JPH06225789A - 熱帯熱マラリア原虫に対する改良された抗体 - Google Patents
熱帯熱マラリア原虫に対する改良された抗体Info
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- JPH06225789A JPH06225789A JP5227486A JP22748693A JPH06225789A JP H06225789 A JPH06225789 A JP H06225789A JP 5227486 A JP5227486 A JP 5227486A JP 22748693 A JP22748693 A JP 22748693A JP H06225789 A JPH06225789 A JP H06225789A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の富ヒスチジンタ
ンパク質ＩＩを認識し且つそれに対して結合する抗体に
関する。 【構成】 これらの抗体は、免疫検定において増大され
た感度を提供する、抗原に対する改良された特異性およ
び親和性を示す。抗体の生成に有用なペプチドを更に提
供する。
ｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の富ヒスチジンタ
ンパク質ＩＩを認識し且つそれに対して結合する抗体に
関する。 【構成】 これらの抗体は、免疫検定において増大され
た感度を提供する、抗原に対する改良された特異性およ
び親和性を示す。抗体の生成に有用なペプチドを更に提
供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、熱帯熱マラリア原虫の
富ヒスチジンタンパク質であるＨＲＰ−ＩＩを認識し且
つそれに対して結合する抗体、これらの抗体を用いる検
定および抗体の生成用ペプチドに関する。
富ヒスチジンタンパク質であるＨＲＰ−ＩＩを認識し且
つそれに対して結合する抗体、これらの抗体を用いる検
定および抗体の生成用ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】熱帯熱マラリア原虫は、ヒトマラリアの
最大の病原種である。赤血球中においてこの種の無性寄
生虫は、通常、高含量のアミノ酸ヒスチジンを特徴とす
るいくつかのタンパク質を生産する。これらのタンパク
質の一つを富ヒスチジンタンパク質（Ｈｉｓｔｉｄｉｎ
ｅ Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩ（ＨＲＰ−ＩＩ）
と称する。ＨＲＰ−ＩＩは寄生虫の無性世代中に合成さ
れ且つ感染細胞から血流中へ放出される。
最大の病原種である。赤血球中においてこの種の無性寄
生虫は、通常、高含量のアミノ酸ヒスチジンを特徴とす
るいくつかのタンパク質を生産する。これらのタンパク
質の一つを富ヒスチジンタンパク質（Ｈｉｓｔｉｄｉｎ
ｅ Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩ（ＨＲＰ−ＩＩ）
と称する。ＨＲＰ−ＩＩは寄生虫の無性世代中に合成さ
れ且つ感染細胞から血流中へ放出される。
【０００３】ＨＲＰ−ＩＩ遺伝子は単離され且つ配列決
定されている。予測されたアミノ酸配列は、ヒスチジン
３４％、アラニン３７％およびアスパラギン酸１０％を
含む（ウェレムス（Ｗｅｌｌｅｍｓ）およびハワード
（Ｈｏｗａｒｄ）、１９８６．ＰＮＡＳ ８３，６０６
５〜６０６９）。ＨＲＰ−ＩＩタンパク質は、更に、そ
れが、タンパク質の配列の約８０％を構成するアミノ酸
配列Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＨｉｓおよびＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｈ
ｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐの多数の縦列反復を含む
という点で例外的である。ＨＲＰ−ＩＩおよび他の富ヒ
スチジンタンパク質の機能はまだ知られていないが、Ｈ
ＲＰ−ＩＩは、それが感染細胞から細胞外媒質中に輸送
され、そこでそれを感染患者の血液中において検出する
ことができるので、マラリア感染の初期検出用に特に関
心を呼んでいる。したがって、ＨＲＰ−ＩＩの検出用の
高感度免疫検定は、疾患の初期段階でマラリア感染を検
出するための手段として望ましい。
定されている。予測されたアミノ酸配列は、ヒスチジン
３４％、アラニン３７％およびアスパラギン酸１０％を
含む（ウェレムス（Ｗｅｌｌｅｍｓ）およびハワード
（Ｈｏｗａｒｄ）、１９８６．ＰＮＡＳ ８３，６０６
５〜６０６９）。ＨＲＰ−ＩＩタンパク質は、更に、そ
れが、タンパク質の配列の約８０％を構成するアミノ酸
配列Ａｌａ−Ｈｉｓ−ＨｉｓおよびＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｈ
ｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐの多数の縦列反復を含む
という点で例外的である。ＨＲＰ−ＩＩおよび他の富ヒ
スチジンタンパク質の機能はまだ知られていないが、Ｈ
ＲＰ−ＩＩは、それが感染細胞から細胞外媒質中に輸送
され、そこでそれを感染患者の血液中において検出する
ことができるので、マラリア感染の初期検出用に特に関
心を呼んでいる。したがって、ＨＲＰ−ＩＩの検出用の
高感度免疫検定は、疾患の初期段階でマラリア感染を検
出するための手段として望ましい。
【０００４】ＨＲＰ−ＩＩに特異的な抗体は当該技術分
野において知られている。完全なＨＲＰ−ＩＩタンパク
質に対して生じた単クローン性抗体ＭＡｂ−８７および
そのサブクローンは、ハワードら（１９８６）Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０３，１２６９〜１２７７；ロッ
ク（Ｒｏｃｋ）ら（１９８７）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇ
ｙ ９５，２０９〜２２７およびパントン（Ｐａｎｔｏ
ｎ）ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａ
ｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ３５，１４９〜１６０によって
記載された。更に、ＭＡｂ−８７およびそのサブクロー
ンは、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）によるＷＯ ８９／０
１７８５に開示されている。しかしながら、Ｍａｂ−８
７およびその関連単クローン系は、エンザイムリンクド
イムノソルベントアッセイ（エリザ（ＥＬＩＳＡ））に
おいて最低の０．０５％寄生虫血しか検出することがで
きないように、それらはマラリアの診断に不適当であ
る。Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１９９
１．４５（３）：２４８〜２４９の補遺。Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−ＨｉｓおよびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ反復を含むＨ
ＲＰ−ＩＩタンパク質のフラグメントに対する多クロー
ン性抗体は、ナップ（Ｋｎａｐｐ）らによって報告され
た（１９８８．Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔ
ｔ．，８２，３４９〜３５９）。ウェレムスら（１９８
７．Ｃｅｌｌ ４９，６３３〜６４２）は、アミノ酸配
列Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−（Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ）２を有する合成ペプチドに
対する多クローン性抗血清を製造しており、これらの抗
体はＨＲＰ−ＩＩタンパク質に対して結合する。ウェレ
ムスおよびハワードは、米国特許第０６／８９５，９４
２号明細書において、これらの同一の多クローン性抗血
清および合成ペプチドを開示している。前述の著者およ
び発明者は、更に、ウェスタンブロットおよびエリザな
どの免疫検定においてＨＲＰ−ＩＩ抗原を検出するため
の種々の抗ＨＲＰ−ＩＩ抗体の使用を記載している。
野において知られている。完全なＨＲＰ−ＩＩタンパク
質に対して生じた単クローン性抗体ＭＡｂ−８７および
そのサブクローンは、ハワードら（１９８６）Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０３，１２６９〜１２７７；ロッ
ク（Ｒｏｃｋ）ら（１９８７）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇ
ｙ ９５，２０９〜２２７およびパントン（Ｐａｎｔｏ
ｎ）ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａ
ｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ３５，１４９〜１６０によって
記載された。更に、ＭＡｂ−８７およびそのサブクロー
ンは、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）によるＷＯ ８９／０
１７８５に開示されている。しかしながら、Ｍａｂ−８
７およびその関連単クローン系は、エンザイムリンクド
イムノソルベントアッセイ（エリザ（ＥＬＩＳＡ））に
おいて最低の０．０５％寄生虫血しか検出することがで
きないように、それらはマラリアの診断に不適当であ
る。Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１９９
１．４５（３）：２４８〜２４９の補遺。Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−ＨｉｓおよびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ反復を含むＨ
ＲＰ−ＩＩタンパク質のフラグメントに対する多クロー
ン性抗体は、ナップ（Ｋｎａｐｐ）らによって報告され
た（１９８８．Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔ
ｔ．，８２，３４９〜３５９）。ウェレムスら（１９８
７．Ｃｅｌｌ ４９，６３３〜６４２）は、アミノ酸配
列Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−（Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ）２を有する合成ペプチドに
