ES2353212T3 - Inmunoensayo de doxorrubicina. - Google Patents

Inmunoensayo de doxorrubicina. Download PDF

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Abstract

Un inmunoensayo para detectar doxorrubicina en una muestra que comprende proporcionar una mezcla de a) dicha muestra, b) un anticuerpo que es reactivo selectivamente con doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 % y c) un conjugado de un vehículo que tiene un **(Ver fórmula)**en la que Aes =N-O-, o Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional capaz de unirse a dicho vehículo a través de dicho grupo amino o tiol; y p es un número entero de 0 a 1; o un compuesto de fórmula: en la que X, Y y p son como se han definido anteriormente y B es -CH2-o o una mezcla de los mismos; **(Ver fórmula)****(Ver fórmula)**provocando que la doxorrubicina en la muestra y dicho conjugado en dicha mezcla se unan en dicha mezcla con dicho anticuerpo y, después de ello, midiendo la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que se une o separa de dicho anticuerpo, de manera que puede determinarse la presencia de doxorrubicina en la muestra.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de los ensayos inmunológicos para determinar la presencia y/o cuantificar la cantidad de doxorrubicina y metabolitos 5 farmacéuticamente activos en fluidos biológicos humanos con el fin de determinar rápidamente
las concentraciones óptimas del fármaco durante la quimioterapia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
“Cáncer” es un término usado para describir un grupo de malignidades que comparten el rasgo común de desarrollarse cuando empiezan a crecer sin control células en una parte del
10 cuerpo. La mayoría de los cánceres forman tumores, pero también pueden manifestarse en la sangre y circular por otros tejidos en los que crecen. Las malignidades cancerosas se tratan la mayoría de las veces con una combinación de cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento usado para tratar un cáncer específico depende de varios factores que incluyen el tipo de malignidad cancerosa y el estadio durante el que se diagnosticó.
15 La doxorrubicina, también conocida como adriamicina, es uno de los agentes citotóxicos más comunes usados para el tratamiento del cáncer de mama. La adriamicina, que es la sal clorhidrato comercial de doxorrubicina, tiene la fórmula:
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Este compuesto se ha asociado con efectos secundarios debilitantes tales como
20 cardiotoxicidad, mielosupresión, hipersensibilidad, náuseas y vómitos. Mediante el control de los niveles de doxorrubicina en el cuerpo y el ajuste de la dosis, estos efectos secundarios pueden controlarse mejor y limitarse en los pacientes.
Al mismo tiempo, con frecuencia existe una relación muy variable entre la dosis de doxorrubicina y la concentración del fármaco en suero resultante que afecta al efecto 25 terapéutico. El grado de variabilidad farmacocinética intra-e interindividual de la doxorrubicina
puede ser de hasta 5 veces y se ve afectado por muchos factores, que incluyen: ο Función de los órganos ο Regulación genética ο Estado de la enfermedad
ο Edad
ο Interacción fármaco-fármaco
ο Momento de ingestión del fármaco
ο Modo de administración del fármaco, y
ο Administración relacionada con la técnica.
Como resultado de esta variabilidad, dosis iguales del mismo fármaco en diferentes individuos pueden producir resultados clínicos radicalmente diferentes (Hon y col. Clinical Chemistry 44, págs. 388-400, 1998). La eficacia de la misma dosificación de doxorrubicina varía de forma significativa basándose en la eliminación individual del fármaco y la concentración final de fármaco en suero en el paciente. La monitorización de fármacos terapéuticos proporcionaría al médico una perspectiva sobre la variación entre los pacientes de la administración intravenosa de fármacos. Con la monitorización de fármacos terapéuticos podrían individualizarse dosificaciones de fármacos para el paciente, y las probabilidades de tratar eficazmente el cáncer, sin los efectos secundarios indeseados, serían mucho mayores.
Además, la monitorización de fármacos terapéuticos de doxorrubicina serviría como una herramienta excelente para asegurar el cumplimiento de la administración de la quimioterapia con la dosis prescrita real y la obtención de los niveles de concentración en suero eficaces. Se ha descubierto que la variabilidad en la concentración en suero no sólo se debe a factores fisiológicos, sino que también puede deberse a una variación en la técnica de administración.
La monitorización de fármacos terapéuticos rutinaria de la doxorrubicina requeriría la disponibilidad de ensayos automáticos sencillos adaptables a equipos de laboratorio generales. Los ensayos que cumplen mejor estos criterios son inmunoensayos tales como un radioinmunoensayo y un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima. Watanabe T. y col., Tokai J. Exp Clin Med, 1990, Vol. 15, Nº. 4, págs. 327-334. Sin embargo, los anticuerpos correspondientes usados en estos inmunoensayos tienen que demostrar una amplia reactividad cruzada con doxorrubicina, sin ninguna actividad sustancial con metabolitos de doxorrubicina que no son farmacéuticamente activos. Para ser eficaces en el control de los niveles de fármaco de doxorrubicina, el anticuerpo debe tener la máxima especificidad para el compuesto activo, doxorrubicina, y presentar una reactividad cruzada muy baja o nula con los metabolitos que no son farmacéuticamente activos de doxorrubicina, particularmente doxorrubicina aglicona que tiene la fórmula:
imagen1
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con la presente invención, se ha producido una nueva clase de anticuerpos que son sustancialmente reactivos de forma selectiva con doxorrubicina para unirse a 5 doxorrubicina sin ninguna reactividad cruzada sustancial, es decir, menor del 20 % con metabolitos de doxorrubicina que no son farmacéuticamente activos, particularmente doxorrubicina aglicona. Por reactivo de forma selectiva se entiende que este anticuerpo sólo reacciona con la molécula de doxorrubicina farmacéuticamente activa y no reacciona sustancialmente (es decir, presenta una reacción cruzada menor del 20 %) con los metabolitos
10 de doxorrubicina que no son farmacéuticamente activos, siendo los metabolitos de bloqueo más importantes la doxorrubicina aglicona. Se ha descubierto que mediante el uso de inmunógenos que son conjugados de un vehículo inmunogénico que tiene un grupo funcional tiol o amino reactivo con compuestos de
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o, en la que Aes
imagen1
Y es un grupo espaciador orgánico;
20 X es un grupo funcional capaz de unirse a dicho vehículo a través de dicho grupo amino o tiol; y
p es un número entero de 0 a 1;
o compuestos de fórmula:
imagen1
en la que p, Y y X son como se ha indicado anteriormente y B es -CH2-o
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5
o mezclas de los mismos; se producen anticuerpos que son específicos para doxorrubicina y no reaccionan sustancialmente (es decir, presentan una reacción cruzada menor del 20 %) con ni se unen a metabolitos que no son farmacéuticamente activos, particularmente doxorrubicina aglicona. La provisión de estos anticuerpos que reaccionan de una forma sustancialmente 10 selectiva con doxorrubicina y no presentan reacción cruzada (es decir, presentan una reacción cruzada menor del 20 % con metabolitos farmacéuticamente inactivos, particularmente doxorrubicina aglicona) permite producir un inmunoensayo que puede detectar específicamente y controlar la doxorrubicina en las muestras de fluido de pacientes que se están tratando con doxorrubicina. También se incluyen dentro de la presente invención
15 reactivos y kits para dicho inmunoensayo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una nueva clase de anticuerpos que reaccionan de una forma sustancialmente selectiva con doxorrubicina y no reaccionan o presentan reacción cruzada sustancialmente con metabolitos de doxorrubicina
20 farmacéuticamente inactivos mencionados anteriormente en el presente documento (es decir, con una reacción cruzada menor del 20 %). Se ha descubierto que mediante el uso de estos derivados de doxorrubicina 13-oxo sustituidos de fórmula II-A y/o de la doxorrubicina 14-hidroxi sustituida de fórmula II-B o mezclas de los mismos, como inmunógenos, se proporciona esta nueva clase de anticuerpos de la presente invención. Mediante el uso de estos anticuerpos, se
25 ha desarrollado un inmunoensayo, incluyendo reactivos y kits para dicho inmunoensayo para detectar y/o cuantificar la doxorrubicina en sangre, plasma u otras muestras de fluidos corporales. Mediante el uso de este inmunoensayo, puede detectarse y/o cuantificarse la presencia y cantidad de doxorrubicina en muestras de fluido corporal, preferentemente una muestra de sangre o plasma. De esta manera, puede controlarse a un paciente que se está tratando con doxorrubicina durante la terapia y puede ajustarse su tratamiento de acuerdo con dicho control. Por medio de la presente invención, se consigue la monitorización de fármacos terapéuticos de doxorrubicina en pacientes con cáncer que se están tratando con doxorrubicina como agente quimioterapéutico.
Los reactivos usados en el ensayo de la presente invención son conjugados de un vehículo que contiene un grupo tiol o amino reactivo con los compuestos de fórmula II-A y II-B
o mezclas de los mismos. Preferentemente, los vehículos contienen un polímero de poliamina, que contiene un grupo tiol o amino reactivo. En los inmunógenos, los vehículos preferentemente contienen un polímero de poliamina, que contiene un grupo tiol o amino reactivo. Estos conjugados son compañeros de unión competitivos con la doxorrubicina presente en la muestra para la unión con los anticuerpos de la presente invención. Por lo tanto, la cantidad de reactivo conjugado que se une al anticuerpo será inversamente proporcional a la cantidad de doxorrubicina en la muestra. De acuerdo con la presente invención, el ensayo usa cualquier medio de medición convencional para detectar y medir la cantidad de dicho conjugado que está unido o no está unido al anticuerpo. Por medio del uso de dichos medios, puede determinarse la cantidad del conjugado unido o no unido. Generalmente, la cantidad de doxorrubicina en una muestra se determina mediante la correlación de la cantidad medida del conjugado unido o no unido producido por la doxorrubicina en la muestra con valores del conjugado unido o no unido determinados a partir de una curva patrón o una curva de calibración obtenida a partir de muestras que contienen cantidades conocidas de doxorrubicina, estando dichas cantidades conocidas en el intervalo esperado para la muestra a ensayar. Estos estudios para producir curvas de calibración se determinan usando el mismo procedimiento de inmunoensayo que se usó para la muestra. Los conjugados que incluyen los inmunógenos se preparan a partir de compuestos de fórmula II-A o II-B, o mezclas de los mismos. Los vehículos que incluyen los inmunógenos que tienen un grupo amino o tiol terminal reactivo se unen a las porciones de ligando que tienen la fórmula:
imagen1
en la que Y, A y p son como se ha indicado anteriormente; y X’ es -CH2-o un grupo de unión funcional; o compuestos de fórmula:
imagen3
en la que X’, Y, B y P son como se ha indicado anteriormente.
