DE602004009824T2

DE602004009824T2 - Analyse von massenspektraldaten in den ruhigen gebieten

Info

Publication number: DE602004009824T2
Application number: DE602004009824T
Authority: DE
Inventors: Darryl J. C. Boxborough PAPPIN
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2024-11-25
Also published as: WO2005054871A2; DE602004009824D1; US20110236982A1; JP2007512536A; JP4838725B2; CA2542941C; US20050153456A1; EP1687638B1; EP1687638A2; ATE377193T1; CA2542941A1; WO2005054871A3

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldungen:
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der provisorischen U.S. Anmeldung Nr. 60/547,375 , die am 26. November 2003 eingereicht wurde.
Gebiet der Erfindung:
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Analyse von massenspektroskopischen Daten.
Einführung:
In einigen Ausführungsformen bezieht sich die Erfindung auf Verfahren, die für die Analyse von Markierungen und/oder markierten Analyten in Ruhezonen eines Massenspektrums nützlich sind. Die Verfahren können Markierungsreagenzien verwenden, die verwendet werden können um markierte Analyte herzustellen. In einigen Ausführungsformen können die Markierungsreagenzien isotopisch angereichert werden. Da die Markierungsreagenzien isotopisch angereichert werden können, können die Markierungsfragment-Ionen, die durch Fragmentierung einer Markierung in einem Massenspektrometer erzeugt werden, in einigen Ausführungsformen einen Isotopencluster mit distinkter Peakkonfiguration produzieren. Analyse der Markierung oder Fragment-Ionen davon können in einigen Ausführungsformen verwendet werden, um die Identität und/oder Quantität eines Analyten oder von Analyten in einer oder mehreren Proben zu bestimmen.
Gemäß einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Markierungsreagenzien, die fragmentieren, um die Isotopencluster zu erzeugen, die in dem Massenspektrum beobachtet werden, zu „Ruhezonen" eines Massenspektrums gelenkt werden. Die „Ruhezonen" können von dem Typ des zu bestimmenden Analyten abhängen. Zum Beispiel, können die Ruhezonen durch Messen der Intensitätsinformation für eine große Anzahl von Spektren eines Analyten-Typs, wie Peptiden, Summieren der Intensitätsinformation und Bestimmen der „Ruhezonen" für die summierten Ergebnisse bestimmt werden. Die „Ruhezonen" sind Bereiche, in denen wenig oder keine Massenintensitätsinformation für den Analyten-Typ oder die Analyten-Typen in dem summierten Ergebnis existiert. Durch Ausrichten der Analyse auf die Ruhezonen, in denen wenige oder keine Analytfragment-Ionen detektiert werden, ist es möglich, die Zuverlässigkeit jeglicher qualitativen und/oder quantitativen Analyse der Markierung, die auf der Bestimmung der Markierungsfragment-Ionen basiert, zu verbessern.
Definitionen:
Für die Zwecke des Interpretieren dieser Beschreibung werden die folgenden Definitionen angewendet werden und, wo immer angebracht, werden Begriffe, die im Singular verwendet werden, auch den Plural einschließen und umgekehrt.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Analyt" ein interessierendes Molekül, das bestimmt werden kann. Nicht einschränkende Beispiele von Analyten schließen ein, sind aber nicht eingeschränkt auf, Proteine, Peptide, Peptidnukleinsäuren (PNA), Nukleinsäuren (sowohl DNA oder RNA), Kohlenhydrate, Lipide und andere kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 Dalton (Da). Die Quelle des Analyten, oder die Probe, die den Analyt umfasst, ist keine Einschränkung, da er von jeder Quelle stammen kann. Der Analyt oder die Analyte können natürlich oder synthetisch sein. Nicht einschränkende Beispiele von Quellen für den Analyten oder die Probe, die den Analyten umfasst, schließen Zellen oder Gewebe, oder Kulturen (oder Subkulturen) davon ein. Andere nicht beschränkende Beispiele von Analyten-Quellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, rohe oder prozessierte Zelllysate, Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakte, Zellextrakte oder Fraktionen (oder Teile) aus einem Separationsprozess wie einer chromatographischen Auftrennung, einer 1D elektrophoretischen Auftrennung, einer 2D elektrophoretischen Auftrennung oder einer elektrophoretischen Kapillarauftrennung. Körperflüssigkeiten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Speichel, Blut, Urin, Fäzes, Spinalflüssigkeit, Zerebralflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Lymphflüssigkeit oder eine Flüssigkeit aus einer Drüsensekretion. Mit prozessierten Zelllysaten meinen wir, dass das Zelllysat, zusätzlich zu den Behandlungen, die benötigt werden, um die Zelle zu lysieren, behandelt wird, um dadurch zusätzliches Prozessieren des gesammelten Materials durchzuführen. Zum Beispiel, kann die Probe ein Zelllysat sein, das einen oder mehrere Analyte umfasst, die Peptide sind, die durch Behandlung des Zelllysats mit einem proteolytischen Enzym gebildet werden, um dadurch Precursor-Peptid oder Protein zu verdauen.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Fragmentation" das Aufbrechen einer kovalenten Bindung. Wie hier verwendet, bezeichnet „Fragment" ein Produkt der Fragmentation (Nomen) oder des Vorgangs der Fragmentation verursacht (Verb).
