DE60211849T2

DE60211849T2 - Verfahren zur Identifizierung von Liganden eines biologischen Substrats

Info

Publication number: DE60211849T2
Application number: DE60211849T
Authority: DE
Inventors: Mathai Redwood City MAMMEN
Original assignee: Theravance Inc
Current assignee: Innoviva Inc
Priority date: 2001-01-11
Filing date: 2002-01-10
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2022-01-11
Also published as: ATE328276T1; WO2002056016A3; JP2005501218A; EP1350108B1; AU2002239882A1; EP1350108A2; DE60211849D1; JP4111830B2; US20020090645A1; WO2002056016A2; US6656694B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die eine biologische Aktivität aufweisen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden, der an ein biologisches Substrat bindet, indem man eine multibindende Verbindung verwendet, von der bekannt ist, dass sie an das Substrat bindet.
Stand der Technik
Die Funktion eines biologischen Systems kann durch die Wirkung eines Liganden moduliert werden, der an ein biologisches Substrat im System bindet und so eine biologische Reaktion hervorruft. Der Ligand kann die Wirkung eines endogenen Liganden nachahmen, wobei er als Agonist bezeichnet wird, oder kann die Wirkung eines endogenen Liganden blockieren, wobei er dann als Antagonist bezeichnet wird. Viele biologisch brauchbare Verbindungen, wie Pharmazeutika, Pestizide und Pflanzenwachstumsregulatoren arbeiten auf diese Weise als Liganden.
Es ist allgemein sehr wichtig, dass ein Ligand selektiv an ein biologisches Substrat bindet und so keine biologische Reaktion in einem anderen biologischen System auslöst. Es ist im allgemeinen auch wichtig, dass der Ligand stark an das biologische Substrat bindet, so dass nur eine kleine Konzentration des Liganden zur Auslösung der biologischen Reaktion erforderlich ist.
Natürlich haben sich über die Zeit biologische Systeme entwickelt, worin die endogenen Liganden stark und selektiv an ihre jeweiligen biologischen Substrate binden.
Verfahren zur Identifizierung von exogenen Liganden, die stark und selektiv an ein biologisches Substrat binden, wurden entwickelt, aber diese Verfahren sind zeitraubend und erfordern die Herstellung und das Testen einer großen Anzahl an Kandidaten.
Ein Verfahren umfasst die Messung der Fähigkeit von Kandidaten, eine biologische Reaktion in einem biologischen Testsystem hervorzurufen und dann die Evaluierung der Selektivität eines aktiven Kandidaten durch Messen der Fähigkeit, in einem anderen biologischen System oder im gesamten Organismus keine biologische Reaktion auszulösen.
Ein weiteres Verfahren umfasst die Messung der Fähigkeit eines Kandidaten einen bekannten Liganden zu verdrängen, wie den endogenen Liganden oder einen Agonisten. In diesem Verfahren wird der bekannte Ligand als Sonde verwendet. Er kann radioaktiv markiert werden, um die Messung der Menge des bekannten Liganden zu erleichtern, der an das biologische Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit des Kandidaten gebunden oder ungebunden ist.
Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung eines Liganden ist in US 5 698 401 A (Fesik) beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die Verwendung eines ¹⁵N markierten biologischen Substrats und eine NMR Technik. Im Verfahren wird ein zweidimensionales ¹⁵N/¹H Korrelationsspektrum eines biologischen Substrats in Gegenwart eines Kandidaten mit einem zweidimensionalen ¹⁵N/¹H Spektrum in Abwesenheit eines Kandidaten verglichen. Durch den Vergleich der in unterschiedlichen Konzentrationen eines Kandidaten erhaltenen Spektren, kann eine Dissoziationskonstante K_d zwischen dem biologischen Substrat und dem Kandidaten bestimmt werden.
Die WO 00 00 823 A beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden, worin ein biologisches Substrat, das eine chemisch reaktive Gruppe enthält (oder so modifiziert wurde, dass es eine chemisch reaktive Gruppe enthält) gegenüber einer Testverbindung exponiert wird, die zur Reaktion mit der chemisch modifizierten Gruppe fähig ist. Das Verfahren nimmt an, dass eine Testverbindung, die eine Bindungsaffinität für das biologische Substrat aufweist, eher zur Reaktion mit der chemisch reaktiven Gruppe tendieren wird, als eine Testverbindung, die diese Bindungsaffinität nicht aufweist.