Estas porciones de ligando pueden unirse a uno o más sitios activos de tiol o amino en
el vehículo que contiene el polímero de poliamina. Preferentemente, estos vehículos contienen
un polímero, más preferentemente un polímero de poliamina, que contiene un grupo tiol o
10 amino reactivo.
Definiciones
A lo largo de esta descripción, deben entenderse las siguientes definiciones: El término doxorrubicina incluye doxorrubicina así como las sales farmacéuticamente aceptables de doxorrubicina. 15 Los términos “inmunógeno” e “inmunogénico” se refieren a sustancias capaces de inducir, producir o generar una respuesta inmune en un organismo.
El término “conjugado” se refiere a cualquier sustancia formada a partir de la unión de dos partes entre si. Los conjugados representativos de acuerdo con la presente invención incluyen los formados por la unión entre sí de una molécula pequeña, tal como el compuesto 20 de fórmula II-A y II-B, y una molécula grande, tal como un vehículo o un polímero de poliamina, particularmente una proteína. En el conjugado, la molécula pequeña puede unirse en uno o
más sitios activos en la molécula grande. El término conjugado incluye el término inmunógeno.
“Haptenos” son antígenos parciales o incompletos. Son sustancias sin vehículo, principalmente sustancias de bajo peso molecular, que no son capaces de estimular la formación de anticuerpos, pero que reaccionan con anticuerpos. Estos últimos se forman por acoplamiento de un hapteno a un vehículo inmunogénico de alto peso molecular y la posterior inyección de este producto acoplado, es decir, el inmunógeno, en un sujeto humano o animal. El hapteno de la presente invención es doxorrubicina.
Como se usa en el presente documento, un “grupo espaciador” o “espaciador” se refiere a una parte de una estructura química que conecta dos o más subestructuras tales como haptenos, vehículos, inmunógenos, marcadores o indicadores a través de un grupo de unión funcional o CH2. Estos grupos espaciadores se enumerarán más adelante en la presente solicitud. Los átomos de un grupo espaciador y los átomos de una cadena dentro del grupo espaciador están conectados entre sí por enlaces químicos. Entre los espaciadores preferidos se encuentran cadenas de carbono lineales o ramificados, saturadas o insaturadas. Estas cadenas de carbono también pueden incluir uno o más heteroátomos dentro de la cadena o en el extremo de las cadenas. Por “heteroátomos” se entiende átomos distintos de carbono que se eligen entre el grupo constituido por oxígeno, nitrógeno y azufre. Los grupos espaciadores también pueden incluir grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como una sustitución en uno de los átomos de la cadena.
El número de átomos en el grupo espaciador se determina contando los átomos distintos de hidrógeno. El número de átomos en una cadena dentro de un grupo espaciador se determina contando el número de átomos distintos de hidrógeno a lo largo del recorrido más corto entre las subestructuras que se están conectando. Un grupo de unión funcional puede usarse para activar, por ejemplo, proporcionar un sitio funcional disponible en, un hapteno o grupo espaciador para sintetizar un conjugado de un hapteno con un marcador o vehículo o polímero de poliamina.
Un “vehículo inmunogénico”, como se usa la expresión en el presente documento, es una sustancia inmunogénica, comúnmente una proteína o una proteína modificada para llevar un grupo tiol o amino reactivo, que puede unirse con un hapteno, en este caso doxorrubicina, permitiendo de esta manera que estos derivados de hapteno induzcan una respuesta inmune y provoquen la producción de anticuerpos que pueden unirse específicamente con estos haptenos. Los vehículos inmunogénicos y los grupos de unión se enumerarán más adelante en la presente solicitud. Entre las sustancias de vehículo inmunogénico se incluyen proteínas, glicoproteínas, poliamino-polisacáridos complejos, partículas y ácidos nucleicos que se reconocen como extraños y por lo tanto provocan una respuesta inmunológica en el huésped.
Los poliamino-polisacáridos pueden prepararse a partir de polisacáridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparación.
También pueden usarse diversos tipos de proteínas como un vehículo inmunogénico de poli(aminoácido). Estos tipos incluyen albúminas, proteínas del suero, lipoproteínas, etc. Las proteínas ilustrativas incluyen albúmina de suero bovino (ASB), hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina de huevo, tiroglobulina bovina (BTG), etc. Como alternativa, pueden usarse poli(aminoácidos) sintéticos. Como alternativa, estas proteínas pueden modificarse para contener un grupo tiol reactivo.
Los vehículos inmunogénicos también pueden incluir poliamino-polisacáridos, que son un polímero de alto peso molecular formado por condensaciones repetidas de monosacáridos. Son ejemplos de polisacáridos almidones, glucógeno, celulosa, gomas de carbohidrato tales como goma arábiga, agar y similares. El polisacárido también puede contener restos de poliaminoácidos y/o restos de lípidos.
El vehículo inmunogénico también puede ser un poli(ácido nucleico) solo o conjugado con uno de los poli(aminoácidos) o polisacáridos mencionados anteriormente.
El vehículo inmunogénico también puede incluir partículas sólidas. Las partículas generalmente tienen al menos aproximadamente 0,02 micrómetros (µm) y no más de aproximadamente 100 µm, y normalmente de aproximadamente 0,05 µm a 10 µm de diámetro. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, óptimamente de una densidad que se aproxima a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml, y compuesta de un material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos tales como células y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitantes tales como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las partículas también pueden estar compuestas por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas de fosfolípidos o lipoproteínas.
“Poli(aminoácido)” o “polipéptido” es una poliamida forma a partir de aminoácidos. Los poli(aminoácidos) generalmente variarán desde un peso molecular de aproximadamente 2.000, sin tener límite superior de peso molecular, siendo normalmente menor de 10.000.000 y normalmente no mayor de aproximadamente 600.000 daltons. Normalmente habrá diferentes intervalos, dependiendo de si está implicado un vehículo inmunogénico o una enzima.
Un “péptido” es cualquier compuesto formado por la unión de dos o más aminoácidos por enlaces amida (peptídicos), normalmente un polímero de α-amino ácidos en el que el grupo α-amino de cada resto aminoacídico (excepto el extremo NH2) está unido al grupo αcarboxilo del siguiente resto en una cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y poli(aminoácido) se usan como sinónimos en el presente documento para hacer referencia a esta clase de compuestos sin restricción en cuanto al tamaño. Los mayores miembros de esta clase se denominan proteínas. Estos péptidos poliméricos pueden modificarse por medios convencionales para convertir el grupo terminal NH2 reactivo en un grupo SH terminal.
Un “marcador”, “molécula de detección” o “indicador” es cualquier molécula que produce, o puede inducirse para que produzca, una señal detectable. El marcador puede conjugarse con un analito, inmunógeno, anticuerpo u otra molécula tal como un receptor o una molécula que puede unirse a un receptor tal como un ligando, particularmente un hapteno. Los ejemplos no limitantes de marcadores incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fragmentos de enzimas, sustratos enzimáticos, inhibidores de enzimas, coenzimas, catalizadores, fluoróforos, colorantes, quimioluminiscentes, luminiscentes o sensibilizadores; una partícula magnética o no magnética, un soporte sólido, un liposoma, un ligando o un receptor.
El término “anticuerpo” se refiere a un compañero de unión a proteínas específico para un antígeno y es cualquier sustancia, o grupo de sustancias, que tiene una afinidad de unión específica por un antígeno para la exclusión de otras sustancias. El término genérico anticuerpo incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
El término “derivado” se refiere a un compuesto químico o molécula obtenida a partir de un compuesto parental por una o más reacciones químicas.
El término “vehículo” se refiere a partículas sólidas y/o polímeros poliméricos tales como polímeros inmunogénicos tales como los mencionados anteriormente. Cuando el vehículo es una partícula sólida, la partícula sólida puede unirse, aplicarse como un revestimiento o asociarse de otra manera a un polímero de poliamina para proporcionar uno o más sitios reactivos para la unión al grupo funcional X en los compuestos de fórmula II-A y II-B.
La expresión “kit de reactivos” o “kit de ensayo” se refiere a un conjunto de materiales que se usan para realizar un ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse en combinación envasados en el mismo o en distintos recipientes, dependiendo de sus reactividades cruzadas y estabilidades, y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y proporciones de reactivos proporcionados en el kit pueden seleccionarse para proporcionar resultados óptimos para una aplicación particular. Un kit de reactivos que incorpora características de la presente invención comprende anticuerpos específicos para doxorrubicina. El kit puede comprender además ligandos del analito y materiales de calibración y control. Los reactivos pueden permanecer en forma líquida o pueden liofilizarse.
La frase “materiales de calibración y control” se refiere a cualquier material convencional o de referencia que contiene una cantidad conocida de un fármaco a medir. La concentración de fármaco se calcula comparando los resultados obtenidos para el ejemplar desconocido con los resultados obtenidos para el patrón. Esto se hace comúnmente construyendo una curva de calibración.
La expresión “muestra biológica” incluye, pero sin limitación, cualquier cantidad de una
5 sustancia de un ser vivo o un ser que antiguamente estaba vivo. Estos seres vivos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos, caballos y otros animales. Estas sustancias incluyen, pero sin limitación, sangre, suero, plasma, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, linfa, ganglios linfáticos, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos sinoviales, células endoteliales y piel.
