ES2347336T3 - Inmunoanalisis del taxol. - Google Patents

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ES2347336T3 ES05781612T ES05781612T ES2347336T3 ES 2347336 T3 ES2347336 T3 ES 2347336T3 ES 05781612 T ES05781612 T ES 05781612T ES 05781612 T ES05781612 T ES 05781612T ES 2347336 T3 ES2347336 T3 ES 2347336T3
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Salvatore Salamone
Jodi Blake Courtney
Dennis Stocker
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Saladax Biomedical Inc
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2407/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving terpenes
    • G01N2407/02—Taxol; Taxanes

Abstract

Un inmunoanálisis para detectar el taxol en una muestra que comprende proporcionar una mezcla que contiene dicha muestra, un anticuerpo que es selectivamente reactivo con el taxol y que tiene una reactividad cruzada con el 6-α-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos del 10% y un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** en la que B es -CH2- o **(Ver fórmula)** Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina; p es un número entero de 0 a 1; y Ph es fenilo, que hace que el taxol de la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y, a partir de entonces, medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que está unido o no unido a dicho anticuerpo mediante lo cual se puede determinar la presencia de taxol en la muestra.

Description

Inmunoanálisis del taxol.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los análisis inmunológicos para determinar la presencia y/o cuantificar la cantidad de taxol en fluidos biológicos humanos con el fin de determinar de manera rápida las concentraciones óptimas del fármaco durante una quimioterapia.
Antecedentes de la invención
Cáncer es un término usado para describir un grupo de tumores malignos que comparten el rasgo común de desarrollarse cuando las células de una parte del cuerpo comienzan a crecer sin control. La mayoría de los cánceres se forman como tumores, pero también se pueden manifestar en la sangre y circular por otros tejidos en los que crecen. Los tumores malignos cancerosos se tratan más comúnmente con una combinación de cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento usado para tratar un cáncer específico depende de varios factores que incluyen el tipo de tumor maligno canceroso y el estadio en el que fue diagnosticado.
El taxol, también conocido como paclitaxel, es uno de los agentes citotóxicos más comunes usados para el tratamiento del cáncer de mama (Holmes et. al. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 10, 60, 1991), del cáncer de ovario (Einzig et. al. Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 31, 1114, 1990) y del cáncer de pulmón de células no pequeñas. El taxol tiene la fórmula:
1
Este compuesto se ha asociado con efectos secundarios debilitantes, tales como la pérdida de densidad de médula ósea, reacción alérgica, neutropenia, hipotensión, bardicardia, náuseas y vómitos. Mediante el control de los niveles de taxol en el cuerpo y el ajuste de la dosis, es posible controlar y limitar mejor estos efectos secundarios en los pacientes.
Al mismo tiempo, a menudo, existe una relación muy variable entre la dosis del taxol y la concentración del fármaco en suero resultante que afecta al efecto terapéutico. El grado de variabilidad farmacocinética intra- e interindividual del taxol puede ser tan elevado como de cinco veces (Gurney et. al., J. Clin. Oncol. 14, pp 2590-2611, 1996) y se ve afectado por muchos factores que incluyen:
\bullet
la función orgánica,
\bullet
la regulación genética,
\bullet
el estado patológico,
\bullet
la edad,
\bullet
la interacción fármaco-fármaco,
\bullet
el momento de la ingestión del fármaco,
\bullet
el modo de administración del fármaco y
\bullet
la administración en relación con la técnica.
Como resultado de esta variabilidad, las dosis iguales de un mismo fármaco en individuos diferentes pueden producir resultados clínicos espectacularmente diferentes (Hon et. al. Clinical Chemistry 44, pp 388-400,1998). La eficacia de la misma dosis de taxol varía significativamente en base al aclaramiento del fármaco individual y la concentración de fármaco en suero final en el paciente. La administración terapéutica del fármaco proporcionaría al profesional clínico la oportunidad de comprender la variación producida en el paciente en la administración tanto oral como intravenosa del fármaco. Con la administración terapéutica del fármaco, se podrían individualizar las dosis de fármaco para el paciente, y las posibilidades de tratar el cáncer con eficacia, sin los no deseados efectos secundarios, podrían ser mucho mayores.
Además, la administración terapéutica del fármaco taxol serviría como una excelente herramienta para garantizar la administración de la quimioterapia con las dosis reales prescritas y el logro de niveles de concentración en suero eficaces. Se ha descubierto que la variabilidad de la concentración en suero no sólo se debe a factores fisiológicos, sino que también puede ser el resultado de la variación en la técnica de administración.
La administración terapéutica rutinaria del fármaco taxol requeriría la disponibilidad de análisis automáticos sencillos adaptables al equipo de laboratorio general. Los análisis que mejor cumplen estos criterios son los inmunoanálisis. Para el taxol, se han publicado un radioinmunoanálisis y un análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima (análisis ELISA) (Erlanger et. al., patente estadounidense 5.756.301, 26 de mayo de 1998 y Grothaus et al., J. Nat. Prod., 1995, Vol. 58, n.º 7, pp 1003-1014). Sin embargo, los derivados y los inmunógenos usados en este análisis confieren a los correspondientes anticuerpos una amplia reactividad cruzada con el taxol y los metabolitos del taxol, particularmente, con el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel. Para ser más eficaz en el control de los niveles de fármaco, el anticuerpo debería ser más específico del compuesto activo y presentar una reactividad cruzada de muy baja a nula con los metabolitos no activos.
Resumen de la invención
Según la presente invención, se ha producido una nueva clase de anticuerpos que son sustancialmente selectivamente reactivos con el taxol como para unirse al taxol sin una reactividad cruzada sustancial con los metabolitos del taxol, particularmente, con el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitaxel. "Selectivamente reactivo" pretende significar que este anticuerpo sólo reacciona con la molécula de taxol y no reacciona sustancialmente con otros compuestos, tales como los metabolitos del taxol, siendo los metabolitos bloqueadores más importantes el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitaxel.
Se ha descubierto que mediante el uso de inmunógenos que sean conjugados de un polímero de poliamina inmunogénico con un compuesto de fórmula:
2
en la que:
Y es un grupo espaciador orgánico;
X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina;
p es un número entero de 0 a 1; y
Ph es fenilo
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y B es -CH_{2}- o
3
o mezclas del mismo; se producen anticuerpos que son específicos del taxol y que no reaccionan sustancialmente ni se unen con otros compuestos, tales como metabolitos o compuestos relacionados del taxol, tales como Bacatina III, 3'-p-hidroxipaclitaxel y 6-\alpha-hidroxipaclitaxel. El suministro de estos anticuerpos que reaccionan sustancialmente selectivamente con el taxol y no reaccionan de manera cruzada con el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel ni con el 3'-p-hidroxipaclitaxel (i.e., menos del 10%) permite la producción de un inmunoanálisis que puede detectar y controlar específicamente el taxol en muestras de fluidos de pacientes que estén siendo tratados con taxol. También se incluyen en la presente los reactivos y equipos para dicho inmunoanálisis. La presencia del 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitaxel como metabolitos del taxol es la causa principal de lecturas de falsos positivos en los inmunoanálisis pasados del taxol.
Descripción detallada
Según la presente invención, se proporciona una nueva clase de anticuerpos que reaccionan sustancialmente selectivamente con el taxol y no reaccionan sustancialmente ni reaccionan de manera cruzada con los metabolitos del taxol mencionados anteriormente en la presente memoria. Se ha descubierto que con el uso de estos derivados del 7-hidroxi-taxol de fórmula II-B como inmunógenos, se proporciona esta nueva clase de anticuerpos de la presente invención. Mediante el uso de estos anticuerpos se ha desarrollado un inmunoanálisis, incluyendo reactivos y equipos para tal inmunoanálisis, para detectar y/o cuantificar el taxol en sangre, plasma u otras muestras de fluidos corporales. Mediante el uso de este inmunoanálisis, se puede detectar y/o cuantificar la presencia y la cantidad de taxol en muestras de fluidos corporales, preferiblemente, en una muestra de sangre o de plasma. De esta manera, se puede hacer un seguimiento de un paciente que esté siendo tratado con taxol durante una terapia y ajustar su tratamiento según dicho seguimiento. Por medio de la presente invención se consigue la administración terapéutica del fármaco taxol en pacientes con cáncer que estén siendo tratados con taxol como agente quimioterapéutico.