Biologische Substrate können mehr als eine Stelle aufweisen, an die ein Ligand binden kann und kürzlich ist das Interesse an Liganden gestiegen, die die Fähigkeit zur Bindung an mehr als ein biologisches Substrat aufweisen (S. Borman, 9. Oktober 2000, C&EN, 48–53). Solche Verbindungen oder Liganden werden als multibindende oder multivalente Verbindungen oder Liganden bezeichnet. Diese multibindenden Verbindungen umfassen zwei oder mehr Binderegionen oder Reste oder Ligandenfragmente, die durch einen oder mehrere Linker verbunden sind. Die Linker erzwingen die relativen Positionen und Orientierungen der Bindungsregionen, so dass jede Bindungsregion zur selben Zeit an die jeweiligen Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat binden kann. Das biologische Substrat kann aus einer einzelnen Einheit oder einem Cluster aus zwei oder mehr Einheiten aufgebaut sein, wobei dann eine multivalente Verbindung simultan an die Bindungsstellen an zwei oder mehr Einheiten binden kann.
Multibindungsliganden können stärker und selektiver an biologische Substrate binden, als monovalente Liganden. Dies kommt dadurch zustande, dass die Anwesenheit von mehreren Binderegionen bedeutet, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass der gesamte Ligand ungebunden ist und da es weniger wahrscheinlich ist, dass zwei unterschiedliche biologische Substrate die selben Mehrtachbindungsstellen in denselben relativen Positionen besitzen.
Die WO 99 42 476 A und WO 99 64 032 A beschreiben ein interaktives Verfahren zur Identifizierung von Mehrfachbindungsliganden, worin die Kandidaten durch die Verbindung einer Diversität an Fragmenten bekannter Liganden über eine Diversität an Linkern hergestellt werden und dann bestimmt wird, ob die Kandidaten Multibindungseigenschaften aufweisen. Ein erfolgreicher Kandidat enthält Fragmente bekannter Liganden, die zur Bindung an unterschiedliche Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat fähig sind und werden durch den Linker so präsentiert, dass sie gleichzeitig an ihre jeweiligen Bindungsstellen binden.
Die Anwendung des in WO 99 42 476 A und WO 99 64 032 A beschriebenen Verfahrens hat die schnelle Identifizierung von starken und selektiven Liganden ermöglicht. Jedoch bleibt weiterhin ein Bedarf für andere Methoden bestehen. Die WO 97 37 223 A beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Arzneimittelkandidaten basierend auf der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einer Kandidatenverbindung und einem Polypeptid mit einer WW Domäne in Gegenwart eines multibindenden, biotinylierten Peptids und Konjugaten aus Streptavidin-alkalischer Phosphatase.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun ein Verfahren zur Identifizierung von Liganden entwickelt, das die Bindungsaffinität eines Liganden für eine Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat ausnutzt, um einen Liganden zu identifizieren, der an einen anderen bindet.
Gemäß einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden für die sekundäre Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat, das die Bestimmung des Effekts einer Kandidatenverbindung auf die Bindung einer Sondenverbindung umfasst, die an eine erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat in Gegenwart einer ersten multibindenden Verbindung bindet, die an die ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat bindet.
Eine erfolgreiche Kandidatenverbindung konkurriert mit der ersten multibindenden Verbindung um die Bindung an die zweite Bindungsstelle und reduziert so die Bindung der ersten multibindenden Verbindung an das biologische Substrat. Diese verringerte Bindung der ersten multibindenden Verbindung kann durch die erhöhte Bindung der Sondenverbindung detektiert werden.
Daher liefert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Kandidatenverbindung ein Ligand für eine zweite Bindungsstelle eines biologischen Substrats ist, wobei das Verfahren umfasst

(a) Zusammenbringen eines biologischen Substrats, das eine erste Bindungsstelle und eine zweite Bindungsstelle umfasst, mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart von (i) einer Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet und (ii) einer ersten multibindenden Verbindung, die an die erste Bindungsstelle und die zweite Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet,
(b) Bestimmung der Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats in Schritt (a) bindet,
(c) Vergleich der an in Schritt (b) bestimmten Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle bindet, wenn das biologische Substrat mit der Sondenverbindung und der ersten multibindenden Verbindung in Abwesenheit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wird.

Falls die Kandidatenverbindung ein Ligand für die zweite Bindungsstelle des biologischen Substrats ist, bindet mehr von der Sondenverbindung an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in deren Abwesenheit.
Zusätzlich können die relativen Bindungsaffinitäten der Kandidatenverbindungen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch den Vergleich der relativen Menge der Sondenverbindung bestimmt werden, die an das biologische Substrat in Gegenwart jeder der Kandidatenverbindungen bindet. Daher liefert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität einer Mehrzahl an Kandidantenverbindungen für eine zweite Bindungsstelle eines biologischen Substrats, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Zusammenbringen eines biologischen Substrats, das eine erste Bindungsstelle und eine zweite Bindungsstelle umfasst, mit jeweils einer Vielzahl an Kandidatenverbindungen in Gegenwart von (i) einer Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet und (ii) einer ersten multibindenden Verbindung, die an die erste Bindungsstelle und die zweite Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet,
(b) Bestimmung der Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats für jede der Kandidatenverbindungen in Schritt (a) bindet,
(c) Vergleich der Menge an Sondenverbindung, die in Schritt (b) bestimmt wurde, für jede der Kandidatenverbindungen.

