B2 JP3937020 B2 JP 3937020B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- protein
- plasmon resonance
- surface plasmon
- array sensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 61
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 title claims description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 92
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 45
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 40
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 30
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 23
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 5
- NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N (2s)-2-[[4-[2-(2,4-diaminoquinazolin-6-yl)ethyl]benzoyl]amino]-4-methylidenepentanedioic acid Chemical compound C1=CC2=NC(N)=NC(N)=C2C=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CC(=C)C(O)=O)C(O)=O)C=C1 NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 86
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 31
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 16
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 16
- NCAKAGVEIJMULW-VKHMYHEASA-N (2r)-2-(cyanoamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical group OC(=O)[C@H](CS)NC#N NCAKAGVEIJMULW-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000007333 cyanation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 7
- GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 6
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTFWCVDISAMGEQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RTFWCVDISAMGEQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- INFBPLSHYFALDE-ACZMJKKPSA-N Gln-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O INFBPLSHYFALDE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 6
- GFLQTABMFBXRIY-GUBZILKMSA-N Glu-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GFLQTABMFBXRIY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- TWYOYAKMLHWMOJ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Leu-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TWYOYAKMLHWMOJ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 6
- KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- GRADYHMSAUIKPS-DCAQKATOSA-N Lys-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GRADYHMSAUIKPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- MPCKIRSXNKACRF-GUBZILKMSA-N Met-Pro-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MPCKIRSXNKACRF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- AGTHXWTYCLLYMC-FHWLQOOXSA-N Phe-Tyr-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AGTHXWTYCLLYMC-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 6
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 6
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003491 array Methods 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- JQSWHKKUZMTOIH-QWRGUYRKSA-N Asn-Gly-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JQSWHKKUZMTOIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 5
- FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- KUBFPYIMAGXGBT-ACZMJKKPSA-N Gln-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KUBFPYIMAGXGBT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 5
- YBJWJQQBWRARLT-KBIXCLLPSA-N Ile-Gln-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YBJWJQQBWRARLT-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 5
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BTRULDJUUVGRNE-DCAQKATOSA-N Ala-Pro-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O BTRULDJUUVGRNE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- LWXJVHTUEDHDLG-XUXIUFHCSA-N Asn-Leu-Leu-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LWXJVHTUEDHDLG-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 4
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- DAHLWSFUXOHMIA-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O DAHLWSFUXOHMIA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-amino-3-carboxypropanoyl)amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- QFMCHXSGIZPBKG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N QFMCHXSGIZPBKG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 3
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- -1 vinyl compound Chemical class 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- XJFPXLWGZWAWRQ-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XJFPXLWGZWAWRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UBKOVSLDWIHYSY-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UBKOVSLDWIHYSY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000010976 amide bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIMIGUBYDJDCKI-UHFFFAOYSA-N diselenium Chemical compound [Se]=[Se] XIMIGUBYDJDCKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 150000003346 selenoethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000003958 selenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/55—Specular reflectivity
- G01N21/552—Attenuated total reflection
- G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
Description
そこで、本発明はこれまでのアレイセンサ、特に実用上有用な抗体アレイセンサにおける上記問題1.の単位面積あたりの結合量の向上、ならびに上記問題2.のタンパク質の固定化における結合機能阻害の克服に関して抜本的解決を与えることを目的としている。
(1)抗体結合性タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端をリンカー配列を介して、一級アミノ基を有するセンサ検出部表面上のリンカー分子とアミド結合で固定化することにより得られ、一般式(1)
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y-Z (1)
[上記式中、R1は、抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R2は任意のリンカー配列のアミノ酸配列、Yはリンカー分子、Zはセンサ検出部表面基材を表す]で表される、センサ検出部表面上の特定領域に抗体結合性タンパク質あるいはペプチドを整列固定化させた表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板であって、上記一級アミノ基を有するリンカー分子が、
一般式(2)
(NH2-X)n (2)
で示される一級アミノ基を有するポリマー化合物である(但し、式中Xは、ポリマー化合物の繰り返し単位の一級アミノ基以外の残基を示し、nは2以上の整数を表す。)ことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(2)上記(1)の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする請求項1に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(3)上記(1)の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする上記(1)に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作成用アレイ基板に、抗体蛋白質を整列固定化させたことを特徴とする、表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ。
(5)一級アミノ基を有するセンサ検出部表面上の特定領域に、一般式(10)
NH2-R1-CO-NH-R2-COOH (10)
〔式中、R1は抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R2はリンカー配列を表す。〕