Los reactivos utilizados en el análisis de la presente invención son conjugados de un vehículo polimérico con los compuestos de fórmula II-B. Estos conjugados son parejas de unión competitiva con el taxol presente en la muestra por la unión con los anticuerpos de la presente. Por lo tanto, la cantidad de reactivo de conjugado que se une con el anticuerpo será inversamente proporcional a la cantidad de taxol de la muestra. Según la presente, el análisis utiliza cualquier procedimiento de medición convencional para detectar y medir la cantidad de dicho conjugado que está unido o no está unido con el anticuerpo. Mediante el uso de dicho procedimiento, se puede determinar la cantidad de conjugado unido o no unido. Generalmente, la cantidad de taxol de una muestra se determina correlacionando la cantidad medida del conjugado unido o no unido producido por el taxol en la muestra con valores del conjugado unido o no unido determinados a partir de muestras patrón o de curvas de calibración que contienen cantidades conocidas de taxol, cuyas cantidades conocidas están en el intervalo esperado para la muestra que se vaya a analizar. Estos estudios para producir curvas de calibración se determinan usando el mismo procedimiento de inmunoanálisis usado para la muestra.
Los conjugados, así como los inmunógenos, se preparan a partir de compuestos de fórmula II-B. Los conjugados o los inmunógenos del vehículo están unidos a las partes ligando del polímero de poliamina que tienen la fórmula:
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en la que X', B y p son como se definen anteriormente.
Estas partes ligando pueden estar unidas a uno o más sitios activos del vehículo o del polímero de poliamina del inmunógeno.
Definiciones
A lo largo de la presente descripción, se entenderán las siguientes definiciones:
El término "Ph", como se usa a lo largo de esta solicitud, indica un radical fenilo. El término "alquileno" indica un sustituyente de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada saturada divalente que contiene de uno a diez átomos de carbono.
Los términos "inmunógeno" e "inmunogénico" se refieren a sustancias capaces de provocar, producir o generar una respuesta inmune en un organismo.
El término "conjugado" se refiere a cualquier sustancia formada a partir de la unión de dos partes. Los conjugados representativos según la presente invención incluyen los formados mediante la unión de una molécula pequeña, tal como el compuesto de fórmula II-B, y una molécula grande, tal como un vehículo o un polímero de poliamina, particularmente, una proteína. En el conjugado, la molécula pequeña puede estar unida a uno o más sitios activos de la molécula grande. El término conjugado incluye el término inmunógeno.
"Haptenos" son antígenos parciales o incompletos. Son sustancias libres de proteínas, en su mayor parte, sustancias de bajo peso molecular, que no son capaces de estimular la formación de anticuerpos, pero que reaccionan con los anticuerpos. Éstos se forman mediante el acoplamiento de un hapteno con un vehículo inmunogénico de alto peso molecular y luego la inyección de este producto acoplado, i. e., el inmunógeno, en un sujeto humano o animal. El hapteno de la presente es el taxol.
Como se usa en la presente memoria, un "grupo espaciador" o "espaciador" se refiere a una parte de una estructura química que conecta dos o más subestructuras, tales como haptenos, vehículos, inmunógenos, marcadores o trazadores, a través de un grupo CH_{2} o un grupo de unión funcional. Estos grupos espaciadores se enumerarán en lo sucesivo en esta solicitud. Los átomos de un grupo espaciador y los átomos de una cadena del grupo espaciador se conectan entre sí mediante enlaces químicos. Entre los espaciadores preferidos están las cadenas de carbonos, saturadas o insaturadas, lineales o ramificadas. Estas cadenas de carbonos también pueden incluir uno o más heteroátomos en la cadena o en los terminales de las cadenas. "Heteroátomos" pretende significar átomos distintos del carbono que se seleccionan del grupo constituido por oxígeno, nitrógeno o azufre. Los grupos espaciadores también pueden incluir grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como una sustitución en uno de los átomos de la cadena.
El número de átomos del grupo espaciador se determina contando los átomos distintos del hidrógeno. El número de átomos de una cadena de un grupo espaciador se determina contando el número de átomos distintos del hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras que están siendo conectadas. Se puede usar un grupo de unión funcional para activar, p. ej., proporcionar un sitio funcional disponible en un hapteno o un grupo espaciador para sintetizar un conjugado de un hapteno con un marcador o un vehículo o un polímero de poliamina.
Un "vehículo inmunogénico", como se usa la expresión en la presente memoria, es una sustancia inmunogénica, comúnmente, una proteína, que se puede unir con un hapteno, en este caso, con el taxol o con los derivados de taxol descritos anteriormente en la presente memoria, permitiendo así que estos derivados de hapteno provoquen una respuesta inmune y generen la producción de anticuerpos que puedan unirse específicamente con estos haptenos. En lo sucesivo, en esta solicitud, se enumerarán los vehículos inmunogénicos y los grupos de unión. Entre las sustancias vehículo inmunogénicas se incluyen proteínas, glucoproteínas, poliamino-polisacáridos complejos, partículas y ácidos nucleicos que son reconocidos como foráneos y provocan, por tanto, una respuesta inmunológica en el huésped. Los poliamino-polisacáridos se pueden preparar a partir de polisacáridos usando cualquier procedimiento convencional conocido para esta preparación.
También se pueden emplear diversos tipos de proteínas como vehículo inmunogénico de poli(aminoácido). Estos tipos incluyen albúminas, proteínas séricas, lipoproteínas, etc. Las proteínas ilustrativas incluyen la albúmina de suero bovino (ASB), la hemocianina de lapa californiana (KLH), la ovoalbúmina, la tiroglobulina bovina (BTG), etc. Alternativamente, se pueden utilizar poli(aminoácidos) sintéticos.
Los vehículos inmunogénicos también pueden incluir poliamino-polisacáridos que sean un polímero de alto peso molecular formado mediante condensaciones repetidas de monosacáridos. Los ejemplos de polisacáridos son almidones, glucógeno, celulosa, gomas de hidratos de carbono, tales como goma arábiga, agar, etcétera. El polisacárido también contiene residuos de poliaminoácido y/o residuos lipídicos.
El vehículo inmunogénico también puede ser un poli(ácido nucleico) bien solo o conjugado con uno de los poli(aminoácidos) o polisacáridos anteriormente mencionados.
El vehículo inmunogénico también puede incluir partículas sólidas. Las partículas son generalmente de un diámetro de al menos aproximadamente 0,02 micrómetros (\mum) o de no más de aproximadamente 100 \mum, y habitualmente, de aproximadamente 0,05 \mum a 10 \mum. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, óptimamente, de una densidad que se aproxima a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml, y compuesta por material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos, tales como células y microorganismos, incluyendo ejemplos no restrictivos, tales como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las partículas también pueden estar compuestas de polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas posfolipídicas o lipoproteínas.
"Poli(aminoácido)" o "polipéptido" es una poliamida formada a partir de aminoácidos. Los poli(aminoácidos) variarán generalmente de un peso molecular de aproximadamente 2.000, sin un límite superior de peso molecular, siendo normalmente de menos de 10.000.000 y, habitualmente, de no más de aproximadamente 600.000 daltons. Habitualmente, habrá diferentes intervalos en función de si hay implicado o no un vehículo inmunogénico o una enzima.
Un "péptido" es cualquier compuesto formado mediante el enlace de dos o más aminoácidos mediante enlaces de tipo amida (peptídicos), habitualmente, un polímero de \alpha-aminoácidos en el que el grupo \alpha-amino de cada residuo de aminoácido (a excepción del terminal NH_{2}) está unido al grupo \alpha-carboxilo del siguiente residuo de la cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y poli(aminoácido) se usan como sinónimos en la presente memoria para referirse a esta clase de compuestos sin ninguna restricción en cuanto al tamaño. Los miembros más grandes de esta clase se denominan proteínas.
