ES2675107T3 - Inmunoensayo de clozapina - Google Patents

Abstract

Un inmunoensayo para la deteccion de clozapina en una muestra, que comprende proporcionar una mezcla de a) dicha muestra, b) un anticuerpo selectivamente reactivo con clozapina y que no presenta reactividad cruzada con la N-desmetilclozapina y el clozapina-N-oxido, y c) un conjugado de un vehiculo que tiene un 5 grupo tiol o amino reactivos con un compuesto de formula:**Fórmula** en la que B es: -(C>=O)-, -(C>=O)-NH-, -(C>=O)-O-, -CH2-; Y es un grupo espaciador organico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polimero de poliamina; y p es un numero entero de 0 a 1; o sus sales; hacer que la clozapina de la muestra y dicho conjugado en dicha mezcla se unan a dicho anticuerpo y posteriormente medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que esta unido o no unido a dicho anticuerpo, por lo que se puede determinar la presenta de clozapina en la muestra.

Description

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DESCRIPCIÓN

Inmunoensayo de clozapina Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los inmunoensayos para la determinación de la presencia y/o la cuantificación de la cantidad de clozapina en fluidos corporales humanos con el fin de determinar rápidamente las concentraciones óptimas del fármaco durante el tratamiento.

Antecedentes de la invención

La esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico grave que afecta a aproximadamente un 1 % de la población mundial. Los síntomas clínicos de la esquizofrenia incluyen delirios, alucinaciones auditivas, pensamientos y habla desorganizados, aislamiento social, falta de motivación y disfunción cognitiva, tal como pensamiento desorganizado y alteraciones de la memoria. Se cree que este trastorno está causado por una combinación de defectos neurológicos, que incluyen niveles de dopamina y serotonina, y deficiencias interneuronales inhibitorias. La esquizofrenia se puede tratar con fármacos dirigidos a los neurotransmisores y los receptores, habitualmente denominados fármacos antipsicóticos o neurolépticos.

Una clase de fármaco antipsicótico denominado "antipsicóticos atípicos" o más habitualmente "antipsicóticos de segunda generación" incluye el derivado de dibenzazepina tricíclico, clozapina (I). La clozapina, comercializado como Clozaril® por Novartis en Estados Unidos, interfiere con la unión de la dopamina en los receptores de dopamina D1, D2, D3, y D5, y tiene una elevada afinidad por el receptor D4 (ficha técnica de Clozaril 2009). Clozaril también actúa como antagonista de los receptores adrenérgicos, colinérgicos, histaminérgicos y serotoninérgicos. La clozapina se metaboliza casi completamente en el citocromo P450 en seres humanos en los derivados de N- desmetilo y N-óxido. El metabolito N-desmetilo tiene una actividad únicamente limitada, mientras que el derivado N- óxido es inactivo. La actividad del metabolito N-desmetilo es con receptores distintos de los receptores con los que la clozapina es activa.

La clozapina tiene la siguiente fórmula:

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La N-desmetilclozapina tiene la siguiente fórmula:

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La clozapina-N-óxido tiene la siguiente fórmula:

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La concentración plasmática de clozapina se efectúa variando la actividad del citocromo P450 (Chetty, M y M Murray, Curr Drug Metab, 8, 4, 307, -13, 2007; Mauri, MC, et al., Clin Pharmacokinet, 46, 5, 359, -88, 2007; Mendoza, MC y JP Lindenmayer, Clin Neuropharmacol, 32, 3, 154-7 2009), age, sex, caffeine use, and smoking (Rostami-Hodjegan, A, et al., J Clin Psychopharmacol, 24, 1,70-8 2004).

Se ha demostrado que la clozapina tiene una alta variabilidad entre pacientes a las concentraciones plasmáticas en estado estacionario y esta variabilidad puede afectar a la seguridad y la calidad de vida (Mauri, MC, LS Volonteri, A Colasanti, A Fiorentini, IF De Gaspari y SR Bareggi, Clin Pharmacokinet, 46, 5, 359-88 2007).

Dado que la eficacia de la clozapina se mejora dentro de un intervalo específico de concentración del fármaco en plasma y el fármaco muestra una amplia variabilidad farmacocinética intrapaciente, el control de las concentraciones de este fármaco en sangre y el ajuste a niveles diana sería de valor en el aumento de la eficacia y la minimización de la toxicidad (Mauri, MC, LS Volonteri, A Colasanti, A Fiorentini, IF De Gaspari y SR Bareggi, Clin Pharmacokinet, 46, 5, 359-88 2007)

Como resultado de esta variabilidad, las mismas dosis del mismo fármaco en diferentes individuos pueden dar lugar a resultados clínicos marcadamente diferentes. La eficacia de la misma dosificación de clozapina varía de manera significativa basándose en la tasa de excreción del fármaco del individuo y la concentración sérica final del fármaco en el paciente. La gestión del fármaco terapéutico podría proporcionar al médico una visión sobre la variación de la administración del fármaco en el paciente. Con la gestión del fármaco terapéutico, se podrían individualizar las dosificaciones para el paciente, y las posibilidades de tratar el trastorno de manera eficaz sin los efectos secundarios indeseados serían mucho mayores.

Además, la gestión del fármaco terapéutico de la clozapina serviría como una excelente herramienta para garantizar el cumplimiento (Treur, M, et al., BMC Health Serv. Res., 9, 9 2009; Valenstein, M, et al., J. Clin. Psychiatry, 67, 10, 1542-1550 2006) con administración y dosificación prescrita para lograr niveles efectivos de concentración sérica. La gestión del fármaco terapéutico de rutina de la clozapina requeriría la disponibilidad de ensayos automatizados simples adaptables a un equipo general de laboratorio. Se ha descrito el uso de cromatografía líquida (LC) con detección por ultravioleta (UV) o espectrometría de masas para determinar la concentración de clozapina en sangre y plasma humano (Rosland, M, et al., Drug Dev Ind Pharm, 33, 10, 1158, -66, 2007; Rao, LV, et al., J Clin Lab Anal, 23, 6, 394, -8, 2009; Ming, dS y J Heathcote, J Anal Toxicol, 33, 4, 198, -203, 2009; Niederlander, HA, et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 834, 1-2, 98-107 2006). Estos métodos son de mano de obra intensiva, que requieren extracciones líquido-líquido o en fase sólida, usan equipos caros y no son susceptibles de uso habitual en laboratorio clínico. Hasta la fecha, no hay inmunoensayos para medir la clozapina en fluidos biológicos humanos de pacientes tratados con agentes antipsicóticos.

Como se deduce de lo anterior, no hay inmunoensayos para determinar la presencia y/o cuantificación de la cantidad de clozapina en fluidos biológicos humanos. La gestión del fármaco terapéutico de rutina de la clozapina mediante inmunoensayos proporcionaría pruebas automatizadas simples adaptadas a los equipos de laboratorio estándar. Sin embargo, con el fin de proporcionar tales inmunoensayos, se deben producir anticuerpos específicos para la clozapina. Los derivados e inmunógeno utilizados en este ensayo deben impartir, a través de estos anticuerpos correspondientes producidos, una reactividad específica a la clozapina sin reactividad cruzada sustancial con los metabolitos terapéuticos o farmacológicamente activos o inactivos de la clozapina que interfieren con la detección de clozapina, siendo estos metabolitos interferentes N-desmetilclozapina, (el compuesto de fórmula II) y clozapina-N- óxido (el compuesto de fórmula III). En la realización de inmunoensayos para controlar la clozapina, es importante que los anticuerpos utilizados no sean reactivos con el metabolito farmacéuticamente activo, N-desmetilclozapina (el compuesto de fórmula II). Esto es cierto, ya que la reactividad con N-desmetilclozapina interfiere con la detección de clozapina en la muestra del paciente y no existe una correlación entre la N-desmetilclozapina detectable y el resultado clínico. Véase Y.-Q. Xiang et al. Serum Concentrations of clozapine and norclozapine in the prediction of relapse of patients with schizophrenia, Schizophrenia Research, 83 (2006) 201 y M.C. Mendoza y J.P. Lindenmayer.

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N-Desmethylclozapine: Is there evidence for its antipsychotic potential?, Clinical Neuropharmacology 32 (3) 154-157 Por lo tanto, para ser eficaces en el control de los niveles de fármaco por medio de un inmunoensayo, los anticuerpos deben ser específicos para la clozapina y no tener una reacción cruzada con su principal metabolito farmacéuticamente activo, la N-desmetilclozapina.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha producido una nueva clase de anticuerpos que son sustancialmente selectivamente reactivos con la clozapina para unirse selectivamente a la clozapina. Por selectivamente reactivos, se entiende que este anticuerpo solo reacciona con la clozapina y no reacciona sustancialmente ni reacciona de forma cruzada con los metabolitos de la clozapina, N-desmetilclozapina y N-óxido-clozapina. La reactividad cruzada con estos metabolitos de la clozapina impide una determinación precisa mediante un inmunoensayo de la presencia y la cantidad de clozapina en los fluidos biológicos humanos. Por medio de estos anticuerpos se proporciona un inmunoensayo para detectar y cuantificar la cantidad de clozapina en muestras de pacientes humanos tratados con clozapina para controlar los niveles de clozapina, para evitar una sobredosificación que podría causar efectos secundarios graves, tales como agranulocitosis y ataques epilépticos.