Wie hier verwendet, bezeichnet ein „Isotopencluster" eine Gruppierung von Intensitätspeaks in einem Massenspektrum, die mit einer einzelnen Verbindung assoziiert sind (z.B. eine Markierung). Die Verbindung oder Markierung kann isotopisch angereichert werden. Der Isotopencluster kann einen einzelnen Isotop-Hauptpeak und zwei oder mehr Nebenpeaks einschließen. Die Nebenpeaks können von niedrigerer Intensität als der Isotop-Hauptpeak sein, und können sowohl eine Masse niedriger oder höher als der Hauptpeak sein. Obgleich die Trennung zwischen dem Hauptpeak und den Nebenpeaks in ganzen Zahlen gemessen werden kann, zum Beispiel 1, 2, 3 usw. Da, kann die Trennung auch in nicht ganzen Zahlen gemessen werden, zum Beispiel, 0.5, 1.2, usw. Zum Beispiel kann ein Isotopencluster mit einem Hauptpeak bei X Da den Intensitätsbeitrag von mindestens einer Nebenpeak mit höherer Masse bei X + 1 Da einschließen und den Intensitätsbeitrag von wenigstens einem Nebenpeak mit niedriger Masse bei X – 1 Da.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „isotopisch angereichert" eine Verbindung (z.B. Markierung, Markierungsreagenz oder Markierungsfragment-Ion), das mit einem oder mehreren hochmassigen oder „schweren" Isotopen angereichert wurde (z.B. stabilen Isotopen wie Deuterium, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O, ³⁷Cl oder ⁸¹Br). Mit „angereichert" meinen wir die Anwendung von Prozessen, die hochmassige Isotope in eine Verbindung über die natürliche Isotopenhäufigkeit hinaus einführen. Wenn eine Verbindung oder Fragment mindestens ein hochmassiges Isotop umfasst, bezeichnen wir manchmal die Verbindung oder das Fragment als „schwer". Da isotopische Anreicherung nicht 100% effektiv ist, können Verunreinigungen der Verbindung vorliegen, die geringere Anreicherungszustände darstellen und diese werden eine niedrigere Masse besitzen. Entsprechend können, wegen Überanreicherung (unerwünschter Anreicherung) und wegen natürlicher Isotopenhäufigkeit, Unreinheiten mit größerer Masse vorhanden sein. Dies ist weshalb eine Probe einer einzelnen isotopisch angereicherten Verbindung (oder ein Teil davon), wenn sie der Analyse in einem Massenspektrometer unterzogen wird, einen isotopischen Cluster von Fragment-Ionen erzeugen kann, der sowohl wenigstens einen Nebenpeak mit höherer Masse als auch einen Nebenpeak mit niedrigerer Masse zusätzlich zu dem Hauptpeak, der auf die Mehrheit der Verbindung zurückzuführen ist, besitzen kann.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „natürliche Isotopenhäufigkeit" das Level (oder die Verteilung) von einem oder mehreren Isotopen, die in einer Verbindung aufgrund des natürlichen Übergewichstes eines Isotops oder von Isotopen in der Natur vorgefunden werden. Zum Beispiel wird eine natürliche Verbindung, die von lebendigem Pflanzenmaterial gewonnen wurde, typischerweise ungefähr 1.08% ¹³C bezogen auf ¹²C enthalten.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Markierung" eine Einheit, die geeignet ist, einen Analyten für die Bestimmung zu markieren. Der Begriff Markierung ist synonym mit den Begriffen Tag und Kennzeichnung und anderen äquivalenten Begriffen und Phrasen. Zum Beispiel, kann ein markierter Analyt als ein getaggter oder gekennzeichneter Analyt bezeichnet werden. Markierungen können in Lösung verwendet werden oder können in Verbindung mit einem festen Träger verwendet werden. Entsprechend kann ein Markierungsreagenz oder ein markierter Analyt in Lösung vorliegen oder auf einem festen Träger deponiert sein oder mit einem festen Träger verbunden sein.
Wie hier verwendet, bezeichnet „Markierungsfragment-Ion" ein Ion, das mindestens Teil einer Markierung ist. Das „Markierungsfragment-Ion" kann durch Fragmentation der Markierung in einem Massenspektrometer erzeugt werden. Die Markierung kann in einem Massenspektrometer, egal ob sie, oder ob sie nicht, mit einem Analyten verbunden ist, in Fragmente zerfallen. Das Markierungsfragment-Ion ist typischerweise nicht ein Ion, das durch Fragmentation des Analyten erzeugt wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnen „Träger", „fester Träger" oder „feste Halterung" jedes Festphasenmaterial. Ein Markierungsreagenz kann auf einem Träger immobilisiert werden und danach verwendet werden, um einen oder mehrer Analyten zu markieren. Ein Analyt kann auf einem Träger immobilisiert werden und dann mit einem Markierungsreagenz markiert werden. Ein markierter Analyt kann auf einem Träger zum Prozessieren immobilisiert werden. Fester Träger umfasst Begriffe wie „Granulat", „Syntheseträger", „Festphase", „Oberfläche", „Membran" und/oder „Träger". Ein fester Träger kann aus organischen Polymeren wie Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyfluoroethylen, Polyethyleneoxy, Polyvinylidendifluorid (PVDF) und Polyacrylamid, wie auch Copolymere und Aufpfropfungen davon bestehen. Ein fester Träger kann auch inorganisch sein, wie Glass, Quarz, kontrolliertes Porenglass (CPG), oder Reversphasen-Quarz. Die Konfiguration eines festen Trägers kann in der Form von Kügelchen, Kugeln, Partikeln, Granulat, einem Gel, einer Membran oder einer Oberfläche konfiguriert sein. Oberflächen können eben, im Wesentlichen eben, oder nicht eben sein. Feste Träger können porös oder nicht porös ein, und können Quell-Eigenschaften haben oder Nichtquell-Eigenschaften. Ein fester Träger kann in der Form einer Nocke, Vertiefung oder anderen Behälters, Gefäßes, Eigenschaft oder Ortes sein. Eine Vielzahl von festen Trägern kann in einem Array mit zahlreichen Orten konfiguriert sein, die für die Abgabe von Reagenzien über Roboter, oder durch Detektionsverfahren und/oder Systeme adressierbar sind.
Beschreibung der zahlreichen Ausführungsformen der Erfindung:
In einigen Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf Verfahren, die für die Analyse von Markierungen und/oder markierten Analyten in Ruhezonen eines Massenspektrums nützlich sind. Durch Ausrichten der Analyse auf Ruhezonen, ist es möglich den dynamischen Bereich der Analyse zu maximieren. Dies kann für die qualitative und/oder quantitative Analyse von Analyten nützlich sein.
