JP5492366B2 - 炭水化物欠失トランスフェリン(cdt)特異的抗体、その製造および使用 - Google Patents
炭水化物欠失トランスフェリン(cdt)特異的抗体、その製造および使用 Download PDFInfo
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Description
驚くべきことには、前記目的は、水溶液中でCDTと選択的に結合し、CDTを固相に結合させることを必要としない抗体を提供することによって達成された。エピトープマッピング実験を用いて、従来技術の抗体とは対照的に、本発明の抗体はCDT配列の異なるセグメントに同時に結合することが判明した。このことから、本発明の抗体が認識するエピトープは不連続エピトープであるということが推論された。
選択的な結合とは、本発明の場合、一方のCDTと他方のヒトトランスフェリンとの間の識別を明瞭に可能にする十分に特異的な結合または実質的に特異的な結合を意味する。
(1)VVARSMGGKEDLIWELL、および
(2)TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF、および
(3)SKLSMGSGLNLSEPN、および
(4)YEKYLGEEYVKAV。
本発明はさらに、その結合が、前述の配列の(1)から(4)のセグメントの3つまたは2つの領域でのみ発生するタイプの抗体に関する。
特に好ましいモノクローナル抗体は、ブダペスト条約に基づいてDSMZ(Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Germany)に寄託された(寄託日:2002年4月16日)、以下の細胞培養によって産生される抗体である:
細胞培養01−102/01 寄託番号:DSM ACC2541
細胞培養98−84/011 寄託番号:DSM ACC2540
抗原結合フラグメント、例えばFab、Fab′、FvまたはF(ab′)2フラグメントもまた本発明にしたがって用いることができる(前記フラグメントは当業者に公知の方法によって前述の本発明の抗体から製造できる)。
(1)VVARSMGGKEDLIWELL、および
(2)TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF、および
(3)SKLSMGSGLNLSEPN、および
(4)YEKYLGEEYVKAV
の領域で発生する抗体を産生するハイブリッド細胞クローンを選別し、続いて、前記のように選別したハイブリッド細胞クローンから最終的には当業者に公知の方法により抗体を得る。
前述のイムノアッセイを実施することを目的とする検査キットも同様に本発明の特徴であり、前記キットは、本発明の抗体または本発明の抗体フラグメントを含む。
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。これら実施例は、もっぱら本発明の個々の特徴を例示により詳述するために用いられ、制限と解されてはならない。
ヒト血清(正常血清およびアルコール中毒患者血清)からトランスフェリンをアフィニティー精製するために、120mgの抗ヒトトランスフェリン(Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Germany)を0.8gのCNBr活性化セファロースCL−4Bとカップリングさせてアフィニティー支持体を調製した。120mgの抗ヒトトランスフェリンを0.1MのNaHCO3溶液に対して透析する。0.8gのセファロースCL−4B(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany)を0.1MのNaHCO3溶液で洗浄し、さらに冷却しながら1.28gの臭化シアン(5mLのアセトニトリルに溶解)を添加する。懸濁物をpH11で4℃15分攪拌する。続いて前記懸濁物を0.1MのNaHCO3溶液で十分に洗浄する。前記活性化セファロースを0.1MのNaHCO3溶液に懸濁し、さらに前記の調製抗体溶液を添加して室温で6時間インキュベートする。前記のようにして調製した抗ヒトトランスフェリンセファロースをpH7.2のリン酸緩衝食塩水で洗浄し、リン酸緩衝食塩水(pH7.2)+NaN3(1g/L)中で使用まで保存する。
ヒト血清からトランスフェリンをアフィニティー精製するために、実施例1で調製した抗ヒトトランスフェリンセファロースをガラスのカラムに充填し、100mLのリン酸緩衝食塩水(pH7.2)+NaN3(1g/L)で洗浄した。10mLのヒト血清(正常血清およびアルコール中毒患者血清)を流速0.5mL/分でカラムにロードし、さらに、50mLのリン酸緩衝食塩水(pH7.2)+NaN3(1g/L)、50mLのNaCl溶液(1M)および50mLの水でカラムを洗浄して非結合タンパク質を除去する。結合トランスフェリンは50mLのグリシン溶液(0.5M)(塩酸でpH2.5に調節)で溶出させ、直ちに固体のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを添加して中和し、リン酸緩衝食塩水(pH7.2)+NaN3(1g/L)に対して透析する。