Se ha encontrado que mediante el uso de inmunógenos que son conjugados de un polímero de poliamina inmunogénico con un compuesto de la fórmula:

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en la que B es: -(C=O)-, -(C=O)-NH-, -(C=O)-O-, -CH2-;

Y es un grupo espaciador orgánico;

X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina; y p es un número entero de 0 a 1;

o sales del mismo;

producen anticuerpos que son específicos para clozapina y no reaccionan sustancialmente ni se unen a N- desmetilclozapina y clozapina-N-óxido.

La provisión de estos anticuerpos que reaccionan de forma sustancialmente selectiva con clozapina y no reaccionan de forma cruzada con N-desmetilclozapina y clozapina-N-óxido permite producir un inmunoensayo que puede detectar y cuantificar específicamente para controlar la clozapina en las muestras de fluidos de pacientes tratados con clozapina. Además, en la presente invención se incluyen reactivos y kits para dicho inmunoensayo.

Descripción detallada

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una nueva clase de anticuerpos que reacciona sustancial y selectivamente con clozapina y no reaccionan de manera sustancial o de manera cruzada con N-desmetilclozapina o clozapina-N-óxido como se ha mencionado anteriormente en el presente documento. Se ha descubierto que mediante el uso de estos derivados de clozapina de fórmula IV o sales de la misma como inmunógenos, se proporciona esta nueva clase de anticuerpos de la presente invención. Es a través del uso de estos anticuerpos que se ha desarrollado un inmunoensayo, incluyendo reactivos y kits para tal inmunoensayo, para detectar y/o cuantificar clozapina en sangre, plasma u otras muestras de fluidos corporales. Mediante el uso del presente inmunoensayo, se puede detectar y/o cuantificar la presencia y la cantidad de clozapina en muestras de fluidos corporales de los pacientes tratados con este agente terapéutico. De esta manera, se puede vigilar durante la terapia a un paciente que se está tratando con clozapina y ajustar su tratamiento de acuerdo con dicho control. Por medio de la presente invención, se consigue la gestión del fármaco terapéutico de la clozapina en pacientes esquizofrénicos tratados con

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clozapina como agente terapéutico. El agente terapéutico que se desea detectar es clozapina de fórmula I.

Los reactivos utilizados en el ensayo de la presente invención son conjugados de un vehículo polimérico con los compuestos de fórmula IV. Estos conjugados son compañeros de unión competitivos con la clozapina presente en la muestra para la unión con los anticuerpos de la presente invención. Por lo tanto, la cantidad de reactivo conjugado que se une al anticuerpo será inversamente proporcional a la cantidad de clozapina en la muestra. De acuerdo con la presente invención, el ensayo utiliza cualquier medio de medición convencional para la detección y la medición de la cantidad de dicho conjugado que se une o desune del anticuerpo. Mediante el uso de dichos medios, se puede determinar la cantidad de conjugado unido o desunido. En general, la cantidad de clozapina en una muestra se determina mediante la correlación de la cantidad medida del conjugado unido o no unido producido por la clozapina en la muestra con valores del conjugado unido o no unido determinado a partir del patrón o curva de calibración obtenida con muestras que contienen cantidades conocidas de clozapina, cuyas cantidades conocidas están en el intervalo esperado para la muestra que se va a analizar. Estos estudios para generar curvas de calibración se determinan usando el mismo procedimiento de inmunoensayo que el usado para la muestra.

Definiciones

A lo largo de la presente descripción, deben entenderse las siguientes definiciones:

El término "Ph" tal como se usa a lo largo de la presente solicitud designa un radical fenilo. El término "alquileno" designa un sustituyente hidrocarbonado divalente saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a diez átomos de carbono.

Los términos "inmunógeno" e "inmunogénico" se refieren a sustancias capaces de provocar, producir o generar una respuesta inmunitaria en un organismo.

El término "conjugado" se refiere a cualquier sustancia formada a partir de la unión conjunta de partes separadas. Los conjugados representativos de acuerdo con la presente invención incluyen los formados por la unión conjunta de una pequeña moléculas, tal como el compuesto de fórmula IV, y una molécula grande, tal como un vehículo o un polímero de poliamina, particularmente una proteína. En el conjugado, la molécula pequeña podría unirse a uno o más sitios activos en la molécula grande. El término conjugado incluye el término inmunógeno.

"Haptenos" son antígenos parciales o incompletos. Son sustancias sin proteína, principalmente sustancias de bajo peso molecular, que no son capaces de estimular la formación de anticuerpos, pero que reaccionan con anticuerpos. Los últimos están formados acoplando un hapteno con un vehículo inmunogénico de alto peso molecular y después inyectando este producto acoplado, es decir, inmunógeno, en un sujeto humano o animal. El hapteno de la presente invención es clozapina.

Como se usa en el presente documento, un "grupo espaciador" o un "espaciador" se refiere a una porción de una estructura química que conecta dos o más subestructuras, tales como haptenos, vehículos, inmunógenos, marcadores o indicadores mediante un grupo de unión funcional. Estos grupos espaciadores se enumerarán en lo sucesivo en el presente documento, en la presente solicitud. Los átomos de un grupo espaciador y los átomos de una cadena en el grupo espaciador están conectados mediante enlaces químicos. Entre los espaciadores preferentes se encuentran cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. Estas cadenas de carbono también pueden incluir uno o más heteroátomos en la cadena o en los extremos de las cadenas. Con "heteroátomos" se refiere a átomos que no sean de carbono que se eligen del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre. Los grupos espaciadores también pueden incluir grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como una sustitución en uno de los átomos en la cadena.

El número de átomos en el grupo espaciador se determina mediante recuento de los átomos que no sean de hidrógeno. El número de átomos en una cadena en un grupo espaciador se determina mediante el recuento del número de átomos que no sean de hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras que se están conectando. Se puede usar un grupo de unión funcional para activar, por ejemplo, proporcionar un sitio funcional disponible en, un hapteno o grupo espaciador para sintetizar un conjugado de un hapteno con un indicador o vehículo o polímero de poliamina.

Un "vehículo inmunogénico", tal como se usa la expresión en el presente documento, es una sustancia inmunogénica, habitualmente una proteína, que se puede unir a una o más posiciones con un hapteno, en este caso clozapina, permitiendo de este modo a los derivados de hapteno inducir una respuesta inmunitaria y provocar la producción de anticuerpos que se pueden unir de manera específica con estos haptenos. Los vehículos inmunogénicos y los grupos de unión se enumerarán en lo sucesivo en el presente documento, en la presente solicitud. Entre las sustancias de vehículo inmunogénico se incluyen proteínas, glucoproteínas, complejos poliamino- polisacáridos, partículas y ácidos nucleicos que se reconocen como extrañas y, por lo tanto, provocan una respuesta inmunológica del huésped. Los poliamino-polisacáridos se pueden preparar a partir de polisacáridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparación.

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Además, se pueden emplear diversos tipos de proteínas como un vehículo inmunogénico de poli(aminoácidos). Estos tipos incluyen albúminas, proteínas séricas, lipoproteínas, etc. Las proteínas ilustrativas incluyen seroalbúmina bovina (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina, tiroglobulina bovina (BTG). Como alternativa, se pueden utilizar poli(aminoácidos) sintéticos.

Los vehículos inmunogénicos también pueden incluir poliamino-polisacáridos, que son un polímero de alto peso molecular construido por condensaciones repetidas de monosacáridos. Los ejemplos de polisacáridos son almidones, glucógeno, celulosa, gomas de carbohidratos, tales como goma arábiga, agar, y así sucesivamente. El polisacárido también contiene residuos de poli (aminoácidos) y/o residuos de lípidos.

El vehículo inmunogénico también puede ser poli(ácido nucleicos) bien solos o conjugados con uno de los poli(aminoácidos) o polisacáridos mencionados anteriormente.

El vehículo inmunogénico también puede incluir partículas sólidas. Las partículas generalmente tienen al menos aproximadamente 0,02 micrómetros (|jm) y no más de aproximadamente 100 pm, y normalmente de aproximadamente 0,05 jm a 10 jm de diámetro. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, de manera óptima, de una densidad que se acerca a la del agua, generalmente desde aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos, tales como células y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitantes, tales como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, y virus. Las partículas también pueden estar compuestas por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas de fosfolípido o lipoproteínas.

"Poli(aminoácido)" o "polipéptido" es una poliamida formada a partir de aminoácidos. El peso molecular de los poli(aminoácidos) generalmente oscilará desde aproximadamente 2.000, sin un límite superior de peso molecular, siendo normalmente menor de 10.000.000 y normalmente de no más de aproximadamente 600.000 Dalton. Normalmente serán intervalos diferentes, dependiendo de si está implicado un vehículo inmunogénico o una enzima.

