DE10327399A1

DE10327399A1 - Verfahren und Messanordnung zur markierungsfreien Detektion von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und oberflächengebundenen Antikörpern

Info

Publication number: DE10327399A1
Application number: DE2003127399
Authority: DE
Inventors: Tobias Dr. rer. nat. Neumann
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2005-01-05

Abstract

Bei einem Verfahren und einer Messanordnung zur markierungsfreien Detektion von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und oberflächengebundenen Antikörpern besteht die Aufgabe der Verringerung des Aufwandes und der Erhöhung der Sicherheit bei der Unterscheidung zwischen spezifischen und unspezifischen Antikörper-Protein-Bindungsereignissen.
Es werden Antikörper mit unterschiedlichen, bekannten Bindungsaffinitäten zu einem nachzuweisenden Protein in gleichen Konzentrationen verwendet, wobei das Vorliegen einer spezifischen Bindung mit dem Nachweis sich im Verhältnis der bekannten Bindungsaffinitäten zueinander verhaltender Konzentrationen von gebundenen Proteinen erfolgt.

Description

Die Erfindung ermöglicht die Validierung der Messergebnisse, die mit hochparallelen optischen Detektionsverfahren beim Nachweis von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und oberflächengebundenen Antikörpern gewonnen werden.
Für hochparallele Detektionsverfahren zur markierungsfreien Detektion von Proteinbindungsereignissen gibt es einen hohen Bedarf, da sich die Vielzahl der auf ca. 1 Million geschätzten unterschiedlichen Proteine in einer Zelle aufgrund ihrer chemischen und biologischen Diversität nicht einheitlich markieren lassen.
Unter der Voraussetzung, dass einer der Bindungspartner z. B. auf der Oberfläche eines vorzugsweise mikrostrukturierten Probenträgers (Mikroarray, Chip oder Nanotiterplatten) immobilisiert vorliegt, können biomolekulare Wechselwirkungen, insbesondere spezifische Bindungen, mit optischen Methoden, wie vor allem der reflektometrischen Interferenzspektroskopie (Rifs), der Plasmonenresonanzspektroskopie (SPR), der Ellipsometrie sowie mit Hilfe von Gitter- oder Prismenkopplern markierungsfrei und zeitaufgelöst durch die Detektion von Phasengrenzenveränderungen nachgewiesen werden.
Ein allgemein bestehendes Problem bei der alleinigen Anwendung dieser markierungsfreien optischen Verfahren ist die Unterscheidung zwischen einer spezifischen und unspezifischen Anlagerung. Es ist der Nachweis zu führen, ob sich an einen Antikörper auch tatsächlich das interessierende Protein durch eine spezifische Bindung anlagert und nicht etwa ein anderes Protein mit einer geringeren Bindungsaffinität.
Beispielhaft besitze ein Antikörper 1 z. B. eine Bindungskonstante von 10⁶ zu einem Protein A und eine Bindungskonstante von 10³ zu einem Protein B. Liegen beide Proteine A und B in einer Probe in gleichen Konzentrationen vor, wird sich das Protein A 1000fach stärker an den Antikörper 1 anlagern als das Protein B. Zwischen Antikörper 1 und dem Protein A bildet sich eine nachweisbare spezifische Bindung aus, während die Bindung zu dem Protein B unspezifisch ist. Der Nachweis gelingt jedoch nicht mehr, wenn in realen Probengemischen die Proteinkonzentrationen unterschiedliche Werte aufweisen. Liegt das Protein B z. B. in einer 1000 mal höheren Konzentration als das Protein A vor, werden für beide Proteine gleiche Messergebnisse ermittelt. Bei noch höheren Konzentrationen des Proteins B wird schließlich die unspezifische Bindung überwiegen.
Zur Validierung wird deshalb bei einer nachgewiesenen Antikörper-Protein-Anlagerung bekanntermaßen zusätzlich die Molmasse des gebundenen Proteins durch eine Massenspektrometrie bestimmt, die jedoch den Vorteil des zuvor angewendeten hochparallelen Detektionsverfahrens wieder zunichte macht, da jeder Messpunkt (Spot) auf dem Probenträger einzeln massenspektrometrisch untersucht werden muss. Das gesamte Nachweisverfahren wird technisch und finanziell aufwendig und die Einsatzmöglichkeit der Methode eingeschränkt.
Zur Unterscheidung zwischen einer spezifischen und einer unspezifischen Anlagerung können auch Antikörper-Verdünnungsreihen ausgemessen werden, indem eine Vielzahl von Antikörpern mit unterschiedlichen, jedoch definierten Konzentrationen auf verschiedene Spots des Probenträgers aufgebracht werden. Liegt eine spezifische Bindung vor, sollte sich die Konzentration des angebundenen Proteins äquivalent zur Konzentration des Antikörpers im jeweiligen Spot verhalten.
Die Methode hat jedoch den Nachteil, dass Verfälschungen des Messergebnisses durch Proteine hervorgerufen werden können, gegen die der Antikörper nicht optimiert wurde.

