JPWO2006022277A1 - 表面プラズモン共鳴分析における解離定数の算出方法 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、表面プラズモン共鳴における金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数の算出を、ノイズレベル（参照チップのノイズ幅）が低く、かつベースライン変動（参照チップの信号変化）が小さく、信頼性の高い測定結果を得ることができる分析方法において実現することである。本発明によれば、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法が提供される。

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴分析において、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法に関する。

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）について説明する。

一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。上記したような分析を行なうための表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、特開２００１−３３０５６０号公報に記載の装置などが挙げられる。

該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する際、一般的には、被験物質と相互作用する生理活性物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する生理活性物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことによって、結合反応の測定を行なう。また、測定の際には、前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換することによって、生理活性物質と被験物質との結合反応を開始させ、時間の経過による信号変化を測定する方法が一般的である。

一方、上記したようなＳＰＲを用いたバイオセンサーにおいては、測定物のセンサー（金属膜＋リガンド）へのアナライト結合を屈折率変化（およびそれに伴う暗線角度変動）として検出する。横軸を時間、縦軸に結合信号をプロットすると、いわゆる「センサーグラム」と呼ばれる、信号（結合量等）の経時変化を得ることができる。そして、センサーグラムに下記式（ｉ）のような速度方程式をフィッティングし、それから、吸着速度係数（ka）、離脱速度係数（kd）等の速度係数を求めることが重要である。
ｄＲ／ｄｔ＝ka×Ｃ×[Ｒｍａｘ−Ｒ（ｔ）]−kd×Ｒ（ｔ） （ｉ）
Ｒ(ｔ)＝（ka×Ｃ×Ｒｍａｘ）/(ka×Ｃ＋kd) ×(1−exp(-kd×Ｃ+kd) ×t))（ｉｉ）（上記式（ｉ）を解いたもの）
kd：吸着速度係数、kd：離脱速度係数、Ｃ:アナライト濃度(既知)、Ｒｍａｘ:理論的最大結合量、ｔ:時間

上記したような流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換することによって、生理活性物質と被験物質との結合反応を開始させ、時間の経過による信号変化を測定する方法においては、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動が問題となり、信頼性の高い結合検出データを取得することは困難であった。上記問題を解消するための手法として、特願２００３−４０４０４０号明細書には、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法であって、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することを特徴とする測定方法が記載されている。このように流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することにより、ノイズレベル（参照チップのノイズ幅）が低く、かつベースライン変動（参照チップの信号変化）が小さく、信頼性の高い測定結果を得ることができる。しかしながら、表面プラズモン共鳴測定装置中の流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、得られた信号変化の測定結果からｋa（吸着速度係数）及びｋd（離脱速度係数）などの速度定数を求めることについてはこれまでのところ報告がない。即ち、本発明は、表面プラズモン共鳴における金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数の算出を、ノイズレベル（参照チップのノイズ幅）が低く、かつベースライン変動（参照チップの信号変化）が小さく、信頼性の高い測定結果を得ることができる分析方法において実現することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、表面プラズモン共鳴測定装置中の流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法においても、得られた信号変化の測定結果からkd（吸着速度係数）及びkd（離脱速度係数）などの速度定数を正確に求めることができることを初めて実証し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法が提供される。

好ましくは、表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から吸着速度係数（kd）及び離脱速度係数（kd）を求め、求めた吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）から、ＫＤ＝kd／kaで表される式により解離定数（ＫＤ）を算出する。

好ましくは、表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（１）、（２）及び（３）を用いることによって吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求める。
ｄθ／ｄｔ＝kd×ｃ_s×（１−θ）−kd×θ （１）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃ_sは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂²ｃ／∂ｘ² （２）
（式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃ_sとなる。）
θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ （３）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。）

好ましくは、前記液体の交換にかかる時間を理想条件での吸着現象とみなして補正することにより解離定数を算出する。
好ましくは、非線形回帰解析を用いて解離定数を算出する。