Un "marcador", una "molécula detectora" o un "trazador" es cualquier molécula que produce, o que puede ser inducida a producir, una señal detectable. El marcador puede estar conjugado a un analito, un inmunógeno, un anticuerpo u otra molécula, tal como un receptor o una molécula que se pueda unir con un receptor, tal como un ligando, particularmente, un hapteno. Los ejemplos no restrictivos de marcadores incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fragmentos enzimáticos, sustratos enzimáticos, inhibidores enzimáticos, coenzimas, catalizadores, fluoróforos, colorantes, quimioluminiscentes, luminiscentes o sensibilizadores; una partícula no magnética o magnética, un soporte sólido, un liposoma, un ligando o un receptor.
El término "anticuerpo" se refiere a una pareja de unión proteica específica para un antígeno, y es cualquier sustancia o grupo de sustancias que tenga una afinidad de unión específica por un antígeno hasta la exclusión de otras sustancias. El término genérico anticuerpo subsume anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
El término "derivado" se refiere a un compuesto químico o una molécula formada a partir de un compuesto precursor mediante una o más reacciones químicas.
El término "vehículo" se refiere a partículas sólidas y/o polímeros poliméricos, tales como polímeros inmunogénicos, tales como aquéllos mencionados anteriormente. Cuando el vehículo es una partícula sólida, la partícula sólida puede estar unida, revestida con o unida de otro modo con un polímero de poliamina para proporcionar uno o más sitios reactivos para la unión con el grupo funcional terminal X de los compuestos de fórmula II-B.
El término "equipo de reactivos" o "equipo de análisis" se refiere a un conjunto de materiales que se usan en la realización de un análisis. Los reactivos se pueden proporcionar en una combinación empaquetada en el mismo envase o en envases separados en función de sus reactividades cruzadas y estabilidades, y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y las proporciones de los reactivos proporcionados en el equipo se pueden seleccionar para proporcionar resultados óptimos para una determinada aplicación. Un equipo de reactivos que incorpora las características de la presente invención comprende anticuerpos específicos del taxol. El equipo puede comprender además ligandos del analito, y
materiales de calibración y de control. Los reactivos pueden permanecer en estado líquido o pueden estar liofilizados.
La expresión "materiales de calibración y de control" se refiere a cualquier patrón o material de referencia que contiene una cantidad conocida de un fármaco que se vaya a medir. La concentración del fármaco se calcula comparando los resultados obtenidos para la muestra desconocida con los resultados obtenidos para el patrón. Esto se hace comúnmente construyendo una curva de calibración.
El término "muestra biológica" incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia procedente de un ser vivo o un ser anteriormente vivo. Tales seres vivos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos, caballos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, linfa, nódulos linfáticos, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos sinoviales, células endoteliales y piel.
Reactivos e inmunógenos
En la construcción de un inmunoanálisis, se construye un conjugado de taxol para competir con el taxol de la muestra por los sitios de unión de los anticuerpos. En el inmunoanálisis de la presente, los reactivos son derivados de 7-taxol de fórmula III-B. En los compuestos de fórmula III-B, el espaciador ligador constituye la parte -CH_{2}-(Y)_{p}-
X'- o -B-(Y)_{p}-X' de esta molécula. Este ligador X' y el espaciador -CH_{2}-(Y)_{p}- o -B-(Y)_{p}-X' son convencionales en la preparación de conjugados e inmunógenos. En los compuestos de fórmula III-B, se puede utilizar cualquiera de los grupos de unión a espaciadores convencionales para preparar conjugados e inmunógenos para inmunoanálisis. Tales ligadores y espaciadores convencionales se revelan en la patente estadounidense n.º 5.501.987 y la patente estadounidense n.º 5.101.015.
Entre los grupos espaciadores preferidos se incluyen los grupos espaciadores mencionados anteriormente en la presente memoria. Los grupos espaciadores particularmente preferidos son grupos tales como el alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono,
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en la que n y o son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6, siendo el alquileno el grupo espaciador especialmente preferido.
En los compuestos de fórmula III-B, X' es -CH_{2}- o un grupo funcional que liga el espaciador, preferiblemente, con un grupo amina del vehículo polimérico. El grupo X' es el resultado del grupo funcional terminal X en los compuestos de fórmula II-B, que es capaz de unirse al grupo amino del polímero de poliamina usado bien como el vehículo o como el inmunógeno. Se puede utilizar cualquier grupo funcional terminal capaz de reaccionar con una amina como el grupo funcional X en los compuestos de fórmula II-B. Estos grupos funcionales terminales incluidos preferiblemente en X son:
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en la que R_{3} es hidrógeno o tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y R_{4} es oxígeno o azufre. El radical -N=C=R_{4} puede ser un isocianato o un isotiocianato. Los ésteres activos formados por OR_{3} incluyen imidoéster, tal como N-hidroxisuccinamida, 1-hidroxi-benzotriazol y p-nitrofenil-éster. Sin embargo, se puede usar cualquier éster activo que pueda reaccionar con un grupo amina.
El grupo carboxílico y los ésteres activos son acoplados al vehículo o al polímero inmunogénico mediante procedimientos convencionales. El grupo amina del polímero de poliamina, tal como una proteína, produce un grupo amida que conecta el espaciador con el polímero, los inmunógenos o el vehículo y/o los conjugados de la presente.
En los inmunógenos y los conjugados de la presente invención, los enlaces químicos entre los haptenos de taxol que contienen grupos carboxilo y los grupos amino del polímero de poliaminas del vehículo o del inmunógeno se pueden establecer usando una variedad de procedimientos conocidos por el experto en la técnica. Frecuentemente, es preferible formar enlaces de tipo amida. Los enlaces de tipo amida se forman activando primero el resto de ácido carboxílico del hapteno taxol de los compuestos de fórmula II-B haciendo reaccionar el grupo carboxilo con un reactivo del grupo saliente (p. ej., N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol, p-nitrofenol y similares). Se puede usar un reactivo activador tal como diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y similares. Luego se hace reaccionar la forma activada del grupo carboxilo del hapteno taxol de fórmula II-B con una solución tamponada que contiene el la proteína vehículo.
En los casos en los que el derivado de taxol de fórmula II-B contiene un grupo amino primario o secundario, así como el grupo carboxilo, es necesario usar un grupo protector de aminas durante las reacciones de activación y acoplamiento para evitar que los conjugados reaccionen entre sí. Comúnmente, las aminas del conjugado se protegen formando la correspondiente N-trifluoroacetamida, N-terc-butiloxicarbonil-uretano (N-t-BOC-uretano), N-carbobenciloxi-uretano o una estructura similar. Una vez realizada la reacción de acoplamiento con el polímero inmunogénico o el vehículo, según lo descrito anteriormente, se puede retirar el grupo protector de aminas usando reactivos que no alteren de otro modo la estructura del inmunógeno o del conjugado. Tales reactivos y procedimientos son conocidos por el experto en la técnica e incluyen ácidos anhidros o acuosos débiles o fuertes, bases anhidras o acuosas débiles o fuertes, reactivos que contienen hidruro, tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio y la hidrogenación catalítica. En la patente estadounidense n.º 3.996.344 y la patente estadounidense n.º 4.016.146, se revelan diversos procedimientos de conjugación de haptenos y vehículos.
Por otro lado, cuando X es un radical de isocianato o de tioisocianato terminal del compuesto de fórmula II-B, estos radicales, cuando han reaccionado con la amina libre de un polímero de poliamina, producen el conjugado o el inmunógeno de fórmula III-B, en la que X' es
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en la que R_{4} es como se define anteriormente, que se conecta funcionalmente con el grupo amino R_{4} del vehículo de poliamina o del polipéptido inmunogénico.
Cuando X, en los compuestos de fórmula II-B, es un grupo aldehído, estos compuestos pueden ser conectados al grupo amina del polipéptido de poliamina o del vehículo a través de un enlace de tipo amina mediante aminación reductora. Se puede usar cualquier procedimiento convencional de condensación de un aldehído con una amina, tal como a través de una aminación reductora para formar este enlace. En este caso, X' de las partes ligando de fórmula III-B es
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Los compuestos 7-sustituidos de fórmula II-B en la que B es -CH_{2}- se forman haciendo reaccionar el grupo 7-hidroxilo del taxol con un haluro de fórmula:
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en la que p, Y y X son como se definen anteriormente.
