KR0181948B1 - 인체 IgE에 대한 모노클론 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인체 IgE에 대한 신규 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B, 이들의 혼합물, 항체 생산 하이브리도마, 그리고 알레르기 질환 및 기생충 감염의 임상에 유용한, 항체 이용 인체 IgE의 면역 측정법을 제공한다.

Description

인체 IgE에 대한 모노클론 항체
제1도는 본 발명의 모노클론항체의 열처리 IgE에 대한 반응성을 나타낸 도면.
제2도는 본 발명의 모노클론항체를 조합한 샌드위치 ELISA계에 있어서의, 모노클론항체의 IgE 감도 곡선을 나타낸 도면.
제3도는 본 발명의 모노클론항체 HE-69B의 고상비이드를 사용한 샌드위치 RIA계에서의, 3종의 모노클론항체(HE-22A, HE-35A, HE-39E) 및 이들 3종의 혼합항체에 의한 IgE감도곡선을 나타낸 도면.
본 발명은 인체 면역 글로블린 E(이하 IgE)에 대한 모노클론항체, 그 모노클론항체의 혼합물, 그 모노클론항체를 생산하는 하이브리도마, 및 그 모노클론항체를 사용하는 인체 IgE의 면역측정법에 관한 것이다. 본 발명의 모노클론 항체는, 인체 IgE를 측정하는 임상 진단 시약용 항체로서 유용하다.
IgE, 1966년 이시자까 들에 의해 발견된 면역 글로블린이며, 비만 세포나 호염기구 표면의 Fc리셉터를 거쳐 결합하고, 알레르겐과 반응하므로서 즉시형 알레르기를 야기시킨다. IgE는 다른 면역 글로블린에 비하여 그 혈중농도가 매우 낮지만, 알레르기성 질환을 비롯하여 간장해나 기생충감염 등의 질환을 수반할 경우 상당한 정도까지 IgE 농도가 상승하는 등, 혈중농도 분포가 광범위하다는 것이 특징이다. 따라서, 혈중 IgE농도의 측정을 행하는 것은, 알레르기성 질환이나, 기생충 감염중의 진단에 유용하다고 생각되고 있으며, 현재 일반적으로 사용되고 있는 방법은, 방사 면역 측정(RIA)법이나, 효소 면역 측정(EIA)법이다.
인체 IgE에 특이적으로 반응하는 모노클론 항체는, 이미 이찌모리 등에 의해서 보고되어 있고 [하이브리도마(Hybridoma) 4, 47(1985)], 인체 IgE특이적 모노클론 항체를 사용한 혈중 인체 IgE 측정법도 J. Grassi 등에 의해서 보고되어 있다. [(J. Allergy. Clin. Immunol.) 77. 808(1986)]. 그러나, 이들의 모노클론 항체를 사용한 종래의 방법으로, 사람 혈중 IgE양을 측정하려고 할 때에는, IgE의 측정범위가 좁고, 측정 조작이 복잡해지는 문제를 겪게된다. 또한 검량선이 직선적이지 않기 때문에, 측정 농도 범위 마다의 감도가 달라, 측정되는 농도에 한결같은 신뢰성을 기대하기 어렵다, 혹은 측정에 특수한 장치를 필요로 하는 등의 문제점이 있으며, 이들 모두를 동시에 해결하는 수단이 발견되고 있지 않다.
본 발명이 제공하는 인체 IgE 특이적 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B는, 4종의 모노클론 항체 각각이 인체 IgE에 대한 다른 항체의 결합에 아무 영향없이 인체 IgE의 다른 영역에 결합할 수 있는 특징으로 갖고 있다. 또한, 4종의 모노클론 항체 각각은 인체 IgE에 대하여 다른 친화성으로 결합하기 때문에 이들을 적절히 혼합하므로서 사람 IgE에 대한 반응성의 강도를 조절할 수 있다고 하는 특징을 갖추고 있다. 이러한 성질을 바탕으로, 본 발명의 인체 IgE 특이적 항체를 사용하므로서, 매우 간편한 조작으로 특수한 장치를 필요로 함이 없이, 광범위한 사람 혈중 IgE 농도를 높은 신뢰성으로 측정하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명 모노클론 항체는, 사람혈중 IgE 측정용 임상 검사약으로서 이용할 수 있다.
