DE69823525T2

DE69823525T2 - Verfahren zur hochauflösenden identifizierung von lösungsmittel-zugänglichen amidhydrogenen in polypeptiden

Info

Publication number: DE69823525T2
Application number: DE69823525T
Authority: DE
Inventors: Jr. Virgil L. Woods
Original assignee: ExSAR Corp
Current assignee: ExSAR Corp
Priority date: 1997-08-19
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2018-08-19
Also published as: CA2300100A1; WO1999009204A1; EP1012325A1; EP1012325A4; US6797482B2; EP1012325B1; AU8913498A; US6291189B1; US20020042080A1; DE69823525D1; IL134565A0; ATE265542T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von für Lösungsmittel zugänglichen Amid-Wasserstoffatomen in Polypeptiden oder Proteinen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Charakterisierung der Bindungsstelle, die an der Bindung zwischen einem Bindungsprotein und einem Bindungspartner beteiligt ist, sowie zur Untersuchung anderer Veränderungen in einem Polypeptid oder Protein, die die Geschwindigkeiten, mit der Wasserstoffatome durch Lösungsmittel-Wasserstoffatome ausgetauscht werden, verändern, z. B. von Faltungserscheinungen und anderen strukturellen Veränderungen, herangezogen werden.
Stand der Technik
Grenzen von derzeitigen Methoden zur Charakterisierung von Proteinbindungsstellen
Zur genauen Charakterisierung einer Bindungsstelle sind erhebliche experimentelle Arbeiten und ein großer Zeitaufwand erforderlich. Im Allgemeinen führen die Techniken, die am leichtesten einzusetzen sind und die raschesten Antworten ergeben, zu einer ungenauen und nur näherungsweisen Vorstellung über die Natur der kritischen strukturellen Merkmale. Zu Techniken in dieser Kategorie gehören die Untersuchung von proteolytisch erzeugten Fragmenten des Proteins, bei denen die Bindungsfunktion erhalten bleibt; rekombinante DNA-Techniken, bei denen Proteine mit einer veränderten Aminosäuresequenz konstruiert werden (positionsgerichtete Mutagenese); Epitop-Scanning-Peptid-Untersuchungen (Konstruktion einer großen Anzahl von kleinen Peptiden, die Unterregionen des intakten Proteins repräsentieren, unter anschließender Untersuchung der Fähigkeit der Peptide zur Hemmung der Bindung des Liganden an den Rezeptor); die kovalente Vernetzung des Proteins mit seinem Bindungspartner im Bereich der Bindungsstelle unter anschließender Fragmentierung des Proteins und Identifizierung von vernetzten Fragmenten; und die Affinitätsmarkierung von Regionen des Rezeptors, die sich in der Nähe der Ligandenbindungsstelle des Rezeptors befinden, unter anschließender Charakterisierung von derartigen Peptiden in "nächster Nachbarschaft" (Übersichtsartikel in den Literaturstellen 1 und 2).
Diese Techniken eignen sich am besten zur Bestimmung der Struktur von Bindungsunterregionen, die von einfacher Natur sind, wenn eine einzelne, kurze, zusammenhängende Polypeptidfolge innerhalb eines Proteins für den Großteil der Bindungsaktivität verantwortlich ist. Jedoch werden bei zahlreichen Protein-Bindungspartner-Systemen, die derzeit von Interesse sind, die Strukturen, die zur Bindung sowohl an den Rezeptor als auch an den Liganden oder Antikörper verantwortlich sind, durch eine komplizierte Wechselwirkung von mehrfachen, nicht-zusammenhängenden Polypeptidsequenzen erzeugt. Die komplizierten Zusammenhänge dieser Wechselwirkungen können zu einer Verwirrung bei herkömmlichen analytischen Techniken führen, da die Bindungsfunktion häufig verloren geht, sobald eine der dreidimensionalen Konformationen der verschiedenen, einen Beitrag leistenden Polypeptidsequenzen direkt oder indirekt gestört wird.
Als die aussagekräftigsten Techniken zur Charakterisierung der Struktur von Rezeptorbindungsstellen haben sich die NMR-Spektroskopie und die Röntgenkristallographie erwiesen. Obgleich diese Techniken idealerweise eine genaue Charakterisierung der einschlägigen strukturellen Merkmale ergeben, unterliegen sie erheblichen Einschränkungen, wozu ein unangemessener Zeitaufwand, der für die Untersuchung erforderlich ist, die Unmöglichkeit zur Untersuchung von großen Proteinen und bei der Röntgenanalyse die Notwendigkeit von Protein-Bindungspartner-Kristallen gehören (Druckschrift 3).
Die Technik der Anmelderin überwindet diese Einschränkungen und ermöglicht eine rasche Identifizierung der einzelnen spezifischen Polypeptide und Aminosäuren innerhalb eines Proteins, die dessen Protein-Ligandenbindungsstelle oder Antikörper-Bindungsunterregion in praktisch beliebigen Protein-Liganden-Systemen oder Protein-Antigen-Antikörper-Systemen darstellen, unabhängig von der Komplexität der vorhandenen Bindungsstellen oder der Größe der beteiligten Proteine. Diese Technik ist in Bezug auf Geschwindigkeit und Auflösung herkömmlicherweise eingesetzten biochemischen Techniken überlegen.
Wasserstoff-(Protonen)-Austausch
Wenn ein Protein in seinem nativen, gefalteten Zustand in Puffern mit einem Gehalt an mit schwerem Wasserstoff (Tritium oder Deuterium) markiertem Wasser inkubiert wird, unterliegt der schwere Wasserstoff im Puffer einem reversiblen Austausch mit normalem Wasserstoff, der im Protein an sauren Positionen (z. B. O-H-, S-H- und N-H-Gruppen) vorhanden ist, unter Austauschgeschwindigkeiten, die von der jeweiligen chemischen Umgebung der austauschbaren Wasserstoffatome, der Temperatur und insbesondere vom Zugang zum tritierten Wasser im Puffer abhängig sind (Druckschriften 4, 5). Die Zugänglichkeit wird wiederum sowohl von der Oberflächendisposition (Exposition gegenüber dem Lösungsmittel) des Wasserstoffes und dem Ausmaß, in dem Wasserstoffbrückenbindungen mit anderen Regionen des gefalteten Proteins vorliegen, bestimmt. Einfach ausgedrückt, saure Wasserstoffatome, die an Aminosäureresten vorhanden sind, die an der Außenoberfläche (Exposition gegenüber dem Puffer) des Proteins vorliegen und die Wasserstoffbrückenbindungen mit Lösungsmittelwasser bilden, unterliegen rascher einem Austausch mit schwerem Wasserstoff im Puffer als ähnliche saure Wasserstoffatome, die innerhalb des ge falteten Proteins verborgen und dort durch Wasserstoffbrückenbindungen gebunden sind.
Wasserstoffaustauschreaktionen können in starkem Maße durch eine sowohl durch Säuren als auch durch Basen vermittelte Katalyse beschleunigt werden. Die Austauschgeschwindigkeit, die bei jedem speziellen pH-Wert beobachtet wird, stellt die Summe der sowohl durch Säuren als auch durch Basen vermittelten Mechanismen dar. Bei zahlreichen sauren Wasserstoffatomen führt ein pH-Wert von 2,7 zu einer Gesamtmindestaustauschgeschwindigkeit (Druckschrift 9, S. 238, 3a–c, Druckschriften 7–11). Obgleich Wasserstoffatome in Protein-Hydroxyl- und -Aminogruppen einem Austausch mit Tritium im Puffer innerhalb von Millisekunden unterliegen, ist die Austauschgeschwindigkeit eines speziellen sauren Wasserstoffatoms, nämlich des durch eine Peptidamidbindung gebundenen Wasserstoffatoms, erheblich langsamer und weist eine Halbwertszeit des Austausches (bei einer freien Wasserstoffbrückenbindung an Lösungsmittelwasser) von etwa 0,5 Sekunden bei 0°C und einem pH-Wert von 7 auf, wobei der Wert erheblich auf eine Halbwertszeit des Austausches von 70 Minuten bei 0°C und einem pH-Wert von 2,7 verlangsamt wird.
Wenn Peptidamidwasserstoffatome innerhalb eines gefalteten Proteins verborgen sind oder Wasserstoffbrückenbindungen mit anderen Teilen des Proteins vorliegen, werden die Halbwertszeiten mit Lösungsmittelwasserstoffatomen häufig erheblich verlängert, wobei sich gelegentlich Werte von Stunden bis Tagen ergeben. Der Wasserstoffaustausch an Peptidamiden stellt eine vollständig reversible Reaktion dar. Die Geschwindigkeiten des AN-Austausches (schwerer Wasserstoff des Lösungsmittels ersetzt proteingebundenen, normalen Wasserstoff) sind identisch mit den Geschwindigkeiten des AUS-Austausches (Wasserstoff ersetzt proteingebundenen schweren Wasserstoff), wenn der Zustand eines speziellen Peptidamids innerhalb eines Proteins, einschließlich von dessen chemischer Umgebung und des Zugangs zu Lösungsmittelwasserstoffatomen, während der AN-Austausch- und AUS-Austauschbedingungen identisch bleibt.
Ein Wasserstoffaustausch wird üblicherweise gemessen, indem man Untersuchungen mit Proteinen und wässrigen Puffern durchführt, die in unterschiedlicher Weise mit Paaren der drei isotopen Formen von Wasserstoff (¹H: normaler Wasserstoff; ²H: Deuterium; ³H: Tritium) markiert sind. Wenn das Paar aus normalem Wasserstoff und Tritium verwendet wird, wird der Vorgang als Tritiumaustausch bezeichnet. Wenn normaler Wasserstoff und Deuterium verwendet werden, wird der Vorgang als Deuteriumaustausch bezeichnet. Es werden im Allgemeinen unterschiedliche physikochemische Techniken herangezogen, um die Verteilung der beiden Isotopen beim Deuteriumaustausch im Vergleich zum Tritiumaustausch zu verfolgen.
Tritium-Austauschtechniken
Tritium-Austauschtechniken (wobei die Menge des Isotops durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird) werden in breitem Umfang zur Messung von Peptidamid-Austauschgeschwindigkeiten innerhalb eines individuellen Proteins verwendet (Übersicht in Druckschrift 4). Die Austauschgeschwindigkeiten von anderen sauren Protonen (OH, NH, SH) sind so rasch, dass sie durch diese Techniken nicht verfolgt werden können. Sämtliche nachstehenden Erörterungen beziehen sich ausschließlich auf den Peptidamid-Protonenaustausch. Bei diesen Untersuchungen werden gereinigte Proteine einem AN-Austausch durch Inkubation in Puffern, die tritiertes Wasser enthalten, für unterschiedliche Zeitspannen unterzogen, in Puffer, die frei von Tritium sind, übertragen und einer Bestimmung des AUS-Austausches des Tritiums unterzogen. Durch Analyse der Geschwindigkeiten des Tritium-AN- und -AUS-Austausches lässt sich die Anzahl der Peptidamidproteinen in Protein, deren Austauschgeschwindigkeiten innerhalb bestimmter Bereiche von Austauschgeschwindigkeiten fallen, durchführen. Diese Unter suchungen erlauben nicht eine Bestimmung der Identität (Position innerhalb der primären Aminosäuresequenz des Proteins) der gemessenen, einem Austausch unterliegenden Amidwasserstoffatome.
Erweiterungen dieser Techniken werden dazu verwendet, innerhalb von Proteinen die Anwesenheit von Peptidamiden nachzuweisen, die allosterisch induzierten Veränderungen in ihrer lokalen chemischen Umgebung unterliegen, wobei diese Techniken zur Untersuchung der Wege der Proteinfaltung dienen (Druckschriften 5, 12, 14). Für diese Untersuchungen lässt man Tritium-AN-ausgetauschte Proteine einem AUS-Austausch unterliegen, nachdem sie entweder eine allosterische Veränderung ihrer Form erfahren haben oder einer zeitabhängigen Faltung in sich selbst unterzogen worden sind. Die Anzahl von Peptidamiden, die einer Veränderung ihrer Austauschgeschwindigkeit im Anschluss an die allosterischen/faltungsbedingten Modifikationen unterliegen, wird bestimmt. Veränderungen der Austauschgeschwindigkeit zeigen an, dass Veränderungen der chemischen Umgebung von speziellen Peptidamiden erfolgt sind, die für den Protonenaustausch relevant sind (Lösungsmittelzugang, Wasserstoffbrückenbindungen und dergl.). Peptidamide, die einer induzierten Verlangsamung ihrer Austauschgeschwindigkeit unterliegen, werden als "verlangsamte Amide" bezeichnet. wenn vorher einem AN-Austausch unterzogenes Tritium in ausreichendem Maße in seinem AUS-Austausch aus derartigen Amiden unterzogen wird, ergibt sich eine "funktionelle Tritiummarkierung" dieser Amide. Aus diesen Messungen werden Rückschlüsse auf die strukturelle Natur der Formänderungen, die innerhalb des isolierten Proteins eingetreten sind, gezogen. Auch hier ist eine Bestimmung der Identität der speziellen Peptidamide, die Veränderungen in ihrer Umgebung unterliegen, mit diesen Techniken nicht möglich.
