DE69909312T2

DE69909312T2 - Methoden zur identifizierung von "hot-spot" resten bindender proteine und kleine verbindungen die an diese binden

Info

Publication number: DE69909312T2
Application number: DE69909312T
Authority: DE
Inventors: L. Virgil WOODS
Original assignee: ExSAR Corp
Current assignee: ExSAR Corp
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2019-09-14
Also published as: DE69909312D1; EP1121594A1; EP1121594A4; DK1121594T3; ATE244405T1; US6599707B1; EP1121594B1; US20020197650A1; WO2000016100A1; CA2347419A1; AU5924699A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Hot-Spot-Resten eines Partners in einem interessierenden Rezeptor-Liganden-Bindungspaar. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Verwendung von Informationen über Rezeptor-Hot-Spots für ein interessierendes Rezeptor-Liganden-Paar als Anleitung zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die funktionell an solche Bereiche des Rezeptors auf eine Weise binden, die den Liganden nachahmt.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Protein-Protein-Wechselwirkungen wie diejenigen, die man bei vielen Rezeptor-Liganden-Komplexen beobachtet, werden typischerweise über große Bindungsobertlächen vermittelt, die zehn bis dreißig Kontaktaminosäurereste auf jedem Protein des Komplexes umfassen (Clackson & Wells, 1995, Science 267: 383–386). Kürzlich wurde für einige Bindungspaare vorgeschlagen, dass innerhalb jeder Bindungsoberfläche der vorherrschende Beitrag zur gesamten freien Bindungsenergie des Komplexes lediglich auf wenige Resten in jeder Bindungsoberfläche zurück zu führen ist (Clackson & Wells, 1995, oben).
Zum Beispiel haben jüngere Studien von Wells und Mitarbeitern die Bindungsoberflächen des Komplexes charakterisiert, der sich zwischen dem menschlichen Wachstumshormon und seinem zellulären Rezeptor bildet (Clackson & Wells, 1995, oben; Pearce et al., 1996, Biochemistry 35: 10300–10307; Wells, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1–6). Röntgenkristallografische Studien hatten gezeigt, dass ungefähr dreißig Aminosäureseitenketten des Hormons mit ungefähr dreißig Aminosäureseitenketten des Rezeptors in Kontakt stehen. Es wurde eine große Zahl mutierter humaner Wachstumshormonproteine und mutierter Rezeptorproteine hergestellt, um den energetischen Beitrag jeder einzelnen Aminosäure der Kontaktoberfläche zur gesamten Bindungswechselwirkung zu bestimmen. In der Studie wurden die Bindungsaffinitäten verschiedener Komplexe zwischen mutierten Hormonen und nativen Rezeptoren und auch zwischen nativen Hormonen und mutierten Rezeptoren gemessen.
Überraschenderweise war nur eine kleine Zahl der Aminosäurereste innerhalb der großen Bindungsoberflächen für den größten Teil der Bindungsenergie verantwortlich. Insgesamt trug nicht einmal die Hälfte der Kontaktreste messbar zur Bindungswechselwirkung bei. Acht Rezeptor-Reste und elf Hormonreste machten mehr als 75% der freien Bindungsenergie des Hormon-Rezeptor-Komplexes aus.
Innerhalb jeder Gruppe von Resten der beiden Bindungspaare trug eine begrenzte Zahl von „Hot-Spot"-Aminosäuren den größten Teil der gesamten freien Bindungsenergie bei. Jeder „Hot-Spot" war von einer Gruppe verschiedener Aminosäuren umgeben, die in geringerem Umfang beitrugen, und auf diese Gruppe folgte wiederum eine größere Gruppe von Resten, die sogar noch weniger zur gesamten freien Bindungsenergie beitrugen. Am bedeutendsten war, dass die „Hot-Spot"-Reste auf der Bindungsoberfläche des Rezeptors direkt mit den komplementären „Hot-Spot"-Aminosäuren auf der Bindungsoberfläche des Hormons in Kontakt standen. Nachfolgende Studien in anderen Systemen haben ebenfalls gezeigt, dass die gesamte Bindungsaffinität zwischen einem Rezeptor und einem Liganden in erster Linie durch kleine und komplementäre Sets von „Hot-Spot"-Resten innerhalb der Bindungsoberflächen des Rezeptors und des Liganden vermittelt wird (Wells, 1996, Science 273: 449–450; Smith-Gill, 1994, Res. Immunol. 145: 67–70, 1994). Einige Systeme legen sogar nahe, dass multiple, nicht zusammenhängende „Hot-Spots" möglich sind.
Die Verfahren von Wells und anderen können zwar detaillierte Informationen über Reste liefern, die in Bindungswechselwirkungen für eine Vielzahl von Rezeptor-Liganden-Paaren verwickelt sind, aber sie leiden unter größeren Nachteilen. Beispielsweise müssen für ein gegebenes Paar aus Rezeptor und bindendem Protein große Serien mutierter Proteine hergestellt werden, um die thermodynamisch signifikanten oder „Hot-Spot"-Reste zu identifizieren. Um das zu erreichen, muss jeder Rest des Rezeptors oder Liganden einzeln mutiert werden, um seinen Beitrag zur gesamten freien Bindungsenergie zu ermitteln.
Im Idealfall können, wenn eine dreidimensionale Struktur des Rezeptor-Liganden-Komplexes verfügbar ist, die Mutationen auf lediglich diejenigen Aminosäuren begrenzt werden, die die Bindungsoberflächen für jeden Partner des Paares darstellen, ungefähr dreißig Reste für jede Einheit bei einer typischen Wechselwirkung. Somit müssen sogar in einer solchen „idealen" Situation, bei der Informationen sowohl über den Rezeptor als auch den Liganden gewünscht sind, insgesamt ungefähr sechzig mutierte Proteine hergestellt werden (eins für jeden Rest in der Bindungsoberfläche des Rezeptors und eins für jeden Rest in der Bindungsoberfläche des Liganden), und es muss die Bindungsenergie eines jeden mutierten Proteins für seinen nativen Bindungspartner bestimmt werden.
In einer typischeren Situation, bei der keine dreidimensionale Struktur der beiden Bindungspartner zur Verfügung steht, müssen im Prinzip Mutanten für jeden Rest beider Proteine hergestellt werden. Somit sind sogar in einer idealen Situation die Verfahren arbeitsintensiv und teuer. In einer Situation, die nicht ideal ist, sind der Zeitaufwand und die Kosten für die Herstellung der Mutanten und der Messung der Bindungsaffinitäten häufig mit denjenigen vergleichbar, die für die Erstellung einer dreidimensionalen Struktur des Komplexes erforderlich sind.
Darüber hinaus identifizieren die Verfahren nicht notwendigerweise exakt die Hot-Spot- Reste. Eine ortsgerichtete Mutagenese einzelner Aminosäuren entfernt nicht einfach eine Aminosäurenseitenkette aus einem Protein. Oft führt eine Mutation eines Restes zu, beispielsweise, einem Alanin-Rest lokale und möglicherweise globale Störungen in der Struktur des mutierten Proteins ein. Diese Strukturveränderungen können die Bindungswechselwirkungen zwischen dem mutierten Protein und seinem Liganden beeinflussen. Als Konsequenz daraus ist es unwahrscheinlich, dass ein Vergleich der Bindungsaffinitäten des mutierten und des nativen Proteins ein exaktes Maß für den relativen Beitrag ist, den dieser Rest zur gesamten freien Bindungsenergie leistet. Tatsächlich überstieg in den Studien von Clackson & Wells die Summe der Beiträge der mutierten Aminosäuren zur scheinbaren freien Bindungsenergie die bekannte freie Bindungsenergie des Komplexes aus dem Rezeptor und dem nativen Liganden um einen Faktor von zwei (siehe Clackson & Wells, 1995, oben). Clackson & Wells zogen die Schlussfolgerung, dass die zusätzliche gemessene Bindungsenergie auf Strukturveränderungen, die die Mutanten hervorriefen, beruhte.
Somit wäre es äußerst wünschenswert, über Methoden zur Identifizierung von Hot-Spot-Aminosäureresten für Rezeptor-Liganden-Paare zu verfügen, wobei diese Methoden nicht unter den oben beschriebenen Einschränkungen leiden. Insbesondere wäre es äußerst wünschenswert, über Methoden zur Identifizierung von Hot-Spot-Resten in Rezeptoren und Liganden zu verfügen, wobei diese Methoden schnell und kostengünstig sind und ferner die Identifizierung von Hot-Spot-Resten für ein natives Rezeptor-Liganden-Paar ermöglichen, ohne dass der Rezeptor oder der Ligand mutiert werden muss.
Kleine Verbindungen, die an Rezeptoren von therapeutischer Bedeutung binden und sie dadurch antagonisieren (Antagonisten) oder aktivieren (Agonisten) sind von beträchtlichem kommerziellem Wert. Jedoch ist derzeit die Möglichkeit zur schnellen und einfachen Identifizierung derartiger kleiner Verbindungen, insbesondere solcher, die im Stande sind, mit Proteinrezeptoren in Wechselwirkung zu treten, die große Polypeptid- oder Protein-Liganden haben, beschränkt. In den meisten Fällen werden derartige Verbindungen durch den arbeitsaufwändigen Prozess des rationalen Drug-Designs erhalten, der üblicherweise ein detailliertes Wissen über die dreidimensionale Struktur des Cokomplexes aus Rezeptor und Ligand oder andere Informationen über Struktur und Funktion erfordert. Das rationale Drug-Design beinhaltet im Allgemeinen die Konstruktion von Verbindungen basierend auf verfügbaren Informationen über Struktur und Funktion, auf einer Verbindung-für-Verbindung-Basis, und das Screenen der einzelnen Verbindungen in biologischen Tests zur Identifizierung derjenigen Verbindungen, die zu einer gewünschten biologischen Aktivität führen. Üblicherweise werden detaillierte Informationen über Struktur und Funktion oder dreidimensionale Strukturen für den Komplex aus Rezeptor und Verbindung erhalten, so dass die Konstruktionshypothesen verifiziert werden können.
Typischerweise werden die detaillierten Informationen über Struktur und Funktion, die für die Konstruktion und die Testung der Verbindungen erforderlich sind, über NMR oder röntgenkristallografische Studien mit dem Rezeptor-Liganden-Cokomplex erhalten. Beide Technologien erfordern große Mengen an reinem Cokomplex, eine teure und spezialisierte Ausrüstung und hoch qualifizierte Techniker, was es extrem kostspielig und zeitaufwändig macht, derartige Strukturinformationen zu erhalten. Darüber hinaus können die detaillierten Strukturinformationen, die mit diesen Verfahren erhalten werden, zwar häufig diejenigen Reste jedes Partners des Bindungspaares identifizieren, die in die Bindungswechselwirkung verwickelt sind, aber keines dieser Verfahren ist zur Identifizierung der einzelnen Reste verwendet worden, die signifikant zur gesamten freien Bindungsenergie des Rezeptor-Liganden-Komplexes beitragen; tatsächlich kann eine röntgenkristallografische Untersuchung diese detaillierte Information einfach nicht liefern. Darüber hinaus haben sich bis jetzt Verfahren des rationalen Drug-Designs als ungeeignet für die Konstruktion von Rezeptor-Agonisten erwiesen, bei denen es sich um eine Klasse pharmazeutischer Ziele von zunehmender Bedeutung handelt. Die Induktion einer Rezeptoraktivierung durch Agonisten erfordert mehr als eine einfache Bindung an den Rezeptor. Eine agonistische Aktivität resultiert im Allgemeinen aus einer Konformationsänderung des Rezeptors oder aus einer Oligomerisierung von Rezeptoruntereinheiten, zu der es durch die Ligandenbindung kommt. Agonistische Liganden müssen im Stande sein, genau an den bzw. die korrekten Unterbereiche) des Rezeptors zu binden, und auch auf eine korrekte Weise, die für die Induktion dieser Rezeptorveränderungen erforderlich ist. Wenn Agonisten richtig an Rezeptoren binden, wird ein Teil der Bindungsenergie dazu eingesetzt, diese Strukturveränderungen des Rezeptors zu erzeugen. Die derzeit verfügbaren Techniken zur Strukturbestimmung (Röntgenkristallografie, NMR) haben große Schwierigkeiten mit der Identifizierung und Lokalisierung der Teile des Rezeptors, die an derartigen Liganden-induzierten Strukturveränderungen teilnehmen, und mit der Identifizierung der Mechanismen, über die sie durch die Bindung des Agonisten induziert werden.
Vor einiger Zeit wurden „nicht-rationale" Verfahren unter Einsatz kombinatorischer Bibliotheken entwickelt, zum Teil, um die Nachteile des rationalen Drug-Designs zu mildern. Bei diesen nicht-rationalen Verfahren werden große Bibliotheken von Verbindungen synthetisiert und bezüglich der Fähigkeit, an einen interessierenden Ziel-Rezeptor zu binden, gescreent. Es werden die Strukturen der identifizierten Verbindungen aufgeklärt und als Leitverbindungen für nachfolgende Runden einer Bibliotheks-Synthese und eines Screenings oder als Leitstrukturen für das rationale Drug-Design verwendet.
Diese Verfahren haben zwar den Reiz, im Stande zu sein, zufällig oder semi-rational große Bereiche des „Konformations-Raums" in relativ kurzer Zeit abzudecken, aber sie haben auch zahlreiche Nachteile. Zum Beispiel müssen für die Identifizierung einer Leitverbindung aus einer reinen Zufallsbibliothek Millionen, und manchmal Trillionen, von Verbindungen synthetisiert und gescreent werden. Somit können zwar pharmazeutische Leitverbindungen theoretisch aus einer reinen Zufallsbibliothek identifiziert werden, aber in der Praxis werden die Verfahren unter Einsatz von Bibliotheken mit Verfahren eines rationalen Designs verschmolzen, um „fokussierte Bibliotheken" zu erzeugen, die eine größere Wahrscheinlichkeit aufweisen, eine geeignete Leitstruktur zu enthalten. Somit beruhen sogar diese Verfahren unter Einsatz von Bibliotheken in gewissem Umfang auf Informationen über Struktur und Funktion.
Weiterhin können zwar Verbindungen, die an einen Ziel-Rezeptor binden, identifiziert werden, aber es wird keine Information darüber, an welcher Stelle am Rezeptor die Verbindung bindet, geliefert. Es ist schlicht unbekannt, ob die Verbindung an den Rezeptor an der gleichen Stelle oder in der Nähe der Stelle bindet, an die der natürliche Ligand des Rezeptors bindet. Verfahren kombinatorischer Bibliotheken sind auch für die Identifizierung von Rezeptor-Agonisten im Wesentlichen aus den gleichen Gründen, wie sie oben diskutiert wurden, ungeeignet.
Es wäre äußerst wünschenswert über die Fähigkeit zu verfügen, identifizieren zu können, wo eine interessierende Kandidatenverbindung an einen interessierenden Ziel-Rezeptor bindet, ohne dass man auf teurem und arbeitsaufwändigem Weg hoch aufgelöste dreidimensionale Strukturen des Rezeptors, des Liganden oder des Rezeptor-Liganden-Cokomplexes erhalten muss. Von besonderem Interesse wäre es, über die Fähigkeit zur Identifizierung von Kandidatenverbindungen zu verfügen, die an einen Rezeptor an der gleichen Stelle binden, an der der natürliche Ligand des Rezeptors bindet, oder zur Identifizierung von Verbindungen, die als Rezeptor-Agonisten wirken. Die derzeitigen Verfahren sind zur Erreichung dieser Ziele ungeeignet. Somit handelt es sich dabei um Ziele der vorliegenden Erfindung.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese und andere Mängel auf diesem Gebiet werden durch die vorliegende Erfindung überwunden, die in einem Aspekt ein Verfahren zur Identifizierung von Hot-Spot-Resten eines Partners oder beider Partner eines interessierenden Rezeptor-Liganden-Paares bereit stellt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die Geschwindigkeiten des Austauschs zwischen einzelnen Wasserstoffen eines Partners oder beider Partner des Rezeptor-Liganden-Paares und Wasserstoffen des Lösemittels für den Partner sowohl im gebundenen als auch im nicht gebundenen Zustand bestimmt. Die einzelnen Wasserstoffe werden mit spezifischen Aminosäureresten in der Primärsequenz des Partners korreliert, wodurch Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten für Wasserstoffe in spezifischen identifizierten Aminosäureresten, die den Partner ausmachen, erhalten werden. Aus diesen Austauschgeschwindigkeiten werden diejenigen Reste, die einzeln wenigstens ungefähr 10–20% der gesamten freien Bindungsenergie des Rezeptor-Liganden-Komplexes beisteuern, als diejenigen identifiziert, die die „Hot-Spot"-Reste dieses Partners im Rezeptor-Liganden-Paar darstellen.
Das Verfahren kann mit der oder ohne die Unterstützung durch die dreidimensionale Struktur oder andere Informationen über Struktur und Funktion des jeweiligen Rezeptors, Liganden oder Rezeptor-Liganden-Paares eingesetzt werden. Die einzige Anforderung ist, dass die primäre Aminosäuresequenz des interessierenden Partners bekannt ist.
Weiterhin schließt das Verfahren im Allgemeinen eine Anwendung beim Auffinden von Hot-Spot-Resten in einem nicht-nativen oder mutierten Rezeptor nicht aus. Ein derartiger Ansatz könnte beispielsweise bei der Etablierung von Struktur-Funktions-Beziehungen Anwendung finden, insbesondere, weil Mutanten gegenüber dem nativen Rezeptor häufig nicht vorhersagbare Konformationsänderungen zeigen.