Un "péptido" es cualquier compuesto formado por la unión de dos o más aminoácidos mediante enlaces amida (peptídicos), normalmente un polímero de a-aminoácidos en el que el grupo a-amino de cada resto de aminoácido (excepto el extremo NH2) se une al grupo a-carboxilo del siguiente resto en una cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y poli(aminoácido) se usan como sinónimos en el presente documento para hacer referencia a esta clase de compuestos sin restricción en cuanto al tamaño. Los miembros más grandes de esta clase se denominan proteínas.

Un "marcador", "molécula detectora" o "indicador" es cualquier molécula que produce o que se puede inducir para que produzca, una señal detectable. El marcador se puede conjugar con un analito, inmunógeno, anticuerpo o con otra molécula, tal como un receptor o una molécula que se puede unir a un receptor tal como un ligando, particularmente un hapteno. Los ejemplos no limitantes de marcadores incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fragmentos de enzimas, sustratos enzimáticos, inhibidores enzimáticos, coenzimas, catalizadores, fluoróforos, colorantes, quimioluminiscentes, luminiscentes o sensibilizadores; una partícula magnética o no magnética, un soporte sólido, un liposoma, un ligando o un receptor.

El término "anticuerpo" se refiere a un compañero de unión específica de proteína para un antígeno y es cualquier sustancia o grupo de sustancias, que tiene una afinidad de unión específica por un antígeno para la exclusión de otras sustancias. El término genérico anticuerpo abarca anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo.

El término "derivado" se refiere a un compuesto o molécula química preparada a partir de un compuesto parental mediante una o más reacciones químicas.

El término "vehículo" se refiere a partículas sólidas y/o polímeros poliméricos, tal como polímeros inmunogénicos tales como los mencionados anteriormente. Cuando el vehículo es una partícula sólida, la partícula sólida se puede unir, recubrir con o fijar de algún modo a un polímero de poliamina para proporcionar uno o más sitios reactivos para la unión al grupo X funcional terminal en los compuestos de la fórmula IV.

La expresión "kit de reactivos" o "kit de ensayo", se refiere a un ensamblaje de materiales que se usan en la realización de un ensayo. Los reactivos se pueden proporcionar en una combinación empaquetada en el mismo envase o en envases separados, dependiendo de las reactividades cruzadas y estabilidades, y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y proporciones de reactivos proporcionados en el kit se pueden seleccionar de manera que proporcionen resultados óptimos para una aplicación particular. Un kit de reactivos que incorpora las características de la presente invención comprende anticuerpos específicos para clozapina. El kit puede comprender adicionalmente ligandos del analito y materiales de calibración y control. Los reactivos pueden permanecer en forma líquida o se pueden liofilizar.

La frase "materiales de calibración y de control" se refiere a cualquier patrón o material de referencia que contiene

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una cantidad conocida de fármaco a medir. La concentración de fármaco se calcula comparando los resultados obtenidos del espécimen desconocido con los resultados obtenidos para el patrón. Esto se hace frecuentemente construyendo una curva de calibración.

La expresión "muestra biológica" incluye, pero sin limitación, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o un ser antes vivo. Tales seres vivos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos, caballos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero sin limitación, sangre, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, linfa, ganglios linfáticos, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos sinoviales, células endoteliales y piel.

Reactivos e inmunógenos

En un inmunoensayo basado en un anticuerpo, se construye un conjugado de clozapina para competir con la clozapina en la muestra por los sitios de unión en el anticuerpo. En el inmunoensayo de la presente invención, los reactivos de la fórmula IV son los derivados de clozapina sustituidos con nitrógeno formados en el grupo 1 -nitro de clozapina de fórmula I. En los compuestos de fórmula IV, el espaciador del enlazador constituye la porción "Y-X" de esta molécula. Este enlazador X y el espaciador. "Y" son convencionales en la preparación de conjugados para inmunoensayos e inmunógenos para la producción de anticuerpos. Se puede utilizar cualquiera de los grupos convencionales que se unen al espaciador utilizados para preparar conjugados para inmunoensayos e inmunógenos para producir anticuerpos en los compuestos de fórmula IV. Tales enlazadores y espaciadores convencionales se desvelan en la Patente de Estados Unidos 5.501.987 y en la Patente de Estados Unidos 5.101.015.

Los conjugados, así como los inmunógenos, se preparan a partir del compuesto de fórmula I. En los conjugados o inmunógenos del vehículo con el hapteno, los vehículos están unidos en una o más posiciones a uno o más grupos tioamino reactivos contenidos en la porción polimérica del vehículo al hapteno que tiene la fórmula:

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en la que X' es un grupo de unión funcional y p e Y son como anteriormente; Entre los grupos espaciadores preferentes se incluyen los grupos espaciadores mencionados anteriormente en el presente documento. Los grupos espaciadores particularmente preferentes son grupos tales como alquilenos que contienen de 1 a 10 átomos de carbono,

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en los que n y 0 son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6, siendo alquileno el grupo espaciador especialmente preferente.

En los compuestos de fórmula V, en la que X’ es un grupo funcional que se une al espaciador, preferentemente mediante un grupo amino reactivo en el vehículo polimérico. El grupo X' es el resultado del grupo X funcional

terminal en los compuestos de fórmula IV que se unen al grupo amino reactivo en el polímero de poliamina del vehículo o el inmunógeno. Cualquier grupo funcional terminal capaz de reaccionar con un grupo amino se puede utilizar como el grupo X funcional en los compuestos de fórmula IV. Estos grupos funcionales terminales preferentemente incluidos en X son:

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Estos grupos funcionales terminales preferentemente incluidos en X son:

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10 en la que R3 es hidrógeno o tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y R4 es oxígeno o azufre. El radical -N=C=R4, puede ser un isocianato o un isotiocianato. Los ésteres activos formados mediante OR3 incluyen imidoéster, tales como N-hidroxisuccinamida, 1-hidroxibenzotriazol y p-nitrofenil éster. Sin embargo, puede usarse cualquier éster activo que pueda reaccionar con un grupo amino o tiol.

15 El grupo carboxílico y los ésteres activos se acoplan al vehículo o al polímero inmunogénico por medios convencionales. El grupo amino en el polímero de poliamina, tal como una proteína, produce un grupo amida que conecta el espaciador con los inmunógenos o vehículos poliméricos para formar los conjugados de la presente invención.

20 Cuando X en el compuesto de fórmula IV es

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estos compuestos preferentemente reaccionan con los grupos amino libres del vehículo polimérico o inmunogénico. Por otro lado, X en el compuesto de fórmula IV puede ser el radical maleimida de la fórmula

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que reacciona con el grupo tio o tiol.

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Estos compuestos de fórmula IV se hacen reaccionar para unirse a una proteína polimérica que se ha modificado para convertir un grupo amino en un grupo tiol. Esto se puede hacer haciendo reaccionar un grupo amino libre de un vehículo de proteína polimérica con un compuesto de la fórmula

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en la que R15 es un grupo protector de tiol;

R3 es como anteriormente; y v es un número entero de 1 a 4.

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Esta reacción se lleva a cabo en un medio acuoso mezclando la proteína que contiene el vehículo con el compuesto de fórmula VI en un medio acuoso. En esta reacción, la temperatura y la presión no son críticas y la reacción se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y a presión atmosférica. Las temperaturas desde 10 °C hasta 25 °C son generalmente preferentes. En el vehículo que contiene la proteína que se hace reaccionar con el compuesto de 45 fórmula VI, se puede utilizar cualquier agente protector de tiol convencional. Los grupos protectores de tiol son bien

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conocidos en la materia, siendo el 2-piridilditio el grupo protector preferente. Mediante esta reacción, el grupo tiol, SH- llega a ser el grupo funcional del vehículo que se une al compuestos de fórmula IV al resto del vehículo

Antes de reaccionar con el compuesto de Fórmula IV con el vehículo modificado con tiol, el grupo protector de tiol del vehículo modificado con tiol se elimina por medios convencionales. Cualquier medio convencional para retirar un grupo protector de tiol se puede utilizar para llevar a cabo esta reacción. Sin embargo, al utilizar un medio para retirar el grupo protector de tiol, se debe tener cuidado de que los reactivos sean solubles en el medio acuoso y de que no destruyan o dañen de ningún modo el polímero de poliamina contenido en el vehículo. Un medio preferente para retirar este grupo protector es mediante el uso de ditiotreitol como un agente para reducir el producto de condensación resultante. Esta reducción se puede llevar a cabo añadiendo simplemente el agente reductor al medio de reacción sin utilizar altas presiones o temperaturas. Esta reducción se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y a presión atmosférica.

Aunque que el método anterior representa un medio para convertir un grupo amino terminal en el vehículo que contiene la poliamina polimérica a un grupo tiol, se puede utilizar cualquier medio convencional para llevar a cabo esta conversión. Los métodos para convertir los grupos amino terminales en vehículos que contienen poliamina polimérica en grupos tiol son bien conocidos en la materia y se pueden emplear de acuerdo con la presente invención.