で示されるタンパク質もしくはペプチドを整列固定化した表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板を作成する方法であって、
一級アミノ基が、一般式(2)で表されるポリマー化合物の一級アミノ基であり、
(NH2-X)n (2)
(但し、式中Xは、ポリマー化合物の繰り返し単位の一級アミノ基以外の残基を示し、nは2以上の整数を表す。)
該一級アミノ基を有するセンサ検出部表面上に、一般式(9)で示されるタンパク質もしくはペプチドが整列配置、吸着された状態で、
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SCN)-CO-NH-R3-COOH・・・・(9)
〔式中、上記式中、R1は、抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R2は任意のリンカー配列のアミノ酸配列、R3は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式(9)で表されるタンパク質もしくはペプチドの等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。〕
弱アルカリ溶媒を用いて、上記ポリマー化合物の一級アミノ基と一般式(10)で表されるタンパク質若しくはペプチド主鎖のカルボキシ末端をペプチド結合させることを特徴とする、表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
(6)上記(5)の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする上記(4)に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
(7)上記(5)の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする上記(4)に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
(8)酸・アルカリ・塩溶液等を用いた抗体分子の脱着再生操作を施すことにより繰り返し同質の測定を可能としたことを特徴とする、上記(4)に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを用いた抗原分子の測定方法。
(9)上記(4)の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを検出部に用いること、ならびに上記(8)に記載の繰り返し再生操作を適用することを特徴とし、試料測定回ごとに検出部表面の自動的再生処理を行う自動送液装置、および検出により生成される測定データの自動的収集ならびにデータ処理を可能にするデータ処理装置を一体として備えた表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサの自動測定システム。
本発明は、非標識分子検出が可能な表面プラズモン共鳴アレイセンサの検出部金属表面のリンカー分子の一級アミノ基に抗体結合性タンパク質を吸着させ、また、さらに該一級アミノ基に該タンパク質主鎖のカルボキシ末端を、シアノシステイン残基を介したアミド結合形成反応を利用して結合させることにより、該基材上に該タンパク質を整列固定化して、抗体結合性タンパク質を抗体捕捉用足場分子とした抗体捕捉用アレイセンサ基材を調製したのち、複数かつ任意の抗体分子を該基材上のそれぞれの特定微小領域に配された抗体結合性タンパク質により捕捉させ、抗体アレイセンサを構築するものである。
本発明においては、アレイセンサ基材上の極めて小さな領域において、高密度かつその機能を保持したまま均一な配向状態で固定化でき、しかるにその高密度かつ均一配向した抗体結合性タンパク質により捕捉された抗体分子もまた、該蛋白質−抗体分子間の結合が、抗体分子の抗原結合機能を司る部位ではなく定常領域と呼ばれる結合機能とは無関係の部位にて確実に達成できることから、均一な配向をもって高密度にアレイセンサ上の特定領域に固定化できる。
すなわち、このような高度に均一な配向と高い密度を同時に達成できる本発明により、固定化された抗体分子は個々の分子が最大限に抗原結合機能を発揮することができ、単位面積あたりの分子数が増大するため、表面プラズモン共鳴アレイセンサでの感度不足が改善し、かつ再現性の高い測定が可能となる。
本発明の上記課題を達成するためには、まずアレイセンサ基材として、負に帯電した抗体結合タンパク質をイオン相互作用により吸着できるに十分な一級アミノ基を露出した表面構造が要求される。この性能を満たす基材の構成としては、表面プラズモン共鳴アレイセンサが元来備える検出部の金属(主に金)表面の上に一級アミノ基をバルク水側に露出し、かつ金属とも共有結合で結合できる二価性の低分子化合物であるリンカー分子の介在が望ましい。このようなリンカー分子は既によく研究され、また市販化もされているが、以下の一般式で示される。
X-A-Y (4)
[上式(4)中のXはチオール(HS-)、ジスルフィド(Y-A-SS-, Y’-A’-SS-)、スルフィド(Y-A-S-,Y’-A’-S-)、セレノール(HSe-)、ジセレナイド(Y-A-SeSe-,Y’-A’-SeSe-)、セレナイド(Y-A-Se-,Y’-A’-Se-)等があげられ、これらの例では硫黄原子あるいはセレン原子と金との間で自発的共有結合が形成される。Aは飽和炭化水素鎖((CH2)n)やエチレングリコール重合体((CH2-CH2-O-)n)を表す(nはそれぞれ2以上の整数)が、部分的に不飽和結合(2重結合等)が挿入されることがある。Yはここでは一級アミノ基である。なお、Y’はYに適合する残基である場合もあるが、それ以外の親水基でもよい。後者の場合、結合反応には関与しない。]
一級アミノ基を繰返し構造中に有するポリマー化合物としては、例えば、ポリアルキレン鎖、ポリアミド鎖、ポリエステル鎖、ポリスチレン鎖等を有するもの等が挙げられ、以下の一般式で表される繰り返し構造を有する。
(X-NH2)n (5)
〔 上記式(5)中、Xは、例えば、ポリアルキレン鎖、ポリアミド鎖、ポリエステル鎖、ポリスチレン鎖等を構成するモノマー残基を表す。また、NH2基は、該モノマー残基中に含まれる基であってもよいし、これらポリマー化合物の主鎖から分枝した側鎖中に含まれる基であってもよい。nは2以上の整数を指す。〕
本発明において固定化に供される抗体結合性タンパク質もしくはペプチドとしては、抗体分子に対して結合能を有するものであれば何でも用いることができる。
抗体分子に結合能を有するタンパク質としては、
NH2-R1-COOH (6)
[上記式中、R1は、抗体分子に結合能を有するタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列を表す]
で表すことができる。
一般式(7)
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOH (7)