対する多クローン性抗血清を製造しており、これらの抗
体はＨＲＰ−ＩＩタンパク質に対して結合する。ウェレ
ムスおよびハワードは、米国特許第０６／８９５，９４
２号明細書において、これらの同一の多クローン性抗血
清および合成ペプチドを開示している。前述の著者およ
び発明者は、更に、ウェスタンブロットおよびエリザな
どの免疫検定においてＨＲＰ−ＩＩ抗原を検出するため
の種々の抗ＨＲＰ−ＩＩ抗体の使用を記載している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、増大した特
異性および親和性によってＨＲＰ−ＩＩを認識し且つそ
れに対して結合し、それによって、先行技術の抗ＨＲＰ
−ＩＩ抗体と比較したところ免疫検定において増大した
感度を与える抗体を提供する。単クローン性抗体も多ク
ローン性抗体も、アミノ酸配列（配列番号１）Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈ
ｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉ
ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａを含む独特の合成
ペプチドを用いる免疫感作によって生じた。Ｎ末端シス
テインは、ペプチドがマレイミドに誘導された担体タン
パク質に対してその−ＳＨ基を介して結合するのを促進
する。システインは第二位のグリシンと一緒に、ＨＲＰ
−ＩＩ様配列と、ペプチドが抗体の生産に一層確実なコ
ンホメーションをとることを可能にする担体タンパク質
とのスペーサー結合として役立つ。Ｊ．Ｂ．ロスバード
（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９
８４．１６０：２０８〜２２１。
異性および親和性によってＨＲＰ−ＩＩを認識し且つそ
れに対して結合し、それによって、先行技術の抗ＨＲＰ
−ＩＩ抗体と比較したところ免疫検定において増大した
感度を与える抗体を提供する。単クローン性抗体も多ク
ローン性抗体も、アミノ酸配列（配列番号１）Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈ
ｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉ
ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａを含む独特の合成
ペプチドを用いる免疫感作によって生じた。Ｎ末端シス
テインは、ペプチドがマレイミドに誘導された担体タン
パク質に対してその−ＳＨ基を介して結合するのを促進
する。システインは第二位のグリシンと一緒に、ＨＲＰ
−ＩＩ様配列と、ペプチドが抗体の生産に一層確実なコ
ンホメーションをとることを可能にする担体タンパク質
とのスペーサー結合として役立つ。Ｊ．Ｂ．ロスバード
（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９
８４．１６０：２０８〜２２１。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の抗体は、先行技
術において記載された抗体と比較したところ、免疫検定
においてＨＲＰ−ＩＩ抗原に対する有意に改良された特
異性および親和性を示す。したがって、それらは免疫検
定の感度を増大させ且つ初期段階で疾患を検出する臨床
医の能力の重要な前進を示す。本発明の抗体は、血漿中
の０．０００８％程度の僅かな寄生虫血および全血中の
０．０００２％寄生虫血を検出することができるが、先
行技術の抗体を用いるエリザは寄生虫血を０．０５％ま
たはそれ以上でしか確実に検出することができなかった
（シェーフラー（Ｓｃｈａｅｆｆｌｅｒ）ら、１９９
１．熱帯医学および衛生学米国学会第４０回年次例会の
プログラムおよびアブストラクト（Ｐｒｏｇｒａｍ ＆
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆｔｈｅ ４０ｔｈ Ａｎｎ
ｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏ
ｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ）。アブストラクト＃３８
４．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．Ｓｕｐ
ｐｌ．４５（３）：２４８〜２４９）。寄生虫血％は、
染色された血液薄膜中の感染赤血球の数を非感染赤血球
に対して評価することによって決定され、そして感染率
を反映する。本発明の改良された抗体とは、開示された
性質を有する多クローン性抗体および単クローン性抗体
双方を包含する意味である。
術において記載された抗体と比較したところ、免疫検定
においてＨＲＰ−ＩＩ抗原に対する有意に改良された特
異性および親和性を示す。したがって、それらは免疫検
定の感度を増大させ且つ初期段階で疾患を検出する臨床
医の能力の重要な前進を示す。本発明の抗体は、血漿中
の０．０００８％程度の僅かな寄生虫血および全血中の
０．０００２％寄生虫血を検出することができるが、先
行技術の抗体を用いるエリザは寄生虫血を０．０５％ま
たはそれ以上でしか確実に検出することができなかった
（シェーフラー（Ｓｃｈａｅｆｆｌｅｒ）ら、１９９
１．熱帯医学および衛生学米国学会第４０回年次例会の
プログラムおよびアブストラクト（Ｐｒｏｇｒａｍ ＆
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆｔｈｅ ４０ｔｈ Ａｎｎ
ｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏ
ｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ）。アブストラクト＃３８
４．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．Ｓｕｐ
ｐｌ．４５（３）：２４８〜２４９）。寄生虫血％は、
染色された血液薄膜中の感染赤血球の数を非感染赤血球
に対して評価することによって決定され、そして感染率
を反映する。本発明の改良された抗体とは、開示された
性質を有する多クローン性抗体および単クローン性抗体
双方を包含する意味である。
【０００７】ＪＣＢ（１９８６）１０３，１２６９に記
載のテイラーの先行技術抗体は、完全な寄生虫に感染し
た、乳化された精製赤血球で免疫されたマウスにおいて
生産された。これに対して、本発明の改良された抗体
は、ウェレムスおよびハワードによって米国特許第０６
／８９５，９４２号明細書に記載されたペプチドの改良
種である合成ペプチドでマウスを免疫することによって
生じた。
載のテイラーの先行技術抗体は、完全な寄生虫に感染し
た、乳化された精製赤血球で免疫されたマウスにおいて
生産された。これに対して、本発明の改良された抗体
は、ウェレムスおよびハワードによって米国特許第０６
／８９５，９４２号明細書に記載されたペプチドの改良
種である合成ペプチドでマウスを免疫することによって
生じた。
【０００８】免疫原性ペプチドは、配列番号１； Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈ
ｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ （但し、ＣｙｓはペプチドのＮ末端を表わし且つＡｌａ
はＣ末端を表わす）のアミノ酸配列を有する。残基３〜
１７は、本来のＨＲＰ−ＩＩのセグメントと同様の富ヒ
スチジン反復配列である。ペプチドは、当該技術分野に
おいて知られている合成法、例えば、現在は自動化され
ているメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９
６９．Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２：２２１）
の固相法またはシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）およびア
サトン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）（ＷＯ ８６／０３４９
４）の改良固相法のいずれかを用いて合成することがで
きる。
ｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ （但し、ＣｙｓはペプチドのＮ末端を表わし且つＡｌａ
はＣ末端を表わす）のアミノ酸配列を有する。残基３〜
１７は、本来のＨＲＰ−ＩＩのセグメントと同様の富ヒ
スチジン反復配列である。ペプチドは、当該技術分野に
おいて知られている合成法、例えば、現在は自動化され
ているメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９
６９．Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２：２２１）
の固相法またはシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）およびア
サトン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）（ＷＯ ８６／０３４９
４）の改良固相法のいずれかを用いて合成することがで
きる。
【０００９】免疫原性ペプチドを製造する別の方法は、
１８マーをコードする組換えオリゴヌクレオチドの発現
による。適当な核酸配列を合成し、それをクローン化
し、そして形質転換された宿主細胞中でそれを発現させ
る方法は周知であり且つ当該技術分野の技術の範囲内で
ある。
１８マーをコードする組換えオリゴヌクレオチドの発現
による。適当な核酸配列を合成し、それをクローン化
し、そして形質転換された宿主細胞中でそれを発現させ
る方法は周知であり且つ当該技術分野の技術の範囲内で
ある。
【００１０】ペプチドのＮ末端のシステイン残基は、ペ
プチドが免疫原性担体に対してシステインの−ＳＨ基を
介して結合するのを促進する。ペプチドの免疫原性担体
に対する結合は、結合が小型の抗原決定基ペプチド（ハ
プテン）に抗体反応を誘導させるので、免疫感作に好適
である。本発明のペプチドのようなハプテンに対する結
合に有用な一般的に用いられる免疫原性担体は、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，ＡｎＩｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｏｕｔ
ｌｉｎｅに、デビッド・メール（ＤａｖｉｄＭａｌ
ｅ）、ガワー・メディカル・パブリッシング（Ｇｏｗｅ
ｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），１９８
６，３１頁により掲載されている。スカシガイのヘモシ
アニン（ＫＬＨ）は、ペプチドに対して結合して抗体反
応を生じるのに好ましい免疫原性担体である。
プチドが免疫原性担体に対してシステインの−ＳＨ基を
介して結合するのを促進する。ペプチドの免疫原性担体
に対する結合は、結合が小型の抗原決定基ペプチド（ハ
プテン）に抗体反応を誘導させるので、免疫感作に好適
である。本発明のペプチドのようなハプテンに対する結
合に有用な一般的に用いられる免疫原性担体は、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，ＡｎＩｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｏｕｔ
ｌｉｎｅに、デビッド・メール（ＤａｖｉｄＭａｌ
ｅ）、ガワー・メディカル・パブリッシング（Ｇｏｗｅ
ｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），１９８
６，３１頁により掲載されている。スカシガイのヘモシ
アニン（ＫＬＨ）は、ペプチドに対して結合して抗体反
応を生じるのに好ましい免疫原性担体である。
【００１１】Ｎ末端Ｃｙｓ−Ｇｌｙは、担体およびペプ
チド間のスペーサー結合として役立つ。本発明が機能す
るいずれの具体的な方法にも制限されたくはないが、本
出願人は、このようなスペーサー結合を提供することに
より、ペプチドのコンホメーションに対する担体の負の
効果が減少し、したがって、そのペプチドが、ＨＲＰ−
ＩＩタンパク質の天然に存在するエピトープに一層特有
のコンホメーションをとることを可能にすることができ
ると考える。この一層確実なコンホメーションは、本発
明の驚くべき高感度抗体を誘導するペプチドの能力の一
因となりうる。
チド間のスペーサー結合として役立つ。本発明が機能す
るいずれの具体的な方法にも制限されたくはないが、本
出願人は、このようなスペーサー結合を提供することに
より、ペプチドのコンホメーションに対する担体の負の
効果が減少し、したがって、そのペプチドが、ＨＲＰ−
ＩＩタンパク質の天然に存在するエピトープに一層特有
のコンホメーションをとることを可能にすることができ
ると考える。この一層確実なコンホメーションは、本発
明の驚くべき高感度抗体を誘導するペプチドの能力の一
因となりうる。
【００１２】ハプテンに対してスルフヒドリル基を介し
て担体を結合する方法は当該技術分野において知られて
おり、これらのいずれもが、免疫原性ペプチドに対して
選択された担体を結合するのに適当である。例えば、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら監
修、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・ア
ンド・ウィリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），１９９２，第９章に記
載された結合プロトコルを参照されたい。システインの
スルフヒドリルを担体タンパク質のアミノ基に対して結
合するのに好ましい試薬は、スルホスクシンイミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）またはＳＭＣＣおよ
びｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＭＢＳ）またはスルホ−ＭＢＳであり、それら
が他のアミノ酸残基での第二結合反応を不可欠に伴うこ
となくＣｙｓ−ＳＨに特異的であるという理由による。
最も好ましい結合試薬はスルホＳＭＣＣであり、Ｓ．ハ
シダ（Ｈａｓｈｉｄａ）ら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６：５６〜６３な
どの既知の方法にしたがってハプテンをペプチドに対し
て結合するのに用いることができる。しかしながら、グ
ルタルアルデヒドなどの他の結合試薬も、ヒスチジン残
基でのある種の第二反応で用いることができる。
て担体を結合する方法は当該技術分野において知られて
おり、これらのいずれもが、免疫原性ペプチドに対して
選択された担体を結合するのに適当である。例えば、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら監
修、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・ア
ンド・ウィリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），１９９２，第９章に記
載された結合プロトコルを参照されたい。システインの
スルフヒドリルを担体タンパク質のアミノ基に対して結
合するのに好ましい試薬は、スルホスクシンイミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）またはＳＭＣＣおよ
びｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＭＢＳ）またはスルホ−ＭＢＳであり、それら
が他のアミノ酸残基での第二結合反応を不可欠に伴うこ
となくＣｙｓ−ＳＨに特異的であるという理由による。
最も好ましい結合試薬はスルホＳＭＣＣであり、Ｓ．ハ
シダ（Ｈａｓｈｉｄａ）ら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６：５６〜６３な
どの既知の方法にしたがってハプテンをペプチドに対し
て結合するのに用いることができる。しかしながら、グ
ルタルアルデヒドなどの他の結合試薬も、ヒスチジン残
基でのある種の第二反応で用いることができる。
【００１３】ペプチドのＣ末端のＡｌａ残基は、Ｃ末端
での陰電荷密度を減少させるのに役立ち且つ本来のＨＲ
Ｐ−ＩＩタンパク質中に存在すると考えられる隣のアミ
ノ酸を表わす。
での陰電荷密度を減少させるのに役立ち且つ本来のＨＲ
Ｐ−ＩＩタンパク質中に存在すると考えられる隣のアミ
ノ酸を表わす。
【００１４】合成ペプチドを用いて動物を免疫するのに
適当な方法も当該技術分野において周知である。Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，上記を参照されたい。概して、免疫原性量のペ
プチド／担体結合体を生理的緩衝液、例えば、リン酸緩
衝溶液（ＰＢＳ）中に溶解または懸濁して、通常、完全
フロイントアジュバントなどのアジュバントと混合す
る。被験動物を最初にこの混合物で免疫した後、追加用
量のペプチド／担体結合体を追加抗原投与する。次に、
ペプチド／担体結合体を用いる免疫感作を完全フロイン
トアジュバントなどのアジュバントを用いて繰返す。最
初の免疫感作後の約７および１２週間に、概して、当該
技術分野で知られている方法を用いて血清を検査して抗
ペプチド抗体の力価を決定する（例えば、エリザにおけ
る免疫原との反応性）。いずれの特定のペプチド／担体
結合体にも最適の抗ペプチド抗体力価を得るためのこの
基本的な免疫感作プロトコルに対する修正および調整
は、当該技術分野の技術の範囲内である。精製多クロー
ン性抗体が望まれる場合、それは、十分に確立された方
法、例えば、ペプチドアフィニティーカラムでの分離を
用いて免疫血清から単離することができる。
適当な方法も当該技術分野において周知である。Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，上記を参照されたい。概して、免疫原性量のペ
プチド／担体結合体を生理的緩衝液、例えば、リン酸緩
衝溶液（ＰＢＳ）中に溶解または懸濁して、通常、完全
フロイントアジュバントなどのアジュバントと混合す
る。被験動物を最初にこの混合物で免疫した後、追加用
量のペプチド／担体結合体を追加抗原投与する。次に、
ペプチド／担体結合体を用いる免疫感作を完全フロイン
トアジュバントなどのアジュバントを用いて繰返す。最
初の免疫感作後の約７および１２週間に、概して、当該
技術分野で知られている方法を用いて血清を検査して抗
ペプチド抗体の力価を決定する（例えば、エリザにおけ
る免疫原との反応性）。いずれの特定のペプチド／担体
結合体にも最適の抗ペプチド抗体力価を得るためのこの
基本的な免疫感作プロトコルに対する修正および調整
は、当該技術分野の技術の範囲内である。精製多クロー
ン性抗体が望まれる場合、それは、十分に確立された方
法、例えば、ペプチドアフィニティーカラムでの分離を
用いて免疫血清から単離することができる。
【００１５】更に、免疫原性ペプチドで免疫された動物
の脾臓細胞は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルス
タイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５．Ｎａｔｕｒｅ
２５６，４９５〜４９７）の方法または当該技術分野
において知られているこの方法の変法（オイ（Ｏｉ）お
よびヘルツェンベルグ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）．１９
８０．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ミシェル（Ｍｉ
ｓｈｅｌｌ）およびシイギ（Ｓｈｉｉｇｉ）監修、３５
１〜３７２頁、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅ），ニュ
ーヨーク；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）．１９８６．
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．アカデミ
ック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サン・
ディエゴ）を用いて単クローン性抗体の生産用にネズミ
骨髄種細胞と融合することができる。融合細胞をクロー
ン化し、そしてエリザなどの免疫学的検定を用いて所望
の抗ペプチド単クローン性抗体の生産に関してスクリー
ンする。所望ならば、ハイブリドーマ培養上澄みまたは
腹水液からの単クローン性抗体の精製を、当該技術分野
において知られている方法、例えば、プロテインＧまた
はペプチドアフィニティーカラムクロマトグラフィーを
用いて達成することができる。
の脾臓細胞は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルス
タイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５．Ｎａｔｕｒｅ
２５６，４９５〜４９７）の方法または当該技術分野
において知られているこの方法の変法（オイ（Ｏｉ）お