In einigen Ausführungsformen kann ein gefaltetes Spektrum aus Ausgabedaten erstellt werden, die von einem Analysegerät wie einem Massenspektrometer erhalten wurden. Die Ausgabedaten können verwendet werden, um ein gefaltetes Spektrum für ein oder mehrere Fragment-Ionen zu konstruieren, die durch die Analyse einer Probe erzeugt wurden. Das gefaltete Spektrum kann entfaltet werden. Entfaltung kann normalisierte Peakintensitätsinformationen für die Fragment-Ionen eines oder mehrerer Isotopencluster bereitstellen. Die Isotopencluster können in die Ruhezonen des Massenspektrums gelenkt werden. Da die normalisierte Peakintensitäten für den Isotopencluster bestimmt werden können, und da die Intensität der Peaks des Isotopencluster eine bestimmte Markierung definieren kann, kann die normalisierte Peakintensität sowohl für qualitative als auch/oder quantitative Bestimmungen der Fragment-Ionen von einer oder mehreren Markierungen (d.h. eines Markierungsfragment-Ions) verwendet werden. Wo das Vorliegen und/oder Menge von Markierungsfragment-Ionen einer Markierung mit dem Vorliegen und/oder der Menge eines Analyten oder von Analyten in einer oder mehreren Proben, die der Analyse mit dem Analysegerät unterzogen wurden, korreliert werden kann, kann das Vorliegen und/oder die Menge eines Analyten oder von Analyten in einer oder mehreren Proben durch die qualitative und/oder quantitative Analyse von dem einen oder mehreren Markierungsfragment-Ionen und ihren assoziierten Isotopencluster bestimmt werden. Beispielhafte Verfahren für eine solche Entfaltung von Spektren können in dem ebenfalls anhängigen und sich ebenfalls im Besitz der Inhaberin befindlichen U.S. Patent 7,105,806 B2 gefunden werden, das am 12. August 2004 eingereicht wurde.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung definiert das gefaltete Spektrum einen interessierenden spektralen Bereich, in dem Isotopencluster aus der Fragmentation von Markierungsreagenzien erzeugt werden können, egal ob oder ob sie nicht mit einem Analyten verbunden sind. In einigen Ausführungsformen können die Markierungsreagenzien isotopisch angereichert werden. In einigen Ausführungsformen können die isotopisch angereicherten Markierungsreagenzien isobar und/oder isomer sein.
Fragmentation eines markierten Analyten kann Fragment-Ionen für den Analyten, für die Markierung oder für einen Teil (Fragment) der Markierung erzeugen. Wenn die Markierung isotopisch angereichert ist, können, abhängig von dem Punkt der Fragmentation, das eine Atom oder mehrere schwere Atome der isotopisch angereicherten Markierung in dem Markierungsfragment-Ion vorliegen oder nicht vorliegen. Wenn mehr als ein schweres Isotop in eine Markierung eingebaut ist, ist es möglich, dass einige der schweren Isotope mit der Markierungsfragment verbleiben, das in dem Massenspektrum beobachtet wird, während andere in Fragmenten verbleiben, die nicht in dem Massenspektrum beobachtet werden, da sie keine Ladung besitzen (z.B. durch neutralen Verlust). In einigen Ausführungsformen ist das Markierungsfragment-Ion, das mindestens ein schweres Isotop umfasst, das vorherrschende Ion eines Isotopenclusters, der im Massenspektum beobachtet wurde.
Fragmentation der Markierungsreagenzien (oder der markierten Analyte) kann sich ereignen, indem die Markierung und/oder der markierte Analyte dissoziativer Energie unterworfen wird (z.B. Kollisionsinduzierte Dissoziierung (CID)). Die normalisierte Peakintensität für die Markierungsfragment-Ionen, die jeden Isotopencluster definieren, können mit dem Vorliegen und/oder mit der Quantität der Markierung, die den Isotopencluster erzeugt, korrelieren. Die Information für jeden Isotopencluster kann mit dem Vorliegen und/oder Quantität eines Analyten korrelieren. Die zahlreichen Isotopencluster, die das gefaltete Spektrum definieren, können jeder einer verschiedenen Markierung oder einem verschieden markiertem Analyt zugeordnet werden. Fragment-Ionen der Markierungen oder markierten Analyte können aus den gleichen oder von verschiedenen Proben gewonnen werden. In einigen Ausführungsformen, können Fragment-Ionen der Markierungen oder markierten Analyte von verschiedenen Proben erhalten werden, die in eine Probe kombiniert werden, die der Analyse durch das Analysegerät unterzogen wird. Entsprechend kann die Analyse des gefalteten Spektrums in der qualitativen und/oder quantitativen Analyse eines oder mehrer Analyte in einer oder mehreren Proben verwendet werden.
In einigen Ausführungsformen wird MSⁿ Analyse in einem Tandem-Massenspektrometer durchgeführt, wobei n größer als oder gleich 2 ist. Für die Analyse, bei der n größer als oder gleich 2 ist, können die Ionen aus einer anfänglichen MS Analyse ausgewählt werden und zu einem separaten MS Analysegerät für die nachfolgende Analyse geführt werden. Die ausgewählten Ionen können dissoziativer Energie unterzogen werden (um Fragmentation zu induzieren) bevor sie einem zweiten MS Analysegerät zugeführt werden. Durch das Auswählen spezifischer Ionen (oder Markierungen oder markierter Analyte) für die nachfolgende Analyse, kann die Komplexität der Probe reduziert werden, so dass zufällige Fragmente von anderen nicht interessierenden Analyten in der Probe von der Massenanalyse eliminiert werden. Auf diese Weise werden nur Fragmente des ausgewählten Ions oder der ausgewählten Ionen in dem zweiten, oder nachfolgenden, Massen-Analysegerät detektiert. Wenn der Analyt, zum Beispiel, ein markiertes Peptid ist und der Fragmentation unterzogen wird, werden nur Fragmente der Markierung und des Peptids in dem Spektrum der Massenanalyse der ausgewählten Ionen in der nachfolgenden Massenanalyse beobachtet werden. Wo die Markierungen in die Ruhezonen des Massenspektrums zur Peptidanalyse gerichtet sind, sollten nur Markierungsfragment-Ionen in den Ruhezonen beobachtet werden, da die möglichen Fragment-Ionen für Peptide außerhalb dieser Zonen liegen.
Es ist nicht eine Vorraussetzung für diese Erfindung, dass die Analyse mit einem Tandem-Massenspektrometer durchgeführt wird. Darüber hinaus kann das Massenspektrometer entweder in positivem oder negativen Ionenmodus betrieben werden. Zusätzliche Massenspektrometriegeräte und Fragmentationsverfahren, die in Kombination mit den Ausführungsformen dieser Erfindung verwendet werden können, schließen Nach-Quellen Zerfall in MALDI-MS Instrumenten und Hochenergie-CID mit MALDI-TOF („time of flight” Flugzeit)-TOF MS ein. Für einen kürzlich veröffentlichten Übersichtsartikel über Tandem-Massenspektrometer sehen Sie bitte: R. Aebersold und D. Goodlett, Mass Spectrometry in Proteomics. Chem. Rev.101: 269-295 (2001). Siehe auch Vereinigte Staaten Patent Nr. 6,319,476 für eine Diskussion von TOF-TOF Massenanalysetechniken.