で示される固定化用のタンパク質を作製する必要がある。これらの一般式中、R3は、中性付近で強く負に荷電し、且つNH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHの等電点を酸性にできる任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。R1は、上述の抗体分子に結合能を有するタンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列である。R2は、上記一般式(1)で示される固定化しようとするタンパク質と金属表面上の両親媒性のリンカー分子との間を延長するリンカーペプチドとなる。R2のアミノ酸配列は任意でありその種類、数ともに限られないが、例えばGly-Gly-Gly-Gly等を用いることができる。このような融合タンパク質は、上記一般式(6)で示されるタンパク質をコードする遺伝子と
一般式(8)
NH2-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOH (8)
[上記式中、R2およびR3は上記の意味を有する。]
で示されるペプチド配列をコードする遺伝子とを結合することにより、一般式(7) NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-NH-R3-COOHで示される融合タンパク質をコードする遺伝子を作製し、これを大腸菌などの宿主生物で発現させ、その後、発現したタンパク質を分離精製することにより得ることができる。
37-45 (1992)参照)を利用することにより、実施することができる。あるいは、上記融合タンパク質は、遺伝子工学的手法と慣用のタンパク質合成技術との組み合わせ、または、蛋白合成技術のみによっても作製することができる。
上記一般式(7)および(8)におけるR3としては、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。好ましくは、上記一般式(7)および(8)の物質の等電点を4から5の間の値になるように、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列をデザインすればよい。そのような配列のうち好適な列としてアラニル-ポリアスパラギン酸をあげることができる。シアノシステイン残基の次のアミノ酸残基をアラニンにすることにより、シアノシステイン残基を介したアミド結合形成反応が生じやすいことと、アミノ酸側鎖の中でアスパラギン酸のカルボキシル基が最も酸性であるからである。
Staphylococcus aureus由来のプロテインAは、アミノ酸配列が著しく類似したA,B,C,D,Eと名付けられた5つのドメインとそれに付随した配列により構成されている。それらの各々のドメインは、57アミノ酸で構成されるが、それぞれ単独でも安定な構造をとり、例えば大腸菌において大量発現させることができる。また、各ドメインは、単独で抗体分子との結合能を発揮できる。その結合の強さは、天然由来のプロテインA全体部分よりも弱まるが、ドメインを2つ連結したものでは、天然由来のプロテインA全体部分とほぼ同程度である。そこで、プロテインAのドメインに着目して、単独ドメイン(これをモノマーと称する)とドメインを2つ連結したもの(これをダイマーと称する)の2種類について、固定化に供するための配列を設計した。
配列番号1
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp
Asp Asp Asp
配列表2
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp
Asp
配列番号3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
配列番号4
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu
Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp
Asp
配列番号5
Gly Gly Gly Gly
Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp
配列番号1及び配列番号2に示すタンパク質をコードする配列の例として、それぞれ配列番号6及び配列番号7に示す塩基配列があげることができる。
配列番号6
ATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAA
配列番号7
ATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAA
アミノ酸をコードする塩基配列は縮退しており、複数のコドンがある1つのアミノ酸残基に対応することから、配列表1及び配列表2に示すタンパク質をコードする配列は、配列表6及び配列表7に限定されず、可能なコドンの組み合わせの数だけ存在する。
配列番号8
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAAGAATTC
配列番号9
GGATCCTTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACTATGGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGGTGGCGGTGGCTGCGCTGATGACGATGACGATGACTAAGAATTC
配列番号10
TTGACAATATCTTAACTATCTGTTATAATATATTGACCAGGTTAACTAACTAAGCAGCAAAAGGAGGAACGACT
に示す配列を開始コドンの上流に結合させると共に、5’末端に制限酵素BamHIの認識切断配列、及び、3’末端に制限酵素EcoRIの認識切断配列を結合させ、ベクターDNAに導入できるようにした配列である。
配列番号8及び配列番号9に示す配列は、いくつかの断片を化学合成した後、PCR法もしくはDNAリガーゼなどの酵素を用いることにより、人工合成することができる。
次に、本発明においては、上記のようにして調製した固定化用抗体結合性タンパク質をタンパク質アレイ用基材に配置、吸着させるが、その方法には特に制限はなく、基材上の特定の領域にタンパク質溶液をスポットできる方法であればいかなる方法も用い得る。例えば、ピン等の針状物、インクジェット、キャピラリー等を用いる方法があるが、いずれの方法を用いてもよい。また、ピッキングロボットを用いることも可能である。以下に一例として、キャピラリーを用いてスポットする方法について詳述する。
別法として説明するように、上記スポットしたタンパク質を吸着固定化させることによりそのままタンパク質アレイとしてもよいが、この段階ではあくまでも静電相互作用等非共有結合によりタンパク質が基材に結合しており、結合強度が低いので、タンパク質を強固に固定化するためには、更に、タンパク質のカルボキシ末端のカルボキシル基と基材上のポリマーの一級アミノ基との間にアミド結合を形成させる。その反応を起こさせるためには、固定化用タンパク質のカルボキシ末端に導入したシステイン残基のスルフヒドリル基をシアノ化しシアノシステインに変換する必要がある。