Vier Forschergruppen haben technische Erweiterungen (zusammenfassend als Tritiumaustausch von mittlerer Auflösung bezeichnet) beschrieben, die eine Lokalisierung von speziel len verlangsamten, mit Tritium markierten Peptidamiden innerhalb der primären Sequenz von kleinen Proteinen, die innerhalb eines speziellen proteolytischen Fragments, jedoch nicht innerhalb einer speziellen Aminosäure zu lokalisieren sind, ermöglichen.
Rosa und Richards waren die ersten Autoren, die in ihren Untersuchungen über die Faltung von Ribonuclease S-Proteinfragmenten Tritiumtechniken mittlerer Auflösung beschrieben und diese einsetzten (Druckschriften 15–17). Jedoch waren die von Rosa und Richards beschriebenen Techniken nur von untergeordnetem Wert, was vorwiegend darauf zurückzuführen war, dass es ihnen nicht gelang, bestimmte kritische experimentelle Stufen zu optimieren (Übersicht in Druckschrift 6, S. 238, 244). Es wurden keine Untersuchungen, die sich verwandter Techniken bedienten, veröffentlicht, bis die Arbeiten von Englander und Mitarbeitern erschienen, in denen erstmals ausgedehnte Modifikationen und Optimierungen der Technik von Rosa und Richards beschrieben wurden.
Die Untersuchungen von Englander, bei denen ein Tritiumaustausch herangezogen wurde, konzentrierten sich ausschließlich auf die Untersuchung von allosterischen Veränderungen, die in tetramerem Hämoglobin (a-Untereinheit und b-Untereinheit mit einer Größe von jeweils 16 kD) bei Desoxygenierung stattfinden (Druckschriften 6, 18–21). Beim Verfahren von Englander wird natives Hämoglobin (Milligrammmengen) im oxygenierten Zustand einem AN-Austausch in tritiertem Wasser von relativ niedriger spezifischer Aktivität (2–100 mCi/ml) unterzogen. Hämoglobin wird anschließend desoxygeniert (Induktion einer allosterischen Veränderung), durch Gelpermeations-Säulenchromatographie auf tritiumfreie Puffer übertragen und sodann einem AUS-Austausch für die 10- bis 50-fache Zeitspanne der AN-Austauschzeit unterzogen. AN-ausgetauschtes Tritium, das an Peptidamiden vorhanden ist, die im Anschluss an die induzierte allosterische Veränderung in der Hämoglobinstruktur keine Verände rung der Austauschgeschwindigkeit erfahren, unterliegen einem AUS-Austausch mit zu den AN-Austauschgeschwindigkeiten identischen Geschwindigkeiten und werden daher nach der langen AUS-Austauschdauer fast vollständig aus dem Protein entfernt. Dagegen behalten Peptidamide, die im Anschluss an die induzierten allosterischen Veränderungen einer Verlangsamung ihrer Austauschgeschwindigkeit unterliegen, während der Dauer des AUS-Austausches bevorzugt die Tritiummarkierung.
Um die verlangsamten Amide, die die restliche Tritiummarkierung tragen, zu lokalisieren (in Bezug auf die Primärsequenz von Hämoglobin) fragmentiert Englander anschließend proteolytisch das dem AUS-Austausch unterzogene Hämoglobin mit der Protease Pepsin, führt eine Abtrennung, Isolierung und Identifizierung der verschiedenen Peptidfragmente durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie (RP-HPLC) durch und bestimmt durch Szintillationszählung, welche Fragmente die restliche Tritiummarkierung tragen. Jedoch geht mit fortschreitender Fragmentierung von Hämoglobin die sekundäre und tertiäre Struktur der einzelnen Fragmente verloren und die ungefalteten Peptidamide werden im Puffer für H₂O frei zugänglich. Bei einem physiologischen pH-Wert (> 6) würden sämtliche amidgebundenen Tritiummarkierungen die aufgefalteten Fragmente innerhalb von Sekunden verlassen. Englander führt daher die Fragmentierungs- und HPLC-Peptidisolierungsvorgänge unter Bedingungen durch, von denen er glaubt, dass der Peptidamid-Protonenaustausch auf ein Minimum beschränkt wird, wobei zu diesen Bedingungen eine kalte Temperatur (4°C) und die Verwendung von Phosphatpuffern vom pH-Wert 2,7 gehören (Übersicht in Druckschrift 6). Diese Technik wurde von Englander erfolgreich dazu herangezogen, die Peptidregionen von Hämoglobin-α- und -β-Ketten, die an durch Desoxygenierung induzierten allosterischen Veränderungen beteiligt sind, grob zu identifizieren und zu lokalisieren (Druckschriften 18–21). Die Möglichkeiten der Technik von Englander zur Lokalisierung von tritiummarkierten Amiden bleiben trotz des damit erzielten wichtigen Vorteils beschränkt. Englander berichtet, dass mit dieser Technik bestenfalls eine Lokalisierung einer Amid-Tritiummarkierung auf Hämoglobinpeptide mit 14 Aminosäuren oder mehr gelingt, ohne dass die Möglichkeit besteht, die Markierung einer weiteren Sublokalisierung zu unterziehen.
In den Arbeiten von Englander findet sich kein Hinweis darauf, dass eine in geeigneter Weise angepasste Tritium-Austauschtechnik zur Identifizierung der Peptidamide, die sich an der Kontaktoberfläche eines Proteinrezeptors mit dessen Bindungspartner befinden, herangezogen werden könnte. Seine Ausführungen befassen sich ausschließlich mit der Kartierung von allosterischen Veränderungen in Hämoglobin. Ferner vermittelt auf der Grundlage seiner Optimierungsversuche (Druckschriften 6–11, 13) Englander die Lehre und die Warnung, dass ein pH-Wert von 2,7 sowohl bei den Stufen der Proteolyse als auch der HPLC herangezogen werden muss, wobei die Verwendung von Proteasen, die bei diesen pH-Werten funktionsfähig sind (saure Proteasen), erforderlich ist. Ungünstigerweise sind saure Proteasen bezüglich ihrer proteolytischen Spaltungsstellen relativ unspezifisch, was zur Bildung einer sehr großen Anzahl an unterschiedlichen Peptidfragmenten und daher zu erheblichen HPLC-Trennungsschwierigkeiten führt. Der Zwang zur Durchführung der HPLC-Trennstufe beim pH-Wert 2,7 schränkt die Möglichkeit zur Optimierung der chromatographischen Auftrennung von zahlreichen, überlappenden Peptiden durch Variation des pH-Werts, bei dem die HPLC durchgeführt wird, stark ein. Englander versuchte, sich bei der Lokalisierung von Hämoglobinpeptiden, die allosterischen Veränderungen unterliegen, mit diesen Problemen zu befassen, indem er die Tatsache ausnützte, dass einige Peptidbindungen gegenüber Pepsin empfindlicher sind als andere. Er begrenzte daher die Dauer, während der das Protein dem Pepsin ausgesetzt ist, um die Anzahl an Fragmenten zu verringern. Auch dann waren die Fragmente "nur unter Schwierigkeiten sauber zu trennen". Die Peptide waren natürlich auch länger (im Durchschnitt), so dass sich eine geringere Auflösung ergab. Der Autor versuchte, die Muster zu vereinfachen, indem er zunächst die α- und β-Ketten von Hämoglobin trennte. Es ergab sich jedoch ein Kompromiss: erhöhter Tritiumverlust während der α-β-Trennung und Entfernung des Lösungsmittels zur Vorbereitung der Proteolyse. Englander trifft folgende Schlussfolgerung:
"Derzeit stellt die Gesamtanalyse des HX-Verhaltens (HX = Wasserstoffaustausch) eines gegebenen Proteins durch diese Methoden eine enorme Aufgabe dar. Allgemein ausgedrückt, müssen die günstigsten Strategien zur Bearbeitung einer derartigen Aufgabe erst noch formuliert werden. Ferner würden diese Anstrengungen durch weitere technische Verbesserungen begünstigt, z. B. in Bezug auf das HPLC-Trennvermögen und möglicherweise insbesondere durch die Entwicklung zusätzlicher saurer Proteasen mit Eigenschaften, die an die Erfordernisse dieser Versuche angepasst sind" (Druckschrift 6).
In den Jahren, die dieser Beobachtung folgten, wird über keine Fortschritte berichtet, die sich mit diesen kritischen Begrenzungen der Tritium-Austauschtechnik von mittlerer Auflösung befassen. Es wurde angenommen, dass Verbesserungen der HPLC-Trennstufe aufgrund der Beschränkung, dass bei einem pH-Wert von 2,7 gearbeitet werden muss, problematisch sind. Der derzeitige begrenzte Erfolg bei kleineren Proteinen lässt es als aussichtslos erscheinen, ähnliche Untersuchungen auf größere Proteine auszudehnen, wo die Schwierigkeiten mit einer unzureichenden HPLC-Peptidtrennung beim pH-Wert 2,7 und die Ungenauigkeit bei der Möglichkeit zur Sublokalisierung von markierten Amiden noch stärker ausgeprägt sind. Ferner sind die meisten säurereaktiven Proteasen im Allgemeinen in ihrem Spaltungsmuster nicht spezifischer als Pepsin, und Anstrengungen zur Verbesserung der Technik unter Verwendung von anderen säurereaktiven Proteasen, die sich von Pepsin unterscheiden, haben zu keiner signifikanten Verbesserung der Technik geführt.
Angesichts dieser Tritium-Austauschtechnik von mittlerer Auflösung gibt es keine Berichte über weitere Untersuchungen, bei denen Proteine mit einer Größe der Untereinheiten von mehr als 16 Kilodalton eingesetzt werden.
Allewell und Mitarbeiter beschrieben Untersuchungen unter Anwendung der Englander-Techniken zur Lokalisierung von induzierten, allosterischen Änderungen im Enzym Escherichia coli-Aspartat-transcarbamylase (Druckschriften 22, 23). Burz et al. (Druckschrift 22) stellt eine kurze Zusammenfassung dar, wobei die isolierte R2-Untereinheit dieses Enzyms einem AN-Austausch in tritiertem Puffer mit der spezifischen Aktivität 100 mCi/ml unterzogen wurde, eine allosterische Änderung durch Zugabe von ATP induziert wurde und anschließend die bezüglich der Information veränderte Untereinheit einem AUS-Austausch unterzogen wurde. Die Enzym-R2-Untereinheit wurde sodann proteolytisch mit Pepsin gespalten und in Bezug auf die Menge der in bestimmten Fragmenten vorhandenen Markierung analysiert. Bei der Analyse bediente man sich Techniken, die streng den Empfehlungen von Englander folgten, wobei eine einzige RP-HPLC-Trennung in einem Puffer vom pH-Wert 2,8 durchgeführt wurde.
Die Autoren stellen selbst bei diesem kleinen Protein-Unterfragment Schwierigkeiten beim Auftrennen der großen Anzahl an gebildeten Proteinen fest, was auf die Einschränkungen der Englander-Methodik zurückzuführen ist. Sie stellen fest, dass "die prinzipielle Beschränkung dieses Verfahrens derzeit bei der Auftrennung mit den zur Zeit verfügbaren Säulen liegt". Es wurde gezeigt, dass eine ATP-Bindung an das Enzym die Austauschgeschwindigkeit der Wasserstoffatome innerhalb mehrerer, relativ großer Peptidfragmente der R2-Untereinheit verändert. In einer nachfolgenden, vollständigeren Beschreibung (Druckschrift 23) beschreibt die Allewell-Gruppe Untersuchungen der allosterischen Veränderungen, die an der R2-Untereinheit sowohl durch ATP als auch durch CTP hervorgerufen werden. Sie beschreiben einen AN-Austausch der R2-Untereinheit in tritiertes Wasser enthaltendem Puffer mit einer spezifischen Aktivität von 22–45 mCi/ml, die Zugabe von ATP oder CTP und den anschließenden AUS-Austausch des Tritiums in normales Wasser enthaltendem Puffer. Die Analyse umfasste den Verdau des Komplexes mit Pepsin und die Auftrennung der Peptidfragmente durch Umkehrphasen-HPLC in einem Puffer mit einem pH-Wert von 2,8 oder 2,7, wobei alle diese Maßnahmen sich streng an die Lehre von Englander anlehnen. Die Peptide wurden durch Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung oder durch N-terminale Analyse identifiziert und die Radioaktivität der einzelnen Fragmente wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Bei beiden Untersuchungen war die Lokalisierung der Tritium-Markierung auf Peptide mit einer durchschnittlichen Größe von 10–15 Aminosäuren beschränkt, ohne dass eine höhere Auflösung versucht wurde.