よびヘルツェンベルグ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）．１９
８０．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ミシェル（Ｍｉ
ｓｈｅｌｌ）およびシイギ（Ｓｈｉｉｇｉ）監修、３５
１〜３７２頁、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅ），ニュ
ーヨーク；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）．１９８６．
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．アカデミ
ック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サン・
ディエゴ）を用いて単クローン性抗体の生産用にネズミ
骨髄種細胞と融合することができる。融合細胞をクロー
ン化し、そしてエリザなどの免疫学的検定を用いて所望
の抗ペプチド単クローン性抗体の生産に関してスクリー
ンする。所望ならば、ハイブリドーマ培養上澄みまたは
腹水液からの単クローン性抗体の精製を、当該技術分野
において知られている方法、例えば、プロテインＧまた
はペプチドアフィニティーカラムクロマトグラフィーを
用いて達成することができる。
【００１６】ペプチドによる免疫感作に対する反応で生
じた単離された多クローン性および単クローン性抗体
は、数種類の免疫検定プロトコルにおいて用いることが
できる。抗体はそのままで用いてよいしまたは、ペプチ
ドおよびＨＲＰ−ＩＩタンパク質（ＦａｂまたはＦ（ａ
ｂ′）２）に対して結合することもできるフラグメント
を生じさせてもよい。完全な抗体も、それらの抗原結合
性フラグメントも、本発明によって包含されることを意
味する。免疫検定は多クローン性抗体試薬のみを用いて
実施することができるが、ほとんどの場合、単クローン
性抗体または多クローン性および単クローン性抗体の組
合わせが好ましい。概して、免疫検定における抗体また
は抗原を検出可能標識に対する結合によって標識して、
抗原／抗体結合の検出を、生成された結合性複合体中に
標識を包含することによって促進する。本明細書中で用
いられる「標識」、「検出可能標識」という用語および
関連用語は、検出可能標識単独および、以下に記載した
ように、粒子と結合した検出可能標識双方を包含する意
味である。抗体などのタンパク質に対して結合するのに
適当な標識および方法は周知である。追加の試薬または
検出すべき反応を必要としない直接検出可能な標識とし
ては、放射性同位体、螢光染料および可視吸収染料があ
る。着色生成物を生じるように反応しうる酵素は、特異
的結合検定において抗体に結合するのに一般的に用いら
れる適当な直接検出可能な標識である。前述の標識はい
ずれも、本発明の多クローン性および単クローン性抗体
に対する結合に適している。
じた単離された多クローン性および単クローン性抗体
は、数種類の免疫検定プロトコルにおいて用いることが
できる。抗体はそのままで用いてよいしまたは、ペプチ
ドおよびＨＲＰ−ＩＩタンパク質（ＦａｂまたはＦ（ａ
ｂ′）２）に対して結合することもできるフラグメント
を生じさせてもよい。完全な抗体も、それらの抗原結合
性フラグメントも、本発明によって包含されることを意
味する。免疫検定は多クローン性抗体試薬のみを用いて
実施することができるが、ほとんどの場合、単クローン
性抗体または多クローン性および単クローン性抗体の組
合わせが好ましい。概して、免疫検定における抗体また
は抗原を検出可能標識に対する結合によって標識して、
抗原／抗体結合の検出を、生成された結合性複合体中に
標識を包含することによって促進する。本明細書中で用
いられる「標識」、「検出可能標識」という用語および
関連用語は、検出可能標識単独および、以下に記載した
ように、粒子と結合した検出可能標識双方を包含する意
味である。抗体などのタンパク質に対して結合するのに
適当な標識および方法は周知である。追加の試薬または
検出すべき反応を必要としない直接検出可能な標識とし
ては、放射性同位体、螢光染料および可視吸収染料があ
る。着色生成物を生じるように反応しうる酵素は、特異
的結合検定において抗体に結合するのに一般的に用いら
れる適当な直接検出可能な標識である。前述の標識はい
ずれも、本発明の多クローン性および単クローン性抗体
に対する結合に適している。
【００１７】粒状の検出可能標識は抗体に対する結合に
好適である。このような粒子としては、ポリマー（例え
ば、ラテックスまたはポリスチレン）、嚢（ｓａｃ
ｓ）、リポソーム、金属性ゾル（例えば、コロイド銀ま
たはコロイド金）、他のコロイド粒子またはポリマー性
染料がある。粒状標識を生成するには、通常、この目的
に関して当該技術分野で知られている方法を用いる化学
結合の生成により、選択された検出可能標識を含むよう
に粒子を誘導する。ラテックス粒子などのポリマー粒子
は、更に、ポリマー中に取込まれた染料を有することが
できる。嚢およびリポソームの場合、標識を小胞中に閉
じ込めることもできる。次に、粒子およびその結合標識
を、特異的結合検定で用いるための抗体に対して化学的
に結合することができる。或いは、ポリマー粒子、ポリ
マー性染料および金属粒子を、米国特許第５，０９６，
８３７号明細書に記載されたように抗体で被覆すること
ができる。本抗体との結合に好ましい検出可能標識は、
閉じ込められた可視染料を封入しているリポソームまた
は他の着色粒子であり、抗体はそのリポソームまたは粒
子の表面に対して結合している。このようなリポソーム
標識は米国特許第４，６９５，５５４号明細書に記載さ
れている。
好適である。このような粒子としては、ポリマー（例え
ば、ラテックスまたはポリスチレン）、嚢（ｓａｃ
ｓ）、リポソーム、金属性ゾル（例えば、コロイド銀ま
たはコロイド金）、他のコロイド粒子またはポリマー性
染料がある。粒状標識を生成するには、通常、この目的
に関して当該技術分野で知られている方法を用いる化学
結合の生成により、選択された検出可能標識を含むよう
に粒子を誘導する。ラテックス粒子などのポリマー粒子
は、更に、ポリマー中に取込まれた染料を有することが
できる。嚢およびリポソームの場合、標識を小胞中に閉
じ込めることもできる。次に、粒子およびその結合標識
を、特異的結合検定で用いるための抗体に対して化学的
に結合することができる。或いは、ポリマー粒子、ポリ
マー性染料および金属粒子を、米国特許第５，０９６，
８３７号明細書に記載されたように抗体で被覆すること
ができる。本抗体との結合に好ましい検出可能標識は、
閉じ込められた可視染料を封入しているリポソームまた
は他の着色粒子であり、抗体はそのリポソームまたは粒
子の表面に対して結合している。このようなリポソーム
標識は米国特許第４，６９５，５５４号明細書に記載さ
れている。
【００１８】抗体を用いる免疫検定用プロトコルは当該
技術分野において周知である。例えば、本発明による多
クローン性若しくは単クローン性抗体またはその抗原結
合性フラグメントを、ＨＲＰ−ＩＩタンパク質を検出す
るためのサンドイッチ検定においてまたはサンドイッチ
検定プロトコルの既知の改良法および変法において用い
ることができる。或いは、抗体およびそれらの抗原結合
性フラグメントを、当該技術分野において知られている
ような種々の競合的検定形式において用いることができ
る。これらの検定プロトコルの基本は、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、
上記で論及されている。マラリア感染の診断薬として用
いる場合、ＨＲＰ−ＩＩタンパク質の存在に関して検査
される試料は溶解したかまたは非溶解血液であることが
好ましい。しかしながら、他の試料、例えば、感染細胞
培養の上澄み、熱帯熱マラリア原虫寄生虫血の抽出物、
血清、血漿、尿および脳脊髄液も同様に検定することが
できる。
技術分野において周知である。例えば、本発明による多
クローン性若しくは単クローン性抗体またはその抗原結
合性フラグメントを、ＨＲＰ−ＩＩタンパク質を検出す
るためのサンドイッチ検定においてまたはサンドイッチ
検定プロトコルの既知の改良法および変法において用い
ることができる。或いは、抗体およびそれらの抗原結合
性フラグメントを、当該技術分野において知られている
ような種々の競合的検定形式において用いることができ
る。これらの検定プロトコルの基本は、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、
上記で論及されている。マラリア感染の診断薬として用
いる場合、ＨＲＰ−ＩＩタンパク質の存在に関して検査
される試料は溶解したかまたは非溶解血液であることが
好ましい。しかしながら、他の試料、例えば、感染細胞
培養の上澄み、熱帯熱マラリア原虫寄生虫血の抽出物、
血清、血漿、尿および脳脊髄液も同様に検定することが
できる。
【００１９】特異的結合検定、特に、免疫検定を実施す
るための装置は知られており、ＨＲＰ−ＩＩの検出用の
本単クローン性および多クローン性抗体と一緒に用いる
のに容易に適応することができる。固相検定は、概し
て、試薬の分離がより迅速且つ簡単であるので、沈降検
定などの不均一検定法よりも簡単に行なわれる。固相検
定装置としては、米国特許第４，７４３，５６０号明細
書；米国特許第４，７０３，０１７号明細書；米国特許
第４，６６６，８６６号明細書；米国特許第４，３６
６，２４１号明細書；米国特許第４，８１８，６７７号
明細書；米国特許第４，６３２，９０１号明細書；米国
特許第４，７２７，０１９号明細書；米国特許第４，９
２０，０４６号明細書；米国特許第４，８５５，２４０
号明細書；米国特許第５，０３０，５５８号明細書；米
国特許第４，１６８，１４６号明細書に記載の微量滴定
プレート、フロースルー検定装置、ディプスティックお
よびイムノキャピラリーまたはイムノクロマトグラフィ
ー免疫検定装置がある。最も好ましいのは、本発明の単
クローン性または多クローン性抗体を用い、ディプステ
ィックとして用いることができるイムノキャピラリー検
定装置である。
るための装置は知られており、ＨＲＰ−ＩＩの検出用の
本単クローン性および多クローン性抗体と一緒に用いる
のに容易に適応することができる。固相検定は、概し
て、試薬の分離がより迅速且つ簡単であるので、沈降検
定などの不均一検定法よりも簡単に行なわれる。固相検
定装置としては、米国特許第４，７４３，５６０号明細
書；米国特許第４，７０３，０１７号明細書；米国特許
第４，６６６，８６６号明細書；米国特許第４，３６
６，２４１号明細書；米国特許第４，８１８，６７７号
明細書；米国特許第４，６３２，９０１号明細書；米国
特許第４，７２７，０１９号明細書；米国特許第４，９
２０，０４６号明細書；米国特許第４，８５５，２４０
号明細書；米国特許第５，０３０，５５８号明細書；米