Im obigen Verfahren wird jede Kandidatenverbindung vorzugsweise getestet oder getrennt gescreent. Da die Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats in Gegenwart jeder Kandidatenverbindung bindet mit der Affinität der Kandidatenverbindung für die zweite Bindungsstelle zusammenhängt, kann die relative Affinität jeder Kandidatenverbindung für die zweite Bindungsstelle bestimmt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt eine Darstellung eines biologischen Substrats (1), eine radioaktiv markierte Sondenverbindung (2) und eine erste multibindende Verbindung (3).
Die 2 zeigt eine Darstellung eines biologischen Substrats (1), einer radioaktiv markierten Sondenverbindung (2), einer ersten multibindenden Verbindung (3) und einer Kandidatenverbindung (9), worin die radioaktiv markierte Sondenverbindung und die Kandidatenverbindung an das biologische Substrat gebunden sind.
Die 3 zeigt eine Darstellung eines biologischen Substrats (1), einer radioaktiv markierten Sondenverbindung (2), einer ersten multibindenden Verbindung (3) und einer Kandidatenverbindung (9), worin die erste multibindende Verbindung an das biologische Substrat gebunden ist.
Die 4 zeigt eine Darstellung der Radioaktivität, die gemessen wurde, nachdem die Kandidatenverbindungen zu jeder Vertiefung gegeben wurden und das biologische Substrat durch Filtration von allen ungebundenen Bestandteilen der Vertiefung abgetrennt wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden für eine zweite Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat mittels einer ersten multibindenden Verbindung und einer Sondenverbindung.
Vorzugsweise bindet die erste multibindende Verbindung schwach an die zweite Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat. Es ist dann für eine Kandidatenverbindung einfacher, die Verbindung vom biologischen Substrat zu verdrängen. Je stärker die erste multibindende Verbindung an die zweite Bindungsstelle bindet, desto höher ist die Konzentration der Kandidatenverbindung, die erforderlich ist, um diese zu verdrängen.
Das biologische Substrat kann jedes biologische Material sein, das erste und zweite Bindungsstellen enthält. Es kann aus einer einzelnen Einheit oder einem Cluster aus zwei oder mehreren benachbarten Einheiten bestehen, welche jeweils eine oder mehrere Bindungsstellen enthalten (das heißt die ersten und zweiten Bindungsstellen können auf den gleichen oder unterschiedlichen biologischen Substraten oder Einheiten liegen). Daher kann ein biologisches Substart aus ein, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Einheiten aufgebaut sein und kann 2 bis 100 Bindungsstellen enthalten.
Das biologische Substrat kann beispielsweise ein Biopolymer umfassen, wie ein Protein, ein Kohlenhydrat oder eine Nukleinsäure.
Das biologische Substrat ist vorzugsweise ein Membranrezeptor, ein Membrankanal (Ionenkanal), ein Enzym oder ein Makromolekül. Ein Beispiel für ein biologisches Substrat ist der muskarinische M2 Rezeptor.
Das biologische Substrat kann an eine Membran gebunden werden und kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, beispielsweise durch eine rekombinante Technik.
Die Sondenverbindung kann beispielsweise radioaktiv markiert, fluoreszierend oder chemilumineszent sein. Die radioaktive Markierung kann beispielsweise Tritium (³H) sein.
Substanzen, die zur Verwendung als Sondenverbindungen für ein gegebenes biologisches Substrat geeignet sind, sind in der Technik bekannt. Typischerweise beträgt der K_d der Sondenverbindung weniger als 100 nM, vorzugsweise weniger als 10 nM. Beispielsweise kann Tritium-markiertes N-Methylscopalamin als Sondenverbindung für den muskarinischen M2 Rezeptor verwendet werden.
Die erste multibindende Verbindung und deren Fähigkeit zur Bindung an die ersten und zweiten Stellen auf dem biologischen Substrat können aus der Technik bekannt sein. Falls keine multibindende Verbindung bekannt ist, kann eine geeignete erste Verbindung wie folgt erhalten werden:
Falls es in der Technik bekannt ist, beispielsweise aus der Röntgenkristallographie, dass ein biologisches Substrat erste und zweite Bindungsstellen enthält, die durch einen bekanten Abstand getrennt sind, und Liganden für jede Bindungsstelle bekannt sind, dann können die ersten multibindenden Verbindungen durch die Verbindung der Fragmente der Liganden über einen Linker identifiziert werden. Die Linker können beispielsweise unverzweigte oder verzweigte Alkyl- oder Etherketten sein, die wahlweise ein oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppel- oder – Dreifachbindungen enthalten. Beispiele für Verfahren zur Identifizierung der ersten multibindenden Verbindungen, für die die erforderlichen Liganden bekannt sind, können beispielsweise in WO 99 42 476 A und WO 99 64 032 A gefunden werden.