Beasty et al. (Druckschrift 24) beschreiben Untersuchungen unter Anwendung von Tritium-Austauschtechniken zum Studium der Faltung der a-Untereinheit von E. coli-Tryptophan-synthetase. Die Autoren verwendeten tritiertes Wasser mit einer spezifischen Aktivität von 20 mCi/ml und fragmentierten das mit Tritium markierte Enzymprotein mit Trypsin beim pH-Wert 5,5, d. h. unter Bedingungen, bei denen das Protein und die erzeugten großen Fragmente eine ausreichend gefaltete Struktur behielten, um Amidwasserstoffatome während der Proteolyse und der HPLC-Analyse gegen einen AUS-Austausch zu schützen. Unter diesen Bedingungen waren die Autoren in der Lage, nur drei Proteinfragmente zu erzeugen, wobei das kleinste eine Größe von 70 Aminosäuren aufwies. Die Autoren machten keinen weiteren Versuch, die Markierung durch zusätzlichen Verdau und/oder HPLC-Analyse genauer zu lokalisieren. In der Tat wäre es unter den experimentellen Bedingungen, derer sie sich bedienten (sie führten alle Stufen bei 12°C anstelle von 4°C durch und führten die Proteolyse bei einem pH-Wert von 5,5 anstelle eines pH-Werts im Bereich von 2–3 aus), unmöglich, die markierten Amide durch Tritium-Austausch weiter zu lokalisieren, da die Markierung sofort durch Auffaltung der anschließend er zeugten proteolytischen Fragmente beim pH-Wert 5,5 verloren ginge (einem AUS-Austausch unterläge), wenn sie eine Größe von weniger als 10–30 Aminosäuren aufwiesen.
Fromageot et al. (US-Patent 3 828 102 (Druckschrift 25)) beschreibt die Anwendung des Wasserstoff-Austausches gegen eine Tritium-Markierung eines Proteins und von dessen Bindungspartner. Benson (US-Patente 3 560 158 und 3 623 840 (Druckschriften 26)) beschreiben die Anwendung eines Wasserstoff-Austausches zum Tritieren von Verbindungen für analytische Zwecke.
Jedoch ist keines dieser im Stand der Technik beschriebenen Verfahren dazu befähigt, die Positionen der Tritium-Markierung der markierten Proteine mit hoher Auflösung zu lokalisieren, wobei die beste Auflösung gemäß dem Stand der Technik im Allgemeinen in der Größenordnung von ≥ 14 Aminosäureresten liegt.
Deuterium-Austauschtechniken
Fesik et al. (Druckschrift 27) beschreibt die NMR-Messung des Wasserstoff (Deuterium)-Austausches eines Peptids vor und nach dessen Bindung an ein Protein. Aus diesen Daten werden die Wechselwirkungen verschiedener Wasserstoffatome im Peptid mit der Bindungsstelle des Proteins analysiert.
Paterson et al. (Druckschrift 28) und Mayne et al. (Druckschrift 29) beschreiben eine NMR-Kartierung einer Antikörper-Bindungsstelle an einem Protein (Cytochrom-C) unter Anwendung des Deuterium-Austausches. Dieses relativ kleine Protein mit einer aufgelösten NMR-Struktur wird zunächst mit einem monoklonalen anti-Cytochrom-C-Antikörper komplexiert. Der vorgebildete Komplex wird sodann in deuteriertes Wasser enthaltenden Puffern inkubiert. NMR-Spektren werden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen. Das NMR-Spektrum des Antigen-Antikörper-Komplexes wird auf das Vorliegen von Peptidamiden geprüft, die einem verlangsamten Wasserstoff- Austausch mit Lösungsmittel-Deuterium unterliegen, verglichen mit ihrer Austauschgeschwindigkeit in unkomplexiertem, nativem Cytochrom-C. Benjamin et al. (Druckschrift 30) bedienen sich einer identischen NMR-Deuterium-Technik, um die Wechselwirkung von Hühnerei-Lysozym (HEL) mit HEL-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu untersuchen. Obgleich sowohl diese NMR-Deuterium-Technik als auch der Tritium-Austausch von mittlerer Auflösung sich auf die Erscheinung des Protonen-Austausches an Peptidamiden stützen, wenden sie vollständig andere Methoden zur Messung und Lokalisierung der austauschenden Amide an. Ferner ist eine Untersuchung von Proteinen durch die NMR-Technik nicht möglich, es sei denn das Protein ist klein (weniger als 30 kD), große Mengen des Proteins sind für die Untersuchung verfügbar und eine rechenmäßig umfangreiche Resonanz-Zuordnungsarbeit wird durchgeführt.
Kürzlich beschrieben andere Autoren (Druckschriften (45–50) Techniken, bei denen durch Austausch deuterierte Proteine mit einem Bindungspartner inkubiert werden, einem AUS-Austausch unterzogen werden, der Komplex mit Pepsin fragmentiert wird und Deuterium tragende Proteine durch einstufiges Fast-Atom-Bombardement (Fab) oder Elektrospray-Massenspektroskopie (MS) identifiziert werden. Bei diesen Untersuchungen wird nicht versucht, peptidgebundenes Deuterium innerhalb der proteolytisch oder auf andere Weise erzeugten Peptidfragmente genauer zu lokalisieren.
Somit verbleibt, wie aus der vorstehenden Erörterung hervorgeht, im Stand der Technik ein Bedürfnis nach einfachen und wirksamen Verfahren, mit denen die Positionen von markierten, für das Lösungsmittel zugänglichen Peptidamid-Wasserstoffatomen mit hoher Auflösung innerhalb der primären Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder Proteins lokalisiert werden können, sowie nach einfachen und wirksamen Verfahren zur Untersuchung oder Kartierung der Bindungsstellen und/oder Wechselwirkungsoberflächen eines Poly peptids oder Proteins. Demzufolge handelt es sich hierbei um Aufgaben der vorliegenden Erfindung.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Diese und weitere Nachteile des Stands der Technik werden erfindungsgemäß überwunden. Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum funktionellen Markieren und Identifizieren von spezifischen Aminosäureresten, die an Bindungsprotein-Bindungspartner-Wechselwirkungen teilnehmen, bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere zur Untersuchung der Bindungsprotein-Bindungspartner-Subregionen von großen Proteinen (> 30 KD), selbst in geringen Mengen.
Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der Markierung um Tritium und die Menge der Markierung an einem Fragment oder Unterfragment wird durch Messung von dessen Radioaktivität bestimmt. Gemäß einer zweiten Ausführungsform handelt es sich bei der Markierung um Deuterium und die Menge der Markierung an einem Fragment oder Unterfragment wird durch Massenspektrometrie bestimmt. Der Ausdruck "schwerer Wasserstoff" wird allgemein zur Bezeichnung von Tritium oder Deuterium verwendet. Ferner gelten Bezugnahmen auf Tritium in entsprechender Weise auch für Deuterium, es sei denn es wird ausdrücklich auf eine Ausnahme hingewiesen.
Ein wesentliches Merkmal besteht darin, dass das Bindungsprotein zunächst tritiert oder deuteriert wird, und zwar unter Bedingungen, bei denen native Wasserstoffatome durch eine Tritium- oder Deuterium-Markierung ersetzt werden (hierbei handelt es sich um die "AN-Austausch"-Stufe). Anschließend läst man den Bindungspartner in Wechselwirkung mit markiertem Protein treten. Der Bindungspartner verschließt die Bindungsstelle und schützt die Tritium- oder Deuterium-Markierungen dieser Stelle vor einem anschließenden "AUS-Austausch". Sodann werden nach dem "AUS-Austausch" nur die Bindungsstellenreste markiert. Da die Bindungsstelle normalerweise nur einen kleinen Teil der Moleküle darstellt, wird mit dieser Vorgehensweise ein höheres Signal-Hintergrund-Verhältnis als beim herkömmlichen Englander-Verfahren erreicht.
Um die markierten Reste tatsächlich zu identifizieren, muss man zunächst den Komplex unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoff-Isotopenaustausches (H³/H¹ oder H²/H¹) dissoziieren, da ansonsten die Markierungen die Bindungsstelle verlassen würden, sobald der Ligand entfernt wird. Anschließend wird das Bindungsprotein gegebenenfalls fragmentiert (z. B. mit einer Endoprotease, wie Pepsin), was immer noch unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches erfolgt, um Fragmente zu erhalten. Diese Fragmente, die die Markierung tragen, umfassen mutmaßlich die Bindungsstellenreste. An dieser Stelle ist die Auflösung der Bindungsstelle nicht besser als die Fragmentgröße.
Eine feinere Lokalisierung der Markierungen wird durch Analyse der erzeugten Unterfragmente durch einen kontrollierten, stufenweisen Abbau des Bindungsproteins oder der einzelnen isolierten, markierten Peptidfragmente (wenn das Bindungsprotein gegebenenfalls fragmentiert worden ist) unter Bedingungen eines langsamen Austausches erreicht. Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird von einem "progressiven", "stufenweisen" oder "sequenziellen" Abbau des Proteins oder eines Peptidfragments gesprochen, wenn eine Reihe von Fragmenten erhalten wird, die ähnlich den Fragmenten sind, die mit einer idealen Exopeptidase erhalten würden. Für eine ideale Exopeptidase wird nur eine Endamimosäure entfernt. Wenn somit n Aminosäuren eines Peptids in Form von A₁ bis A_n markiert würden (die Nummerierung geht jeweils von dem Ende aus, an dem der Abbau beginnt), ergäbe sich durch eine ideale Exopeptidase eine Reihe von Unterfragmenten in Form von A₂ ... A_n, A₃ ... A_n, ..., A_n–1–A_n und schließlich A_n. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass zwar vorzugsweise jedes Unterfragment der Reihe von erhaltenen Unterfragmenten um einen einzigen terminalen Aminosäurerest kürzer als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe ist, dass aber Exopeptidasen nicht notwendigerweise ideal sind. Somit wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein Fragment als "progressiv", "stufenweise" oder "sequenziell" abgebaut bezeichnet, wenn eine Reihe von Unterfragmenten erzeugt wird, bei denen jedes Unterfragment in der Reihe aus etwa 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist. Die durch die aufeinanderfolgenden Unterfragmente erzeugten Signale werden in Korrelation gebracht, um festzustellen, welche Aminosäuren des in Frage stehenden Fragments markiert wurden.
Dieses Verfahren wurde in keiner der zitierten Druckschriften zu einer weiteren Lokalisierung der Markierungsstellen herangezogen, obgleich eine verbesserte Auflösung mit Sicherheit im Stand der Technik ein Ziel darstellte. Den nächstliegenden Stand der Technik stellt die allgemeine Empfehlung von Englander dar, eine weitere Fragmentierung mit einer anderen "sauren Protease" durchzuführen.
Der progressive Abbau wird vorzugsweise durch ein Enzym und insbesondere durch eine Carboxypeptidase erreicht. Die Notwendigkeit der Verwendung eines sauren pH-Werts zum Zeitpunkt des Abbaus, um Tritiumverluste auf ein Minimum zu beschränken, spricht gegen die Verwendung von Carboxypeptidasen, die durch die erforderlichen sauren Puffer im Wesentlichen inaktiviert werden. Jedoch sind Carboxypeptidase-P, Carboxypeptidase-Y und mehrere andere säurereaktive (d. h. unter sauren Bedingungen enzymatisch aktive) Carboxypeptidasen zur Proteolyse von Peptiden unter sauren Bedingungen, sogar beim pH-Wert 2,7, geeignet.
Eine progressive Unterfragmentierung von gereinigten, eine Tritiummarkierung tragenden Peptiden wird mit säurereaktiven Carboxypeptidasen unter Bedingungen vorgenommen, die einen vollständigen Satz von amidmarkierten Tochterpeptiden erzeugen, die jeweils um 1–5 carboxyterminale Aminosäuren kürzer als das vorhergehende Peptid sind, und zwar vorzugsweise um eine einzige carboxyterminale Aminosäure. Eine HPLC-Analyse von mehreren Mitgliedern dieses Satzes von progressiv geschnittenen Peptiden ermöglicht eine zuverlässige Zuordnung der Markierung auf eine spezielle Amidposition innerhalb des Ausgangspeptids.
Alternativ betrifft die Erfindung C-terminale chemische Abbautechniken, die unter "Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches" durchgeführt werden können, z. B. durch Pentafluorpropionsäureanhydrid. Die Empfindlichkeit der Technik kann durch Verwendung von Referenzpeptid-Unterfragmenten als HPLC-Mobilitätsmarker verbessert werden.
Im Allgemeinen wurden im Stand der Technik die Probleme der ausreichenden Denaturierung des Bindungsproteins, um die Proteolyse unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches zu erleichtern, nicht in ausreichendem Maße berücksichtigt. Pepsin ist beispielsweise bei 0°C weniger aktiv als bei Raumtemperatur. Während Pepsin zur weitgehenden Verdauung von Hämoglobin, das durch einen sauren pH-Wert bei 0°C denaturiert worden ist, befähigt ist, sind bestimmte andere Bindungsproteine, wie Hühnerei-Lysozym, gegen eine Denaturierung durch Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches und damit gegen einen anschließenden Pepsinverdau wesentlich beständiger. Im Ergebnis werden weniger und längere Fragmente erzeugt. Dies macht die Analyse komplizierter.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das markierte Bindungsprotein vor der Fragmentierung denaturierenden Bedingungen ausgesetzt, die mit einem langsamen Wasserstoffaustausch verträglich und ausreichend stark sind, um das Protein in ausreichendem Maße zu denaturieren, dass es für die vorgesehene proteolytische Behandlung in angemessener Weise empfindlich wird. Wenn diese Denaturierungsbedingungen auch zur Denaturierung der Protease führen würden, so wird vor der Proteolyse das denaturierte Protein auf weni ger denaturierende Bedingungen (noch mit einem langsamen Wasserstoffaustausch verträglich) umgestellt, um eine ausreichende Denaturierung unter Aufrechterhaltung des Proteins in einem gegenüber Protease empfindlichen Zustand zu halten, wobei aber die in Frage stehende Protease wesentlich weniger geschädigt wird.