国特許第４，１６８，１４６号明細書に記載の微量滴定
プレート、フロースルー検定装置、ディプスティックお
よびイムノキャピラリーまたはイムノクロマトグラフィ
ー免疫検定装置がある。最も好ましいのは、本発明の単
クローン性または多クローン性抗体を用い、ディプステ
ィックとして用いることができるイムノキャピラリー検
定装置である。
【００２０】好ましいイムノキャピラリーディプスティ
ック検定装置を、ＨＲＰ−ＩＩ抗原のサンドイッチ免疫
検定の実施に関して示す。それは、プラスチック裏地に
対して積層されたニトロセルロースなどの微孔性吸収材
料部分を含む。微孔性材料と接触しているガラス繊維な
どの第二の吸収材料ストリップがあり、更に、プラスチ
ック裏地に対して積層されている。ニトロセルロース
は、それがタンパク質溶液をニトロセルロースに適用し
且つそれに吸収させることによって簡単にタンパク質を
固定化させるので、第一材料に好適である。第二の吸収
剤は微孔性材料と流動連通しており、微孔性吸収剤を介
して検定液を引き寄せるのを助ける。第二吸収剤も、微
孔性材料を介して通過する液体を吸収する。
ック検定装置を、ＨＲＰ−ＩＩ抗原のサンドイッチ免疫
検定の実施に関して示す。それは、プラスチック裏地に
対して積層されたニトロセルロースなどの微孔性吸収材
料部分を含む。微孔性材料と接触しているガラス繊維な
どの第二の吸収材料ストリップがあり、更に、プラスチ
ック裏地に対して積層されている。ニトロセルロース
は、それがタンパク質溶液をニトロセルロースに適用し
且つそれに吸収させることによって簡単にタンパク質を
固定化させるので、第一材料に好適である。第二の吸収
剤は微孔性材料と流動連通しており、微孔性吸収剤を介
して検定液を引き寄せるのを助ける。第二吸収剤も、微
孔性材料を介して通過する液体を吸収する。
【００２１】本発明による単クローン性抗体は、試験さ
れる試料中に直接浸漬されることがない位置にある微孔
性吸収剤上に固定化されている。検定を実施するには、
単クローン性抗体より下の微孔性材料の部分を試料と接
触させて、試料液が毛管現象（吸上）によってその中に
吸い上げられ、それによって試料が抗体と接触するよう
になり、そして抗体と、試料中に存在しうるＨＲＰ−Ｉ
Ｉ抗原全部とを結合させるようにする。次に、本発明に
よる可視染料で標識した多クローン性抗体を含む溶液を
微孔性吸収剤中に吸上させて単クローン性抗体／結合抗
原複合体と接触させ、多クローン性抗体がＨＲＰ−ＩＩ
との相互作用によって該複合体に結合するようにる。場
合により、リポソームを破壊することがない緩洗剤を含
む洗浄液（例えば、ツヴィッタージェント（ＺＷＩＴＴ
ＥＲＧＥＮＴ））を、多クローン性抗体の結合後に微孔
性吸収剤中に吸上させてもよい。次に、検出可能な染料
標識を、固定された単クローン性抗体の区域において可
視化させる。
れる試料中に直接浸漬されることがない位置にある微孔
性吸収剤上に固定化されている。検定を実施するには、
単クローン性抗体より下の微孔性材料の部分を試料と接
触させて、試料液が毛管現象（吸上）によってその中に
吸い上げられ、それによって試料が抗体と接触するよう
になり、そして抗体と、試料中に存在しうるＨＲＰ−Ｉ
Ｉ抗原全部とを結合させるようにする。次に、本発明に
よる可視染料で標識した多クローン性抗体を含む溶液を
微孔性吸収剤中に吸上させて単クローン性抗体／結合抗
原複合体と接触させ、多クローン性抗体がＨＲＰ−ＩＩ
との相互作用によって該複合体に結合するようにる。場
合により、リポソームを破壊することがない緩洗剤を含
む洗浄液（例えば、ツヴィッタージェント（ＺＷＩＴＴ
ＥＲＧＥＮＴ））を、多クローン性抗体の結合後に微孔
性吸収剤中に吸上させてもよい。次に、検出可能な染料
標識を、固定された単クローン性抗体の区域において可
視化させる。
【００２２】ディプスティック検定装置の好ましい別の
実施態様において、陽性対照区域は、固定された単クロ
ーン性抗体の近くであるがそれとは異なる微孔性吸収剤
上に含まれる。陽性対照はＨＲＰ−ＩＩ抗原であってよ
いし、免疫原性ペプチドまたはその誘導体若しくは類似
体は更に本発明の抗体を結合する。好ましい陽性対照
は、固定された単クローン性抗体の区域にそれが接触し
た後に、移行性試料液によって接触した区域においてニ
トロセルロース上に固定されたＨＲＰ−ＩＩ抗原であ
る。
実施態様において、陽性対照区域は、固定された単クロ
ーン性抗体の近くであるがそれとは異なる微孔性吸収剤
上に含まれる。陽性対照はＨＲＰ−ＩＩ抗原であってよ
いし、免疫原性ペプチドまたはその誘導体若しくは類似
体は更に本発明の抗体を結合する。好ましい陽性対照
は、固定された単クローン性抗体の区域にそれが接触し
た後に、移行性試料液によって接触した区域においてニ
トロセルロース上に固定されたＨＲＰ−ＩＩ抗原であ
る。
【００２３】免疫検定を実施するのに選択された装置お
よび試薬は、便宜上、キットの形で包装することができ
る。例えば、このようなキットは、適当な検定装置、抗
体試薬、緩衝液などの検定の展開用試薬、そして必要な
らば、選択された標識の検出用試薬を含むことができ
る。
よび試薬は、便宜上、キットの形で包装することができ
る。例えば、このようなキットは、適当な検定装置、抗
体試薬、緩衝液などの検定の展開用試薬、そして必要な
らば、選択された標識の検出用試薬を含むことができ
る。
【００２４】本発明の抗体は、更に、熱帯熱マラリア原
虫感染の危険を減少させるかまたはいったん達成された
このような感染を治療するのに有用であることができ
る。治療は、マラリア感染に罹患している動物、好まし
くは、ヒトに対して、本発明による単クローン性または
多クローン性抗体を含む薬剤組成物の治療的有効量を投
与することによって達成することができる。類似の薬学
的に許容しうる組成物を、引続きの熱帯熱マラリア原虫
感染に対する免疫を増大させるのに十分な用量で投与し
てもよい。或いは、本発明の単クローン性または多クロ
ーン性抗体に対して生じた抗イディオタイプ抗体も、マ
ラリア感染に対するワクチンとして薬剤組成物で投与す
ることができる。
虫感染の危険を減少させるかまたはいったん達成された
このような感染を治療するのに有用であることができ
る。治療は、マラリア感染に罹患している動物、好まし
くは、ヒトに対して、本発明による単クローン性または
多クローン性抗体を含む薬剤組成物の治療的有効量を投
与することによって達成することができる。類似の薬学
的に許容しうる組成物を、引続きの熱帯熱マラリア原虫
感染に対する免疫を増大させるのに十分な用量で投与し
てもよい。或いは、本発明の単クローン性または多クロ
ーン性抗体に対して生じた抗イディオタイプ抗体も、マ
ラリア感染に対するワクチンとして薬剤組成物で投与す
ることができる。
【００２５】以下の実施例は本発明のある種の特徴およ
び実施態様を例示するためのものであるが、請求の範囲
によって定義される本発明の範囲を制限すると考えるべ
きではない。
び実施態様を例示するためのものであるが、請求の範囲
によって定義される本発明の範囲を制限すると考えるべ
きではない。
【００２６】
【実施例】実施例１ 配列番号１のアミノ酸配列を有する１８マーペプチド
を、本質的には、Ｄ．ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）（１９
８８．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３：６１７〜６２４）
によって記載されたように、ＢＯＴおよびＨＯＢＴを用
いるＦｍｏｃに媒介された合成化学を用いて製造した。
ミリジェン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）／バイオ・サーチ・エ
クセル（Ｂｉｏ−Ｓｅａｒｃｈ ＥＸＣＥＬＬ）固相ペ
プチド合成機を、合成を実施する製造業者によって推奨
されたように用いた。完成したペプチドを、ミリジェン
／バイオサーチによってその使用説明書で推奨されたよ
うに、試薬Ｒを用いて脱保護し且つ樹脂から分離した。
粗製ペプチドは、混合された試薬Ｒおよび樹脂のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）洗液に対して７容量の冷ジルエー
テルを加えることによって生じた沈澱を遠心分離するこ
とによって単離された。沈澱を冷ジエチルエーテルで洗
浄した後、真空中で乾燥させた。更に、粗製ペプチドを
水中０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）およびアセトニトリル
中０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）の勾配を用いて溶離され
るＣ１８−逆相マトリックス上のクロマトグラフィーに
よって精製した。１８マーペプチドは３３〜３４％緩衝
液Ｂで溶離した後、プロールしたペプチド含有画分を凍
結乾燥することによって集められた。スルホ−ＳＭＣＣ
に誘導されたスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に対
する精製ペプチドの結合は、ロスバード（Ｒｏｔｈｂａ
ｒｄ）ら（１９８４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：２
０８〜２２１）によって記載されたように僅かに変更し
て行なわれた。ペプチド結合体をセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５上のクロマトグラフィーによっ
て非結合ペプチドから単離した。次に、精製１８マーペ
プチド：ＫＬＨ結合体を、ＨＲＰ−ＩＩに対して抗体を
誘導するための免疫原として用いた。
を、本質的には、Ｄ．ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）（１９
８８．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３：６１７〜６２４）
によって記載されたように、ＢＯＴおよびＨＯＢＴを用
いるＦｍｏｃに媒介された合成化学を用いて製造した。
ミリジェン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）／バイオ・サーチ・エ
クセル（Ｂｉｏ−Ｓｅａｒｃｈ ＥＸＣＥＬＬ）固相ペ
プチド合成機を、合成を実施する製造業者によって推奨
されたように用いた。完成したペプチドを、ミリジェン
／バイオサーチによってその使用説明書で推奨されたよ
うに、試薬Ｒを用いて脱保護し且つ樹脂から分離した。
粗製ペプチドは、混合された試薬Ｒおよび樹脂のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）洗液に対して７容量の冷ジルエー
テルを加えることによって生じた沈澱を遠心分離するこ
とによって単離された。沈澱を冷ジエチルエーテルで洗