a)リコンビナント非糖化ヒトトランスフェリン
リコンビナント非糖化トランスフェリンは、通常の遺伝子操作法および分子生物学を用いて調製する。前記は以下の文献に記載されている:Mason et al.(1993) Biochemistry, 32:5472-5379。
b)ヒトトランスフェリンの酵素による脱糖化反応
60mgのヒトトランスフェリン(例えば以下から入手:Calbiochem -Novabiochem GmbH, Bad Soden, Germany)を、10mMのEDTAおよび1g/L(w/v)のデシル硫酸ナトリウム(Fluka, order No. 71443)を含む8mLのリン酸緩衝食塩水(pH7.2)に溶解する。前記のようにして調製したトランスフェリン溶液を水浴中で37℃に加温し、NグリコシダーゼF(Roche, order No. 1365193)180単位(3単位/mgトランスフェリン)を添加する。前記混合物を水浴中で37℃で17時間インキュベートする。脱糖化反応の完了はSDS−PAGEで調べる(Duan et al.(1998) Applied Biochemistry and Biotechnology, 69:217-224)。
従来技術によるモノクローナル抗体の調製は、欧州特許第605627B1号に記載されたように、トランスフェリン特異的ペプチド配列P1およびP2を用いて免疫することによって実施される。以下のハイブリッド/モノクローナル抗体が得られた:
01−32/062 抗P1
00−177/012 抗P1
00−187/016 抗P2
00−187/027 抗P2
a)マウスの免疫
完全フロイントアジュバント中の非糖化トランスフェリン20μgでBALB/cマウスの各々を腹腔内免疫した。ブースターは、4週間後に各々のマウスに不完全フロイントアジュバント(ICN Biomedical GmbH, Eschwege, Germany)中の20μgの非糖化トランスフェリンを、さらに8週間後に各々にフロイントアジュバントを含まない20μgの非糖化トランスフェリンを投与して実施した。融合前の最後の3日間に、マウスに静脈内ブースターとして各々に20μgの非糖化トランスフェリンを投与した。
マウスをCO2吸入によって殺した後、脾臓を取り出し、血清を含まないダルベッコー改変イーグル培養液(DMEM)(CC Pro GmbH, Neustadt/W, Germany)中の単一細胞懸濁液を調製した。細胞を遠心分離し(652g)、DMEMで2回洗浄した。続いて細胞数をトリパンブルー染色によって決定した。2×107のミエローマ細胞(Sp2/0)を約108の脾臓細胞に添加した。遠心分離(360g)した後、上清を廃棄し、1mLのポリエチレングリコール溶液(PEG400、DMEM中で約50%の濃度)(Merck Eurolab, Bruchsal, Germany)を前記細胞ペレットに添加し、再度懸濁させた後37℃で1分インキュベートした。続いて約10mLのDMEMを一滴ずつ添加し、さらに前記混合物を室温で2〜4分インキュベートした。融合細胞を遠心分離し(326g)、ペレットをDMEM+20%FCS(ウシ胎児血清)(Biowhittaker Europe, Verviers, Belgium)+HAT溶液(CC Pro GmbH, Neudstadt/W, Germany)中に再懸濁し、24ウェルの細胞培養プレート(Costar)に導入した。ウェル当たりのおおよその細胞濃度は5×104〜5×106細胞であった。
2〜3週間後に、得られた細胞コロニー(ハイブリッド)を取り出し新しい培養プレートに移した。
免疫抗原被覆マイクロタイタープレート(Nunc, タイプB)(コーティング1μg/mL、約0.015μg/ウェル)を用いて、細胞培養中に放出された抗体の特異性を第一の検査工程で検査した。
100μLの細胞培養上清(1:2希釈)をマイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで加え、+15℃〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液POD(OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany)で2回洗浄した後、100μLの抗マウスIgG/F(ab′)2−POD共役物(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、続いて+15℃〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートをさらに2回洗浄した後、100μLの色素原TMB溶液(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、+15℃〜+25℃でさらに30分インキュベートした。前記インキュベーションの後、100μLの停止溶液POD(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをBEPII(Behring ELISA Processor II; Dade Behring, Harburg, Germany)で450nmで調べた。