La reacción del vehículo que contiene la poliamina polimérica que tiene un grupo tiol terminal reactivo con el compuesto de fórmula IV donde X es un grupo funcional capaz de unirse al grupo tiol terminal que lleva el vehículo se puede llevar a cabo por medios convencionales. En esta realización, el compuesto de fórmula IV en el que X es maleimida se hace reaccionar con el grupo tiol portado por el vehículo de poliamina polimérica. Cualquier medio bien conocido para la adición de un tiol a través de un enlace doble de maleimida se puede utilizar en la producción de conjugados de fórmula IV que se conjugan con el vehículo mediante un puente de tiol.

De acuerdo con una realización preferente, los conjugados, que incluyen los inmunógenos de la presente invención, que están unidos a través de enlaces amida, el enlace químico entre el grupo carboxilo que contiene el hapteno de clozapina y los grupos amino en el vehículo o inmunógeno se pueden obtener usando diversos métodos conocidos por el experto en la materia. Con frecuencia es preferible formar enlaces amida activando primero el resto de ácido carboxílico X del hapteno de clozapina en el compuesto de fórmula IV o sus sales farmacéuticamente aceptables haciendo reaccionar el grupo carboxi con un reactivo de grupo saliente (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, 1- hidroxibenzotriazol, p-nitrofenol y similares). Se puede usar un reactivo de activación tal como diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y similares. La forma activada del grupo carboxilo en el hapteno de clozapina del compuesto de Fórmula IV o sus sales farmacéuticamente aceptables se hace reaccionar luego en una solución tamponada que contiene el vehículo proteico.

Al preparar los conjugados unidos a amino en los que el derivado de clozapina de fórmula IV contiene un grupo amino primario o secundario así como también el grupo carboxilo, es necesario usar un grupo protector de amina durante las reacciones de activación y de acoplamiento para evitar que los conjugados reaccionen con ellos mismos. Normalmente, las aminas en el derivado de clozapina de fórmula IV se protegen formando la correspondiente N- trifluoroacetamida, N-terc-butiloxicarboniluretano (N-t-BOC uretano), N-carbobenciloxiuretano o estructura similar. Una vez que se ha logrado la reacción de acoplamiento al polímero o vehículo inmunogénico, como se ha descrito anteriormente, el grupo protector de amina puede eliminarse usando reactivos que de otro modo no alterarían la estructura del inmunógeno o conjugado. Dichos reactivos y métodos son conocidos por un experto en la técnica e incluyen ácidos acuosos o anhidros débiles o fuertes, bases acuosas o anhidras débiles o fuertes, reactivos que contienen hidruros tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio e hidrogenación catalítica. Varios métodos para conjugar haptenos y vehículos también se desvelan en las Patentes de Estados Unidos 3.996.344 y la patente de Estados Unidos 4.016.146.

El grupo carboxílico y los ésteres activos se acoplan al vehículo o al polímero inmunogénico por medios convencionales. El grupo amino en el polímero de poliamina, tal como una proteína, produce un grupo amida que conecta el espaciador al polímero, inmunógenos o vehículo y/o conjugados de la presente invención.

En los inmunógenos conjugados de la presente invención, los enlaces químicos entre el hapteno de clozapina que contiene el grupo carboxilo y los grupos amino reactivos en el polímero de poliamina que está contenido en el vehículo o inmunógeno se pueden establecer usando varios métodos conocidos por el experto en la materia. Frecuentemente se prefiere formar enlaces amida. Los enlaces amida se forman en primer lugar activando el resto de ácido carboxílico en los compuestos de fórmula IV haciendo reaccionar el grupo carboxilo con un reactivo de grupo de salida (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol, p-nitrofenol y similares). Se puede usar un reactivo de activación tal como diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida y similares. La forma activada del grupo carboxilo en el hapteno de clozapina de fórmula V se hace reaccionar después con una solución tamponada que contiene el vehículo con el grupo amino reactivo.

Por otro lado, cuando X es un isocianato terminal o un radical tioisocianato en el compuesto de fórmula IV, cuando estos radicales reaccionan con los aminos libres de un polímero de poliamina producen el conjugado o inmunógeno

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de fórmula V, en la que X' es

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con el grupo amino en el vehículo de poliamina o en el polipéptido inmunogénico.

Cuando X, en los compuestos de fórmula IV contiene un radical aldehído, estos compuestos se pueden conectar a los grupos amino libres del polipéptido de poliamina en el vehículo mediante un enlace amino mediante aminación reductora. Se puede usar cualquier método convencional de condensación de un aldehído con una amina tal como la aminación reductiva para formar este enlace. En este caso, X' en las porciones de ligando de fórmula IV es -CH2-.

Los compuestos de fórmula IV se forman haciendo reaccionar la clozapina de fórmula I con un haluro de fórmula:

halo-B-(Y)p-X

en la que p, B, Y y X son como se ha indicado anteriormente.

Cualquier medio convencional de hacer reaccionar un haluro con el nitrógeno en la amina se puede utilizar en la condensación del compuesto de fórmula IV a la posición de amina secundaria en el clozapina de fórmula I. El uso de un haluro en el compuesto de fórmula IV proporciona un medio eficiente para formar tal amina terciaria sustituida mediante condensación del haluro con el grupo amina secundaria en el compuesto de fórmula I.

Cuando el compuesto de fórmula I está en la forma de su sal es necesario convertir esta sal en su base libre antes de hacerla reaccionar con el compuesto de fórmula IV para formar el compuesto de fórmula IV. Esto se puede llevar a cabo por medios convencionales tales como la neutralización de la sal. Cuando la sal es una sal básica, la neutralización se puede realizar en un medio acuoso mediante adición de un ácido. Cuando la sal es una sal de adición de ácido, la neutralización se realiza en un medio acuoso mediante la adición de una base.

El compuesto de fórmula IV se puede convertir en los inmunógenos y/o los reactivos del conjugado de la presente invención haciendo reaccionar estos compuestos con un vehículo que contiene una poliamina o un polipéptido. Se puede utilizar el mismo polipéptido como el vehículo y como el polímero inmunogénico en el inmunógeno de la presente invención siempre que la poliamina o el polipéptido sean inmunológicamente activos. Sin embargo, para formar los conjugados, estos polímeros no necesitan producir una respuesta inmunitaria tal como necesitan los inmunógenos. De acuerdo con la presente invención, los diversos grupos funcionales representados por X' en los compuestos de fórmula V se pueden conjugar con el vehículo que contiene polímero con un grupo amino reactivo por medios convencionales de unión de un grupo funcional a un grupo amino contenido en el polímero. De acuerdo con una realización preferente, en el compuesto de fórmula IV, X es un grupo de ácido carboxílico o un éster activo del mismo.

Los compuestos de fórmula IV son el reactivo, incluyendo el conjugado el inmunógeno preparado pueden estar presentes o usarse en el inmunoensayo de la presente invención en su forma de sal o como una base libre. El grupo amino libre en el compuesto de fórmula IV y en el conjugado que incluye inmunógeno preparado a partir del mismo forma fácilmente sales con ácidos preferentemente ácidos farmacéuticamente aceptables. En la presente invención puede usarse cualquier sal de ácido del compuesto de fórmula IV y los conjugados que incluyen inmunógeno preparado a partir del mismo. Estas sales incluyen ácidos inorgánicos y orgánicos tales como, por ejemplo, acético, bencenosulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etenosulfónico, dicloroacético, fórmico, fumárico, glucónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, oxálico, p-toluenosulfónico, y similares. Son particularmente preferentes los ácidos fumárico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, succínico, sulfúrico y metanosulfónico.

ANTICUERPOS

La presente invención también se refiere a nuevos anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales frente a clozapina producidos mediante la utilización de los inmunógenos mencionados anteriormente. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que estos anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención son reactivos selectivos con clozapina y no reaccionan ni reaccionan de forma cruzada con N-desmetilclozapina ni clozapina-N-óxido que interfieren con los inmunoensayos para clozapina. La capacidad de los anticuerpos de la presente invención para no reaccionar con N-desmetilclozapina o clozapina-N-óxido hace que estos anticuerpos proporcionen un inmunoensayo para detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de clozapina en muestras de fluido de pacientes.

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos y a anticuerpos monoclonales contra clozapina. Los

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antisueros de la invención se pueden producir de manera conveniente mediante la inmunización de animales huésped con los inmunógenos de la presente invención. Los animales huésped adecuados incluyen roedores, tal como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas y similares, o mamíferos superiores tales como cabras, ovejas, caballos y similares. Las dosis iniciales, los sangrados y las dosis de refuerzo se pueden dar de acuerdo con los protocolos aceptados para provocar respuestas inmunitarias en animales, por ejemplo, en una realización preferente, los ratones recibieron una dosis inicial de 100 ug de inmunógeno/ratón, i.p. y una o más dosis de refuerzo posteriores de entre 50 y 100 ug de inmunógeno/ratón durante un período de seis meses. Mediante el sangrado período, se observó que las muestras de sangre de los ratones inmunizados desarrollaban una respuesta inmunitaria frente a la unión a clozapina utilizando inmunoensayos convencionales. Estos métodos proporcionan una manera conveniente de reconocer huéspedes que están produciendo antisueros que tienen la actividad deseada. También se reconocieron anticuerpos frente al metabolito principales de N-desmetilclozapina y N-óxido-clozapina, y no presentaron unión sustancial a estos compuestos.