Die Wirkung einer Kandidatenverbindung auf die Bindung einer Sondenverbindung kann leicht durch die Verwendung einer in der Technik bekannten Methodik bestimmt werden. Wenn beispielsweise die Sondenverbindung radioaktiv markiert wird, kann die Wirkung durch die Messung der Radioaktivität von der gebundenen Sondenverbindung mit und ohne der Exposition gegenüber der Kandidatenverbindung gemessen werden. Eine erfolgreiche Kandidatenverbindung verringert die Menge an radioaktiv markierter Sondenverbindung, die durch die erste multibindende Verbindung durch die Verringerung der Bindung der ersten multibindenden Verbindung an das biologische Substrat verdrängt wird, und macht es so für die radioaktiv markierte Sondenverbindung einfacher, mit der ersten multibindenden Verbindung um die Bindung an die zweite Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat zu konkurrieren. Als Konsequenz ist die Radioaktivität der gebundenen Sondenverbindung mit einer Exposition gegenüber der Kandidatenverbindung höher als ohne.
Die Wirkungen jeder Kandidatenverbindung können separat gemessen werden oder die Effekte einer Mehrzahl an Kandidatenverbindungen können in einer Mikrotiterplatte gemessen werden. Eine bequeme Mikrotiterplatte ist eine Platte mit 96, 384 oder 1536 Vertiefungen. Die Kandidatenverbindungen können einzeln in getrennten Vertiefungen oder als Gruppen gescreent werden, wobei jede Gruppe in einer Vertiefung ist. Falls eine Gruppe an Kandidatenverbindungen eine gute Bindung zeigt, dann können die Vertreter der Gruppe einzeln evaluiert werden. Das anfängliche Screenen an Kandidatenverbindungen anstelle von einzelnen Kandidatenverbindungen kann den Screeningprozess beträchtlich beschleunigen und das Screening von Bibliotheken an Kandidatenverbindungen erleichtern, die durch kombinatorische Chemietechniken oder aus natürlichen Produktgemischen erzeugt werden (beispielsweise hergestellt durch Fermentation oder extrahiert aus Organismen, wie Pflanzen).
Im Verfahren kommt die erste multibindende Verbindung bequemerweise in einer Konzentration im Bereich des Fünf- bis Zehnfachen des Kd der ersten multibindenden Verbindung vor. Bei dieser Konzentration wird die Sondenverbindung signifikant verdrängt. Falls beispielsweise die Sondenverbindung radioaktiv markiert wird, wird nur eine sehr geringe Radioaktivität in einer Vertiefung detektiert, die nur die erste multibindende Verbindung und die Sondenverbindung enthält.
Die Sondenverbindung ist bequemerweise in einer Konzentration von weniger als dem Kd der Sondenverbindung vorhanden.
Die Kandidatenverbindung ist bequemerweise in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 μM bis etwa 1 mM, vorzugsweise 100 μM bis 500 μM vorhanden.
Die Kandidatenverbindungen können zufällig zum Testen ausgewählt werden, beispielsweise aus einer diversen Sammlung an Verbindungen. Alternativ dazu können die Kandidatenverbindungen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit der Region der ersten multibindenden Verbindung ausgewählt werden, die an die zweite Stelle bindet. Falls beispielsweise die Region der ersten multibindenden Verbindung, die an die zweite Stelle bindet, ein Amin ist, können andere Amine als Kandidatenverbindungen ausgewählt werden. „Eine Vielzahl an Kandidatenverbindungen" bezieht sich auf zwei oder mehr, vorzugsweise 2 bis etwa 100 000, bevorzugter 2 bis 100 und noch bevorzugter 2 bis 20 Kandidatenverbindungen.
Eine erfolgreiche Kandidatenverbindung kann sich wiederum als potenter und selektiver Ligand für das biologische Substrat selbst herausstellen. Falls nicht, dann können die folgenden Schritte unternommen werden.
Wenn eine erfolgreiche Kandidatenverbindung identifiziert wurde, wird eine zweite multibindende Verbindung hergestellt, die den Rest oder das Ligandenfragment umfasst, das an die erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet und einen Rest oder ein Fragment der erfolgreichen Kandidatenverbindung. Das Kandidatenfragment und die Position in der zweiten multibindenden Verbindung werden im Hinblick auf die Auffindung eines Liganden ausgewählt, der an die ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat bindet, vorzugsweise mit einer Stärke, die die der ersten multibindenden Verbindung überschreitet.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt umfasst das Verfahren daher ferner die Herstellung einer zweiten multibindenden Verbindung, die einen Rest oder ein Ligandenfragment umfasst, das an die erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet und einen Rest oder ein Fragment der Kandidatenverbindung und die Bestimmung der Bindung der zweiten multibindenden Verbindung an das biologische Substrat.
Es ist ersichtlich, dass eine Kandidatenverbindung als ganzes nicht in die zweite Verbindung eingearbeitet werden kann, da zumindest ein Atom auf der Kandidatenverbindung entfernt werden muss, um die Kandidatenverbindung kovalent an die zweite Verbindung zu binden. Wenn beispielsweise die Kandidatenverbindung die Formel X-H aufweist, kann das Fragment die Formel X haben.