1) 하이브리도마의 제조
마우스를 인체 IgE로 면역시킨다. 면역된 마우스에서 항체 생산 세포를 얻고, 이것과 골수종세포를 융합하여 얻어진 하이브리도마 세포중 면역 인체 IgE 및 유래가 다른 인체 IgE에 강하게 반응하나, 인체 IgG에는 반응하지 않는 하이브리도마 세포를 선택한다. 선택된 하이브리도마를 클로닝하고, 생성 항체에 대하여, 유래가 다른 인체 IgE 3종 및 인체 IgA, 인체 IgM, 인체 IgG에 대한 항체의 반응 특이성을 상세히 검정한 후, 면역한 인체 IgE 및 유래가 다른 인체 IgE에 대해서는 강하게 반응하지만, 다른 인체 면역 글로블린에는 반응하지 않는 클론 생성 항체를 선택하고, 이것을 배양하여 모노클론 항체를 회수한다. 면역법, 세포융합법, 융합세포의 선별등은 공지의 통상의 방법에 의해서 행할 수 있다.
2) 모노클론 항체의 제조
선택한 하이브리도마를 in Vitro 배양법 또는 in Vivo 배양법에 의해 증식시켜 모노클론 항체를 얻는다. in Vitro배양법으로서는, 하이브리도마를 완전 RPMI 배지로 증식 한계로 될 때까지 배양하고, 그 배양상청을 회수하므로서 모노클론 항체를 얻을 수 있다. in Vivo 배양법으로서는, 미리 프리스텐을 복강내 투여처리한 BALB/c 마우스에, 5×106107개의 하이브리도마를 복강내에 이식하고, 약 3주후에 마우스의 복부비대를 확인하여, 그 복수를 채취하고, 복수에서 IgG획분을 분리정제하므로서 모노클론 항체를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기한 방법에 따라, 인체 IgE에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체 HE-39E, HE-22A, HE-69B 및 HE-35A가 얻어졌다. 이들의 항체를 생산하는 하이브리도마 HE-39E 시오노기, HE-22A 시오노기, HE-69B 시오노기 및 HE-35A 시오노기는, 각각, 미공연균기 제11381호(FERM P-11381), 미공연균기 제 11382호(FERM P-11382), 미공연균기 제11383호(FERM P-11383) 및 미공연균 제11384호(FERM P-11384)로서, 이바라기껜쯔 꾸바시 히가시1-1-3의 미생물 공업기술 연구소에, 90년 2월 27일부로 기탁되어 있으며, 또한 부다페스트 조약에 따라 1991, 4. 4일자로 FERM BP-3342, FERM BP-3343, FERM BP-3344 및 FERM BP-3345으로 기탁되어 있다.
본 발명의 모노클론 항체는, 인체 IgA, 인체 IgG 및 인체 IgM와는 반응하지 않으며, 인체 IgE·λ 및 인체 IgE·κ와 강하게 반응한다. 즉, 인체 IgE에 특이적이다.
모노클론 항체 HE-22A는, 당단백질 당쇄를 절단하는 엔도클리코시다아 제F로 처리한 인체 IgE와 반응하지 않으며, 따라서, 인체 IgE의 당쇄와 밀접하게 관련한 구조를 인식하는 것으로 추정된다.
모노클론 항체 HE-35A는, 열변성 인체 IgE에 대한 반응성이 현저하게 낮고, 열처리에 의해 인체 IgE의 Dε2의 도메인의 구조변화가 일어난다는 것이 알려져 있으므로, 인체 IgE의 Dε2 도메인을 인식하는 것으로 추정된다.
모노클론 항체 HE-39E 및 HE-69B는, 시판중인 모노클론 항 Dε1 항체(세로테크사)에 의해, 인체 IgE에의 결합이 저해되므로, 인체 IgE의 Dε1 도메인을 인식하는 것으로 추정된다. 그러나, 모노클론 항체 HE-39E 및 HE-69B는, 서로가 인체 IgE에의 결합을 저해하는 일이 없으므로 Dε1 도메인의 다른 부분을 인식하고 있다.
따라서, 본 발명의 모노클론 항체는, 각각 인체 IgE의 다른 영역에 결합하며, 다른 모노클론 항체의 인체 IgE에 대한 결합에 아무 영향없이 인체 IgE에 결합한다.
본 발명의 모노클론 항체는 모두, 미변성의 인체 IgE에 강하게 결합하지만, 염산 구아니딘 및 2-메르캅토 에탄올에 의한 변성 인체 IgE에는 결합하지 않는다.
본 발명의 모노클론 항체는 모두, 마우스의 면역 글로블린 G에 속한다.