En la formación del compuesto de fórmula II-B del taxol, se puede utilizar cualquier procedimiento convencional para hacer reaccionar un alcohol para formar un éter en la condensación del compuesto de fórmula V-C con la posición 7-hidroxilo del taxol. El uso de un haluro en el compuesto de fórmula V-C proporciona un medio eficaz para formar tal éter mediante la condensación con el alcohol. Por otro lado, cuando el compuesto de fórmula V-C contiene grupos funcionales, que pueden interferir con esta reacción para formar el compuesto de fórmula II-B, se pueden proteger estos grupos funcionales por medio de grupos protectores adecuados que se puedan eliminar tras esta reacción según lo descrito anteriormente en la presente memoria.
Los compuestos 7-sustituidos de fórmula II-B en la que B es
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se producen haciendo reaccionar el grupo 7-hidroxilo del taxol con un compuesto amino de fórmula:
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en la que X, Y y p son como se definen anteriormente.
Tras convertir primero el grupo 7-hidroxilo del taxol en el grupo cloroformiático
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Se puede usar cualquier procedimiento convencional para convertir un grupo hidroxilo en un grupo cloroformiático. Tras la formulación de un cloroformiato, se condensa el grupo halo del cloroformiato con el grupo amina del compuesto de fórmula VI. Antes de esta reacción, se protegen el grupo reactivo del taxol y/o del compuesto de fórmula VI según lo descrito anteriormente en la presente memoria con un grupo protector convencional.
Se pueden eliminar estos grupos protectores tras esta condensación del haluro mediante procedimientos convencionales, tales como los descritos anteriormente en la presente memoria.
El compuesto de fórmula II-B se puede convertir en los inmunógenos y/o los reactivos de conjugados de la presente haciendo reaccionar estos compuestos con una poliamina o con un polipéptido. Se puede utilizar el mismo polipéptido como vehículo y como polímero inmunogénico en el inmunógeno de la presente con la condición de que la poliamina o el polipéptido sean inmunológicamente activos. Sin embargo, para formar los conjugados, es necesario que estos polímeros no produzcan una respuesta inmunológica como la necesaria para los inmunógenos. Según la presente, se pueden conjugar los diversos grupos funcionales representados por X en los compuestos de fórmula II-B con el material polimérico mediante procedimientos convencionales de unión de un grupo funcional con un grupo amina contenido en el polímero. Según una realización preferida, en el compuesto de fórmula II-B, X es un grupo de ácido carboxílico.
Anticuerpos
La presente invención también se refiere a nuevos anticuerpos incluyendo anticuerpos monoclonales contra el taxol producidos utilizando los inmunógenos anteriormente mencionados. Según la presente, se ha descubierto que estos anticuerpos producidos según la presente son selectivamente reactivos con el taxol, y a diferencia de los anticuerpos de la técnica anterior, no reaccionan con los metabolitos que interferirían con los inmunoanálisis del taxol. Los más problemáticos de estos metabolitos del taxol son el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitaxel. La capacidad de los anticuerpos de la presente para no reaccionar con estos metabolitos 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y 3'-hidroxipaclitaxel convierte a estos anticuerpos en particularmente valiosos para proporcionar un inmunoanálisis para el taxol.
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos y anticuerpos monoclonales contra el taxol según lo definido en las reivindicaciones.
Los antisueros de la invención se pueden producir convenientemente inmunizando animales huésped con los inmunógenos de la presente. Los animales huésped adecuados incluyen roedores tales como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cerdos de guinea y similares, o mamíferos superiores, tales como cabras, ovejas, caballos y similares. Las dosis iniciales, las sangrías y las inyecciones de refuerzo se pueden administrar y realizar según protocolos aceptados para provocar respuestas inmunes en animales, p. ej., en una realización preferida, los ratones recibieron una dosis inicial de 100 ug de inmunógeno/ratón, i.p., y dos o más inyecciones de refuerzo posteriores de entre 50 y 100 ug inmunógeno/ratón en un período de seis meses. Mediante una sangría periódica, se observaron las muestras de sangre de los ratones inmunizados en cuanto al desarrollo de una respuesta inmune frente a la unión del taxol utilizando inmunoanálisis convencionales. Estos procedimientos proporcionan un modo conveniente de rastrear los huéspedes que estén produciendo antisueros que tengan la actividad deseada. También se rastrearon los anticuerpos contra los metabolitos principales del taxol, y no se observó una unión sustancial con estos compuestos.
Los anticuerpos monoclonales se producen convenientemente inmunizando ratones Balb/c según el plan anterior e inyectando después 100 ug de inmunógeno i.p. o i.v. en los ratones en tres días sucesivos comenzando cuatro días antes de la fusión celular. Por supuesto, también se pueden utilizar otros protocolos en la técnica de los anticuerpos. El protocolo de inmunización completo detallado en la presente memoria proporcionó un protocolo óptimo para la respuesta del anticuerpo en suero contra el taxol.
Se pueden usar linfocitos B obtenidos de bazo, sangre periférica, nódulos linfáticos u otro tejido del huésped como la célula productora de anticuerpos monoclonales. Los más preferidos son los linfocitos B obtenidos del bazo. Los hibridomas capaces de generar los anticuerpos monoclonales deseados de la invención se obtienen fusionando tales linfocitos B con una línea celular inmortal, que es una línea celular que confiere una estabilidad del cultivo tisular a largo plazo en la célula híbrida. En la realización preferida de la invención, la célula inmortal puede ser una célula linfoblastoide o una célula de plasmacitoma, tal como una célula de mieloma, una célula productora de anticuerpos, pero también una célula maligna. Los hibridomas murinos que producen anticuerpos monoclonales contra el taxol se forman mediante la fusión de células de mieloma de ratón y células de bazo procedentes de ratones inmunizados contra conjugados de taxol-proteína. Es posible producir anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados mediante la clonación de genes que expresan los anticuerpos de las células de hibridoma y el empleo de procedimientos de ADN recombinante actualmente ampliamente conocidos en la técnica, bien para unir la subsecuencia de la región variable de ratón con las regiones constantes humanas o para combinar las regiones marco humanas con regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina de ratón o de rata donante. En la solicitud de patente internacional WO 92/11018, se expone un procedimiento mejorado para llevar a cabo la humanización de anticuerpos monoclonales murinos que proporciona anticuerpos de mayores afinidades.
Se pueden producir fragmentos polipeptídicos que sólo comprendan una parte de la estructura primaria del anticuerpo, fragmentos que poseen una o más actividades de la inmunoglobulina. Estos fragmentos polipeptídicos se pueden producir mediante la escisión proteolítica de anticuerpos intactos mediante procedimientos ampliamente conocidos en la técnica, o insertando codones de terminación en las ubicaciones deseadas de los vectores de expresión que contienen los genes frente a los anticuerpos usando una mutagénesis de sitio dirigida para producir fragmentos Fab o fragmentos (Fab')_{2}. Se pueden producir anticuerpos monocatenarios uniendo las regiones VL y VH con un ligador de ADN (véase Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85:5879-5883 (1988) y Bird et al., Science, 242:423-426 (1988)).
Los anticuerpos de la presente son selectivos del taxol sin tener ninguna reactividad cruzada sustancial con metabolitos del taxol tales como los metabolitos mencionados anteriormente en la presente memoria. No tener una reactividad cruzada sustancial pretende significar que los anticuerpos de la presente tienen una reactividad cruzada con estos metabolitos, en comparación con el taxol, de menos del 10%. Los anticuerpos de la presente pueden ser reactivos con otros compuestos de tipo taxol, tales como el docetaxel.