10 Reactivos e Inmunógenos Para construir un inmunoensayo, se construye un conjugado de doxorrubicina para competir con la doxorrubicina en la muestra por sitios de unión en los anticuerpos. En el inmunoensayo de la presente invención, los reactivos son los derivados de doxorrubicina 13sustituidos de los compuestos de fórmula III-A y los derivados de doxorrubicina 14-sustituidos
15 de fórmula III-B. En los compuestos de fórmula III-A y III-B, el espaciador de engarce constituye la parte -CH2-(Y)p-X’-o -B-(Y)pX’ de esta molécula. En estos engarces, X’ y el espaciador -CH2-(Y)p -o -B-(Y)p-X’ son convencionales en la preparación de conjugados e inmunógenos. En los compuestos de fórmula III-A y III-B puede usarse cualquiera de los grupos espaciadores-de engarce convencionales usados para preparar conjugados e
20 inmunógenos para inmunoensayos. Estos engarces y espaciadores convencionales se desvelan en la Patente de Estados Unidos 5.501.987 y en la Patente de Estados Unidos
5.101.015. Entre los grupos espaciadores preferidos se incluyen los grupos espaciadores
mencionados anteriormente en el presente documento. Son grupos espaciadores 25 particularmente preferidos grupos tales como alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de
imagen4
30 en los que n y o son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6, siendo alquileno el grupo espaciador especialmente preferido. Con respecto a las estructuras anteriores del grupo espaciador designado por Y, el grupo funcional X está conectado a la posición terminal en el lado derecho de la estructura, es decir, donde están situados (CH2)m y (CH2)o.
En los compuestos de fórmula III-A y III-B, X' es -CH2-o un grupo funcional que une el
5 espaciador a la amina o grupo tiol en el vehículo polimérico. El grupo X' es el resultado del grupo funcional terminal X en los compuestos de Fórmula II-A y II-B que es capaz de unirse al grupo amino o tiol en el polímero de poliamina usado como vehículo o inmunógeno. Cualquier grupo funcional terminal que puede reaccionar con un grupo amina o tiol puede usarse como grupo funcional X en los compuestos de fórmula II-A y II-B. Estos grupos funcionales
10 terminales incluidos preferentemente dentro de X son:
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en los que R3 es hidrógeno o se toma junto con sus átomos de oxígeno unidos para formar un éster reactivo y R4 es oxígeno o azufre. El radical -N=C=R4 puede ser un isocianato o un isotiocianato. Los ésteres activos formados por OR3 incluyen imidoéster, tal como N
15 hidroxisuccinamida, 1-hidroxibenzotriazol y p-nitrofenil éster. Sin embargo, puede usarse cualquier éster activo que reaccione con un grupo amina o tiol.
El grupo carboxílico y los ésteres activos se acoplan con el vehículo o polímero inmunogénico por medios convencionales. El grupo amina del polímero de poliamina, tal como una proteína, produce un grupo amida que conecta el espaciador con los inmunógenos o
20 vehículos poliméricos para formar los conjugados usados en la presente invención. Cuando X en el compuesto de fórmula II-A o II-B es
imagen1
estos compuestos reaccionan preferentemente con el grupo amino libre del vehículo polimérico
o inmunogénico. Por otro lado, cuando X en el compuesto de fórmula II-A o II-B es el radical 25 maleimida de fórmula
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este compuesto preferentemente reacciona con el grupo tiol (o SH) que puede estar presente en el vehículo polimérico o proteico, incluyendo los inmunógenos, para producir X' en los compuestos de fórmula III-A y III-B que tienen la estructura:
y
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De acuerdo con una realización preferida, estos compuestos de fórmula III-A1 y III-B1 están unidos a una proteína polimérica que se ha modificado para convertir un grupo amino en 10 un grupo tiol. Esto puede realizarse haciendo reaccionar un grupo amino libre de un vehículo
proteico polimérico con un compuesto de fórmula
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en la que R15 es un grupo protector de tiol; R3 es como antes; y v es un número entero de 1 a 4.
De esta manera, el grupo tiol, SH-, se convierte en el grupo funcional del vehículo unido al resto del vehículo.
Esta reacción se realiza en un medio acuoso mezclando el vehículo que contiene proteína con el compuesto de fórmula V en un medio acuoso. En esta reacción, la temperatura y la presión no son críticas y la reacción puede realizarse a la temperatura ambiente y a presión atmosférica. Se prefieren generalmente temperaturas de 110 ºC a 25 ºC. En la siguiente etapa, primero el vehículo modificado con tiol se hace reaccionar con el compuesto de fórmula II-A y II-B y después el grupo protector de tiol del vehículo se retira por medios convencionales del producto de reacción resultante del compuesto de fórmula V con el vehículo.
En la realización de la presente invención puede usarse cualquier medio convencional para retirar un grupo protector de tiol. Sin embargo, al usar un medio para retirar el grupo protector de tiol, debe tenerse cuidado de que los reactivos sean solubles en el medio acuoso y de que no destruyan ni dañen de ningún modo al polímero de poliamina contenido en el vehículo. Un medio preferido para retirar este grupo protector es mediante el uso de ditiotreitol como agente para reducir el producto de condensación resultante. Esta reducción puede realizarse simplemente añadiendo el agente reductor al medio de reacción usando presiones o temperaturas más elevadas. Esta reducción puede realizarse a temperatura ambiente y a presión atmosférica. Puede usarse cualquier agente protector de tiol convencional en la realización de esto en el compuesto de fórmula V. Los grupos protectores de tiol son bien conocidos en la técnica, siendo el grupo protector preferido 2-piridilditio.
Aunque el procedimiento anterior representa un medio para convertir un grupo amino terminal reactivo que se encuentra en el vehículo que contiene poliamina polimérico en un grupo tiol, puede usarse cualquier medio convencional para realizar esta conversión. Los procedimientos para convertir grupos amino terminales que se encuentran en vehículos que contiene poliamina polimérico son bien conocidos en la técnica y pueden usarse de acuerdo con la presente invención. Se ha descubierto que de acuerdo con la realización preferida de la presente invención, cuando los compuestos de fórmula III-A y III-B que tienen X' unido a un grupo tiol realizado por el vehículo que contiene poliamina polimérico inmunogénico produce anticuerpos de mayor especificidad a doxorrubicina. Por lo tanto, el uso del compuesto de fórmula II-A y II-B en la que X está unido a un grupo tiol terminal del vehículo que contiene poliamina polimérico inmunogénico constituye la realización preferida del inmunógeno usado
en la presente invención.
La reacción del vehículo que contiene poliamina polimérico que tiene un grupo tiol reactivo terminal con el compuesto de fórmula II-A o II-B en la que X es un grupo funcional capaz de unirse al grupo tiol terminal realizado por el vehículo puede realizarse por medios convencionales. En la realización preferida, la maleimida de fórmula III-A1 y III-B1 se hace reaccionar con el grupo tiol realizado por el vehículo polimérico de poliamina. Puede usarse cualquier medio bien conocido para la adición de un tiol a través de un doble enlace maleimida en la producción de los conjugados de fórmula II-A y II-B que están conjugados a través de un puente tiol.
En los conjugados, unidos a través de enlaces amida cuyos conjugados incluyen los inmunógenos usados en la presente invención, el enlace químico entre el grupo carboxilo que contiene haptenos de doxorrubicina y los grupos amino del vehículo o inmunógeno pueden obtenerse usando diversos procedimientos conocidos para un experto en la técnica. Con frecuencia, es preferible formar enlaces amida activando primero el resto ácido carboxílico del hapteno de doxorrubicina en los compuestos de fórmula II-A y II-B haciendo reaccionar el grupo carboxi con un reactivo de grupo saliente (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, 1hidroxibenzotriazol, p-nitrofenol y similares). Puede usarse un reactivo de activación, tal como dicicloheoxilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y similares. Después, la forma activada del grupo carboxilo en el hapteno de doxorrubicina de fórmula II-A o II-B se hace reaccionar en una solución tamponada que contiene el vehículo proteico.
En la preparación de los conjugados unidos a amino en los que el derivado de doxorrubicina de fórmula II-A o II-B contiene un grupo amino primario o secundario, así como el grupo carboxilo, es necesario usar un grupo protector de amina durante las reacciones de activación y acoplamiento para evitar que los conjugados reaccionen consigo mismos. Típicamente, las aminas del derivado de doxorrubicina de fórmula II-A o II-B se protegen formando la correspondiente N-trifluoroacetamida, N-tertbutiloxicarbonil uretano (N-t-BOC uretano), N-carbobenciloxi uretano o estructura similar. Cuando la reacción de acoplamiento con el polímero o vehículo inmunogénico se ha efectuado, como se ha descrito anteriormente, el grupo protector de amina puede retirarse usando reactivos que no alteran de otra forma la estructura del inmunógeno o conjugado. Dichos reactivos y procedimientos son conocidos por un experto en la materia e incluyen ácidos acuosos o anhidros débiles o fuertes, bases acuosas o anhidras débiles o fuertes, reactivos que contienen hidruro, tales como borohidruro sódico o cianoborohidruro sódico e hidrogenación catalítica. También se desvelan diversos procedimientos de conjugación de haptenos y vehículos en la Patente de Estados Unidos
3.996.344 y en la Patente de Estados Unidos 4.016.146.
Por otro lado, en la preparación de conjugados de amino en los que X es un radical isocianato o tioisocianato terminal en el compuesto de fórmula II-A o II-B, estos radicales, cuando reaccionan con la amina libre de un polímero de poliamina, producen el conjugado o inmunógeno de fórmula III-A o III-B en la que X' es
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5
en la que R4 es como antes, y la funcionalidad conecta con el grupo amino del vehículo de poliamina o del polipéptido inmunogénico. En la preparación de los conjugados de amino de los compuestos de fórmula II-A y II-B, en la que X es un grupo aldehído, estos compuestos pueden conectarse con el grupo amina
10 del polipéptido o vehículo de poliamina a través de un engarce amina por aminación reductora. Puede usarse cualquier procedimiento convencional para condensar un aldehído con una amina, tal como a través de aminación reductora, para formar este engarce. En este caso, X' en las porciones ligando de fórmula III-A y III-B es -CH2-.