好ましくは、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いる。

好ましくは、前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する。

好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流す。

好ましくは、前記セルの体積(Vs ml)に対する1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)が1以上100以下である。さらに好ましくは、Ve/Vsが1以上50以下である。
好ましくは、前記流路系内の液体の交換にかかる時間が0.01秒以上100秒以下である。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法に関するものである。より具体的には、本発明による解離定数の算出方法は、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出することを特徴とする。

本発明の別の観点によれば、金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法であって、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出することを含む、上記した表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法が提供される。

被解析分子は金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子へ時間とともに吸着する。この現象は下記式（１）で記述できる。
ｄθ／ｄｔ＝ka×ｃ_s×（１−θ）−kd×θ （１）
式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃ_sは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。
ここで、金属表面を定常的に新鮮な液に置換しつづけられる理想的な条件ではｃ_sは一定となり、簡素な微分方程式を解くことで測定結果からka、kdを求めることが可能である。

しかしながら、金属表面の流れが極めて遅く、ｃ_sを一定に保つには高速に被解析分子溶液を高速に流す必要がある。一方、表面プラズモンは金属表面の流れの乱れが信号に揺らぎを与えること、および高速に流すためには被解析分子を大量に使用することとなる。このため、ｃ_sを一定にすることは実際には不可能である。

ｃ_sが一定で無い場合、被解析分子の吸着、離脱による濃度変化は沖合いからの被解析分子の拡散によって変化する関数となる。このときの拡散は下記式（２）で表される。
∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂²ｃ／∂ｘ² （２）
（式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃ_sとなる。）

一方、表面プラズモン信号R(被解析分子が吸着していないときの表面プラズモン信号との差)は被解析分子表面吸着量に比例することが知られており、下記式（３）で表される。
θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ （３）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。）

上記式（１）（２）および（３）を用いることで実験により測定した信号から吸着速度係数ka、離脱速度kdおよびその比である平衡解離定数ＫＤ（＝kd／ka）を求めることが可能となる。

以下、具体的な解析方法を示す。
被解析分子を含まない参照溶液から被解析分子を含む試料溶液への切り替えが、被解析分子の吸着速度より充分速く、かつ沖合い濃度Ｃ₀が均一な流れが定常的に生じている場合（以下、理想条件と呼ぶ）は、式（１）で計算することが可能となる。具体的には表面プラズモンの信号変化は式（４）で表される。
ｄＲ／ｄｔ＝ka×Ｃ₀×（Ｒｍａｘ−Ｒ）kd×Ｒ （４）

実験で得られた時間ｔにおける信号Rの変化を式（４）を用いて非線形回帰分析することで、吸着速度係数ka、離脱速度係数kdを求めることができる。ここで、Ｒｍａｘは被解析分子の金属表面への結合状態などを反映するためka及びkdを同時に求めることが好ましく、未知数が３つの非線形回帰分析を行うこととなる。しかしながら、この条件を充足するには溶液の線速度を高める必要があり、表面プラズモン信号が不安定となりノイズが上昇する問題がある。

被解析分子を含まない参照溶液から濃度Ｃ₀の被解析分子を含む試料溶液への切り替えが被解析分子の吸着速度より充分速く、かつ液交換後速やかに液が停止する場合(以下、Stopped Flow (SF)条件と呼ぶ)は、式（１）（２）（３）で計算することが可能となる。具体的には式（１）（２）（３）は近似的に差分方程式を下記差分方程式に置き換えることが可能である。

Ｒ［ｔ］＝（ka×Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］×（Ｒｍａｘ−Ｒ［ｔ−Δｔ］）−kd×Ｒ［ｔ−Δｔ］）×Δｔ＋Ｒ［ｔ−Δｔ］ （５）