Die hier beschriebenen Verfahren stellen im Vergleich zu derzeit verfügbaren Methoden zur Identifizierung von Hot-Spot-Resten eines Rezeptors und/oder Liganden beträchtliche Vorteile bereit. Zum Beispiel können gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren Hot-Spot-Reste einfach, schnell und kostengünstig für jeden Partner in einem nativen Rezeptor-Liganden-Komplex identifiziert werden. Im Gegensatz zu Verfahren nach dem derzeitigen Stande der Technik, die eine Mutation des Rezeptors und/oder Liganden erfordern, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zum ersten Male eine verlässliche Identifizierung von Hot-Spot-Resten von Rezeptoren und/oder Liganden in deren wirklich nativen, biologisch relevanten Konformationen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die mit einem interessierenden Ziel-Rezeptor auf eine Weise in Wechselwirkung treten, die derjenigen eines bekannten Liganden dieses Rezeptors ähnlich ist; d. h. die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die als Nachahmer der Bindung bekannter Rezeptorliganden wirken. Gemäss dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zuerst Rezeptor-Hot-Spot-Reste für ein interessierendes Rezeptor-Liganden-Paar identifiziert. Kandidatenverbindungen werden dann mit dem Rezeptor gescreent, um diejenigen Kandidatenverbindungen zu identifizieren, die mit wenigstens einem und vorzugsweise wenigstens einer Mehrzahl oder sogar noch mehr der Hot-Spot-Reste des Rezeptors in Wechselwirkung treten. Diejenigen Kandidatenverbindungen, die mit wenigstens einem Hot-Spot-Rest des Rezeptors in Wechselwirkung treten, werden als kleine Moleküle, die die Bindung des bekannten Liganden „nachahmen", selektiert.
Für jedes gegebene Rezeptor-Liganden-Paar können die Hot-Spot-Reste des Rezeptors. mittels einer beliebigen von verschiedenen Techniken bestimmt werden, zu denen beispielsweise die hier beschriebenen Verfahren gehören, ein Wasserstoff-Austausch mit schwerem Wasserstoff (Deuterium oder Tritium) zusammen mit der magnetischen Kernresonanzspektroskopie (NMR) oder der Massenspektroskopie, ein Tritiumaustausch zusammen mit Radioaktivitätsbestimmungen und zusammen mit einer ortsgerichteten Mutagenese. Die genauen Bindungswechselwirkungen zwischen dem Rezeptor und den Kandidatenverbindungen können ebenfalls mit beliebigen dieser Verfahren charakterisiert werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die essentielle Rezeptor-bindende Aktivität des bekannten Liganden nachahmen.
Jede Kandidatenverbindung kann zuerst bezüglich einer bestimmten interessierenden biologischen Aktivität getestet werden, beispielsweise der Fähigkeit zur Bindung, zur Antagonisierung oder Agonisierung des Rezeptors, um diejenigen Kandidatenverbindungen zu identifizieren, die die gewünschte biologische Aktivität aufweisen, und dann können die aktiven Kandidatenverbindungen weiter gescreent werden um diejenigen zu identifizieren, die mit einem Hot-Spot-Rest des Rezeptors in Wechselwirkung treten. Alternativ können die Kandidatenverbindungen direkt gescreent werden, um diejenigen zu identifizieren, die mit einem Hot-Spot-Rest des Rezeptors in Wechselwirkung treten, ohne sie zuerst auf ihre biologische Aktivität zu testen.
Die Auswahl der anfänglichen Kandidatenverbindungen, die gescreent werden sollen, kann durch ein Strukturmodell des Liganden oder des Rezeptor-Liganden-Komplex geleitet werden, durch verfügbare Informationen zu Struktur und Funktion für den Rezeptor-Liganden-Komplex, oder sie kann durch völlig zufällige Prozesse erfolgen. Die anfänglichen Kandidatenverbindungen können einzeln synthetisiert werden, oder sie können mittels eines beliebigen der gut bekannten Verfahren unter Einsatz kombinatorischer Bibliotheken synthetisiert werden. Kandidatenverbindungen, und insbesondere kombinatorische Bibliotheken von Kandidatenverbindungen, die zuerst auf eine biologische Aktivität gescreent werden, insbesondere auf eine Bindungsaktivität, können in Pools im Batchverfahren unter Verwendung eines beliebigen der zahlreichen Screening-Verfahren gescreent werden, die in diesem Gebiet beschrieben wurden, um biologisch aktive Verbindungen für die weitere Analyse gemäß der Erfindung zu identifizieren.
Im Idealfall wird das erfindungsgemäße Verfahren iterativ zur Identifizierung von Stoffen, die Liganden nachahmen, eingesetzt. Beim iterativen Verfahren leiten die Ergebnisse einer Screening-Runde die Auswahl von Kandidatenverbindungen für die nächste Screening-Runde. Zum Beispiel können die Strukturen der Kandidatenverbindungen, die in einer ersten Runde des Hot-Spot-Screenings identifiziert wurden, bestimmt werden, und diese Strukturen werden dazu verwendet, die Synthese neuer oder modifizierter Kandidatenverbindungen zu leiten. Nach mehreren Runden aus Synthese und Screening werden Verbindungen identifiziert, die genau den bekannten Liganden nachahmen; d. h. Verbindungen werden identifiziert, die exakt mit denjenigen Hot-Spot-Resten des Rezeptors in Wechselwirkung treten, mit denen der bekannte Ligand in Kontakt tritt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an einen Rezeptor binden, liefern gegenüber den derzeit verfügbaren Techniken beträchtliche Fortschritte. Da die bevorzugten Verfahren empfindliche Wasserstoffe auf der Aminosäureseitenkette oder dem Rückgrat als Reporter der lokalen Veränderungen in der Umgebung einsetzen, sind die Verfahren auch im Stande, Verbindungen zu identifizieren, die mit einem interessierenden Ziel-Rezeptor an den biologisch signifikantesten Resten in Wechselwirkung treten – denjenigen Resten des Rezeptors, die am meisten zur Bindung des natürlichen Liganden des Rezeptors beitragen. Von Bedeutung ist, dass die Verfahren keine detaillierten Informationen über die Struktur und die Funktion oder die dreidimensionale Strukturen des Rezeptors, des Liganden des Rezeptor-Liganden-Cokomplexes oder des Rezeptor-Verbindung-Cokomplexes benötigen, auch wenn die Interpretation der Ergebnisse durch die Verfügbarkeit derartiger Informationen erleichtert wird. Die einzige Anforderung besteht darin, dass die primäre Aminosäuresequenz des interessierenden Rezeptors bekannt ist. Somit erlauben die erfindungsgemäßen Verfahren die Identifizierung von „Liganden-Nachahmern", insbesondere von kleinen, die essentielle Bindungsfunktion des natürlichen Liganden nachahmen Stoffen, und zwar mit beispielloser Leichtigkeit.
Darüber hinaus liefern die Verfahren Einblicke in die Natur der Strukturveränderungen des Rezeptors, die durch die Ligandenbindung induziert und für die agonistische Aktivität benötigt werden. Das ermöglicht, in Kombination mit der Fähigkeit, die Konstruktion kleiner Moleküle für bekannte, über Liganden definierte Hot-Spots zu fokussieren, die schnelle Identifizierung von Verbindungen, die als Rezeptor-Agonisten fungieren – ein Charakteristikum, das auf diesem Gebiet einfach ohne Beispiel ist.
Somit stellt in einem letzten Aspekt die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, insbesondere von kleinen organischen Verbindungen, die als Agonisten für einen interessierenden Ziel-Rezeptor fungieren. Gemäss dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Techniken des Wasserstoff-Austauschs, wie sie bereits beschrieben wurden, zur Identifizierung dreier getrennter Klassen von Rezeptor-Aminosäureresten für ein interessieren-des Paar aus Rezeptor und Agonist eingesetzt:

(i) derjenigen, die auf der Bindungsoberfläche zwischen Rezeptor und Agonist vorliegen;
(ii) derjenigen, die an Konformationsänderungen als Folge der Bindung zwischen Rezeptor und Agonist teilnehmen; und
(iii) derjenigen, die an einer durch die Bindung induzierten Oligomerisierung der Rezeptoruntereinheit teilnehmen. Der Rezeptor wird dann mit Kandidatenverbindungen unter Verwendung der Techniken des Wasserstoff-Austauschs gescreent, die hier beschrieben werden, um diejenigen zu identifizieren, die mit wenigstens einer Aminosäure des Rezeptors aus den Klassen (ii) oder (iii) oben in Wechselwirkung treten. Man geht davon aus, dass die Kandidatenverbindung mit einem dieser Rezeptor-Reste in Wechselwirkung tritt, wenn der Rezeptor-Rest einen Schutzfaktor von wenigstens Eins nach der Bildung eines Komplexes zwischen dem Rezeptor und der Kandidatenverbindung hat. Die Kandidatenverbindungen können vor dem Screening mit den erfindungsgemäßen Verfahren auf biologische Aktivität gescreent werden, wie zuvor beschrieben wurde.

Die Verfahren können iterativ auf eine Weise verwendet werden, die der oben beschriebenen ähnlich ist, um Verbindungen zu identifizieren, die mit einer Mehrzahl der Aminosäurereste des Rezeptors aus der Klasse (ii) oder (iii) in Wechselwirkung treten.
3. DEFINITIONEN
Die folgenden Begriffe sollen so, wie sie hier verwendet werden, die folgenden Bedeutungen haben:
„Ligand": bezieht sich auf jedes beliebige Molekül, das im Stande ist, an einen Rezeptor zu binden. Der Ligand kann ein kleines organisches Molekül sein oder ein großes Molekül, wie ein Polypeptid oder Protein.
„Rezeptor": bezieht sich auf jedes beliebige Molekül, das im Stande ist, einen Liganden. zu binden. Somit bezieht sich „Rezeptor", wie der Begriff hier verwendet wird, nicht nur auf Moleküle, von denen allgemein bekannt ist, dass sie zur Klasse von Bindungsmolekülen, die als „Rezeptoren" bezeichnet werden, gehören, d. h. beispielsweise zu Rezeptoren für Zytokine, Wachstumsfaktoren, Chemokine, Hormonrezeptoren, Adhäsionsrezeptoren, Apoptoserezeptoren etc., sondern der Begriff soll auch jedes beliebige Molekül einschließen, das ein anderes Molekül binden kann und zu denen beispielsweise ein Antikörper oder ein Enzym gehören.
Der Rezeptor kann in seiner primären Aminosäuresequenz mit einem natürlich vorkommenden Rezeptor identisch sein, oder er kann ein funktionell aktives Fragment, eine Mutante oder ein Derivat von ihm sein. Das Fragment, die Mutante oder das Derivat kann die gleichen oder andere Bindungscharakteristika oder andere biologische Charakteristika wie bzw. als das parentale Protein aufweisen.
Zu besonders interessanten Rezeptoren gehören integrale Membranproteine, da es schwierig ist, sie für Röntgenbeugungsstudien zu kristallisieren. Rezeptoren, die für eine Untersuchung mit NMR-Verfahren zu groß sind, z. B. diejenigen, die größer als ungefähr 50 kDa sind, sind ebenfalls besonders interessant, vor allem, wenn sie nicht als eine Zusammensetzung aus zwei oder mehr getrennt analysierbaren Domänen charakterisiert werden können. Beispiele für besonders interessante Rezeptoren sind Integrine (bei denen es sich um große integrale Membranproteine handelt), Zelloberflächenrezeptoren für Wachstumsfaktoren (einschließlich von Zytokinrezeptoren), „Siebenspänner", Selektin und Oberflächenrezeptoren der Immunglobulin-Superfamilie (z. B. ICAM-1).
Wie es einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein dürfte, ist die Bezeichnung „Rezeptor" und „Ligand" etwas willkürlich. Typischerweise verwendet man den Begriff „Rezeptor" für den größeren der beiden Bindungspartner oder für denjenigen Partner des bindenden Paares, der ein Protein ist. Für die Zwecke dieser Erfindung sollen die Ausdrücke „Rezeptor" und „Ligand" nicht auf diese Weise eingeschränkt sein; sie beziehen sich einfach jeweils auf einen Partner eines Paares bindender Moleküle.
„Protein": so wie der Begriff hier verwendet wird schliesst er, mutatis mutandis, Polypeptide, Oligopeptide und Derivate davon ein, zu denen, lediglich beispielhaft und ohne einzuschränken, Glykoproteine, Lipoproteine, Phosphoproteine und Metalloproteine gehören. Die wesentliche Anforderung an ein Molekül, wenn es als Protein betrachtet werden soll, besteht darin, dass es eine oder mehrere Peptidbindunge(n) (-HNC(O)-) enthält, da der Amidwasserstoff der Peptidbindung (sowie diejenigen der Seitenketten bestimmter Aminosäurereste) bestimmte Eigenschaften hat, die es möglich machen, ihn über einen Wasserstoff-Austausch zu analysieren.
„Agonist": so wie der Begriff hier verwendet wird bezieht er sich auf einen Liganden, der nach der Bindung an einen Rezeptor die Aktivierung einer chemischen Signalkaskade auslöst, die zu einer definierbaren Veränderung im Verhalten oder im physikalischen oder biologischen Zustand einer Zelle führt.
„Antagonist": so wie der Begriff hier verwendet wird bezieht er sich auf ein Molekül, das als Folge seiner Bindung an einen Rezeptor oder Agonisten im Stande ist, die zellaktivierenden Einflüsse des Agonisten zu blockieren, und das selbst nicht zu einer substanziellen Aktivierung der Zelle führt.
„Labiler Wasserstoff": ist eine allgemeine Beschreibung eines beliebigen Wasserstoffs, der sich mit einem Lösemittelwasserstoff unter den Bedingungen des Austauschexperimentes austauschen kann. Eine Kategorie derartiger Wasserstoffe stellen die Amidwasserstoffe dar, die sich am Protein- oder Peptid-Rückgrat finden. Der Austausch dieser Wasserstoffe, wie er hier beschrieben wird, wird als „Amidwasserstoff-Austausch" bezeichnet. Eine weitere Kategorie umfasst Wasserstoffe, die an einen beliebigen Kohlenstoff der Aminosäuren gebunden sind, die das Protein bilden, einschließlich des Rückgrats und der Seitenketten, und die temporär unter spezifischen experimentellen Bedingungen labil gemacht werden können. Der Austausch dieser Wasserstoffe, wie er hier beschrieben wird, wird als „Alkylwasserstoff-Austausch" bezeichnet.
„Bendingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs": bezieht sich auf Bedingungen, unter denen die Geschwindigkeit des Austauschs von labilem Wasserstoff an Atomen von Resten, die für das Lösemittel frei zugänglich sind, beträchtlich vermindert ist, d. h. in genügendem Ausmaß, dass die verschiedenen Manipulationen durchgeführt werden können, die zur Handhabung der Proben erforderlich sind, ohne dass es dabei zu einem nicht annehmbaren Verlust von Lösemittel-exponierten labilen Wasserstoffen kommt.
Die Bedingungen eines verlangsamten Alkylwasserstoff-Austauschs werden leicht, auf nahezu triviale Weise erreicht, da ein Alkylwasserstoff-Austausch nur erfolgt, wenn bestimmte experimentelle Bedingungen ihn temporär induzieren.
Der Amidwasserstoff-Austausch dagegen erfolgt in einem gewissen Umfang immer, und zwar mit einer Geschwindigkeit, die eine Funktion von Faktoren ist, zu denen die Temperatur, der pH und die Zusammensetzung des Lösemittels gehören. Die Geschwindigkeit wird für jeweils 10°C Temperaturabnahme auf ein Drittel erniedrigt. Deshalb wird der Einsatz von Temperaturen um 0°C bevorzugt. In Wasser liegt die niedrigste Geschwindigkeit des Amidwasserstoff-Austauschs bei pH 2–3. Wenn sich die Bedingungen vom optimalen pH weg bewegen, dann steigt die Geschwindigkeit des Amidwasserstoff-Austauschs typischerweise um einen Faktor von 10 bei einer Zunahme oder Abnahme gegenüber dem Minimum um eine pH-Einheit. Der Einsatz hoher Konzentrationen eines polaren organischen Co-Lösemittels verschiebt das pH-Minimum zu einem höheren pH, potenziell zu einem pH von bis zu 6 oder vielleicht, mit dem richtigen Lösemittel, sogar noch höher.
Typischerweise liegt bei pH 2,7 und 0°C, um ein Beispiel zu nennen, die Halbwertszeit einer Tritium- oder Deuterium-Markierung in einer Amidposition, die frei für das Lösemittel Wasser zugänglich ist, bei ungefähr 70 Minuten. Vorzugsweise führen die verlangsamten Bedingungen der vorliegenden Erfindungen zu einer Halbwertszeit für einen frei zugänglichen Amidwasserstoff von wenigstens 10 Minuten, bevorzugter von wenigstens 60 Minuten.
4. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
4.1 EINLEITUNG
Viele biologische Prozesse werden über nicht-kovalente Bindungswechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden vermittelt. Die Identifizierung der strukturellen Züge des Rezeptors und des Liganden, die unmittelbar zu diesen Bindungswechselwirkungen beitragen, wäre, unter anderem, für das Verständnis der Mechanismen nützlich, über die Arzneimittel an Rezeptoren binden und sie aktivieren, und für die Konstruktion oder Identifizierung von Arzneimitteln, die diese Prozesse verändern.