NH2-R1-CO-NH- R2-CO-NH-CH(CH2-SCN)-CO-NH-R3-COOH ・・・(9)
[上記式中、R1、R2、R3は一般式(7)のR1、R2、R3とそれぞれ同じであり、R1は任意のアミノ酸配列を、、R2はリンカーペプチドを、R3は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式(7)の化合物の等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。]
NTCBを用いたシアノ化は、pH7.0の10mM燐酸緩衝液中で効率よく行うことができる。このシアノ化反応の後、溶媒を弱アルカリにすることにより、固定化反応が進行する。即ち、シアノシステイン残基直前のアミノ酸残基のカルボキシル基と担体の一級アミノ基との間にアミド結合が形成される。このことは、緩衝液をpH9.5の10mM硼酸緩衝液に換えること等で可能である。
本実施例においては、一級アミンを表面に露出している表面プラズモン共鳴アレイセンサとして、東洋紡製の機器、Multi SPRinterに付属するNH2−チップあるいはCOOH−チップを利用し、これを該機器に装着して検討した。これらのチップではそれぞれ、チップ上の金属表面を98カ所の微小領域に分割し、該領域にアミノ基あるいはカルボキシル基を末端に有し、反対側の末端にチオール基を有するポリエチレングリコール(PEG)分子により、単層の安定なSAM表面を用意している。一級アミノ基を繰り返し構造中に有するポリマー化合物として、シグマ−アルドリッチで市販しているポリ−L−リジンを用いた。
〔1〕COOH−チップを用いた比較実験のための抗体分子直接非配向固定化により構築した従来型アレイセンサの作製
COOH−チップ上に0.2 M EDC (N-ethyl-N’-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide)
/ 0.05 M NHS (N-Hydroxysuccinimide)の混和水溶液を全体を覆うように滴下して1時間静置し、表面カルボン酸を活性化させた。純水にて表面をすすいだ後、HEPES緩衝液(0.05 M HEPES (pH 7.4) + 0.2 M NaCl)に溶解させた100 μg/mL 抗ヒツジIgG抗体ウサギ由来抗体を滴下して2時間作用させた。純水にて表面をすすいだ後、1.0 M エタノールアミン塩酸塩水溶液(pH 8.5)を30分作用させ、未反応カルボン酸活性化体を不活性化した。
COOH−チップ上に0.2 M EDC (N-ethyl-N’-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide)
/ 0.05 M NHS (N-Hydroxysuccinimide)の混和水溶液を、全体を覆うように滴下して1時間静置し、表面カルボン酸を活性化させた。純水にて表面をすすいだ後、1 %のポリ−L−リジン(分子量:15万〜30万)を含む水溶液を、東洋紡製のピン型自動スポッティング装置を用いて、表面プラズモン共鳴アレイセンサの微小領域にスポッティングし、密閉した容器の中で湿度を80%に保つことにより、2時間静置した。1.0
M KClにて表面を5回洗浄した後、1.0 M エタノールアミン塩酸塩水溶液(pH 8.5)を30分作用させ、未反応カルボン酸活性化体を不活性化した。このように構築したポリマー修飾済のSPRセンサチップをMulti
SPRinterのフローセルに装着し、10 μg/mLの末端に負に荷電するアミノ酸とシステイン残基を加えた組換えプロテインA分子をフローセル中に1時間通液循環させ、イオン的相互作用によるタンパク質末端とポリマー中の一級アミノ基との結合を促進した。この後5
mM NTCB溶液(pH 7.0)を1時間通液循環させてプロテインA中のシステイン残基をシアノ化した後、10 mM 硼酸緩衝液(pH 9.5)を1時間通液循環させてシアノ化システイン残基を介したプロテインAタンパク質のC末端の主鎖固定化反応を促進させた。最後に1.0
M KClにて表面を5回洗浄して共有結合が形成できなかった未反応タンパク質を洗い流してアレイセンサ基材を作製した。この基材をフローセル内にとどめたまま、10 μg/mL
抗ヒツジIgG抗体ウサギ由来抗体を通液循環させて、表面のプロテインA分子に結合させることにより、本発明による表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを完成させた。
上記〔1〕、〔2〕でそれぞれ作成した従来法ならびに本発明による表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを比較するため、2つのアレイセンサを別途フローセルに納め、10 μg/mL抗ウシ・アルブミンヒツジ抗体(フナコシ)を通液循環により作用させて反応を観測した(図1)。図から明快なように、従来型の固定化法(非配向)にて抗体分子を固定化させた表面(図中曲線A)では、検出限界に近い小さなシグナルしか観測できなったが、本発明によるアレイセンサ(図中曲線B)では、配向制御固定化法による実効感度の向上を反映して遙かに大きなシグナルが観測されており、本発明による表面プラズモン共鳴アレイセンサ構築技術の妥当性を示している。
Claims (9)
- 抗体結合性タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端をリンカー配列を介して、一級アミノ基を有するセンサ検出部表面上のリンカー分子とアミド結合で固定化することにより得られ、一般式(1)
NH2-R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y-Z (1)
[上記式中、R1は、抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R2は任意のリンカー配列のアミノ酸配列、Yはリンカー分子、Zはセンサ検出部表面基材を表す]で表される、センサ検出部表面上の特定領域に抗体結合性タンパク質あるいはペプチドを整列固定化させた表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板であって、上記一級アミノ基を有するリンカー分子が、
一般式(2)
(NH 2 -X)n (2)
で示される一級アミノ基を有するポリマー化合物である(但し、式中Xは、ポリマー化合物の繰り返し単位の一級アミノ基以外の残基を示し、nは2以上の整数を表す。)ことを特徴とする表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。 - 請求項1の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする請求項1に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
