JP2006047017A - ペプチドの固定化方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】表面にアミノ基を有するチップの基板と式(I)で表される化合物:
(式中、Rは水素原子またはSO3 -(1/nMn+)(Mn+はn価のカチオンを示す。nは1又は2を示す。)である)を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
【選択図】なし
Description
バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリックスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリックスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド(EDC)とN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している(非特許文献1)。しかしながら、デキストランのような大きな分子を介してペプチドなどの生体分子を固定化した場合、デキストラン等の影響が大きく、ペプチドの性質の測定に悪影響を及ぼす可能性がある。
Anal.Biochem.198,268,1991
1.表面にアミノ基を有するチップの基板と式(I)で表される化合物:
を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
2.チップ表面が金であることを特徴とする項1記載の方法。
3.チップの基板が透明基板であることを特徴とする項1又は2に記載の方法。
4.2種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする項1〜3のいずれか記載の方法。
5.固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であり、該システイン残基のSH基がマレイミド基と反応することを特徴とする項1〜4のいずれかに記載の方法。
6.チップが表面プラズモン共鳴(SPR)解析に用いられることを特徴とする項1〜5のいずれかに記載の方法。
7.下記式
チオール基(SH)は、ペプチド中のシステイン残基に由来するのが好ましい。
固定化されるペプチドに関しては、1種類のみであってもよいし、2種類以上であってもよい。ここで、ペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が2個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は5〜60残基程度であり、10〜25残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち1乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも1種は含むことが好ましい。
システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端(N末端もしくはC末端)のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして1乃至数残基のアミノ酸配列をシステイン残基と目的のペプチドの間にさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び/又はアラニン残基もしくはセリン残基が1乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
1/nMは、H,Na,K,Li,Cs等のアルカリ金属(n=1)、NH4,N(Me)4等のC1〜C4のアルキル基で置換されていてもよい四級アンモニウム(n=1)、1/2Ca,1/2Mg,1/2Ba等のアルカリ土類金属(n=2)等が挙げられ、好ましくはアルカリ金属、より好ましくはNaである。
本発明の方法の第一工程は、アミノ基を有するチップの基板と式(I)の化合物とを反応させ、式(I)の化合物のコハク酸イミド部分(スルホン酸基またはその塩を有していてもよい)を脱離させてアミド結合を形成し、マレイミド基を基板に導入する。
該反応は、基板上のアミノ基1モルに対して1モルから過剰量の式(I)の架橋剤の水溶液(Rがスルホン酸又はその塩の場合)または有機溶媒(Rが水素原子の場合)溶液を基板上に塗布するか、或いは基板を式(I)の架橋剤の水溶液又は有機溶媒溶液に浸漬することにより、行うことができる。反応は、例えば10〜60℃程度(好ましくは室温)の温度下に、1〜24時間程度反応させることで有利に進行する。
次に、第二工程では、チオール基を有するペプチドと式(I)の化合物に由来する基板にアミド結合を介して導入されたマレイミド基を反応させる。反応は、マレイミド基1モルに対しチオール基を有するペプチドを1モルから過剰量使用し、溶媒中で、10〜60℃程度(好ましくは室温)の温度下に、1〜24時間程度反応させることで有利に進行する。溶媒としては、水、含水有機溶媒(含水エタノール、含水メタノール、含水プロパノールなどの含水アルコール、含水THF、含水アセトン、含水THFなど)、低級アルコール、DMF,ジメチルアセトアミド、DMSOなどの水混和性の有機溶媒が例示される。
[実施例1]
(ペプチド固定化)
末端官能基がチオール基である4armPEG(日本油脂製SUNBRIGHT PTE−100SH)を1mMの濃度で7mlのエタノール:水=6:1の混合溶液に溶解させた。4armPEGの分子量は10000であり、中心からほぼ同等の長さのPEG鎖が4つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、PEGの4つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。
(未反応マレイミド基のブロッキング)
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、上記TEG−SH(HS-(CH2CH2O)4-CH3)を1mM濃度になるようにリン酸緩衝液(20mMリン酸、150mM NaCl;pH7.2)に溶解して、250μlをチップ上に注出し、室温で1時間反応させた。また比較例として、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるPEGチオール(日本油脂製SUNBRIGHT MESH−50H)を1mM濃度になるようにリン酸緩衝液(20mMリン酸、150mM NaCl;pH7.2)に溶解して、250μlをチップ上に注出し、室温で1時間反応させた。ここで用いたPEGチオールの分子量は5,000である。
(SPR解析によるPKAリン酸化の検出)
上記のようにブロッキングを行ったアレイを用いてPKAによるリン酸化を行った。PKA溶液400μlをアレイ上にドロップして、30℃、4時間反応を行った。PKA溶液の組成は、PKA触媒サブユニット(プロメガ製)1μl、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)375μl、1M塩化マグネシウム溶液20μl、10mM ATP4μlとした。その後、PBS及び水で3回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、SPRイメージング機器(MultiSPRinter:東洋紡績製)にセットし、ランニングバッファーとして50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)を100μl/minの速度でフローセル内に流した。SPRからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化セリン抗体PSR−45(シグマ製)をSPR装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで4000倍、2000倍、1000倍希釈した溶液を用いて希釈倍率の高いものから順に作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のSPRシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Backgroundにおいても実施した。
(観察の結果と考察)
SPRシグナル変化をグラフ化したセンサグラムの結果を図1に示した。センサグラムはスポットごとにおけるシグナルの平均値をプロットしている。Backgroundについては、基質ペプチドのスポット部分以外の任意に選択した箇所を測定ポイントとして得たシグナルの平均値をプロットしている。ポジティブコントロールに対しては非常に強い抗体結合シグナルの上昇を確認されており、PKA基質においてもある程度の結合シグナルの上昇を認めることができる。一方、ネガティブコントロール、cSrc基質、ブランク及びBackgroundに関してはほとんどシグナル変化を認めることができない。したがって、この方法により、非常に特異的にPKA基質のリン酸化を検出することができている。
[比較例1]
金表面に8−AOTを導入した後、SSMCCの替わりに、分子量3400の末端にスクシンイミド(NHS)基とマレイミド(MAL)基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール(NHS−PEG−MAL,Nektar社製)を作用させる点を除き、全て実施例1と同様にして検討した。NHS−PEG−MALはリン酸緩衝液(20mM リン酸、150mM NaCl;pH7.2)に10mg/mlで溶解し、金表面の8−AOTに2時間反応させた。結果を図2に示す。
Claims (8)
- チップ表面が金であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 2種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であり、該システイン残基のSH基がマレイミド基と反応することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- チップが表面プラズモン共鳴(SPR)解析に用いられることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- S(Cys)が、ペプチドの末端のCys残基のSH基に由来するSである請求項7に記載のチップ。
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