Wenn sowohl der Rezeptor als auch der Ligand ein Protein ist, dann können zur Bindungsstelle des Paares unter Umständen dreißig Aminosäurereste auf dem Rezeptor und eine gleiche Zahl auf dem Liganden gehören. Diese Reste stellen die „Bindungsoberflächen" der jeweiligen Partner des Paares dar. Allerdings tragen die einzelnen Aminosäurereste der jeweiligen Bindungsoberflächen nicht notwendigerweise gleich stark zur freien Bindungsenergie des Komplexes bei. Nach den Studien von Wells und anderen, die im Hintergrund-Abschnitt diskutiert wurden, wird die Bindung manchmal und möglicherweise generell über komplementäre „Hot-Spot"-Bereiche einer kleinen Zahl von Aminosäureresten auf den Bindungsoberflächen eines jeden Bindungspartners vermittelt. Jeder dieser „Hot-Spot"-Reste leistet einen signifikanten Beitrag zur freien Bindungsenergie, und in der Summe können diese relativ wenigen Reste bis zu 40–50% der freien Bindungsenergie des Komplexes beitragen. Die Hot-Spot-Reste sind von Resten umgeben, die in geringerem Ausmaß zur freien Bindungsenergie beitragen, und diese Reste sind wiederum von Resten umgeben, die noch weniger beitragen.
Der Begriff „Hot-Spot-Rest", wie er hier verwendet wird, soll diejenigen Reste einer Bindungsoberfläche eines Rezeptors oder Liganden einschließen, die einzeln wenigstens ungefähr 10% der gesamten freien Bindungsenergie des Rezeptor-Liganden-Komplexes beitragen. Vorzugsweise trägt jeder Hot-Spot-Rest ungefähr 20 bis 30%, oder sogar mehr, zur freien Bindungsenergie bei. Insgesamt stellen die Hot-Spot-Reste einen Bindungs-Hot-Spot für den Rezeptor oder Liganden dar. Jede Bindungsoberfläche kann einen einzelnen Hot-Spot aufweisen, oder sie kann multiple, zusammenhängende oder nicht-zusammenhängende Hot-Spots aufweisen.
Im Allgemeinen machen die Hot-Spot-Reste insgesamt wenigstens ungefähr 30%, vorzugsweise ungefähr 40%, und sogar noch bevorzugter 50% oder mehr der gesamten freien Bindungsenergie des Rezeptor-Liganden-Komplexes aus.
Fachleuten auf diesem Gebiet ist klar, dass in vielen Fällen ein Ligand für einen Rezeptor ein kleines Polypeptid oder sogar ein kleines organisches Molekül sein kann. In diesen Situationen kann es sein, dass der Rezeptor und/oder der Ligand keine „Bindungsoberfläche" hat. Tatsächlich könnten in vielen dieser Fälle, insbesondere denjenigen, bei denen Liganden aus kleinen Molekülen beteiligt sind, nur relativ wenige Aminosäurereste des Rezeptors mit dem Liganden in Wechselwirkung treten. Trotzdem sind in diesen Fällen trotz des Fehlens einer echten „Bindungsoberfläche" die Hot-Spot-Reste des Rezeptors und/oder Liganden wie oben definiert.
Die Hot-Spot-Reste für den interessierenden Bindungspartner, der entweder der Rezeptor, der Ligand oder beides sein kann, werden gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren über die Bestimmung der Geschwindigkeiten des Wasserstoff-Austauschs der individuellen labilen Wasserstoffe des Partners sowohl im gebundenen als auch im nicht gebundenen Zustand und über die Korrelation dieser gemessenen Austauschgeschwindigkeiten mit den Beiträgen zur freien Bindungsenergie des Rezeptor-Liganden-Komplexes identifiziert. Da die Austauschgeschwindigkeiten für einen nativen Rezeptor und/oder nativen Liganden unter nativen, biologisch relevanten Bedingungen bezüglich des Puffers gemessen werden können, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zum ersten Mal die Identifizierung von Hot-Spot-Resten eines nativen Rezeptors oder nativen Liganden in seiner biologisch relevanten Konformation.
Ein Wasserstoff-Austausch spiegelt die Tatsache wider, dass viele Wasserstoffe in einem Makromolekül mit Wasserstoffen in wässerigen Lösemitteln austauschen. Saure Wasserstoffe (O-H, N-H, S-H) tauschen unter nahezu allen physikalischen und chemischen Bedingungen mit Wasserstoffen wässeriger Lösemittel aus. Die meisten sauren Wasserstoffe tauschen zu schnell mit Lösemittelwasserstoffen aus, als dass sie experimentell nützlich wären. Im Gegensatz dazu tauschen die langsamer austauschenden Peptidamidwasserstoffe so langsam aus, dass man den Austausch verfolgen und messen kann. Wenn sie in einer Polypeptidkette enthalten ist, dann enthält jede Aminosäure, unabhängig davon, ob sie durch ein Gen codiert wird oder nicht, einen Wasserstoff einer Peptidamidbindung, mit Ausnahme von Prolin. Alkylwasserstoffe (C-N) tauschen fast nie mit Wasserstoffen wässeriger Lösemittel aus, außer unter speziellen Bedingungen und nur, solange diese Bedingungen bestehen. Ein Alkylwasserstoff-Austausch kann durch die Verwendung von Mitteln, die freie Radikale erzeugen, einschließlich einer Bestrahlung, induziert wären.
Die für einen bestimmten labilen Wasserstoff eines Polypeptids ermittelte Austauschgeschwindigkeit steht in direkter Beziehung zur Leichtigkeit, mit der das Lösemittel Wasser in die enge (atomare) Nähe des betreffenden Wasserstoff gelangen kann, was wiederum abhängig vom Bereich des Polypeptids ist, der den labilen Wasserstoff enthält. Somit ermöglicht die Messung der Austauschgeschwindigkeiten eines labilen Wasserstoffs, dass diese Wasserstoffe als „Sensoren" oder „Reporter" für Veränderungen in der lokalen Umgebung, die jedes einzelne labile Wasserstoffatom umgibt, verwendet werden können. Zum Beispiel ist in einem System, in dem sich ein Protein in einem von zwei allosterischen Zuständen befinden kann, die Veränderung der freien Energie der lokalen Umgebung eines, bestimmten labilen Wasserstoffs, wenn das Protein zwischen den beiden allosterischen Zuständen hin- und herwechselt, durch die folgende Formel gegeben: ΔΔGi = –RT In(ki1/ki2) Gleichung (I)wobei ΔΔG_i die Veränderung der freien Energie in der Umgebung des i-ten labilen Wasserstoffs ist, wenn das Protein aus dem allosterischen Zustand 1 in den allosterischen Zustand 2 wechselt; R ist die universelle Gaskonstante; T ist die absolute Temperatur des Proteins; In ist der natürliche Logarithmus; k_i1 ist die Geschwindigkeitskonstante des Austauschs für den i-ten labilen Wasserstoff im Peptid im allosterischen Zustand 1; und k_i2 ist die Geschwindigkeitskonstante des Austauschs für den i-ten labilen Wasserstoff im Peptid im allosterischen Zustand 2 (siehe z. B. Englander & Englander, 1994, Meth. Enzymol. 232: 26–42; Bai et al., 1995, Meth. Enzymol. 259: 344–356).
Die atomaren und molekularen Kräfte, die die Polypeptidfaltung und Konformationsänderungen bestimmen, sind dieselben wie diejenigen, die bestimmen, wie zwei unterschiedliche Proteine aneinander binden. Die Bindungsoberflächen zwischen Rezeptor und Ligand sind den Querschnitten durch ein einziges gefaltetes Protein vergleichbar, mit hydrophoben Resten auf der Innenseite und hydrophilen Resten auf der Außenseite. Die Bindungsoberfläche zwischen Rezeptor und Ligand wird durch Hot-Spot-Reste zusammengehalten. Um diese Hot-Spots herum öffnet sich die Bindungsoberfläche vorübergehend an bestimmten Orten, wodurch Teile der Oberfläche dem Lösemittel ausgesetzt werden. Die unterschiedlichen Schutzfaktoren für die verschiedenen Kontaktreste spiegeln ihre unterschiedliche Zugänglichkeit für das Lösemittel Wasser in der flexiblen Rezeptor-Liganden-Oberfläche wider.
Neben dem eben Gesagten besteht eine ähnliche Beziehung bezüglich der lokalen Veränderungen der freien Energie nach der Bildung eines Rezeptor-Liganden-Komplexes. In diesem Falle spiegelt das Verhältnis der Austauschgeschwindigkeiten des Wasserstoffs im gebundenen und im nicht gebundenen Zustand für einen bestimmten labilen Wasserstoff, oder der „Schutzfaktor" für diesen labilen Wasserstoff, das Ausmaß der Austauschverlangsamung wider, die dieser labile Wasserstoff bei der Bildung des Rezeptor-Liganden-Komplexes erfuhr. Der Schutzfaktor steht in Beziehung zur Veränderung der freien Energie zwischen dem gebundenen und dem nicht gebundenen Zustand in der Position dieses labilen Wasserstoffs im Rezeptor oder Liganden gemäß Gleichung (II): ΔΔGi = –RT In(PF) Gleichung (II)wobei ΔΔG_i die Veränderung der freien Energie in der Umgebung des i-ten labilen Wasserstoffs nach der Bildung des Rezeptor-Liganden-Komplexes ist; „PF" oder „Schutzfaktor" (protecfion factor) ist das Verhältnis der Austauschgeschwindigkeiten für den i-ten labilen Wasserstoff im Peptid im gebundenen und im nicht gebundenen Zustand; und die anderen Terme sind die gleichen wie in der Gleichung (I).
Die Gleichung (II) ermöglicht es, den Beitrag der freien Energie eines jeden Restes des Rezeptors zur gesamten freien Bindungsenergie zu bestimmen. Wenn jeder Aminosäurerest einer Bindungsoberfläche eines Rezeptors auf die gleiche Weise zur Ligandenbindung beiträgt (und umgekehrt), dann würden die labilen Wasserstoffe in jedem Rest der Bindungsoberfläche nach einer Bindung des Liganden den gleichen Schutzfaktoren ausgesetzt sein. Wenn jedoch bestimmte Reste einer Bindungsoberfläche wichtiger als andere für die Bindung sind, dann sind die Schutzfaktoren nicht für jeden Rest gleich, und die labilen Wasserstoffe an den Resten, die mehr beitragen, haben Schutzfaktoren, die über dem Durchschnitt liegen. Diejenigen Reste mit Schutzfaktoren, die für die Reste innerhalb der Bindungsoberfläche größer als der Durchschnitt pro Rest sind, sind die Hot-Spot-Reste dieser Erfindung.
Im Gegensatz zur Entfaltung eines Polypeptids kann ein Paar aus einem Rezeptor und einem Liganden vollständig dissoziieren. Als Konsequenz davon ist der Zeitanteil, für den der Rezeptor und der Ligand als Komplex vorliegen, eine Funktion ihrer Konzentrationen in der Lösung. Im Gegensatz dazu sind das Faltungsverhalten und die daraus resultierenden Aus- tauschgeschwindigkeiten der labilen Wasserstoffe eines einzigen Polypeptids im Wesentlichen unabhängig von der Konzentration des Polypeptids. Das Dissoziationsverhalten eines Rezeptor-Liganden-Komplexes bestimmt eine obere Grenze für den maximalen Schutzfaktor, der mittels der Wasserstoff-Austauschtechnik gemessen werden kann. Unter der Annahme äquimolarer Mengen an Rezeptor und Ligand in einem monovalenten Rezeptor-Liganden-Komplex wird der maximale messbare Schutzfaktor durch die Gleichung (III) gegeben: MPF = ([R–L]/Kd)1/2 Gleichung (III)wobei MPF der maximale Schutzfaktor (maximum protection factor) ist; [R-L] ist die Konzentration des Rezeptor-Liganden-Komplexes; und K_d ist die Dissoziationskonstante des Rezeptor-Liganden-Komplexes (Mayne et al., Biochemistry 31: 10678–10685, 1992; Paterson et al., Science 249: 755–759, 1990). Alle Schutzfaktoren in einer Bindungsoberfläche, die über dem MPF liegen, werden als gleich dem MPF-Wert bestimmt. Unter den Bedingungen, die üblicherweise bei dieser Technik eingesetzt werden, liegt der maximale Schutzfaktor, der in einem Bindungswechselwirkungssystem mit einer K_d von 1 × 10^–9 messbar ist, bei 316; in einem System mit einer K_d von 1 × 10^–8 ist der MPF-Wert 100, und in einem System mit einer K_d von 1 × 10^–7 ist der MPF-Wert 31. Wenn die Affinitätswechselwirkung zu gering ist, dann können Hot-Spot-Reste nicht von weniger energetischen Bereichen auf der Bindungsoberfläche unterschieden werden. Für eine Wechselwirkung mit niedriger Affinität sollte die Konzentration des Rezeptors und des Liganden so hoch wie möglich sein. Außerdem sind viele biologische Wechselwirkungen niedriger Affinität multivalent, wodurch der MPF-Wert des Systems erhöht wird.
Somit werden gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren Hot-Spot-Reste für einen oder für beide Partner eines jeweiligen Paares aus Rezeptor und Ligand durch das Ableiten der Schutzfaktoren für jeden der einzelnen Aminosäurereste identifiziert, die den jeweiligen Rezeptor- oder Liganden-bindenden Partner ausmachen, und das Identifizieren derjenigen, die die erforderliche Menge zur gesamten freien Bindungsenergie gemäß Gleichung (II) beitragen.
Wie aus der obigen Diskussion klar sein wird, beruhen die erfindungsgemäßen Verfahren auf der Erkenntnis, dass die Austauschgeschwindigkeiten von labilen Wasserstoffen in einem Polypeptid als empfindliche Reporter oder Sensoren lokaler Veränderungen in der Umgebung, die den jeweiligen labilen Wasserstoff umgibt, dienen, und dass diejenigen labilen Wasserstoffe, bei denen es bei der Bildung eines Rezeptor-Liganden-Komplexes zu den größten Veränderungen der Austauschgeschwindigkeiten kommt, in einem Bereich des bindenden Partners liegen, der thermodynamisch signifikanter für die gesamte Bindungswechselwirkung ist als andere. In diesem Sinne kann die Markierung „differenzielle Markierung" genannt werden, da das Ausmaß der Markierung einer bestimmten Stelle von ihrer exponierten (für das Lösemittel zugänglichen) Oberfläche abhängt. So wird zwar der Ausdruck „Hot-Spot-Rest" im gesamten Text verwendet, um diejenigen Aminosäurereste in einem Rezeptor oder Liganden zu bezeichnen, dessen labiler Wasserstoff bei der Bildung eines Rezeptor-Liganden-Komplexes bezüglich seiner Austauschgeschwindigkeit eine gewisse Veränderung erfahren hat, aber der Ausdruck soll nicht implizieren, dass der jeweilige labile Wasserstoff selbst, oder die Seitenkette dieses Restes, notwendigerweise in die Bindungswechselwirkung involviert ist. Der Ausdruck wird lediglich der Einfachheit halber verwendet, um diejenigen Reste innerhalb der primären Aminosäuresequenz des Rezeptors oder Liganden anzugeben, die in Bereichen des Rezeptors oder Liganden liegen, die sich in enger Nachbarschaft zu thermodynamisch signifikanten Bindungswechselwirkungen befinden.
Zur Bestimmung der Schutzfaktoren der einzelnen labilen Wasserstoffe des interessierenden Partners müssen die Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen labilen Wasserstoffe des Partners sowohl im gebundenen als auch im nicht gebundenen Zustand bestimmt werden.
Zusammenfassend erfordert die Messung von Austauschgeschwindigkeiten für Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden und von Schutzfaktoren für labile Wasserstoffe und somit die Ableitung von Bindungs-Hot-Spots:

1. Eine initiale differenzielle Markierung über einen Austausch des Wasserstoffs des Rezeptors und des Liganden in labilen Positionen gegen schwere Wasserstoffisotopen sowohl im gebundenen als auch im nicht gebundenen Zustand.
2. Eine Lokalisation und Quantifizierung der Markierung mit dem schweren Wasserstoff, die am Rezeptor und am Liganden angebracht wurde, sowohl im gebundenen als auch im nicht gebundenen Zustand.

Die oben genannten Schritte einer differenziellen Markierung und nachfolgenden Lokalisation und Quantifizierung können bei Einsatz geeigneter experimenteller Techniken entweder auf Amidwasserstoffe oder auf Alkylwasserstoffe ausgerichtet sein.
4.1 Differentielle Wasserstoff-Austauschmarkierung dPC Rezeptors und/oder Liganden
4.1.1 Amidwasserstoffe im nicht gebundenen Zustand
Für den nicht gebundenen Zustand können die Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen Amidwasserstoffe während des Austrittsaustauschs oder des Eintrittsaustauschs, oder den Eintrittsaustausch gefolgt vom Austrittsaustausch, von schwerem Wasserstoff mittels verschiedener Techniken gemessen werden. Zum Beispiel können Austauschgeschwindigkeiten bequem während des Eintrittsaustauschs mittels herkömmlicher Techniken der magnetischen Kernresonanzspektroskopie (NMR) gemessen werden, beispielsweise mittels der Techniken, die in Cavanaugh et al., 1996, Protein NMR Spectroscopy Principles and Practice, Academic Press, New York; New York, beschrieben wurden. In einem derartigen Experiment wird der Partner mit einer Lösung von Deuterium oder Tritium („schwerem Wasserstoff"), vorzugsweise von Deuterium, unter nativen Bedingungen (typischerweise physiologischen Bedingungen bezüglich Temperatur, pH, Ionenstärke und Puffer) in Kontakt gebracht, und die Geschwindigkeit der Auslöschung der Resonanzen des Amidwasserstoffs wird mittels ¹H-NMR verfolgt. Alternativ kann der Partner zeitabhängig einem Eintrittsaustausch unterzogen werden, und die Mengen und Lokalisationen der Markierung können mittels der im Folgenden beschriebenen Methode bestimmt werden.,
Für Messungen während des Austrittsaustauschs muss der Partner zunächst mit Deuterium oder Tritium markiert (einem Eintrittsaustausch unterzogen) werden, indem der Partner mit einer Lösung von schwerem Wasserstoff unter den gewünschten Bedingungen bezüglich des Puffers, vorzugsweise unter Bedingungen, bei denen der Rezeptor seine native Konformation annimmt, beispielsweise physiologischen Bedingungen bezüglich Temperatur, pH, Ionenstärke und der Gegenwart von Puffersalzen, in Kontakt gebracht wird. Während dieses Inkubationszeitraums tauschen schwere Wasserstoffe aus dem Lösemittel mit Amidwasserstoften des Peptids, die für das Lösemittel zugänglich sind, aus, wodurch sie einen Eintrittsaustausch in Peptidreste Lösemittel-zugänglicher Teile des Partners, zu denen unter anderem die Peptidreste auf der Bindungsoberfläche des Partners gehören, durchlaufen.