Inmunoanálisis
Según la presente, los conjugados y los anticuerpos generados a partir de los inmunógenos de estos compuestos de fórmula II-B, o mezclas de los mismos, se pueden utilizar como reactivos para la determinación del taxol en muestras de pacientes. Esta determinación se realiza por medio de un inmunoanálisis. Para determinar la presencia del taxol en una muestra de paciente, se puede utilizar cualquier inmunoanálisis en el que los conjugados de reactivos formados a partir de los compuestos de fórmula II-B compiten con el taxol en la muestra por los sitios de unión de los anticuerpos generados según la presente. La manera de llevar a cabo tal análisis para el taxol en una muestra sospechosa de contener taxol comprende combinar (a) una muestra en medio acuoso, (b) un anticuerpo contra el taxol generado según la presente y (c) los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula II-B, o mezclas de los mismos. La cantidad de taxol en la muestra se puede determinar midiendo la inhibición de la unión con el anticuerpo específico de una cantidad conocida del conjugado añadida a la mezcla de la muestra y el anticuerpo. El resultado de la inhibición de tal unión de la cantidad conocida de conjugados mediante la muestra desconocida se compara con los resultados obtenidos en el mismo análisis utilizando soluciones patrón conocidas de taxol. En la determinación de la cantidad de taxol en una muestra desconocida, la muestra, los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula II-B y el anticuerpo se pueden añadir en cualquier orden.
Se pueden utilizar diversos procedimientos para medir la cantidad de conjugado formado a partir de los compuestos de fórmula II-B unidos al anticuerpo. Un procedimiento es aquél en el que la unión de los conjugados con el anticuerpo provoca una disminución en la velocidad de rotación de un conjugado de fluoróforo. La cantidad de disminución en la velocidad de rotación de un conjugado de fluoróforo en la mezcla líquida se puede detectar mediante la técnica de polarización fluorescente, tal como la revelada en la patente estadounidense n.º 4.269.511 y la patente estadounidense n.º 4.420.568.
Por otro lado, se puede utilizar el anticuerpo para revestir o ser absorbido en nanopartículas de modo que cuando estas partículas reaccionan con los conjugados del taxol formados a partir de los compuestos de fórmula II-B, estas nanopartículas formen un agregado. Sin embargo, cuando las nanopartículas que han absorbido o han sido revestidas con el anticuerpo reaccionan con el taxol en la muestra, el taxol de la muestra unido a estas nanopartículas no produce la agregación de las nanopartículas con anticuerpo. La cantidad de agregación o aglutinamiento se puede medir en la mezcla de análisis mediante absorbancia.
Por otro lado, estos análisis se pueden llevar a cabo teniendo bien el anticuerpo o los conjugados de taxol unidos a un soporte sólido, tal como una placa de microvaloración o cualquier otro soporte sólido convencional, incluyendo partículas sólidas. La unión de anticuerpos y proteínas a tales partículas sólidas es ampliamente conocida en la técnica. Se puede utilizar cualquier procedimiento convencional para llevar a cabo tales uniones. En muchos casos, para ayudar en la medición, se pueden colocar marcadores sobre los anticuerpos, los conjugados o las partículas sólidas, tales como marcadores radiactivos o marcadores enzimáticos, como asistentes en la detección de la cantidad de los conjugados formados a partir de compuestos de fórmula II-B que esté unida o no unida con el anticuerpo. Otros marcadores adecuados incluyen cromóforos, fluoróforos, etc.
Por conveniencia, los componentes del análisis de la presente invención se pueden proporcionar en un equipo, una combinación empaquetada con cantidades predeterminadas de nuevos reactivos empleados en el análisis del taxol. Estos reactivos incluyen el anticuerpo de la presente, así como los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula II-B, o mezclas de los mismos. Si se utiliza un conjugado formado a partir de un compuesto de fórmula II-B, es preferible que el anticuerpo generado por el inmunógeno se forme a partir de un compuesto de fórmula II-B. Sin embargo, puede que esto no sea necesario, y que los anticuerpos y los conjugados de un análisis dado se obtengan de cualquiera o de ambos de estos conjugados e inmunógenos.
Además de estos reactivos necesarios, se pueden incluir aditivos tales como reactivos auxiliares, por ejemplo, estabilizadores, tampones y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del análisis. Se pueden proporcionar los reactivos en disolución o como un polvo seco, habitualmente, liofilizado, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivos que tendrá las concentraciones apropiadas para realizar el análisis.
Ejemplos
En los ejemplos, Ph representa fenilo. En los ejemplos, se usan las siguientes abreviaturas para designar los siguientes términos:
THF
Tetrahidrofurano
EA
Alcohol etílico
EtOAc
Acetato de etilo
DCM
Diclorometano
DMAP
Dimetilaminopiridina
NHS
N-hidroxi-succinimida
EDC
Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
CCF
Cromatografía de capa fina
ANS
Ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico
i.p.
Intraperitoneal
HRP
Peroxidasa de rábano picante
TMB
3,3',5,5'-Tetrametilbencidina
TRIS
Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano
ASB
Albúmina de suero bovino
BTG
Tiroglobulina bovina
PBS
Solución salina tamponada con fosfato
di
Agua desionizada
En los ejemplos, los siguientes Esquema 1 y Esquema 2 presentan los compuestos específicos preparados e indicados mediante números en los ejemplos. Los esquemas son los siguientes:
Esquema 1
13
Esquema 2
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Ejemplo 1 Preparación de derivado de taxol [5] (Esquema 1)
Se colocó taxol 1 (1,685 g) en un matraz de tres cuellos con 26 ml de diclorometano recién destilado bajo un flujo continuo de argón. Durante esta adición, se mantuvo la temperatura a -15ºC, y también se añadieron diisopropilamina (1 eq.) y cloroformiato de alilo (1,1 eq.). Se llevó la temperatura de la mezcla de reacción hasta la temperatura ambiente y se dejó agitando durante 4 horas. Tras este tiempo, se añadieron 40 ml de diclorometano y se lavó la mezcla de reacción con HCl 0,1N (60 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró sobre un rotaevaporador para generar el producto 2, con el grupo 2'-hidroxilo del taxol protegido. Se dejó este producto en un desecador durante 2 días y luego se usó en la siguiente etapa y en el ejemplo 2 sin mayor purificación.
Entonces, se disolvió el producto 2 en 40 ml de THF bajo argón mientras se mantenía la temperatura a -15ºC. Después se añadió a esta solución primero NaH (2 eq.) y, tras 10 minutos, ácido 5-bromo-valérico (1,1 eq. disueltos en 3 ml de THF y añadidos lentamente) para generar 3 como un producto en la mezcla de reacción. Tras una confirmación mediante CCF del producto 3, se añadieron 4,4 ml de HCl 2N en gotas a esta mezcla de reacción. Se lavó la mezcla de reacción que contenía el producto 3 con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se concentró sobre un rotaevaporador y luego se purificó. Se purificó el producto 3 sobre una columna de gel de sílice, se eluyó con EtOAc al 15%:DCM hasta EtOAc al 20%:DCM, produciendo 1,1611 g de producto puro 3.
Se disolvió el producto 3 purificado en 40 ml de diclorometano bajo argón y luego se añadió PhSiH_{3} (6,25 eq) a esta solución junto con Pd(PPh_{3})_{4} (0,05 eq.). Se dejó reposar la mezcla de reacción resultante durante 1 hora. Tras ese tiempo, se añadieron 12 ml de MeOH a la mezcla de reacción y se agitó la mezcla de reacción resultante durante 10 minutos. Se evaporó esta mezcla de reacción hasta la sequedad para generar el producto 4 con el grupo 2'-hidroxilo desprotegido. Se purificó el producto 4 de la mezcla de reacción sobre una columna de gel de sílice usando EtOAc al 30%:DCM como sistema disolvente y se aisló como un polvo de color hueso (817 mg; 43,4% en peso producido a partir del material inicial). Se disolvió el producto 4 purificado (355 mg; 0,37 mmoles) en 15 ml de diclorometano. Luego se añadieron N-hidroxi-succinimida (2 eq.) y EDC (2 eq.) bajo argón y se dejó agitando la mezcla de reacción resultante durante una noche. Se lavó la mezcla de reacción que contenía el producto 5 con HCl 0,1N y luego con H_{2}O tan rápidamente como fue posible. Se secó sobre Na_{2}SO_{4} la mezcla de reacción que contenía el producto 5 y se concentró sobre un rotaevaporador bajo un alto vacío para producir 401 mg (pureza del 99,9%) del producto 5.