본 발명의 모노클론 항체는, 각각 사람 IgE에 대해서 다른 친화성으로 결합하므로, 그 2종 이상을 혼합하므로서, 사람 IgE에 대한 반응성의 강도를 조절할 수 있다. 예컨대, 고정화 모노클론 항체 HE-69B를 사용하는 샌드위치 면역 측정법에 있어서, 표시항체로서, 표시물의 항체당의 비활성이 동일한 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A 및 HE-39E를 단백질 농도비 2 7 : 1 : 5 20으로 혼합한 것을 사용하면, IgE의 측정범위가 넓고, 검량선의 조절이 가능해진다. 이처럼, 본 발명의 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A 및 HE-39E로서된 군에서 선택되는 다른 2종 이상의 모노클론 항체를 혼합함으로써 인체 IgE에 대해서 원하는 반응성을 갖는 모노클론 항체 혼합물을 얻을 수 있다.
또,125I 등의 방사성 동위체, 서양겨자 페르옥시다아제 등의 효소, 그 밖에 비오틴, 아비딘 등의 공지의 표시 화합물에 의해 표시된 본 발명의 모노클론 항체 및 모노클론 항체 혼합물도 본 발명에 포함된다.
본 발명은, 또한 상기한 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명은, 상기 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-35E 및 HE-69B로서된 군에서 선택되는 모노클론 항체를 고정화하고, 얻어진 고정화 항체를 인체 IgE 함유 시료와 접촉시켜 그 고정화 항체와 인체 IgE를 결합시킨 후, 그 고정화 항체에 결합된 인체 IgE에, 그 군에서 선택되며, 그 고정화 항체와는 다른, 표시 모노클론 항체를 결합시킴을 특징으로 하는 인체 IgE 면역 측정법을 제공한다. 본 발명의 모노클론 항체는, 각각의 인식부위가 다르며, 또한 서로가 다른 항체의 IgE에의 결합을 저해하지 않으므로, 이와 같은 샌드위치 면역 측정법이 가능해진다. 하기 실시예에 나타낸 바와같이, 항체중 어떤 것이든 고정화에 사용될 수 있으며, 나머지 세 개 가운데 어떤 것이든 표시 항체로서 사용이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기한 모노클론 항체 HE-69B를 고정화하고, 얻어진 고정화 항체를 인체 IgE 함유 시료와 접촉시켜 그 고정화 항체와 인체 IgE를 결합시킨 후, 그 고정화 항체에 결합된 인체 IgE에, 상기 표시 모노클론 항체 혼합물을 결합시킴을 특징으로 하는 인체 IgE의 면역측정법을 제공한다. 이 방법에 의하면, 넓은 농도 범위의 IgE를 직선 검량선으로부터 측정할 수 있으므로, 보다 바람직하다.
본 발명은 또, 고정화 항원에 인체 IgE 함유 시료를 접촉시켜, 그 시료중의 그 항원에 특이적인 인체 IgE 항체를 그 고정화 항원에 결합시킨후 그 고정화 항원에 결합된 항원 특이성 인체 IgE 항체에, 상기 표시 모노클론 항체를 결합시킴을 특징으로 하는 항원 특이성 인체 IgE 항체의 면역 측정법을 제공한다. 예컨대, 고정화 항원으로서 진드시 항원을 사용하면, 인체 혈액 등과 같은 시료중의, 진드기 항원 특이 IgE 항체 만을 측정할 수 있다.
측정된 시료중의 IgE 농도는, 여러 가지의 농도의 IgE를 사용하여 작성된 검량선에서 구할 수 있다.
[실시예 1]
(1) 면역
8주의 암컷 BALB/c 마우스 3마리에, 각각 200㎍의 인체 IgE를 프로인트 완전 보조액과 함께 복강내 투여하고, 3주후에, 다시 20㎍의 인체 IgE를 명반 침강 현탁액으로서 복강내에 3일 연속 투여하였다.
(2) 세포융합
최종면역 다음날, 3마리의 비장을 적출하고, RPMI 배지를 사용하여 이것의 세포 부유액을 조제하였다. 이 3×108개의 비장세포와 9×107개의 골수종 세포 NS-1을 혼합하고, 원심분리후, 침전물에 50% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 4000) 1㎖를 서서히 교반해가면서 가하고, 다시 1분간 교반하였다. RPMI 배지 1㎖을 1분간 가하고, 마찬가지로 1㎖를 추가한후, 다시 7㎖를 3분간을 소요해서 가하였다. 원심분리후, 침전물을 15% 소태아혈청 함유 RPMI 배지 (완전 RPMI 배지) 60㎖에 부유시키고, 96웰 마이크로 플레이트 6개의 각 웨에 0.1㎖씩 접종하고, 7% CO2의 존재하에서 37℃로 배양하였다. 24시간 후, 히폭산틴 100μM, 아미노프테린 0.4μM, 티미딘 16μM을 함유한 완전 RPMI 배지(HAT 배지), 0.1㎖ 가한다.