- 請求項1の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする請求項1に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作成用アレイ基板に、抗体蛋白質を整列固定化させたことを特徴とする、表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ。
- 一級アミノ基を有するセンサ検出部表面上の特定領域に、一般式(10)
NH 2 -R 1 -CO-NH-R 2 -COOH (10)
〔式中、R 1 は抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R 2 はリンカー配列を表す。〕
で示されるタンパク質もしくはペプチドを整列固定化した表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板を作成する方法であって、
一級アミノ基が、一般式(2)で表されるポリマー化合物の一級アミノ基であり、
(NH 2 -X)n (2)
(但し、式中Xは、ポリマー化合物の繰り返し単位の一級アミノ基以外の残基を示し、nは2以上の整数を表す。)
該一級アミノ基を有するセンサ検出部表面上に、一般式(9)で示されるタンパク質もしくはペプチドが整列配置、吸着された状態で、
NH 2 -R 1 -CO-NH-R 2 -CO-NH-CH(CH 2 -SCN)-CO-NH-R 3 -COOH (9)
〔式中、上記式中、R 1 は、抗体結合性タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸配列、R 2 は任意のリンカー配列のアミノ酸配列、R 3 は中性付近で強く負に荷電しかつ一般式(9)で表されるタンパク質もしくはペプチドの等電点を酸性にし得るアミノ酸配列を表す。〕
弱アルカリ溶媒を用いて、上記ポリマー化合物の一級アミノ基と一般式(10)で表されるタンパク質若しくはペプチド主鎖のカルボキシ末端をペプチド結合させることを特徴とする、表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。 - 請求項5の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリアリルアミンであることを特徴とする請求項4に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
- 請求項5の一般式(2)で表されるポリマー化合物が、ポリリジンであることを特徴とする請求項4に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用アレイ基板の作製方法。
- 酸・アルカリ・塩溶液等を用いた抗体分子の脱着再生操作を施すことにより繰り返し同質の測定を可能としたことを特徴とする、請求項4に記載の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを用いた抗原分子の測定方法。
- 請求項4の表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサを検出部に用いること、ならびに請求項8に記載の繰り返し再生操作を適用することを特徴とし、試料測定回ごとに検出部表面の自動的再生処理を行う自動送液装置、および検出により生成される測定データの自動的収集ならびにデータ処理を可能にするデータ処理装置を一体として備えた表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサの自動測定システム。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004030700A JP3937020B2 (ja) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 |
PCT/JP2005/001579 WO2005075996A1 (ja) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004030700A JP3937020B2 (ja) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005221423A JP2005221423A (ja) | 2005-08-18 |
JP3937020B2 true JP3937020B2 (ja) | 2007-06-27 |
Family
ID=34836012
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004030700A Expired - Lifetime JP3937020B2 (ja) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3937020B2 (ja) |
WO (1) | WO2005075996A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5026815B2 (ja) * | 2006-02-23 | 2012-09-19 | 富士フイルム株式会社 | バイオセンサー及び生理活性物質の固定化方法 |
US20070196233A1 (en) | 2006-02-23 | 2007-08-23 | Fujifilm Corporation | Biosensor and method for immobilizing a physiologically active substance |
JP5004166B2 (ja) * | 2006-10-10 | 2012-08-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質を固定化した担体 |
JP5008027B2 (ja) * | 2006-10-10 | 2012-08-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質を設計する方法 |
JP5004165B2 (ja) * | 2006-10-10 | 2012-08-22 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質 |
JP4400668B2 (ja) | 2007-11-01 | 2010-01-20 | 株式会社豊田中央研究所 | 微小物体が固定化された固相体の製造方法及びその利用 |
US10983118B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-20 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Biosensor microarray compositions and methods |