Der Ort der „Ruhezonen" in einem Spektrum kann von der Natur der Probe oder des analysierten Analyten abhängen. Fragmentation in einem Massenspektrometer ist nicht vollkommen zufällig und ist tatsächlich ziemlich reproduzierbar für Analyte einer bestimmten Gattung (z.B. Peptiden und Proteinen). Obgleich viele verschiedene Typen von Fragment-Ionen in einem Massenspektrometer erzeugt werden können, werden die schwächsten Bindungen typischer die ersten seien, die fragmentieren. Wenn zum Beispiel die zu analysierende Probe primär Peptide und/oder Proteine umfasst, werden Fragment-Ionen, die in einem Massenspektrum der Probe beobachtet werden, primär ähnliche Fragmenttypen umfassen (z.B. Ionen von kürzeren Peptiden, Aminosäuren und Teilen von Peptiden und Aminosäuren).
Entsprechend kann reproduzierbare Fragmentation der Peptide und Proteine so auftreten, dass es Bereich des Spektrums gibt, in den wenige oder keine Fragment-Ionen detektiert werden, da die Fragmentation eines Peptids oder Proteins einfach nicht detektierbare Ionen dieser bestimmten Verhältnisse von Masse zu Ladung erzeugt (z.B. die Signale können schwach oder nicht detektierbar sein). Diese Bereiche des Masse zu Ladung (m/z) Spektrums sind die „Ruhezonen", wenn der Analyt ein Peptid und/oder Protein ist. Ruhezonen für Nukleinsäuren würden sich typischerweise von denjenigen unterscheiden, die für Proteine und Peptide beobachtet werden, da die Produkte einer Fragmentierung einer Nukleinsäure in einem Massenspektrum sich von denjenigen unterscheiden werden, die aus der Fragmentierung eines Peptids erhalten wurden. Wegen der Beständigkeit der Fragmentierung für Analyte eines bestimmten Genus, werden die Ruhezonen jedoch typischerweise reproduzierbar und Analytenabhängig sein.
Ein Weg die Ruhezonen für die Analyse eines bestimmten Analyten zu bestimmen, ist es die Massenspektren, die aus der Analyse der Fragment-Ionen des Analyten-Genus erhalten wurden, aufzusummieren und dann die Ruhezonen zu bestimmen (d.h. Bereiche, in den wenig oder keine Fragment-Ionen in dem aufsummierten Ergebnis beobachtet werden). Die Spektren können zufällig ausgewählte Spektren für den interessierenden Analyten sein. Die aufzusummierenden Spektren können gegenwärtig gesammelt werden oder historisch sein (z.B. durch eine Datenbank zur Verfügung gestellt). Entsprechend unterliegt die Quelle der aufzusummierenden Spektren keiner Einschränkung.
Sobald die Ruhezonen festgelegt sind, können Markierungsreagenzien, die Markierungsfragment-Ionen in den Ruhezonen erzeugen, auf dem Wissen der Fragmentationsmuster der Verbindungen basierend, ausgewählt werden. Bei isotopisch angereicherten Markierungen sollten die möglichen Isotope und ihre Verteilung innerhalb des Markierungsreagenz berücksichtigt werden, so dass die die Markierungsfragment-Ionen in die Ruhezonen gelenkt werden. Zum Beispiel können Sätze von isobaren und/oder isomeren Markierungsreagenzien hergestellt werden, so dass innerhalb des Satzes, alle diese Markierungen ein Markierungsfragment-Ion innerhalb einer oder mehrer Ruhezonen erzeugen, wobei aber jede Markierung des Satzes eine unterschiedliche Verteilung der Isotope umfasst, so dass jede unterschiedliche Markierung ein einzigartiges Markierungsfragment-Ion eines einzigartigen Verhältnisses von Masse zu Landung innerhalb der Ruhezone erzeugt. Auf diese Weise kann jede Markierung des Satzes unabhängig bestimmt und/oder quantifiziert werden.

Unter Bezug auf 1 und Beispiel 1 wird eine Kombination der aufsummierten Intensitätsdaten für ungefähr 75,000 zufällige historische Spektren von Peptid-/Proteinanalysen präsentiert. Ausschnittsvergrößerungen der 0-75 Atommasseneinheiten (amu) (2), 76-150 amu (3) und 151-225 (amu) (4) werden auch präsentiert. Die Ruhezonen können auch durch visuelle Inspektion oder durch programmierte Analyse des Summenspektrums oder der Ausschnittsvergrößerungen bestimmt werden. Tabelle 1 führt die „Ruhezonen" auf die durch visuelle Analyse des Summenspektrums oder der Ausschnittsvergrößerungen erhalten wurden. „Ruhezonen" umfassen den Bereich des Massenspektrums, in dem nur eine geringe oder keine Peakintensität in den aufsummierten Intensitätsdaten beobachtet wird. Tabelle 1: Mögliche „Ruhezonen" für die Auswahl von Markierungsfragment-Ionen m/z Für Peptide und Proteine

M/z Start-Ende

10-14
19-22
24-26
31-38
40-40
46-50
52-52
58-58
61-69
71-71
74-83
89-97
103-109
113-119
121-125
128-128
131-135
137-147
149-154
156-156
160-174
177-182
184-184
188-189
191-191
202-207
210-210
216-222
224-226

Entsprechend bezieht sich diese Erfindung in einigen Ausführungsformen auf ein Verfahren, das das Summieren der Intensität einer repräsentativen Anzahl von Fragmentationsspektren umfasst, die für einen ausgewählten Analyten erhalten wurden, um dadurch ein Summenspektrum zu erhalten. Mit „Fragmentationsspektren" meinen wir Spektren, die erhalten wurden, nachdem der Analyt genügend dissoziativer Energie unterworfen wurden, um wenigstens einen Teil der Moleküle des Analyten in der Probe zu fragmentieren. Mit repräsentativer Anzahl meinen wir eine genügende Anzahl von Spektren, die Intensitätsdaten für einen großen Satz von möglichen Fragmenten bereitstellen, die typischerweise für den ausgewählten Analyten beobachtet werden. Zum Beispiel können mindestens 1,000 Massenspektren des interessierenden Analyten aufsummiert werden. Die Ruhezonen des Summenspektrums können dann aus der Analyse des Summenspektrums bestimmt werden.