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Ejemplo 2 Preparación de derivado de taxol [8] (Esquema 2)
Se añadió cloruro de tionilo lentamente a una suspensión de ácido 6-aminohexanoico (3 g; 22,87 mmoles) en alcohol alílico (14 ml; exceso). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante una noche para producir éster alílico de ácido 4-aminohexanoico 6. Tras eliminar el exceso de alcohol alílico, se secó el producto de éster alílico de ácido 4-aminohexanoico (3,9 g; sólido cristalino blanco) bajo un alto vacío.
Se añadió trietilamina (1,57 mmoles) seguida de cloroformiato de p-nitrofenilo (103 mg; 0,51 mmoles) a una solución del producto 2 de taxol alilo-protegido producido en el ejemplo 1 (400 mg; 0,43 mmoles) y DMAP (191,5 mg; 1,57 mmoles) en DCM (10 ml) bajo nitrógeno. Entonces, se agitó la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 5,5 horas y luego se añadió una solución de la amina 6, preparada anteriormente, como un sólido cristalino blanco (1,1 eq.) disuelto en DCM (2 ml) para formar el producto 7. Se dejó agitando la mezcla resultante durante una noche a temperatura ambiente. Se retiró de esta mezcla de reacción resultante el DCM al vacío y se purificó el producto de reacción 7 crudo sobre una columna de gel de sílice con EtOAc al 15%/DCM como sistema disolvente para generar el producto 7 purificado (320 mg; 66,1%) como un sólido de color hueso.
Se disolvió el producto 7 purificado, preparado anteriormente, en 30 ml de diclorometano bajo argón y luego se añadió PhSiH_{3} (6,25 eq) junto con Pd(PPh_{3})_{4} (0,05 eq.). Tras 1,5 horas, se añadieron 12 ml de MeOH y se agitó durante 10 minutos más. Se evaporó la mezcla de reacción hasta la sequedad para generar el producto 8 de 7-hidroxi-taxol derivado. Se purificó este producto 8 sobre una columna de gel de sílice (MeOH al 10%:EtOAc como sistema disolvente) y se aisló como una goma de color hueso (236 mg; 82,8%), rendimiento del 54,73% a partir del material inicial.
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Ejemplo 3 Preparación del inmunógeno de taxol
A 6,8 ml de BTG (36,4 mg/ml) en tampón de fosfato 50 mM (50 mM, pH 7,5), se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) (13,8 ml) en gotas para formar una solución. A 16,6 ml de esta solución, se añadió en gotas el derivado de taxol 5 de éster de N-hidroxisuccinimida activado purificado preparado en el ejemplo 1 (1,26 ml de una solución de 50 mg/ml de DMSO). Se dejó agitando la mezcla resultante durante una noche a temperatura ambiente para conjugar la BTG con el derivado de taxol 5 purificado. Entonces se purificó este conjugado inmunogénico mediante diálisis y se caracterizó según procedimientos descritos anteriormente (Wu et. al., Bioconj. Chem., 8: pp 385-390, 1997, Li et. al., Bioconj. Chem., 8: pp. 896-905, 1997, Salamone et. al., J. Forensic Sci. pp. 821-826, 1998).
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Ejemplo 4 Preparación de anticuerpos contra el taxol
Se inmunizaron diez ratones Balb/c hembra i.p. con 100 \mug/ratón de taxol-BTG (preparado en el ejemplo 3) emulsionado en adyuvante completo de Freund. Cuatro semanas después de la inyección inicial, se volvieron a inyectar una vez a los ratones 100 \mug de taxol-BTG/ratón emulsionado en adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la inyección de refuerzo, se realizaron extracciones de sangre para analítica en cada ratón mediante sangrías orbitales. El anti-suero de estas sangrías para analítica contenía los anticuerpos contra el taxol evaluados en los ejemplos 7, 8a y 9. Para los anticuerpos monoclonales, comenzando cuatro días antes de la fusión, se inyectaron a los ratones i.p. 100 \mug de taxol-BTG en PBS en tres días sucesivos. Se aislaron células de bazo de los ratones seleccionados y se fusionaron con 2 x 10^{7} células de mieloma SP_{2}/0 con polietilenglicol 1500 al 50% según el procedimiento de Coligan, J. E. et al., eds., "Current Protocols in Immunology", 2.5.1-2.5.8, (1992), Wiley & Sons, NY. Se emplacaron las células fusionadas sobre diez placas de 96 pocillos en DMEM/F12 complementado con FetalClone I al 20%, L-glutamina al 2% (100 mM) y HAT 50X al 2%. Dos semanas después, se analizó el sobrenadante de hibridoma en cuanto a la presencia de anticuerpos contra taxol-BTG mediante ELISA (ejemplo 8b). Las células de los pocillos que dieron resultados positivos en el ELISA (ejemplo 8b) se expandieron a placas de 24 pocillos. Se subclonaron una vez o dos veces los clones positivos según el ELISA mediante dilución limitante según el procedimiento revelado en Coligan, J.E. et al., eds., "Current Protocols in Immunology", 2.5.8-2.5.17, (1992), Wiley & Sons, NY. La unión al taxol de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma que contenían anticuerpo monoclonal de los subclones seleccionados se confirmó mediante un ELISA competitivo (ejemplos 8a y 9). Se analizaron estos anticuerpos monoclonales en cuanto a su unión con el taxol y su reactividad cruzada con metabolitos de taxol mediante un análisis competitivo indirecto de las placas de microvaloración según lo descrito en el ejemplo 9.
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Ejemplo 5 Preparación de conjugado de taxol-ASB con derivado 5
A 20 ml de solución de ASB (50 mg/ml) en tampón de fosfato (50 mM, pH 7,5), se añadieron 20 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) en gotas. A 18 ml de esta solución, se añadió en gotas el derivado de taxol 5 de éster de N-hidroxisuccinimida activado purificado preparado como en el ejemplo 1 (0,316 ml de una solución de 50 mg/ml de DMSO). Se dejó agitar la mezcla durante una noche a temperatura ambiente para producir el conjugado del éster 5 activado y ASB. Entonces se purificó este conjugado mediante diálisis y se caracterizó según procedimientos descritos anteriormente (Wu et. al., Bioconj. Chem., 8: pp 385-390, 1997, Li et. al., Bioconj. Chem., 8: pp. 896-905, 1997, Salamone et. al., J. Forensic Sci. pp. 821-826, 1998).
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Ejemplo 6 Preparación de conjugado de taxol-ASB con derivado 8
A 25 mg del derivado de taxol 8, preparado en el ejemplo 2, en cloruro de metileno (3 ml), se añadieron EDC (28 mg) y NHS (16,8 mg). Se agitó la solución en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 24 h. A esta mezcla, se añadieron 7 ml de más cloruro de metileno seguidos de 2 ml de ácido clorhídrico (0,3N). Se agitó la mezcla de reacción durante 15 minutos y se separó la capa orgánica, se secó y se evaporó hasta producir un residuo blanco amorfo que era el éster activado de NHS del derivado de taxol 8. Se disolvió este residuo en 2 ml de DMSO y se añadieron 1,25 ml de esta solución en gotas a 40 ml de una solución de ASB (25 mg/ml; 20 ml de DMSO/20 ml de fosfato 50 mM, pH 7,5). Se agitó la solución durante 60 horas a temperatura ambiente para producir el conjugado de ASB y el derivado de taxol 8. Se purificó este conjugado mediante diálisis según procedimientos descritos anteriormente (Wu et. al., Bioconj. Chem., 8: pp 385-390, 1997, Li et. al., Bioconj. Chem., 8: pp. 896-905, 1997, Salamone et. al., J. Forensic Sci. pp. 821-, 826).