La doxorrubicina del compuesto de fórmula I, y su grupo 13-ceto, pueden representarse 15 por la fórmula:
en la que
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representa doxorrubicina con su grupo 13-ceto mostrado. La 13-ceto doxorrubicina puede 20 convertirse en el compuesto de fórmula II-A en la que A es =N-O-haciendo reaccionar doxorrubicina con una metoxiamina de fórmula: NH2-O-CH2-(Y)p-X VI-A para producir el compuesto de fórmula:
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en la que p, Y y X son como antes.
El compuesto de fórmula I se hace reaccionar en su grupo 13-oxo con una metoxiamina de fórmula VI-A para formar los compuestos de fórmula VI-B por medios convencionales de condensación de metoxiamina con un grupo carbonilo para formar una oxilamina de fórmula
5 VI-B, tal como se desvela en la Patente de Estados Unidos 4.039.385. Si el compuesto de fórmula VI-A contiene cualquier sustituyente funcional, estos sustituyentes pueden reaccionar con grupos protectores convencionales antes de la reacción de doxorrubicina con un compuesto de VI-A. Después de que se produzca el conjugado a partir del compuesto de fórmula VI-B, estos grupos protectores pueden retirarse por procedimientos bien conocidos en
10 la técnica para retirar dichos grupos protectores manteniendo al mismo tiempo el engarce oxilamina en el compuesto de fórmula VI-B. El compuesto de fórmula II-A en la que A es
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puede prepararse convirtiendo primero el grupo 13-oxo de la doxorrubicina en el grupo 1315 amino y después condensado esta 13-amino doxorrubicina con un haluro de ácido de fórmula:
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en la que Y, p y X son como antes. El grupo 13-oxo de la doxorrubicina puede convertirse en el grupo 13-amino por aminación reductora usando cloruro de amonio y un agente reductor, tal como 20 cianoborohidruro sódico.
Puede usarse cualquiera de las condiciones convencionales en la aminación reductora para convertir el grupo 13-oxo de la doxorrubicina en un grupo amino. La 13-amino doxorrubicina se hace reaccionar con el haluro de ácido por condensación para formar la amida de fórmula II-A en la que A es
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Para realizar esta condensación, puede usarse cualquier procedimiento de condensación de un haluro de ácido con una amina para formar una amida.
17 El compuesto de fórmula II-A en la que A es una hidrazona de fórmula
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puede prepararse haciendo reaccionar el 13-oxo de la doxorrubicina de fórmula I con una hidrazida de fórmula
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en la que p, Y y X son como antes.
En esta conversión puede usarse cualquier procedimiento de reacción de una cetona con una hidrazida para producir una hidrazona. Generalmente, esta reacción se realiza haciendo reaccionar la sal de amonio del compuesto de IX-B con el grupo 13-oxo del
10 compuesto de fórmula I, en un medio disolvente orgánico inerte, tal como un alcanol inferior a un pH de 3 a 6, prefiriéndose generalmente valores de pH ácidos. En la realización de esta reacción, la temperatura y la presión no son críticas, y esta reacción puede realizarse a temperatura ambiente y a presión atmosférica.
Los compuestos 14-sustituidos de fórmula II-B en la que B es -CH2-se forman haciendo 15 reaccionar el grupo 14-hidroxi de la doxorrubicina con un haluro de fórmula: halo-CH2-(Y)p-X VIII-B en la que p, Y y X son como antes. En la formación del compuesto de fórmula II-B a partir de doxorrubicina, para condensar el compuesto de fórmula VIII-B con la posición 14-hidroxi de la doxorrubicina, puede
20 usarse cualquier medio convencional de reacción de un alcohol para formar un éter. El uso de un haluro en el compuesto de fórmula VIII-B proporciona un medio eficaz para formar dicho éter por condensación con el alcohol. Por otro lado, cuando Y en el compuesto de fórmula VIIIB contiene grupos funcionales, que pueden interferir con esta reacción para formar el compuesto de fórmula II-B, estos grupos funcionales pueden protegerse por medio de grupos
25 protectores adecuados que pueden retirarse después de esta reacción como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Los compuestos 14-sustituidos de fórmula II-B en la que B es
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se producen haciendo reaccionar el grupo 14-hidroxi de la doxorrubicina con un compuesto amino de fórmula:
NH2-CH2-(Y)p-X IX en la que X, Y y p son como antes. Después de convertir en primer lugar el grupo 14-hidroxi de la doxorrubicina en el grupo cloroformático
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Puede usarse cualquier medio convencional para convertir un grupo hidroxi en un grupo cloroformático. Después de la formación de un cloroformiato, el grupo halo del cloroformiato se condensa con el grupo amina del compuesto de fórmula IX. Antes de esta reacción, el grupo reactivo de la doxorrubicina y/o del compuesto de fórmula IX se protegen como se ha descrito anteriormente en el presente documento con un grupo protector convencional. Estos grupos protectores pueden retirarse después de esta condensación del haluro por medios convencionales, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
El compuesto de fórmula II-A y II-B puede convertirse en los inmunógenos y/o reactivos conjugados usados en la presente invención haciendo reaccionar estos compuestos con una poliamina o un vehículo de polipéptido que contiene un grupo amino terminal. El mismo polipéptido puede usarse como vehículo y como vehículo de polímero inmunogénico en el inmunógeno usado en la presente invención dado que el vehículo de poliamida o polipéptido usado para generar el antígeno es inmunológicamente activo. Sin embargo, para formar los conjugados, estos polímeros no necesitan producir una respuesta inmunológica tal como se requiere para los inmunógenos. De acuerdo con la presente invención, los diversos grupos funcionales representados por X en los compuestos de fórmula II-A y II-B pueden estar conjugados con el materia polimérico por medios convencionales de unión de un grupo funcional a un grupo amina o tiol contenido dentro del vehículo polimérico. ANTICUERPOS
La presente invención también se refiere a nuevos anticuerpos, tal como se define en las reivindicaciones, que incluyen anticuerpos monoclonales contra doxorrubicina producidos usando los inmunógenos mencionados anteriormente. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que estos anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención son selectivamente reactivos con doxorrubicina y, a diferencia de los anticuerpos de la técnica anterior, no reaccionan con metabolitos que no son farmacéuticamente activos, lo cual interferiría con inmunoensayos para doxorrubicina. El más problemático de estos metabolitos de doxorrubicina es doxorrubicina aglicona. La capacidad de los anticuerpos de la presente invención de no reaccionar con estos metabolitos inactivos hace que estos anticuerpos sean particularmente valiosos para proporcionar un inmunoensayo para doxorrubicina.
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos y anticuerpos monoclonales contra doxorrubicina. Los antisueros de la invención pueden producirse convenientemente por inmunización de animales huésped con los inmunógenos usados en la presente invención. Los animales huésped adecuados incluyen roedores tales como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas y similares, o mamíferos superiores tales como cabras, ovejas, caballos y similares. Las dosis iniciales, extracciones de sangre e inyecciones de refuerzo pueden administrarse de acuerdo con protocolos aceptados para provocar respuestas inmunes en animales, por ejemplo, en una realización preferida los ratones recibieron una dosis inicial de 100 µg de inmunógeno/ratón i.p. y una o más inyecciones de refuerzo posteriores de entre 50 y 100 µg de inmunógeno/ratón durante un periodo de seis meses. Por medio de la extracción periódica de sangre, se observaron las muestras de sangre de los ratones inmunizados para crear anticuerpos contra doxorrubicina usando inmunoensayos convencionales. Estos procedimientos proporcionan una forma conveniente para seleccionar huéspedes que estén produciendo antisueros que tienen la actividad deseada. Los anticuerpos también se exploraron contra los metabolitos principales de doxorrubicina y no mostraron unión sustancial a estos compuestos.
Los anticuerpos monoclonales se producen convenientemente por inmunización de ratones Balb/c de acuerdo con el programa anterior seguido de inyección en los ratones de 100 µg de inmunógeno i.p. o i.v. en tres días sucesivos empezando cuatro días antes de la fusión celular. Por supuesto, también pueden usarse otros protocolos bien conocidos en la técnica de anticuerpos. El protocolo de inmunización completo detallado en el presente documento proporcionó un protocolo óptimo para la respuesta de anticuerpos en suero para el anticuerpo contra doxorrubicina.
Como célula productora de anticuerpos monoclonales pueden usarse linfocitos B obtenidos de bazo, sangre periférica, ganglios linfáticos u otros tejidos del huésped. Los más preferidos son linfocitos B obtenidos del bazo. Se obtienen hibridomas capaces de generar los anticuerpos monoclonales deseados de la invención fusionando dichos linfocitos B con una línea de células inmortales, que es una línea celular que imparte a la célula híbrida estabilidad en cultivo de tejidos a largo plazo. En la realización preferida de la invención, la célula inmortal puede ser una célula linfoblastoide o una célula de plasmocitoma, tal como una célula de mieloma. Los hibridomas murinos que producen anticuerpos monoclonales contra doxorrubicina se forman por fusión de células de mieloma de ratón y células de bazo de ratones inmunizados contra conjugados de doxorrubicina-proteína. Pueden producirse anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos por clonación de los genes que expresan el anticuerpo procedentes de las células de hibridoma y usando procedimientos de ADN recombinante bien conocidos actualmente en la técnica para unir la subsecuencia de la región variable de ratón a regiones constantes humanas o para combinar regiones flanqueantes humanas con regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina donadora de rata o ratón. En la Solicitud de Patente Internacional WO 92/11018 se expone un procedimiento mejorado para realizar la humanización de anticuerpos monoclonales murinos que proporciona anticuerpos de mayores afinidades.
Pueden producirse fragmentos polipeptídicos que comprenden sólo una parte de la estructura primaria de anticuerpo, poseyendo dichos fragmentos una o más actividades de inmunoglobulina. Estos fragmentos polipeptídicos pueden producirse por escisión proteolítica de anticuerpos intactos por procedimientos bien conocidos en la técnica, o por inserción de codones de terminación en las localizaciones deseadas en vectores de expresión que contienen los genes de anticuerpo usando mutagénesis dirigida para producir fragmentos Fab
o fragmentos (Fab’)2. Pueden producirse anticuerpos monocatenarios por unión de regiones VL y VH con un engarce de ADN (véase Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988) y Bird et al., Science, 242:423-426 (1988)).