Vorzugsweise handelt es sich beim anfänglichen Denaturierungsmittel um Guanidinthiocyanat. Die weniger denaturierende Bedingung wird durch Verdünnung mit Guanidin-HCl erreicht.
Im zu verdauenden Bindungsprotein gegebenenfalls vorhandene Disulfidbindungen können ebenfalls die Analyse stören. Disulfidbindungen können das Protein in einem gefalteten Zustand halten, wo nur eine relativ geringe Anzahl an Peptidbindungen dem proteolytischen Angriff ausgesetzt ist. Selbst wenn einige Peptidbindungen gespalten werden, würde ein Unterbleiben des Aufbrechens der Disulfidbindungen die Auflösung der durch die Disulfidbindung noch miteinander verbundenen Peptidfragmente verringern, wobei sie anstelle einer Trennung beieinander bleiben würden. Dies würde die Auflösung um einen Faktor von mindestens 2 (möglicherweise mehr, je nach der Beziehung zwischen der Disulfidbindungs-Topologie und den Peptid-Spaltungsstellen) verringern. Wenn die Disulfidbindungen nicht aufgebrochen werden, wäre eine weitere Sublokalisierung der mit Tritium markierten Amide innerhalb der disulfidgebundenen Peptide sehr schwierig, da eine Entfernung von Aminosäuren zu verschiedenen Zeitpunkten und mit verschiedenen Geschwindigkeiten an jedem C-Terminus der disulfidverknüpften Segmente auftreten würde.
Die Anmelderin hat festgestellt, dass wasserlösliche Phosphine zum Aufbrechen von Protein-Disulfidbindungen unter Bedingungen eines "langsamen Wasserstoffaustausches" verwendet werden können. Dies ermöglicht eine wesentlich wirksamere Fragmentierung von großen Proteinen, die Disulfidbindungen enthalten, ohne dass es dazu kommt, dass eine Tritiummarkierung aus dem Protein oder aus dessen proteolytischen Fragmenten verloren geht (wie es der Fall bei herkömmlichen Disulfid-Reduktionstechniken wäre, die bei pH-Werten durchgeführt werden müssen, die für die Erhaltung der Tritiummarkierung sehr ungünstig sind).
Bei einer weiteren Ausführungsform werden Peptidamide an der Oberfläche des Bindungsproteins indirekt durch Übertragung von Tritium oder Deuterium markiert, das vorher durch Wasserstoffaustausch an der Grenzfläche des Bindungspartners gebunden worden ist. Dieses Verfahren bewirkt eine funktionelle Markierung von Rezeptor-Proteinamiden, wenn sie durch Komplexbildung verlangsamt werden und ferner im komplexierten Zustand im innigen Kontakt mit dem Bindungspartner stehen. Amide die von der Wechselwirkungsoberfläche entfernt liegen, jedoch einen verlangsamten Austausch aufgrund der durch die Komplexbildung induzierten allosterischen Veränderungen im Protein zeigen, werden nicht markiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Klärung der Frage dar, welche Peptidamid-Wasserstoffatome in einem Polypeptid oder Protein für das Lösungsmittel zugänglich sind. Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Positionen von für Lösungsmittel zugänglichen Peptidamid-Wasserstoffatomen innerhalb eines Polypeptids oder Proteins mit hoher Auflösung lokalisiert werden, d. h. typischerweise innerhalb von 5 oder weniger Aminosäureresten und in zahlreichen Fällen innerhalb eines einzigen Aminosäurerestes.
Bei dem Verfahren werden für das Lösungsmittel zugängliche Peptidamid-Wasserstoffatome eines Polypeptids oder Proteins von Interesse einem AN-Austausch durch Kontaktieren des Polypeptids oder Proteins mit schwerem Wasserstoff unter Bedingungen unterzogen, bei denen die nativen, für Lösungsmittel zugänglichen Peptidamid-Wasserstoffatome durch schweren Wasserstoff (Deuterium oder Tritium) ersetzt werden, z. B. unter physiologischen Bedingungen, bei denen das Polypeptid oder Protein zu seiner nativen Konformation gefaltet wird. Peptidamid-Protonen, die für das Lösungsmittel nicht zugänglich sind, wie solche, die im Innern der Polypeptid- oder Proteinstruktur verborgen sind oder solche die an intramolekularen Wasserstoffbrücken-Bindungswechselwirkungen teilnehmen, unterliegen nicht leicht einem Austausch mit schweren Wasserstoffatomen im Lösungsmittel. Somit werden die Peptidamid-Wasserstoffatome, die für das Lösungsmittel zugänglich sind, selektiv mit schwerem Wasserstoff markiert.
Die Positionen der markierten Peptidamid-Wasserstoffatome innerhalb des Polypeptids oder Proteins können mit hoher Auflösung lokalisiert werden, indem man progressiv eine Reihe von Unterfragmenten unter Bedingungen eines langsamen Austausches erzeugt, wie vorstehend beschrieben wurde, wobei man feststellt, welche Unterfragmente markiert sind, und die Sequenzen der markierten Unterfragmente mit der Sequenz des Polypeptids oder Proteins in Korrelation stellt, um festzustellen, welche Peptidamidgruppen im Polypeptid oder Protein markiert wurden und somit für das Lösungsmittel zugänglich waren.
In einigen Ausführungsformen, insbesondere in solchen, bei denen das Polypeptid oder Protein von Interesse relativ groß ist, kann das Polypeptid oder Protein gegebenenfalls zuerst fragmentiert werden (z. B. mit einer Endoprotease oder einem Gemisch von Endoproteasen), und zwar unter Bedingungen eines langsamen Austausches, wie vorstehend ausgeführt. Die Positionen der Markierungen können in hoher Auflösung lokalisiert werden, indem man progressiv die einzelnen markierten Fragmente zu einer Reihe von Unterfragmenten abbaut und feststellt, welche Unterfragmente markiert sind, und die Sequenzen der markierten Unterfragmente mit den Sequenzen der markierten Fragmente und letztlich mit der Sequenz des Polypeptids oder Proteins in Korrelation setzt, wie vorstehend beschrieben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden das Polypeptid oder Protein denaturiert und etwaige Disulfidbildungen werden unter Bedingungen eines langsamen Austausches vor der Fragmentierung und/oder Unterfragmentierung reduziert.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1a–1d stellen die Ergebnisse der Analyse von mit Tritium verbundenen Hämoglobin (Hgb)-fragmenten dar, die durch Pepsinverdau von einem Tritiumaustausch unterzogenem Hämoglobin ± monoklonalem Antikörper unter anschließender HPLC in PO₄-gepufferten Lösungsmitteln vom pH-Wert 2,7 erhalten wurden.
1a: Verfolgung der Absorption (214 nm) von unmarkiertem, proteolysiertem Hgb. 1b: Hgb nach 4-stündigem AN-Austausch, Umstellung auf den pH-Wert 2,7 und anschließende Proteolyse ohne AUS-Austausch. 1c: Hgb nach 4-stündigem AN-Austausch, Vermischen mit monoklonalem Antikörper β-6 und anschließend 40-stündiger AUS-Austausch vor einer Proteolyse beim pH-Wert 2,7. 1d: Hgb nach 4-stündigem AN-Austausch und anschließend 40-stündiger AUS-Austausch vor einer Proteolyse beim pH-wert 2,7.
2 stellt die Ergebnisse der zweiten Dimensionstrennung (HPLC mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) mit einem Gehalt an Lösungsmitteln) bei 0°C einer Tritium aufweisenden rpHPLC-Fraktion von der ersten Dimensionstrennung, 1c, dar.
3a–c zeigen die Identifizierung von funktionell markierten Hämoglobinpeptiden durch Wechselwirkung mit monoklonalem Antikörper β-121.
4a–d stellen die Identifizierung von funktionell markierten Hämoglobinpeptiden durch Wechselwirkung mit Haptoglobin dar.
5a–b zeigen die Struktur von Hämoglobin, wobei die Peptidregionen hervorgehoben dargestellt sind. 5a: monoklonale β6-Wechselwirkungspeptide; 5b: monoklonale β121-Wechselwirkungspeptide.
6a–e stellen die Ergebnisse des Carboxypeptidase-P-Verdaus von β1-14-Peptid dar. Ein durch Austausch mit Tritium markiertes synthetisches β1-14-Peptid wurde mit Carboxypeptidase-P (CP-P) unter Anwendung eines Bereiches von Enzymkonzentrationen und Verdauungszeiten (am äußeren linken Rand angegeben) verdaut (0°C). Anschließend wurde eine HPLC-Analyse wie in den 1a–d durchgeführt, wobei aber gleichzeitig der OD₂₁₄-Wert und die Radioaktivität des aus der Säule ausströmenden Produkts gemessen wurden. Die Positionen der verschiedenen gebildeten C-terminalen, geschnittenen Peptidfragmente sind angegeben (Nummern 3 bis 9). Eine progressive Erzeugung von Fragmenten wird beobachtet.
7a–e stellen die Ergebnisse der Reduktion von Disulfidbindungen beim pH-Wert 2,7 dar. Ein durch Tritiumaustausch markiertes β1-14-Peptid (2 μg bei 0°C, pH-Wert 2,7) wurde mit dem Peptid Endothelin (4 μg) versetzt, das zwei Disulfidbindungen enthält (Druckschrift 35). Das Gemisch wurde ohne (7a) oder mit (7b–e) 50 mM Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP) für verschiedene Zeitspannen bei 0°C (7a, 7c–e) oder 2 Minuten bei 22°C (7b) inkubiert. Anschließend wurden die Gemische wie in den 6a–e einer HPLC-Analyse unterworfen. Der prozentuale Anteil an Endothelin, das unter den jeweiligen Bedingungen unreduziert blieb, ist als die Fraktion der Tritiummarkierung angegeben, die am β1-14-Peptid gebunden blieb. Eine 50-%ige Reduktion von Endothelin-Disulfiden wird beim pH-Wert 2,7 bei einem unbedeutenden Verlust von an Peptidamid gebundenem Tritium aus dem β1-14-Peptid erreicht. "R" bedeutet die Positionen der reduzierten Formen von Endothelin.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Biochemische Bindung, allgemeine Ausführungen Zahlreiche biologische Vorgänge werden durch nicht-kovalente Bindungswechselwirkungen zwischen einem Protein und einem anderen Molekül, d. h. dessen Bindungspartner, vermittelt. Die Identifizierung der strukturellen Merkmale der zwei bindenden Moleküle, die unmittelbar zu derartigen Wechselwirkungen beitragen, wäre bei der Entwicklung von Arzneistoffen, die diese Vorgänge verändern, wertvoll.
Moleküle, die bevorzugt eine Bindung miteinander eingehen, lassen sich als Mitglieder eines "spezifischen Bindungspaars" bezeichnen. Zu derartigen Paaren gehören ein Antikörper und dessen Antigen, ein Lectin und ein dieses bindende Kohlenhydrat, ein Enzym und dessen Substrat und ein Hormon und dessen zellulärer Rezeptor. In einigen Arbeiten werden die Ausdrücke "Rezeptor" und "Ligand" zur Identifizierung eines Paars von bindenden Molekülen verwendet. Üblicherweise wird der Ausdruck "Rezeptor" einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaars zugeordnet, bei dem es sich um eine Klasse von Molekülen handelt, die für ihre Bindungsaktivität bekannt sind, z. B. Antikörper. Der Ausdruck "Rezeptor" wird ferner vorwiegend auf das größere Mitglied des Paars angewandt, z. B. auf Avidin im Fall des Avidin-Biotin-Paars. Jedoch ist die Identifizierung von Rezeptor und Ligand letztlich willkürlich. Der Ausdruck "Ligand" kann zur Bezeichnung eines Moleküls verwendet werden, das von anderen Bearbeitern als "Rezeptor" bezeichnet würde. Der Ausdruck "anti-Ligand" wird gelegentlich anstelle des Ausdrucks "Rezeptor" verwendet.
Obgleich Bindungswechselwirkungen zwischen beliebigen Paaren von Molekülen, z. B. zwei Strängen von DNA, stattfinden können, befasst sich die vorliegende Beschreibung vorwiegend mit Wechselwirkungen, bei denen es sich bei mindestens einem der Moleküle um ein Protein handelt. Daher ist es zweckmäßig, von einem "Bindungsprotein" und dessen "Bindungspartner" zu sprechen. Der Ausdruck "Protein" wird hier in einem breiten Sinn verwendet, der, mutatis mutandis, Polypeptide und Oligopeptide sowie Derivate davon, wie Glycoproteine, Lipoproteine und Phosphoproteine sowie Metallproteine umfasst. Die wesentliche Voraussetzung besteht darin, dass das "Bindungsprotein" eine oder mehrere Peptidbindungen (-NHCO-) aufweist, da das Amid-Wasserstoffatom der Peptidbindung (sowie in den Seitenketten von bestimmten Aminosäuren) bestimmte Eigenschaften aufweist, aufgrund derer es selbst zur Analyse durch Protonenaustausch geeignet ist.