배양개시후, 2, 3, 5 및 8일째에, 배양상청 0.1㎖을 버리고, HAT 배지 0.1㎖을 가하였다. 11 및 14일째에, 배양상청 0.1㎖을 버리고 히폭산틴 100μM, 티미딘 16μM을 함유한 완전 RPMI 배지 (HT 배지) 0.1㎖을 가하였다. 총 506웰중 460웰에서 하이브리도마 콜로니가 출현하였다.
(3) 하이브리도마의 선택
배양 웰중의 하이브리도마를 완전 RPMI 배지로 배양하고, 그 배양 상청 중의 특이항체 생산의 여부를 다음과 같이 조사하였다.
폴리스티렌제 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에, 인체 IgE(면역에 사용한 것; IgE·λ)를 0.01M 인산 완충 식염액 (pH 7.4)에 녹인 용액(10㎍/㎖) 50㎕을 넣고, 37℃로 1시간 방치한 후, 10% 소태아혈청 함유 0.01M 인산 완충식염액 (pH 7.4) 10㎕을 가하여, 37℃로 20분간 불록킹화하였다. 0.05% 트윈 20 함유 0.01M 인산 완충식염액 (pH 7.4)로 세척하여, 인체 IgE 고정화 웰을 제작하였다. 인체 IgE 고정화 웰에배양상청50㎕을 가하여, 37℃로 1시간 인큐베이트 하였다. 상기와 마찬가지로 세척한 후, 제2항체로서, 서양겨자 페르옥시다아제 표시 토끼 항마우스 IgE(H+L) 항체 50㎕을 가하여, 37℃로 1시간 인큐베이트 하였다. 마찬가지로 세척한 후, 1.1% 과산화수소수와 150㎍/㎖의 아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS) 함유 50mM 시트르산 완충액(pH 4.5) 50㎕을 가하여, 25℃에서 5분간 발색시켰다. 정지액으로서 2mM 아지화 나트륨을 50㎕가하고, 450㎚의 흡광도를 마이크로 플레이트용의 분광 광도계에 의해 측정한 후, 0.5 이상의 흡광도가 있는 하이브리도마 총 145웰을 선택하였다..
면역원으로서의 인체 IgE에 대한 항체 생산 하이브리도마에 대해서, 유래가 다른 인체 IgE(IgE·κ) 및 인체 IgG에 대한 반응성을, 상기와 마찬가지로 ELISA 법으로 조사하였다. 그 결과, 2종의 인체 IgE에 강하게 반응하고, 인체 IgG에는 반응하지 않는 하이브리도마 40웰을 선택하였다. 선택된 하이브리도마를 한계 희석법에 의해 콜로닝하고, 출현한 하이브리도마 클론의 배양상청에 대하여, 인체 IgE·λ, 인체 IgE·κ, 인체 IgA, 인체 IgG, 인체 IgM 및 인체면역 글로블린 λ사슬 및 κ사슬에 대한 항체의 반응 특이성을 ELISA법으로 검정하였다.
이하 같이해서, 인체 IgE에 특이적으로 반응하는 모노클론 항체를 생산하는 하이브리도마 40클론을 얻었다.
이들중에서, 전기한 특성을 가지며, 하기 실시예에서 명백한 바와 같이, 본 발명의 인체 IgE의 면역측정법에 알맞는 모노클론 항체를 선별하였다. 즉, 하이브리도마 HE-39E 시오노기(미공연균기 제11381호 FERM P-11381), HE-22A 시오노기 (미공연균기 제11382호 FERM P-11382), HE-69B 시오노기(미공연균기 제11383호 FERM P-11383) 및 HE-35A 시오노기(미공연균기 제11384호 FERM P-11384)를 수득하였다.
(4) 모노클론 항체의 제조
(a) in Vitro 배양법
하이브리도마를 완전 RPMI 배지로 증식한계(1×106세포/㎖)로 될 때까지 배양하고, 그 배양상청을 회수하였다.
(b) in Vivo 배양법
미리 프리스텐 0.5㎖로 복강내 투여처리한 BALB/c 마우스에 5×106개의 하이브리도마를 복강내에 이식하였다. 약 3주후, 마우스의 복수비대를 확인하고, 그 복수를 채취하였다.