Die Zuverlässigkeit der Bestimmung der Ruhezonen kann von der Anzahl der verwendeten Spektren, die verwendet werden, um das summierte Ergebnis zu erzeugen, abhängen. Je größer die Zahl der Spektren, die verwendet werden, um das summierte Ergebnis zu erzeugen, desto höher wird die Zuverlässigkeit sein, dass es wenig oder keine Interferenz in einer bestimmten Ruhezone gibt. In einigen Ausführungsformen kann die Intensität von mindestens 5,000 Spektren aufsummiert werden. In einigen Ausführungsformen kann die Intensität von mindestens 10,000 Spektren aufsummiert werden. In einigen Ausführungsformen kann die Intensität von mindestens 25,000 Spektren aufsummiert werden. In einigen Ausführungsformen kann die Intensität von mindestens 50,000 Spektren aufsummiert werden. In einigen Ausführungsformen ist es möglich oder wünschenswert sogar mehr Spektren zu summieren. In einigen Ausführungsformen werden die zu summierenden Spektren zufällig ausgewählt. Die Spektren können gegenwärtig gesammelt oder historisch sein (z.B. durch Archive einer Datenbank bereitgestellt werden).
In einigen Ausführungsformen, kann das Verfahren ferner Auswählen eines oder mehrerer Markierungsreagenzien umfassen, die, wenn sie verwendet werden, um den ausgewählten Analyten zu markieren, in einem Massenspektrometer fragmentieren werden, um wenigstens ein Ion eines Markierungsfragmentes zu erzeugen, das ein Verhältnis von Masse zu Ladung besitzt, das in einer der Ruhezonen des Summenspektrums liegt. Durch Wählen eines Markierungsreagenz, das fragmentiert, um ein Markierungsfragment-Ion zu erzeugen, das in die Ruhezone gelenkt wird, können die Analyse und insbesondere die Quantifizierung des Markierungsfragment-Ions hoch zuverlässig sein. In einigen Ausführungsformen, können zwei oder mehr isobare oder isomere Markierungsreagenzien verwendet werden, um den gleichen Analyten zu markieren, wobei die Markierungsreagenzien fragmentieren, um Fragment-Ionen zu erzeugen, die sich um eine Atommasseneinheit (d.h. ein Dalton) unterscheiden, wobei ein Fragment von jedem der verschiedenen Markierungsreagenzien ein Verhältnis von Masse zu Ladung besitzt, das sich in einer der Ruhezonen des interessierenden Analyten befindet. In einigen Ausführungsformen, kann der Hauptpeak von jedem der zwei Isotopencluster durch ein einzelnes Dalton getrennt sein.
In einigen Ausführungsformen, kann das ausgewählte Markierungsreagenz isotopisch angereichert sein. Das isotopisch angereicherte Markierungsreagenz kann verwendet werden, um einen Analyten zu markieren. In einigen Ausführungsformen des Verwendens von isotopisch angereichertem Markierungsreagenz, kann das Verfahren ferner die Markierung eines Peptids oder Proteins (oder einer Probe, die ein Peptid oder Protein umfasst) mit dem ausgewählten Markierungsreagenz umfassen. In einigen Ausführungsformen des Verwendens von isotopisch angereichertem Markierungsreagenz, kann das Verfahren ferner die Markierung einer Nukleinsäure (oder einer Probe, die eine Nukleinsäure umfasst) mit dem ausgewählten Markierungsreagenz umfassen. Unabhängig von der Natur des Analyten kann das Verfahren ferner das Detektieren von mindestem einem Markierungsfragment-Ion umfassen in einer Ruhezone des ausgewählten Analyten-Typen, das durch die Fragmentation des markierten Analyten in einem Massenspektrometer erzeugt wurde. Tabelle 1 führt die Ruhezonen für die Analyse der Analyte auf die Peptide oder Proteine sind.
In einigen Ausführungsformen, können die bezeichneten „Ruhezonen" für eine Zusammensetzung aus zwei oder mehr verschiedenen Analyten-Typen bestimmt werden. Wenn zum Beispiel eine Probe Peptide und Nukleinsäuren umfasst, kann eine Zusammenstellung der Intensitätsspektren und/oder Tabellendaten sowohl für die fragmentierten Peptide als auch die fragmentierten Nukleinsäuren hergestellt und analysiert werden, um dadurch die „Ruhezonen" für die Zusammensetzung aus den zwei Analyten oder mehreren Typen zu bestimmen. Es sollte selbstverständlich sein, dass die Verfahrens-, System- und Zusammensetzungsausführungsformen dieser Erfindung auf mehr als einen Analyten auf diese Weise angewendet werden können.
In einigen Ausführungsformen kann das Markierungsreagenz ein kleines Molekül sein, das ein Markierungsfragment-Ion erzeugt, das ein Verhältnis von Masse zu Ladung von weniger als 250 amu besitzt. Zum Beispiel kann die Markierung, die das Markierungsfragment-Ion erzeugt, eine Piperidinverbindung, eine Piperazinverbindung oder eine Morpholinverbindung sein. Zum Beispiel kann der markierte Analyt eine Verbindung der folgenden Formel sein:
wobei:
Z O, S, NH oder NR¹ ist; jedes J das gleiche oder verschieden ist und H, Deuterium (D), R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, N(R¹)₂, Fluor, Chlor, Brom oder Iod ist; W ein Atom oder eine Gruppe ist, die sich ortho, meta oder para zu dem Ringstickstoff befindet und NH, N-R¹, N-R², P-R¹, P-R², O oder S ist; jeder Kohlenstoff des heterozyklischen Ringes die Formel CJ₂ besitzt; jedes R1 das gleiche oder verschieden ist und eine Alkylgruppe ist, die ein bis acht Kohlenstoffatome umfasst, die optional ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten, wobei die Kohlenstoffatome der Alkyl- und Arylgruppen unabhängig verbundene Wasserstoff-, Deuterium und/oder Fluoratome umfassen; und R² eine Amioalkyl-, Hydroxyalkyl-, Thioalkylgruppe ist oder ein spaltbarer Linker, der in spaltbarer Weise das Reagenz mit einem festen Träger verbindet, wobei die Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Thioalkylgruppe ein bis acht Kohlenstoffeatome umfasst, die optional ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten, und wobei die Kohlenstoffatome der Alkyl- und Arylgruppe unabhängig verbundene Wasserstoff-, Deuterium- und/oder Fluoratome umfassen. Einige Ausführungsformen eines nützlichen Piperazinmarkierungsreagenz für die Peptidanalyse können Markierungsfragment-Ionen in der Ruhezone von 113-119 amu erzeugen (siehe: 5). Die Markierungsreagenzien können isotopisch angereichert werden. Die Markierungsreagenzien können isomer oder isobar sein. Andere nicht einschränkende Beispiele von geeigneten Markierungsreagenzien, was Sätze von isomeren und/oder isobaren Markierungsreagenzien einschließt, können in der ebenfalls anhängigen Internationalen Patentanmeldung Nr. WO2004/070352 gefunden werden, für die der Inhaber dieses Patents ebenfalls Inhaber ist.