Das Bindungsprotein kann identisch mit einem natürlich auftretenden Protein sein oder es kann sich um ein Bindungsfragment oder eine andere Mutante eines derartigen Proteins handeln. Das Fragment oder die Mutante können gleiche oder unterschiedliche Bindungseigenschaften, verglichen mit dem Ausgangsprotein, aufweisen.
Integrale Membranproteine sind von besonderem Interesse, da sie für eine Untersuchung durch Röntgenbeugung nur schwer zu kristallisieren sind. Proteine, die für eine Untersuchung durch NMR-Methoden zu groß sind, z. B. solche mit einer Größe von mehr als etwa 50 kDa, sind ebenfalls von speziellem Interesse, insbesondere wenn sie nicht als ein Verbund von zwei oder mehr getrennt analysierbaren Domänen charakterisiert werden können. Zu Beispielen für geeignete Proteine gehören Integrine (bei denen es sich um große integrale Membranproteine handelt), Zelloberflächenrezeptoren für Wachstumsfaktoren (einschließlich Zytokin-Rezeptoren), "seven-spanners", Selectin und Zelloberflächenrezeptoren der Immunoglobulin-Oberfamilie (z. B. ICAM-1).
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Untersuchung von Proteinen mit diskontinuierlichen Epitopen, z. B. an bestimmten Antikörpern, einschließlich bestimmter, klinisch wichtiger Autoimmun-Antikörper.
Eine "Bindungsstelle" ist ein Kontakt zwischen einer Bindungsoberfläche ("Paratop") des Bindungsproteins und einer komplementären Oberfläche ("Epitop") des Bindungspartners. (Wenn es sich beim Bindungspartner um ein Protein handelt, ist die Bezeichnung "Paratop" und "Epitop" im Wesentlichen willkürlich. Jedoch ist es im Fall von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen üblich, die Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers als "Paratop" und die Zielstelle im Antigen als "Epitop" zu bezeichnen.) Ein spezifisches Bindungspaar kann mehr als eine Bindungsstelle aufweisen. Der Ausdruck "Paar" wird nicht streng angewandt, da das Bindungsprotein zwei oder mehr Bindungspartner binden kann (im Fall eines zweiwertigen Antikörpers). Außerdem können andere Moleküle, z. B. allosterische Effektoren, die Konformation eines Mitglieds des "Paars" verändern und dadurch die Bindung modulieren. Der Ausdruck "Paar" soll diese komplizierteren Wechselwirkungen umfassen.
Bedingungen des langsamen Wasserstoffaustausches
Die vorliegende Erfindung betrifft die Markierung der Bindungsstelle eines Bindungsproteins (oder Bindungspartners) mit einem schweren Wasserstoffisotop und die Bestimmung der Position der Markierungen unter den Bedingungen des verlangsamten Wasserstoffaustausches. Die "Bedingungen des verlangsamten Wasserstoffaustausches" werden hier als Bedingungen definiert, bei denen die Geschwindigkeit des Austausches von normalem Wasserstoff gegen schweren Wasserstoff an Amid-Wasserstoffatomen, die frei dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, erheblich verringert ist, d. h. in ausreichendem Maße, um eine ausreichende Zeitspanne zu bieten, um mit den hier beschriebenen Verfahren die genauen Amid- Wasserstoffpositionen, die mit schwerem Wasserstoff markiert worden sind, zu bestimmen. Die H-Austauschgeschwindigkeit hängt von der Temperatur, dem pH-Wert und dem Lösungsmittel ab. Die Geschwindigkeit nimmt bei einer Temperaturabsenkung von jeweils 10°C um den Faktor 3 ab. Daher wird eine Temperatur nahe bei 0°C bevorzugt. In Wasser ergibt sich die minimale H-Austauschgeschwindigkeit bei einem pH-Wert von 2–3. Mit Abweichung der Bedingungen vom optimalen pH-Wert steigt die H-Austauschgeschwindigkeit an, typischerweise um den Faktor 10 bei Zunahme oder Abnahme um eine pH-Einheit in Bezug zum Minimum. Die Anwendung hoher Konzentrationen eines polaren, organischen Kolösungsmittels verschiebt das pH-Mimnimum auf höhere pH-Werte, möglicherweise bis zum pH-Wert 6 und bei Verwendung des richtigen Lösungsmittels sogar noch weiter nach oben.
Beim pH-Wert 2,7 und bei 0°C beträgt die typische Halbwertszeit einer Tritium-Markierung an einer Amidposition, die dem Lösungsmittel Wasser frei ausgesetzt ist, etwa 70 Minuten. Vorzugsweise führen die erfindungsgemäßen verlangsamten Bedingungen zu einer Halbwertszeit von mindestens 10 Minuten und vorzugsweise von mindestens 60 Minuten.
Ausführungsformen mit Tritiumaustausch
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die folgende Verfahrensweise zur Charakterisierung einer Bindungsstelle oder der Identifizierung mit hoher Auflösung von für das Lösungsmittel zugänglichen Peptidamidgruppen:

A. Die Erscheinung des Wasserstoff-(Tritium)-Austausches wird dazu verwendet, eine radioaktive Sonde (Tritium) an die Stelle der einzelnen Amid-Wasserstoffatome an den Aminosäuren, die die Oberfläche des Rezeptorproteins, unter Einschluss der Oberfläche der Ligandenbindungsstelle des Rezeptors, bilden, zu setzen. Diese Markierung wird unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen erreicht, indem man das Rezeptorprotein in Lösungen mit einem Gehalt an tritiertem Wasser inkubiert. (Vorzugsweise handelt es sich um Wasser von hoher spezifischer Aktivität.) Sofern es angestrebt wird, die Bindungsstellen des Proteins zu charakterisieren, werden die folgenden Stufen (B) und (C) durchgeführt.
B. Sodann wird ein Proteinligand (Bindungspartner) zu dem dem AN-Austausch (Tritierung) unterzogenen Rezeptorprotein gegeben und man ermöglicht eine Bindung an dessen spezifischer Stelle am Rezeptor. Nachdem der Ligand an den Rezeptor gebunden ist, sind Wasserstoffatome an den Aminosäuren, die die Oberfläche der Bindungsstelle des Rezeptors bilden, nicht mehr in der Lage, in wirksamer Weise eine Wechselwirkung mit dem umgebenden wässrigen Puffer einzugehen. Somit wird ein weiterer Wasserstoffaustausch erheblich gehemmt.
C. Der tritierte Rezeptor-Ligand-Komplex wird sodann in physiologische Puffer, die frei von Tritium sind, übertragen. Man ermöglicht der Tritium-Markierung am Rezeptor-Ligand-Komplex einen AUS-Austausch des Rezeptors. Jedoch stellen die vom Bindungskomplex abhängige Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Protein und dem Bindungspartner und die begrenzte Zugänglichkeit des Lösungsmittels zur Protein-Bindungspartner-Grenzfläche im Komplex selektive Behinderungen des AUS-Austausches der sandwichartig zwischen dem Protein und dem Bindungspartner angeordneten Peptidamid-Tritiummarkierung dar. Nachdem die Entfernung (AUS-Austausch) von Tritium aus anderen Regionen des Protein-Bindungspartner-Komplexes im Wesentlichen beendet ist, erhält man als Ergebnis die bevorzugte Retention von Tritiummarkierung an den Amiden, für die der Wasserstoffaustausch durch Protein-Bindungspartner-Wechselwirkungen verlangsamt ist, typischerweise an Amiden in der Nähe von Aminosäuren, die die Oberfläche der Ligandenbindungsstelle des Rezeptors darstellen. Gegebenenfalls kann der Komplex einem begrenzten proteolytischen Verdau, einer Denaturie rung und/oder Disulfidreduzierung unterzogen werden, während der AUS-Austausch abläuft, so lang die Integrität der Bindungsprotein-Bindungspartner-Wechselwirkung durch derartige Maßnahmen nicht erheblich gestört wird. Alternativ kann der Rezeptor-Ligand-Komplex so tritiert werden, dass die Peptidamidgruppen, die die Bindungsstelle und/oder die Bindungsoberfläche bilden, nicht markiert werden und alle übrigen, für das Lösungsmittel zugänglichen Peptidamidgruppen selektiv markiert werden. Somit werden bei dieser alternativen Ausführungsform Peptidamidgruppen, die die Bindungsstelle und/oder Bindungsoberflächen umfassen, durch das Fehlen von Tritium "funktionell markiert".
D. Anschließend werden die spezifischen peptidgebundenen Amide, die Tritium aufweisen, identifiziert. Dies wird folgendermaßen durchgeführt:
(1) Verschieben des markierten Rezeptor-Ligand-Komplexes auf Bedingungen (z. B. 0–4°C, pH-Wert 2,7), die zur Dissoziation des Komplexes führen und gleichzeitig den Amid-Wasserstoffaustausch verlangsamen.
(2) Gegebenenfalls Durchführen einer Proteolyse am Rezeptor unter anschließender Umkehrphasen (RP)-Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)-Trennung (vorzugsweise 2-dimensional) der erhaltenen Rezeptorfragmente unter anhaltenden Bedingungen eines langsamen Protonenaustausches. Rezeptorfragmente, die eine Tritiummarkierung aufweisen, werden sodann identifiziert, isoliert und in Bezug auf ihre Aminosäuresequenz und somit in Bezug auf ihre Stellung innerhalb der primären Aminosäuresequenz des intakten Rezeptors charakterisiert. Die Herstellung des Bindungsproteins für eine proteolytische Analyse kann folgende Maßnahmen umfassen:
(a) Entfernen von Portionen des Proteins, die für die Komplexbildung nicht erforderlich sind;
(b) Aufbrechen von Disulfidbindungen, die die Analyse der Fragmente erschweren könnten (vergl. Abschnitt 5A); und/oder
(c) Denaturierung des Proteins, um es für den proteolytischen Angriff empfindlicher zu machen (vergl. Abschnitt 5B). Die Stufe (a) kann vor oder nach Umstellen auf Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches durchgeführt werden, da sie keine Dissoziation der Kontaktoberflächen bewirkt. Die Stufen (b) und (c) bewirken mit höherer Wahrscheinlichkeit eine derartige Dissoziation und müssen daher häufiger unter den Bedingungen eines langsamen Austausches durchgeführt werden.
(3) Bestimmen der Position der Tritiummarkierung innerhalb des Bindungsproteins oder der einzelnen markierten Peptidfragmente von Stufe (2) durch Unterfragmentierung der markierten Bindungsproteine oder -peptide (z. B. mit säurereaktiven Carboxypeptidasen oder durch chemische Verfahren, die mit einem Tritiumaustausch verträglich sind) unter Bedingungen eines langsamen Protonenaustausches und Charakterisierung der markierten Unterfragmente. Beispielsweise lässt sich die Identität der einzelnen Unterfragmente durch Aminosäureanalyse, durch Peptidsequenzierung oder durch Vergleich ihrer Beweglichkeit mit synthetischen HPLC-Mobilitätsmarkerpeptiden bestimmen. Die Menge der Tritiummarkierung, die an jedes Unterfragment gebunden ist, lässt sich durch Szintillationszählung ermitteln. Da jede carboxyterminale Aminosäure des funktionell markierten Bindungsproteins oder Peptidfragments sequenziell durch die Carboxypeptidase abgespalten wird, wird der Stickstoff, der das langsam austauschende Peptidamid in der intakten Peptidbindung gebildet hat, in ein rasch austauschendes sekundäres Amin umgewandelt und eine etwaige Tritiummarkierung an diesem Stickstoff geht innerhalb von Sekunden aus dem Peptid verloren, während das gesamte übrige amidgebundene Tritium an Ort und Stelle verbleibt. Ein stufenweiser Abfall der Radioaktivität von einem Unterfragment zum nächsten kleineren Unterfragment zeigt an, dass das gerade veränderte Amid mit Tritium markiert war. Auf diese Weise wird innerhalb des Proteins die genaue Position der einzelnen Peptidamide, die funktionell aufgrund ihrer Lösungsmittelzugänglichkeit und/oder ihrer Wechselwirkung mit ihren Bindungspartnern bestimmt. Auf diese Weise werden folglich die genauen Aminosäuren, die die Oberfläche des Rezeptors und/oder die Oberfläche der Bindungsstelle des Rezeptors bilden, bekannt. Es lassen sich Untersuchungen durchführen, um die Austauschgeschwindigkeiten der einzelnen markierten Amide, die auf die vorstehende Weise identifiziert worden sind, vor und nach der Komplexbildung mit dem Bindungspartner quantitativ zu bestimmen. Dies ermöglicht eine Berechnung des Ausmaßes der Verlangsamung des Austausches, die ein jedes dieser Amide im Anschluss an die Komplexbildung erfährt, und ermöglicht eine Optimierung der AN- und AUS-Austauschzeiten.
E. Parallele Untersuchungen lassen sich durchführen, bei denen der verwandte Bindungspartner einem AN-Austausch mit Tritium unterzogen, mit Rezeptorprotein komplexiert, einem AUS-Austausch als Bindungspartner-Protein-Komplex unterzogen und die verlangsamten Amide im Bindungspartner auf die vorstehende Weise identifiziert werden. Dieses Verfahren führt zur Identifizierung der Unterregionen des Bindungspartners, die mit dem Protein in Wechselwirkung treten.
F. Die Kenntnisse über die Identität der genauen Kontaktpeptide sowohl im Rezeptor als auch im Liganden können mit zusätzlichen strukturellen Informationen, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden (Identifizierung von Peptidami den des Proteins und des Bindungspartners, die vermutlich direkt Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Protein und dem Bindungspartner bei der Komplexbildung bilden) kombiniert werden, um Modelle für die komplementären, 3-dimensionalen Strukturen der Rezeptor- und Liganden-Wechselwirkungsoberflächen zu erzeugen. Diese Modelle können sodann als Basis für die Konzeption und Erzeugung geeigneter Peptidarzneistoffe und -peptidomimetischen Arzneistoffe herangezogen werden.

Die einzelnen Stufen dieser Vorgehensweise werden nachstehend ausführlicher erläutert.
1. AN-Austausch
Das zu untersuchende Protein wird in Puffer, der mit tritiertem Wasser (³H₂O), vorzugsweise von hoher spezifischer Aktivität, ergänzt ist, inkubiert. Dies führt zu einem zeitabhängigen, reversiblen Einbau der Tritiummarkierung in jedes Peptidamid an der Oberfläche des Proteins, unter Einschluss von dessen (potentieller) Ligandenbindungsunterregion durch den Mechanismus des Protonenaustausches.
Beliebige physiologische Puffer, die für die Wechselwirkung des Proteins mit dessen Bindungspartner geeignet sind, können verwendet werden (ohne Einschränkungen in Bezug auf den Puffer-pH-Wert oder die Temperatur. Zu geeigneten Puffern gehören phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,15 mM NaCl, 10 mM PO₄, pH-Wert 7,4, PBS. Die Verwendung von kleinen Inkubationsvolumina (0,1–10 μl) mit einem Gehalt an hohen Konzentrationen an Rezeptorprotein (10–100 mg/ml) wird bevorzugt.
Der erforderliche Tritierungsgrad (und somit die Konzentration an Tritium im Puffer) hängt von der Gesamtmenge des für die Analyse verfügbaren Proteins ab. Zur Analyse von 1 mg Protein sind mindestens 10 Ci/ml erwünscht; für 0,1 mg 100 Ci/ml und für 0,01 mg 1000 Ci/ml. (Reines tritiertes H₂O weist etwa 2500 Ci/ml auf.) Für die meisten Anwendungszwecke weist das tritierte Wasser 50–500 Ci/ml auf. Ohne Anwendung dieser hohen spezifischen Aktivitäten wären Untersuchungen von Proteinen, die in begrenzten Mengen verfügbar sind, schwieriger. (Erfindungsgemäß kann auch eine höhere spezifische Aktivität (z. B. 500–1500 Ci/ml) angewandt werden, wobei aber aus Erwägungen der Strahlensicherheit die Durchführung von derartigen AN- und AUS-Austauschvorgängen in speziellen Anlagen erforderlich ist, wie sie im Tritium-Laboratorium des National Tritium Facility, Lawrence Berkeley Laboratories, University of California, Berkeley, verfügbar sind.)
Es ist darauf hinzuweisen, dass mit herkömmlichen Konzentrationen von Tritium nur ein geringer prozentualer Anteil der Bindungsproteinmoleküle an beliebigen gegebenen exponierten Positionen tritiert werden. Es ist lediglich erforderlich, dass im Wesentlichen alle exponierten Amid-Wasserstoffatome in einer nachweisbaren (durch Strahlungszählung) Anzahl der Bindungsproteinmoleküle ersetzt werden.
Es ist nicht erforderlich, dass die Tritium-Austauschanalyse sich nur auf eine einzelne Wahl der "AN-Austausch"-Zeit stützt. Vielmehr kann der Fachmann den Versuch unter Anwendung eines breiten Bereiches von AN-Austauschzeiten durchführen, die sich vorzugsweise über mehrere Größenordnungen erstrecken (Sekunden bis Tage), um eine Auswahl von AN-Austauschzeiten zu ermöglichen, die eine wirksame Markierung der verschiedenen Peptidamide, die im Protein vorhanden sind, gestatten, wobei dieses Protein in Folge der Wechselwirkung des Proteins mit seinem Bindungspartner einer Verlangsamung seiner Austauschgeschwindigkeit unterliegt und gleichzeitig die Hintergrundmarkierung der anderen Amidpositionen, nachdem der AUS-Austausch beendet ist, auf ein Minimum beschränkt wird (vergl. den nachstehenden Abschnitt 10).
2. Rezeptor-Bindungspartner-Komplexbildung
Nach einer geeigneten Dauer des Tritium-AN-Austausches wird der Bindungspartner des Proteins zur tritierten Protein-Pufferlösung gegeben. Die beiden Bestandteile bilden einen Bindungskomplex. Der Bindungspartner wird vorzugsweise in Mengen, die zur Erzeugung einer Sättigungsbindung mit dem Protein ausreichen (üblicherweise äquimolare Mengen) und in hohen Konzentrationen (z. B. 10–100 mg/ml), um die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Bindung auf ein Maximum zu bringen, gegeben. Um die Tritium-Markierung des zugesetzten Bindungspartners durch Protonenaustausch auf ein Minimum zu beschränken (wichtig, wenn man sich kurzer AN-Austauschzeiten bedient), wird das ³H₂O im Puffer vorzugsweise mit tritiumfreien Puffer (10- bis 1000-fache Verdünnung) innerhalb von 0–100 Sekunden nach Zugabe des Bindungspartners verdünnt. Weitere, nachstehend aufgeführte Maßnahmen können bei dieser Stufe ergriffen werden, um den Einbau der Tritium-Markierung in den Bindungspartner weiter zu minimieren.
3. AUS-Austausch
Der tritierte Protein-Bindungspartner-Komplex wird sodann auf physiologische Puffer, die identisch mit den während des AN-Austausches verwendeten Puffern sind, die aber im Wesentlichen frei von Tritium sind, übertragen. Die Tritium-Markierung am Protein unterliegt sodann einem AUS-Austausch des Proteins in Geschwindigkeiten, die überall identisch mit der AN-Austauschgeschwindigkeit sind, ausgenommen an Amiden, die durch die Wechselwirkung von Protein mit Bindungspartner einer Verlangsamung ihrer Austauschgeschwindigkeit unterzogen worden sind. Nach ausreichender AUS-Austauschzeit ergibt sich eine spezifische Retention der Tritium-Markierung an den einzelnen Peptid-Amidbindungen, die zwischen den Aminosäuren auftreten, die die Oberfläche der Protein-Bindungsstelle für den Bindungspartner darstellen. Wir bezeichnen dieses Verfahren als von der Komplexbildung abhängige funktionelle Markierung des Proteins mit Tritium. Mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95, 96, 96, 97, 98 oder 99% oder mehr der dem AN-Austausch unterzogenen Tritium-Markierung an anderen Stellen wird einem AUS-Austausch aus dem Protein unterzogen.
Im Allgemeinen lässt man den AUS-Austausch 5- bis 50-fach länger und vorzugsweise etwa 10-fach länger als die AN-Austauschdauer ablaufen, da dies einen AUS-Austausch aus dem Protein von mehr als 99% der dem AN-Austausch unterzogenen Tritium-Markierung ergibt, die im Anschluss an die Wechselwirkung des Proteins mit dem Bindungspartner keine Verlangsamung der Austauschgeschwindigkeit erfahren hat. Voruntersuchungen können mit dem Protein und dem Bindungspartner durchgeführt werden, um die AN- und AUS-Austauschzeiten zu bestimmen, die das Verhältnis von Signal (Tritium, das in den funktionell markierten Amiden verbleibt) zum Rauschen (Tritium, das in den Hintergrundamiden verbleibt) zu optimieren (vergl. Abschnitt 8).
In bevorzugten Ausführungsformen kann das AUS-Austauschverfahren unter Verwendung von Sephadex G-25-Schleudersäulen, die gemäß Beispiel 1 (vergl. unten) vorbereitet und eingesetzt werden, durch G-25-Säulenchromatographie gemäß Englander (Druckschriften 6 und 19) oder durch Anwendung von perfusiven HPLC-Trägern, die eine rasche Abtrennung von Peptid/Protein aus dem Lösungsmittel ermöglichen (Poros^R-Säulen, PerSeptive Biosystems, Boston, MA), durchgeführt werden. Die Verwendung der G-25-Schleudersäulen ermöglicht die Abtrennung des Komplexes aus mehr als 99,9% Puffer-Tritium. Restliches Puffer-Tritium und dem AUS-Austausch unterzogenes Tritium aus dem Komplex können gegebenenfalls zusätzlich durch Dialyse des Komplexes gegen tritiumfreien Puffer während des AUS-Austausches entfernt werden.
Alternativ können die Komplexbildung und der AUS-Austausch erreicht werden, indem man zunächst das dem AN-Austausch unterzogene Protein-Puffergemisch mit dem Bindungspartner, der kovalent an einen festen Träger (z. B. Bindungspartner-Sepharose) gebunden ist, umsetzt, die Komplexbildung des dem AN-Austausch unterzogenen Proteins mit dem Bindungspartner an der festen Phase ermöglicht und anschließend das Sepharose-Bindungspartner-Protein-Konjugat mit tritiumfreiem Puffer wäscht. Alternativ lassen sich lösliche Protein-Bindungspartner-Komplexe auf die vorstehende Weise bilden und mit einem Festphasen-Adsorbens abfangen, das entweder an das Protein oder die Bindungspartnerkomponente des Komplexes (z. B. Sepharose mit kovalent gebundenen Antikörpern, die für das Protein oder den Bindungspartner spezifisch sind) binden können.
Bei den meisten Protein-Ligand-Bindungswechselwirkungen, die mit dieser Technik sondiert werden können, handelt es sich um reversible Reaktionen: der Bindungspartner dissoziiert während der AUS-Austauschdauer vom Protein und bindet erneut daran, und während der kurzen Zwischenräume, in denen die Protein-Bindungsstelle nicht mit dem Bindungspartner besetzt ist, läuft ein Protonen-AUS-Austausch mit der Geschwindigkeit des ungeschützten Zustands ab. Es ist daher wichtig, die Zeitspanne, in der die Bindungsstelle unbesetzt ist, auf ein Minimum zu beschränken. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird dies erreicht, indem man für hohe Konzentrationen sowohl von Rezeptor als auch Bindungspartner, z. B. mindestens mg/ml-Konzentrationen bis zu 100 mg/ml-Konzentrationen während der gesamten AUS-Austauschdauer, sorgt und die AN- und AUS-Austauschreaktionen bei Temperaturen von Raumtemperatur oder darunter und vorzugsweise bei 4°C durchführt.
4. Zurichten des Bindungsproteins (fakultativ)
Vor der Dissoziation des Komplexes, z. B. während der AUS-Austauschdauer, die typischerweise Stunden bis Tage beträgt, kann der Komplex gegebenenfalls chemisch oder enzymatisch behandelt werden, um das kleinste Proteinfragment zu erzeugen, das noch dazu in der Lage ist, fest am Bin dungspartner gebunden zu bleiben. Dieser verbleibende "zugerichtete" Komplex wird isoliert. Die Entfernung von Teilen des Proteins, die nicht für die anhaltende Komplexbildung wesentlich sind, verringert die Anzahl an Hintergrundpeptiden, die während der anschließenden sauren Proteolyse des zugerichteten Komplexes entstehen (Abschnitt 6). Diese Vorverdauungs- und Reinigungsmaßnahmen können mit einer Vielzahl von Proteasen (z. B. Trypsin, Pronase, V-8-Protease, Chymotrypsin, Proteinase-K) sowie mit bestimmten chemischen Mitteln (z. B. Bromcyan, Iodosobenzoesäure) und unter praktisch beliebigen Bedingungen einer induzierten partiellen Proteindenaturierung (z. B. Harnstoff, Guanidiniumchlorid, Natriumdodecylsulfat, nicht-ionische Detergentien, Reduktionsmittel, wie 2-Mercaptoethanol, Dithiothreit), der Ionenstärke, der Temperatur, der Zeit und des pH-Werts, die zu keiner wesentlichen Dissoziation der Kontaktoberflächen des Protein-Bindungspartner-Komplexes führen, durchgeführt werden. Übermäßige Verdauungsmaßnahmen, die zu einer gegenseitigen Dissoziation dieser Oberflächen führen, können bewirken, dass ein großer Anteil der funktionellen Tritium-Markierung sofort einem AUS-Austausch unterliegt, da mehr als 50% der Peptidamide in den dissoziierenden Oberflächen Austausch-Halbwertszeiten von weniger als 1 Minute bei einem pH-Wert von etwa 7 aufweisen. Das Ziel besteht in der Erzeugung und Isolierung eines Fragments des Proteins mit einer Größe von vorzugsweise 15–100 kD und insbesondere von 15 kD, das am Bindungspartner gebunden bleibt. Häufig ermöglicht die "Ligandenstabilisierung" von Proteinen, die der Proteolyse unterliegen, während sie an den Bindungspartner gebunden sind, die anhaltende Bindung der Proteinfragmente an den Partner.