結果は表1に示す。
本発明の抗体(非糖化ヒトトランスフェリンと結合するが、ヒトトランスフェリンとは結合しない)を産生するハイブリッドの単細胞をマイクロマニピュレーター(Leitz, Wetzlar, Germany)を用いてクローニングした。このようにして得たクローン98−84/011および01−102/01を2002年4月16日に下記の機関に寄託した:DSMZ Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Brunswick, Germany)。受託番号DSM ACC2540(98−84/011)およびDSM ACC2541(01−102/01)。
抗体98−84/011および01−102/01のサブクラスをアイソストリップ(IsoStrip(登録商標))マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット(Boehringer Mannheim, Germany)を用いて調べ、98−84/011および01−102/01はIgG1と決定された。
大量の抗体を製造するために、適当な細胞クローンをローラーボトル(Corning Costar Deutschland, Bodenheim)に移し、+37℃で所望の最終容積に増殖させた。続いて前記ローラー培養浮遊液の0.22μmろ過を実施して細胞を除去する。前記抗体溶液(この時点で細胞を含まない)を限外ろ過により濃縮し(分離限界30000ダルトン)、続いて精製する。
得られた抗体溶液を再度0.14Mのリン酸緩衝液(pH8.6)で処理し、r−プロテインAセファロースファストフロー(Amersham)を充填したクロマトグラフィーカラムにロードした(精製するべき抗体10mg当たり1mLのr−プロテインAセファロースファストフローを用いた)。0.14Mのリン酸緩衝液(pH8.6)でカラムを洗浄して全ての非結合成分を除去する。結合抗体は0.1Mのクエン酸(pH3.0)でカラムから溶出させ、以下に対して透析する:0.05M酢酸ナトリウム+0.5MのNaCl+0.05Mのトリス+0.01%のアジ化ナトリウム(pH7.0)。
得られた抗体の特異性は以下を用いてテストした:a)非糖化トランスフェリンで被覆したマイクロタイタープレート(Nunc, タイプB)(コーティング1μg/mL、約0.015μg/ウェル)、b)ヒトトランスフェリンで被覆したマイクロタイタープレート(Nunc, タイプB)(コーティング1μg/mL、約0.015μg/ウェル)、c)ペプチドP1で被覆したマイクロタイタープレート(Nunc, タイプB)(コーティング3μg/mL、約0.045μg/ウェル)、およびd)ペプチドP2で被覆したマイクロタイタープレート(Nunc, タイプB)(コーティング3μg/mL、約0.045μg/ウェル)。
結果は表2に示されている。
a)マイクロタイタープレート(Nunc, タイプB)を本発明のモノクローナル抗体および従来技術のモノクローナル抗体で被覆した。コーティング濃度は1μg/mL、約0.015μg/ウェル。
200μg/mLから出発した二倍段階希釈の、a)ヒトトランスフェリン、b)酵素により脱糖化処理したヒトトランスフェリン、c)正常血清由来ヒトトランスフェリンおよびd)アルコール中毒患者血清由来ヒトトランスフェリンの100μLをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで加え、+15℃〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液POD(OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany)で2回洗浄した後、100μLの抗ヒトトランスフェリン−POD共役物(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、続いて+15℃〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートをさらに2回洗浄した後、100μLの色素原TMB溶液(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、+15℃〜+25℃でさらに30分インキュベートした。前記インキュベーションの後、100μLの停止溶液POD(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをBEPII(Behrlng ELISA Processor II; Dade Behring, Marburg, Germany)で450nmで調べた。
結果は表3.1および3.2に示されている。