Ｃ［０，ｔ］＝Ｄ×（Ｃ［Δｘ，（ｔ−Δｔ）］−Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］）＋Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］−（ka×Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］×（Ｒｍａｘ−Ｒ［ｔ−Δｔ］）−（kd×Ｒ［ｔ−Δｔ］）／Ｒｍａｘ×Ｓｍ×Δｔ）／Δｘ （６）

Ｃ［ｎ×Δｘ，ｔ］＝Ｄ×（Ｃ［（ｎ＋１）×Δｘ，（ｔ−Δｔ）］＋Ｃ［（ｎ−１）×Δｘ，（ｔ−Δｔ）］−２×Ｃ［Δｘ，（ｔ−Δｔ）］）＋Ｃ［Δｘ，（ｔ−Δｔ）］ （７）

ここで、Ｒ［ｔ］は時間ｔでの表面プラズモン信号を表し、Δｔは微小時間を示す。Ｃ［ｘ，ｔ］は時間ｔでの金属表面から距離ｘ離れた地点の被解析分子の濃度を表し、Δｘは微小距離を示す。また、Ｓｍは被解析分子の飽和吸着量を表す。

Δｘ、Δｔが充分小さいとき、式（５）（６）（７）は式（１）（２）（３）を近似することとなる。このとき、Δｔ時間での被解析分子の拡散が距離Δｘより充分短い必要がある。具体的には下記式（８）で表される仮拡散係数Ｄ_Mが０．０１以上０．５以下である必要があり、０．０５以上０．４５以下であることが好ましい。

Δｘ²／Ｄ×Δｔ＝Ｄ_M （８）

さらに金属表面に接する地点の被解析分子濃度の間Δｔで変化する量が充分小さい必要があり、下記式（９）で表される。
（Ｃ［０，ｔ＋Δｔ］−Ｃ［０，ｔ］） ＜＜ Ｃ［０，ｔ］ （９）

式（６）（８）（９）から、Δｘは下記式（１０）を充足する必要がある。
Δｘ ＜＜ Ｄ／（Ｄ_M×Ｓｍ×ka） （１０）

ここで、影響度定数Ａｘを用いて式（１０）を下記式（１１）のように記述したとき、Ａｘは０．１以下０．０００１以上である必要があり、好ましくは０．０３以下０．００１以上である。
Δｘ＝Ａｘ×Ｄ／（Ｄ_M×Ｓｍ×ka） （１１）

また、通常の測定結果を解析する際には、kaが未知の状態で計算をすることとなるため、ka値として予想される最大値より大きい値を代入してΔｘを決定する必要がある。

上記式（４）〜（１１）に対して下記式（１２）の境界条件を用いることで表面プラズモン信号Ｒ［ｔ］を記述できる。
Ｃ［ｎ×Δｘ，０］＝Ｃ₀ （１２）

ＳＦ条件では被解析分子を含まない参照溶液から濃度Ｃ₀の被解析分子を含む試料溶液への切り替えが被解析分子の吸着速度より充分速いことを仮定しているが、実際の測定系（Ｒｅａｌ ＳＦ条件）では実現が困難である。このため、図３に示すように液切替時にＳＦ条件より高速の変化が発生する。これは液切替時には高速で液が流れているため、ノイズで計測は充分にはできないが理想条件での吸着現象が見られていることとなる。

実際の測定系では、液切り替え時間内（０≦ｔ≦ｔ_i）を式（４）をもとにした差分方程式を下記式（１３）として計算し、液交換後（ｔ_i≦ｔ）は式（１４）（１５）（１６）を用いることで解析が可能となる。ここで、Δｘ，Δｔについては式（８）〜（１１）を充足する値を選択する。