Voruntersuchungen können mit einem dem AUS-Austausch unterzogenen Komplex durchgeführt werden, um die Bedingungen festzulegen, die zu einem in geeigneter Weise zugerichteten Protein-Bindungspartner-Komplex führen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst die Menge an restlichem Tritium bestimmt, das funktionell an den intakten, dem AUS- Austausch unterzogenen Komplex gebunden ist, durch Messung des Tritiums bestimmt, das an einer G-25-Schleudersäule (pH-Wert 7,4) mit dem Hohlraumvolumen (Mr > 10000 kD) wandert. Aliquotanteile des Komplexes werden verschiedenen Fragmentierungsbedingungen unterzogen. Die Fraktion der Tritium-Markierung, die bei sämtlichen Verdauungsbedingungen an Polypeptiden gebunden bleibt (Wanderung mit dem G-25-Leervolumen), wird bestimmt. Die proteolytischen Produkte der meisten heftigen Verdauungen, die weniger als 5 des komplexassoziierten Tritiums "freisetzen", werden (gemäß Abschnitt 5) auf den pH-Wert 2,7, 0°C, eingestellt, einer RP-HPLC beim pH-Wert 2,7, 0°C, unterworfen, und Peptid/Protein-Fragmente, die die Markierung tragen, werden identifiziert, isoliert und durch SDS-PAGE einer Molekulargewichtsbestimmung unterzogen. Bei den bei diesen begrenzten Verdauungsvorgängen erzeugten markierten proteolytischen Produkten handelt es sich vermutlich um große Polypeptide. Daher werden RP-HPLC-Träger, die sich für die Reinigung derartiger Peptide eignen (C-4, Phenylsäulen), verwendet. Alternativ lässt man dann, wenn Festphasen-Adsorptionsmittel für die Komplexbildungs-/AUS-Austauschvorgänge verwendet werden (Stufe 3) die Proteolyse auf die vorstehend beschriebene Weise (nunmehr des Festphasen-Bindungspartner-Protein-Komplexes) so weitgehend wie möglich ablaufen, ohne dass vom festen Träger mehr als 5% funktionell gebundenes Tritium freigesetzt werden. Der vorverdaute Protein/Komplex wird sodann vom Immunoadsorbens mit Denaturierungsmitteln unter Einschluss einer Verschiebung auf den pH-Wert 2,7 freigesetzt. Das vorverdaute Protein wird ferner einer Proteolyse mit Pepsin, bei denen es sich nicht um säurereaktive Proteasen handelt, proteolysiert.
Ein Bindungsprotein kann auch vorher zugerichtet werden, z. B. vor dem "AN-Austausch" oder vor der Komplexbildung, vorausgesetzt, dass das zugerichtete Protein den Partner in ausreichendem Maße auf ähnliche Weise wie das ursprüngliche Protein von Interesse bindet.
5. Umstellung auf Bedingungen des langsamen Amid-Wasserstoffaustausches
Der Protein-Bindungspartner-Komplex (oder vorverdaute Komplex; vergl. Stufe 4) oder selektiv markiertes Protein im Fall der alternativen Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die Positionen der für das Lösungsmittel zugänglichen Peptidamid-Protonen in Abwesenheit eines Bindungspartners zu bestimmen sind, wird sodann auf Temperatur- und pH-Bedingungen umgestellt, die die Halbwertszeit des Peptidamid-Wasserstoffaustausches stark verlangsamen und im Wesentlichen die Tritium-Markierungen an Ort und Stelle "einfrieren". In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex auf 0°C und einen pH-Wert von 2,7 umgestellt, Bedingungen, bei denen die Halbwertszeit des Austausches der Peptidamid-Markierung in vollständig denaturierten Peptiden mindestens 70 Minuten beträgt. Die Markierung wird unter diesen Bedingungen in ausreichendem Maße an Ort und Stelle gehalten, so dass mehrere Runden einer proteolytischen Fragmentierung, HPLC-Trennung und quantitativen Tritium-Bestimmung ohne inakzeptablen Verlust an Markierung durchgeführt werden können.
Für einige Bindungsproteine ist eine Umstellung auf Bedingungen des langsamen Wasserstoffaustausches ausreichend, um eine Dissoziation des Komplexes zu bewirken. Wenn nicht, kann ein Dissoziationsmittel, wie ein chaotropes Mittel, zugesetzt werden.
5A. Aufbrechen von Disulfidbindungen (fakultativ)
Eine Lokalisierung mit hoher Auflösung von eine Tritiummarkierung aufweisenden Amiden erfordert die proteolytische Erzeugung von Peptiden mit einer Größe von weniger als etwa 15–20 Aminosäuren unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass die Markierung an Ort und Stelle verbleibt (z. B. 0°C, pH-Wert 2,7). Die Fähigkeit einer Protease zur Fragmentierung eines Proteins oder Peptids ist durch die Zugangsmög lichkeit der Protease zu den empfindlichen Peptidbindungen begrenzt. Während die Denaturierungsmittel, wie ein saurer pH-Wert, Harnstoff, Detergentien und organische Kolösungsmittel, Proteine partiell denaturieren können und zahlreiche, ansonsten strukturell abgeschirmte Peptidbindungen freilegen, können vorher vorhandene Disulfidbindungen in einem Protein eine ausreichende Denaturierung mit diesen Mitteln allein verhindern. Bei herkömmlichen strukturellen Untersuchungen von Proteinen werden Disulfide üblicherweise durch Reduktion mit 2-Mercaptoethanol, Dithiothreit oder anderen Reduktionsmitteln gespalten, die ungünstigerweise für eine ausreichende Aktivität einen pH-Wert von mehr als 6 und eine erhöhte Temperatur benötigen und sich daher für die Reduktion von Disulfiden beim pH-Wert 2,7 oder darunter nicht eignen. Aus diesem Grund wurde beim herkömmlichen Tritium-Austausch nicht versucht, irgendwelche Formen von Disulfidbindungen aufzubrechen, wobei der Tritium-Austausch größtenteils auf die Untersuchung von Proteinen ohne vorhandene Disulfidbindungen begrenzt war und eine niedrige Auflösung, die ohne Aufbrechen von Disulfidbindungen erreichbar war, akzeptiert wurde. Die Anmelderin hat erkannt und nachgewiesen, dass säurereaktive Phosphine, wie Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP) (Druckschriften 31–36) zum Aufbrechen von Disulfiden unter den eingeschränkten Bedingungen eines sauren pH-Werts und einer niedrigen Temperatur, die für die Tritium-Austauschanalyse erforderlich sind, herangezogen werden können (vergl. 7a–e). Durch diese Manipulationen werden diese Assoziationen aufgebrochen und gleichzeitig in der Folge eine ausgeprägt verlangsamte Protonenaustauschgeschwindigkeit für Peptidamidprotonen erreicht.
5B. Proteindenaturierung (fakultativ)
In früheren Untersuchungen von Englander et al. und von anderen Arbeitsgruppen, die sich eines Tritiumaustausches von mittlerer Auflösung bedienen, wurde eine proteolytische Fragmentierung von mit Tritium markierten Proteinen unter Bedingungen eines verlangsamten Austausches erreicht, indem man den pH-Wert des Proteins auf 2,7 verschob, hohe Konzentrationen an Pepsin in flüssiger Phase zusetzte und anschließend eine kurze (10 Minuten) Inkubation bei 0°C durchführte. Bei den von Englander et al. untersuchten Proteinen reichte eine einfache Verschiebung des pH-Werts vom physiologischen Wert (7,0) auf 2,7 aus, um die Proteine in ausreichendem Maße zu denaturieren, so dass sie gegen die Proteolyse durch Pepsin bei 0°C empfindlich waren. Ferner enthielten diese Proteine im Allgemeinen keine Disulfidbindungen, die die wirksame Denaturierung durch derartige (saure) pH-Bedingungen stören, oder keine Disulfidbindungen innerhalb von mit dieser Technik zu untersuchenden Bereichen des Proteins. Die Anmelderin hat festgestellt, dass weitere Proteine (z. B. Hühnerei-Lysozym) in vernachlässigbarer Weise denaturiert werden und gegen eine Proteolyse durch Pepsin nicht in wesentlichem Umfang empfindlich sind, wenn sie fortwährend bei vergleichbaren sauren pH-Werten und einer verringerten Temperatur (10–0°C) inkubiert werden. Dies ist die Folge des Vorliegens einer thermischen Barriere gegen eine Denaturierung zahlreicher Proteine, die in vielen Denaturierungsmitteln inkubiert werden; d. h. die Denaturierung von Proteinen bei niedrigeren Temperaturen (10–0°C) stellt häufig einen ineffizienten und langsamen Vorgang dar, der mit dem Erfordernis der Technik des Tritiumaustausches von mittlerer Auflösung, nämlich dass die Vorgänge rasch durchgeführt werden, unverträglich ist, so dass die gebundene Tritium-Markierung im Wesentlichen an funktionell markierten Amiden des Bindungsproteins gebunden ist.
Die Anmelderin hat festgestellt, dass derartige Proteine in außerordentlichem Maße gegenüber einer Proteolyse durch Pepsin bei 0°C empfindlich werden, wenn sie durch das nachstehend beschriebene sequenzielle Denaturierungsverfahren behandelt werden. Ferner hat die Anmelderin festgestellt, dass TCEP zwar die Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen bei 0°C und pH-Werten im Bereich von 2–3 be wirken kann, dass es aber bei der Ausführung unter diesen Bedingungen relativ ineffizient ist und bei der Durchführung der Reduktion bei einem pH-Wert von 5,0 oder darüber wesentlich wirksamer wird. Die Bedingungen können so eingestellt werden, dass der Wirkungsgrad der TCEP-vermittelten Reduktion stark erhöht werden kann, während gleichzeitig die Bedingungen eines langsamen Austausches erhalten bleiben. Dies wird durch gleichzeitige Denaturierung des Proteins mit Guanidinthiocyanat, Anwendung von sehr hohen Konzentrationen an TCEP und Erhöhung des pH-Werts der Lösung auf 5,0 erreicht. Während dieser pH-Wert normalerweise einen inakzeptablen, 100-fachen Anstieg (verglichen mit dem Wert beim pH-Wert 2,7) der Geschwindigkeit des Verlustes von Tritium aus dem markierten Protein bewirkt, wird der erhöhte, pH-induzierte Anstieg der Geschwindigkeit des Tritiumverlustes im Wesentlichen durch Begrenzung des Wassergehalts des Inkubationsgemisches (und somit durch eine erhebliche Verlangsamung der Geschwindigkeit des Tritiumverlustes) ausgeglichen, wenn das Protein beim pH-Wert 5,0 reduziert wird und der pH-Wert der Lösung sodann wieder auf 2,7 verschoben wird, nachdem die Reduktion vollständig ist. Es ergibt sich somit eine wirksame Reduktion von Proteinen bei einem pH-Wert von 5 und 0°C, wobei die Tritium-Markierung am Bindungsprotein im Wesentlichen vollständig erhalten bleibt.
Die Lösung des denaturierten (oder des denaturierten und reduzierten) Proteins wird sodann über eine Pepsin-Agarose-Säule gegeben, wodurch man eine wirksame und rasche Fragmentierung des Proteins (in ≤ 1 min) erreicht. Die Fragmente können sofort durch RP-HPLC analysiert werden (was üblicherweise der Fall ist) ohne dass eine unnötige Verunreinigung des Peptidgemisches mit dem Enzym Pepsin oder Fragmenten des Enzyms Pepsin erfolgt. Eine derartige Kontamination ist bei der Lehre gemäß Englander et al. problematisch, da hohe Konzentrationen an Pepsin (häufig entsprechend der Masse des zu untersuchenden Proteins) verwen det werden, um die Proteolyse rasch beim pH-Wert 0°C zu forcieren.