CN110221059A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-09-10 | 大连理工大学 | 一种调控硅纳米材料表面hcg抗体取向的方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK100592D0 (da) * | 1992-08-10 | 1992-08-10 | Mouritsen & Elsner Aps | Metode til kemisk kobling paa faste faser |
JP3047020B1 (ja) * | 1999-02-26 | 2000-05-29 | 工業技術院長 | 固定化蛋白質の製造法 |
US6413722B1 (en) * | 2000-03-22 | 2002-07-02 | Incyte Genomics, Inc. | Polymer coated surfaces for microarray applications |
-
2004
- 2004-02-06 JP JP2004030700A patent/JP3937020B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-02-03 WO PCT/JP2005/001579 patent/WO2005075996A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2005075996A1 (ja) | 2005-08-18 |
JP2005221423A (ja) | 2005-08-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Vaisocherová et al. | Functionalizable low-fouling coatings for label-free biosensing in complex biological media: advances and applications | |
Heyse et al. | Emerging techniques for investigating molecular interactions at lipid membranes | |
CA2024548C (en) | Analyte specific chemical sensor | |
Gedig | Surface chemistry in SPR technology | |
JP5588430B2 (ja) | 標識独立検出のための表面及びその方法 | |
EP1696235B1 (en) | Biosensor | |
WO2005075996A1 (ja) | 表面プラズモン共鳴抗体アレイセンサ作製用基板及びその作製方法 | |
Ha et al. | Oriented immobilization of antibodies with GST-fused multiple Fc-specific B-domains on a gold surface | |
US20060014232A1 (en) | Immobilization method | |
Günay et al. | Identification of soft matter binding peptide ligands using phage display | |
CN103348244B (zh) | 与苯基硼酸基特异性结合的寡肽序列 | |
Löfås et al. | The art of immobilization for SPR sensors | |
Pollheimer et al. | Reversible biofunctionalization of surfaces with a switchable mutant of avidin | |
JP3740529B2 (ja) | 配向制御したタンパク質の固定化方法およびそれを利用したタンパク質の整列固定化方法 | |
JP4006523B2 (ja) | タンパク質アレイ及びその作製方法 | |
US20100093106A1 (en) | Amine-Reactive Biosensor | |
Saxena et al. | Functionalizing gold nanoparticles with bluetongue virus multiple peptide antigens utilizing gold–thiol interaction: a novel approach to develop pen side test | |
US20060257933A1 (en) | Biosensor | |
Islam et al. | Use of a branched linker for enhanced biosensing properties in IgG detection from mixed Chinese hamster ovary cell cultures | |
Blond et al. | Kinetic characterization of early intermediates in the folding of E. coli tryptophan‐synthase β2 subunit | |
KR100877187B1 (ko) | 질병마커 인지 에피토프와 연결된 단백질 나노입자를포함하는 진단용 단백질 칩과 그의 초고감도 검출 방법 | |
JP2006266832A (ja) | 固定化方法、バイオセンサー及び試験方法 | |
Grunwald | A brief introduction to the streptavidin-biotin system and its usage in modern surface based assays | |
WO2004092712A1 (ja) | 分子の検出方法、分子の計数方法、分子局在化の検出方法、及びこれらに用いる分子検出装置 | |
EP1314036A2 (en) | Biosensor assay device and method |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051004 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060926 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061219 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070126 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070227 |
|
R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |