JP2003194820A - バイオセンサー用表面 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 金属表面に生理活性物質を、ほとんどの分子
が、物理吸着や疎水平面との相互作用による変性を軽減
させ、できるだけ活性を保ったまま、脱落することなく
固定化するための手段であって、処理過程が簡便で信頼
性の高い、金属表面、固定化方法、その製造方法、およ
びそれらを用いる分析方法を提供すること。 【解決手段】 下記式（１）で表される化合物で処理し
た金属表面又は金属膜から成る、生理活性物質を共有結
合で固定化するためのバイオセンサー用表面。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
テイン以外である。］

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生理活性物質と結
合することができるリンカー化合物で処理した金属表面
又は金属膜からなるバイオセンサー用表面、該バイオセ
ンサー用表面に生理活性物質を固定化したバイオセンサ
ー用測定チップ、それらの製造方法、並びに、それらを
用いた測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、臨床検査等で免疫反応など分子間
相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来
法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物
質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感
度に検出することのできるいくつかの技術が使用されて
いる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技
術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、
金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用
した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜
に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピ
ークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定
して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着
を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の
金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振
動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技
術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機
能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活
性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微
粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。

【０００３】以上のすべての技術においては、いずれの
場合、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以
下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）を例として、説明する。

【０００４】一般に使用される測定チップは、透明基板
（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からな
り、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定
化する。該生理活性物質とアナライト間の特異的な結合
反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を
分析する。

【０００５】生理活性物質を固定化できる官能基を有す
る薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数
が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる
官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化
した測定チップが報告されている（特許第2815120号を
参照）。

【０００６】しかしながら、リガンド（或いはアナライ
ト）と有機膜表面の物理的吸着による非特異結合はチッ
プの感度に悪い影響を及ぼす。即ち、生理活性物質が金
属膜に固定化される際、目的の共有結合だけで固定化さ
れるだけでなく、部分的に物理吸着でも生理活性物質は
固定化される。蛋白質が金表面へ物理吸着で固定化され
ると、蛋白質は変性しやすい。また、共有結合での固定
化に比較し、測定中に脱落するという問題がある。これ
らの問題は、結果的に、測定の感度低下と再現性の劣化
をもたらすため、不要な物理吸着を無くすための施策が
望まれていた。

【０００７】この課題を解決するためにいくつかの方法
が採用されている。例えば、金属表面にリンカーを介
し、親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸
着を抑制する方法も使用されてきた（特許第2815120
号、米国特許第5436161号、特開平8-193948号公報を参
照）。しかしながら、この方法は、ハイドロゲルの固定
化が容易ではないため、様々なユーザーが自分たちの目
的に合わせ表面処理を行うには適さなかった。さらに、
ハイドロゲルを用いた場合、細胞などの高分子量の分析
物（アナライト）を測定する場合、アナライトがマトリ
ックスの隙間に侵入できない問題点があった。

【０００８】一方、生理活性物質の物理吸着による非特
異結合を軽減する方法として、プラスチックプレートを
用いる免疫化学分析では、ウシ血清アルブミンなどによ
るいわゆるブロッキングが用いられてきた。また、金属
表面を用いる分析法では、末端をチオール化したＤＮＡ
を金属膜に固定化し、ＳＰＲを用いるＤＮＡセンサーを
作製する場合、６−ヒドロキシ−１−ヘプタンチオール
を添加することによって、非特異的吸着が起こらず、高
感度で目的ＤＮＡを検出できることが報告されている
（米国特許第5942397号、及びJ.Am.Chem.Soc., 1997,11
9,8916-8920を参照）。また、チオール化したビオチン
と１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールとを同時
混合し、ストレプトビジンとの反応を非特異結合を抑制
して検出することが報告されている（J.Am.Chem.Soc.,
1999, 121, 6469-6478を参照）。

【０００９】しかしながら、これらの方法は次の問題点
もある。すなわち、これらは、分析対象物（アナライ
ト）の非特異的吸着を抑制を目的にしており、固定化さ
れる生理活性物質の一部が物理吸着することによる生理
活性物質の不必要な変性や脱落に関する問題点に対する
解決法を与えるものではない。また、金属表面に直接固
定化できる生理活性物質の誘導体の合成は容易ではな
い。また、これらの２成分を用いるＳＡＭは、その作製
において、均一性や再現性に問題があるため、単一成分
で、生理活性物質の変性や物理吸着が少ない金属表面が
望まれている。