Los anticuerpos de la presente invención son selectivos para doxorrubicina sin tener ninguna reactividad cruzada sustancial con metabolitos farmacéuticamente activos de doxorrubicina, tales como los metabolitos mencionados anteriormente en el presente documento. Al no tener una reactividad cruzada sustancial, se entiende que los anticuerpos de la presente invención tienen una reactividad cruzada con respecto a la doxorrubicina con estos metabolitos menor del 20 %. Se prefieren los anticuerpos que tienen una reactividad cruzada menor del 15 %. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser reactivos con otros compuestos parecidos a doxorrubicina farmacéuticamente activos tales como doxorrubicinol. INMUNOENSAYOS
De acuerdo con la presente invención, los conjugados y los anticuerpos generados a partir de los inmunógenos de estos compuestos de fórmula II-A y II-B o mezclas de los mismos pueden usarse como reactivos para la determinación de doxorrubicina en muestras de pacientes. Esta determinación se realiza por medio de un inmunoensayo. Para determinar la presencia de doxorrubicina en una muestra de un paciente, puede usarse cualquier inmunoensayo en el que los conjugados de reactivo formados a partir de los compuestos de fórmula II-A y II-B compitan con la doxorrubicina en la muestra por sitios de unión en los anticuerpos generados de acuerdo con la presente invención. La manera para realizar dicho ensayo para doxorrubicina en una muestra que se sospecha que contiene doxorrubicina, comprende combinar (a) una muestra en medio acuoso, (b) un anticuerpo contra doxorrubicina generado de acuerdo con la presente invención y (c) los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula II-A o II-B o mezclas de los mismos. La cantidad de doxorrubicina en la muestra puede determinarse midiendo la inhibición de la unión con el anticuerpo específico de una cantidad conocida del conjugado añadido a la mezcla de la muestra y anticuerpo. El resultado de la inhibición de dicha unión de la cantidad conocida de conjugados por la muestra desconocida se compara con los resultados obtenidos en el mismo ensayo usando soluciones patrón conocidas de doxorrubicina.
Pueden usarse diversos medios para medir la cantidad de conjugado formado a partir de los compuestos de fórmula II-A y II-B unido al anticuerpo. Un procedimiento es aquel en el que la unión de los conjugados al anticuerpo produce una reducción en la velocidad de rotación de un conjugado de fluoróforo. La cantidad de reducción en la velocidad de rotación de un conjugado de fluoróforo en la mezcla líquida puede detectarse por la técnica de polarización fluorescente, tal como la descrita en la Patente de Estados Unidos 4.269.511 y en la Patente de Estados Unidos 4.420.568.
Por otra parte, el anticuerpo puede aplicarse como un revestimiento o absorberse en nanopartículas de forma que cuando estas partículas reaccionan con los conjugados de doxorrubicina formados a partir de los compuestos de fórmula II-A y II-B, estas nanopartículas forman un agregado. Sin embargo, cuando las nanopartículas con el anticuerpo aplicado como un revestimiento o absorbido reaccionan con la doxorrubicina en la muestra, la doxorrubicina de la muestra unida a estas nanopartículas no produce agregación de las nanopartículas de anticuerpo. La cantidad de agregación o aglutinación puede medirse en la mezcla de ensayo por absorbancia.
Por otra parte, estos ensayos pueden realizarse teniendo el anticuerpo o los conjugados de doxorrubicina unidos a un soporte sólido tal como una placa de microtitulación o cualquier otro soporte sólido convencional incluyendo partículas sólidas. La unión de anticuerpos y proteínas a dichas partículas sólidas es bien conocida en la técnica. Puede usarse cualquier procedimiento convencional para realizar dichas uniones. En muchos casos, para ayudar a la medición, pueden ponerse marcadores sobre los anticuerpos, conjugados o partículas sólidas, tales como marcadores radiactivos o marcadores enzimáticos, como adyuvantes en la detección de la cantidad de los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula II-A y II-B que se unen o no se unen con el anticuerpo. Otros marcadores adecuados incluyen cromóforos, fluoróforos, etc.
Por conveniencia, pueden proporcionarse componentes de ensayo de la presente
invención en un kit, una combinación envasada con cantidades predeterminadas de nuevos reactivos usados en el ensayo de doxorrubicina. Estos reactivos incluyen el anticuerpo de la presente invención, así como los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula II-A y II-B o mezclas de los mismos. Generalmente se prefiere que, en un inmunoensayo dado, si se usa un conjugado formado a partir de un compuesto de fórmula II-A, el anticuerpo se generará por un inmunógeno formado a partir de un compuesto de fórmula II-A. De una manera similar, si se usa un conjugado formado a partir de un compuesto de fórmula II-B, el anticuerpo se generará por el inmunógeno formado a partir de un compuesto de fórmula II-B. Sin embargo, esto no es necesariamente así y los anticuerpos y conjugados en un ensayo dado pueden proceder de cualquiera o de estos dos conjugados e inmunógenos.
Además de estos reactivos necesarios, pueden incluirse aditivos tales como reactivos auxiliares, por ejemplo, estabilizantes, tampones y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimicen la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse en solución o como un polvo seco, normalmente liofilizado, incluyendo excipientes que tras la disolución proporcionarán una solución de reactivo que tenga las concentraciones apropiadas para realizar el ensayo.
EJEMPLOS
En los Ejemplos, las siguientes abreviaturas se usan para designar lo siguiente: CHCl3 Cloroformo BMPH hidrazida de N-[ácido β-maleimidopropiónico], sal del ácido trifluoroacético MeOH metanol DMF Dimetilformamida TFA Ácido trifluoroacético DMSO Dimetilsulfóxido CAPS Ácido 3-(cicloheoxilamino)-1-propanosulfónico NHS N-hidroaril succinimida EDC Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida KPi tampón fosfato potásico pH 7,5 SPDP Éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico MES Tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico pH 6 ANS Ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico
i.p. Intraperitoneal HRP Peroxidasa de rábano picante TFA Trifluoroacético específicos preparados por, y referidos a, los números de los Ejemplos. Los esquemas son 10 como se indica a continuación:
TMB
3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina
TRIS
Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano
BSA
Albúmina de suero bovino
KLH
Hemocianina de Lapa Californiana
5
BTG Tiroglobulina bovina
PBS
Solución salina tamponada con fosfato
di
agua desionizada
En los Ejemplos, los siguientes Esquema 1 y Esquema 2 exponen los compuestos
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Ejemplo 1 Preparación de éster activado de Doxorrubicina trifluoroacetamida 4 (esquema 1)
Una suspensión agitada de doxorrubicina (1) (0,8 g, 1,38 mmol) en CHCl3/MeOH (1:1) (15 ml) a 0 ºC se trató con 2,76 ml de metóxido sódico metanólico 0,5 M añadido gota a gota seguido de la adición de trifluorotioacetato de S-etilo (0,89 ml, 7,02 mmol) en una atmósfera de nitrógeno. Después de agitar en la oscuridad durante 16 h a temperatura ambiente, la reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió en 10 ml de CHCl3/MeOH (1:1) y 4 ml de tolueno y se concentró. De nuevo, el residuo se disolvió en 50 ml de CHCl3/MeOH (9:1) y se lavó con 10 ml de ácido cítrico 0,1 M y salmuera (2 x 10 ml). Se secó sobre sulfato de magnesio y la evaporación de los disolventes seguida de trituración en cloruro de metileno/Éter/Hexanos dio 2 (0,814, 92 %) en forma de un sólido de color rojo.
Una mezcla del compuesto 2 (0,49 g, 0,766 mmol), hemiclorhidrato de carboximetoxilamina (0,30 g, 1,38 mmol) y acetato sódico (0,38 g, 4,60 mmol) en MeOH (15 ml) se agitó en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se disolvió en agua (25 ml) y CHCl3 / MeOH (9: 1) (3 x 25 ml). Todas las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se evaporaron y se trituraron con cloruro de metileno/Hexanos, proporcionando 3 (0,45 g, 82 %).
A una solución del compuesto 3 (0,45 g, 0,63 mmol) en cloruro de metileno/DMF (1:5) (12 ml) a 0 ºC se le añadieron EDC (0,11 g, 0,95 mmol) y NHS (0,18 g, 0,95 mmol) en una atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 18 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno (50 ml) y se lavó con agua (2 x 15 ml). Se secó sobre sulfato de magnesio y la evaporación del disolvente dio el compuesto 4 (0,445 g, 86 %) en forma de un sólido de color rojo; este material se usó directamente en la siguiente etapa (Ejemplos 3a y 3b). Ejemplo 2 Preparación de (3-Maleimidopropil)hidrazona de Doxorrubicina (esquema 2)
La doxorrubicina [1] se derivatizó con N-[ácido P-maleimidopropiónico] hidrazida (BMPH) para introducir un grupo maleimido para la conjugación eventual a la proteína a través de un engarce tio-éter. A una solución de clorhidrato de doxorrubicina (29 mg, 0,05 x 10-3 mmol) y BMPH (50 mg, 3,4 equiv.) en 10 ml de MeOH anhidro se le añadieron 3 µl de TFA. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas mientras se protegía de la luz. La solución metanólica se concentró hasta un volumen de 2 ml y se añadió gota a gota a acetonitrilo (30 ml) con agitación. La suspensión resultante se dejó en reposo a 4 ºC durante la noche para la cristalización del derivado de hidrazona maleimido doxorrubicina C13 [5]. Este producto se aisló por centrifugación, se lavó con metanol-acetonitrilo recién preparado (1:10) y se secó al vacío, produciendo la (6-Maleimidocaproil)hidrazona de doxorrubicina (5). La estructura se confirmó por RMN.