WO 03/025576 bezieht sich auf das Markieren von Analyten für die Detektion durch Massenspektrometrie und damit in Verbindung stehende Verfahren zum Analysieren von mit Massen markierten Analyten für die Massenspektroskopie.
5 ist eine Darstellung eines Satzes von vier Piperazin basierten isotopisch angereicherten isobaren Markierungsreagenzien, die verwendet werden können, um einen Analyten zu markieren, wie ein Peptid oder Protein.
Da sie isobar sind, umfassen sie die gleiche Struktur und die gleiche Masse, jedoch mit einer einzigartigen Verteilung der schweren Isotope. Wie die Abbildung zeigt, fragmentieren diese vier Markierungsreagenzien identisch.
Jedoch erzeugt jeder der vier Markierungsreagenzien, wegen der einzigartigen Verteilung der schweren Isotope innerhalb jeder der Markierungsreagenzien, ein Markierungsfragment-Ion mit einem einzigartigen Verhältnis von Masse zu Ladung innerhalb des Satzes. Insbesondere ist das Verhältnis von Masse zu Ladung der vier Markierungsfragment-Ionen durch ein Dalton im Bereich von 114-117 m/z getrennt. Entsprechend werden diese Markierungsfragment-Ionen in die Ruhezone von 112-119 m/z zur Peptid-/Proteinanalyse gelenkt, wie sie in 3 beobachtet und in Tabelle 1 identifiziert wird.
In einigen Ausführungsformen, bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren, das das Detektieren eine Markierungsfragment-Ions in einem Massenspektrometer umfasst, das durch Fragmentation eines markierten Analyten in dem Massenspektrometer erzeugt wurde, wobei das Markierungsfragment-Ion ein Verhältnis von Masse zu Ladung in einer Ruhezone für den ausgewählten Analyten besitzt. Die Markierung des markierten Analyten kann isotopisch angereichert sein. Die Markierung, die das Markierungsfragment-Ion erzeugt, kann isomer oder isobar sein. Der markierte Analyt kann jeder Analyt sein.
In einigen Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf ein Markierungsfragment-Ion, das durch Fragmentation eines markierten Analyten in einem Massenspektrometer erzeugt wurde, wobei es ein Verhältnis von Masse zu Ladung in einer Ruhezone für den ausgewählten Analyten besitzt. Die Markierung, die das Markierungsfragment-Ion erzeugt, kann isotopisch angereichert sein. In einigen Ausführungsformen kann das Markierungsfragment-Ion zwei verschiedene schwere Isotope umfassen (z.B. mindesten ein ¹³C und mindestens ein ¹⁵N). Die Markierung, die das Markierungsfragment-Ion erzeugt, kann isomer oder isobar sein. Der markierte Analyt kann jeder Analyt sein.
In einigen Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf ein Markierungsfragment-Ion, das durch Fragmentation eines markierten Biomoleküls (z.B. eines Peptids, Proteins, Kohlenhydrats, einer Nukleinsäure (DNA oder RNA), eines Lipids, usw.) in einem Massenspektrometer erzeugt wurde, wobei es ein Verhältnis von Masse zu Ladung in einem Bereich des Massenspektrums besitzt, in dem die erwarteten Fragmente des Biomoleküls eine niedrige Intensität besitzen oder abwesend sind. Zum Beispiel schließen erwartete Fragmente eines Peptids Aminosäuren und kürzere Peptide und Fragmente davon ein. Die Markierung, die das Markierungsfragment-Ion erzeugt, kann isotopisch angereichert sein. Die Markierung, die das Markierungsfragment erzeugt, kann isomer oder isobar sein. Der markierte Analyt kann jeder Analyt sein.
In einigen Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf ein Markierungsfragment-Ion, das durch Fragmentation eines markierten Biomoleküls in dem Massenspektrometer erzeugt wurde, wobei es ein Verhältnis von Masse zu Ladung in einem Bereich des Massenspektrums besitzt, in dem die erwarteten Fragmente des Biomoleküls eine niedrige Intensität besitzen oder abwesend sind. Die Markierung, die das Markierungsfragment-Ion erzeugt, kann isotopisch angereichert sein. In einigen Ausführungsformen kann das Markierungsfragment-Ion zwei verschiedene schwere Isotope umfassen (z.B. mindesten ein ¹³C und mindestens ein ¹⁵N). Die Markierung, die das Markierungsfragment erzeugt, kann isomer oder isobar sein. Der markierte Analyt kann jeder Analyt sein.
In einigen weiteren Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf ein Massenanalysegerät (z.B. Massenspektrometer) in Kombination mit markierten Analyten, die die markierten Fragment-Ionen erzeugen, die hierin zuvor beschrieben wurden. In einigen weiteren Ausführungsformen bezieht sich diese Erfindung auf Massenanalysegeräte (z.B. Massenspektrometer) in Kombination mit der Durchführung jeder der hierin zuvor beschriebenen Verfahren.
6 ist ein Blockdiagramm eines Systems, in dem einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden können. In 6 kann eine Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 mit einem Computersystem 620 gekoppelt werden. Die Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 kann zum Beispiel ein Massenspektrometer (MS) einschließen, was diejenigen einschließt, die zum nach-Quellen-Zerfall in der Lage sind, ein MS/MS, ein MS", ein Quadropol-MS, wie auch Datendateien von historischen MS-Analysen, ist aber darauf nicht beschränkt. Computersystem 620 kann eine Verarbeitungseinheit 622, gekoppelt mit einer Anzeige 624 und einem Eingabegerät 626, zum Beispiel, einer Tastatur einschließen. Andere Eingabegeräte 626 können ein elektronisches Schreibtablett, eine Maus, einen Stimmen aktiviertes Eingabegerät, usw. einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Verarbeitungseinheit 622 kann einen Prozessor, zum Beispiel, einen Mikroprozessor oder multiple Prozessoren einschließen, die mit einem Datenspeicher- und einem Massenspeichergerät gekoppelt sind. Zum Beispiel kann der Prozessor, obgleich es in keiner Weise beabsichtigt ist die möglichen Konfigurationen der Verarbeitungseinheit 622 zu beschränken, einen Mikroprozessor einschließen, der Datenspeicher kann einen Direktzugriffsspeicher (RAM) einschließen und das Massenspeichergerät kann ein Festplattengerät einschließen. Computersystem 620 kann gefaltete Spektrumdaten, historische Spektren und/oder bekannte Isotopenclusterinformation aus der Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 erhalten, und die Daten des gefalteten Spektrums unter der Verwendung der bekannten Clusterinformation entfalten.