Aufgabe der Erfindung ist deshalb die Verringerung des Aufwandes und die Erhöhung der Sicherheit bei der Unterscheidung zwischen spezifischen und unspezifischen Antikörper-Protein-Bindungsereignissen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren gemäß dem Anspruch 1 sowie einer Messanordnung gemäß dem Anspruch 12 gelöst.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

Die Erfindung basiert darauf, dass zum Nachweis eines Proteins nicht nur ein Antikörper mit höchster Bindungsaffinität zum Einsatz kommt, sondern dass zusätzlich weitere, strukturähnliche Antikörper aus einer gemeinsamen Herstellungsreihe verwendet werden, von denen jeder Antikörper eine andere, bekannte Bindungsaffinität zu dem nachzuweisenden Protein aufweist.

Werden die Antikörper oberflächengebunden in gleichen Konzentrationen auf verschiedenen Messpunkten (Spots) eines mikrostrukturierten Probenträgers, wie z. B eines Proteinchips für die Messung bereitgestellt, so sollten sich die nachgewiesenen Konzentrationen für das angelagerte Protein bei einer spezifischen Bindung im Verhältnis der bekannten Bindungsaffinitäten zueinander verhalten. Bei unspezifischen Bindungen dagegen bleibt dieses Verhältnis nicht gewahrt.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann zusätzlich eine Abschätzung der Molekülmasse der bindenden Proteine durch eine Größenausschluss-Chromatographie erfolgen, wobei diese auch auf interne Größenstandards in der Probe angewendet werden kann. Der Probenträger sollte hierfür als Mikrofluidikchip ausgebildet sein, auf dem die Messpunkte in Messpunkte zum Nachweis der Bindungsereignisse und in Messpunkte zum Nachweis der Größenstandards getrennt sind.

Die Erfindung sieht ferner vor, dass die Messpunkte parallel mit optischen Detektionsverfahren ausgemessen werden. Zur markierungsfreien Detektion der Antikörper-Protein-Bindungsereignisse sind vor allem die reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfs), die Plasmonenresonanzspektroskopie (SPR), die Ellipsometrie sowie Gitter- oder Prismenkoppler geeignet.