Es ist auch ersichtlich, dass Teile der Struktur einer erfolgreichen Kandidatenverbindung wenig oder gar nichts zur Bindung der Kandidatenverbindung an das biologische Substrat beitragen können. Demnach muss, damit eine zweite multibindende Verbindung an die zweite Stelle auf dem biologischen Substrat binden kann, das Fragment der Kandidatenverbindung Teile der Struktur der Kandidatenverbindung enthalten, die zur Bindung beitragen. Darüberhinaus muss das Fragment korrekt positioniert wer den, um für die zweite multibindende Verbindung sowohl die ersten als auch die zweiten Stellen auf dem biologischen Substrat zu binden.
So können beispielsweise die Strukturen der ersten und zweiten multibindenden Verbindungen jeweils durch die Formeln I und II dargestellt werden: R^1a – L^a – R^2a I R^1b – L^b – R^2b IIworin
R^1a und R^1b jeweils für eine organische Gruppe stehen, die ein Fragment enthält, das zur Bindung an die erste Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat fähig ist,
R^2a für eine organische Gruppe steht, die ein Fragment enthält, das zur Bindung an die zweite Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat fähig ist, L^a für eine Linkergruppe steht, die die Gruppen R^1a und R^2a in die korrekte Position orientiert, um die
Bindung sowohl von R^1a als auch R^2a an die jeweiligen ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat zu erlauben,
R^2b für eine organische Gruppe steht, die ein Fragment einer erfolgreichen Kandidatenverbindung enthält, und
L^b für eine Linkergruppe steht, die die relativen Position von R^1b und R^2b erzwingt.
Ein Beispiel für eine erste multibindende Verbindung der Formel I, die an die ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem muskarinischen M2 Rezeptor bindet, ist eine Verbindung der Formel:
Bequemerweise ist R^1b dasselbe wie R^1a.
Wenn die Formel einer erfolgreichen Kandidatenverbindung für X-H steht, kann R^2b beispielsweise für X stehen,
L^b kann in einigen Fällen dasselbe sein, wie L^a, wenn beispielsweise R^2b für X steht.
Ein Beispiel für eine Kandidatenverbindung der Formel H-X ist eine Verbindung der Formel
Demnach kann die zweite Verbindung beispielsweise die folgende Formel aufweisen R^1a – L^a – X II'
Daher ist ein Beispiel für eine Verbindung der Formel II' eine Verbindung der Formel:
Die Teile der Struktur der Kandidatenverbindung, die zu einer Bindung beitragen, können durch die Ausführung einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudie mittels einer Sondenverbindung, einer ersten multibindenden Verbindung und einer Vielzahl an Kandidatenverbindungen bestimmt werden, wie dies hierin beschrieben ist. In der Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudie können die Strukturen der Kandidatenverbindungen systematisch variiert werden, um zu bestimmen, welche Teile der Struktur für die Bindung wichtig sind. Aus den Ergebnissen der Studie sollte es auch möglich sein, die Punkte auf dem Fragment zu bestimmen, die an den Rest des Rests der zweiten Verbindung gebunden werden können.
Vorzugsweise wird eine Vielzahl an unterschiedlichen zweiten Verbindungen hergestellt und es wird jeweils die Bindung an das biologische Substrat bestimmt. Die Mehrzahl an zweiten Verbindungen kann beispielsweise unterschiedliche Fragmente oder dieselben Fragmente umfassen, die an verschiedene Positionen auf dem Fragment gebunden sind.
Bequemerweise werden die Kandidatenverbindungen so ausgewählt, dass die zweiten Verbindungen auf dieselbe Weise hergestellt werden, wie die erste multibindende Verbindung. Beispielsweise kann die erste Verbindung durch das folgende Verfahren (A) hergestellt werden: R^1a – L^a' – Z¹ + H-R^2a → R^1a – L^a – R^2a worin Z¹ für eine chemisch reaktive Gruppe steht, und dann werden die Kandidatenverbindungen der Formel H-X ausgewählt, die zur Herstellung der zweiten Verbindungen durch ein analoges Verfahren verwendet werden: R^1a – L^a' – Z¹ + H-X → R^1a – L^a – X
Beispielsweise kann H-R^2a und jede Kandidatenverbindung der Formel H-X Amine repräsentieren und Z¹ kann für ein Abgangsatom oder eine Abgangsgruppe stehen, wie ein Halogenatom oder eine Organosulfonyloxygruppe.
Alternativ dazu werden, falls die erste multibindende Verbindung durch das folgende Verfahren (B) hergestellt werden kann: R^1a – L^a – H + Z²-R^2a' → R^1a – L^a – R^2a worin Z² für eine chemisch reaktive Gruppe steht, die Kandidatenverbindungen der Formel H-X so ausgewählt, dass zweite Verbindungen durch ein analoges Verfahren hergestellt werden können: R^1a – L^a – H + Z²-X' → R^1a – L² – X
Es ist ersichtlich, dass in beiden Fällen die relativen Positionen der Bindungsregionen der zweiten Verbindungen relativ zu ihren Positionen in den ersten Verbindungen konserviert werden, das die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die zweiten Verbindungen sowohl an die ersten als auch zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat binden. Es ist ersichtlich, dass in Verfahren (A) das Ausgangsmaterial die Kandidatenverbindung selbst ist, da dieses Verfahren bevorzugt ist.
Wenn eine zweite multibindende Verbindung aufgefunden wurde, die sowohl die ersten als auch die zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat bindet, kann diese zweite multibindende Verbindung zusammen mit einer Sondenverbindung verwendet werden, die an die zweite Bindungsstelle bindet, um andere Liganden für die erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat zu identifizieren. Diese anderen Liganden können wiederum verwendet werden, um weitere Verbindungen zu identifizieren, die an die ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat binden. Daher kann ausgehend von einer ersten multibindenden Verbindung, die an die ersten und zweiten Bindungsstellen auf einem biologischen Substrat bindet, das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um die Bindung an das biologische Substrat durch die Bereitstellung von Austauschen für die Regionen der ersten multibindenden Verbindung zu optimieren, die jeweils an die ersten und zweiten Bindungsregionen binden.
Es ist auch ersichtlich, dass, obwohl die Erfindung im Detail mit besonderer Bezugnahme auf die Identifizierung von divalenten Verbindungen beschrieben wurde, im Prinzip keine Grenze bezüglich der Valenz der multibindenden Verbindungen existiert, die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert werden können. Beispielsweise kann die erste multivalente Verbindung und/oder die zweiten Verbindungen eine Valenz von 2 bis 100 aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner die Herstellung einer dritten Verbindung umfassen, die zur Bindung an die ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat fähig ist und ein Fragment einer Verbindung enthält, das zur Bindung an eine dritte Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat fähig ist, und Bestimmung der Bindung der dritten Verbindung an das biologische Substrat.
Die Erfindung wird jetzt mehr im Detail unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
Die 1 zeigt eine Darstellung eines biologischen Substrats (1), einer radioaktiven Sondenverbindung (2), die an eine erste Stelle (3) auf dem biologischen Substrat bindet und eine erste multibindende Verbindung (4), die an die erste Bindungsstelle (3) und eine zweite Bindungsstelle (5) auf dem biologischen Substrat bindet. Die erste multibindende Verbindung enthält eine erste Binderegion (6), die an die erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet, eine zweite Bindungsregion (7), die an die zweite Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet und einen Linker (8), der die ersten und zweiten Regionen verbindet.
Die 2 zeigt eine Darstellung eines biologischen Substrats (1), eine radioaktive Sondenverbindung (2), die an die erste Bindungsstelle (3) auf dem biologischen Substrat bindet, eine erste multibindende Verbindung (4), die an die erste Stelle (3) und eine zweite Stelle (5) auf dem biologischen Substrat bindet und eine Kandidatenverbindung (9), die stark an die zweite Bindungsstelle (5) auf dem biologischen Substrat bindet. Die Kandidatenverbindung hat die erste multibindende Verbindung vom biologischen Substrat verdrängt und die Sondenverbindung (2) hat an die erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat gebunden.
Die 3 zeigt eine Darstellung eines biologischen Substrats (1), einer radioaktiv markierte Sondenverbindung (2), die an eine erste Stelle (3) auf dem biologischen Substrat bindet, eine erste multibindende Verbindung (4), die an die erste Bindungsstelle (3) und eine zweite Stelle (5) auf dem biologischen Substrat bindet und eine Kandidatenverbindung (10), die schwach an die zweite Bindungsstelle (5) auf dem biologischen Substrat bindet. Die Kandidatenverbindung hat die erste multibindende Verbindung nicht vom biologischen Substrat verdrängt, so dass die Sondenverbindung (2) nicht an der ersten Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat gebunden ist.
Nachdem die Kandidatenverbindungen zu den Vertiefungen gegeben wurden, wird der Inhalt inkubiert, dann werden die biologischen Substrate vom ungebundenen Inhalt der Vertiefungen durch Filtration abgetrennt. Dann wird die von den biologischen Substraten emittierte Radioaktivität gemessen. Die 4 zeigt die Radioaktivität, die für verschiedene Kandidatenverbindungen gemessen wird. Kandidatenverbindungen, die stark an die zweite Bindungsstelle des biologischen Substrats binden, verursachen eine starke Bindung der Sondenverbdinung an das biologische Substrat und führen zu einem hohem Maß an Aktivität. Kandidatenverbindungen, die schwach binden, bilden ein schwaches Maß an Radioaktivität.