０≦ｔ≦ｔ_iのとき
Ｒ［ｔ］＝（ka×Ｃ₀×（Ｒｍａｘ−Ｒ［ｔ−Δｔ］）−kd×Ｒ［ｔ−Δｔ］）×Δｔ＋Ｒ［ｔ−Δｔ］ （１３）

t_i≦tのとき
Ｒ［ｔ］＝（ka×Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］×（Ｒｍａｘ−Ｒ［ｔ−Δｔ］）−kd×Ｒ［ｔ−Δｔ］）×Δｔ＋Ｒ［ｔ−Δｔ］ （１４）

Ｃ［０，ｔ］＝Ｄ×（Ｃ［Δｘ，（ｔ−Δｔ）］−Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］）＋Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］−（ka×Ｃ［０，（ｔ−Δｔ）］×（Ｒｍａｘ−Ｒ［ｔ−Δｔ］）−（kd×Ｒ［ｔ−Δｔ］）／Ｒｍａｘ×Ｓｍ×Δｔ）／Δｘ （１５）
Ｃ［ｎ×Δｘ，ｔ］＝Ｄ×（Ｃ［（ｎ＋１）×Δｘ，（ｔ−Δｔ）］＋Ｃ［（ｎ−１）×Δｘ，（ｔ−Δｔ）］−２×Ｃ［Δｘ，（ｔ−Δｔ）］）＋Ｃ［Δｘ，（ｔ−Δｔ）］ （１６）

ここで、境界条件は下記式（１７）を用いる。
Ｃ［ｎ×Δｘ，ｔ_i］＝Ｃ₀ （１７）

Ｒｅａｌ ＳＦ条件を用いて実際の測定結果を非線形回帰解析するにはka，kdおよびＲｍａｘに加えて拡散係数Ｄも未知数として取り扱うことが好ましい。拡散係数ＤはＥｉｎｓｔｅｉｎの式を用いることで分子量より算出できるとされているが、実際には分子形状や溶媒の影響が大きく実測することが好ましい。また、０≦ｔ≦ｔ_iの領域では測定系のノイズが大きく計算に使うことで誤差が大きくなる。そこで、ｔ_i≦ｔの領域に関してka，kd，ＲｍａｘおよびＤを未知数として非線形回帰を行い、求めたka，kd，ＲｍａｘおよびＤから得られる０≦ｔ全領域の曲線と実測値を比較すると図４のように良好な一致を示すこととなる。

実際の計算は差分方程式（１３）〜（１７）を用いていれば、いかようなアルゴリズムであってもよい。また、非線形回帰法についても既知のいかなる手法を使ってもよい。

本発明においては、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することにより、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することが可能になる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。

本発明においては好ましくは、流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。

本発明においては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。

また、本発明においては、測定に用いるセルの体積(Vs ml)（上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)は、好ましくは1以上100以下である。Ve/Vsは、より好ましくは1以上50以下であり、特に好ましくは1以上20以下である。測定に用いるセルの体積(Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは１×１０^-6〜１．０ml、特に好ましくは１×１０^-5〜１×１０^-1ml程度である。また、液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。

表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。

また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。

本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。

例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。

なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。

その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。

一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。

その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。

他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。

また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。

また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。

さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。

そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。

あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。

測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。

他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。

また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。

さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。

また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。

他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。

また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。

また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。

そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。

さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。

上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。

本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。

金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

金属膜は、最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。

好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹及びＲ²は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ³ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。

最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。

上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。

本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。

免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。

微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。

生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。

上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。

即ち、本発明によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している測定チップ（セル）を少なくとも使用し、測定すべき被験物質を含有する試料液体と該セルとを接触させ、流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する工程を含む、生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。

図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド400,400に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック401が用いられている。そしてこのスライドブロック401には、上記ガイドロッド400,400と平行に配された精密ねじ402が螺合され、この精密ねじ402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ403によって正逆回転されるようになっている。

なおこのパルスモータ403の駆動は、モータコントローラ404によって制御される。すなわちモータコントローラ404には、スライドブロック401内に組み込まれてガイドロッド400,400の長手方向における該スライドブロック401の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ40が入力され、モータコントローラ404はこの信号Ｓ40に基づいてパルスモータ403の駆動を制御する。