Ejemplo 3a Preparación de Inmunógeno BTG con Hapteno Activado 4
A 18,8 ml de BTG (7,1 mg/ml) en 1:1 de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5):DMSO se le añadieron 1,3 ml del compuesto 4 del Ejemplo 1 (20 mg/ml en DMSO) mientras se agitaba la solución de proteína sobre hielo. Después de la adición, se volvió a comprobar que el pH era 8. La mezcla se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. El grupo protector de trifluoroacetamida del amino azúcar se retiró por diálisis con tampón CAPS, pH 11. La primera diálisis se realizó con CAPS 50 mM al 50 % y DMSO al 50 % a temperatura ambiente. Después de ello, la proporción de DMSO se redujo por etapas: 40 %, 30 %, 20 %, 10 % y 0 %. Para la última diálisis de CAPS, la concentración de tampón se redujo a 25 mM y la diálisis se realizó a 4 ºC. Después, el conjugado inmunogénico se purificó por diálisis frente a tampón fosfato (50 mM, pH 7,5). El conjugado se caracterizó por espectroscopía UV/VIS. Ejemplo 3b Preparación de Inmunógeno KLH con Hapteno Activado 4
A 18,0 ml de KLH (7,35 mg/ml) en 1:1 de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5):DMSO se le añadieron 1,3 ml del compuesto 4 del Ejemplo 1 (20 mg/ml en DMSO) mientras se agitaba la solución de proteína en hielo. Después de la adición, se volvió a comprobar que el pH era 8. La mezcla se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. El grupo protector de trifluoroacetamida del amino azúcar se retiró por diálisis con tampón CAPS, pH 11. La primera diálisis se realizó con CAPS 50 mM al 50 % y DMSO al 50 % a temperatura ambiente. Después de esto, la proporción de DMSO se redujo por etapas: 40 %, 30 %, 20 %, 10 % y 0 %. Para la última diálisis de CAPS, la concentración de tampón se redujo a 25 mM y la diálisis se realizó a 4 ºC. Después, el conjugado inmunogénico se purificó por diálisis frente a tampón fosfato (50 mM, pH 7,5). El conjugado se caracterizó por espectroscopía UV/VIS. Ejemplo 4a Preparación de Inmunógeno BTG con Hapteno Activado 5
Para conjugar el derivado de hidrazona maleimido doxorrubicina C13 con la proteína, los restos de lisina proteína se modificaron para introducir un grupo sulfhidrilo. A una solución de tiroglobulina bovina (BTG) en tampón fosfato potásico, pH 7,5 (14,9 mg/ml, 3 ml) se le añadieron 4 mg de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) (20 equiv.) en 50 µl de DMSO para derivatizar las lisinas con grupos piridilditio propiónicos. Después de 1,5 horas de agitación a temperatura ambiente, a la mezcla se le añadieron 40 mg de ditiotreitol disuelto en 100 µl de KPi para generar los sulfhidrilos por reducción del resto ditiopiridilo. La reducción del derivado de piridilditio de la proteína para liberar el grupo sulfhidrilo se realizó en una atmósfera de nitrógeno, con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, el BTG tiolado se purificó por cromatografía de filtración en gel.
La columna de filtración en gel se preparó con 15 g de Sephadex G-25 hinchado en Tampón KPi 50 mM a temperatura ambiente durante 1 h, se desgasificó al vacío y se cargó en una columna (1,5 cm x 50 cm). La columna cargada se equilibró con el tampón durante 1 hora. La mezcla de reacción se cargó sobre la columna y se eluyó con tampón KPi. Se usó reactivo de Ellman para supervisar la elución de la proteína. Las fracciones que contenían proteína se recogieron y se combinaron. La concentración molar de los grupos tiol se determinó por el procedimiento de Ellman (Riddles, P.W. y col., Analytical Biochemistry, reactivo de Ellman: 5,5'-Ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico)-reexamen A., 94, 75-81 (1979).
A la proteína BTG tiolada purificada (5 mg/ml en KPi, 44,7 mg) en un baño de hielo-agua se le añadieron gota a gota 3 ml del derivado de doxorrubicina hidrazona 5 preparado en el Ejemplo 2 (2,33 mg/ml) y la mezcla de reacción se agitó a 4 ºC durante 16 horas y se protegió de la luz. El conjugado inmunogénico se purificó por filtración en gel como se ha descrito anteriormente. El conjugado inmunogénico se caracterizó por espectroscopía UV/VIS. Ejemplo 4b Preparación de Inmunógeno KLH con Hapteno Activado 5
A una solución de KLH en tampón fosfato potásico, pH 7,5 (5,58 mg/ml, 4 ml) se le añadieron 3 mg de SPDP en 50 µl de DMSO. Después de 1,5 horas de agitación a temperatura ambiente, a la mezcla se le añadieron 25 mg de ditiotreitol disuelto en 50 µl de KPi. La reducción se realizó en una atmósfera de nitrógeno, con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, el KLH tiolado se purificó por cromatografía de filtración en gel como se ha descrito en el Ejemplo 4a.
A la proteína KLH tiolada purificada (4 mg/ml en KPi, 5 ml) en un baño de hielo-agua se le añadieron gota a gota 2,124 ml del derivado de doxorrubicina hidrazona 5 preparado en el Ejemplo 2 (1,41 mg/ml) y la mezcla de reacción se agitó a 4 ºC durante 16 horas y se protegió de la luz. El conjugado inmunogénico se purificó por filtración en gel como se ha descrito en el Ejemplo 4a. El conjugado inmunogénico se caracterizó por espectroscopía UV/VIS. Ejemplo 5 Preparación de Conjugado de BSA (proporción 1:1) con Hapteno Activado 4
A 40 ml de BSA (25 mg/ml) en 1:1 de tampón fosfato (50 mM, pH 7,5):DMSO se le añadieron 0,62 ml del compuesto 4 del Ejemplo 1 (20 mg/ml en DMSO) mientras se agitaba la solución de proteína sobre hielo. Después de la adición, volvió a comprobarse que el pH era 8. La mezcla se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. El grupo protector de trifluoroacetamida en el amino azúcar se retiró por diálisis con tampón CAPS, pH 11. La primera diálisis se realizó con CAPS 50 mM al 50 % y DMSO al 50 % a temperatura ambiente. Después de esto, la proporción de DMSO se redujo por etapas: 40 %, 30 %, 20 %, 10 % y 0 %. Para la última diálisis de CAPS, la concentración de tampón se redujo a 25 mM y la diálisis se realizó a 4 ºC. Después, el conjugado inmunogénico se purificó por diálisis frente a tampón fosfato (50 mM, pH 7,5). El conjugado se caracterizó por espectroscopía UV/VIS.
Ejemplo 6a Preparación de BSA tiolado para reacción con Hapteno Activado 5
A una solución de BSA en tampón fosfato potásico, pH 7,5 (50 mg/ml, 6 ml) se le añadieron 4,2 mg de SPDP (3 equiv.) en 84 µl de DMSO. Después de 1,5 horas de agitación a temperatura ambiente, a la mezcla se le añadieron 27 mg de ditiotreitol disuelto en 0,135 ml de KPi. La reducción se realizó en una atmósfera de nitrógeno, con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, el BSA tiolado se purificó por cromatografía de filtración en gel.
La columna de filtración en gel se preparó con 12 g de Sephadex G-25 hinchado en tampón MES 10 mM (pH 6) a temperatura ambiente durante 1 h, se desgasificó al vacío y se cargó en una columna (1,5 cm x 50 cm). La columna cargada se equilibró con el tampón durante 1 hora. La mezcla de reacción se cargó sobre la columna y se eluyó con tampón MES. Se usó reactivo de Ellman para supervisar la elución de la proteína. Las fracciones que contenían proteína se recogieron y se combinaron. La concentración molar de los grupos tiol se determinó por el procedimiento de Ellman. Ejemplo 6b Preparación de Conjugado de BSA (proporción 3:1) con Hapteno Activado 5
A la proteína BSA tiolada purificada preparada en el Ejemplo 6a (5 mg/ml en MES, 35 mg) en un baño de agua enfriada con hielo se le añadieron gota a gota 0,135 ml del derivado de doxorrubicina hidrazona 5 preparado en el Ejemplo 2 (8 mg/ml) y la mezcla de reacción se agitó a 4 ºC durante 16 horas y se protegió de la luz. El conjugado inmunogénico se purificó por filtración en gel como se ha descrito en el Ejemplo 6a. El conjugado inmunogénico se caracterizó por espectroscopía UV/VIS. Ejemplo 6c Preparación de Conjugado de BSA (proporción 1:1) con Hapteno Activado 5
A la proteína BSA tiolada purificada preparada en el Ejemplo 6a (5 mg/ml en MES, 80 mg) en un baño de agua enfriada con hielo se le añadieron gota a gota 0,107 ml del derivado de doxorrubicina hidrazona 5 preparado en el Ejemplo 2 (8 mg/ml) y la mezcla de reacción se agitó a 4 ºC durante 16 horas y se protegió de la luz. El conjugado inmunogénico (6 ml) se purificó por filtración en gel como se ha descrito en el Ejemplo 6a. El conjugado inmunogénico purificado se caracterizó por espectroscopía UV/VIS. El resto del conjugado inmunogénico de la mezcla de reacción se usó para la reacción de protección sin purificación adicional.