【００１０】また、１成分のＳＡＭとして、短鎖の化合
物を使用した例が示されている（Biosensor & Bioelect
ronics,1998,13, 1213-1225）。その例には、システイ
ンが含まれ、そのカルボキシル基を使用して免疫グロブ
リンを共有結合することで、ＳＡＭのない金属表面に直
接物理吸着で固定化することより、安定な固定化を達成
した。しかしながら、この報告では、システインに存在
する親水性の官能基がタンパク質変性を抑制する効果に
ついて言及されていない。これらの問題点は、表面プラ
ズモン共鳴（ＳＰＲ）技術だけでなく、ＱＣＭ技術及び
金超微粒子技術にも同様に存在している。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、上記の従来技術の問題点を解消することで
ある。即ち、本発明は、金属表面に生理活性物質を、ほ
とんどの分子が、物理吸着や疎水平面との相互作用によ
る変性を軽減させ、できるだけ活性を保ったまま、脱落
することなく固定化するための手段であって、処理過程
が簡便で信頼性の高い、金属表面、固定化方法、その製
造方法、およびそれらを用いる分析方法を提供すること
を解決すべき課題とした。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、生理活性物質を金属
表面に固定化する際に、生理活性物質を共有結合を介し
て結合するための官能基とともに、同一分子内に生理活
性物質の物理吸着や変性を抑制する官能基を有する化合
物で金属表面を処理し、その後に生理活性物質を反応さ
せることにより、生理活性物質を安定的に共有結合を介
して金属表面に固定化できることを見出し、本発明を完
成するに至った。また、この表面を使用して作製したバ
イオセンサーチップも、従来の問題点を軽減することが
見出された。特に、システインまたはシスチンを含むペ
プチドまたはその誘導体で金属表面を処理した表面を用
いると、システイン単独で処理した表面よりも、簡単に
再現よく、生理活性物質を安定的に共有結合を介して金
属表面に固定化できることが見出された。

【００１３】即ち、本発明によれば、少なくとも下記式
（１）で表される化合物で処理した金属表面又は金属膜
から成る、生理活性物質を共有結合で固定化するための
バイオセンサー用表面が提供される。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
テイン以外である。］

【００１４】本発明のバイオセンサー用表面は、好まし
くは非電気化学的検出に使用され、特に好ましくは、表
面プラズモン共鳴分析に使用される。好ましくは、式
（１）において、Ｘが、チオール（−ＳＨ）、イソニト
リル、ニトロ（−ＮＯ₂）、セレノール（−ＳｅＨ）、
３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、
チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸（−ＣＯＳ
Ｈ）、ジチオ酸（−ＣＳＳＨ）、非対称又は対称ジスル
フィド［−ＳＳＡ¹（−Ｙ¹） _m1（−Ｚ¹）_n1］、スルフ
ィド［−ＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−Ｚ¹）_n1］、ジセレニド
［−ＳｅＳｅＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−Ｚ¹）_n1］、またはセ
レニド［−ＳｅＡ¹（−Ｙ ¹）_m1（−Ｚ¹）_n1］を示し、
ここでＡ¹は、置換又は未置換のアミノ酸残基、脂肪族
基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組み合わせか
ら選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙ¹は生理活性物
質と結合することができる官能基、Ｚ¹はセンサーの性
能を改善できる官能基を示し、ｍ１及びｎ１は１以上の
整数を示す。

【００１５】好ましくは、式（１）において、Ｙは、−
ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ₂、
−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基である。好まし
くは、式（１）において、Ｚは、Ｙと結合させる生理活
性物質またはその生理活性物質と相互作用するアナライ
トの変性または物理吸着を抑制できる官能基である。好
ましくは、式（１）において、Ｚは、−ＯＨ、−ＣＯＯ
Ｈ、−ＮＨ₂、−ＳＯ₃Ｈ、アルキルエステルまたはアリ
ールエステル、糖、核酸、蛋白質、または水溶性ポリマ
ーである。

【００１６】好ましくは、式（１）で表される化合物
は、システインのアミノ基またはカルボキシル基のどち
らか片方または両方に、アミノ酸が縮合した長さがジペ
プチド以上のシステインを含むペプチドまたはそれらの
誘導体、または、それらのシステインを含むペプチド
が、Ｓ−Ｓ結合で２量体のシスチン誘導体を形成したペ
プチドまたはそれらの誘導体であるさらに好ましくは、
式（１）で表される化合物は、還元型、または酸化型グ
ルタチオン、またはそれらの誘導体である

【００１７】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のバイオセンサー用表面に生理活性物質を共有結合さ
せて得られる、バイオセンサー用測定チップが提供され
る。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明
のバイオセンサー用表面又はバイオセンサー用測定チッ
プと被験物質とを接触させる工程を含む、該バイオセン
サー用表面に固定化されている生理活性物質と相互作用
する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
好ましくは、バイオセンサー用表面に固定化されている
生理活性物質と被験物質との相互作用は非電気化学的方
法により検出及び／又は測定され、特に好ましくは、バ
イオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と
被験物質との相互作用は表面プラズモン共鳴分析により
検出及び／又は測定される。

【００１８】本発明のさらに別の側面によれば、金属表
面又は金属膜を、少なくとも１種類の下記式（１）で表
される化合物を含む混合物で処理する工程を含む、少な
くとも１種類の下記式（１）で表される化合物を含む混
合物で処理した金属表面又は金属膜から成る、生理活性
物質を共有結合で固定化するためのバイオセンサー用表
面の製造方法が提供される。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
テイン以外である。］

【００１９】本発明のさらに別の側面によれば、金属表
面又は金属膜を、少なくとも１種類の下記式（１）で表
される化合物を含む混合物で処理する工程；及び該式
（１）で表される化合物に直接あるいは架橋性化合物ま
たはヒドロゲルを介して生理活性物質を共有結合により
結合させる工程を含む、金属表面又は金属膜に生理活性
物質を固定化する方法が提供される。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
テイン以外である。］

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明のバイオセンサー用表面は、少なく
とも１種類の下記式（１）で表される化合物を含む混合
物で処理した金属表面又は金属膜から成ることを特徴と
する。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
テイン以外である。］

【００２１】本発明のバイオセンサー用表面は、金属表
面又は金属膜を本明細書に定義する少なくとも１種類の
下記式（１）で表される化合物を含む混合物で処理する
ことにより製造される。金属膜は好ましくは基板上に配
置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、
金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場
合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の
層を介して配置されている場合をも含む意味である。

【００２２】金属膜が基板上に配置されている場合、本
発明のバイオセンサー用測定チップは、基板と、基板上
に形成された金属膜と、金属膜上に形成されたリンカー
層（一般式Ｉで示される化合物から成る）とを有する。

【００２３】本発明で使用することができる基板として
は例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考え
た場合、固定化法に使用されるものであればどのような
ものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフ
タレート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して
透明な材料からなるものが使用できる。このような基板
は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工
性の優れた材料が望ましい。基板の厚さは特には限定さ
れないが、通常0.1 〜20mm程度である。

【００２４】本発明のバイオセンサー用測定チップにお
ける金属膜としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイ
オセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ
得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜
に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、
銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独又
は組み合わせて使用することができる。また、上記基板
への付着性を考慮して、基板と金、銀等からなる層との
間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。

【００２５】金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１０
０ 〜２０００オングストロームであるのが好ましく、
特に２００〜６００オングストロームであるのが好まし
い。３０００オングストロームを超えると、媒質の表面
プラズモン現象を十分検出することができない。また、
クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚
さは、５〜５０オングストロームであるのが好ましい。
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパ
ッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき
法、無電解めっき法等によって行うことができる。

【００２６】次に本発明で用いる式（１）で表される化
合物について説明する。式（１）において、Ｘは金属表
面と共有結合を形成しうる官能基であればその種類は特
に限定されない。好ましくは、Ｘは、チオール（−Ｓ
Ｈ）、イソニトリル、ニトロ（−ＮＯ₂）、セレノール
（−ＳｅＨ）、３価リン化合物、イソチオシアネート、
キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸
（−ＣＯＳＨ）、ジチオ酸（−ＣＳＳＨ）、非対称又は
対称ジスルフィド［−ＳＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−
Ｚ¹）_n1］、スルフィド［−ＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−Ｚ¹）
_n1］、ジセレニド［−ＳｅＳｅＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−
Ｚ¹）_n1］、またはセレニド［−ＳｅＡ¹（−Ｙ¹）
_m1（−Ｚ¹）_n1］を示し、ここでＡ¹は、置換又は未置換
のアミノ酸残基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基また
はこれらの組み合わせから選ばれる３価以上の連結基を
示し、Ｙ¹は生理活性物質と結合することができる官能
基、Ｚ¹はセンサーの性能を改善できる官能基を示し、
ｍ１及びｎ１は１以上の整数を示す。

【００２７】特に好ましくは、Ｘは、チオール（−Ｓ
Ｈ）、あるいは非対称又は対称ジスルフィド［−ＳＳＡ
¹（−Ｙ¹）_m1（−Ｚ¹）_n1］であり、最も好ましくは、
Ｘは、チオール（−ＳＨ）である

【００２８】式（１）において、Ａ及びＡ¹は、置換又
は未置換のアミノ酸、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基
またはこれらの組み合わせから選ばれる３価以上の連結
基を示す。Ａ及びＡ¹は、同一の基でも異なる基でもよ
い。Ａ及びＡ¹は炭化水素基であることが好ましい。ま
た、Ａ及びＡ¹が示す３価以上の連結基は好ましくは、
鎖長の原子数が１０以下であり、より好ましくは鎖長の
原子数が８以下である。

【００２９】アミノ酸残基のアミノ酸としては、金属と
直接結合するシステインの他、グリシン、アラニンなど
が挙げられ、それらが重合して形成されるペプチドでも
よい。脂肪族基としては、アルキレン基、アルケニレン
基又はアルキニレン基等を包含し、鎖の形態は直鎖、分
岐鎖、環状鎖又はこれらの組み合わせの何れでもよい。
脂肪族基としてはアルキレン基が特に好ましく、最も好
ましくは直鎖のアルキレン基である。脂肪族基の長さは
特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０であり、
より好ましくは炭素数１〜１０程度であり、特に好まし
くは炭素数２〜１０程度である。芳香族基としては、ア
リーレン基などが挙げられ、具体的にはフェニレン基、
ナフチレン基などが挙げられる。

【００３０】ヘテロ環としては、窒素原子、酸素原子又
は硫黄原子から選ばれる１種以上のヘテロ原子を１個以
上含む５または７員の飽和または不飽和の単環または縮
合環などが挙げられ、具体的には、ピリジン、キノリ
ン、イソキノリン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジ
ン、フタラジン、トリアジン、フラン、チオフェン、ピ
ロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、チアゾー
ル、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾ
ール、チアジアゾール、トリアゾール等が挙げられる。
ヘテロ環基とは上記したようなヘテロ環から誘導される
２価の基を言う。

【００３１】Ａ及びＡ¹で表される３価以上の連結基
は、上記したような脂肪族基、芳香族基又はヘテロ環基
の組み合わせから構成されるものでもよい。Ａ及びＡ¹
で表される連結基の価数は３価以上であればその上限は
特に限定されないが、好ましくは５価以下、より好まし
くは４価以下であり、最も好ましくは３価である。Ａ及
びＡ¹で表される連結基の価数が４価以上の場合、Ａ
は、２以上の−Ｙで表される置換基及び／または２以上
の−Ｚで表される置換基を有することができる。

【００３２】式（１）において、Ｙは生理活性物質と結
合することができる官能基を示し、その官能基の種類は
固定化する生理活性物質の種類に応じて適宜選択するこ
とができる。一般的には、Ｙは、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、
−ＮＨ₂、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ₂、−ＮＣＳ、エポキシ
基、またはビニル基などである。

【００３３】式（１）において、Ｚはセンサーの性能を
改善できる官能基を示し、例えば、生理活性物質または
その生理活性物質と相互作用するアナライトの変性また
は金属表面への物理吸着を抑制できる官能基などが挙げ
られる。このような官能基は、Ｙで示される生理活性物
質と結合することができる官能基とは異なる基として、
固定化する生理活性物質の種類に応じて適宜選択するこ
とができる。一般的には、Ｙは、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、
−ＮＨ₂、−ＳＯ₃Ｈ、アルキルエステルまたはアリール
エステル、糖、核酸、蛋白質、または水溶性ポリマー
（例えば、ポリオキシエチレンなどの親水性基）であ
る。

【００３４】式（１）において、ｍ、ｎ、ｍ１、ｎ１は
それぞれ独立に、１以上の整数を示し、好ましくは１か
ら１０を示し、より好ましくは１から５を示し、さらに
好ましくは１から２を示し、最も好ましくは１である。

【００３５】式（１）で表される化合物の官能基Ｙ、Ｚ
の分子内の数は、生理活性物質の種類、実験条件などに
応じて適宜選択することができる。一般的には、式
（１）のＹで表される官能基：式（１）のＺで表される
官能基の分子内におけるモル比は１：１０から１０：１
の範囲内であり、好ましくは１：５から５：１の範囲内
であり、特に好ましくは１：１である。式（１）のＹで
表される官能基の比率がこれより高いと、生理活性物質
の物理吸着を抑制するというＺで表される官能基の作用
効果が低くなるため好ましくなく、また式（１）のＹで
表される化合物の比率がこれより低いと、生理活性物質
の固定化の効率が低下し、好ましくない。式（１）のＹ
で表される官能基と式（１）のＺで表される官能基の比
率は、生理活性物質の固定化の効率と、生理活性物質の
物理吸着を抑制する作用効果とのバランスを考慮して決
定することが望ましい。

【００３６】本発明の特に好ましい態様によれば、式
（１）で表される化合物は、 システインのアミノ基ま
たはカルボキシル基のどちらか片方または両方に、アミ
ノ酸が縮合した長さがジペプチド以上のシステインを含
むペプチドまたはそれらの誘導体、または、それらのシ
ステインを含むペプチドが、Ｓ−Ｓ結合で２量体のシス
チン誘導体を形成したペプチドまたはそれらの誘導体で
あるさらに好ましくは、式（１）で表される化合物は、
還元型、または酸化型グルタチオン、またはそれらの誘
導体である

【００３７】本発明では、生理活性物質を共有結合する
ことができる官能基（即ち、上記の式（１）のＹで表さ
れる官能基）とセンサーの性能を改善できる官能基（即
ち、上記の式（１）のＺで表される官能基であり、好ま
しくは、生理活性物質またはその生理活性物質と相互作
用するアナライトの物理吸着による変性を抑制できる化
合物である）とを有する化合物を含む溶液で金属膜を処
理することにより、生理活性物質を安定的に共有結合を
介して金属表面に固定化できる。

【００３８】本発明では、上記式（１）の化合物を含む
混合物を用いて金属表面又は金属膜を処理することによ
り、バイオセンサー用表面を作製する。具体的には、式
（１）で表される化合物を、官能基ＹとＺが上記した適
当な範囲のモル比で適当な溶媒（例えば、水、エタノー
ルなど）中に混合した溶液中に金属表面又は金属膜を浸
し、一定時間表面処理を行うことにより、バイオセンサ
ー用表面を作製することができる。

【００３９】式（１）で表される化合物を含む混合物を
用いて金属表面又は金属膜を処理する方法としては、上
記のように該化合物を含む混合溶液中に金属膜等を一定
時間浸漬する方法（浸漬法）以外にも、スピンコータを
用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機
を用いる方法（グラビア法）などを例示することができ
る。

【００４０】上記のようにして得られたバイオセンサー
用表面はその表面に式（１）で表される化合物を有す
る。本発明によれば、バイオセンサー用表面に固定化さ
れた式（１）で表される化合物に直接あるいは架橋性化
合物（例えば、水溶性多価性試薬等）またはヒドロゲル
を介して生理活性物質を共有結合により結合させること
によって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化
する方法が提供される。

【００４１】架橋性化合物としては、例えば、グルタル
アルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ−スクシニミジル−２−マ
レイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪
酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、
Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキ
サン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４
−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、
Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミドメチル安息香酸、
Ｎ−スクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−ス
ルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−ス
クシニミジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ
−スルホスクシニミジル−４−マレイミドフェニル−４
−酪酸、ＮＮ'−オキシジメチレン−ジマレイミド、Ｎ
Ｎ'−O-フェニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ'−ｍ-フェ
ニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ'−p-フェニレン−ジマ
レイミド、Ｎ，Ｎ'−ヘキサメチレン−ジマレイミド、
Ｎ−スクシニミジルマレイミドカルボン酸、Ｎ−スクシ
ニミジル−Ｓ−アセチルメルカプト酢酸、Ｎ−スクシニ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、
Ｓ−アセチルメルカプトスクシニックアンヒドライド、
メチル−３−（４'−ジチオピリジル）プロピオニミデ
ート、メチル−４−メルカプトブチルイミデート、メチ
ル−３−メルカプトプロピオニミデート、イミノチオレ
ン、O−カルボキシメチル−ヒドロキシルアミン、アゾ
ジフェニルビルマレイミド、ビス（スルホサクシニイミ
ジル）スペレイト、４,４'−ジイソチオシアノ−２,２'
−ジスルホン酸スチルベン、４,４'−ジフルオロ−３,
３'−ジニトロジフェニルスルホン、１,５−ジフルオロ
−２,４−ジニトロベンゼン、p−フェニレンジイソチオ
シアネイト、ジメチルアジピミデイト、ジメチルピメル
イミデイト、ジメチルスベルイミデイト、ｐ−アジドフ
ェナアシルブロマイド、ｐ−アジドフェニルグリオキサ
ル、Ｎ−ヒドロキシサクシニイミジル−４−アジドベン
ゾエイト、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、
メチル−４−アジドベンゾイミデイト、Ｎ−５−アジド
−２−ニトロベンゾイルオキシスクシイミド、Ｎ−スク
シイミジル６−（４'−アジドー２'−ニトロフェニルア
ミノ）ヘキサノエイト、１、４ベンゾキノン、Ｎ−スク
シンイミジル−３−（２'-ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスク
シンイミドナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロ
イロキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−
（８−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミ
ドナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロ
キシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−［２−
（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド二塩酸、ビス
ジアゾベンジジン、ヘキサメチレンジイソシアネート、
トルエンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオ
シアネート、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスマレインイミド、
Ｎ，Ｎ'−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、２、
４−ジニトロベンゼンスルフォネートナトリウム塩、ジ
アゾ化合物あるいは縮合試薬がＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ（又は
Ｒ'）で表されるカルボジイミド誘導体、Ｎ−ヒドロキ
シスクシイミド、トリ−ｎ−ブチルアミン、ブチルクロ
ロフォルメーテ、イソブチルイソシアニドなどが挙げら
れる。

【００４２】ヒドロゲルとしては、アガロース、デキス
トラン、キチン、キトサン、カラゲナン、ヒアルロン
酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸、澱粉及びセルロ
ースからなる群より選択される多糖類もしくはこれらの
いずれかの誘導体、並びにポリアクリル酸、ポリメタク
リル酸などの合成ポリカルボン酸、ポリHEMAなどのポリ
ヒドロキシアルキルカルボン酸エステル、ポリアクリル
アミドなどの合成ポリカルボン酸アミド、ポリビニルア
ルコール、エチレングリコール単位を有するオリゴマー
及びポリマー、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン
酸、ゼラチン、コラーゲンなどのポリペプチド、デンド
リマーから選ばれた少なくとも一の化合物及び／又は該
化合物の誘導体からなる親水性ポリマーなどが挙げられ
る。ヒドロゲルは所望の生理活性物質を固定化するため
に、水酸基、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、カル
ボニル、エポキシ又はビニル基などの反応性基を含むよ
うに誘導体化されていることが好ましい。

【００４３】本発明のバイオセンサー用表面上に固定さ
れる生理活性物質としては、測定対象物と相互作用する
ものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵
素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、
免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認
識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいは
リガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペ
プチドなどが挙げられる。

【００４４】免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原と
する抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体
としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。
具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれ
ば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用するこ
とができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色
ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、ク
ラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗
体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あ
るいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、15
7 などに対する抗体等を使用することができる。

【００４５】酵素としては、測定対象物又は測定対象物
から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、
特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元
酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素
等を使用することができる。具体的には、測定対象物が
グルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定
対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキ
シダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場
合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示
す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールア
ミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ド
ーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができ
る。

【００４６】微生物としては、特に限定されることな
く、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用すること
ができる。核酸としては、測定の対象とする核酸と相補
的にハイブリダイズするものを使用することができる。
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも
使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来
のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮ
Ａ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。低分子有機化
合物としては通常の有機化学合成の方法で合成すること
ができる任意の化合物が挙げられ、好ましくは、本発明
で使用する一般式Ｉのリンカー化合物と直接又は架橋性
化合物を介して結合することができるような官能基を有
する化合物である。

【００４７】非免疫蛋白質としては、特に限定されるこ
となく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオ
チン又はレセプターなどを使用できる。免疫グロブリン
結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプ
ロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することが
できる。糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げら
れる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステア
リン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチ
ル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられ
る。

【００４８】生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又
は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミ
ノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有
結合させることで行うことができる。

【００４９】上記のようにして生理活性物質を固定化さ
れたバイオセンサー用表面は、バイオセンサー用測定チ
ップとして、当該生理活性物質と相互作用する物質の検
出及び／又は測定のために使用することができる。

【００５０】即ち、本発明によれば、生理活性物質が固
定化された本発明のバイオセンサー用測定チップを用い
て、これに被験物質を接触させることにより、該バイオ
センサー用表面に固定化されている生理活性物質と相互
作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供され
る。被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と
相互作用する物質を含む試料などを使用することができ
る。

【００５１】本発明では、バイオセンサー用表面に固定
化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非
電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好
ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共
鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス
（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子ま
での機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。

【００５２】本発明の好ましい態様によれば、本発明の
バイオセンサー用測定チップは、例えば、透明基板上に
配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プ
ラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ等として用い
ることができる。表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに
使用されるチップであって、該センサーより照射された
光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定
する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着
されるものであってもよく、また脱着可能なものであっ
てもよい。

【００５３】表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の
光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射され
た単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に
依存することによるものであり、従って、反射された単
色光の強度を測定することにより、試料を分析すること
ができる。

【００５４】

【実施例】以下の実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 実施例１：バイオセンサーチップ用表面の作製： （１）チオール以外に２官能基を有す水溶性ＳＡＭ試薬
−グルタチオンを用いたバイオセンサー用表面の作製：
50nmの金蒸着膜がある1cm(1cmのカバーガラスをModel-2
08ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION I
NC.）で30分処理した後、1mMグルタチオン（還元型）の
水溶液に浸して、25℃で18時間インキュベートした。そ
の後、チップ表面を４０℃の水で１０回を洗浄した。

【００５５】（２）比較例１として、チオール以外に官
能基をひとつしか有しない化合物（7−カルボキシ−１
−ヘプタンチオール）によるバイオセンサー用表面の作
製：金蒸着膜が50nmの1cm(1cmのカバーガラスをオゾン
クリーナーで30分処理した後、1mMの7−カルボキシ−１
−ヘプタンチオール（同仁化学）のエタノール溶液に浸
して、25℃で18時間表面処理を行った。その後、４０℃
でエタノール５回、エタノール/水混合溶媒で１回、水
で５回チップを洗浄した。 （３）比較例２として、1mMのL-システイン（和光純
薬）の水溶液に浸し、グルタチオンでの処理と同じ方法
で、金蒸着膜の表面処理および洗浄を行った。

【００５６】実施例２：バイオセンサーチップ用表面の
性能評価：実施例１で作製した各々のチップを、市販の
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BI
Acore3000）のカートリッジブロック上に設置し、メー
カー推奨の方法で実験を行なった。 （１）固定化用チップへの蛋白質の非特異結合の測定 固定化用チップへの蛋白質の非特異結合の測定は以下の
通り行った（固定化用チップを、活性化剤を使用せず蛋
白質と反応させた。蛋白質が吸着されないほうが望まし
い）。作製したチップをそのまま、４０ｍｇ／ｍｌのプ
ロテインＡの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１０
分間流し込み、プロテインＡの物理吸着量を測定した。
また、１５μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧのｐＨ７のＨＢＳ
緩衝液を１０分間流し込み、ウサギＩｇＧの非特異吸着
量を測定した。流速は１０μＬ／分を用いた。それぞ
れ、１０分後の共鳴シグナル（ＲＵ）を、物理吸着の指
標とした。

【００５７】（２）蛋白質相互作用の測定 蛋白質相互作用の測定は以下の通り行った。生理活性物
質固定化用チップを、１−エチル−２，３−ジメチルア
ミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液７０μ
Ｌを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流し込み、４０
ｍｇ／ｍｌのプロテインＡの１０ｍＭ酢酸緩衝液溶液
（ｐＨ４．５）を３０分間流し込むことで、チップにプ
ロテインＡを固定した。その後、固定化したプロテイン
Ａを７０μＬの１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）で未反
応成分を分解後、１０μＬの１０ｍＭグリシン・塩酸緩
衝液（ｐＨ２）を測定セルに流し込み、洗浄した。プロ
テインＡを固定化した測定セルに、１５μｇ／ｍｌに希
釈したウサギＩｇＧを流速１０μＬ／分で１０分間流し
ながら、光強度を測定し、共鳴シグナルを求めた。プロ
テインＡ固定化による共鳴シグナル変化量（ＲＵ）、お
よび、結合したＩｇＧの共鳴シグナル変化量（ＲＵ）を
望ましい指標とした。