Die Erfindung soll nachstehend anhand der schematischen Zeichnung näher erläutert werden. Es zeigen:
1 einen Proteinchip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
2 einen mikrofluidischen Proteinchip mit vorgeschalteter Chromatographiesäule
3 die Detektion eines Proteins über die Kombination zweier Antikörper für unterschiedliche Bindungsdomänen des Proteins
Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Antikörper mit der höchsten Bindungsaffinität gemeinsam mit den strukturähnlichen Antikörpern geringerer Bindungsaffinität auf die Trägeroberfläche 1 eines mikrostrukturierten Probenträgers 2, jedoch auf unterschiedlichen Messpunkten 3 (Spots) aufgebracht. Wesentlich dabei ist, dass die bindungsschwächeren Antikörper in gleicher Konzentration wie der Antikörper mit der höchsten Bindungsaffinität auf der Trägeroberfläche 1 vorliegen.
Nach der Inkubation der Probe und nach dem Abwaschen nicht gebundener Moleküle, können die Messpunkte 3 mit Hilfe hochparalleler optischer Detektionsverfahren ausgewertet werden. Hierzu eignen sich vor allem die reflektometrische Interferenzspektroskopie (Rifs), die Plasmonenresonanzspektroskopie (SPR), die Ellipsometrie sowie Gitter- oder Prismenkoppler.
Die Herstellung der Antikörper zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Bekanntermaßen wird bei der Gewinnung von monoklonalen Antikörpern von relativ unspezifischen Antikörpern ausgegangen. Die Antikörper werden in mehreren Schritten entwickelt, wobei die Bindungsaffinität zu dem interessierenden Protein durch Selektion stufenweise erhöht wird. Somit sind im Allgemeinen hochspezifische Antikörper sowie strukturell ähnliche, jedoch weniger bindungsstarke Antikörper vorhanden, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren ausführbar ist.
Alternativ können bei alleinigem Vorliegen eines Antikörpers durch gezielte Mutationen oder geeignete chemische oder biochemische Derivatisierung strukturell verwandte Antikörper mit geringerer (aber definierter) Bindungsstärke als der Antikörper 1 hergestellt werden.
Im Ergebnis der Auswertung wird sich bei einer spezifischen Bindung zwischen zwei Bindungspartnern die gleiche Bindungsstärke, wie aus den bekannten Bindungsaffinitäten der Antikörper zu erwarten war, wiederfinden, so dass die Konzentration gebundener Proteine mit diesen Bindungsaffinitäten korreliert. Bei erheblichen Abweichungen von den bekannten Verhältnissen, ist von einer unspezifischen Bindungsreaktion auszugehen und dieser Messpunkt zu verwerfen.
Für den Fall, dass ein Protein zwar die für den Antikörper erkennbare Bindungsdomäne aufweist, sich jedoch zum Beispiel durch Spleißen oder andere metabolische Prozesse in der Größe wesentlich von dem eigentlichen, zum Antikörper passenden Protein unterscheidet, ist es möglich, zwischen den unterschiedlichen Größen chromatographisch zu unterscheiden. Eine geeignete Anordnung ist der 2 zu entnehmen, bei der einem Mikrofluidikchip 4 an seinem Einlass 5 eine Chromatographiesäule 6 zur Größenausschluss-Chromatographie vorgeschaltet ist, durch die die Probe hindurchtritt, bevor sie in dem Mikrofluidikchip 4 anlangt. Über einen Auslass 7 kann überflüssiges Probenmaterial ausgespült werden.
Grundlage der Größenausschluss-Chromatographie ist, dass die Oberfläche des Chromatographiematerials nicht mit den Proteinen wechselwirkt, jedoch über unterschiedliche Porengrößen eine Trennung der Proteine gemäß ihrer Moleküldurchmesser, welche in erster Näherung mit ihrer Molekülmasse korrelieren, erfolgt. Der Nachweis der Spezifität einer Protein-Antikörperbindung erfolgt in der Korrelation mit der Retentionszeit in der vorgeschalteten Chromatographie, welche annäherungsweise mit der Retentionszeit entsprechend gleich großer Markerproteine übereinstimmen muss. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Größenausschluss-Chromatographie in anderer Weise auszuführen, wie z. B. als Kopplung mit einer Ionenaustauschchromatographie.
Zur Bestimmung dieser Zeitpunkte können der Probe interne Größenstandards beigefügt sein, die nach erfolgter Durchwanderung der Chromatographiesäule 6 zeitlich nacheinander auf dem Mikrofluidikchip 4 eintreffen. Als Größenstandards sind z. B. bekannte Proteine geeignet, die keine Bindungsaffinität zu den Antikörpern auf den zu untersuchenden Antikörper-Messpunkten 3 besitzen, sondern ausschließlich mit Bindungspartnern auf separat vorgesehenen Markerspots 8 in Wechselwirkung treten. Somit kann durch die zeitliche Abfolge der Bindungsereignisse eine zusätzliche Abschätzung der Molekülmasse erfolgen. Im Unterschied zu der bekanntermaßen verwendeten Massenspektrometrie ist mit der Größenausschluss-Chromatographie eine parallel durchzuführende, schnelle Voraufreinigung möglich, die aufgrund der einfachen Technik zudem preiswert erfolgen kann. In Verbindung mit der Information zur spezifischen Bindung über die Antikörperbindungsstärke ergibt sich für den Anwender ein hochparalleles Messverfahren zur schnellen markierungsfreien Proteindetektion.
3 veranschaulicht den Fall verschiedener Antikörper AK1, AK2 mit unterschiedlichen, aber bekannten Bindungsaffinitäten zu unterschiedlichen Bindungsdomänen DA und DB des Proteins 1. Ein Protein, das lediglich eine der beiden Bindungsdomänen DA, DB aufweist, wird sich nur mit dem passenden Antikörper AK1 oder AK2 verbinden. Ein Protein PR1, das beide Bindungsdomänen DA und DB aufweist, wird sich an beiden Spots (AK1 und AK2) im Verhältnis der bindungskonstanten AK1/DB zu AK2/DA anlagern. Dies gilt als Zeichen für eine spezifische Protein-Antikörperbindung. Liegen aber Mischungen mit unterschiedlichen Proteinen vor, von denen ein Teil der Proteine beide Bindungsdomänen DA, DB aufweist, wird ein Konzentrationsverhältnis von angelagerten Proteinen zwischen den beiden Antikörpern AK1, AK2 nachzuweisen sein, das eine Reinheit des Proteins mit nur einer Bindungsdomäne DA oder DB ausschließt.