Bei einigen Ausführungsformen wird der Partner einem Eintrittsaustausch über einen Zeitraum unterzogen, der ausreicht, den Partner mit schwerem Wasserstoff zu sättigen, d. h. für einen Zeitraum, der ausreicht, wenigstens ungefähr 90%, und vorzugsweise ungefähr 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder sogar mehr der Amidwasserstoffe mit schwerem Wasserstoff zu sättigen. Typischerweise reichen Zeiträume für den Eintrittsaustausch in der Größenordnung von wenigen Stunden bis 24 Stunden aus, wenn der Austausch bei Raumtemperatur oder physiologischen Temperaturen und in physiologischem Puffer und bei physiologischem pH (beispielsweise 0,15 mM NaCl, 10 mM PO₄, pH 7,4; „PBS") durchgeführt wird, den Partner mit der Markierung zu sättigen. Die Bestimmung einer geeigneten Dauer für den Eintrittsaustausch stellt für einen Fachmann keine Schwierigkeit dar. Vorzugsweise wird der Eintrittsaustausch in kleinen Inkubationsvolumina (0,1–10 μl) und mit hohen Konzentrationen des Partners (10–100 mg/ml) durchgeführt. Jedoch wird in anderen Ausführungsformen der Partner, wie unten detaillierter diskutiert werden wird, zeitabhängig einem Eintrittsaustausch unterzogen, typischerweise dadurch, dass der Partner in eine Vielzahl von Aliquots aufgeteilt wird und der Partner in jedem Aliquot für einen unterschiedlichen Zeitraum einem Eintrittsaustausch unterzogen wird, oder indem aus einer Probe für den Eintrittsaustausch nach festgelegten Zeiträumen Aliquots entnommen werden.
Der dem Eintrittsaustausch unterzogene Partner wird dann mit einer Lösung mit normalem Wasserstoff unter den gleichen Bedingungen bezüglich der Temperatur, des pH, der Ionenstärke und der Puffersalze, die für den Eintrittsaustausch verwendet wurden, in Kontakt gebracht. Schwere Wasserstoffe in Lösemittel-zugänglichen Bereichen des markierten Partners tauschen mit normalen Wasserstoffen im Lösemittel aus, wodurch sie einen Austrittsaustausch aus den Resten des Partners durchlaufen, und zwar mit Geschwindigkeiten, die von der Zugänglichkeit der Reste für das Lösemittel abhängen.
Die Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen Amidwasserstoffe während des Austrittsaustauschs werden mittels eines beliebigen einer Vielzahl von Techniken, die dafür , zur Verfügung stehen, gemessen. Zum Beispiel können, wenn der Rezeptor oder der Ligand mit Tritium markiert ist, die Geschwindigkeiten der Auslöschung der ³N-NMR-Signale verfolgt und mit den Austauschgeschwindigkeiten des labilen Wasserstoffs wie zuvor beschrieben korreliert werden. Umgekehrt können die Geschwindigkeiten des Aufbaus von ³H-NMR-Signalen verfolgt werden. Ähnliche Messungen könnten mit einem Deuterium-markierten Rezeptor oder Liganden durchgeführt werden.
Alternativ können die Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen Amidwasserstoffe durch die Quantifizierung der Menge an schwerem Wasserstoff in jedem Rest im markierten Partner als Funktion der Dauer des Austrittsaustauschs bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform wird der Rezeptor zuerst einem Eintrittsaustausch bis zur Sättigung unterzogen, wie oben beschrieben wurde, und dann zeitabhängig einem Austrittsaustausch, typischerweise, indem der dem Eintrittsaustausch unterzogene Partner in eine Vielzahl von Aliquots aufgeteilt wird und jedes Aliquot für eine unterschiedliche Zeit einem Austrittsaustausch unterzogen wird, oder indem zu bestimmten Zeitpunkten Aliquots aus einem Partner, der einem Austrittsaustausch unterzogen wurde, entnommen werden. Typische Zeitpunkte sind 1, 10, 100, 10³, 104 Sekunden etc.. Natürlich können die tatsächlich eingesetzten Zeiten variieren, und sie können für jedes untersuchte System experimentell bestimmt werden.
Der Austrittsaustausch wird durch die Änderung der Pufferbedingungen der Aliquots zu Bedingungen eines langsamen Amidwasserstoff-Austauschs gestoppt, d. h. beispielsweise pH 2,7 und 0°C. Dann werden die Lokalisationen und Mengen der schweren Wasserstoffe für jeden Partner in jedem Aliquot (für jeden Zeitpunkt) bestimmt, und diese Daten werden mittels mathematischer Standardtechniken analysiert, um die Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen labilen Wasserstoffe des Partners zu erhalten.
4.1.2 Markierung durch Alkylwasserstoff-Austausch im nicht gebunden Zustand
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der untersuchte Wasserstoff ein Alkylwasserstoff sein, der vorübergehend labil gemacht wurde durch einen über freie Radikale vermittelten Austausch mit Kohlenstoff-gebundenen Wasserstoffen innerhalb jedes beliebigen Abschnitts der Seitenkette oder des Rückgrats eines beliebigen Aminosäurerests im Rezeptor oder im Liganden. Der Mechanismus, über den ein Austausch derartiger Wasserstoffe erreicht wird, ist komplizierter als der durch Säure (H⁺) oder Base (OH^-) katalysierte Amidaustausch der oben beschrieben wurde. Es ist erforderlich, einen potenten Wasserstoffabstraktor in situ zu erzeugen, um transient Wasserstoffe von den Kohlenstoffatomen des Rezeptors zu „entfernen". Es ist ebenfalls notwendig, sicher zu stellen, dass eine Quelle für schweren Wasserstoff (typischerweise schweres Wasser) und ein Austauschkatalysator, der den abstrahierten Wasserstoff (unter Verwendung von schwerem Wasserstoff des Lösemittels) ersetzen und letztlich den Proteinrest, dessen Wasserstoff entfernt worden war, reparieren kann, vorhanden ist.
Bei der bevorzugten Ausführungsform ist der Abstraktor des Wasserstoffatoms das Hydroxylradikal, und dieses wird in situ durch den temporären Einsatz einer Radiolyse, z. B. über γ-Strahlen von ¹³⁷Cs, erzeugt. (Siehe beispielsweise M. B. Goshe, „Hydroxyl Radical Induced Hydrogen/Deuterium Exchange: Identification of Amino Acid Residues Involved in Peptide Protein Interactions", Doktorarbeit, Case Western Reserve University, Ohio, 1999; M. B. Goshe and V. E. Anderson, „Hydroxyl Radical-Induced Hydrogen/Deuterium Exchange in Amino Acid Carbon-Hydrogen Bonds", Radiation Research 151: 50–58, (1999); M. B. Goshe and V. E. Anderson, „Examining Hydroxyl Radical Induced Hydrogen/Deuterium Exchange Into Peptides: Identification of Isotopically Modified Amino Acid Residues Using ESI-MS", American Society for Mass Spectrometry, Annual Meeting, 1998). Dieser Mechanismus kann als solcher bezüglich der Bestrahlungsdauer (Umfang oder Geschwindigkeit der Erzeugung der Hydroxylradikale), bezüglich Austausch-Förderern (Dithiothreitol, siehe unten) und bezüglich Faktoren, die Nebenreaktionen minimieren (Distickstoffoxid), fein gesteuert werden. Die Menge des Rezeptors oder Liganden und das Ausmaß der Bestrahlung müssen so titriert werden, dass eine Menge an Produkt mit ausgetauschtem Wasserstoff erzeugt wird, die ausreicht, ein Signal hervor zu rufen, das in einem Massenspektrometer messbar ist. In der Praxis wird für jede interessierende Probe eine Titrationsstudie mit begrenztem Ausprobieren benötigt. Vor der Bestrahlung wird gelöster Sauerstoff durch das Durchblubbern von Distickstoffoxidgas aus der Lösung entfernt. Distickstoffoxid erfüllt insofern einen doppelten Zweck, als es auch freie Elektronen abfängt, die aus der Bestrahlung resultieren. Bei der Radiolyse, oder über andere Verfahren, werden Hydroxylradikale in einer Konzentration von typischerweise 10 mM erzeugt. Die gebildeten Hydroxylradikale sind hoch reaktiv und abstrahieren ein Wasserstoffatom von der nächstliegenden Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung, mit der sie auf atomarer Ebene (innerhalb eines van-der-Waals-Radius) in Kontakt kommen können. In der Praxis sind diese Bindungen vorwiegend diejenigen, die in den Aminosäureresten vorliegen, wenn sie für das Lösemittel zugänglich sind. Wenn ein Wasserstoffatom entfernt worden ist, bleibt ein Kohlenstoff-zentriertes Radikal zurück. Um sicher zu stellen, dass die offene Bindungsstelle dieses Kohlenstoffs durch einen schweren Wasserstoff ersetzt wird, liegt bzw. liegen der Rezeptor und/oder der Ligand zum Zeitpunkt der Bestrahlung in einer Lösung vor, die stark mit schwerem Wasserstoff in Form von Wasser angereichert ist. Weiterhin ist gleichzeitig ein Donor für schweren Wasserstoff, beispielsweise Dithiothreitol (DTT), in der Lösung vorhanden, wo er letztlich die Austauschreaktion katalysiert. Wenn DTT verwendet wird, sollte der pH der Lösung unter 9,0 liegen. Aufgrund des Wunsches, die größtmögliche Menge an mit schwerem Wasserstoff ausgetauschtem Produkt zu erhalten, sollte das schwere Wasser in einer hohen Konzentration vorliegen, und zwar in einem molaren Anteil von bis zu 80 Molprozent für Deuterium und in einer spezifischen Aktivität von 50–100 Curie/ml für tritiiertes Wasser. Sobald es zu einem Austausch gekommen ist, der eine nachfolgende Messung ermöglicht, wird die Bestrahlung beendet, wodurch weitere Austausche und unerwünschte Nebenreaktionen gestoppt werden.
Bei dem Austausch des Amidwasserstoffs kann das Markieren des Rezeptors und/oder Liganden über einen Eintritts- und einen Austrittsaustausch entweder einzeln oder nacheinander experimentell nützlich sein. Jedoch ist nur ein Eintrittsaustausch in Puffern, die schweren Wasserstoff enthalten, bei einer Markierung durch Alkylwasserstoff-Austausch nützlich. Das liegt daran, dass angenommen wird, dass die experimentelle Effizienz des Alkylaustauschs beträchtlich geringer ist als diejenige des Amidaustauschs, und dass die Signale des schweren Wasserstoffs, die nach einem aufeinanderfolgenden Eintritts- und Austrittsaustausch übrig bleiben, so niedrig wären, dass sie nutzlos wären. Dementsprechend nimmt man, um Austauschgeschwindigkeiten für Alkylwasserstoffe zu erhalten, nur eine zeitlich abgestimmte Reihe von Proben des Rezeptors, die einen Eintrittsaustausch durchlaufen haben.
Während bei der Austauschgeschwindigkeit des Amidwasserstoffs und der Bestimmung des Schutzfaktors die Dauer des Eintrittsaustauschs in der Lösung die kritische unabhängige Variable ist, ist die Bestrahlungszeit die Variable, die für die Bestimmung der Alkylaustauschgeschwindigkeiten und der Schutzfaktoren wichtig ist. Diese Bestrahlungszeiten können nicht unangemessen lang sein, da das Risiko einer Schädigung des Rezeptors und/oder Liganden durch unerwünschte strahlungsinduzierte Reaktionen, wie eine kovalente Vernetzung oder Bildung von Oxidationsaddukten, besteht. (Es gibt, um das Ganze einfach auszudrücken, kein Konzept einer „Sättigungsmarkierung" für den Alkylwasserstoff-Austausch, da die Zeit, die nötig wäre, diese zu erreichen, lang genug ist, um praktisch die Rezeptorstruktur über Nebenreaktionen abzubauen.) Die Bestrahlung wird am besten über einen Zeitraum durchgeführt, der ausreicht, ein verlässliches Signal des schweren Wasserstoffs zu erzeugen, wie anhand von vorläufigen Titrationsexperimenten bestimmt wird. Im Einzelnen kann es erwünscht sein, die Aufmerksamkeit, und somit derartige Titrationsstudien, auf einen bestimmten Wasserstoff eines Restes oder einer Seitenkette zu fokussieren.
Typische Bestrahlungszeiten können eine Folge aus beispielsweise 1 Minute, 10 Minuten und 100 Minuten umfassen. Nach der längsten dieser Zeiten kann der Abbau der Proteinstruktur so schwerwiegend sein, dass man letztlich nur einen unteren Grenzwert bezüglich eines Schutzfaktors erhält. Nach der Bestrahlung wird eine Affinitätschromatographie der Produkte durchgeführt.
4.2 Lokalisierung und Quantifizierung der am Rezeptor oder Liganden angebrachten, ausgetauchten schweren Wassertoffe
Die Lokalisationen und Mengen des schweren Wasserstoffs, der am Rezeptor oder Liganden entweder über einen Amid- oder Alkylaustausch angebracht wurde, können mittels verschiedener Techniken bestimmt werden, wie eines enzymatischen und/oder chemischen Abbaus gefolgt von einer NMR-Analyse oder einer Strahlungsmessung oder von Massenspektrometrie.
Im Falle von Amidwasserstoften ist dies schwierig, da Amidwasserstoffe so labil sind, dass sie unter vielen Bedingungen miteinander austauschen. Demnach muss der Abbau eines Rezeptors oder Liganden, dessen Amidwasserstoffe markiert wurden, so durchgeführt werden, dass die Markierungen sich nicht bewegen. Im Gegensatz dazu sind Alkylwasserstoffe ausreichend unreaktiv (in Abwesenheit von Bedingungen, die zur Erzeugung freier Radikale führen), dass, sobald ein Rezeptor und/oder Ligand durch das Anbringen von schweren Wasserstoffen an den Kohlenstoffatomen markiert worden ist, die markierte Struktur gegen eine weitere Veränderung resistent ist.
4.2.1 Lokalisierung von Amidwasserstoffen durch enzymatischen Abbau
Bei einer Ausführungsform werden die Mengen und Lokalisationen der schweren Wasserstoffe für jedes Aliquot oder jeden Zeitpunkt unter Einsatz der Verfahren des gesteuerten sequenziellen Abbaus bestimmt, die im US-Patent Nr. 5 658 739, der Anmeldung 6 291 189B1, eingereicht am 19. August 1997, und/oder in WO 97/41436 beschrieben wurde.
Es wird, um das Ganze kurz zusammenzufassen, bei dieser Ausführungsform, die für den speziellen Fall des Austauschs von Amidwasserstoff entwickelt wurde, der Partner unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs inkubiert, Bedingungen, die den Partner gegebenenfalls gleichzeitig denaturieren. Der Partner wird dann zu Fragmenten von ungefähr 5–25 Aminosäuren Länge mittels eines beliebigen Verfahrens, das für Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs geeignet ist, gespalten. Zu typischen Verfahren gehören beispielsweise Chemikalien wie. CNBr oder säurestabile proteolytische Enzyme wie Pepsin, Newlase, Aspergillus-Proteasen und Protease-Typ VIII sowie Mischungen davon. Vorzugsweise wird der Partner mit Pepsin fragmentiert (10 mg/ml, kovalent gekoppelt an eine feste Trägermatrix wie Agarose oder Poros^®-Medium (AL-20); bei 0°C, pH 2,7, 0,1–20 min, vorzugsweise 10 min).
Die Fragmente werden dann unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs voneinander getrennt, beispielsweise durch HPLC, und die markierten Fragmente werden identifiziert, typischerweise über Radioaktivitätsmessungen, durch Massenspektrometrie oder durch NMR (in Abhängigkeit von der Markierung), und isoliert.
Jedes isolierte markierte Fragment wird dann sequenziell mit beispielsweise Carboxypeptidasen abgebaut, wiederum unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs, um eine Reihe von Subfragmenten zu erhalten, wobei jedes Subfragment in dieser Reihe um 1–5 Aminosäurereste, vorzugsweise um einen einzigen Aminosäurerest, kürzer ist als das vorhergehende Subfragment. Da jede carboxyterminale Aminosäure des einem Austrittsaustausch unterzogenen Partners sequenziell durch die Carboxypeptidase gespalten wird, wird der Stickstoff, der im intakten Protein das langsam austauschende Amid bildete, in ein schnell austauschendes sekundäres Amin überführt, und jede Markierung an diesem Stickstoff wird vom Protein innerhalb von Sekunden verloren gehen, sogar bei saurem pH. Ein Unterschied zwischen den molaren Mengen der Markierung, die mit beliebigen zwei aufeinander folgenden Subfragmenten assoziiert sind, zeigt an, dass sich eine Markierung an der Amidbindung befindet, und dass sie sich zwischen den beiden Subfragmenten unterscheidet. Die Quantifizierung der Menge der Markierung in jedem markierten Amid, beispielsweise über Messungen der Radioaktivität oder über. eine Massenspektrometrie als Funktion der Dauer des Eintritts- oder Austrittsaustauschs, ergibt die Austauschgeschwindigkeit für jeden Rest der markierten Fragmente. Die Positionen der Reste werden dann mit der primären Aminosäuresequenz des Partners korreliert, um die Austauschgeschwindigkeiten der Amidwasserstoffe des Partners zu erhalten.