Los anticuerpos monoclonales se producen de manera conveniente mediante la inmunización de ratones Balb/c de acuerdo con la pauta anterior, seguida por la inyección de los ratones con 100 ug de inmunógeno i.p. o i.v. en tres días o 400 ug de inmunógeno i.p. o i.v. o 200 ug diarios durante los siguientes dos días comenzando cuatro días antes de la fusión celular. También se pueden utilizar otros protocolos bien conocidos en la técnica de los anticuerpos. El protocolo de inmunización completa detallado en el presente documento proporcionó un protocolo óptimo para la respuesta de anticuerpos séricos para el anticuerpo contra clozapina o sus sales farmacológicamente activas.

Los linfocitos B obtenidos del bazo, sangre periférica, ganglios linfáticos u otro tejido del huésped se pueden usar como la célula productora de anticuerpos monoclonales. Los más preferentes son los linfocitos B obtenidos del bazo. Los hibridomas capaces de generar los anticuerpos monoclonales deseados de la invención se obtienen fusionando tales linfocitos B con una línea celular inmortal, que es una línea celular que proporciona estabilidad a largo plazo del cultivo tisular en la célula híbrida. En la realización preferente de la invención, la célula inmortal puede ser una célula linfoblastoide o una célula de plasmocitoma tal como una célula de mieloma, en sí misma una célula productora de anticuerpos pero también maligna. Los hibridomas murinos que producen anticuerpos monoclonales contra clozapina o sus sales farmacológicamente activas se forman mediante la fusión de células de mieloma de ratón y células de bazo de ratones inmunizados frente a conjugados de proteína con clozapina o sus sales farmacológicamente activas. Los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante la clonación de los genes que expresan anticuerpos a partir de las células de hibridoma y empleando métodos de ADN recombinante bien conocidos en la actualidad en la técnica para unir la subsecuencia de la región variable de ratón a las regiones constantes humanas o para combinar regiones marco humanas con regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina de rata o de ratón donante. Un método mejorado para llevar a cabo la humanización de anticuerpos monoclonales murinos que proporciona anticuerpos de afinidades mejoradas se expone en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/11018.

Se pueden producir fragmentos de polipéptido que comprenden solo una parte de la estructura primaria de los anticuerpos, cuyos fragmentos poseen una o más actividades de inmunoglobulina. Estos fragmentos de polipépido se pueden producir mediante escisión proteolítica de anticuerpos intactos mediante métodos bien conocidos en la materia o mediante la inserción de codones de parada en los lugares deseados en vectores de expresión que contienen los genes de anticuerpo usando mutagénesis dirigida al sitio para producir fragmentos Fab o fragmentos (Fab')2. Los anticuerpos de cadena simple se pueden producir uniendo las regiones VL y VH con un enlazador de AdN (véase Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883 (1988) y Bird et al., Science, 242:423-426 (1988))

Los anticuerpos de la presente invención son selectivos para clozapina sin tener ninguna reactividad cruzada sustancial con los únicos metabolitos de clozapina: N-desmetilclozapina y N-óxido-clozapina. Por no tener reactividad cruzada sustancial se quiere decir que los anticuerpos de la presente invención no tienen reactividad o reactividad cruzada con respecto a su reactividad con clozapina con estos metabolitos, particularmente N- desmetilclozapina y clozapina-N-óxido de menos de 5 %, preferentemente menos de 2 %, y, lo más preferentemente, menos de 1 %. Estos porcentajes se basan en la reactividad de estos anticuerpos con clozapina.

INMUNOENSAYOS

De acuerdo con la presente invención, los conjugados y los anticuerpos generados a partir de los inmunógenos de estos compuestos de fórmula IV se pueden utilizar como reactivos para la determinación de clozapina en muestras de pacientes. Esta determinación se realiza por medio de un inmunoensayo. Cualquier inmunoensayo en el que los conjugados de reactivo formados a partir de los compuestos de fórmula IV compiten con la clozapina en la muestra por los sitios de unión en los anticuerpos generados de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para determinar la presencia de clozapina en una muestra de pacientes. La manera de realizar dicho ensayo para clozapina en una muestra sospechosa de contener clozapina comprende combinar (a) una muestra de medio acuoso, (b) un anticuerpo frente a clozapina generado de acuerdo con la presente invención y (c) los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula IV o las mezclas de los mismos. La cantidad de clozapina en la muestra se puede determinar midiendo la inhibición de la unión al anticuerpo específico de una cantidad conocida

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del conjugado añadido a la mezcla de la muestra y anticuerpos. El resultado de la inhibición de tal unión de la cantidad conocida de conjugados mediante la muestra desconocida se compara con los resultados obtenidos en el mismo ensayo utilizando soluciones patrón conocidas de clozapina. Al determinar la cantidad de clozapina en una muestra desconocida, la muestra, los conjugados formados a partir de los compuestos de la fórmula IV y el anticuerpo se pueden añadir en cualquier orden.

Se pueden utilizar diversos medios para medir la cantidad de conjugado formado a partir de los compuestos de fórmula IV unidos al anticuerpo. Un método es cuando la unión de los conjugados al anticuerpo provoca una disminución en la tasa de rotación de un conjugado de fluoróforo. La cantidad de disminución de la velocidad de rotación de un conjugado de fluoróforo en la mezcla líquida se puede detectar mediante la técnica de polarización fluorescente tal como la desvelada en la patente de Estados Unidos 4.269.511 y la patente de Estados Unidos 4.420.568.

Por otro lado, el anticuerpo se puede recubrir o adsorber sobre nanopartículas de manera que cuando estas partículas reaccionen con los conjugados de clozapina formados a partir de los compuestos de fórmula V, estas nanopartículas formen un agregado. Sin embargo, cuando las nanopartículas recubiertas de o con anticuerpo adsorbido reaccionen con la clozapina en la muestra, la clozapina de la muestra unida a estas nanopartículas no genera la agregación de las nanopartículas de anticuerpo. La cantidad de agregación o aglutinación se puede medir en la mezcla de ensayo mediante absorbancia.

Por otro lado, estos ensayos se pueden llevar a cabo teniendo bien el anticuerpo o bien los conjugados de clozapina unidos a un soporte sólido tal como una placa de microtitulación o cualquier otro soporte sólido convencional, incluyendo partículas sólidas. La unión de anticuerpos y proteínas a tales partículas sólidas es bien conocida en la materia. Cualquier método convencional se puede utilizar para llevar a cabo tales uniones. En muchos casos, con el fin de ayudar a la medición, se pueden colocar marcadores sobre los anticuerpos, los conjugados o las partículas sólidas, tales como marcadores radiactivos o marcadores enzimáticos, como ayuda en la detección de la cantidad de los conjugados formados a partir de los compuestos de fórmula IV que se unen o desunen del anticuerpo. Otros marcadores adecuados incluyen cromóforos, fluoróforos, etc.

Por cuestiones de conveniencia, los componentes del ensayo de la presente invención se pueden proporcionar en un kit, una combinación empaquetada con cantidades predeterminadas de nuevos reactivos empleados en el ensayo para clozapina. Estos reactivos incluyen el anticuerpo de la presente invención, así como, los conjugados formados a partir de los compuestos de la fórmula V.

Además de estos reactivos necesarios, se pueden incluir aditivos tales como reactivos auxiliares, por ejemplo, estabilizantes, tampones y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos se pueden proporcionar en solución o como polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentraciones adecuadas para realizar el ensayo.

Ejemplos

En los ejemplos, las siguientes abreviaturas se usan para designar lo siguiente:

MsCl cloruro de metanosulfonilo

DIPEA N-N'-Diisopropiletilamina

CH2Cl2 cloroformo

MeOH metanol Na2SO4 sulfato sódico

LiOH hidróxido de litio

EtOAc acetato de etilo

Et3N trietilamina

THF tetrahidrofurano

TFA ácido trifluoroacético

pTSA ácido p-toluenosulfónico

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HATU hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

DMF dimetilformamida

DMSO dimetilsulfóxido

s-NHS sulfo-N-hidroxisuccinimida

EDC (clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida)

KLH hemocianina de lapa californiana BSA Seroalbúmina bovina

PBS solución salina tamponada con fosfato

NaCl cloruro sódico

HRP peroxidasa de rábano picante

ANS ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico

TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina

TRIS clorhidrato de Tris(hidroximetil)aminometano

di H2O agua desionizada

La composición de tampón de fosfato tiene una solución acuosa que contiene

fosfato de sodio dibásico 15,4 mM (Na2HPO4) fosfato de sodio monobásico 4,6 mM (NaH2PO4) pH = 7,2±0,10

En los siguientes ejemplos, los esquemas 1-2 a continuación exponen los compuestos específicos preparados y citados mediante números en los Ejemplos. Los esquemas son los siguientes:

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Ejemplo 1

Preparación de ácido 6-[8-cloro-11- (4-metil-piperazin-1-il)-dibenzo[ó,eH1,4] diazepin-5-il]-6-oxo-hexanoico (esquema 1)

A una solución de compuesto [1] (2 g, 6,12 mmol) en tolueno (60 ml), se añadió piridina (0,49 ml, 6,12 mmol) seguido de cloruro de metiladipoílo (1,3 ml, 7,95 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3,5 horas, se enfrió hasta la temperatura ambiente y se agitó con Na2CO3 acuoso al 10 % (12 ml) durante 20 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con éter y se lavó con agua. La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida usando CH2Cl2/MeOH 98:2 a 97:3 que contiene Et3N al 0,1 % dio el compuesto [2] (3,07 g, cuantitativa).