7 ist ein Blockdiagramm eines anderen Systems, in dem einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden können. In 7 kann die Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 und das Computersystem 620 aus 6 gekoppelt werden, in 7, über ein Netzwerk 710, zum Beispiel ein Kommunikationsnetzwerk, das Internet, ein lokales Netzwerk (LAN), ein Weitverkehrsnetz (WAN) und ein kabelloses Netzwerk. Der Betrieb des Systems in 7, wie auch die ähnlichen Komponenten, sind zu dem System in 6 identisch mit der Ausnahme, dass die Vermittlung der Information aus der Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 an das Computersystem 620 durch das Netzwerk 710 sich ereignen kann.
8 ist ein Blockdiagramm eines weiteren anderen Systems, in dem Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden können. In 8 kann die Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 eine Verarbeitungseinheit 810 einschließen, die mit einem peripheren Subsystem 820 gekoppelt sein kann, was zum Beispiel ein Anzeigegerät 822 und ein Eingabegerät 824 einschließt. Verarbeitungseinheit 810 kann wie oben in 5 für die Verarbeitungseinheit 622 beschrieben konfiguriert sein. Der Betrieb des Systems in 8, wie auch die ähnlichen Komponenten, sind zu dem System in 6 identisch mit der Ausnahme, dass die Verarbeitungseinheit 810 in der Quelle für ein gefaltetes Spektrum 610 angeordnet ist.
Obgleich die vorliegende Erfindung im Detail offenbart wurde, sollte es verstanden werden, dass zahlreiche Änderungen, Austausche, und alternative Änderungen hier unternommen werden können. Darüber hinaus können solche Funktionen, obwohl Software und Hardware beschrieben sind, die bestimmte Funktionen kontrollieren, mit jeder Software, Hardware oder einer Kombination von Software und Hardware durchgeführt werden, wie in der Technik wohl bekannt ist. Andere Beispiele sind für den Fachmann leicht erfassbar und können ohne vom Sinn und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, wie er durch die folgenden Patentansprüche definiert ist, gemacht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
1 ist ein Summenspektrum des Ergebnisses von summierten Intensitätsdaten, von 0 bis 200 Atommasseneinheiten (amu), für ungefähr 75,000 historische Kollisions-induzierten Dissoziierungs- (CID)-Massenspektren von Peptid/Protein enthaltenden Proben, die mit einem Applied Biosystems 4700 Massenanalysegerät gewonnen wurden.
2 ist eine Ausschnittsvergrößerung des Summenspektrums des Ergebnisses von summierten Intensitätsdaten, von m/z 0 bis 75 (Daten für 10-75), für ungefähr 75,000 historische Massenspektren von Peptid/Protein enthaltenden Proben, die mit einem Applied Biosystems 4700 Massenanalysegerät gewonnen wurden.
3 ist eine Ausschnittsvergrößerung des Summenspektrums des Ergebnisses von summierten Intensitätsdaten, von m/z 75 bis 150, für ungefähr 75,000 historische Massenspektren von Peptid/Protein enthaltenden Proben, die mit einem Applied Biosystems 4700 Massenanalysegerät gewonnen wurden.
4 ist eine Ausschnittsvergrößerung des Summenspektrums des Ergebnisses von summierten Intensitätsdaten, von m/z 150 bis 225, für ungefähr 75,000 historische Massenspektren von Peptid/Protein enthaltenden Proben, die mit einem Applied Biosystems 4700 Massenanalysegerät gewonnen wurden.
5 ist eine Darstellung der Strukturen eines Satzes von vier isotopisch angereicherten isobaren Markierungsreagenzien, die jeweils in einem Massenspektrometer fragmentieren können, um ein Markierungsfragment-Ion mit einem unterschiedlichen Verhältnis von Masse zu Ladung im Vergleich mit den anderen zu erzeugen. Das Verhältnis von Masse zu Ladung all der Markierungsfragment-Ionen ist in einer Ruhezone der Peptid-/Proteinanalyse.
6 ist ein Blockdiagramm eines Systems, in dem die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden können.
7 ist ein Blockdiagramm eines anderen Systems, in dem Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden können.
8 ist ein Blockdiagramm eines weiteren anderen Systems, in dem Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden können.
Ausführungsformen der Erfindung:
Beispiel 1: Bestimmen von Ruhezonen für die Peptid-/Proteinanalyse
1 ist ein Summenspektrum der summierten Intensitäten von ungefähr 75,000 Peptid CID-Spektren, die mit dem 4700 TOF-TOF Massenspektrometer von Applied Biosystems erhalten wurden. Die Peptide wurden aus einer Vielzahl von Quellen abgeleitet, was Hefe- und Humanzelllinien wie auch Gewebeproben einschließt. Die Spektren sollen die Fragment-Ionen repräsentieren, die über eine sehr breite Population von möglichen Aminosäuresequenzen und Zusammensetzungen beobachtet wurden. Diese Fragmente würden für die Protein- und/oder Peptidanalyse charakteristisch sein. Eine genaue Untersuchung des Summenspektrums zeigt, dass es viele Bereiche gibt, in denen das Signal gering oder nicht vorhanden ist (siehe: 2, 3 & 4). Die Daten für die Ruhezonen der Peptidproben, wie sie aus dem Summenspektrum bestimmt wurden, werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Zum Beispiel ist der Ruhezonen von 113-119 amu. Ein ähnliches Summenspektrum und damit einhergehende Analyse von Ruhezonen kann für andere Analyte, wie Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate, Peptidnukleinsäuren (PNA) und kleine Moleküle erstellt werden.