またガイドロッド400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック401をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源31および集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。集光レンズ32は光ビーム30を集光する。また、光検出器40が設置されている。

ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体410が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック401にセットされるようになっている。

図２は、このユニット連結体410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体410は、測定ユニット10が８個、連結部材411により連結されてなるものである。

この測定ユニット10は、誘電体ブロック11と試料保持枠13とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜12の上にセンシング物質14が固定されている。

実施例：液を停止した状態での測定
（１）デキストラン測定チップの作製
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）中11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。

次に、11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオールで被覆した表面を10重量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。

次に、25重量％のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。

（２）ProteinA固定チップの作成
上記（１）で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド)と50mM NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのAcetate5.0バッファー(BIAcore社製)で3回洗浄した。Acetate5.0バッファーを100μl入れた状態でこのチップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、チップ内をProteinA溶液(ProteinA(ナカライテスク社製)を50μg/mlになるようAcetate5.0(BIAcore社製)に溶解したもの)に入れ替え30分間放置し、ProteinAを固定した。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのAcetate5.0バッファーで10回洗浄した。ProteinAの固定による共鳴シグナル変化量は、500RUであった。

（３）参照チップの作成：
上記（１）で作成したデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDCと50mM NHSの混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのAcetate5.0バッファーで3回洗浄した。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのAcetate5.0バッファーで10回洗浄した。

（４）流路系の作成
本発明のProteinA固定チップに対し、誘電体ブロックをシリコンゴムでふたをすることで、内容積１５μlのセルを作成した。また、ふたのシリコンゴムに２箇所、1mm径の穴をあけ、内径0.5mm、外径1mmのテフロンチューブを通し、流路を作成した。同様に参照チップにもふた、流路を作成し、２つのチップを直列につなぎ、流路系を作成した。この流路系の２つのチップをそれぞれ、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置した。

（５）mouse IgG結合性能評価
流路系内をHBS-EPバッファー(BIAcore社製)で満たした。HBS-EPバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/l、ＥＤＴＡ 0.003mol/l、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０ 0.005重量％である。液交換前を基準とした信号変化を0.5秒間隔で測定した。流路系内を20μl/secの速度でmouse IgG溶液(mouse IgG(コスモバイオより購入)を10μg/mlになるようHBS-EPバッファーに溶解したもの)に置き換えた。置き換えに要した時間は５秒であった。

液交換開始５秒後以降は、液の流れを停止させた。
液交換開始５秒後から２分後までのデータを使用し、初期値としてka = 1×10⁵(M^-1s^-1), kd = 1×10^-3(s^-1), Rmax = 500(RU), D = 1×10^-7(cm² s^-1), C = 6.7×10^-8(M)を代入し、Excel2000(Microsoft社製)のソルバー機能を使用してka, kd, Rmax, Dの値を変化させた時、最も実測グラフとの最小自乗法による誤差が小さくなる曲線を非線形回帰法により求めた。その結果を図４に示す。実測グラフと計算で求めた曲線がほぼ重なっていることが分かる。

比較例：液を流している状態での測定
以下の実験は、BIAcore3000(BIAcore社製)を使用して行った。センサーチップCM-5を通常の方法でセットした後、HBS-EPバッファーでプライムを行った。以下フローセル２にフロー速度10μl/minでバッファー、各種溶液を流して実験を行った。200mM EDCと50mM NHSの混合溶液を7分間流した後、HBS-EPバッファーを流して洗浄した。次にProteinA溶液(ProteinA(ナカライテスク社製)を10μg/mlになるようAcetate5.0(BIAcore社製)に溶解したもの)を1分間流し、ProteinAを固定した。ProteinA溶液をHBS-EPバッファーで洗浄した後、1M エタノールアミン溶液を7分間流した。エタノールアミン溶液をHBS-EPバッファーで洗浄した。ProteinAの固定による共鳴シグナル変化量は、300RUであった。