A una mezcla del compuesto [2] (3,06 g, 6,12 mmol), THF (50 ml), MeOH (50 ml) y H2O (19 ml), se añadió LiOHH2O (1,8 g, 42,84 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en nitrógeno durante 3 horas, tras lo cual la TLC mostró ausencia del material de partida. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 0,1 N. La capa acuosa se volvió a extraer con CH2Cl2 (3 x). Las capas de EtOAc y CH2Cl2 se lavaron por separado con salmuera saturada, se secaron usando Na2SO4 anhidro, se filtraron y se evaporaron. El producto combinado se trituró con CH2Cl2/hexano para producir compuesto [3], que es ácido 6-[8-cloro-11-(4-metil-piperazin-1-il)- dibenzo[6,e]-[1,4]diazepin-5-il]-6-oxo-hexanoico (2,50 g, 90 %).

Ejemplo 2

Preparación de éster terc-butílico de ácido 4 - ({6-[8-cloro-11- (4-metil-piperazin-1-il)-dibenzo[b,e]-[1,4] diazepin-5- il]6-oxo-hexanoilamino}-metil)-benzoico (esquema 2)

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A 0 °C, a una mezcla del compuesto [3], ácido 6-[8-cloro-11-(4-met¡l-p¡peraz¡n-1-¡l)-d¡benzo[6,eH1,4]d¡azep¡n-5-¡l]-6- oxo-hexanoico (600 mg, 1,32 mmol), compuesto [6] (430 mg, 1,45 mmol), DIPEA (0,78 ml, 4,48 mmol) en DMF seco (13 ml), se añad¡ó HATU (601 mg, 1,58 mmol) y la mezcla de reacc¡ón se ag¡tó durante la noche. Se añad¡ó una cant¡dad ad¡c¡onal de HATU (601 mg, 1,58 mmol) y la mezcla de reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 1 día. La mezcla de reacc¡ón se repart¡ó entre agua y EtOAc, la capa orgán¡ca se lavó sucesivamente con HCl 1 N, NaHCO3 sat., agua y salmuera sat., y se secó usando Na2SO4 anh¡dro, se f¡ltró y se evaporó. La pur¡f¡cac¡ón med¡ante cromatografía usando C^Ch/MeOH/EtaN (93:7:0.1) d¡o el compuesto [7] (638 mg, 75 %).

A temperatura amb¡ente, a una soluc¡ón del compuesto [7] (635 mg, 0,986 mmol) en CH2O2 (4 ml), se añad¡ó TFA (4 ml) y la mezcla de reacc¡ón se ag¡tó a temperatura amb¡ente en n¡trógeno durante 4 horas. El d¡solvente se evaporó y coevaporó con CH2Ch (2x) y se secó al vacío. El res¡duo en la tr¡turac¡ón con éter produjo compuesto [8], que es el éster terc-butíl¡co de ác¡do 4-({6-[8-cloro-11-(4-met¡l-p¡peraz¡n-1-¡l)-d¡benzo[6,e]-[1,4]d¡azep¡n-5-¡l] 6-oxo-

hexano¡lam¡no}-met¡l)-benzo¡co (563 mg, 97 %).

Ejemplo 3

Método general para preparar der¡vados de fármacos act¡vados por s-NHS a part¡r de los ác¡dos correspond¡entes [3] y [8]

En los ejemplos 3a y 3b, los der¡vados del ác¡do clozapín¡co [3] y [8] se act¡varon con EDC y s-NHS para produc¡r los ésteres de clozap¡na act¡vados con s-NHS [4] y [9] para la eventual conjugac¡ón con proteínas (ejemplos 4 y 5).

Ejemplo 3a

Preparac¡ón de ác¡do 6- [8-cloro-11-(4-met¡l-p¡peraz¡n-1-¡l) -d¡benzo[b,e]-[1,4]d¡azep¡n-5-¡l]-6-oxo-hexano¡co [4]

Se d¡solv¡ó el der¡vado de clozap¡na [3], Ejemplo 1, Esquema 1 (56,8 mg) en 5,68 ml de DMSO, a lo que se añad¡ó s-NHS (66,56 mg) y EDC (58,58 mg). La mezcla de reacc¡ón se ag¡tó durante 20 horas a temperatura amb¡ente bajo una atmósfera de n¡trógeno para produc¡r el éster de clozap¡na act¡vado por NHS-s. [4]. La mezcla de reacc¡ón se usó d¡rectamente en los Ejemplos 4 y 5a.

Ejemplo 3b

Preparac¡ón de ác¡do 4 - ({6- [8-cloro-11-(4-met¡l-p¡peraz¡n-1-¡l) -d¡benzo[b,e]-[1,4]d¡azep¡n-5-¡l]6-oxo-

hexano¡lam¡no}met¡l)-benzo¡co [9] act¡vado por s-NHS

Se d¡solv¡ó el der¡vado de clozap¡na [8], Ejemplo 2, Esquema 2 (25,0 mg) en 2,5 ml de DMSO, a lo que se añad¡ó s- NHS (19,9 mg) y EDC (17,6 mg). La mezcla de reacc¡ón se ag¡tó durante 20 horas a temperatura amb¡ente bajo una atmósfera de n¡trógeno para produc¡r el éster de clozap¡na act¡vado por NHS-s. [9]. La mezcla de reacc¡ón se usó d¡rectamente en el Ejemplo 5b.

Ejemplo 4

Preparac¡ón de ¡nmunógeno de KLH [5] con hapteno act¡vado [4]

Se preparó una soluc¡ón de proteína de KLH d¡solv¡endo 300 mg de KLH en 20 ml de tampón fosfato (50 mM, pH

7.5) , segu¡do de la ad¡c¡ón de 4,85 ml de der¡vado de clozap¡na [4] act¡vado por s-NHS preparado en el ejemplo 3a. La mezcla de reacc¡ón de KLH y el der¡vado de clozap¡na act¡vado [4] se dejaron en ag¡tac¡ón durante 20 horas a temperatura amb¡ente para produc¡r el conjugado de clozap¡na-KLH [5]. El conjugado de clozap¡na-KLH [5] se pur¡f¡có después med¡ante d¡ál¡s¡s frente a DMSO al 30 % en tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) a temperatura amb¡ente. A cont¡nuac¡ón, la proporc¡ón de DMSO se redujo de manera gradual: 20 %, 10 % y 0 %. La últ¡ma d¡ál¡s¡s se real¡zó frente a tampón fosfato a 4 °C. El conjugado de clozap¡na-KLH [5] se caracter¡zó med¡ante espectroscopía de ultrav¡oleta-v¡s¡ble. El conjugado se d¡luyó a una concentrac¡ón f¡nal de 2 mg/ml en tampón fosfato (50 mM, pH

7.5) .

Ejemplo 5a

Preparac¡ón de Conjugado de BSA [5] con hapteno act¡vado [4]

Se preparó una soluc¡ón de proteína de BSA d¡solv¡endo 1 g de BSA en tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) a una concentrac¡ón f¡nal de 50 mg/ml. A esta soluc¡ón de proteína se añad¡eron 0,83 ml de der¡vado de clozap¡na act¡vado por s-NHS [4] preparado en el Ejemplo 3a. La cant¡dad de der¡vado de clozap¡na act¡vado por sulfo-NHS [4] añad¡da a la soluc¡ón de proteína de BSA se calculó para una proporc¡ón molar de 1:1 entre el der¡vado de clozap¡na [4] y la BSA. La mezcla de BSA y el der¡vado de clozap¡na act¡vado [4] se dejó en ag¡tac¡ón durante 18 horas a temperatura amb¡ente para produc¡r el conjugado del éster de clozap¡na act¡vado y BSA. Este conjugado se pur¡f¡có después med¡ante d¡ál¡s¡s frente a DMSO al 20 % en tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) a temperatura amb¡ente. A

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continuación, la proporción de DMSO se redujo de manera gradual: 10 % y 0 %. La última diálisis se realizó frente a tampón fosfato a 4 °C. El conjugado de clozapina-BSA [5] se caracterizó mediante espectroscopía UV/VIS.