Beispiele
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel A
Synthese von 4-Piperidyl-N-(2-biphenyl)carbamat
Schritt 1: In ein verschlossenes 50 ml Röhrchen wird 2-Biphenylylisocyanat (8 g, 41 mmol) in wasserfreies Acetonitril (40 ml) gegeben. Zu dieser Lösung wird dann N-Benzyl-4-piperidinol (9,8 g, 51,25 mmol) gegeben und das Röhrchen wird teilweise in ein Silikonölbad eingetaucht und auf 85°C erhitzt. Nach 16 Stunden wird das Reaktionsgemisch abgekühlt und im Vakuum unter Bildung an 1-Benzyl-4-piperidyl-N-(2-biphenyl)carbamat konzentriert, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wird.
Schritt 2: 1-Benzyl-4-piperidyl-N-(2-biphenyl)carbamat (12,5 g, 32,3 mmol) wird in wasserfreiem Methanol (150 ml) und Ameisensäure (25 ml, 660 mmol) gelöst und die Lösung wird mit gasförmigem Stickstoff für 15 Minuten gespült. 10 % Palladium auf Kohle (3 g) werden zugegeben und das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Nach 18 Stunden wird das Reaktionsgemisch durch Celite filtriert und das Filtrat wird unter Bildung eines gelben Feststoffs konzentriert. Der Feststoff wird zwischen 0,1 N Chlorwasserstoffsäure (300 ml) und Diethylether (300 ml) aufgeteilt. Die wässrige Phase wird mit Diethylether gewaschen und dann mit 1 N Natriumhydroxidlösung auf pH 12 basisch gemacht. Ein ausgefallener weißer Niederschlag wird in Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Bildung von 4-Piperidyl-N-(2-biphenyl)carbamat als farbloser Feststoff (6,63 g, 69 %) zur Trockne eingedampft. MS = 296,9 MH+.
Beispiel B
Synthese der Verbindung A
Ein Gemisch aus 4-Piperidyl-N-(2-biphenyl)carbamat (1,95 g, 6,60 mmol) und 1,9-Dibromnonan (1,34 ml, 6,60 mmol) in Acetonitril (45 ml) wird auf 80°C erhitzt. Nach 1 Stunde wird 4-(3-Phenylpropyl)piperidin (1,33 g, 6,60 mmol) zum Reaktionsgemisch gegeben und das Erhitzen wird fortgesetzt. Nach 4 Stunden wird das Reaktionsgemisch abgekühlt und unter verringertem Druck konzentriert und durch HPLC unter Bildung des gewünschten Produkts gereinigt.
Beispiel 1
Screening der Kandidatenverbindungen
In jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen wird folgendes gegeben:

a) Verbindung A, so dass eine Endkonzentration in der Vertiefung 200 nM (zehnfach des Kd der Verbindung A) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 beträgt,
b) Tritium-markiertes N-Methylscopalamin (³H-NMS), so dass die Endkonzentration in jeder Vertiefung 10 nM beträgt (0,5-fach des Kd von ³H-NMS),
c) eine Kandidatenverbindung in einer Endkonzentration von 500 nM, wobei die Kandidatenverbindung aus Aminen ausgewählt ist, die die Verbindung B und die Verbindung C umfassen (die im Handel erhältlich sind)
und
d) Membran, die den humanen klonierten muskarinischen Rezeptor enthält (hergestellt durch die Expression eines M2 kodierenden Plasmids in CHO Zellen mittels gut bekannter Verfahren und Reagenzien).

Die Platte mit den 96 Vertiefungen wird dann für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Membranen zur Trennung des gebundenen vom ungebundenen ³H-NMS filtriert. Dann wird die Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Platte wird in ein Zählgerät gegeben, um die Radioaktivität in jeder Vertiefung zu messen.
Die Menge an Radioaktivität, die für jede Vertiefung bestimmt wird, wird dann mit einer vorbestimmten Menge an Radioaktivität verglichen, die mittels des obigen Verfahrens in Abwesenheit einer Kandidatenverbindung gemessen wird. Eine Vertiefung, die eine erfolgreiche Kandidatenverbindung enthält (das heißt einen Liganden für die zweite Bindungsstelle des Rezeptors) zeigt eine höhere Radioaktivität relativ zur Menge an Radioaktivität, die in Abwesenheit einer Kandidatenverbindung gemessen wird.
Zusätzlich ist die Menge an Radioaktivität in Vertiefungen, die mehr erfolgreiche Kandidatenverbindung enthalten (das heißt einer Verbindung mit einer größeren Affinität für die zweite Bindungsstelle) höher als die Menge an Radioaktivität in Vertiefungen, die eine weniger erfolgreiche oder unerfolgreiche Kandidatenverbindung enthalten, da die erfolgreichere Kandidatenverbindung mehr Verbindung A vom Rezeptor verdrängt hat und es so erlaubt, dass stattdessen mehr ³H-NMS bindet. Im obigen Verfahren bindet die Verbindung B schwach an den Rezeptor (geringere Radioaktivität beobachtet) relativ zur Verbindung C, die stärker bindet (höhere beobachtete Radioaktivität).