【００５８】（３）結果 表1にグルタチオン、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオ
ールおよびL-システインによる表面修飾したチップ表面
のリガンド（プロテインA）の物理吸着量、リガンド
（プロテインA）の共有結合による固定化量、アナライ
ト（ウサギIgG）の特異的結合量、アナライト（ウサギI
gG）の非特異的結合量を示す。

【００５９】

【表１】

【００６０】表１の結果から、グルタチオンで表面処理
を行うことにより、比較例である７−カルボキシ−１−
ヘプタンチオールおよびシステインと比較し、タンパク
質の物理吸着及び非特異的な結合が減少したことがわか
る。また、グルタチオンで表面処理を行なうことによ
り、同様に、チップに固定化されたプロテインＡの固定
化量は同程度だが、ウサギIgGの固定化量が相対的に向
上したことがわかる。この結果は、固定化後のプロテイ
ンAの結合活性は、相対的に保持されたことを示す。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、グルタチオンによる金属
表面は、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオールやシス
テインでの表面処理と比較し、生理活性物質を、ほとん
どの分子が、活性を保ったまま、脱落することなく固定
化するための手段であって、かつ、不必用な物理吸着や
非特異結合を軽減でき、処理過程が簡便で信頼性の高い
方法を提供することが可能になった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小島 政芳 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 須藤 幸夫 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 FA11 HA02 2G059 AA05 CC16 CC20 DD13 EE01 EE02