浄した後、真空中で乾燥させた。更に、粗製ペプチドを
水中０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）およびアセトニトリル
中０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）の勾配を用いて溶離され
るＣ１８−逆相マトリックス上のクロマトグラフィーに
よって精製した。１８マーペプチドは３３〜３４％緩衝
液Ｂで溶離した後、プロールしたペプチド含有画分を凍
結乾燥することによって集められた。スルホ−ＳＭＣＣ
に誘導されたスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に対
する精製ペプチドの結合は、ロスバード（Ｒｏｔｈｂａ
ｒｄ）ら（１９８４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：２
０８〜２２１）によって記載されたように僅かに変更し
て行なわれた。ペプチド結合体をセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５上のクロマトグラフィーによっ
て非結合ペプチドから単離した。次に、精製１８マーペ
プチド：ＫＬＨ結合体を、ＨＲＰ−ＩＩに対して抗体を
誘導するための免疫原として用いた。
【００２７】雄のＢａｌｂＣ／ＡｎＣｒｌマウス（１８
〜２０ｇ）を免疫に用いた。免疫原性ペプチドの原液２
ｍｇ／ｍｌは、凍結乾燥ペプチド８ｍｇを予め加温した
ＰＢＳ４．０ｍｌ中に粉末が溶解するまで激しく混合し
ながら還元することによって製造された。その原液をＰ
ＢＳで１：１に希釈し、そして溶液１ｍｇ／ｍｌを免疫
に用いた。最初の２回の注射を足部および皮下に与えた
（完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆ
ｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、ディフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ）１００μｌを含む１ｍｇ／ｍｌのペプチド：ＫＬ
Ｈを各部位に１００μｌ）。これに続いて、ペプチド：
ＫＬＨ１００μｌをほぼ２日間隔で４回腹腔内注射し
た。抗１８マー力価を評価し、そして免疫された４匹の
マウスの内３匹がペプチドに対して十分に反応した。次
に、ペプチド：ＫＬＨ１００μｌの２回の腹腔内注射を
ほぼ１週間おきに与えた。これらの注射後、４匹のマウ
ス全部がペプチドに対して若干の免疫反応を示した。約
３か月後、それらのマウスにペプチド：ＫＬＨを４回の
腹腔内注射で追加抗原投与した。エリザにおける１８マ
ーペプチドとの反応性に基づいて、「免疫学における最
新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｊ．Ｅ．コリガン
（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら監修、１９９１年、ジョン・ウィ
リー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ）、第２章に記載されたような標準的なプロトコ
ルにしたがって、脾臓細胞とＰ３骨髄種細胞との融合用
に１匹を選択した。
〜２０ｇ）を免疫に用いた。免疫原性ペプチドの原液２
ｍｇ／ｍｌは、凍結乾燥ペプチド８ｍｇを予め加温した
ＰＢＳ４．０ｍｌ中に粉末が溶解するまで激しく混合し
ながら還元することによって製造された。その原液をＰ
ＢＳで１：１に希釈し、そして溶液１ｍｇ／ｍｌを免疫
に用いた。最初の２回の注射を足部および皮下に与えた
（完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆ
ｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、ディフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ）１００μｌを含む１ｍｇ／ｍｌのペプチド：ＫＬ
Ｈを各部位に１００μｌ）。これに続いて、ペプチド：
ＫＬＨ１００μｌをほぼ２日間隔で４回腹腔内注射し
た。抗１８マー力価を評価し、そして免疫された４匹の
マウスの内３匹がペプチドに対して十分に反応した。次
に、ペプチド：ＫＬＨ１００μｌの２回の腹腔内注射を
ほぼ１週間おきに与えた。これらの注射後、４匹のマウ
ス全部がペプチドに対して若干の免疫反応を示した。約
３か月後、それらのマウスにペプチド：ＫＬＨを４回の
腹腔内注射で追加抗原投与した。エリザにおける１８マ
ーペプチドとの反応性に基づいて、「免疫学における最
新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｊ．Ｅ．コリガン
（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら監修、１９９１年、ジョン・ウィ
リー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ）、第２章に記載されたような標準的なプロトコ
ルにしたがって、脾臓細胞とＰ３骨髄種細胞との融合用
に１匹を選択した。
【００２８】被免疫マウスまたはハイブリドーマをスク
リーニングするために、エリザプレートを、非結合１８
マーペプチド、ＫＬＨ（免疫原）に結合したペプチドま
たはＢＳＡに結合したペプチド２０μｇ／ｍｌで４℃に
おいて被覆した。脾臓細胞融合前の被免疫マウスからの
血液またはハイブリドーマ培養上澄みをＰＢＳ−トウィ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で１：１０に希釈した後、続
いて連続２倍希釈を行なった。その希釈を、調製された
エリザプレート中において室温で１時間インキュベート
した。西洋ワサビ大根ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリンまたはウサギ抗マウスＩｇＧ抗体をＰ
ＢＳ−トウィーンで希釈し且つエリザプレートを用いて
１時間インキュベートした。Ｏ−フェニレンジアミン二
塩酸塩酵素基質をクエン酸−リン酸緩衝液で希釈し且つ
エリザプレートを用いて室温で１０分間インキュベート
した。媒質の吸光度をＡ４９０で読み取った。
リーニングするために、エリザプレートを、非結合１８
マーペプチド、ＫＬＨ（免疫原）に結合したペプチドま
たはＢＳＡに結合したペプチド２０μｇ／ｍｌで４℃に
おいて被覆した。脾臓細胞融合前の被免疫マウスからの
血液またはハイブリドーマ培養上澄みをＰＢＳ−トウィ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で１：１０に希釈した後、続
いて連続２倍希釈を行なった。その希釈を、調製された
エリザプレート中において室温で１時間インキュベート
した。西洋ワサビ大根ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリンまたはウサギ抗マウスＩｇＧ抗体をＰ
ＢＳ−トウィーンで希釈し且つエリザプレートを用いて
１時間インキュベートした。Ｏ−フェニレンジアミン二
塩酸塩酵素基質をクエン酸−リン酸緩衝液で希釈し且つ
エリザプレートを用いて室温で１０分間インキュベート
した。媒質の吸光度をＡ４９０で読み取った。
【００２９】融合から得られたハイブリドーマをクロー
ン化し且つエリザでのペプチド：ＫＬＨとの反応性に基
づいて増殖させた。クローンＭＡＬ １８−２７は、非
結合ペプチドおよび結合ペプチド双方と反応性の唯一の
クローンであり、生じた抗体はＫＬＨよりもむしろペプ
チドに特異的であることを示すことが分かった。更に、
ＭＡＬ １８−２７は、それが、エリザにおいて１０マ
ーおよび／または２１マーと更に反応しなかった試験さ
れた唯一のクローンであったように、１８マー特異性で
あることが分かった。クローンＭＡＬ １８−２７のイ
ソタイプ検定は、ＩｇＧｌｋイソタイプであるように生
産された抗体を示した。
ン化し且つエリザでのペプチド：ＫＬＨとの反応性に基
づいて増殖させた。クローンＭＡＬ １８−２７は、非
結合ペプチドおよび結合ペプチド双方と反応性の唯一の
クローンであり、生じた抗体はＫＬＨよりもむしろペプ
チドに特異的であることを示すことが分かった。更に、
ＭＡＬ １８−２７は、それが、エリザにおいて１０マ
ーおよび／または２１マーと更に反応しなかった試験さ
れた唯一のクローンであったように、１８マー特異性で
あることが分かった。クローンＭＡＬ １８−２７のイ
ソタイプ検定は、ＩｇＧｌｋイソタイプであるように生
産された抗体を示した。
【００３０】それが所望の特異性を実証したので、クロ
ーンＭＡＬ １８−２７を更にサブクローン化した。こ
れらのサブクローンの内の二つであるＭＡＬ １８−２
７．２．３．１およびＭＡＬ １８−２７．２．３．
１．２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル、メリーランド州
に、１９９２年９月３日寄託の受託番号ＨＢ１１１１１
および１９９２年９月３日寄託のＨＢ１１１１２として
それぞれ寄託された。
ーンＭＡＬ １８−２７を更にサブクローン化した。こ
れらのサブクローンの内の二つであるＭＡＬ １８−２
７．２．３．１およびＭＡＬ １８−２７．２．３．
１．２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル、メリーランド州
に、１９９２年９月３日寄託の受託番号ＨＢ１１１１１
および１９９２年９月３日寄託のＨＢ１１１１２として
それぞれ寄託された。
【００３１】ＭＡＬ １８−２７．２．３．１．２の親
クローンである単クローン性抗体ＭＡＬ １８−２７．
２．３．１を、固相ディプスティック免疫検定において
試験した。イムノキャピラリーディプスティック装置
は、プラスチック裏地ストリップに積層された７ｍｍ幅
で２５ｍｍ長さのニトロセルロースのストリップ（シュ
ライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キーン、ニューハンプシャー
州）から成った。７ｍｍ幅で５ｃｍ長さのガラス繊維の
ストリップ（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）、アン・アーバ
ー、ミシガン州）を更にプラスチック裏材料に積層し
て、ガラス繊維がニトロセルロースの上端と接触してお
り且つ僅かに重なっているようにした。単クローン性抗
体ＭＡＬ １８−２７．２．３．１の１μｇを、ニトロ
セルロースストリップのほぼ中間点にある線の形でニト
ロセルロース上にスポットした。線から約６ｍｍ上に、
単離されたＨＲＰ−ＩＩ抗原０．１７μｇをニトロセル
ロース上に破線でスポットした。ＨＲＰ−ＩＩ抗原は免
疫検定において陽性対照として役立った。