Ejemplo 6d Protección de Doxorrubicina Hidrazona 5 -Conjugado de BSA (1:1 ratio)
A 5 ml de 1:1 de doxorrubicina [5] -conjugado de BSA preparado en el Ejemplo 6c (5 mg/ml en tampón MES) se le añadieron 0,047 ml de N-Etilmaleimida (2 equivalentes, 2 mg/ml en tampón MES) para proteger los grupos tiol no modificados por doxorrubicina. La reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente y después se purificó como en el Ejemplo 6a. Ejemplo 7 Preparación de Anticuerpos contra Doxorrubicina [4]
Se inmunizaron dos grupos de diez ratones BALB/c hembra i.p., uno con 100 µg/ratón de inmunógeno de doxorrubicina [4]-BTG preparado en el Ejemplo 3a y el otro con 100 µg/ratón de inmunógeno de doxorrubicina [4]-KLH preparado en el Ejemplo 3b emulsionado en adyuvante completo de Freund. Los ratones se reforzaron una vez cuatro semanas después de la inyección inicial con 100 µg/ratón de los mismos inmunógenos emulsionados en adyuvante incompleto de Freund. Diez días después del refuerzo, se obtuvieron extracciones de sangre de ensayo a partir de cada ratón por extracción de sangre orbital. Para los anticuerpos monoclonales, dependiendo del inmunógeno, la edad y el periodo de reposo del ratón empezando cuatro días antes de la fusión, en los ratones se inyectaron i.p. 400 µg (tres días antes de la fusión), 200 µg (2 días antes de la fusión) y 200 µg (1 día antes de la fusión) de inmunógeno de doxorrubicina [4]-BTG preparado en el Ejemplo 3a en PBS o 100 µg cada día de inmunógeno de doxorrubicina [4]-KLH preparado en el Ejemplo 3b en PBS tres días sucesivos. De acuerdo con el protocolo de Coligan y col., se aislaron células de bazo de los ratones seleccionados y se fusionaron con 2 x 107 células de la línea celular compañera de fusión de mieloma (SP2/0) usando polietilenglicol 1500 al 50 % [Coligan, J.E. y col., eds., Current Protocols in Immunology, 2.5.1 -2.5.8, (1992), Wiley & Sons, NY]. Para desarrollar las células fusionadas con el fin de obtener colonias productoras de anticuerpos de acuerdo con el procedimiento de Coligan y col., las células fusionadas se cultivaron en 10 placas de 96 pocillos en un medio de crecimiento selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) convencional tal como DMEM/F12 (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco 1:1 con Lglutamina y HEPES) suplementado con suero bovino fetal al 20 % alternativo, y que contenía un 2 % de L-glutamina (100 mM) y un 2 % de HAT 50X. Dos semanas después, el sobrenadante del hibridoma se ensayó con respecto a la presencia de anticuerpos antidoxorrubicina por ELISA como se describe en el Ejemplo 10b. Los pocillos positivos se expandieron y se exploraron de nuevo por el mismo procedimiento. Los clones positivos se confirmaron con respecto a la unión de doxorrubicina por un ELISA competitivo como se describe en el Ejemplo 11 o se subclonaron directamente. Los clones positivos por ELISA se subclonaron una o dos veces por dilución limitante de acuerdo con el procedimiento descrito en Coligan, J.E. y col, eds., Current Protocols in Immunology, 2.5.8 -2.5.17, (1992), Wiley & Sons, NY. Sólo se seleccionaron los anticuerpos monoclonales que fueron selectivos para la doxorrubicina y tenían una reactividad cruzada con respecto a la doxorrubicina con la aglicona de doxorrubicina del 15 % o menor como se determinó por estos procedimientos de exploración.
Ejemplo 8 Preparación de anticuerpos contra Doxorrubicina [5]
Dos grupos de diez ratones BALB/c hembra se inmunizaron i.p., un grupo con 100 µg/ratón de inmunógeno de doxorrubicina [5]-BTG preparado en el Ejemplo 4a y el otro con 100 µg/ratón de inmunógeno de doxorrubicina [5]-KLH preparado en el Ejemplo 4b emulsionado en Adyuvante Completo de Freund. Los ratones se reforzaron una vez cuatro semanas después de la inyección inicial con 100 ng/ratón de los mismos inmunógenos emulsionados en Adyuvante Incompleto de Freund. Diez y 28 días después del refuerzo, se obtuvo sangre de ensayo de cada ratón por extracción de sangre orbital. El anti-suero procedente de las muestras de sangre de ensayo del día 28 contenía anticuerpos contra doxorrubicina evaluados en los Ejemplos 10a y 11. Sólo se seleccionaron los antisueros que tenían anticuerpos que eran selectivos para doxorrubicina y tenían una reactividad cruzada con respecto a la doxorrubicina con la aglicona de doxorrubicina del 15 % o menor como se determina por estos procedimientos de exploración.
Ejemplo 9a Procedimiento de Sensibilización en Placas de Microtitulación con Conjugado de Doxorrubicina [4]-BSA 1:1
Con el fin de explorar anticuerpos y medir la concentración de doxorrubicina por el procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), se usaron placas de microtitulación de poliestireno (Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules) optimizadas con respecto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por placa. Cada pocillo se revistió con conjugado de doxorrubicina [4]-BSA 1:1 (preparado como en el Ejemplo 5) añadiendo 300 µl de conjugado de doxorrubicina [4]-BSA a 10 µg/ml en MES 0,01 M, pH = 6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con MES 0,005 M, pH 6 y después se bloquearon con 375 µl de sacarosa al 5 % y solución de caseinato sódico al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar la solución aplicada después del revestimiento, las placas se secaron a 37 ºC durante la noche.
Ejemplo 9b Procedimiento de Sensibilización en Placas de Microtitulación con Conjugado de Doxorrubicina [5]-BSA 3:1
Con el fin de explorar anticuerpos y medir la concentración de doxorrubicina por el procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), se usaron placas de microtitulación de poliestireno (Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules) optimizadas con respecto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por placa. Cada pocillo se revistió con conjugado de doxorrubicina [5]-BSA 3:1 (preparado como en el Ejemplo 6b) añadiendo 300 µl de conjugado de doxorrubicina [5]-BSA a 10 µg/ml en MES 0,01 M, pH = 6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con MES 0,005 M, pH 6 y después se bloquearon con 375 µl de sacarosa al 5 % y solución de caseinato sódico al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar la solución aplicada después del revestimiento, las placas se secaron a 37 ºC durante la noche. Ejemplo 9c Procedimiento de Sensibilización en Placas de Microtitulación con Conjugado de Doxorrubicina [5]-BSA 1:1
Con el fin de explorar anticuerpos y medir la concentración de doxorrubicina por el procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), se usaron placas de microtitulación de poliestireno (Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules) optimizadas con respecto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por placa. Cada pocillo se revistió con conjugado de doxorrubicina [5]-BSA 1:1 (preparado como en el Ejemplo 6c) añadiendo 300 µl de conjugado de doxorrubicina [5]-BSA a 10 µg/ml en MES 0,01 M, pH = 6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con MES 0,005 M, pH 6 y después se bloquearon con 375 µl de sacarosa al 5 % y solución de caseinato sódico al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar la solución aplicada después del revestimiento, las placas se secaron a 37 ºC durante la noche. Ejemplo 9d Procedimiento de Sensibilización en Placas de Microtitulación con Conjugado de Doxorrubicina [5]-BSA 1:1 (protegido terminalmente con tiol)
Con el fin de explorar anticuerpos y medir la concentración de doxorrubicina por el procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), se usaron placas de microtitulación de poliestireno (Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules) optimizadas con respecto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por placa. Cada pocillo se revistió con conjugado protegido terminalmente de doxorrubicina [5]-BSA 1:1 (preparado como en el Ejemplo 6b) añadiendo 300 µl de conjugado de doxorrubicina [5]-BSA a 10 µg/ml en MES 0,01 M, pH = 6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con MES 0,005 M, pH 6 y después se bloquearon con 375 µl de sacarosa al 5 % y solución de caseinato sódico al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar la solución aplicada después del revestimiento, las placas se secaron a 37 ºC durante la noche.
Ejemplo 10a Procedimiento de Exploración de Anticuerpos -Título
Se exploraron anticuerpos por el procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Este procedimiento para explorar los anticuerpos contra doxorrubicina (producidos en los Ejemplos 7 y 8) se realizó con las placas de microtitulación que se sensibilizaron con doxorrubicina [5]-BSA preparado en los Ejemplos 9b, c y d. El ensayo de exploración de anticuerpos se realizó diluyendo los antisueros que contenían anticuerpos contra doxorrubicina a 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000 y 1:1.000.000 en solución salina tamponada con fosfato que contenía BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 %. Para la evaluación de los anticuerpos monoclonales, se diluyeron sobrenadantes de hibridoma del Ejemplo 7, que se descubrió que eran positivos con respecto a la presencia de anticuerpos por el procedimiento del Ejemplo 10b, a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc. En cada pocillo de los pocillos sensibilizados con doxorrubicina [5]-BSA (preparado en los Ejemplos 9b, c, d) se añadieron 100 µL de anticuerpo diluido y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el anticuerpo se une al conjugado de doxorrubicina [5] en el pocillo. Los pocillos de las placas se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, NaCl al 0,9 %, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, pH 7,8 para retirar todo el anticuerpo que no se había unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra doxorrubicina unido al conjugado de doxorrubicina [5]-BSA en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 µl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica (aproximadamente 1/2800) en PBS con BSA al 0,1 %, ANS al 0,05 % y timerosal al 0,01 %, capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas y de producir un producto coloreado cuando se incubaba con un sustrato. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la cual el conjugado de anticuerpo de cabra antiratón-enzima HRP se une a los anticuerpos contra doxorrubicina en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para retirar el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP no unido. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado se continuó por la adición de 100 µl de TMB (TMB Liquid Substrate), un sustrato para HRP, para desarrollar color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Después de la incubación para el desarrollo de color, se añadieron 50 µL de solución de terminación (fluoruro sódico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo de color y, después de 10 segundos de agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm con un lector de placas de 96 pocillos. La cantidad de anticuerpo en un pocillo era proporcional a la absorbancia medida y se expresó como la dilución (título) que daba como resultado una absorbancia de 1,5. Los títulos se determinaron representando en un gráfico el logaritmo de la dilución de anticuerpo del anticuerpo medido (eje x) frente a la absorbancia a 650 nm (eje y) y extrapolando el título a una absorbancia de 1,5. El título determinó la concentración (dilución) de anticuerpo usada en el ensayo de placa de microtitulación competitivo indirecto descrito en el Ejemplo 11.