Zu bevorzugten säurestabilen Carboxypeptidasen für den kontrollierten sequenziellen Abbau gehören die Carboxypeptidasen P, Y, W und C, wobei die Carboxypeptidase P besonders bevorzugt ist.
4 2.2 Lokalisierung von Amidwasserstoffen durch Massenspektrometrie
Bei einer bevorzugten Ausführungsform verlässt man sich weniger auf einen sequenziellen Abbau durch Peptidasen. Statt dessen erfolgt die Fragmentierung in einem Massenspektrometer. Wenn ein Peptid in einem Massenspektrometer unter Einsatz herkömmlicher Bedingungen fragmentiert wird, dann werden die Amidwasserstoffe typischerweise vermischt, d. h. sie tauschen ihre Positionen mit anderen Amidwasserstoffen im gleichen Peptid aus. Durch die Durchführung spezialisierter Formen der Massenspektrometrie (Massenspektrometrie unter Verwendung von Ionenfallen) und durch das Betreiben des Massenspektrometers unterhalb einer vorher festgelegten Mischschwelle bezüglich der Fragmentierungsenergie kann dieser Austausch vermieden oder minimiert werden. (Siehe beispielsweise Deng Y., Pan N., Smith D. L., „Selective Isotope Labeling Demonstrates That Hydrogen Exchange at Individual Peptide Amide Linkages Can Be Determined by Collision-Induced Dissociation Mass Spectrometry", Journal of the American Chemical Society 121(9): 1966–1967 (1999); D. L. Smith, Y. Dheng und Z. Zhang, „Probing the Non-covalent Structure of Proteins by Amide Hydrogen Exchange and Mass Spectrometry", Journal of Mass Spectrometry 32: 135–146 (1997); D. L. Smith, vorläufige U.S.-Patentanmeldung, „Methods of Quantifying Heavy Hydrogen Levels at Specific Peptide Linkages in Proteins and Peptides", Serien-Nr. 60/113 772, eingereicht am 23.12.1998.
Wenn diese Messung richtig durchgeführt wird, dann besteht das Ergebnis aus der Erzeugung einer Reihe von Subfragmenten, die in ihrer Art den Produkten ähnlich sind, die von Carboxypeptidasen unter Bedingungen erzeugt werden, unter denen sich schwere Wasserstoffe innerhalb der verschiedenen Amidwasserstoffreste im Fragment nicht nennenswert austauschen („Mischen"). Die Gewichte eines jeden Subfragments werden dann im Massenspektrometer bestimmt, was die Identifizierung von Subfragmenten mit daran angebrachten Markierungen aus schwerem Wasserstoff ermöglicht. Derartige Bedingungen können über die Verwendung eines „Ionenfallen"-Massenspektrometers erreicht werden, bei dem die Fragmentierungsenergie sorgfältig gesteuert werden kann. Als Folge davon gibt das resultierende Spektrum genau an, welcher Rest das schwere Wasserstoffatom enthält.
Die Bedingungen eines verlangsamten Austauschs müssen vor dem Eintritt des Peptids in das Massenspektrometer eingesetzt werden. Vor dem Eintritt kann gegebenenfalls eine Fragmentierung des Rezeptors und/oder Liganden mit säurerresistenten Enzymen (Pepsin, Carboxypeptidase etc.) durchgeführt werden. Alternativ kann eine anfängliche Fragmentierung gegebenenfalls über eine Massenspektroskopie unter Einsatz einer „Collision Induced Dissociation" (CID) erzielt werden. Sobald die oben genannte Prozedur für alle Fragmentierungsprodukte, die durch die optionale anfängliche Fragmentierung erhalten wurden, durchgeführt worden ist, kann die Lokalisation der über einen Eintrittsaustausch aufgenommenen schweren Wasserstoffe in der gesamten Peptidsequenz abgeleitet werden. Die Durchführungsprinzipien, die hier beschrieben wurden, können auch mit anderen Typen von Massenspektrometern erreicht werden, wie für einen Fachmann auf diesem Gebiet klar sein dürfte.
4.2.3 Lokalisation von Amidwasserstoffen mittels anderer Verfahren und Zusammenfassung
Alternativ kann der kontrollierte sequenzielle Abbau unter Verwendung von Pentafluorpropionsäureanhydrid (PFPA) in der Dampfphase durchgeführt werden, wie bei Tsugita et al., 1992, Chemistry Letters, Seiten 235–238 und bei Tsugita et al., „Development of Novel C-Terminal Sequencing Methods", in: Methods in Protein Sequence Analysis, S. 55, Imahara & Sakiyma, Hrsg., Plenum Press, New York, New York (1993) beschrieben wurde, außer dass das Protein 3 Stunden bei -35°C gehalten wird. PFPA wird dann im Vakuum abgezogen, das in Subfragmente gespaltene Protein wird auf 50 mM PO₄, pH 7,2 eingestellt und mittels HPLC analysiert.
Fachleuten auf diesem Gebiet wird klar sein, dass in vielen Fällen der Partner ausreichend klein ist, so dass keine Notwendigkeit besteht, ihn vor der gesteuerten sequenziellen Abbaureaktion zu fragmentieren. So werden bei einer alternativen Ausführungsform die ausgetauschten Partner gegebenenfalls unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs denaturiert und sequenziell, wie oben beschrieben, abgebaut. Die Quantifizierung der Menge der Markierung eines jeden Amids als Funktion der Austauschzeit ergibt die Austauschgeschwindigkeiten für jeden Rest des nicht gebundenen Partners.
Die Pufferbedingungen, Proteinkonzentrationen und Reagenzien sowie automatisierte Verfahren zur Durchführung eines jeden der oben beschriebenen Schritte sowie weitere optionale Schritte, die zusammen mit der Erfindung eingesetzt werden können, werden in den U.S.-Patenten Nr. 5 658 739, 6 291 189 B1 oder WO 97/41436 beschrieben.
Alternativ können die Mengen und Lokalisationen der schweren Wasserstoffe für jedes Aliquot oder jeden Zeitpunkt mittels NMR unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs bestimmt werden. Ein Vorteil der NMR-Technik besteht darin, dass der markierte Rezeptor oder Ligand in ein aprotisches Lösemittel gegeben werden kann, das den Wasserstoff-Austausch stark verlangsamt, beispielsweise in Lösungen, die aus mehr als 90% Dimethylsulfoxid (DMSO), Aceton, Chloroform und anderen, ähnlichen organischen Lösemitteln bestehen.
Für diese alternativen Verfahren kann der ganze Rezeptor oder Ligand eingesetzt werden, oder gegebenenfalls kann der Rezeptor oder Ligand zuerst denaturiert und zu kleineren Stücken fragmentiert werden, beispielsweise mit Chemikalien wie CNBr oder säurestabilen proteolytischen Enzymen, und die markierten Fragmente werden, wie zuvor beschrieben, identifiziert und gereinigt, und die Lokalisationen und Mengen der schweren Wasserstoffe innerhalb eines jeden Fragments werden über Radioaktivitätsmessungen (Tritiumaustausch), Massenspektroskopie oder NMR (Deuterium) bestimmt. Es dürfte natürlich klar sein, dass die Denaturierung, Fragmentierung, Reinigung und Analyse unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs durchgeführt werden müssen.
Im Allgemeinen können die oben genannten Techniken zur Lokalisation gemeinsam eingesetzt werden, wenn es gewünscht wird, sobald ein Rezeptor oder Ligand markiert worden ist. Bei einem Ansatz kann eine optionale vorläufige Fragmentierung des markierten Rezeptors oder Liganden erfolgen, wenn das Molekül so groß genug ist, dass das erforderlich ist, gefolgt von einer optionalen chromatografischen Trennung der fragmentierten Produkte. Die Fragmentierungsprodukte können dann ihrerseits einer weiteren Subfragmentierung durch eine Massenspektroskopie unter Einsatz einer kollisionsinduzierten Fragmentierung, gefolgt von einer Untersuchung des resultierenden Spektrums, unterzogen werden.
4.2.4 Lokalisierung von Alkylwasserstoffen
Wie zuvor erwähnt wurde, wird der Prozess der Identifizierung der Positionen von markierten Alkylwasserstoffen durch die Tatsache erleichtert, dass derartige Wasserstoffe nicht von Haus aus labil sind und nicht leicht miteinander austauschen.
Das generelle Prinzip, dass der markierte Rezeptor oder Ligand zu Fragmenten abgebaut wird, die üblicherweise eine handhabbare Zahl von Aminosäureresten aufweisen, kann auf einen vollständigen Abbau zu einzelnen Aminosäuren erweitert werden. Das könnte z. B. eine sequenzielle Lokalisation durch enzymatischen oder chemischen Verdau umfassen. Auf dieser Ebene zielt man darauf ab, die Position des Alkylwasserstoffs innerhalb eines bestimmten Aminosäurerests fest zu legen. Das Prinzip kann noch stärker erweitert werden, um die genaue Lokalisation des schweren Wasserstoffs in der Aminosäure durch einen weiteren Abbau zu „Subfragmenten" durch Massenspektrometrie zu identifizieren.
4.3 Austauschgeschwindigkeiten für den gebundenen Zustand
Als nächstes werden die Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen labilen Wasserstoffe des Partners in dem Zustand, in dem er an einen Bindungspartner gebunden ist, bestimmt. Wie die Austauschgeschwindigkeiten des nicht gebundenen Partners können die Austauschgeschwindigkeiten der labilen Amidwasserstoffe des gebundenen Partners während des Eintrittsaustauschs oder des Austrittsaustauschs oder während des Eintritts- und Austrittsaustauschs nacheinander mittels der zuvor beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Entsprechend können die Austauschgeschwindigkeiten der labilen Alkylwasserstoffe im gebundenen Zustand über den Eintrittsaustausch bestimmt werden.
Sowohl für die Amid- als auch die Alkylwasserstoffe werden die oben genannten Verfahren der Lokalisierung und Quantifizierung für den gebundenen Zustand eingesetzt, um die Zahl der Wasserstoffe, die an interessierenden Resten markiert sind, abzuleiten.
4.3.1 Amidwasserstoff-Austausch im gebundenen Zustand
Im Allgemeinen sind die Bedingungen, die zur Bewirkung eines Amidwasserstoff-Austauschs für gebundene Zustände von Rezeptor-Liganden-Komplexen eingesetzt werden, genau die gleichen wie diejenigen, die für die nicht gebundenen Zustände eingesetzt werden.
Beispielsweise können für den Eintrittsaustausch die Austauschgeschwindigkeiten des Amidwasserstoffs auf einfache Weise über NMR gemessen werden. Bei einer Ausführungsform wird der Partner mit seinem Bindungspartner unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Bindung ermöglichen, wodurch ein Rezeptor-Liganden-Komplex gebildet wird. Der Rezeptor-Liganden-Komplex wird dann mit einer Lösung von schwerem Wasserstoff in Kontakt gebracht, wiederum unter Bedingungen, die eine Bindung ermöglichen, und die Geschwindigkeit der Auslöschung der Resonanzen der einzelnen Amidwasserstoffe wird über ¹H-NMR verfolgt. Da die Amidwasserstoffe an der Bindungsoberfläche des Partners durch die Anwesenheit seiner Bindungspartner für den Zutritt von Lösemittel blockiert sind, tauschen diese Amidwasserstoffe einigermaßen langsam aus und zeigen langlebige ¹H-NMR-Resonanzen.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird der Rezeptor-Liganden-Komplex mit tritiiertem Wasser unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Bindung ermöglichen, und es werden die Aufbaugeschwindigkeiten der Resonanzen der einzelnen Amidwasserstoffe über ³H-NMR verfolgt.
Für Messungen der Austauschgeschwindigkeit während des Austrittsaustauschs wird der Partner zunächst, wie zuvor beschrieben, mit schwerem Wasserstoff markiert. Wieder wird der Partner einem Eintrittsaustausch für einen Zeitraum unterzogen, der ausreicht, den Partner im Wesentlichen zu sättigen. Der markierte Partner wird dann mit seinem Bindungspartner unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Rezeptor-Liganden-Bindung ermöglichen. Nach der Bindung sind die Zugänglichkeiten für Lösemittel derjenigen schweren Wasserstoffe des Partners, die mit dem Bindungspartner in Wechselwirkung treten, durch den gebundenen Partner signifikant verringert. Somit werden die schweren Wasserstoffe des Partners, die mit dem Bindungspartner in Wechselwirkung treten, auf wirksame Weise auf dem Partner „gefangen".
Der Rezeptor-Liganden-Komplex wird dann in Aliquots aufgeteilt, und jedes Aliquot wird mit einer Lösung von normalem Wasserstoff unter den gleichen Bedingungen in Kontakt gebracht, die für die Bildung des Rezeptor-Liganden-Komplexes eingesetzt wurden, und jedes Aliquot wird für einen unterschiedlichen Zeitraum einem Austrittsaustausch ausgesetzt. Während der Inkubation für den Austrittsaustausch durchlaufen die schweren Wasserstoffe in Lösemittel-zugänglichen Bereichen des Rezeptor-Liganden-Komplexes einen Austrittsaustausch aus dem Rezeptor, typischerweise mit der gleichen Geschwindigkeit, mit der sie ursprünglich den Eintrittsaustausch durchliefen.
Die schweren Wasserstoffe, die in die Bindungsoberfläche des Partners inkorporiert wurden, durchlaufen jedoch den Austrittsaustausch mit normalen Wasserstoffen aus dem Lösemittel mit beträchtlich geringerer Geschwindigkeit, da der gebundene Bindungspartner die Zugänglichkeit dieser Reste für das Lösemittel erniedrigt. Der Austrittsaustausch wird wiederum dadurch gestoppt, dass der Rezeptor-Liganden-Komplex Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs ausgesetzt wird, wie zuvor beschrieben wurde.
Typische Zeiträume für den Austrittsaustausch sind 1, 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵ Sekunden etc., aber wiederum können die optimalen Zeitpunkte für ein bestimmtes Bindungspaar leicht empirisch bestimmt werden.
Nach der Inkubation für den Austrittsaustausch lässt man den Rezeptor-Liganden-Komplex eines jeden Aliquots unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs dissoziieren, der gewünschte Bindungspartner wird wiedergewonnen, und die Mengen und Lokalisationen der schweren Wasserstoffe in der Aminosäuresequenz des Partners werden für verschiedene Zeitpunkte des Austrittsaustauschs, wie oben beschrieben, bestimmt. Wiederum werden geeignete Bedingungen für die Durchführung des Austrittsaustauschs sowie optimale Schritte, die zusammen mit den Verfahren eingesetzt werden können, in den U.S.-Patenten Nr. 5 658 739, 6 291 189 B1 und/oder WO 97/41436 beschrieben.
Wenn die Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff des interessierenden Bindungspartners sowohl für den gebundenen als auch den nicht gebundenen Zustand erhalten worden sind, werden die Hot-Spot-Reste für diesen bestimmten Partner gemäß der Gleichung (II) oben identifiziert. Diejenigen Aminosäuren, deren labiler Wasserstoff einen ΔΔG-Wert aufweist, der wenigstens 10–20% der gesamten freien Bindungsenergie des Komplexes ausmacht, sind die Hot-Spot-Reste für diesen bestimmten Bindungspartner.
Zwar können die „Schutzfaktoren" für jeden Rest des interessierenden Bindungspartners gemäß der oben beschriebenen Verfahren bestimmt werden, aber bei bevorzugten Ausführungsformen werden die Reste, die die Bindungsoberflächen des Partners ausmachen, zunächst identifiziert, vorzugsweise unter nativen Bedingungen bezüglich des Puffers, und, es werden lediglich die Schutzfaktoren dieser identifizierten Reste der Bindungsoberfläche bestimmt, um die Hot-Spot-Reste zu identifizieren. Gemäss dieser bevorzugten Ausführungsform können die Aminosäurereste, die die Bindungsoberfläche des Partners ausmachen, mittels eines beliebigen der zur Verfügung stehenden Verfahren bestimmt werden, zu denen die Verfahren gehören, die in den U.S.-Patenten Nr. 5 658 739, 6 291 189 B1 und/oder in WO 97/41436 beschrieben wurden; mittels der Verfahren von Clackson und Wells, 1995, oben, oder aus Strukturinformationen zur dreidimensionalen Struktur des Rezeptor-Liganden-Cokomplexes (falls verfügbar).
Bei einer passenden Ausführungsform werden die Reste der Bindungsoberfläche des Partners mittels der Wasserstoff-Austauschtechnik identifiziert, die im U.S.-Patent Nr. 5 658 739 beschrieben wurde. Während dieses Prozesses wird ein funktionell markierter Partner, der nur an den Resten Markierungen mit schweren Wasserstoffen trägt, die die Bindungsoberfläche darstellen, erzeugt, der funktionell markierte Partner wird fragmentiert, und die markierten Fragmente werden identifiziert und isoliert. Somit werden über die Kartierung der Bindungsoberfläche mittels dieses Verfahrens Bedingungen erhalten, über die Fragmente, die labile Wasserstoffe enthalten, die in der Bindungsoberfläche des Partners liegen, erzeugt und isoliert werden. Die Fragmentierung der dem Eintrittsaustausch oder dem Austrittsaustausch unterzogenen Partner, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter den gleichen wie den Fragmentierungsbedingungen erhalten wurden, gefolgt von einer Reinigung unter den zuvor angegebenen Isolierungsbedingungen ermöglicht es, nur diejenigen Fragmente, die labile Wasserstoffe in der Bindungsoberfläche tragen, selektiv zu isolieren und bezüglich des Ausmaßes der Markierung zu analysieren.