クローンである単クローン性抗体ＭＡＬ １８−２７．
２．３．１を、固相ディプスティック免疫検定において
試験した。イムノキャピラリーディプスティック装置
は、プラスチック裏地ストリップに積層された７ｍｍ幅
で２５ｍｍ長さのニトロセルロースのストリップ（シュ
ライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キーン、ニューハンプシャー
州）から成った。７ｍｍ幅で５ｃｍ長さのガラス繊維の
ストリップ（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）、アン・アーバ
ー、ミシガン州）を更にプラスチック裏材料に積層し
て、ガラス繊維がニトロセルロースの上端と接触してお
り且つ僅かに重なっているようにした。単クローン性抗
体ＭＡＬ １８−２７．２．３．１の１μｇを、ニトロ
セルロースストリップのほぼ中間点にある線の形でニト
ロセルロース上にスポットした。線から約６ｍｍ上に、
単離されたＨＲＰ−ＩＩ抗原０．１７μｇをニトロセル
ロース上に破線でスポットした。ＨＲＰ−ＩＩ抗原は免
疫検定において陽性対照として役立った。
【００３２】ニトロセルロースの下端を、溶解全血、血
清または血漿の試料５０μｌが入っている浅いウェルに
入れて、試料液がニトロセルロース中に吸上し且つ固定
化抗体と接触するようになり、そして試料中に存在する
ＨＲＰ−ＩＩ抗原を結合させるようにした。閉じ込めら
れたスルホロダミンＢと一緒にリポソーム中に取込まれ
た免疫原ペプチドに対して生じたウサギ多クローン性抗
体を含むトレーサー試薬の１滴をウェルニ入れ且つニト
ロセルロース中に吸上させた。トレーサー試薬は、更
に、固定化された単クローン性抗体と複合した試料抗原
に対して接触し且つ結合されるようになった。次に、
０．１２５％ツヴィッタージェント３−１０（カルビオ
ケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラホヤ、カリホルニア
州）を含む洗浄試薬をニトロセルロース中に吸上させ
た。
清または血漿の試料５０μｌが入っている浅いウェルに
入れて、試料液がニトロセルロース中に吸上し且つ固定
化抗体と接触するようになり、そして試料中に存在する
ＨＲＰ−ＩＩ抗原を結合させるようにした。閉じ込めら
れたスルホロダミンＢと一緒にリポソーム中に取込まれ
た免疫原ペプチドに対して生じたウサギ多クローン性抗
体を含むトレーサー試薬の１滴をウェルニ入れ且つニト
ロセルロース中に吸上させた。トレーサー試薬は、更
に、固定化された単クローン性抗体と複合した試料抗原
に対して接触し且つ結合されるようになった。次に、
０．１２５％ツヴィッタージェント３−１０（カルビオ
ケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ラホヤ、カリホルニア
州）を含む洗浄試薬をニトロセルロース中に吸上させ
た。
【００３３】陽性試料において、染料はニトロセルロー
スの中間点に線で目に見えて、陽性検定を示した。中間
点より６ｍｍ上の破線は、更に、標識された多クローン
性抗体を固定して、装置および試薬が正しく働いたこと
を示した。
スの中間点に線で目に見えて、陽性検定を示した。中間
点より６ｍｍ上の破線は、更に、標識された多クローン
性抗体を固定して、装置および試薬が正しく働いたこと
を示した。
【００３４】寄生虫４０個／μｌの血漿（０．０００８
％寄生虫血に対応する）を有する一人の患者は、ディプ
スティック検定において明確な１＋の陽性反応を示し
た。全血試料中に寄生虫２個／１００個（白血球）
（０．００３％寄生虫血に対応する）を有する二人の患
者は，ディプスティック検定において極めて強い３−４
＋の陽性反応を示した。
％寄生虫血に対応する）を有する一人の患者は、ディプ
スティック検定において明確な１＋の陽性反応を示し
た。全血試料中に寄生虫２個／１００個（白血球）
（０．００３％寄生虫血に対応する）を有する二人の患
者は，ディプスティック検定において極めて強い３−４
＋の陽性反応を示した。
【００３５】実施例２ 単クローン性抗体ＭＡＬ １８−２７．２．３．１のペ
プチド抗原に対する力価を、抗体特異性の尺度としてＭ
ＡＢ ８７−２Ｇ１２（ＷＯ８９／０１７８５）と比較
した。９６ウェル微量滴定プレートの各ウェルをペプチ
ド抗原の０．１Ｍ炭酸緩衝液中２０μｇ／ｍｌ溶液、ｐ
Ｈ９．６の５０μｌで被覆し且つ３７℃でカバーをして
一晩中インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５
％トウィーン２０緩衝液２００μｌで５回洗浄した。プ
ロテインＧで精製した単クローン性抗体をウェル中に
（５０μｌ／ウェル）、タンパク質濃度２０μｇ／ｍｌ
で開始して連続希釈した。抗体を固定化抗原に対して３
７℃でカバーをして１時間結合させ、そしてウェルをＰ
ＢＳ−０．０５％トウィーン２０緩衝液２００μｌで５
回洗浄した。
プチド抗原に対する力価を、抗体特異性の尺度としてＭ
ＡＢ ８７−２Ｇ１２（ＷＯ８９／０１７８５）と比較
した。９６ウェル微量滴定プレートの各ウェルをペプチ
ド抗原の０．１Ｍ炭酸緩衝液中２０μｇ／ｍｌ溶液、ｐ
Ｈ９．６の５０μｌで被覆し且つ３７℃でカバーをして
一晩中インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５
％トウィーン２０緩衝液２００μｌで５回洗浄した。プ
ロテインＧで精製した単クローン性抗体をウェル中に
（５０μｌ／ウェル）、タンパク質濃度２０μｇ／ｍｌ
で開始して連続希釈した。抗体を固定化抗原に対して３
７℃でカバーをして１時間結合させ、そしてウェルをＰ
ＢＳ−０．０５％トウィーン２０緩衝液２００μｌで５
回洗浄した。
【００３６】西洋ワサビ大根ペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ（オルガノン・テクニ
カ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）、ダーラム、ノ
ース・カロライナ州）を、ＰＢＳ−０．０５％トウィー
ン２０緩衝液中の希釈度１：８，０００で５０μｌ／ウ
ェル加え且つ３７℃でカバーをして１時間インキュベー
トした。ウェルを前記のように洗浄し、そしてＯ−フェ
ニレンジアミン二塩酸塩（酵素基質）５０μｌを室温で
１０分間加えた。４．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ／ウ
ェル加えることによってその酵素反応を止めた。
Ｐ）で標識したヤギ抗マウスＩｇ（オルガノン・テクニ
カ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）、ダーラム、ノ
ース・カロライナ州）を、ＰＢＳ−０．０５％トウィー
ン２０緩衝液中の希釈度１：８，０００で５０μｌ／ウ
ェル加え且つ３７℃でカバーをして１時間インキュベー
トした。ウェルを前記のように洗浄し、そしてＯ−フェ
ニレンジアミン二塩酸塩（酵素基質）５０μｌを室温で
１０分間加えた。４．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ／ウ
ェル加えることによってその酵素反応を止めた。
【００３７】力価は、１．００のＯＤ４９０を与える抗
体濃度として計算された。Ｍａｂ８７−２Ｇ１２は、２
０μｇ／ｍｌでＯＤ読み約０．４２を結果として生じ、
２０μｇ／ｍｌより大の力価が１．００のＯＤ読みに必
要であろうということを示した。対照的に、本発明の単
クローン性抗体ＭＡＬ １８−２７．２．３．１は力価
１．７９μｇ／ｍｌを有しており、したがって、ペプチ
ド抗原に関する有意に一層高い特異的活性を示す。すな
わち、１．００のＯＤ単位の強さの一定量のペプチドを
決定するには、２０μｇ／ｍｌより大のＭａｂ ２Ｇ１
２と比較したところ、ＭＡＬ １８−２７．２．３．１
は１．７９μｇ／ｍｌしか必要とされない。
体濃度として計算された。Ｍａｂ８７−２Ｇ１２は、２
０μｇ／ｍｌでＯＤ読み約０．４２を結果として生じ、
２０μｇ／ｍｌより大の力価が１．００のＯＤ読みに必
要であろうということを示した。対照的に、本発明の単
クローン性抗体ＭＡＬ １８−２７．２．３．１は力価
１．７９μｇ／ｍｌを有しており、したがって、ペプチ
ド抗原に関する有意に一層高い特異的活性を示す。すな
わち、１．００のＯＤ単位の強さの一定量のペプチドを
決定するには、２０μｇ／ｍｌより大のＭａｂ ２Ｇ１
２と比較したところ、ＭＡＬ １８−２７．２．３．１
は１．７９μｇ／ｍｌしか必要とされない。
【００３８】第二の比較において、ＭＡＬ １８−２
７．２．３．１の抗原力価をＭａｂ８７−１Ｅ１（ＷＯ
８９／０１７８５）に対して試験した。ウェルを、プ
ロテインＧで精製した単クローン性抗体（０．１Ｍ炭酸
緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）５μｌ／ウェルによって４℃
で一晩中被覆した。プレートをバイオテク（Ｂｉｏｔｅ
ｃ）ＥＬ４０３自動９６ウェル洗浄器で５回洗浄した。
ペプチド抗原を、微量滴定プレートの被覆ウェル中に連
続希釈し（５０μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌで開始す
る）且つ３７℃で１時間カバーをして振とうしながらイ
ンキュベートした。プレートを再度バイオテク洗浄器で
５回洗浄した。
７．２．３．１の抗原力価をＭａｂ８７−１Ｅ１（ＷＯ
８９／０１７８５）に対して試験した。ウェルを、プ
ロテインＧで精製した単クローン性抗体（０．１Ｍ炭酸
緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）５μｌ／ウェルによって４℃
で一晩中被覆した。プレートをバイオテク（Ｂｉｏｔｅ
ｃ）ＥＬ４０３自動９６ウェル洗浄器で５回洗浄した。
ペプチド抗原を、微量滴定プレートの被覆ウェル中に連
続希釈し（５０μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌで開始す
る）且つ３７℃で１時間カバーをして振とうしながらイ
ンキュベートした。プレートを再度バイオテク洗浄器で
５回洗浄した。
【００３９】検出器抗体の溶液１０μｇ／ｍｌをＰＢＳ
−０．０５％トウィーン２０緩衝液中で調製し、５０μ
ｌ／ウェルを抗原捕捉プレートに対して加えた。プレー
トを３７℃で１時間カバーをして振とうしながらインキ
ュベートした。双方のエリザをそれらの最大検出能力ま
で最適化することを確実にするために、単クローン性検
出器抗体をＭａｂ ８７１Ｅ１の検定に用いたが、実施
例１に記載されたウサギ多クローン性検出器抗体はＭＡ
Ｌ １８−２７．２．３．１を検定するのに用いた。
−０．０５％トウィーン２０緩衝液中で調製し、５０μ
ｌ／ウェルを抗原捕捉プレートに対して加えた。プレー
トを３７℃で１時間カバーをして振とうしながらインキ