1:10希釈から出発した二倍段階希釈の、a)正常血清およびd)アルコール中毒患者血清の100μLをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで加え、+15℃〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液POD(OSEW; Dade Behring, Marburg, Germany)で2回洗浄した後、100μLの抗ヒトトランスフェリン−POD共役物(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、続いて+15℃〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートをさらに2回洗浄した後、100μLの色素原TMB溶液(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、+15℃〜+25℃でさらに30分インキュベートした。前記インキュベーションの後、100μLの停止溶液POD(Dade Behring, Marburg, Germany)を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをBEPII(Behring ELISA Processor II; Dade Behring, Marburg, Germany)で450nmで調べた。
結果は表4に示されている。
ヒトトランスフェリン配列に由来するオーバーラップペプチド(13量体ペプチド、11アミノ酸のオーバーラップ)のスキャンは、SPOT合成技術を用いて調製した。前記方法は以下の文献に記載されている:H. Wenschuh et al. (2000) Coherent membrane supports for parallel microsynthesis and screening of bioactive peptides, Biopolymers (Peptide Science), 55:188-206。前記ペプチドはセルロース支持体とそのC末端で結合し、さらにそのN末端に反応性タグを保持する。前記ペプチドを切離しSPOTとして切断した後(96ウェルのマイクロタイタープレート)、活性化ガラスチップに結合させた。これらガラスチップのインキュベーションプロトコルは以下のとおりである:
−TBS緩衝液(pH8.0)で平衡化
−封鎖緩衝液(pH8.0)で2時間
−抗体のインキュベーション(封鎖緩衝液(pH8.0)に3μg/mL)、2時間
−TBS(0.05%トゥイーン20)で洗浄
−封鎖緩衝液(pH8.0)中の抗マウスIgG−PODとインキュベーション、2時間
−TBS(0.05%トゥイーン20)で洗浄、3回、5分
−化学発光の検出(Lumi-Imager, Roche Diagnostics)
−TBS緩衝液(pH8.0)で平衡化
−封鎖緩衝液(pH8.0)で2時間
−抗体のインキュベーション(封鎖緩衝液(pH8.0)に3μg/mL)、2時間
−TBS(0.05%トゥイーン20)で洗浄、3回、5分
−化学発光の検出(Lumi-Imager, Roche Diagnostics)
ペプチド1に対する従来技術の抗体
1.VLAENYNKSDNCE
2. AENYNKSDNCEDT
3. NYNKSDNCEDTPE
4. NKSDNCEDTPEAG
1.VHKILRQQQHLFG
2. KILRQQQHLFGSN
3. LRQQQHLFGSNVT
4. QQQHLFGSNVTDC
5. QHLFGSNVTDCSG
前記認識される配列は免疫に用いられたペプチドと同一である。
1.VVARSMGGKEDLI
2. ARSMGGKEDLIWE
3. SMGGKEDLIWELL
4.TTEDSIAKIMNGE
5. SIAKIMNGEADAM
6. AKIMNGEADAMSL
7. IMNGEADAMSLDG
8. NGEADAMSLDGGF
9.SKLSMGSGLNLSE
10. LSMGSGLNLSEPN
11.YEKYLGEEYVKAV
領域1から3はトランスフェリンのN末端ドメインに位置し、一方4から8、9から10および11はC末端ドメインに位置し、不連続エピトープを示している。
Claims (4)
- 水溶液中で、炭水化物欠失トランスフェリン(CDT)を固相に結合させる必要なく、該CDTと選択的に結合するモノクローナル抗体であって、
当該抗体が寄託番号DSM ACC2540を有する細胞培養によって産生される、モノクローナル抗体。
- 請求項1に記載の抗体の抗原結合フラグメント。
- 以下の工程:請求項1に記載の抗体または請求項2に記載の抗原結合フラグメントをサンプルと接触させ、さらにCDTを含む免疫複合体の生成を定性的または定量的に決定することを含むサンプル中のCDTを検出するイムノアッセイ。
- 請求項1に記載の抗体または請求項2に記載の抗原結合フラグメントを含む、請求項3に記載のイムノアッセイを実施するための検査キット。
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