Ejemplo 5b

Preparación de Conjugado de BSA [10] con hapteno activado [9]

Se preparó una solución de proteína de BSA disolviendo 1 g de BSA en tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) a una concentración final de 50 mg/ml. A 10,0 ml de la solución de proteína de BSA en agitación con hielo, se añadieron 0,620 ml de derivado de clozapina activado por s-NHS [9] preparado en el Ejemplo 3b. La cantidad de derivado de clozapina activado por sulfo-NHS [9] añadida a la solución de proteína de BSA se calculó para una proporción molar de 1:1 entre el derivado de clozapina [9] y la BSA. La mezcla de BSA y el derivado de clozapina activado [9] se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente para producir el conjugado del éster de clozapina activado y BSA [10]. Este conjugado se purificó después mediante diálisis frente a DMSO al 15 % en tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) a temperatura ambiente. A continuación, la proporción de DMSO se redujo de manera gradual: 10 %, 5 % y 0 %. La última diálisis se realizó frente a tampón fosfato a 4 °C. El conjugado de clozapina [9]-BSA se caracterizó mediante espectroscopía UV/VIS.

Ejemplo 6a

Preparación de anticuerpos policlonales frente al conjugado de clozapina-KLH [5]

Se inmunizaron diez ratones hembra BALB/c i.p. con 100 pg/ratón de inmunógeno de clozapina-KLH [5], como se preparó en el Ejemplo 4, emulsionado en adyuvante completo de Freund. Los ratones se reforzaron una vez, cuatro semanas después de la inyección inicial con 100 pg/ratón del mismo inmunógeno emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Veinte días después del refuerzo, los sangrados de prueba que contenían anticuerpos policlonales de cada ratón se obtuvieron por sangrado orbital. El antisuero de estos sangrados de prueba contenía anticuerpos frente a clozapina se evaluaron en los Ejemplos 8 y 9.

Ejemplo 6b

Preparación de anticuerpos monoclonales frente a clozapina-KLH [5]

Los ratones del ejemplo 6a que se inmunizaron con clozapina-[5]-KLH preparado en el Ejemplo 4 se usaron para producir anticuerpos monoclonales. Para los anticuerpos monoclonales, comenzando tres días antes de la fusión, se inyectó i.p. a los ratones con 400 |jg (3 días antes de la fusión), 200 |jg (2 días antes de la fusión) y 200 |jg (1 día antes de la fusión) o 100 jg (3 días antes de la fusión), 100 pg (2 días antes de la fusión) y 100 jg (1 día antes de la fusión) de conjugado de clozapina-KLH [5] en PBS/DMSO preparado en el ejemplo 4. Las células del bazo se aislaron a partir de los ratones seleccionados y se fusionaron con 2 x 107 células SP2/0 con polietilenglicol 1500 al 50 %, de acuerdo con el método de Coligan, J.E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, 2.5.1 - 2.5.8, (1992), Wiley & Sons, NY. Las células fusionadas se sembraron en diez placas de 96 pocillos en DMEM/F12 suplementado con FetalClone I al 20 %, L-glutamina al 2 % (100 mM) y 50X HAT al 2 %. Dos o tres semanas después, el sobrenadante de hibridoma se ensayó para la presencia de anticuerpos anti-clozapina mediante ELISA (como en el ejemplo 8). Las células de los pocillos que dieron resultados positivos en el ELISA (ejemplo 8) se expandieron a placas de 24 pocillos. Los clones positivos mediante ELISA se subclonaron dos veces mediante dilución límite de acuerdo con el método desvelado en Coligan, J.E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, 2.5.8 - 2.5.17, 1992, Wiley & Sons, NY. Los sobrenadantes de cultivo de hibridoma que contienen anticuerpos monoclonales de subclones seleccionados se confirmaron para la unión a clozapina mediante un ELISA competitivo (ejemplo 9). Estos anticuerpos monoclonales se analizaron para la unión de clozapina y la reactividad cruzada a los metabolitos principales de clozapina, N-desmetilclozapina y N-óxido-clozapina, mediante ensayo de placa de microtitulación competitivo indirecto tal como se describe en el ejemplo 9.

Ejemplo 7a

Procedimiento de sensibilización de placa de microtitulación con conjugado de clozapina-BSA [5]

El método ELISA para medir concentraciones de imatinib se realizó en placas de microtitulación de poliestireno (Nunc MaxiSorp f8 Immunomodules) optimizadas para la unión a proteína y que contienen 96 pocillos por placa. Cada pocillo se revistió con conjugado de clozapina-BSA [5] (preparado como en el Ejemplo 5a) añadiendo 300 pl de conjugado de clozapina-BSA [5] a 10 pg/ml en carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6 y después de bloquearon con 375 pl de sacarosa al 5 %, solución de caseinato de sodio al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la retirada de la solución posrecubrimiento, las placas se secaron a 37 °C durante toda la noche.

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Procedimiento de sensibilización de placa de microtitulación con conjugado de clozapina-BSA [10]

El método ELISA para medir concentraciones de imatinib se realizó en placas de microtitulación de poliestireno (Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules) optimizadas para la unión a proteína y que contienen 96 pocillos por placa. Cada pocillo se revistió con conjugado de clozapina-BSA [10] (preparado como en el Ejemplo 5b) añadiendo 300 pl de conjugado de clozapina-BSA [10] a 10 pg/ml en carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6 y después de bloquearon con 375 pl de sacarosa al 5 %, solución de caseinato de sodio al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la retirada de la solución posrecubrimiento, las placas se secaron a 37 °C durante toda la noche.

Ejemplo 8

Procedimiento de selección de anticuerpos - Título

Este procedimiento es para descubrir la dilución de anticuerpos que se debe usar para el desplazamiento, tal como en el Ejemplo 9. El método de ELISA para seleccionar anticuerpos frente a clozapina se realizó con las placas de microtitulación que se sensibilizaron con el conjugado de clozapina-BSA preparado en el Ejemplo 7a y 7b. El ensayo de detección selectiva de anticuerpos se realizó diluyendo el suero murino de las muestras de sangre que contenían anticuerpos policlonales frente a clozapina a 1:10, 1:100, 1:1.000 y 1:10.000 (volumen/volumen) en solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,1 % de BSA y 0,01 % de timerosal. Se añadieron a cada pocillo de pocillos sensibilizados con clozapina-BSA (preparados en los ejemplos 7a y 7b) se añadieron 50 pl de solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,1 % de BSA y 0,01 % de timerosal y 50 pl de anticuerpo diluido y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Durante esta incubación, el anticuerpo se une al conjugado de clozapina-BSA absorbido de manera pasiva en los pocillos (Ejemplo 7a 7b). Los pocillos de las placas se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, NaCl al 0,9 %, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, a pH 7,8 para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo frente a clozapina unida al conjugado de clozapina-BSA en los pocillos, 100 pl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón - enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido a una actividad específica (aproximadamente 1/3000) en PBS con 0,1 % de BSA, 0,05 % de ANS, 0,01 % de timerosal, capaz de unirse específicamente a inmunoglobulinas murinas y de producir un producto coloreado cuando se incuba con un sustrato, en este ejemplo TMB, se añadieron a cada pocillo. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón con enzima HRP se une a los anticuerpos frente a clozapina en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para eliminar el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón con enzima HRP no unido. Para desarrollar un color mensurable en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 pl de TMB (sustrato de TMB, BioFx), el sustrato para HRP, para desarrollar color durante una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, se añadieron 50 pl de solución de parada (fluoruro sódico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo del color y tras 20 segundos de agitación se determinó la absorbancia a 650 nm (lector de placa de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida y se expresó como la dilución (título) que da como resultado una absorbancia de 1,5. Los títulos se determinaron representando gráficamente la dilución de anticuerpo del anticuerpo medido (eje x) frente a la absorbancia a 650 nm (eje y) e interpolando el título a una absorbancia de 1,5. El título que produjo la absorbancia de 1,5 determinó la concentración (dilución) de anticuerpo usado en el ensayo de placa de microtitulación competitivo indirecto descrito en el Ejemplo 9.