ュベートした。双方のエリザをそれらの最大検出能力ま
で最適化することを確実にするために、単クローン性検
出器抗体をＭａｂ ８７１Ｅ１の検定に用いたが、実施
例１に記載されたウサギ多クローン性検出器抗体はＭＡ
Ｌ １８−２７．２．３．１を検定するのに用いた。
【００４０】捕捉抗体としてＭａｂ ８７１Ｅ１を用い
ると、平均ＯＤ読み１．０を与えるのにペプチド抗原約
１４４μｇ／ｍｌを必要とした。捕捉抗体としてＭＡＬ
１８−２７．２．３．１を用いると、平均ＯＤ読み
１．０にはペプチド抗原０．８〜１．２μｇ／ｍｌのみ
を必要とした。これらの結果は、本発明の抗体を用いる
検定における有意に一層高い感度を実証している。
ると、平均ＯＤ読み１．０を与えるのにペプチド抗原約
１４４μｇ／ｍｌを必要とした。捕捉抗体としてＭＡＬ
１８−２７．２．３．１を用いると、平均ＯＤ読み
１．０にはペプチド抗原０．８〜１．２μｇ／ｍｌのみ
を必要とした。これらの結果は、本発明の抗体を用いる
検定における有意に一層高い感度を実証している。
【００４１】実施例３ 単クローン性抗体ＭＡＬ １８−２７．２．３．１．２
を、従来記載されたディプスティック検定形式を用いる
熱帯熱マラリア原虫感染の診断薬として商業的に入手可
能な診断試験（ＱＢＣ、ベクトン・ディキンソン・アド
バンスト・ダイアグノスティクス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ）、ボルチモア、メリーランド州）と比較して臨
床的に試験した。ＱＢＣの結果は薄膜の顕微鏡分析によ
って確証された。全試験を、２〜２４時間熟成され且つ
冷蔵下で保存された抗凝血処理済み静脈血試料で実施し
た。更に、試験を３つの試料で４日後に実施した。
を、従来記載されたディプスティック検定形式を用いる
熱帯熱マラリア原虫感染の診断薬として商業的に入手可
能な診断試験（ＱＢＣ、ベクトン・ディキンソン・アド
バンスト・ダイアグノスティクス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ）、ボルチモア、メリーランド州）と比較して臨
床的に試験した。ＱＢＣの結果は薄膜の顕微鏡分析によ
って確証された。全試験を、２〜２４時間熟成され且つ
冷蔵下で保存された抗凝血処理済み静脈血試料で実施し
た。更に、試験を３つの試料で４日後に実施した。
【００４２】１２個の試料はＱＢＣによって陽性であっ
て、薄膜もディプスティック検定において陽性であっ
た。これらの試料の一つは、生殖母細胞のみを示す患者
由来であった。ディプスティック検定は、薄膜上に３個
だけの寄生虫が見られた一つの寄生虫血を含む０．１％
未満の寄生虫血に陽性であった。
て、薄膜もディプスティック検定において陽性であっ
た。これらの試料の一つは、生殖母細胞のみを示す患者
由来であった。ディプスティック検定は、薄膜上に３個
だけの寄生虫が見られた一つの寄生虫血を含む０．１％
未満の寄生虫血に陽性であった。
【００４３】５日間追跡された一人の患者は、薄膜上に
おいて希なトロホブラストに続いて希な生殖母細胞に進
行した４％の初期寄生虫血を示した。しかしながら、各
段階でのディプスティック検定は明らかに陽性であっ
た。
おいて希なトロホブラストに続いて希な生殖母細胞に進
行した４％の初期寄生虫血を示した。しかしながら、各
段階でのディプスティック検定は明らかに陽性であっ
た。
【００４４】２１人の患者試料はＱＢＣによって陰性で
あって、薄膜はディプスティック検定によって試験され
た。熱帯熱マラリア原虫マラリアが証明されたこれらの
患者の内の３人は、静脈内キニーネ療法によって治療さ
れた。３日後、それらのＱＢＣおよび薄膜は陰性のまま
であったが、患者はディプスティック検定に関して６日
間程の長期間陽性であった。
あって、薄膜はディプスティック検定によって試験され
た。熱帯熱マラリア原虫マラリアが証明されたこれらの
患者の内の３人は、静脈内キニーネ療法によって治療さ
れた。３日後、それらのＱＢＣおよび薄膜は陰性のまま
であったが、患者はディプスティック検定に関して６日
間程の長期間陽性であった。
【００４５】これらの結果は、１８マーペプチドに対し
て生じた抗体が、一般的に診断に用いられる抗熱帯熱マ
ラリア原虫抗体と比較したところ、臨床試験において特
異性および感度を増大させたことを実証している。
て生じた抗体が、一般的に診断に用いられる抗熱帯熱マ
ラリア原虫抗体と比較したところ、臨床試験において特
異性および感度を増大させたことを実証している。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ） 配列 Cys Gly Ala His His Ala His His Ala Ala Asp Ala His His Ala Ala Asp Ala 1 5 10 15
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/04 6807−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ハンス・エイチ・フェイント アメリカ合衆国メリーランド州21120，パ ークトン，プリティーボーイ・ガース ９ (72)発明者 ジェラルド・ドゥエイン・ハン アメリカ合衆国メリーランド州21144，サ ヴァーン，ゴールデン・パイン・サークル 7862 (72)発明者 キース・ウィソーヴェン アメリカ合衆国メリーランド州21794，ウ エスト・フレンドシップ，ワインフィール ド・ロード 2671
Claims (21)
- 【請求項１】 免疫検定によって血液中の０．０５％未
満の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）寄生虫血の検出を可能にする、特異
性および親和性によって熱帯熱マラリア原虫の富ヒスチ
ジンタンパク質ＩＩに対して結合する単クローン性抗
体。 - 【請求項２】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１１１を有す
るハイブリドーマによって生産された単クローン性抗
体。 - 【請求項３】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１１２を有す
るハイブリドーマによって生産された単クローン性抗
体。 - 【請求項４】 配列番号１のアミノ酸配列を有するペプ
チド。 - 【請求項５】 配列番号１のアミノ酸配列を有するペプ
チドを用いて動物を免疫し、被免疫動物からハイブリド
ーマを生産し、そして単クローン性抗体を生産するクロ
ーンを選択する方法によって生産された、配列番号１の
アミノ酸配列を有するペプチドに対して結合する単クロ
ーン性抗体。 - 【請求項６】 熱帯熱マラリア原虫の富ヒスチジンタン
パク質ＩＩに対して結合する単クローン性抗体および生
理的に許容しうる媒質を含む薬剤組成物であって、該抗
体が、免疫検定において血液中の０．０５％未満の熱帯
熱マラリア原虫寄生虫血の検出を可能にするタンパク質
に対して特異性および親和性を有する上記の薬剤組成
物。 - 【請求項７】 抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１１
１またはＨＢ１１１２を有するハイブリドーマによって
生産された抗体である請求項６に記載の組成物。 - 【請求項８】 配列番号１のアミノ酸配列を有するペプ
チドおよび生理的緩衝液を含む組成物。 - 【請求項９】 ペプチドが免疫原性担体に対して結合し
ている請求項８に記載の組成物。 - 【請求項１０】 アジュバントを更に含む請求項９に記
載の組成物。 - 【請求項１１】 熱帯熱マラリア原虫のＨＲＰ−ＩＩを
検出する方法であって、 （ａ）試料と、ＨＲＰ−ＩＩに対して結合する単クロー
ン性抗体とを接触させるが、その際、該抗体は、免疫検
定において血液中の０．０５％未満の熱帯熱マラリア原
虫寄生虫血の検出を可能にするＨＲＰ−ＩＩに特異性お
よび親和性を有し； （ｂ）該抗体をＨＲＰ−ＩＩに対して結合させて抗体／
ＨＲＰ−ＩＩ複合体を生成し、そして； （ｃ）該複合体中に含まれる検出可能な標識によってＨ
ＲＰ−ＩＩを検出する工程を含む上記の方法。 - 【請求項１２】 ＨＲＰ−ＩＩを固相上で検出する請求
項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ＨＲＰ−ＩＩをイムノキャピラリー固
相上で検出する請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 ＨＲＰ−ＩＩを、ＨＲＰ−ＩＩに対し
て結合する第二抗体によって検出し、該第二抗体が検出
可能な標識に対して結合している請求項１１または１３
に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＨＲＰ−ＩＩを、第二抗体に結合した
リポソームによって検出し、該リポソームが可視染料を
封入している請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 ＨＲＰ−ＩＩおよび標識に対して結合
したＨＲＰ−ＩＩが、抗体に対する結合に関して拮抗す
る請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１７】 熱帯熱マラリア原虫のＨＲＰ−ＩＩに
対して結合する抗体を製造する方法であって、 （ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドで哺
乳動物を免疫し、そして； （ｂ）免疫検定において血液中の約０．０５％未満の熱
帯熱マラリア原虫寄生虫血の検出を可能にする、特異性
および親和性を有するＨＲＰ−ＩＩに対して結合する単
クローン性抗体を単離する工程を含む上記の方法。 - 【請求項１８】 微孔性吸収材料を第二吸収材料と流動
連通して含む免疫検定装置であって、該微孔性吸収材料
が、免疫検定において血液中の０．０５％未満の熱帯熱
マラリア原虫寄生虫血の検出を可能にする、特異性およ
び親和性を有する熱帯熱マラリア原虫のＨＲＰ−ＩＩに
対して結合する単クローン性抗体をその上に固定化して
有する上記の免疫検定装置。 - 【請求項１９】 微孔性吸収材料がニトロセルロースで
あり且つ第二吸収材料がガラス繊維である請求項１８に
記載の免疫検定装置。 - 【請求項２０】 ＨＲＰ−ＩＩ抗原を含む陽性対照区域
を含む請求項１９に記載の免疫検定装置。 - 【請求項２１】 熱帯熱マラリア原虫のＨＲＰ−ＩＩに
関するエンザイムリンクドイムノアッセイの実施用材料
のキットであって、 （ａ）請求項１８に記載の検定装置、および； （ｂ）ＨＲＰ−ＩＩに対する多クローン性抗体に結合し
たリポソームであって、可視染料を封入している該リポ
ソームを含む試薬を含む上記のキット。
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