Alternativ können, wenn Informationen zur dreidimensionalen Struktur oder andere Informationen zur Struktur-Funktions-Beziehung vorliegen, die anzeigen, welche Reste die Bindungsoberfläche für den Partner oder den Cokomplex ausmachen, Bedingungen für die selektive Isolierung von Fragmenten, die diese Reste tragen, bestimmt werden, und dann werden nur diese Fragmente aus dem dem Austrittsaustausch unterzogenen Partner isoliert und bezüglich des Ausmaßes der Markierung analysiert.
Wenn der Rezeptor-Liganden-Komplex dissoziiert werden kann, ohne dass die native Struktur des interessierenden Bindungspartners zerstört wird, kann ein funktionell markierter Partner erhalten werden, wie es im U.S.-Patent Nr. 5 658 739 beschrieben wird, und es können die Austauschgeschwindigkeiten der funktionell markierten labilen Wasserstoffe im nicht gebundenen Zustand erhalten werden. Der funktionell markierte Komplex wird zuerst unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs dissoziiert, der gewünschte Bindungspartner wird isoliert, und die Austauschgeschwindigkeiten der labilen Wasserstoffe der funktionell markierten labilen Wasserstoffe werden wie zuvor beschrieben bestimmt. Für die Messung der Austauschgeschwindigkeiten der funktionell markierten labilen Wasserstoffe im gebundenen Zustand wird der funktionell markierte Cokomplex wie zuvor beschrieben analysiert, ohne dass der Komplex zuerst dissoziiert wird.
Es können andere Verfahren zur Messung der Schutzfaktoren lediglich derjenigen labilen Wasserstoffe, die in der Bindungsoberfläche des Partners liegen, zusammen mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
4.3.2 Bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von Schutzfaktoren für den Amidaustausch
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Schutzfaktoren lediglich derjenigen labilen Wasserstoffe, die in der Bindungsoberfläche des Partners liegen, auf einfache Weise in einem einzigen Experiment erhalten. Bei dieser Ausführungsform wird der Partner einem Eintrittsaustausch in Abhängigkeit von der Zeit unterzogen, typischerweise dadurch, dass der Partner in eine Vielzahl von Aliquots aufgeteilt wird und der Partner in jedem Aliquot für unterschiedliche Zeiten einem Eintrittsaustausch unterzogen wird, oder durch das Entfernen von Aliquots des Partners, der dem Eintrittsaustausch unterzogen wird, zu definierten Zeiten. Typische Zeitpunkte für einen Eintrittsaustausch sind 1, 10, 10², 10³, 10⁴ und 10⁵ Sekunden. Es sollten Pufferbedingungen eingesetzt werden, die eine Rezeptor-Liganden-Bindung ermöglichen. Der Partner in jedem Aliquot wird mit seinem Bindungspartner in Kontakt gebracht und zeitabhängig einem Austrittsaustausch unterzogen, typischerweise wieder dadurch, dass er in Aliquots aufgeteilt wird. Jedes Aliquot wird für das 0-, 1-, 10-, 100- oder 10³-Fache des Zeitraums des Eintrittsaustauschs einem Austrittsaustausch unterzogen. Vorzugsweise wird der Partner dadurch mit dem Bindungspartner in Kontakt gebracht, dass er durch, eine Säule geleitet wird, in der der Bindungspartner an einen Träger gebunden ist, beispielsweise Bindungspartner-Sepharose. Nach dem Austrittsaustausch werden die Reaktionen durch das Verändern der Pufferbedingungen zu Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs gestoppt (typischerweise pH 2,7 und 0°C), und die Mengen und Lokalisationen der Markierung werden für den interessierenden Partner wie zuvor beschrieben bestimmt.
Die Durchführung des Experiments auf diese Weise liefert die folgende Ergebnismatrix:
Für jeden labilen Wasserstoff im Partner liefert das Auftragen der Menge der Markierung, die für unterschiedliche Eintrittsaustauschzeiten vorhanden ist, während die Austrittsaustauschzeit konstant gehalten wird, die Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff im nicht gebundenen Zustand. Das Auftragen der Menge der Markierung, die für unterschiedliche Austrittsaustauschzeiten vorhanden ist, während die Eintrittsaustauschzeiten konstant gehalten werden, liefert die Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff im gebundenen Zustand: Die Schutzfaktoren für jeden labilen Wasserstoff sowie deren jeweiliger Beitrag zur freien Bindungsenergie werden wie zuvor beschrieben bestimmt.
Einem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass die Messung von Schutzfaktoren nach diesem bevorzugten Verfahren mehrere Vorteile hat. Erstens liefert die Matrix Datenredundanzen, die es ermöglichen, die Qualität der ermittelten Austauschgeschwindigkeiten zu verfolgen. Die für jeden Zeitpunkt des Austrittsaustauschs erhobenen Daten (d. h. Daten, die für diagonale Elemente der Matrix erhalten wurden) liefern Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff des Partners im nicht gebundenen Zustand. Daten, die für jeden Zeitpunkt des Eintrittsaustauschs erhoben wurden (d. h. Daten, die für Matrixelemente in Säulen erhalten wurden) liefern Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff des Partners im gebundenen Zustand. Anders ausgedrückt liefert jede Diagonale der Matrix Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff des Partners im nicht gebundenen Zustand, und jede Säule der Matrix liefert Austauschgeschwindigkeiten für jeden labilen Wasserstoff des Partners im gebundenen Zustand. Somit können Austauschgeschwindigkeiten in den Säulen und Diagonalen als interne Kontrolle der Qualität der Daten miteinander verglichen werden.
Darüber hinaus ermöglicht es dieser Matrixansatz, die Austauschgeschwindigkeiten labiler Wasserstoffe mit unterschiedlicher Zugänglichkeit für das Lösemittel (und somit Austauschgeschwindigkeiten) exakt zu bestimmen. Wie zuvor diskutiert wurde, gehören die labilen Wasserstoffe in verschiedene Klassen bezüglich ihrer Zugänglichkeit für das Lösemittel: schnell austauschende, langsam austauschende und diejenigen, die dazwischen liegen. Die Austauschgeschwindigkeiten dieser verschiedenen Klassen können aus dem Datenset erhalten werden, das aufgrund der eingeschlossenen Zeitpunkte Daten höchster Qualität für jede Klasse der labilen Wasserstoffe liefert.
Darüber hinaus ermöglicht es der Matrixansatz, lediglich die Schutzfaktoren derjenigen Reste des Partners, die von Bedeutung sind – derjenigen, die in der Bindungsoberfläche liegen – zu bestimmen. Das kann auf bequeme Weise dadurch erreicht werden, dass zunächst ein Zeitpunkt (t₁), der größer als Null ist, für den Austrittsaustausch verwendet wird. Für das Lösemittel zugängliche labile Wasserstoffe, die nicht in der Bindungsoberfläche liegen, tauschen mit den Wasserstoffen des Lösemittels aus und verlieren ihre Markierung während des Zeitraumes, der durch t₀–t₁ definiert ist. Die tatsächliche Zeit, die eingesetzt wird, um diese uninteressanten labilen Wasserstoffe vor der Gewinnung zeitabhängiger Daten für den Austrittsaustausch zu sammeln, kann leicht empirisch bestimmt werden. Typischerweise kann eine Präinkubation für den Austrittsaustausch in der Größenordnung von 1–5, 6, 7, 8, 9 oder sogar 10 Sekunden eingesetzt werden, um selektiv die Markierung durch labile Wasserstoffe zu entfernen, die nicht in der Bindungsoberfläche des Partners sitzen. Durch die Entfernung der Markierung von den sich schnell austauschenden Lösemittel-zugänglichen Wasserstoffen weist dieses Verfahren den zusätzlichen Vorteil auf, dass es die Messung von Schutzfaktoren für interessierende labile Wasserstoffe unter optimalen Bedingungen bezüglich des Signal-Rausch-Verhältnisses ermöglicht. Nur diese labilen interessanten Wasserstoffe werden markiert und somit durch die Nachweis- und Quantifizierungsschritte „gesehen", wodurch das Hintergrundrauschen vermindert wird. In dem zweistufigen Experiment wurden Erhöhungen des Signal-Rausch-Verhältnisses in der Größenordnung von 1000 : 1 erhalten.
Die erfindungsgemäßen Verfahren wurden zwar hinsichtlich der Identifizierung von Hot-Spot-Resten für einen Partner eines interessierenden Rezeptor-Liganden-Paares beschrieben, aber Fachleuten auf diesem Gebiet wird klar sein, dass die Verfahren dazu verwendet werden können, Hot-Spot-Reste sowohl des Liganden als auch des Rezeptors zu bestimmen, entweder in einzelnen Experimenten oder gleichzeitig, solange man sowohl für den Rezeptor als auch für den Liganden die Aminosäuresequenz des Proteins kennt. Somit besteht die einzige Anforderung an das Verfahren darin, dass der Bindungspartner, für den Hot-Spot-Reste gewünscht sind, über einen Wasserstoff-Austausch analysiert werden kann, beispielsweise wenn der Rezeptor oder der Ligand ein Protein mit bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz ist.
Wenn Hot-Spot-Reste sowohl für den Rezeptor als auch für den Liganden gewünscht sind, dann können die Austauschgeschwindigkeiten für die einzelnen labilen Wasserstoffe jedes Bindungspartners auf einfache Weise in einem einzigen Experiment gemessen werden. Beispielsweise können in Fällen, in denen die NMR-Resonanzen für den Rezeptor-Liganden-Komplex für jeden Bindungspartner unterschieden und zugeordnet werden können, die Austauschgeschwindigkeiten für den nicht gebundenen Zustand auf einfache Weise in einem einzigen NMR-Eintrittsaustausch-Experiment gemessen werden.
Alternativ können, wenn die NMR-Resonanzen des Komplexes nicht aufgelöst werden können, die verschiedenen Zeitpunkte des Austrittsaustauschs auf einfache Weise in einem einzigen Experiment über das Inkontaktbringen eines markierten Rezeptors mit einem markierten Liganden unter Bedingungen, die eine Bindung ermöglichen, erhalten werden. Nach dem Stoppen des Austrittsaustauschs kann der Rezeptor-Liganden-Komplex dissoziiert werden und unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoff-Austauschs isoliert werden, und die Austauschgeschwindigkeiten für die labilen Wasserstoffe eines jeden Bindungspartners können wie zuvor beschrieben bestimmt werden.
Vorzugsweise werden die Schutzfaktoren für jeden Partner des Bindungspaares in einem einzigen Experiment unter Verwendung des Datenmatrixansatzes, der oben beschrieben wurde, erhalten.
4.3.3 Alkylwasserstoff-Austausch im gebundenen Zustand
Beim Einsatz ähnlicher Prinzipien wie für den Amidwasserstoff-Austausch ist das Verfahren zur Markierung von Alkylwasserstoffen für gebundene Zustände im Wesentlichen das gleiche wie das, das für den nicht gebundenen Zustand eingesetzt wird. Es muss nur ein Eintrittsaustausch in Puffern, die schweren Wasserstoff enthalten, eingesetzt werden. Um Schutzfaktoren für Alkylwasserstoffe zu erhalten, benötigt man nur eine zeitlich gestaffelte Reihe von Proben des an den Liganden gebundenen Rezeptors, die einen Eintrittsaustausch durchlaufen haben. Aus solchen Messungen werden die Austauschgeschwindigkeiten für die Alkylwasserstoffe des Rezeptors im gebundenen Zustand abgeleitet, und es werden Schutzfaktoren aus dem Verhältnis zwischen dem gebundenen und dem nicht gebundenen Zustand berechnet. Es gelten auch hier die gleichen Vorbehalte bezüglich der Zeiten, für die bestrahlt werden kann, wie sie für den nicht gebundenen Rezeptor oder Liganden angegeben wurden.
Es sollte angemerkt werden, dass in dem Falle, dass der Ligand ein kleines organisches Molekül ist, das an einen Proteinrezeptor gebunden ist, die Austauschmarkierung der Alkylwasserstoffe auf diesem Liganden befindliche Alkylwasserstoffe markieren kann. Eine Amidaustauschmarkierung würde natürlich nur dann im Stande sein, eine direkte Information über die Kontaktbereiche des Liganden zu liefern, wenn der Ligand ein Peptid wäre oder auf sonstige Weise zufällig eine Amidbindung enthielte.
4.3.4 Allgemeine Bedingungen, die für den Wasserstoff-Austausch im gebundenen Zustand eingesetzt werden
Bei den verschiedenen Ausführungsformen des Wasserstoff-Austauschs, die hier beschrieben werden und die eine Messung der Radioaktivität und eine Tritiummarkierung verwenden, hängt das erforderliche Ausmaß der Tritiierung (und somit die Konzentration von Tritium im Puffer) von der Gesamtmenge des Proteins ab, die für die Analyse zur Verfügung steht. Für die Analyse von 1 mg Protein sind wenigstens 10 Ci/ml wünschenswert; für 0,1 mg sind es 100 Ci/ml und für 0,01 mg 1000 Ci/ml (reines tritiiertes H₂O entspricht ungefähr 2500 Ci/ml). Für die meisten Anwendungen hat das tritiierte Wasser 50–500 Ci/ml. Ohne die Verfügbarkeit dieser hohen spezifischen Aktivitäten wären Untersuchungen von Proteinen, die nur in beschränkter Menge zur Verfügung stehen, viel schwieriger. Es kann sogar eine noch höhere spezifische Aktivität (beispielsweise 500–1500 Ci/ml) in der Erfindung eingesetzt werden, aber im Hinblick auf Überlegungen bezüglich des Strahlenschutzes müssen derartige Eintritts- und Austrittsaustauschverfahren in spezialisierten Einrichtungen durchgeführt werden, wie sie im Tritiumlabor zur Verfügung stehen, das von der National Tritium Facility, Lawrence Berkeley Laboratories, Universität von Kalifornien, Berkeley, betrieben wird.
Es sollte angemerkt werden, dass für die üblichen Tritiummengen nur ein kleiner Prozentsatz der bindenden Proteinmoleküle in jeder gegebenen exponierten Position tritiiert ist. Das einzige, was erforderlich ist, ist, dass praktisch alle der exponierten labilen Wasserstoffatome in einer Anzahl von Proteinmolekülen ersetzt sind, die nachgewiesen werden kann (durch Strahlungsmessung).
Für die verschiedenen hier beschriebenen Ausführungsformen, die eine Markierung mit Deuterium einsetzen, wird der Eintrittsaustausch vorzugsweise in 80–99 Molprozent an deuteriertem Wasser durchgeführt, bevorzugter in 98 Molprozent an deuteriertem Wasser. Das deuterierte Wasser kann gegebenenfalls mit beispielsweise 2 Molprozent an tritiiertem Wasser (beispielsweise 50 Ci/ml) supplementiert werden. Dieses modifizierte Verfahren markiert den Bindungspartner sowohl mit Deuterium als auch mit Tritium, so dass entweder Radioaktivitätsmessungen, eine Massenspektrometrie und/oder NMR-Techniken zur Identifizierung und Isolierung markierter Fragmente und/oder zur Lokalisierung und Quantifizierung der Positionen der Markierung in den Polypeptidsequenzen des Partners eingesetzt werden kann bzw. könen. Methoden zur Verwendung von Radioaktivitätsmessungen und massenspektrometrischen Untersuchungen gemäß dieser modifizierten Ausführungsform werden im U.S.-Patent Nr. 5 658 739, 6 291 189 B1 und/oder in WO 97/41436 beschrieben.
4.4 Kombinierter Einsatz von Techniken
Generell sollte angemerkt werden, dass die genannten Schritte miteinander in geeigneter Reihenfolge kombiniert werden können, wenn es passend erscheint. Beispielsweise kann es günstig sein, interessierende Reste (Hot-Spots der Rezeptor-Liganden-Bindung) über eine Amidwasserstoff-Austauschmarkierung zu identifizieren und dann fokussierte Untersuchungen gerade solcher Bereiche mit einer Alkylwasserstoff-Austauschmarkierung durchzuführen. Iterative Kombinationen der Schritte können ebenfalls durchgeführt werden, um Hot-Spot-Reste sowohl auf einfache Weise als auch spezifisch zu erkennen.
4.5 Verwendung der Informationen über Hot-Spots für das Screenen bezüglich ähnlicher Bindungspartner
In einer Erweiterung der obigen Diskussion ist es offensichtlich, dass die Techniken der Wasserstoff-Austauschmarkierung und der Lokalisation dazu verwendet werden können, Veränderungen des Beitrages eines Restes zur Bindungsenergie in einer Reihe mutierten Proteine oder Polypeptide zu verfolgen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, insbesondere kleiner organischer Verbindungen, die die Bindung eines bekannten Liganden an einen interessierenden Rezeptor nachahmen, d. h. an den Rezeptor-Hot-Spots oder in der Nähe des Rezeptor-Hot-Spots eines bekannten Liganden des interessierenden Rezeptors binden. Wie der Begriff hier verwendet wird, ist ein Nachahmer eines Liganden eine Verbindung, die eine Struktur hat, die sich von derjenigen des Liganden unterscheidet, die aber mit wenigstens einem Hot-Spot-Rest des Rezeptors des Rezeptor-Liganden-Komplexes in Wechselwirkung tritt (hier im folgenden bezeichnet als die „Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste"). Je größer die Zahl der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste ist, die mit der Verbindung in Wechselwirkung stehen, umso eher wird die Verbindung als ein Nachahmer des Liganden angesehen. Vorzugsweise tritt die Verbindung mit wenigstens der Mehrzahl oder sogar noch mehr der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste in Wechselwirkung. Dieser Ansatz stellt einen Weg dar, „Mutationen" kleiner Moleküle auf konzeptionell ähnliche Weise zu testen wie bei dem Prozess, der hinter dem Vergleich von Mutationen des Rezeptors steht.