以下フローセル１にフロー速度10μl/minでバッファー、各種溶液を流して実験を行った。200mM EDCと50mM NHSの混合溶液を7分間流した後、HBS-EPバッファーを流して洗浄した。1M エタノールアミン溶液を7分間流した。エタノールアミン溶液をHBS-EPバッファーで洗浄した。

以下フローセル１,２にフロー速度20μl/minでバッファー、各種溶液を流して実験を行った。mouse IgG溶液(mouse IgG(コスモバイオより購入)を10μg/mlになるようHBS-EPバッファーに溶解したもの)をkinjectコマンドで注入し、結合、解離それぞれ5分間の信号を測定した。
測定した信号について、解析ソフトBIAevaluation3.1(BIAcore社製)を使用し、1：1(Langmuir) bindingモードでフィッティングを行い、ka, kd, Rmaxを求めた。

実施例及び比較例で求めた各パラメータの値を表１に示す。実施例で得られたka, kdの値は、比較例で得られた値と近いことが分かる。また、ベースライン変動等が良好な状態での解離定数を理想状態と同様に求めることができた。

本発明によれば、ノイズレベル（参照チップのノイズ幅）が低く、かつベースライン変動（参照チップの信号変化）が小さく、信頼性の高い測定結果を得ることが可能な、表面プラズモン共鳴測定装置中の流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法においても、表面プラズモン共鳴における金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数の算出を行うことが可能になった。

図１は、実施例で用いた表面プラズモン共鳴測定装置を示す。図中、１０は測定ユニット、３０は光ビーム、３１はレーザ光源、３２ば集光レンズ、４０は光検出器、Ｓ４０は出力信号、４００はガイドロッド、４０１はスライドブロック、４０２は精密ねじ、４０３はパルスモータ、４０４はモータコントローラ、４１０はユニット連結体を示す。 図２は、実施例で用いた誘電体ブロックを示す。図中、１０は測定ユニット、１１は誘電体ブロック、１２は金属膜、１３は試料保持枠、１４はセンシング物質、４１０はユニット連結体、４１１は連結部材を示す。 図３は、ＳＰＲ測定について理想条件、ストップ・フロー条件及び実測値の比較を示す。 図４は、本発明の方法により求めたka，kd，ＲｍａｘおよびＤから得られる全領域の曲線と、ＳＰＲの実測値とを比較した結果を示す。

Claims (11)

1. 金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の信号変化を測定する方法において、信号変化の測定結果から、金属表面に固定化された被解析分子と相互作用する分子との解離定数を算出する方法。
2. 表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求め、求めた吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）から、ＫＤ＝kd／kaで表される式により解離定数（ＫＤ）を算出する、請求項１に記載の方法。
3. 表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（１）、（２）及び（３）を用いることによって吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求める、請求項１又は２に記載の方法。
   ｄθ／ｄｔ＝ka×ｃ_s×（１−θ）−kd×θ （１）
   （式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃ_sは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
   ∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂²ｃ／∂ｘ² （２）
   （式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃ_sとなる。）
   θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ （３）
   （式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。）
4. 前記液体の交換にかかる時間を理想条件での吸着現象とみなして補正することにより解離定数を算出する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
5. 非線形回帰解析を用いて解離定数を算出する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
6. 誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いる、請求項１から５の何れかに記載の方法。
7. 前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する、請求項１から６の何れかに記載の方法。
8. 被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流す、請求項１から７の何れかに記載の方法。
9. 前記セルの体積(Vs ml)に対する1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)が1以上100以下である、請求項８に記載の方法。
10. Ve/Vsが1以上50以下である、請求項９に記載の方法。
11. 前記流路系内の液体の交換にかかる時間が0.01秒以上100秒以下である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
    
    
    

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