Claims

Ein Verfahren umfassend: a) Summieren der Intensität einer repräsentativen Anzahl von Fragmentationsspektren, die für einen ausgewählten Analyten erhalten wurden, um dadurch ein Summenspektrum zu erhalten; und b) Bestimmen einer oder mehrerer Ruhezonen in dem Summenspektrum; c) Auswählen eines oder mehrerer Markierungsreagenzien, die, wenn sie verwendet werden, um die ausgewählten Analyten zu markieren, in einem Massenspektrometer fragmentieren werden, um wenigstens ein Ion eines Markierungsfragmentes zu erzeugen, das ein Verhältnis von Masse zu Ladung besitzt, das in einer der Ruhezonen des Summenspektrums liegt.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei die Intensität von wenigstens 1,000 Spektren, wenigstens 5,000 Spektren, wenigstens 10,000 Spektren, wenigstens 25,000 Spektren oder wenigstens 50,000 Spektren summiert werden.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei die zu summierenden Spektren zufällig ausgewählt sind.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei die zu summierenden Spektren aktuell gesammelt werden.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei die zu summierenden Spektren historisch sind.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei der ausgewählte Analyt ein Peptid, ein Protein oder eine Peptidnukleinsäure ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei der ausgewählte Analyt eine Nukleinsäure ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, wobei das ausgewählte Markierungsreagenz eines oder mehrere schwere Isotope umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 8, wobei das Ion des Markierungsfragmentes mindestens ein ¹³C und mindestens ein ¹⁵N umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 8, wobei das eine oder mehrere schwere Isotop/Isotope stabile Isotope sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Deuterium, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O, ³⁷Cl oder ⁸¹Br.
Das Verfahren von Anspruch 8 ferner umfassend: d) Markieren des ausgewählten Analytes mit dem ausgewählten Markierungsreagenz; e) Detektieren eines Ions eines Markierungsfragmentes in einem Massenspektrometer, das durch Fragmentation des markierten Analyts in dem Massenspektrometer erzeugt wurde, wobei das Ion des Markierungsfragmentes ein Verhältnis von Ladung zu Masse besitzt, das in einer der Ruhezonen des Summenspektrums liegt.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei der ausgewählte Analyt ein Protein, ein Peptid, eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat, ein Lipid, eine Peptidnukleinsäure oder ein kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 Dalton (Da) ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Ion des Markierungsfragmentes das vorherrschende Ion eines isotopischen Clusters ist und mindestens ein schweres Isotop umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Verhältnis von Masse zu Ladung des Ions des Markierungsfragmentes von 10-14 amu, von 19-22 amu, von 24-26 amu, von 31-38 amu, von 46-50 amu, von 131-135 amu, von 137-147 amu, von 149-154 amu, von 160-174 amu, von 177-182 amu, von 188-189 amu, von 202-207 amu, von 216-222 oder von 224-226 amu ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Verhältnis von Masse zu Ladung des Ions des Markierungsfragmentes von 61-69 amu, von 74-83 amu, von 89-97 amu, von 103-109 amu, von 113-119 amu oder von 121-125 amu ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Verhältnis von Masse zu Ladung des Ions des Markierungsfragmentes 40 amu, 52 amu, 58 amu, 71 amu, 128 amu, 156 amu, 184 amu, 191 amu oder 210 amu ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Verhältnis von Masse zu Ladung des Ions des Markierungsfragmentes weniger als 250 amu ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Markierungsfragment ein Ion eines Fragmentes ist, das durch Fragmentation einer Piperidinverbindung, einer Piperazinverbindung oder einer Morpholinverbindung erzeugt wird.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Markierungsfragment eine Verbindung der Formel
ist, wobei: Z 0, S, NH oder NR¹ ist; jedes J das gleiche oder verschieden ist und H, Deuterium (D), R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, N(R¹)₂, Fluor, Chlor, Brom oder Iod ist; W ein Atom oder eine Gruppe ist, die sich ortho, meta oder para zu dem Ringstickstoff befindet und NH, N-R¹, N-R², P-R¹, P-R², O oder S ist; jeder Kohlenstoff des heterozyklischen Ringes die Formel CJ₂ besitzt; jedes R¹ das gleiche oder verschieden ist und eine Alkylgruppe ist, die ein bis acht Kohlenstoffatome umfasst, die optional ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten, wobei die Kohlenstoffatome der Alkyl- und Arylgruppen unabhängig verbundene Wasserstoff-, Deuterium und/oder Fluoratome umfassen; und R² eine Amioalkyl-, Hydroxyalkyl-, Thioalkylgruppe oder ein spaltbarer Linker ist, der in spaltbarer Weise das Reagenz mit einem festen Träger verbindet, wobei die Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl- oder Thioalkylgruppe ein bis acht Kohlenstoffe umfasst, die optional ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten, und wobei die Kohlenstoffatome der Alkyl- und Arylgruppe unabhängig verbundene Wasserstoff-, Deuterium- und/oder Fluoratome umfassen.
Das Verfahren von Anspruch 19, wobei das Verhältnis von Masse zu Ladung des Ions des Markierungsfragmentes von 113-119 amu ist.
Das Verfahren von Anspruch 11, wobei das Ion des Markierungsfragmentes erzeugt wird, indem ein ausgewähltes Ion eines markierten Analyten dissoziativer Energie unterworfen wird.
Das Verfahren von Anspruch 21, wobei die dissioziative Energie durch Kollision induzierte Dissoziierung ist.
Ein Verfahren umfassend: a) Summieren der Intensität einer repräsentativen Anzahl von Fragmentationsspektren, die für zwei oder mehr ausgewählte Analyte erhalten wurden, um dadurch ein Summenspektrum für die zwei oder mehr Typen von Analyten zu erhalten; und b) Bestimmen einer oder mehrerer Ruhezonen in dem Summenspektrum; c) Auswählen eines oder mehrerer Markierungsreagenzien, die, wenn sie verwendet werden, um die ausgewählten Analyte zu markieren, in einem Massenspektrometer fragmentieren werden, um wenigstens ein Ion eines Markierungsfragmentes zu erzeugen, das ein Verhältnis von Masse zu Ladung besitzt, das in einer der Ruhezonen des Summenspektrums liegt.
Das Verfahren von Anspruch 23 ferner umfassend: d) Markieren des ausgewählten Analyten mit dem ausgewählten Markierungsreagenz; e) Detektieren eines Ions eines Markierungsfragmentes in einem Massenspektrometer, das durch Fragmentation der markierten Analyte in dem Massenspektrometer erzeugt wurde, wobei das Ion des Markierungsfragmentes ein Verhältnis von Ladung zu Masse besitzt, das in einer der Ruhezonen des Summenspektrums liegt.