Die Verbindung D wird dann aus Verbindung C durch ein Verfahren hergestellt, das zum dem analog ist, welches zur Herstellung der Verbindung A verwendet wird.
Die Bindung der Verbindung D an den Rezeptor wird dann mittels ³H-NMS gemessen. Die Verbindung D hat einen Kd von 2 nM, was stärker ist als die Verbindung A.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines Liganden für eine zweite Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat, das die Bestimmung des Effekts einer Kandidatenverbindung auf die Bindung einer Sondenverbindung umfasst, die an eine erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat in Gegenwart einer ersten multibindenden Verbindung bindet, welche an die erste und zweite Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste multibindende Verbindung schwach an die zweite Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sondenverbindung radioaktiv markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Wirkung der Kandidatenverbindung durch Messen der Radioaktivität der gebundenen Sondenverbindung mit und ohne einer Exposition gegenüber der Kandidatenverbindung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste multibindende Verbindung in einer Konzentration im Bereich des fünf- bis zehnfachen des Kd der ersten multibindenden Verbindung vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sondenverbindung in einer Konzentration von weniger als der K_d der Sondenverbindung vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kandidatenverbindung mit einer Konzentration im Bereich von 100 bis 1000 μM vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das biologische Substrat ein Membranrezeptor, ein Membrankanal, ein Enzym oder ein Makromolekül ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirkungen einer Vielzahl an Kandidatenverbindungen in einer Mikrotiterplatte gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Herstellung einer zweiten multibindenden Verbindung, die ein Ligandenfragment, das an die erste Bindungsstelle auf dem biologischen Substrat bindet und ein Fragment der Kandidatenverbindung umfasst, und die Bestimmung der Bindung der zweiten multibindenden Verbindung an das biologische Substrat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Kandidatenverbindung die Formel X-H aufweist und das Fragment die Formel X aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin eine Vielzahl an unterschiedlichen Verbindungen hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Strukturen der ersten und zweiten Verbindungen jeweils durch die Formel I und II dargestellt werden R^1a – L^a – R^2a I R^1b – L^b – R^2b IIworin R^1a und R^1b jeweils für eine organische Gruppe stehen, die ein Fragment enthält, das zur Bindung an die erste Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat fähig ist, R^2a für eine organische Gruppe steht, die ein Fragment enthält, das zur Bindung an die zweite Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat fähig ist, L^a für eine Linkergruppe steht, die die Gruppen R^1a und R^2a in die korrekte Position orientiert, um die Bindung sowohl von R^1a als auch R^2a an die jeweiligen ersten und zweiten Bindungsstellen auf dem biologischen Substrat zu erlauben, R^2b für eine organische Gruppe steht, die ein Fragment einer erfolgreichen Kandidatenverbindung enthält, und L^b für eine Linkergruppe steht, die die relativen Positionen von R^1b und R^2b erzwingt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin eine zweite Verbindung die folgende Formel aufweist: R^1a – L^a – X II'
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Kandidatenverbindung ein Ligand für eine zweite Bindungsstelle auf einem biologischen Substrat ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Zusammenbringen eines biologischen Substrats, das eine erste Bindungsstelle und eine zweite Bindungsstelle umfasst, mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart von (i) einer Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet und (ii) einer ersten multibindenden Verbindung, die an die erste Bindungsstelle und die zweite Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet, (b) Bestimmung der Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats in Schritt (a) bindet, (c) Vergleich der an in Schritt (b) bestimmten Menge an Sondenverbindung mit einer vorbestimmten Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle bindet, wenn das biologische Substrat mit der Sondenverbindung und der ersten multibindenden Verbindung in Abwesenheit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wird.
Verfahren zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität einer Vielzahl an Kandidatenverbindungen für eine zweite Bindungsstelle eines biologischen Substrats, wobei das Verfahren umfasst (a) Zusammenbringen eines biologischen Substrats, das eine erste Bindungsstelle und eine zweite Bindungsstelle umfasst, jeweils mit einer Vielzahl an Kandidatenverbindungen in Gegenwart von (i) einer Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet und (ii) einer ersten multibindenden Verbindung, die an die erste Bindungsstelle und die zweite Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet, (b) Bestimmung der Menge an Sondenverbindung, die an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats für jede der Kandidatenverbindungen in Schritt (a) bindet, (c) Vergleich der Menge an Sondenverbindung, die in Schritt (b) bestimmt wurde, für jede der Kandidatenverbindungen.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin das Verfahren die Herstellung einer zweiten multibindenden Verbindung, die ein Ligandenfragment, das an die erste Bindungsstelle des biologischen Substrats bindet, und ein Fragment einer Kandidatenverbindung umfasst, und die Bestimmung der Bindung der zweiten multibindenden Verbindung an das biologische Substrat umfasst.