(5)모노클론 항체의 정제
앞 공정에서 얻어진 복수를 18% 황산나트륨 용액으로 침전시키고, 생긴 침전을 0.01M 붕산완충 식염액(pH 8.0)에 용해후, 그 액으로 투석하였다. 염석에 의해 얻어진 모노클론 항체 20㎎을 0.01M 붕산 완충 식염액(pH 8.0) 2㎖에 녹이고, 프로테인 A-세파로오스[파르마시아사 Pharmacia AB]의 칼럼(1.6×5㎝)에 흡착시켰다. 먼저, 0.01M 붕산 완충식염액(pH 8.0) 약 50㎖로 불순물을 유출하고,이어서 0.01N 시트르산 완충 식염액(pH 4.0) 약 100㎖로 용출하여, 정제 모노클론 항체를 얻었다.
[실험예 1]
[인체 면역 글로블린과의 반응성]
폴리스티렌제 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에, 인에 IgE 2종[IgE·λ(면역원), IgE·κ(세로텍사)], 인체 IgA(카페르사), 인체 IgM(마일스사), 인체 IgG(마일스사) 및 인체 면역 글로블린 L 사슬 λ타입, L사슬 κ타입을 각각 0.01M 인산 완충식염액 (pH 7.4)에 녹인 용액(10㎍/㎖) 50㎕를 넣고, 37℃로 1시간 방치한 후, 10% 소태아혈청 함유 0.01M 인산 완충 식염액 (pH 7.4) 100㎕을 가하고, 37℃로 20분간 블록킹화하였다. 0.05% 트윈 20 함유 0.01M 인산 완충 식염액 (pH 7.4)로 세척하여, 각종 인체 면역 글로블린 고정화 웰을 제조하였다. 다음에, 10% 소태아혈청 함유 0.01M 인산 완충 식염액 (pH 7.4)에 녹인 정제 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A ,HE-39E 및 HE-69B(10㎍/㎖) 50㎕을 가하고, 37℃로 1시간 반응시켰다. 상기와 마찬가지로 세척한 후, 실시예 1 (3)과 마찬가지의 방법으로 발색시켜서 흡광도를 측정하였다.
표 1에 나타낸 것처럼 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B의 모노클론 항체는, 2종의 인체 IgE에는 각각 반응하지만, 다른 인체 멱역 글로블린에는 반응하지 않았다.
[실험예 2]
[모노클론 항체의 요오드(125I) 표시]
1, 3, 4, 6-테트라클로로-3α, 6α-디페닐글리콜우릴(IODO-GEN, 피어스 케미컬사)의 디클로로메탄 용액(40㎍/㎖) 50㎕을 유리 시험간에 넣고, 방치 건조하였다. 이 시험관에 0.1M 인산 완충 식염액 (pH 7.4)에 녹인 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B(2㎎/㎖) 25㎕를 가하고, 이어서 방사성 옥화 나트륨(Na125I) 0.5mci/5㎕을 가하여, 실온으로 15분간 조용히 진탕하였다. 얻어진 반응액을 세파덱스 G-25(파르마시아사)의 칼럼(1.6×18㎝)에 통과시키고 인산 완충 식염수로 용출하였다. 초기 용출 분획을 나누어 채취하여,125I 표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B를 각각 얻었다.
[실험예 3]
[모노클론 항체의 서양겨자 페르옥시다아제 (HRP) 표시]
5㎎의 HRP를 2㎖의 0.01M 초산완충액에 녹이고, 그 완충액 0.2㎖에 녹인 메타과옥소산나트륨 2㎎을 가한후, 25℃로 20분간 반응시켰다. 얻어진 반응액을, 세파덱스 G-25의 칼럼 (1.6×18㎝)에 통과시키고, 0.001M 초산완충액 (pH 4.5)으로 용출하였다. 초기 용출 분획을 나누어 채취하고, 413㎚의 흡광도에서, 1.4㎎의 활성화 HRP를 얻었다. 이것에, 1.2㎖의 0.1M 탄산 완충 식염수에 녹인 2㎎의 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B를 가하여, 25℃로 2시간 반응시켰다. 다음에 0.2㎎의 수소화 붕소나트륨 수용액 0.1㎖를 가하여, 4℃로 2시간 반응시켰다. 얻어진 반응액을, 세파덱스 G-25의 칼럼(1.6×1.8㎝)에 통과시키고, 0.01M 인산 완충 식염수 (pH 7.4)로 용출하였다. 초기 용출분획 4㎖을 나누어 채취하여 세파크릴 S-200(파르마시아사)의 칼럼(1.6×70㎝)에 통과시키고, 0.01M 인산 완충 식염수 (pH 7.4)로 용출하였다. 초기 용출 분획을 나누어 채취하여, HRP 표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B를 각각 얻었다.