Ejemplo 9

Procedimiento de inmunoensayo competitivo indirecto en placa de microtitulación que determina la CI50 y la reactividad cruzada para anticuerpos frente a clozapina

El método de ELISA para determinar los valores de la CI50 y la reactividad cruzada se realizó con las placas de microtitulación que se sensibilizaron con conjugados de clozapina-BSA descritas en los Ejemplos 7a 7b. Los analitos se diluyeron del siguiente modo: la clozapina se diluyó en serie en DMSO y se diluyó adicionalmente a 1 % de DMSO sobre un intervalo de concentración de 0,01 a 50 ng/ml para placas de microtitulación de clozapina-[5]-BSA y clozapina-[10]-BSA, la N-desmetilclozapina se diluyó en serie en DMSO y se diluyó adicionalmente a DMSO al 1 % en un intervalo de concentración de 0,24 a 1.000 ng/ml para el conjugado de clozapina-BSA [5] y las placas de microtitulación de conjugado de clozapina-BSA [10] y clozapina N-óxido se diluyeron en serie en DMSO y se diluyeron adicionalmente hasta DMSO al 1 % a un intervalo de concentración de 0,24 a 1.000 ng/ml para las placas de microtitulación de conjugado de clozapina-BSA [5] y el conjugado de clozapina-BSA [10] placas de microtitulación. Cada uno de los ensayos se realizaron incubando 50 pl de la solución de analito con 50 pl de uno de los anticuerpos seleccionados entre los anticuerpos policlonales producidos en el Ejemplo 6 con el inmunógeno del ejemplo 4. Todos estos ensayos se realizaron diluyendo la concentración de anticuerpos en cada uno de los pocillos al título determinado en el Ejemplo 8. Durante la incubación de 10 minutos (a temperatura ambiente, con agitación) se da una competición de la unión de anticuerpos para el conjugado de clozapina-BSA en el pocillo (producida en los ejemplos 7a 7b) y el analito en solución. Tras esta incubación, los pocillos de la placa se lavaron tres veces con

5

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15

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30

TRIS 0,02 M, NaCI al 0,9 %, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, a pH 7,8 para retirar cualquier material que no estaba unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo frente a clozapina unido al conjugado de clozapina-BSA en los pocillos (producida en el ejemplo 7a 7b), 100 jl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón-enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido a una actividad específica (aproximadamente 1/3000) en PBS con 0,1 % de BSA, 0,05 % de ANS, 0,01 % de timerosal, capaz de unirse específicamente a inmunoglobulinas murinas y de producir un producto coloreado cuando se incuba con un sustrato, en este ejemplo TMB, se añadieron a cada pocillo. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente con agitación, durante la que el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón con enzima HRP se une a los anticuerpos frente a clozapina en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para retirare el conjugado secundario no unido. Para desarrollar un color mensurable en los pocillos, el lavado fue seguido por la adición de 100 pl de TMB (sustrato de TMB, BioFx), el sustrato para HRP, para desarrollar color en una incubación de 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. Tras la incubación para el desarrollo del color, la absorbancia se determinó a 650 nm (Molecular Devices Plate Reader). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida e inversamente proporcional a la cantidad de clozapina en la muestra. Los valores de CI50 de clozapina se determinaron construyendo curvas de respuesta a la dosis con la absorbancia en los pocillos representada frente a la concentración de analito en los pocillos. La absorbancia del color en los pocillos que contienen el analito se comparó con la de sin analito y se generó una curva patrón. El valor de la CI50 se definió como la concentración de analito que se requiere para tener el 50 % de la absorbancia de los pocillos que no contienen analito. La reactividad cruzada se calculó como la proporción de la CI50 de clozapina frente al valor de la CI50 de N-desmetilclozapina o clozapina-N-óxido y se expresó como un porcentaje. Después de explorar la biblioteca de anticuerpos monoclonales usando este método, se seleccionaron los anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos elegidos se clasificaron según su placa y número de pocillo de la siguiente manera: 5B1-24-30, 5H2-6-14, 5H2-6-30, 5G10-19-19, 1G9-22-5 y 20A5-25-24. Cuando se midieron, el porcentaje de reactividades cruzadas de estos anticuerpos con respecto a su reactividad con clozapina para N- desmetilclozapina (NDMC) y clozapina-N-óxido fue < 2 %. Los resultados para los anticuerpos monoclonales frente a clozapina se dan en las Tablas I y II a continuación.

TABLA I

Reactividad cruzada de inmunoanálisis competitivo utilizando anticuerpos monoclonales frente a clozapina.

N. de subclon

Placas recubiertas con el conjugado de clozapina-BSA [5] (Ejemplo 7A)

CI50 de Clozapina (ng/ml)

CI50 de NDMC (ng/ml) CI50 de Clozapina-N- óxido (ng/ml) % de reactividad cruzada NDMC % de reactividad cruzada N-óxido

5B1-24-30

10 760 >1000 1,3 0,99

5H2-6-14

5 920 880 0,53 0,56

5H2-6-30

5 >1000 620 <0,45 0,73

5G10-19-19

0,8 150 170 0,49 0,44

1G9-22-5

0,6 280 40 0,22 1,39

20A5-25-24

0,7 >1000 100 <0,07 0,72

TABLA II

Reactividad cruzada de inmunoensayo competitivo utilizando anticuerpos monoclonales frente a clozapina

N. de subclon

Placas recubiertas con conjugado clozapina-BSA [10] (Ejemplo 7B)

CI50 de Clozapina (ng/ml)

CI50 de NDMC (ng/ml) CI50 de Clozapina-N- óxido (ng/ml) % de reactividad cruzada NDMC % de reactividad cruzada N-óxido

5B1-24-30

7 600 200 1,1 3,3

5H2-6-14

3 970 620 0,30 0,47

5H2-6-30

3 >1000 480 <0,27 0,57

5G10-19-19

2 180 280 1,2 0,78

1G9-22-5

0,5 220 60 0,23 0,86

20A5-25-24

2 >1000 150 <0,24 1,56

Como se ve en estas tablas, los anticuerpos de la presente invención son sustancialmente selectivamente reactivos con la forma activa de clozapina y no son sustancialmente reactivos cruzados con los metabolitos activos N- desmetilclozapina y clozapina-N-óxido.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un inmunoensayo para la detección de clozapina en una muestra, que comprende proporcionar una mezcla de a) dicha muestra, b) un anticuerpo selectivamente reactivo con clozapina y que no presenta reactividad cruzada con la 5 N-desmetilclozapina y el clozapina-N-óxido, y c) un conjugado de un vehículo que tiene un grupo tiol o amino reactivos con un compuesto de fórmula:

   imagen1

   10 en la que B es: -(C=O)-, -(C=O)-NH-, -(C=O)-O-, -CH2-;

   Y es un grupo espaciador orgánico;

   X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina; y p es un número entero de 0 a 1;

   15 o sus sales;

   hacer que la clozapina de la muestra y dicho conjugado en dicha mezcla se unan a dicho anticuerpo y posteriormente medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que está unido o no unido a dicho anticuerpo, por lo que se puede determinar la presenta de clozapina en la muestra.

   20 2. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde p es 0.
2. 3. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde p es 1.
3. 4. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde Y es alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de 25 carbono,

   imagen2

   o

   30

   imagen3

   en donde n y o son números enteros de 0 a 6, y m es un número entero de 1 a 6, y, preferentemente, Y es alquileno inferior.

   35
4. 5. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X es

   -C-OR3

   O

   -N=C =R4,

   -CH

   O

   o

   imagen4

   40 en la que R3 es hidrógeno o tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y R4 es oxígeno o azufre.
5. 6. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde X es

   imagen5

   5 y R3 es hidrógeno.
6. 7. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde X es

   -j-OR3

   o

   10

   y OR3 forma un éster reactivo.
7. 8. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el éster formado es un éster de alquilo inferior, un imidoéster o un amidoéster.

   15
8. 9. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno que comprende un vehículo inmunogénico que contiene un grupo tiol o amino reactivos conjugados a un compuesto de la fórmula:

   20

   imagen6

   en la que p, X, Y y B son como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores;

   o sus sales.

   25
9. 10. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vehículo contiene un grupo tiol y X en el compuesto que está conjugado con el polímero inmunogénico es un grupo funcional capaz de reaccionar con dicho tiol, y es, preferentemente,

   O

   imagen7
10. 11. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el vehículo inmunogénico contiene como grupo funcional

    imagen8

    en el que v es un número entero de 1 a 6.
11. 12. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es una

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    muestra humana.
12. 13. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se une a un soporte sólido, preferentemente placas de microtitulación o nanopartículas.
13. 14. Un anticuerpo que se une selectivamente a clozapina y tiene una reactividad cruzada con N-desmetilclozapina y clozapina-N-óxido de menos del 5 %.
14. 15. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho anticuerpo proviene de ratones, ovejas, conejos o ratas y es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal.
15. 16. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15 como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
16. 17. Un conjugado de un vehículo que tiene un grupo tiol o un grupo amino con un compuesto de la fórmula:

    imagen9

    en la que p, X, Y y B son tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; o sus sales;

    y en donde el vehículo contiene un polímero inmunogénico que contiene uno o más grupos amino unidos

    -NH-C-

    mediante o o R4

    en el que R4 es oxígeno o azufre.
17. 18. Un kit para la determinación de la presencia de clozapina en una muestra de un paciente, que comprende reactivos en envases separados, siendo uno de los reactivos un conjugado de un vehículo que contiene un grupo funcional amino o un grupo tiol con un compuesto seleccionado de los grupos que consisten en compuestos de fórmula:

    imagen10

    en la que p, X, Y y B son tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; o sus sales; y el segundo envase que contiene un anticuerpo reactivo de forma sustancialmente selectiva con clozapina y que no presenta reactividad cruzada sustancial con N-desmetilclozapina y clozapina-N-óxido.

    5 19. Un kit de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho conjugado está presente en una cantidad

    predeterminada en dicho primer envase.
18. 20. Un kit de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho kit se usa para determinar la cantidad de clozapina en dicha muestra.

    10
19. 21. Un kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho vehículo tiene un grupo tiol funcional terminal reactivo y X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a dicho grupo tiol, y es, preferentemente,

    imagen11