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（１）で表される化合物で処理し
   た金属表面又は金属膜から成る、生理活性物質を共有結
   合で固定化するためのバイオセンサー用表面。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
   うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
   基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
   み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
   理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
   ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
   の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
   テイン以外である。］
2. 【請求項２】 非電気化学的検出に使用される、請求項
   １に記載のバイオセンサー用表面。
3. 【請求項３】 表面プラズモン共鳴分析に使用される、
   請求項１または２に記載のバイオセンサー用表面。
4. 【請求項４】 式（１）において、Ｘが、チオール（−
   ＳＨ）、イソニトリル、ニトロ（−ＮＯ₂）、セレノー
   ル（−ＳｅＨ）、３価リン化合物、イソチオシアネー
   ト、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チ
   オ酸（−ＣＯＳＨ）、ジチオ酸（−ＣＳＳＨ）、非対称
   又は対称ジスルフィド［−ＳＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−
   Ｚ¹）_n1］、スルフィド［−ＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−Ｚ¹）
   _n1］、ジセレニド［−ＳｅＳｅＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−
   Ｚ¹）_n1］、またはセレニド［−ＳｅＡ¹（−Ｙ¹）
   _m1（−Ｚ¹）_n1］を示し、ここでＡ¹は、置換又は未置換
   のアミノ酸残基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基また
   はこれらの組み合わせから選ばれる３価以上の連結基を
   示し、Ｙ¹は生理活性物質と結合することができる官能
   基、Ｚ¹はセンサーの性能を改善できる官能基を示し、
   ｍ１及びｎ１は１以上の整数を示す、請求項１から３の
   いずれかに記載のバイオセンサー用表面。
5. 【請求項５】 式（１）において、Ｙが、−ＯＨ、−Ｃ
   ＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ₂、−ＮＣＳ、
   エポキシ基、またはビニル基である、請求項１から４の
   いずれかに記載のバイオセンサー用表面。
6. 【請求項６】 式（１）において、Ｚが、Ｙと結合させ
   る生理活性物質またはその生理活性物質と相互作用する
   アナライトの変性または物理吸着を抑制できる官能基で
   ある、請求項１から５のいずれかに記載のバイオセンサ
   ー用表面。
7. 【請求項７】式（１）において、Ｚが、−ＯＨ、−ＣＯ
   ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＯ₃Ｈ、アルキルエステルまたはア
   リールエステル基、糖、核酸、蛋白質、または水溶性ポ
   リマーである、請求項１から６のいずれかに記載のバイ
   オセンサー用表面。
8. 【請求項８】 式（１）で表される化合物が、システイ
   ンのアミノ基またはカルボキシル基のどちらか片方また
   は両方に、アミノ酸が縮合した長さがジペプチド以上の
   システインを含むペプチドまたはそれらの誘導体であ
   る、請求項１から７のいずれかに記載のバイオセンサー
   用表面。
9. 【請求項９】 式（１）で表される化合物が、請求項７
   のシステインを含むペプチドにおいてＳ−Ｓ結合で２量
   体のシスチン誘導体を形成したペプチドまたはそれらの
   誘導体である、請求項１から８のいずれかに記載のバイ
   オセンサー用表面。
10. 【請求項１０】 式（１）で表される化合物が、還元
    型、または酸化型グルタチオン、またはそれらの誘導体
    である、請求項１から９のいずれかに記載のバイオセン
    サー用表面。
11. 【請求項１１】 請求項１から１０のいずれかに記載の
    バイオセンサー用表面に生理活性物質を共有結合させて
    得られる、バイオセンサー用測定チップ。
12. 【請求項１２】 請求項１から１０のいずれかに記載の
    バイオセンサー用表面又は請求項１１に記載のバイオセ
    ンサー用測定チップと被験物質とを接触させる工程を含
    む、該バイオセンサー用表面に固定化されている生理活
    性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方
    法。
13. 【請求項１３】 バイオセンサー用表面に固定化されて
    いる生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学
    的方法により検出及び／又は測定する、請求項１２に記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 バイオセンサー用表面に固定化されて
    いる生理活性物質と被験物質との相互作用を表面プラズ
    モン共鳴分析により検出及び／又は測定する、請求項１
    ２または１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 金属表面又は金属膜を、少なくとも１
    種類の下記式（１）で表される化合物を含む混合液で処
    理する工程を含む、少なくとも１種類の下記式（１）で
    表される化合物を含む混合物で処理した金属表面又は金
    属膜から成る、生理活性物質を共有結合で固定化するた
    めのバイオセンサー用表面の製造方法。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
    うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
    基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
    み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
    理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
    ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
    の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
    テイン以外である。］
16. 【請求項１６】 金属表面又は金属膜を、少なくとも１
    種類の下記式（１）で表される化合物を含む混合物で処
    理する工程；及び該式（１）で表される化合物に直接あ
    るいは架橋性化合物またはヒドロゲルを介して生理活性
    物質を共有結合により結合させる工程を含む、金属表面
    又は金属膜に生理活性物質を固定化する方法。 Ｘ−Ａ（−Ｙ）_m（−Ｚ）_n （１） ［式（１）において、Ｘは金属表面と共有結合を形成し
    うる官能基を示し、Ａは、置換又は未置換のアミノ酸残
    基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環基またはこれらの組
    み合わせから選ばれる３価以上の連結基を示し、Ｙは生
    理活性物質と結合することができる官能基、Ｚはセンサ
    ーの性能を改善できる官能基を示す。ｍ及びｎは１以上
    の整数を示す。但し、式（１）で表される化合物はシス
    テイン以外である。］
17. 【請求項１７】 式（１）において、Ｘが、チオール
    （−ＳＨ）、イソニトリル、ニトロ（−ＮＯ₂）、セレ
    ノール（−ＳｅＨ）、３価リン化合物、イソチオシアネ
    ート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、
    チオ酸（−ＣＯＳＨ）、ジチオ酸（−ＣＳＳＨ）、非対
    称又は対称ジスルフィド［−ＳＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−Ｚ
    ¹）_n1］、スルフィド［−ＳＡ¹（−Ｙ¹）_m1（−
    Ｚ¹）_n1］、ジセレニド［−ＳｅＳｅＡ¹（−Ｙ¹）
    _m1（−Ｚ¹）_n1］、またはセレニド［−ＳｅＡ¹（−
    Ｙ¹）_m1（−Ｚ¹）_n1］を示し、ここでＡ¹は、置換又は
    未置換のアミノ酸残基、脂肪族基、芳香族基、ヘテロ環
    基またはこれらの組み合わせから選ばれる３価以上の連
    結基を示し、Ｙ¹は生理活性物質と結合することができ
    る官能基、Ｚ¹はセンサーの性能を改善できる官能基を
    示し、ｍ１及びｎ１は１以上の整数を示す、請求項１５
    または１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 式（１）において、Ｙが、−ＯＨ、−
    ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ₂、−ＮＣ
    Ｓ、エポキシ基、またはビニル基である、請求項１５か
    ら１７のいずれかに記載の方法。
19. 【請求項１９】 式（１）において、Ｚが、−ＯＨ、−
    ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＯ₃Ｈ、アルキルエステルまた
    はアリールエステル基、糖、核酸、蛋白質、または水溶
    性ポリマーである、請求項１５から１８のいずれかに記
    載の方法。
20. 【請求項２０】 式（１）で表される化合物が、システ
    インのアミノ基またはカルボキシル基のどちらか片方ま
    たは両方に、アミノ酸が縮合した長さがジペプチド以上
    のシステインを含むペプチドまたはそれらの誘導体であ
    る、請求項１５から１９のいずれかに記載の方法。
21. 【請求項２１】 式（１）で表される化合物が、請求項
    ２０のシステインを含むペプチドにおいてＳ−Ｓ結合で
    2量体を形成したシスチン誘導体を形成したペプチド、
    またはそれらの誘導体である、請求項２０に記載の方
    法。
22. 【請求項２２】 式（１）で表される化合物が、還元
    型、または酸化型グルタチオン、またはそれらの誘導体
    である、請求項１５から２１のいずれかに記載の方法。