[실험예 4]
[열처리 IgE에 대한 반응성]
인체 IgE(10㎍/㎖)의 10% 소태아혈청 함유 0.01M 인산 완충 식염수 (pH 7.4) 1.5㎖을, 56℃로 2시간 열처리하였다.
실험예 1과 마찬가지의 방법으로, 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B의 고정화 플레이트를 제조하였다. 이어서, 상기 열처리 인체 IgE의 500, 167, 56, 19 및 2.1ng/㎖ 용액 50㎕을 가하고, 37℃로 1시간 반응시켰다. 또, 대조 실험으로서, 미처리 인체 IgE를 동일한 농도로 사용하였다. 세척한 후, HRP 표시 모노클론 항체 ID-15F(본항원 인체 IgE의 이디오 타입 부분에 반응하는 특성을 갖는다) (10㎍/㎖)용액 50㎕을 가하여, 37℃로 1시간 반응시켰다. 세척한 후, 실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
제1도에 나타낸 것처럼, 모노클론 항체 HE-22A 및 HE-69B는 열처리 인체 IgE에 대해서 잘 반응했으나, HE-35A는 열처리 인체 IgE에 대한 반응이 현저하게 저하하였다. 이와 같은 열처리에 의해, IgE의 Dε2영역의 구조 변화가 일어난다는 것이 알려져 있으며, HE-35A는, Dε2영역의 열감수성 구조를 인식한다고 생각된다.
[실험예 5]
[엔도글리코시다아제 F처리 IgE에 대한 반응성]
엔도글리코시아다제 F는, 당단백질의 당쇄 부분에 작용하여, 이를 절단하는 효소이다.
인체 IgE(5㎎/㎖)의 생리식염용액 0.1㎜에, 엔도글리코시다아제 F(8.3U/㎖)의 에틸렌디아민 4초산나트륨(50mmol/ℓ), 0.05% 아지드화나트륨, 0.5% 도데실 황산 나트륨 및 0.05% 트윈 20을 함유한 0.1M 인산 완충 용액(pH 6.1) 0.12㎖을 가하고, 37℃로 20시간 반응시켜서 엔도글리코시다아제 F처리 인체 IgE를 얻었다.
실시예 1 (3)과 마찬가지의 방법으로 엔도글리코시다아제 처리 인체 IgE 고정화 플레이트를 제조하였다. 또, 대조 실험으로서 미처리 인체 IgE고정화 플레이트를 제조하였다. 다음에, HRP 표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B의 10% 소태아혈청을 함유한 0.01M 인산 완충용액(pH 7.4) 50㎕을 가하여 37℃로 1시간 반응시켰다. 세척한 후, 실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
표 2에 나타낸 것처럼, 모노클론 항체 HE-35A, HE-39E 및 HE-69B는 엔도클리코시다아제 F처리 인체 IgE에 각각 반응하지만, HE-22A는 엔도글리코시다아제 F처리 인체 IgE에 반응하지 않았다. 따라서, HE-22A는 IgE의 당쇄와 밀접하게 관련하는 구조를 인식한다고 생각된다.
[실험예 6]
[저해 테스트에 의한 모노클론 항체의 반응 특성]
실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로, 인체 IgE 고정화 플레이트를 제조하였다. 다음에 HRP 표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 또는 HE-69B 용액(10㎍/㎖) 50㎕과, 각각 미표시의 모노클론 항체HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B 및 항 Dε1항체, 항 Cε4항체(2000, 500, 125, 31.2, 7.8 및 0㎍/㎖) 용액 50㎕씩을 각 웰에 가하여, 37℃로 1시간 반응시켰다. 세척한 후, 실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
표 3에 나타낸 것처럼, HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B는, 각각 같은종의 항체에 의한 사람 IgE에 대한 반응 저해 효과를 보였으나, 다른 항체 사이에서의 반응 저해는 보이지 않았다. 또, HE-39E 및 HE-69B는, 모노클론 항 Dε1 항체에 의한 반응저해를 보였다. 모노클론 항 Cε4항체에 의해 저해되는 항체는 보이지 않았다.
[실험예 7]
[변성 IgE에 대한 반응성]
인체 IgE (5㎎/㎖)의 생리식염 용액 0.2㎖에 염산 구아니딘(6M/ℓ) 및 4%의 2-메르캅토 에탄올을 함유한 수용액 0.2㎖를 가하여, 60℃로 2시간 작용시켜서, 변성 인체 IgE를 얻었다.