Ejemplo 10b Procedimiento de Exploración de Anticuerpos -Exploración Monoclonal
Se exploraron anticuerpos por el procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Este procedimiento para explorar anticuerpos monoclonales contra doxorrubicina (producidos en el Ejemplo 7) se realizó con las placas de microtitulación que se sensibilizaron con doxorrubicina [5]-BSA como se describe en el Ejemplo 9b. En cada pocillo de los pocillos sensibilizados con doxorrubicina [5]-BSA (preparado en el Ejemplo 9b) se añadieron 50 µl de solución salina tamponada con fosfato que contenía BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 % y después se añadieron 50 µl de sobrenadante de cultivo monoclonal y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el anticuerpo se une al conjugado de doxorrubicina [5] en el pocillo. Los pocillos de las placas se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, NaCl al 0,9 %, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, pH 7,8, para retirar todo el anticuerpo que no se había unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra doxorrubicina unido al conjugado de doxorrubicina [5]-BSA en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 µl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica predeterminada (aproximadamente 1/2800) en PBS con BSA al 0,1 %, ANS al 0,05 % y timerosal al 0,01 %, capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas y de producir un producto coloreado cuando se incubaba con un sustrato. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la cual el conjugado de anticuerpo de cabra antiratón-enzima HRP se une a anticuerpos contra doxorrubicina en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para retirar el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP no unido. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado se continuó por la adición de 100 µl de TMB (TMB Liquid Substrate), un sustrato para HRP, para desarrollar color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Después de la incubación para el desarrollo de color, se añadieron 50 µl de solución de terminación (fluoruro sódico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo de color y, después de 10 segundos de agitación, la absorbancia se determinó a 650 nm con un lector de placas de 96 pocillos. La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida. Las muestras con una absorbencia mayor de más de tres o más veces el nivel de fondo se consideraron positivas.
Ejemplo 11 Procedimiento de Inmunoensayo en Placas de Microtitulación Competitivo Indirecto que Determina la CI50 y la Reactividad Cruzada para Anticuerpos contra Doxorrubicina
Se midieron concentraciones de doxorrubicina por un procedimiento de ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) competitivo indirecto. Este procedimiento para medir las concentraciones de doxorrubicina se realizó con las placas de microtitulación que se sensibilizaron con doxorrubicina [5]-BSA descrito en los Ejemplos 9b, c, d. Se diluyeron doxorrubicina y doxorrubicina aglicona 10 veces en PBS que contenía BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 % sobre un intervalo de concentraciones de 0,01 a 10.000 ng/ml. El ensayo se realizó incubando 50 µl de los analitos a medir con 50 µl de anticuerpo (producido en los Ejemplos 7 y 8 con inmunógenos de los Ejemplos 3a, 3b, 4a y 4b) diluido a un título determinado en el Ejemplo 10a. Durante la incubación de 10 minutos (T.A., con agitación) hay una competición de unión de anticuerpo por el conjugado de doxorrubicina en el pocillo y el analito en solución. Después de esta incubación, los pocillos de la placa se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, NaCl al 0,9 %, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, pH 7,8 para retirar todo el material que no se había unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra doxorrubicina unido al conjugado de doxorrubicina [5]-BSA en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 µl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido a una actividad específica predeterminada (aproximadamente 1/2800) en PBS con BSA al 0,1 %, ANS al 0,05 % y timerosal al 0,01 %, capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas y de producir un producto coloreado cuando se incubaba con un sustrato. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la cual el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP se une a anticuerpos contra doxorrubicina en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para retirar el conjugado secundario no unido. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado se continuó por la adición de 100 µl de TMB (TMB Liquid Substrate), un sustrato para HRP, para
desarrollar el color en una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Después de la incubación para el desarrollo de color, se añadieron 50 µl de solución de terminación (fluoruro sódico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo de color y, después de 10 segundos de agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm con un 5 lector de placas de 96 pocillos. La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida e inversamente proporcional a la cantidad de doxorrubicina en la muestra. La absorbancia del color en los pocillos que contenían analito se comparó con la de los pocillos que no contenían analito y se generó una curva patrón. El valor de CI50 para un analito dado se definió como la concentración de analito que se necesita para inhibir el 50 % de la absorbancia 10 para los pocillos que no contenían analito. La reactividad cruzada de un analito dada se calculó como la relación de CI50 para doxorrubicina con respecto a la CI50 para la doxorrubicina aglicona y expresada como un porcentaje. Cuando se midió con un anticuerpo producido en los Ejemplos 7 y 8 con inmunógeno de los Ejemplos 3a, 3b, 4a y b, el porcentaje de reacción cruzada con respecto a la doxorrubicina para la doxorrubicina aglicona fue menor o igual al 10
15 %. Los resultados se presentan en las tablas 1 y 2 mostradas a continuación.
Tabla 1: Reactividad cruzada de Inmunoensayo Competitivo usando anticuerpos contra doxorrubicina [5]-BTG y KLH (Ejemplo 8) con conjugado de doxorrubicina [5]-BSA (Ejemplos 9b, 9c, 9d) como revestimientos de placa.
20
Inmunógeno Ejemplo 4a
Inmunógeno Ejemplo 4b
% de reactividad cruzada
% de reactividad cruzada
Placa sensibilizada como en el Ejemplo
Doxorrubicina Doxorrubicina aglicona Doxorrubicina Doxorrubicina aglicona
9b
100 % 5,7 % 100 % 8,6 %
9c
100 % 10,0 % 100 % no medido
9d
100 % 8,8 % 100 % no medido
Tabla 2: Reactividad cruzada de Inmunoensayo Competitivo usando un anticuerpo monoclonal contra doxorrubicina [4]-BTG y KLH (Ejemplo 7) con conjugado de doxorrubicina [5]-BSA (Ejemplos 9b, 9c, 9d) como revestimiento de placa.
Inmunógeno Ejemplo 3a
Inmunógeno Ejemplo 3b
% de reactividad cruzada
% de reactividad cruzada
Placa sensibilizada como en el Ejemplo
Doxorrubicina Doxorrubicina aglicona Doxorrubicina Doxorrubicina aglicona
9b
100 % 10,6 % 100 % 1,5 %
9c
100 % 12,9 % 100 % 3,9 %
9d
no ensayado 100 % 3,0 %
5
Como puede verse por estas tablas, los anticuerpos de la presente invención son sustancialmente reactivos de forma selectiva con la forma parental activa de doxorrubicina y no presentan sustancialmente reacción cruzada con el metabolito inactivo aglicona de doxorrubicina.
10


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Claims (26)

1. Un inmunoensayo para detectar doxorrubicina en una muestra que comprende proporcionar una mezcla de a) dicha muestra, b) un anticuerpo que es reactivo selectivamente con doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 % y c) un conjugado de un vehículo que tiene un
imagen1
en la que Aes
=N-O-, o
Y es un grupo espaciador orgánico;
X es un grupo funcional capaz de unirse a dicho vehículo a través de dicho grupo amino o tiol; 15 y
p es un número entero de 0 a 1;
o un compuesto de fórmula:
en la que X, Y y p son como se han definido anteriormente y B es -CH2-o
o una mezcla de los mismos;
imagen2
imagen2
5 provocando que la doxorrubicina en la muestra y dicho conjugado en dicha mezcla se unan en dicha mezcla con dicho anticuerpo y, después de ello, midiendo la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que se une o separa de dicho anticuerpo, de manera que puede determinarse la presencia de doxorrubicina en la muestra.
10 2. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que p es 0 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
3.
Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que p es 1 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
4.
Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que Y es alquileno que
15
imagen3
en los que n y o son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
5.
Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que Y es alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
6.
Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es
-N =C =R4,
imagen2
10 en los que R3 es hidrógeno o se toma junto con el átomo de oxígeno al que está unido para formar un éster reactivo y R4 es oxígeno o azufre en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
7. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en 15 el que X es
imagen2
y R3 es hidrógeno en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
8. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el 20 que X es
imagen2
y R3 forma un éster reactivo en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
9. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el éster formado es un
25 éster de alquilo inferior, imidoéster o amidoéster en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
10.
Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que X es un grupo funcional capaz de unirse a un grupo tiol en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
11.
Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que X es
imagen2
en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.
12. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en 10 el que la muestra es una muestra humana.
13. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno que comprende un vehículo inmunogénico que tiene un grupo tiol o amino reactivo conjugado con un compuesto de
15 fórmula:
imagen2
en la que p, X, Y y A son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un compuesto de fórmula:
imagen2
en la que p, Y, X y B son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una mezcla de los mismos.
14. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el compuesto conjugado con dicho vehículo inmunogénico para generar los anticuerpos tiene la fórmula:
imagen2
en la que p, X, Y y A son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
10
15. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que el vehículo contiene un grupo tiol y X en el compuesto que está unido al polímero inmunogénico es un grupo funcional capaz de reaccionar con dicho tiol.
15 16. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que X es
imagen2
17.
Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que
18.
Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el vehículo inmunogénico contiene como grupo funcional
imagen2
5
en el que v es un número entero de 1 a 6.
19.
Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está unido a un soporte sólido.
20.
Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el soporte sólido son placas de microtitulación.
10
21. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el soporte sólido son 15 nanopartículas.
22. Un anticuerpo que se une selectivamente a doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 %.
20 23. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho anticuerpo se obtiene de ratón, oveja, conejos o ratas.
24. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
25
25.
Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho anticuerpo es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.
26.
Un kit para determinar la presencia de doxorrubicina en una muestra de un paciente
30 que comprende reactivos en distintos recipientes, siendo uno de los reactivos un conjugado de un vehículo que contiene un grupo amino o tiol funcional con un compuesto de fórmula:
imagen2
en la que p, X, Y y A son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un compuesto de fórmula:
imagen2
5 en la que p, Y, X y B son como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una mezcla de los mismos; y conteniendo el segundo recipiente un anticuerpo que es sustancialmente reactivo de forma selectiva con doxorrubicina y tiene una reactividad cruzada con respecto a doxorrubicina con doxorrubicina aglicona de menos del 20 %.
10 27. Un kit de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho conjugado está presente en una cantidad predeterminada en dicho primer recipiente.
28. Un kit de acuerdo con la reivindicación 26 o la reivindicación 27, en el que dicho kit se usa para determinar la cantidad de doxorrubicina en dicha muestra.
15
29. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dicho anticuerpo es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25.
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