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Ejemplo 7a Procedimiento de sensibilización de placas de microvaloración con derivado de taxol 5
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las concentraciones de taxol en placas de microvaloración de poliestireno (Inmunomódulos C8 o F8 MaxiSorp de Nunc) optimizadas en cuanto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por placa. Se revistió cada pocillo con conjugado de taxol-ASB (preparado como en el ejemplo 5) añadiendo 300 \mul de conjugado de taxol-BSA a 10 \mug/ml en bicarbonato de sodio 0,05M, pH = 9,6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos con bicarbonato de sodio 0,05M, pH 9,6, y luego se bloquearon con 400 \mul de sacarosa al 5%, solución de caseinato de sodio al 0,2% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras eliminar solución de post-revestimiento, se secaron las placas a 37ºC durante una noche.
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Ejemplo 7b Procedimiento de sensibilización de placas de microvaloración con derivado de taxol 8
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las concentraciones de taxol en placas de microvaloración de poliestireno (Inmunomódulos C8 o F8 MaxiSorp de Nunc) optimizadas en cuanto a la unión de proteínas y que contenían 96 pocillos por placa. Se revistió cada pocillo con conjugado de taxol-ASB (preparado como en el ejemplo 6) añadiendo 300 \mul de conjugado de taxol-BSA a 10 \mug/ml en bicarbonato de sodio 0,05M, pH = 9,6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos con bicarbonato de sodio 0,05M, pH 9,6, y luego se bloquearon con 400 \mul de sacarosa al 5%, solución de caseinato de sodio al 0,2% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras eliminar la solución de post-revestimiento, se secaron las placas a 37ºC durante una noche.
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Ejemplo 8a Procedimiento de rastreo de anticuerpos - Título
Se realizó el procedimiento ELISA para rastrear anticuerpos contra el taxol (producidos en el ejemplo 4) con las placas de microvaloración que fueron sensibilizadas con taxol-ASB según lo descrito en el ejemplo 7. El análisis de rastreo de anticuerpos se realizó diluyendo los antisueros que contenían anticuerpos contra el taxol (del ejemplo 4) hasta 1:100; 1:1.000; 1:10.000 y 1:100.000 en solución salina tamponada con fosfato que contenía ASB al 0,1% y timerosal al 0,01%. Para la evaluación de anticuerpos monoclonales, se diluyeron los sobrenadantes de hibridoma del ejemplo 4, que resultaron ser positivos en cuanto a la presencia de anticuerpo mediante el procedimiento de 8b, 1:2; 1:4; 1:8; 1:16, etc., en solución salina tamponada con fosfato que contenía ASB al 0,1% y timerosal al 0,01%. Se añadieron a cada uno de los pocillos sensibilizados con taxol-ASB (preparados en el ejemplo 7) 100 \mul de anticuerpo diluido y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el anticuerpo se une con el conjugado de taxol en el pocillo. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces con TRIS 0,02M, NaCl al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal al 0,001%, pH 7,8, para eliminar cualquier anticuerpo sin unir. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra el taxol unido al conjugado de taxol-ASB en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS al 0,05%; timerosal al 0,01%, capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas y generar un producto coloreado cuando se incuba con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de HRP secundario se une a los anticuerpos contra el taxol en los pocillos, se volvieron a lavar las placas tres veces para eliminar el conjugado secundario sin unir. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 \mul de TMB (sustrato líquido de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP, hasta desarrollar un color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se añadieron 50 \mul de solución de detención (fluoruro de sodio al 1,5% en H_{2}O di) a cada pocillo hasta detener el desarrollo de la coloración y, tras 10 segundos de agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placas de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida y se expresó como la dilución (título) resultante en una absorbancia de 1,5. Los títulos se determinaron representando el Log de la dilución del anticuerpo medido (eje X) frente a la absorbancia a 650 nm (eje Y) y extrapolando el título a una absorbancia de 1,5. El título determinó la concentración (dilución) del anticuerpo usado en el análisis competitivo indirecto de las placas de microvaloración descrito en el ejemplo 9.
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Ejemplo 8b Procedimiento de rastreo de anticuerpos - Rastreo monoclonal
Se realizó el procedimiento ELISA para rastrear anticuerpos monoclonales contra el taxol (producidos en el ejemplo 4) con las placas de microvaloración que fueron sensibilizadas con taxol-ASB según lo descrito en el ejemplo 6. Se añadieron a cada uno de los pocillos sensibilizados con taxol-ASB (preparados en el ejemplo 7b) 50 ul de solución salina tamponada con fosfato que contenía ASB al 0,1% y timerosal al 0,01%, y luego se añadieron 50 \mul de sobrenadante de cultivo monoclonal y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el anticuerpo se une con el conjugado de taxol en el pocillo. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces con TRIS 0,02M, NaCl al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal al 0,001%, pH 7,8, para eliminar cualquier anticuerpo sin unir. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra el taxol unido al conjugado de taxol-ASB en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS al 0,05%; timerosal al 0,01%, capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas y generar un producto coloreado cuando se incuba con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP se une a los anticuerpos contra el taxol en los pocillos, se volvieron a lavar las placas tres veces para eliminar el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP sin unir. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 \mul de TMB (sustrato líquido de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP, hasta desarrollar un color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se añadieron 50 \mul de solución de detención (fluoruro de sodio al 1,5% en H2O di) a cada pocillo hasta detener el desarrollo de la coloración y, tras 10 segundos de agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placas de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida. Las muestras con una absorbancia de más de dos veces el fondo fueron designadas positivas.
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Ejemplo 9a Procedimiento de inmunoanálisis competitivo indirecto de placas de microvaloración que determina la CI_{50} y la reactividad cruzada
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las concentraciones de taxol con las placas de microvaloración que fueron sensibilizadas con taxol-ASB descritas en el ejemplo 7a. Se diluyeron taxol, bacatina III, 3'-p-hidroxipaclitaxel, 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y taxotere 10 veces en PBS o en PBS que contenía ASB al 0,1% y timerosal al 0,01% en un intervalo de concentraciones de 0,01 hasta 10.000 ng/ml. El análisis se realizó incubando 50 \mul de los analitos que se iban a medir con 50 \mul de anticuerpo (producido en el ejemplo 4) diluidos hasta un título determinado en el ejemplo 8a. Durante la incubación de 10 minutos (T.A., con agitación), hay una competición en la unión del anticuerpo por el conjugado de taxol en el pocillo y el analito en la solución. Tras esta incubación, se lavaron los pocillos de la placa tres veces con TRIS 0,02M, NaCl al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal al 0,001%, pH 7,8, para eliminar cualquier material que no se hubiera unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra el taxol unido al conjugado de taxol-ASB en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un anticuerpo secundario que era un conjugado de anticuerpo contra la globulina de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS al 0,05%; timerosal al 0,01%, capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas y generar un producto coloreado cuando se incuba con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de HRP secundario se une a los anticuerpos contra el taxol en los pocillos, se volvieron a lavar las placas tres veces para eliminar el conjugado secundario sin unir. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 \mul de TMB (sustrato líquido de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP, hasta desarrollar un color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se añadieron 50 \mul de solución de detención (fluoruro de sodio al 1,5% en H_{2}O di) a cada pocillo hasta detener el desarrollo de la coloración y, tras 10 segundos de agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placas de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida e inversamente proporcional a la cantidad de taxol de la muestra. Se compara la absorbancia del color en los pocillos que contenían analito con la de los que no tienen analito y se genera una curva estándar. El valor de la CI_{50} para un analito dado fue definido como la concentración de analito que es necesaria para inhibir el 50% de la absorbancia para los pocillos que no contienen analito. Se calculó la reactividad cruzada de un analito dado como la proporción entre la CI_{50} para el taxol y la CI_{50} para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel, 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el taxotere expresadas como un porcentaje. Para evaluar las reactividades cruzadas de la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel, el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el taxotere con los anticuerpos policlonales contra el taxol generados en el ejemplo 4, se elaboró una mezcla de antisueros de sangrías orbitales. Esta mezcla combinaba los anticuerpos de cuatro ratones, que tenían individualmente valores de CI_{50} < 20 ng/ml para el taxol. Cuando se midió con esta mezcla de anticuerpos, el porcentaje de reactividades cruzadas en comparación con el taxol para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel y el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel fue menor del 10%. La reactividad cruzada con el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel fue menor del 60%. En la tabla I, figuran los resultados. Para evaluar las reactividades cruzadas de la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel, el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el taxotere con los anticuerpos monoclonales contra el taxol generados en el ejemplo 4, se usaron sobrenadantes de cultivos de hibridoma de monoclonales subclonados seleccionados. Cuando se midió con dos de estos anticuerpos monoclonales, el porcentaje de reactividades cruzadas en comparación con el taxol para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel y el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel fue menor del 6%. En la tabla II, figuran los resultados.