실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B 고정화 플레이트를 제조하였다. 세척후, 상기의 변성 인체 IgE (1㎍/㎖)의 10% 소태아혈청을 함유한 0.01M 인산 완충 식염 용액 50㎕을 가하여, 37℃로 1시간 반응시켰다. 또, 이때 대조실험으로서 미변성 인체 IgE(1㎍/㎖)용액 50㎕을 가하여, 마찬가지로 37℃로 1시간 반응시켰다. 세척후, HRP 표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B (10㎍/㎖)의 10% 소태아혈청을 함유한 0.01M 인산 완충 식염용액 50㎕를 가하여, 37℃로 1시간 반응시켰다. 세척후, 실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
표 4에 나타낸 것처럼, 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B는, 미변성 IgE와 반응하지만, 변성 IgE와는 하진 않았다.
[실험예 8]
[IgE 샌드위치 법]
실시예 1(3)과 마찬가지의 방법으로, 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B 고정화 플레이트를 제조하였다. 세척후, 인체 IgE 10000, 2000, 400, 80, 16 및 0(IU/㎖)의 10% 소태아혈청을 함유한 0.01M 인산 완충용액(pH 7.4) 50㎕을 가하고, 37℃로 1시간 반응시켰다. 세척후 실험예 5와 마찬가지의 방법으로 HRP 표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B와 반응시킨후, 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
제2도에 나타낸 것처럼, 고정화 모노클론 항체와 HRP표시 모노클론 항체의 조합 가운데서 다른 항체의 조합예에서는 인체 IgE에 대해서 반응성이 높은 측정계가 되지만, 같은 종의 항체의 조합예에서는 반응성이 낮은 측정계로 되었다.
[실험예 9]
[인체 IgE항체에 대한 친화정수]
진드기(데르마토파고이데스 프테로니시나스 : DP) 특이 IgE 양성 인체 혈청을 혼합하여 50㎖의 푸울 혈청을 수득하였다. 이 풀 혈청 200㎕을 시험관(시오노기 튜우브)에 넣고, DP 항원 결합 비이드(진드기 특이 IgG 테스트 : 시오노기 제약) 1개를 가하고, 25℃로 3시간 진탕하면서 반응시켰다. 다음에, 0.05% 트윈 20함유 0.01M 인산 완충액 (pH 7.4)으로 세척한 후,125I-표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B(10.5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313 및 0.156μCi/㎖)의 10% 소태아혈청 함유 0.01M 인산 완충액 (pH 7.4) 200㎕을 가하여 25℃로 16시간 진탕하면서 반응시켰다. 세척후, 각 시험관의 각 방사능량을 γ카운터로서 측정하였다.
표 5에 나타낸 것처럼, DP 특이 항체의 친화성은, HE-35A HE-69B HE-22A HE-39E 의 순으로 높고, 마찬가지로 모노클론 항체의 결합 가능부위 (에피 토우프 밀도)도, HE-35A HE-69B HE-22A HE-39E의 순으로 높았다.
[실험예 10]
[인체 IgE 측정법]
폴리스티렌 비이드 (이뮤노케미컬사) 100개에, 모노클론 항체 HE-69B(40㎍/㎖)의 0.01M 인산 완충 식염 용액 (pH 7.4) 200㎖를 가하고, 37℃로 20시간 방치하였다. 모노클론 항체 용액을 제거한 후, 0.01M 인산 완충 식염액 (pH 7.4)으로 비이드를 세척하고, 다음에 0.1%의 소혈청 알부민 함유 0.01M 인산 완충 식염액 (pH 7.4) 200㎖를 가하고, 37℃로 3시간 방치하였다. 0.05% 트윈 20 함유 0.01M 인산 완충액 (pH 7.4)로 세척하고, 모노클론 항체 HE-69B 결합 비이드를 수득하였다.
인체 IgE를, 10% 소태아혈청 함유 0.01M 인산 완충 식염액으로, 5000, 1000, 200, 40, 8, 1.6 및 0 IU/㎖의 용액이 되도록 조제하고, 시험관에 각각 50㎕씩 넣는다. 다음에, 각 시험관에125I-표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, 또는 HE-39E (3.7μ Ci/㎖) 100㎕를 가하여 혼화하였다. 또, 미리 혼합한 HE-22A, HE-35A, 및 HE-39E(3.7μ Ci/㎖) 100㎕을 가하여 혼화하였다. 모노클론 항체 HE-69B 결합 비이드를 각 시험관에 1개씩 가하고, 25℃로 3시간 반응시켰다. 세척 후, 각 시험관의 방사능 양을 γ-카운터로서 측정하였다.