Das letztendliche Vorgehen hinter diesem Ansatz besteht darin, dass Messungen der Schutzfaktoren in einem iterativen Schema aus drei Teilen eingesetzt werden. Im ersten Teil werden Schutzfaktoren gemessen, wodurch Hot-Spot-Reste identifiziert werden; im zweiten werden Familien verwandter Moleküle erhalten, beispielsweise über eine Synthese; und im dritten Teil werden diese Moleküle bezüglich einer Aktivität gegenüber dem Rezeptor gescreent.
4.5.1 Iterative Entdeckung ähnlicher Bindungspartner
Gemäss dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste für ein interessierendes Paar von Rezeptor und Ligand identifiziert, typischerweise unter nativen Bedingungen, beispielsweise physiologischen Bedingungen bezüglich Temperatur, pH, Ionenstärke und Puffer. Wie einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein dürfte, ist das Verfahren nicht auf irgend ein spezielles Verfahren zur Identifizierung von Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Resten beschränkt. Zum Beispiel können die Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste gemäß den früher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren, mittels der Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese von Clackson und Wells, 1995, siehe oben, oder mittels jedes anderen, auf diesem Gebiet beschriebenen Verfahrens, identifiziert werden. Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Identifizierung von Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Resten für ein Rezeptor-Liganden-Paar in seiner nativer Konformation unter nativen Pufferbedingungen werden die Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste vorzugsweise mittels der erfindungsgemäßen Verfahren, die hier zuvor beschrieben wurden, identifiziert. Jedoch weicht jede beliebige andere Technik, die den Beitrag zur freien Bindungsenergie der einzelnen Rezeptor-Reste in einem gegebenen Rezeptor-Liganden-Komplex quantifiziert, zur Identifizierung der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Aminosäuren für die unten diskutierten Screening-Schritte aus. In diesem Zusammenhang ist ein geeignet ausgewählter Ligand einer, von dem bekannt ist, dass er ein natürlicher Bindungspartner des fraglichen Rezeptors ist, obwohl jeder andere Ligand, von dem gefunden wurde, dass er bindet, verwendet werden kann, wie auch prinzipiell jede beliebige mutierte Form des Rezeptors verwendet werden kann.
Für den Zweck der Bestimmung von Hot-Spot-Resten für einen Einsatz in Screening-Experimenten umfasst eine Ausführungsform die Durchführung einer Messung bezüglich des Amidwasserstoff-Austauschs zu einem einzigen, Zeitpunkt. Dieser Ansatz ermöglicht es, derartige Stellen schnell einer Sättigungsmarkierung zu unterziehen, wodurch schnell Untergrenzen bezüglich ihrer Schutzfaktoren erhalten werden.
Nach der Identifizierung der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste wird der Rezeptor mit Kandidatenverbindungen gescreent, um diejenigen Verbindungen auszuwählen, die aufgrund ihrer Bindung an den Rezeptor den Wasserstoff-Austausch an einem oder mehreren der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste verlangsamen. Die Kandidatenverbindungen können zu jedem beliebigen Verbindungstyp gehören, einschließlich biologischer Verbindungen, wie Peptiden, Polypeptiden, Peptidomimetika, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten sowie nicht-biologischen Verbindungen wie kleinen organischen Molekülen. Die Verbindungen können einzeln synthetisiert werden, oder sie können Mitglieder einer Bibliothek, beispielsweise einer kombinatorischen Bibliothek, sein. Da kleine organische Moleküle typischerweise für pharmazeutische Anwendungen bevorzugt werden, werden diese Verbindungen für die hier beschriebenen Screening-Schritte bevorzugt.
Die Kandidatenverbindungen können direkt bezüglich einer Wechselwirkung mit Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Resten gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren gescreent werden, oder sie können erst bezüglich einer gewünschten biologischen Aktivität „vorgescreent" werden. Zum Beispiel kann ein anfänglicher Screen mittels einer beliebigen herkömmlichen Technik durchgeführt werden, um auf eine Bindung an den Rezeptor zu testen, einschließlich von nicht-selektiven Bindungstests und einer kompetitiven Hemmung der Bindung des nativen Rezeptor-Liganden-Komplexes. Es können auch, in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung, andere biologische Tests verwendet werden, die für Fachleute offenkundig sein dürften.
Diejenigen Kandidatenverbindungen, die eine gewisse Aktivität im initialen Screen zeigen, werden dann bezüglich der Wechselwirkungen mit den Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Resten gescreent. Die Verbindungen werden bezüglich Wechselwirkungen mit einem Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Rest über ein „Receptor-Candidate-Compound-Hot-Spot-Screening" gescreent, d. h. es werden die Hot-Spot-Reste für den Komplex aus dem Rezeptor und der Kandidatenverbindung identifiziert (die hier im folgenden als Rezeptor_R–C-Hot-Spot-Reste bezeichnet werden), wobei typischerweise beliebige der zuvor beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Hot-Spot-Resten eingesetzt werden. Für diejenigen Kandidatenverbindungen, die einen Rezeptor_R–C-Hot-Spot-Rest erzeugen, der identisch mit einem Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Rest ist, wird angenommen, dass sie mit einem Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Rest in Wechselwirkung treten. Vorzugsweise wird jede Kandidatenverbindung als ein Ligand mit den Techniken des Wasserstoff-Austauschs dieser Erfindung gescreent, um die Rezeptor_R–C-Hot-Spot-Reste für den Komplex aus Rezeptor und Kandidatenverbindung zu identifizieren. Am stärksten bevorzugt wird es, die Schutzfaktoren der Rezeptor-Reste, die mit der Kandidatenverbindung in Wechselwirkung treten, über einen Deuterium- oder Tritiumaustausch zu messen. Alternativ können andere Techniken zur Bestimmung der Rezeptor_R–C-Hot-Spot-Reste für den Komplex aus Rezeptor und Kandidatenverbindung verwendet werden, einschließlich einer ortsgerichteten Mutagenese und von NMR, wie zuvor beschrieben wurde.
Diejenigen Kandidatenverbindungen, die mit dem Rezeptor auf eine Weise in Wechselwirkung treten, die derjenigen eines Liganden des Rezeptors am ähnlichsten ist, werden als „Nachahmer" des Liganden ausgewählt. Die Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste werden als Richtlinie für die Auswahl von Liganden-„Nachahmern" aus den Kandidatenverbindungen verwendet. Die Auswahl basiert auf der Zahl der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste, mit denen die Kandidatenverbindung in Wechselwirkung tritt, auf der Größe der Schutzfaktoren für diese jeweiligen Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste für den Komplex aus Rezeptor und Kandidat und auf der Zahl der anderen Reste des Rezeptors, mit denen die Kandidatenverbindung in Wechselwirkung tritt. Es sollten diejenigen Verbindungen aus dem Pool, die mit der größten Zahl an Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Resten und der geringsten Zahl anderer Reste in Wechselwirkung treten, ausgewählt werden. Eine weitere Unterscheidung wird durch die Auswahl derjenigen Kandidatenverbindungen ermöglicht, deren Schutzfaktoren für die Rezeptor_R–C-Hot-Spot-Reste bezüglich ihrer Größe ähnlich dem Schutzfaktor des Rezeptor_R–L-Restes für den gleichen Rest sind.
In der Praxis wird in einer anfänglichen Screening-Runde jede beliebige Kandidatenverbindung als ein Liganden-Nachahmer ausgewählt, die mit wenigstens einem Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Rest mit einem beliebigen Schutzfaktor in Wechselwirkung tritt. Diese Verbindung kann dann modifiziert werden, indem sie beispielsweise als Kern oder Leitstruktur für die Erzeugung einer kombinatorischen Bibliothek dient, und die modifizierten Verbindungen können mittels der erfindungsgemäßen Verfahren gescreent werden. In den nachfolgenden Screening-Runden sollte zu den Auswahlparametern die Bindung an mehrere Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste und die Bereitstellung von Schutzfaktoren gehören, die hinsichtlich ihrer Größe näher an denjenigen liegen, die vom Liganden bereit gestellt werden. Schließlich werden Verbindungen isoliert, die dem Liganden sehr ähnlich sind. Typischerweise interagieren diese guten Liganden-Nachahmer exakt mit einer Mehrzahl, und vorzugsweise allen, der Rezeptor_R–L-Hot-Spot-Reste.
Zu weiteren Auswahlkriterien kann die Fähigkeit der Kandidatenverbindungen gehören, Strukturveränderungen im Rezeptor zu induzieren, wie sie über die Fähigkeit der Kandidatenverbindung zur Reproduktion von Teilen des Liganden-bewirkten thermodynamischen Fingerabdrucks identifiziert werden, von dem bekannt ist, dass er derartige Strukturveränderungen anzeigt. Außerdem können die Verbindungen bezüglich ihrer Fähigkeit, in vitro und/oder in vivo als Antagonisten für die Aktivität des Liganden gegenüber dem Rezeptor zu fungieren, getestet werden.
Die Informationen, die man aus den oben genannten Screening-Verfahren erhält, können zusammen mit anderen verfügbaren Daten dazu verwendet werden, die Identifizierung von Verbindungen zu leiten, die genau auf die thermodynamischen Hot-Spots eines gegebenen Rezeptor-Liganden-Komplexes zielen. Die Methoden können iterativ mit aufeinanderfolgenden Runden eines Hot-Spot-Screenings eingesetzt werden. Außerdem können weitere Informationen, einschließlich der dreidimensionalen Strukturen des Rezeptors, des Liganden oder des Rezeptor-Liganden-Komplexes, soweit sie verfügbar sind, für die Auswahl der Methoden eingesetzt werden. Es sollte jedoch klar sein, dass der Erfolg der Methoden nicht von der Verfügbarkeit derartiger Informationen abhängt – sie können, wenn sie verfügbar sind, einfach zur Verbesserung der Verfahren eingesetzt werden.
4.5.2 Anwendungen für die kombinatorische Chemie
Eine Kandidatenverbindung, von der gefunden wurde, dass sie einem Teil des thermodynamischen Fingerabdrucks der Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand gerecht wird, wie durch das Hot-Spot-Screening bestimmt wurde, wird ihrerseits als Leitstruktur für die Erzeugung einer neuen kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen verwendet, aus denen weitere Verbindungen ausgewählt werden können, die als Liganden-Nachahmer wirken. Eine kombinatorische Bibliothek ist wirklich geradezu eine Bibliothek aus Mutanten kleiner Moleküle. Ein Ansatz besteht darin, jedes Mitglied aus einer derartigen Bibliothek in Form dieser identifizierten Verbindung vorliegen zu haben, die auf kombinatorische Art weitere Strukturmerkmale trägt, woran sich die Auswahl von Verbindungen anschließt, die im Rezeptor nicht nur den Hot-Spot-Fingerabdruck des Liganden hinterlassen, sondern auch zusätzliche gewünschte Fingerabdruck-Wechselwirkungen induzieren. Es werden aufeinander folgende Runden einer derartigen Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken und einer derartigen Selektion durchgeführt, bis das gewünschte Ausmaß an Affinität und/oder Spezifität für den Rezeptor erreicht worden ist. Die voranschreitende Gewinnung der Kontaktoberflächen-Targets mit den höchsten Schutzfaktoren in jeder Runde wird zur Isolierung von Verbindungen führen, die, im Hinblick auf ihre Größe, optimal mit der größten Zahl an energetisch wichtigen Resten des Rezeptors in Wechselwirkung treten.
Vielversprechende Verbindungen, die auf wichtige Rezeptor-Reste abzielen, die aber auch eine große Zahl irrelevanter Wechselwirkungen mit dem Rezeptor zeigen, können optimiert werden, indem eine kombinatorische Bibliothek erzeugt wird, die kleinere Versionen der Verbindung enthält, wobei verschiedene Teile der Verbindung fehlen, und indem Verbindungen ausgewählt werden, die zwar die Reaktivität mit thermodynamisch wichtigen Rezeptor-Resten beibehalten, aber die nicht mehr mit unwichtigen Rezeptor-Resten in Wechselwirkung treten. Ganz ähnlich können Bemühungen zur Verbesserung anderer Verbindungseigenschaften, wie der oralen Bioverfügbarkeit, der Proteinbindung und der Plasma-Halbwertszeit mit dem Wissen vonstatten gehen, welche Teile der Verbindung geändert werden können, ohne dass es zu einem wahrscheinlichen Effekt auf den gewünschten thermodynamischen Fingerabdruck kommt. Das Konzept der absichtlichen Durchführung von Modifikationen einer existierenden Leitverbindung und des Bestimmens der Ergebnisse derartiger Strukturveränderungen bezüglich der funktionellen Aktivität ist in diesem Gebiet bekannt. Es ist ein Ziel dieser Endung, das Fachgebiet zu erweitern, indem unabhängig und gleichzeitig die Wechselwirkungen einer Verbindung mit jedem Rest des Rezeptors oder jedem Rest der Bindungsoberfläche zwischen Rezeptor und Ligand untersucht werden. Derzeit ist man in diesem Gebiet nicht in der Lage, eine derart detaillierte Information über die thermodynamische Bindung zu liefern, ohne die dreidimensionale Struktur des Cokomplexes aufzuklären, wobei es sich um ein arbeitsaufwändiges, teures Unterfangen handelt. Sogar dann können derart detaillierte thermodynamische Informationen oft nur abgeleitet werden.
4.5.3 Anwendung auf die Identifizierung von Agonisten
Die Erfindung umfasst auch einen Ansatz zur Identifizierung von Verbindungen, insbesondere kleiner organischer Verbindungen, mit Agonisten-Aktivität aus einem Pool von Kandidatenverbindungen. Eine Aktivität eines Liganden-Agonisten gegenüber einem Rezeptor wird üblicherweise über eine, durch die Bindung induzierte, Oligomerisierung oder Konfor mationsänderung des zellulären Rezeptors vermittelt.
Die Verlangsamung des Austauschs von labilem Wasserstoff, die in einem Rezeptor über einen Liganden-Agonisten induziert wird, kann über drei verschiedene Mechanismen zustande kommen:

(i) Verlangsamung des Austauschs von labilen Wasserstoffen in Resten, die in der Bindungsoberfläche von Rezeptor und Ligand liegen;
(ii) Verlangsamung des Austauschs von labilen Wasserstoffen, da bestimmte Reste an Konformationsänderungen als Konsequenz des Bindungsereignisses teilnehmen (und deshalb Veränderungen in ihren Zugänglichkeiten für Lösemittel erfahren); und
(iii) Verlangsamung des Austauschs von labilen Wasserstoffen in bestimmten Resten, die an einer durch die Bindung induzierten Oligomerisierung von Rezeptoruntereinheiten teilnehmen (und deshalb aufgrund dieser neuen Assoziationen der Untereinheit eine erniedrigte Zugänglichkeit für das Lösemittel erfahren). Wenn detaillierte Informationen bezüglich der Art der Struktur des Rezeptor-Liganden-Komplexes vorliegen, ermöglicht die einfache Betrachtung derartiger Modelle, zusammen mit den erhaltenen Schutzfaktoren der Reste, eine Unterscheidung zwischen Aminosäureresten jeder dieser drei Klassen. Das Ergebnis ist (1) die Identifizierung von Resten, die an der Rezeptor-Liganden-Bindung teilnehmen (und die nachfolgende Lokalisation von Rezeptor-Liganden-Hot-Spots); (2) die Identifizierung von Rezeptor-Resten, die an Konformationsänderungen im Rezeptor teilnehmen; und (3) die Identifizierung von (einer) Oligomerisierungs-Oberfläche(n) der Rezeptoruntereinheiten.

Wenn derartige Strukturinformationen nicht zur Verfügung stehen, dann können die Rezeptor-Reste in der Bindungsoberfläche von Rezeptor und Ligand identifiziert und von den Aminosäureresten unterschieden werden, bei denen der Austausch über eine Konformationsänderung oder Oligomersierung verlangsamt ist, über eine Markierung des Liganden mit schwerem Wasserstoff gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren, das Bilden eines Rezeptor-Liganden-Komplexes und das Identifizieren derjenigen Rezeptor-Reste, die über einen Transfer vom markierten Liganden markiert werden. Methoden zur Durchführung derartiger Markierungs-Transfer-Experimente werden in den U.S.-Patenten Nr. 5 658 739, 6 291 189 B1 und in WO 97/41436 beschrieben.
Da dieser Transfer prinzipiell auf der Bindungsoberfläche erfolgt, können die Hot-Spot-Reste der Bindungsoberfläche des Rezeptors von Resten unterschieden werden, die Veränderungen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten aufgrund von Konformationsänderungen und/oder einer Oligomerisierung zeigen. Diejenigen Rezeptor-Reste, deren Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten sich aufgrund von Konformationsänderungen und/oder einer Liganden-induzierten Rezeptor-Oligomerisierung verändern, können in den erfindungsgemäßen Verfahren verfolgt werden, um Kandidatenverbindungen bezüglich einer potenziellen agonistischen Aktivität zu screenen.
Zur Identifizierung von Verbindungen, die eine agonistische Aktivität aufweisen, wird die Kandidatenverbindung mit dem Rezeptor als Ligand unter Verwendung der Techniken des Wasserstoff-Austauschs, die hier beschrieben werden, gescreent. Diejenigen Kandidatenverbindungen, die mit wenigstens einem Rezeptor-Rest aus den obigen Klassen (ü) oder (iii) in Wechselwirkung treten, wie sich aus der Bestimmung eines Schutzfaktors von über 1 ergibt, werden als solche mit potenzieller agonistischen Aktivität identifiziert, was über die Verwendung von biologischen Standard-Tests bestätigt wird..