Claims

Verfahren zur markierungsfreien Detektion von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und oberflächengebundenen Antikörpern, bei dem zur Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Bindungen Antikörper mit unterschiedlichen, bekannten Bindungsaffinitäten zu einem nachzuweisenden Protein in gleichen Konzentrationen verwendet werden, wobei das Vorliegen einer spezifischen Bindung mit dem Nachweis sich im Verhältnis der bekannten Bindungsaffinitäten zueinander verhaltender Konzentrationen von gebundenen Proteinen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die verwendeten Antikörper als strukturähnliche Antikörper aus unterschiedlichen Fraktionen einer Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers entnommen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die verwendeten Antikörper als strukturähnliche Antikörper durch gezielte Mutation eines Ausgangs-Antikörpers hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die verwendeten Antikörper als strukturähnliche Antikörper durch chemische oder biochemische Derivatisierung eines Ausgangs-Antikörpers hergestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem durch Größenausschluss-Chromatographie die Molekülmasse der bindenden Proteine abgeschätzt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Größenausschluss-Chromatographie auf interne Größenstandards angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Messpunkte parallel mit optischen Detektionsverfahren ausgemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem als optisches Detektionsverfahren die reflektometrische Interferenzspektroskopie verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem als optisches Detektionsverfahren die Plasmonenresonanzspektroskopie verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem als optisches Detektionsverfahren die Ellipsometrie verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem zur optischen Detektion Gitter- oder Prismenkoppler verwendet werden.
Messanordnung zur markierungsfreien Detektion von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und Antikörpern, die oberflächengebunden auf Messpunkten (3) eines mikrostrukturierten Probenträger (2, 4) aufgebracht sind, wobei sich die mit gleichen Konzentrationen in unterschiedlichen Messpunkten (3) aufgebrachten Antikörper durch unterschiedliche, bekannte Bindungsaffinitäten zu einem nachzuweisenden Protein unterscheiden.
Messanordnung nach Anspruch 12, bei dem der Probenträger (4) als Mikrofluidikchip ausgebildet ist, an dessen Einlass (5) eine Chromatographiesäule (6) zur Größenausschluss-Chromatographie vorgeschaltet ist.
Messanordnung nach Anspruch 12 oder 13, bei dem die Messpunkte auf dem Probenträger (4) getrennt sind in Messpunkte (3) zum Nachweis der Bindungsereignisse und in Messpunkte (8) zum Nachweis von probeninternen Größenstandards.