제3도에 나타낸 것처럼, HE-35A에서는 인체 IgE 0.32 200 IU/㎖(625배), HE-22A에서는 1.6 1000 IU/㎖(625배), HE-39E에서는, 40 5000 IU/㎖(125배)의 농도 영역에서, 각각 사람 IgE농도에 대해서 감도 곡선이 얻어졌다. 한편, 동일한 비방사능량을 갖는125I-표시 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A 및 HE-39E를, 미리 적당한 단백질 농도비(3 : 1 : 6)로 혼합한 경우, 인체 IgE 0.32 5000 IU/㎖ (15625배)에 걸친 넓은 농도 영역에서 감도곡선이 얻어졌다.

Claims (16)

  1. 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B로 구성된 군에서 선택되며, 인체 IgE에 대해 특이적 결합을 하는 모노클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인체 IgE의 당쇄와 밀접한 구조를 인식하는 모노클론 항체 HE-22A.
  3. 제1항에 있어서, 인체 IgE의 Dε2 도메인을 인식하는 모노클론 항체 HE-35A.
  4. 제1항에 있어서, 모노클론 항체 HE-39E 및 HE-69B로 구성된 군에서 선택되며, 인체 IgE의 Dε1 도메인을 인식하고, 또한 상기 모노클론 항체중의 하나가 나머지 모노클론 항체가 IgE에 결합하는 부분과는 다른 부위에 결합하는 모노클론 항체.
  5. 제1항에 있어서, 미변성 인체 IgE에는 강하게 결합하지만, 변성 인체 IgE에는 결합하지 않는 모노클론 항체.
  6. 제1항에 있어서, 제1항에 따른 상기 군의 모노클론 항체 각각이, 이를 제외한 나머지 모노클론 항체의 인체 IgE에 대한 결합에 의해 영향을 받지 않고, 다른 모노클론 항체가 결합한 영역과는 다른 인체 IgE의 영역에 결합하는 모노클론 항체.
  7. 제1항에 있어서, 인체 IgE와 서로 다른 친화 정도로 결합하는 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A 및 HE-39E로 구성된 군에서 선택되며, 이 항체 혼합물과 인체 IgE와의 반응성이 이 항체를 적절히 혼합함으로써 조절 가능한 모노클론 항체.
  8. 제1항에 있어서, 마우스 IgG로 분류되는 모노클론 항체.
  9. 모노클론 항체 HE-39E를 생산하는 하이브리도마 세포주 HE-39E 시오노 기(수탁번호 FERM BP-3342).
  10. 제1항 내지 8항 중 어느 한항에 따른 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A 및 HE-39E 로 구성된 군에서 선택된 적어도 두 개의 다른 항체를 혼합하여 수득된 인체 IgE와의 원하는 반응성을 얻기 위한 모노클론 항체 혼합물.
  11. 제1항 내지 8항 중의 어느 한 항에 따른 모노클론 항체 HE-22A, HE-35A, HE-39E 및 HE-69B로 구성된 군에서 선택한 모노클론 항체를 고정화하고; 이 고정화 항체와 인체 IgE 함유 시료를 접촉시켜 이 고정화 항체를 인체 IgE에 결합시킨 후, 이 고정화 항체에 결합된 인체 IgE를, 상기 군에서 선택되며, 고정화 항체와는 다른 표시 항체에 결합시킴을 특징으로 하는 인체 IgE의 면역 측정법.
  12. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 모노클론 항체 HE-69B를 고정화하고; 이 고정화 항체와 인체 IgE 함유 시료를 접촉시켜 이 고정화 항체를 인체 IgE에 결합시킨 후; 제10항에 따른 표시 모노클론 항체 혼합물을, 이 고정화 항체에 결합된 인체 IgE에 결합시킴을 특징으로 하는 인체 IgE의 면역 측정법.
  13. 고정화 항원을 인체 IgE 함유 시료와 접촉시키고; 시료에 포함된 항원-특이 인체 IgE 항체를 고정화 항원에 결합시킨후; 제1항 내지 8중의 어느 한 항에 따르는 표시 모노클론 항체를, 이 고정화 항원에 결합된 인체 IgE 항체에 결합시킴을 특징으로 하는 항원-특이 인체 IgE 항체의 면역 측정법.
  14. 모노클론 항체 HE-22A 를 생산하는 하이브리도마 세포주 HE-22A 시오노기(수탁번호 FERM BP-3343).
  15. 모노클론 항체 HE-69B 를 생산하는 하이브리도마 세포주 HE-69B 시오노기(수탁번호 FERM BP-3344).
  16. 모노클론 항체 HE-35A 를 생산하는 하이브리도마 세포주 HE-35A 시오노기(수탁번호 FERM BP-3345).
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