Alternativ wird zuerst ein Pool von Kandidatenverbindungen mit dem Rezeptor gescreent, um diejenigen Kandidatenverbindungen zu identifizieren, die agonistische Aktivität zeigen. Die identifizierten Verbindungen werden dann mit dem Rezeptor unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken des Wasserstoff-Austauschs gescreent, um diejenigen Verbindungen zu identifizieren, die mit wenigstens einem Rezeptor-Rest aus den obigen Klassen (ii) oder (iii) in Wechselwirkung treten. Es können iterative Screening-Runden eingesetzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die dem Agonisten sehr ähnlich sind, wie über die Identifizierung von Verbindungen bestimmt wird, die mit einer Mehrzahl der Rezeptor-Reste der Klasse (ii) oder der Klasse (iii) in Wechselwirkung treten, und gegebenenfalls der, die Schutzfaktoren induzieren, die bezüglich dieser Reste im Wesentlichen ähnlich groß sind wie diejenigen, die vom Agonisten induziert werden.
Wie Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein wird, sind die erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf das Identifizieren von Verbindungen beschränkt, die einen natürlichen Liganden eines Rezeptors nachahmen. In vielen Fällen sind weitere Liganden bekannt, die an einen Rezeptor binden. Diese Liganden können in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung neuer Liganden verwendet werden, die ihre Bindung und/oder Aktivität nachahmen.
Die vorhergehende schriftliche Beschreibung reicht aus, einen Fachmann in die Lage zu versetzen, die Erfindung zu praktizieren. Verschiedene Modifikationen der oben beschriebenen Varianten zur Durchführung der Erfindung, die einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein dürften, sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche mit eingeschlossen sein.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines Hot-Spot-Rests eines Partners eines Rezeptor-Liganden-Komplexes, das die Schritte umfaßt: a. Gewinnen der Schutzfaktoren von speziellen Wasserstoffen an individuellen Aminosäureresten, aus denen der Partner sich zusammensetzt; und b. Bestimmen auf der Grundlage der Schutzfaktoren eines Hot-Spot-Rests als individueller Aminosäurerest des Partners, der wenigstens etwa 10% der gesamten freien Bindungsenergie des Komplexes beiträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannten speziellen Wasserstoffe Amidwasserstoffe an der Peptidbindung zwischen benachbarten Aminosäureresten sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die genannten individuellen Aminosäurereste die bindende Oberfläche des Partners umfassen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei diejenigen identifizierten Hot-Spot-Reste in der Summe 20 bis 30% der gesamten freien Bindungsenergie des Komplexes beitragen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die identifizierten Hot-Spot-Reste etwa 40% der gesamten freien Bindungsenergie des Komplexes beitragen.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Schutzfaktoren durch ein Verfahren erhalten werden, das die Schritte umfaßt a. Messen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten der AmidWasserstoffe der individuellen Aminosäurereste, die den Partner bilden, wenn der Partner sich in einem ungebundenen Zustand befindet; b .Messen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten der Amidwasserstoffe der individuellen Aminosäurereste, die den Partner bilden, wenn der Partner sich in einem gebundenen Zustand befindet; und c. Ermitteln für jeden individuellen Rest das Verhältnis von dem in Stufe b. erhaltenen Wert zu dem aus Stufe a. erhaltenen Wert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Austauschgeschwindigkeiten der Amidwasserstoffe der individuellen Reste des Partners im ungebundenen Zustand durch ein Verfahren bestimmt werden, das die Schritte umfaßt: a. Inkontaktbringen des Partners mit schwerem Wasserstoff unter Bedingungen, unter denen Amidwasserstoffe in dem Partner, die für ein Lösemittel zugänglich sind, mit schwerem Wasserstoff austauschen und markiert werden; b. Inkontaktbringen des markierten Rezeptors mit einem Lösemittel, das im wesentlichen frei von schwerem Wasserstoff ist, unter Bedingungen eines raschen Austauschs, um die "Austritts-Austausch"-Perioden zu variieren, während derer Lösemittel-zugängliche Amidwasserstoffe oder schwere Wasserstoffe des markierten Partners mit normalem Wasserstoff des Lösemittels austauschen; c. Quantifizieren für jede "Austritts-Austausch"-Periode die Menge an Label aus schwerem Wasserstoff, die dem Amidwasserstoff eines jeden individuellen Aminosäurerests des Partners zugeordnet ist; und d. Bestimmen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten für die Amidwasserstoffe eines jeden individuellen Partner- rests aufgrund der Menge an Label, die dem Rest als Funktion der Variation der "Austritts-Austausch"-Periode zugeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Menge an Label, die den Amidwasserstoffen eines jeden individuellen Partnerrests für jede Austritts-Austausch-Periode zugeordnet ist, nach einem Verfahren quantifiziert wird, das die Schritte umfaßt: a. Fragmentieren des markierten Rezeptors in eine Vielzahl von Fragmenten unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs, b. Bestimmen, welche Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert sind; c. Fortschreitender Abbau unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs, eines jeden mit schwerem Wasserstoff markierten Fragments, um eine Reihe von Unterfragmenten zu erhalten, wobei jedes Unterfragment der Reihe aus 1 bis 5 Aminosäureresten weniger besteht als das vorausgehende Unterfragment in der Reihe; d. Quantifizieren der Menge an schwerem Wasserstoff, die jedem Unterfragment zugeordnet ist; und e. Korrelieren der Menge an schwerem Wasserstoff der Unterfragmente mit den Aminosäuresequenzen der Fragmente, aus denen Unterfragmente erzeugt wurden, wodurch die Positionen des Fragments, das mit schwerem Wasserstoff markiert wurde, bis zu einer Auflösung von 1 bis 5 Aminosäureresten lokalisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der schwere Wasserstoff Tritium ist und die Anwesenheit oder Menge von schwerem Wasserstoff an einem Fragment oder Unterfragment durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der schwere Wasserstoff Deuterium ist und die Anwesenheit oder Menge an schwerem Wasserstoff an einem Fragment oder Unterfragment durch NMR-Spektroskopie bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, das außerdem den Schritt der Auftrennung der Fragmente vor der Bestimmung, welche Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert wurden, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Auftrennung zwei aufeinanderfolgende Trennstufen umfaßt, die unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die erste der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH im Bereich von pH 2,1 bis pH 3,0 durchgeführt wird, und die zweite der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH im Bereich von 2,1 bis 3,0 durchgeführt wird, wobei die pH-Werte der ersten und zweiten aufeinanderfolgenden Trennstufen verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH von 2,7 durchgeführt wird, und die zweite der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH von 2,1 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der schrittweise Abbau der markierten Fragmente das Inkontaktbringen der markierten Fragmente mit einer säurebeständigen Carboxypeptidase umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase W und Carboxypeptidase C.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei alle Disulfidbrücken in dem Austritts-ausgetauschten Partner vor der Fragmentierung oder der fortschreitenden Unterfragmentierung unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs gebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Disulfidbrücken durch Umsetzen des Austritts-ausgetauschten Partners oder der Fragmente mit einem wasserlöslichen Phosphin gebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Austritts-ausgetauschte Partner vor der Fragmentierung oder Unterfragmen tierung unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Denaturierung in einem Lösemittel so durchgeführt wird, daß der pH zur Minimierung des Wasserstoffaustauschs höher ist als der einer rein wäßrigen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Lösungsmittel 5 bis 20% Wasser umfaßt und der Rest ein nichtwäßriges polares Lösemittel ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das nichtwäßrige polare Lösemittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht. aus Acetonitril, Dimethylsulfoxid, einem Polyol und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Polyol Glycerin ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Lösemittel außerdem 2 bis 4 M Guanidinthiocyanat enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der pH des Lösemittels pH 4,8 bis 5,2 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Amidwasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten der individuellen Reste des Partners im gebundenen Zustand mittels eines Verfahrens bestimmt werden, das die Schritte umfaßt: a. Inkontaktbringen des Partners mit einem mit schwerem Wasserstoff markierten Lösemittel unter Bedingungen eines raschen Wasserstoffaustauschs für eine "Eintritts-Austausch"-Periode, die ausreicht; daß Lösemittel-zugängliche Amidwasserstoffe des Partners durch schwere Wasserstoffe des Lösemittels ausgetauscht und im wesentlichen durch diese ersetzt werden; b. Inkontaktbringen des Partners mit seinem Bindungspartner unter Bedingungen, unter denen die Markierungen aus schwerem Wasserstoff im wesentlichen erhalten bleiben und unter denen der Partner an seinen Partner bindet, wodurch ein Rezeptor-Liganden-Komplex gebildet wird; c. Inkontaktbringen des Rezeptor-Liganden-Komplexes mit einem Lösemittel, das im wesentlichen frei von schwerem Wasserstoff ist, unter raschen Austauschbedingungen, um die "Austritts-Austausch"-Perioden zu variieren, während derer Lösemittel-zugängliche Amidwasserstoffe oder schwere Wasserstoffe des Rezeptor-Liganden-Komplexes mit dem normalen Wasserstoff des Lösemittels austauschen; d. Quantifizieren für jede "Austritts-Austausch"-Periode der Menge an Label aus schwerem Wasserstoff, die den Amidwasserstoffen von individuellen Aminosäureresten des Rezeptors zugeordnet ist; und e. Bestimmen der Austauschgeschwindigkeiten eines jeden individuellen Rests des Partners anhand der Menge an Label, die dem Rest zugeordnet sind, als eine Funktion der Variation der "Austritts-Austausch"-Perioden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Menge an Label, die den Amidwasserstoffen der individuellen Partnerreste für jede Austritts-Austausch-Periode zugeordnet ist, nach einem Verfahren quantifiziert wird, das die Schritte umfaßt: a. Dissoziieren des Rezeptor-Liganden-Komplexes und Gewinnen des Austritts-ausgetauschten Partners von Interesse jeweils unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoffaustauschs; b. Fragmentieren des Austritts-ausgetauschten Partners in eine Vielzahl von Fragmenten unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs; c. Bestimmen, welche Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert sind; d. unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs fortschreitender Abbau aller mit schwerem Wasserstoff markierten Fragmente, um eine Reihe von Unterfrag menten zu erhalten, wobei jedes Unterfragment der Reihe sich aus 1 bis 5 Aminosäuren weniger zusammensetzt als das vorausgehende Unterfragment in der Reihe; e. Quantifizieren der Menge an schwerem Wasserstoff, die jedem Unterfragment zugeordnet ist; und f. Korrelieren der Menge an schwerem Wasserstoff der Unterfragmente mit den Aminosäuresequenzen der Fragmente, aus denen die Unterfragmente erzeugt wurden, wodurch die Positionen des Fragments, das mit schwerem Wasserstoff markiert wurde, mit einer Auflösung von 1 bis 5 Aminosäureresten lokalisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der schwere Wasserstoff Tritium ist und die Anwesenheit oder Menge an schwerem Wasserstoff an einem Fragment oder Unterfragment durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der schwere Wasserstoff Deuterium ist und die Anwesenheit oder Menge des schweren Wasserstoffs an einem Fragment oder Unterfragment durch NMR-Spektroskopie oder durch Messen der Masse. des Fragments oder Unterfragments bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, das außerdem den Schritt der Auftrennung der Fragmente umfaßt, bevor man bestimmt, welche Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Auftrennung zwei aufeinanderfolgende Trennstufen umfaßt, die unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die erste der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH im Bereich von pH 2,1 bis 3,0 durchgeführt wird, und die zweite der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH im Bereich von 2,1 bis 3,0 durchgeführt wird, wobei der pH der ersten und der zweiten aufeinanderfolgenden Trennstufen unterschiedlich ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die erste der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH von 2,7 durchgeführt wird, und die zweite der aufeinanderfolgenden Trennstufen bei einem pH von 2,1 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der schrittweise Abbau der markierten Fragmente das Inkontaktbringen der markierten Fragmente mit einer säurebeständigen Carboxypeptidase umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase W und Carboxypeptidase C.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Abbau der markierten Fragmente das Inkontaktbringen der markierten Fragmente mit einer säuretoleranten Protease umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Pepsin, Newlase, Aspergillus-Proteasen und der Protease vom Typ XIII.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei vor der Fragmentierung oder der fortschreitenden Unterfragmentierung alle Disulfidbrücken in dem Austritts-ausgetauschten Partner unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs gebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Disulfidbrücken durch Umsetzung des Austritts-ausgetauschten Partners mit einem wasserlöslichen Phosphin gebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei vor der Fragmentierung oder Unterfragmentierung der Austritts-ausgetauschte Partner unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Denaturierung in einem Lösemittel so durchgeführt wird, daß der pH für eine Minimierung des Wasserstoffaustauschs wesentlich höher ist als der einer rein wäßrigen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Lösemittel 5 bis 20% Wasser umfaßt und der Rest ein nichtwäßriges polares Lösemittel ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei das nichtwäßrige polare Lösemittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Acetonitril, Dimethylsulfoxid, einem Polyol und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Polyol Glycerin ist.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Lösemittel außerdem 2 bis 4 M Guanidinthiocyanat enthält.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei der pH des Lösemittels pH 4,8 bis 5,2 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Austauschgeschwindigkeiten für die Amidwasserstoffe von individuellen Aminosäureresten des Partners im ungebundenen Zustand durch Deuterium- oder Tritium-Austausch-NMR bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Austauschgeschwindigkeiten für die Amidwasserstoffe von individuellen Aminosäureresten des Partners im gebundenen Zustand durch Deuterium- oder Tritium-Austausch-NMR bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannten speziellen Wasserstoffe Alkylwasserstoffe an individuellen Aminosäureresten sind.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Schutzfaktoren nach einem Verfahren erhalten werden, das die Schritte umfaßt: a. Messen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten der Alkylwasserstoffe der individuellen Aminosäurereste, die den Partner bilden, wenn er teils im ungebundenen Zustand vorliegt; b. Messen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten der Alkylwasserstoffe der individuellen Aminosäurereste, die den Partner bilden, wenn der Partner in einem gebundenen Zustand vorliegt; und c. Bilden für jeden individuellen Rest das Verhältnis des in Stufe b erhaltenen Werts mit dem von Stufe a.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei die Austauschgeschwindigkeiten der Alkylwasserstoffe der individuellen Reste des Partners im ungebundenen Zustand nach einem Verfahren bestimmt werden, das die Schritte umfaßt: a. Inkontaktbringen des Partners mit schwerem Wasserstoff unter Bedingungen, unter denen Alkylwasserstoffe in dem Partner, die für das Lösemittel zugänglich sind, mit schwerem Wasserstoff austauschen, wobei sie markiert werden, um die "Eintritts-Austausch"-Perioden zu variieren; b. für jede "Eintritts-Austausch"-Periode in Stufe a. Quantifizieren der Menge des Labels aus schwerem Wasserstoff, die dem Alkylwasserstoff eines jeden individuellen Aminosäurerests des Partners zugeordnet ist; und c. Bestimmen der Wasserstoff-Austauschgeschwindigkeiten für die Alkylwasserstoffe jedes individuellen Rests des Patners anhand der Menge an Label, die diesem Rest zugeordnet ist, als eine Funktion der variierenden "Eintritts-Austausch"-Periode.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Anwesenheit oder Menge von schwerem Wasserstoff an einem Fragment oder Unterfragment durch Messen der Masse des Fragments oder Unterfragments durch Massenspektrometrie bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der schrittweise Abbau der markierten Fragmente die Anwendung einer kollisionsinduzierten Massenspektrometrie mit einer minimalen Egalisierungsschwelle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, beidem der schrittweise Abbau der markierten Fragmente eine Kombination aus einer enzymatischen Fragmentierung und einer kollisionsinduzierten Massenspektrometrie umfassen.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die über Hot-Spot-Reste an einen Rezeptor bindet, das umfaßt: a. Identifizieren der Rezeptor-Hot-Spot-Reste für das Rezeptor-Liganden-Paar von Interesse als individuelle Aminosäure-Reste des Partners, die wenigstens etwa 10% der gesamten freien Bindungsenergie des Rezeptor-Liganden-Paars beitragen, durch: (i) Gewinnen eines Schutzfaktors eines Wasserstoffs an wenigstens einem individuellen Aminosäurerest des Rezeptors; (ii) Bestimmen anhand dieses Schutzfaktors den Beitrag des wenigstens einen individuellen Aminosäurerests zu einer gesamten freien Bindungsenergie eines Komplexes zwischen dem genannten bekannten Liganden und dem Rezeptor; und (iii) Identifizieren des genannten einen Aminosäurerests als Hot-Spot-Rest, wenn der genannte Beitrag wenigstens etwa 10% der genannten gesamten freien Bindungsenergie zwischen dem genannten bekannten Liganden und dem Rezeptor beiträgt; und
Auswählen aus einem Pool von Kanditatenverbindungen diejenigen Verbindungen, die an wenigstens einen der Rezeptor-Hot-Spot-Reste binden.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei die Kandidatenverbindungen auf ihr Binden an den Rezeptor gescreent werden, und diejenigen Verbindungen, die binden, auf ihr Binden an die Rezeptor-Hot-Spot-Reste gescreent werden.
Verfahren nach Anspruch 52, bei dem die Rezeptor-Hot-Spot-Reste durch die Technik einer ortsspezifischen Mutagenese identifiziert werden.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die als ein Agonist für einen Rezeptor von Interesse wirkt, das umfaßt a. Identifizieren für ein Rezeptor-Agonisten-Paar von Interesse diejenigen Rezeptor-Reste, die teilnehmen an (i) der Rezeptor-Agonisten-Bindung; (ii) Konformationsänderungen des Rezeptors infolge des Bindungsereignisses zwischen Rezeptor und Agonist; und (iii) einer Rezeptoruntereinheits-Oligomerisierung unter Gewinnung von Schutzfaktoren von Wasserstoff an Aminosäureresten des Rezeptors; und b. Auswählen aus einem Pool von Kandidatenverbindungen diejenigen Verbindungen, die mit wenigstens einem Rest der genannten Rezeptoren Wechselwirken. c. Verfahren nach Anspruch 55, wobei die Identifizierung das Gewinnen von Schutzfaktoren von Wasserstoffen an Aminosäureresten des Rezeptors umfassen.