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Ejemplo 9b Procedimiento de inmunoanálisis competitivo indirecto de placas de microvaloración que determina la CI_{50} y la reactividad cruzada
Se realizó el procedimiento ELISA para medir las concentraciones de taxol con las placas de microvaloración que fueron sensibilizadas con taxol-ASB descritas en el ejemplo 7b. Se diluyeron taxol, bacatina III, 3'-p-hidroxipaclitaxel, 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y taxotere 10 veces en PBS o en PBS que contenía ASB al 0,1% y timerosal al 0,01% en un intervalo de concentraciones de 0,01 hasta 10.000 ng/ml. El análisis se realizó incubando 50 \mul de los analitos que se iban a medir con 50 \mul de anticuerpo (producido en el ejemplo 4) diluidos hasta un título determinado en el ejemplo 8a. Durante la incubación de 10 minutos (T.A., con agitación), hay una competición en la unión del anticuerpo por el conjugado de taxol en el pocillo y el analito en la solución. Tras esta incubación, se lavaron los pocillos de la placa tres veces con TRIS 0,02M, NaCl al 0,9%, Tween-80 al 0,5% y timerosal al 0,001%, pH 7,8, para eliminar cualquier material que no se hubiera unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo contra el taxol unido al conjugado de taxol-ASB en los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de un anticuerpo secundario que era un conjugado de anticuerpo contra la globulina de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido hasta una actividad específica predeterminada (aproximadamente 1/2000) en PBS con ASB al 0,1%; ANS al 0,05%; timerosal al 0,01%. Este anticuerpo secundario fue capaz de unirse específicamente con inmunoglobulinas murinas generando un producto coloreado cuando se incubó con un sustrato. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de HRP secundario se une a los anticuerpos contra el taxol en los pocillos, se volvieron a lavar las placas tres veces para eliminar el conjugado secundario sin unir. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 \mul de TMB (sustrato líquido de TMB, Sigma), un sustrato para la HRP, hasta desarrollar un color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se añadieron 50 \mul de solución de detención (fluoruro de sodio al 1,5% en H_{2}O di) a cada pocillo hasta detener el desarrollo de la coloración y, tras 10 segundos de agitación, se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placas de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida e inversamente proporcional a la cantidad de taxol de la muestra. Se compara la absorbancia del color en los pocillos que contenían analito con la de los que no tienen analito y se genera una curva estándar. El valor de la CI_{50} para un analito dado fue definido como la concentración de analito que es necesaria para inhibir el 50% de la absorbancia para los pocillos que no contienen analito. Se calculó la reactividad cruzada de un analito dado como la proporción entre la CI_{50} para el taxol y la CI_{50} para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel, 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el taxotere expresadas como un porcentaje. Para evaluar las reactividades cruzadas de la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel, el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el taxotere con los anticuerpos contra el taxol generados en el ejemplo 4, se usó la mezcla del ejemplo 9a. Cuando se midió con esta mezcla de anticuerpos, los porcentajes de reactividades cruzadas en comparación con el taxol para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel, el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el taxotere (docetaxel) fueron menores del 2%. En la tabla I, figuran los resultados. Cuando se midió con anticuerpos monoclonales seleccionados (como en el ejemplo 9a), los porcentajes de reactividades cruzadas en comparación con el taxol para la bacatina III, el 3'-p-hidroxipaclitaxel y el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel fueron menores del 9%. En la tabla I, figuran los resultados.
TABLA I Reactividad cruzada de inmunoanálisis competitivo usando anticuerpos policlonales contra el taxol (ejemplo 4)
15 
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TABLA II Reactividad cruzada de inmunoanálisis competitivo usando anticuerpos monoclonales contra el taxol (ejemplo 4)
16 
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Según lo observado en la tabla anterior, los anticuerpos de la presente no son reactivos con los metabolitos principales del taxol, pero son reactivos con el taxol y los fármacos de tipo taxol. Cuando los pacientes que están recibiendo taxol no están recibiendo simultáneamente docetaxil, se pueden usar estos anticuerpos en un inmunoanálisis que puede detectar y controlar específicamente el taxol en muestras de fluidos de pacientes que estén siendo tratados con taxol.

Claims (25)

1. Un inmunoanálisis para detectar el taxol en una muestra que comprende proporcionar una mezcla que contiene dicha muestra, un anticuerpo que es selectivamente reactivo con el taxol y que tiene una reactividad cruzada con el 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y el 3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos del 10% y un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula:
17
en la que B es -CH_{2}- o
18
Y es un grupo espaciador orgánico;
X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina;
p es un número entero de 0 a 1; y
Ph es fenilo,
que hace que el taxol de la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y, a partir de entonces, medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que está unido o no unido a dicho anticuerpo mediante lo cual se puede determinar la presencia de taxol en la muestra.
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2. Un inmunoanálisis según la reivindicación 1, en el que p es 0.
3. Un inmunoanálisis según la reivindicación 1, en el que p es 1.
4. Un inmunoanálisis según la reivindicación 3, en el que Y es alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono,
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19 
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en la que n y o son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6.
5. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es
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20 
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en la que R_{3} es hidrógeno o tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y R_{4} es oxígeno o azufre.
6. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es
21
y R_{3} es hidrógeno.
7. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que X es
22
y R_{3} forma un éster reactivo.
8. Un inmunoanálisis según la reivindicación 7, en el que el éster formado es un alquiléster inferior, un imidoéster o un amidoéster.
9. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es una muestra humana.
10. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno que comprende un polímero inmunogénico ligado a un compuesto de fórmula:
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23 
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en la que Ph, p, Y, X y B son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Un inmunoanálisis según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está unido a un soporte sólido.
12. Un inmunoanálisis según la reivindicación 11, en el que el soporte sólido es placas de microvaloración.
13. Un inmunoanálisis según la reivindicación 11, en el que el soporte sólido es nanopartículas.
14. Un anticuerpo que es selectivamente reactivo con el taxol y que tiene una reactividad cruzada con 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y 3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos del 10%.
15. Un anticuerpo según la reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo deriva de ratones, conejos o ratas.
16. Un anticuerpo según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, anticuerpo que es un anticuerpo monoclonal.
17. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, anticuerpo que deriva de un inmunógeno de un polímero de poliamina con un compuesto de fórmula:
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24 
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en la que Ph, p, Y, X y B son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
18. Un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula:
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25 
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en la que Ph, p, Y, X y B son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
19. Un conjugado según la reivindicación 18, en el que el vehículo contiene uno o más grupos amino ligados por
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26
en la que R_{4} es oxígeno o azufre.
20. Un inmunógeno que contiene un polímero de poliamina inmunogénico ligado a un compuesto de fórmula:
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27 
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en la que Ph, p, Y, X y B son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
21. Un inmunógeno según la reivindicación 20, en el que el polímero inmunogénico contiene uno o más grupos amino ligados por
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28 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R_{4} es oxígeno o azufre.
22. Un equipo para determinar la presencia de taxol en una muestra de paciente que comprende reactivos en recipientes separados, siendo uno de los reactivos un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula:
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29 
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en la que Ph, p, Y, X y B son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
y conteniendo el segundo recipiente un anticuerpo que es selectivamente reactivo con el taxol y que tiene una reactividad cruzada con 6-\alpha-hidroxipaclitaxel y 3'-p-hidroxipaclitacel en comparación con el taxol de menos del 10%.
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23. Un equipo según la reivindicación 22, en el que dicho conjugado está presente en una cantidad predeterminada en dicho primer recipiente.
24. Un equipo según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, equipo que se usa para determinar la cantidad de taxol en dicha muestra.
25. Un equipo según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno de un polipéptido de poliamina inmunogénico ligado a un compuesto de fórmula:
30
en la que Ph, p, Y, X y B son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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