Während Proteine vor dem Verdau mit Pepsin häufig einer absichtlichen Denaturierung mit Mitteln, bei denen es sich nicht um Mittel zur Verschiebung des pH-Werts handelt, unterworfen werden, wurde dies vorher nie bei verringerten Temperaturen (10–0°C) durchgeführt. Die Anmelderin hat festgestellt, dass Guanidinthiocyanat zwar bei den angegebenen Konzentrationen ausreicht, um Proteine in geeigneter Weise zu denaturieren und sie gegenüber der Proteolyse durch Pepsin bei 10–0°C empfindlich zu machen, dass aber mehrere andere starke Denaturierungsmittel, darunter Harnstoff, HCl, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Guanidin-HCl, zumindest bei Alleinverwendung nicht dazu befähigt sind, Lysozym bei diesen niedrigen Temperaturen in angemessener Weise zu denaturieren. Jedoch sind die Konzentrationen von Guanidinthiocyanat, die für eine derartige Denaturierung erforderlich sind, mit dem Pepsinverdau unverträglich, d. h. sie denaturieren das Pepsin-Enzym, bevor es auf das denaturierende Bindungsprotein einwirken kann. Wenn das Guanidinthiocyanat (bei 10–0°C) aus der Lösung entfernt wird, nachdem die Proteindenaturierung beendet worden ist, und zwar in dem Bestreben, diese Hemmung der Pepsin-Aktivität zu überwinden, kommt es rasch zu einer Rückfaltung und/oder Aggregation des Proteins, was wiederum die proteolytische Wirkung von Pepsin beeinträchtigt.
Die Anmelderin hat festgestellt, dass dann, wenn Proteine zunächst in ≥ 2 M Guanidinthiocyanat bei 0°C denaturiert werden und anschließend die Konzentration des Thiocyanats auf ≤ 2 M verringert wird, während gleichzeitig die Guanidinionen auf ≥ 2 M gehalten werden (durch Verdünnen Guanidinthiocyanats in Guanidinhydrochlorid), das denaturierte Protein in Lösung bleibt, der denaturierte Zustand erhalten bleibt und das Enzym Pepsin in wirksamer Weise proteolytisch aktiv gegen das denaturierte Protein in dieser Lösung von 0°C ist. Die Stabilität von Pepsin-Agarose gegenüber diesem Verdauungspuffer ist so beschaffen, dass keine nachweisbare Beeinträchtigung des Verhaltens der Pepsin-Säule, die von der Anmelderin verwendet wird, auftritt, nachdem sie zur Proteolyse von mehr als 500 Proben über 1 Jahr hinweg verwendet worden ist. Unter diesen Bedingungen findet kein Pepsin-Selbstverdau statt.
Eine Denaturierung ohne gleichzeitige Reduktion des Bindungsproteins kann erreicht werden, indem man es (bei 0–5°C) mit einer Lösung mit einem Gehalt an ≥ 2 M Guanidinthiocyanat vom pH-Wert 2,7 in Kontakt bringt, wonach sich die Zugabe eines gleichen Volumens an 4 M Guanidinhydrochlorid vom pH-Wert 2,7 anschließt.
Eine Denaturierung unter Disulfidreduktion kann erreicht werden, indem man das Bindungsprotein mit einer Lösung mit einem Gehalt an ≥ 2 M Guanidinthiocyanat, 0,3–0,7 M TCEP, 5–20% H₂O (bezogen auf das Volumen) in Kontakt bringt, wobei der Rest des Volumens aus Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder einem weiteren, mit Wasser mischbaren, nichtwässrigen Lösungsmittel besteht, in dem das Denaturierungsmittel (z. B. Guanidinthiocyanat) und das gegebenenfalls verwendete Mittel zum Aufbrechen von Disulfidbindungen (z. B. TCEP) in diesem Konzentrationsbereich löslich bleibt, wobei ein derartiges Lösungsmittelsystem bei der Temperatur des "langsamen Austausches" nicht einfriert. Der pH-Wert der Lösung liegt vorzugsweise im Bereich von 4,8–5,2 und optimal bei 5,0. Nach dieser Inkubation werden 2 Volumenteile einer 2,5 M Guanidinhydrochloridlösung zugegeben, wobei der pH-wert und die Pufferkapazität der Lösung so beschaffen sind, dass im endgültigen Gemisch ein pH-Wert von 2,7 erreicht wird.
Denaturiertes Bindungsprotein (reduziert oder nicht) wird sodann über eine Säule gegeben, die aus unlöslichem (feste Phase) Pepsin besteht, wobei während der Passage eines derartigen denaturierten oder denaturierten und reduzierten Bindungsproteins durch die Säule dieses Produkt im Wesent lichen vollständig durch das Pepsin bei 0°C und einem pH-Wert von 2,7 im Wesentlichen vollständig zu Peptiden mit einer Größe im Bereich von 1–20 Aminosäuren fragmentiert wird. Das aus dieser Säule ausströmende Produkt (mit einem Gehalt an proteolytisch erzeugten Fragmenten des Bindungsproteins) wird direkt und sofort im chromatographischen Verfahren, das zur Abtrennung und Isolierung von Proteinfragmenten, vorzugsweise durch analytische Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie, eingesetzt wird, zugeführt.
Es ist darauf hinzuweisen, dass Denaturierungsmittel neben ihrer Eigenschaft, das Bindungsprotein gegenüber der Proteolyse empfindlicher zu machen, auch dessen Dissoziation vom Bindungspartner unterstützen.
6. Erzeugung von Peptidfragmenten (fakultativ)
Um letztlich die Amide des Proteins, die funktionell mit Tritium markiert sind, zu lokalisieren, werden kleine Peptide, die die verbliebene Tritium-Markierung tragen (vorzugsweise mit einer Größe von 5–25 Aminosäuren), gegebenenfalls proteolytisch aus dem markierten Protein erzeugt und von den zahlreichen übrigen unmarkierten Peptiden, die durch Fragmentierung des Proteins entstanden sind, abgetrennt, wobei sämtliche Maßnahmen unter Bedingungen durchgeführt werden, die den AUS-Austausch von Amid-Tritium aus dem Peptid auf ein Minimum beschränken. Kleine Peptide weisen eine geringfügige Sekundärstruktur auf, so dass ihre Amide frei für einen Austausch mit Lösungsmittelwasserstoff bereitstehen. Wenn die Tritium-Markierung an derartigen Stellen an Ort und Stelle verbleiben soll, müssen die Bedingungen der Proteolyse und Reinigung (z. B. RP-HPLC) so eingestellt werden, dass ein derartiger AUS-Austausch verlangsamt wird.
Das markierte und dissoziierte Bindungsprotein wird daher unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches fragmentiert, z. B. durch Proteolyse mit hohen Konzentratio nen einer Protease, die unter den vorerwähnten Bedingungen (z. B. pH-Wert 2,7, 0°C) stabil und aktiv ist. Zu geeigneten säuretoleranten Proteasen gehören Pepsin (Druckschrift 19), Cathepsin-D (Druckschrift 37), Aspergillus-Proteasen (Druckschriften 37a–37c), Thermolysin (Druckschrift 38) und Gemische dieser Proteasen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Pepsin verwendet, vorzugsweise in einer Konzentration von 10 mg/ml Pepsin bei 0°C und einem pH-Wert von 2,7 für Zeitspannen von 5–30 Minuten und vorzugsweise von 10 Minuten.
Weitere physikalische und chemische Fragmentierungsverfahren können verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie (1) mit den Bedingungen eines langsamen H-Austausches verträglich sind, (2) keine Verschiebungen der Positionen der Amid-Markierungen bewirken und (3) eine vernünftige Anzahl an Fragmenten aus dem Protein von Interesse erzeugen.
Vorzugsweise wird vor der Fragmentierung des Bindungsproteins der Bindungspartner (wenn er gegenüber dem Fragmentierungsmittel empfindlich ist) entfernt, so dass er die Reinigung mit Bindungspartnerfragmenten nicht erschwert.
6A. Reinigung von Fragmenten
Da saure Proteasen im Allgemeinen eine sehr breite Spaltungsspezifität aufweisen, fragmentieren sie das Protein in eine sehr große Anzahl von verschiedenen Peptiden. Bei den meisten durch Tritiumaustausch untersuchten Protein-Bindungspartner-Systemen ist es wahrscheinlich, dass die Wechselwirkungsbindungsoberflächen ungefähr 10–20 mit Tritium markierte Peptidamide aufweisen, die bei Proteolyse zu Peptiden, die etwa 1–5 Markierungen tragen, führen, wobei die genaue Anzahl vom natürlichen Fragmentierungsmodus des zu untersuchenden Proteins mit den verwendeten Proteasen abhängt. Die Anzahl der nicht-markierten "Hintergrund"-Peptide (abgeleitet von Regionen des Proteins und des Bindungspartners, die nicht an der Bindungswechselwirkung teilnehmen), die durch das Fragmentierungsverfahren erzeugt worden ist, stellt eine direkte Funktion der Größe des Proteins dar. Hintergrund-Peptide sind im proteolytischen Verdauungsprodukt in einer Anzahl vorhanden, die 10- bis 1000-fach größer ist als die Anzahl der funktionell markierten Peptide, wenn Proteine mit Größen im Bereich von 30–200 kD proteolysiert werden.
Diese große Anzahl an Hintergrund-Peptiden verursacht zwei Schwierigkeiten: erstens müssen sie alle sauber von den funktionell markierten Peptiden abgetrennt werden, um eine Identifizierung von Peptiden mit einer Markierung zu ermöglichen. Zweitens enthalten Hintergrundpeptide geringe Mengen an Tritium-Markierung und selbst wenn der Anteil der Markierung pro Hintergrund-Peptid im Allgemeinen weniger als 1% der Anzahl der funktionell markierten Peptide beträgt, sind Hintergrund-Peptide in wesentlich größeren Mengen vorhanden und bewirken wahrscheinlich eine Verschleierung der Anwesenheit von funktionell markierten Peptiden und eine Verschleierung der analytischen Trennung.
Bei dieser Sachlage wurden in der Vergangenheit durch Tritiumaustausch von mittlerer Auflösung nur Proteine mit einer Größe von weniger als 30 kD in erfolgreicher Weise charakterisiert. Bei saurer Proteolyse von größeren Proteinen werden so zahlreiche Fragmente erhalten, dass individuelle Fraktionen, die bei einer beim pH-Wert 2,7 durchgeführten, einzelnen HPLC-Trennung erhalten worden sind, in inakzeptabler Weise durch Hintergrund-Peptide verunreinigt wären.
Alle Verfahren zur Reinigung der Fragmente, die zur Auftrennung des Gemisches unter Aufrechterhaltung der Bedingungen eines langsamen H-Austausches befähigt sind, sind akzeptabel. Das bevorzugte Verfahren ist die Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), insbesondere in umgekehrter Phase (RP). (Ein alternatives Verfahren ist die Massenspektroskopie.)
Im Stand der Technik wurde die Empfindlichkeit der Tritium-Markierung gegenüber dem pH-Wert überbetont. Englander (Druckschrift 10)) berichtete, dass bei 0°C die Tritium-Markierung beim pH-Wert 2,7 besonders stabil war (wenn das tritierte Protein in einen untritierten wässrigen Puffer gebracht wurde) und dass die Geschwindigkeit des AUS-Austausches rasch zunahm (10-fach pro pH-Einheit), wenn man sich von diesem pH-Wert weg bewegte. Überraschenderweise hat die Anmelderin festgestellt, dass bei 0°C die Markierung ausreichend stabil war, um eine Analyse selbst beim pH-Wert 2,1 zu ermöglichen. Während dieser akzeptable pH-Bereich sich mit der Temperatur und der Wahl des Lösungsmittels verändert (der optimale pH-Wert nimmt zu, wenn ein polares, nicht wässriges Lösungsmittel zugegeben wird), bleibt die Tatsache bestehen, dass der pH-Wert vorher als im Wesentlichen feststehend angesehen wurde. Da die Tritium-Markierung über einen breiteren pH-Bereich, z. B. bei 2,1–3,5, stabil war, ist es möglich, von dem von Englander empfohlenen pH-Wert von 2,7 abzuweichen, in dem Bestreben, HPLC-Bedingungen zu ermöglichen, die zu einer wirksamen Trennung der Peptidfragmente führen.
Bei groben Bindungsmolekülen werden nach dem proteolytischen Verdau so zahlreiche Fragmente erhalten, dass einige der individuellen Peaks bei einer einzigen HPLC-Trennung, selbst bei einem optimierten pH-Wert, heterogen sein können.
Die RP-HPLC-Auflösung von gemeinsam wandernden, zahlreichen Peptiden kann durch Zuhilfenahme einer zweidimensionalen RP-HPLC-Trennung stark verbessert werden, bei der zwei aufeinanderfolgende RP-HPLC-Trennungen bei erheblich unterschiedlichen pH-Werten, z. B. 2,7 und 2,1 durchgeführt werden.
Eine zweidimensionale HPLC-Trennung ermöglicht einen hohen Wirkungsgrad der Reinigung der Tritium-Markierungen tragen den Peptide aus der riesigen Anzahl von unmarkierten Peptiden, die durch die peptische Fragmentierung von großen Proteinen erzeugt worden sind. Eine zweidimensionale Trennung von Molekülen ist auf dem Gebiet der Chromatographie bekannt. Jedoch wurden trotz zahlreicher Klagen in der Tritium-Austausch-Literatur über Auftrennungsprobleme zweidimensionale Trennungen früher nicht in Verbindung mit dem Tritium-Austausch herangezogen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mit Tritium markierte Proteinfragmente zunächst durch Maßnahmen getrennt, die zu einer ausreichenden Auftrennung der Fragmente in der Lage sind, z. B. durch RP-HPLC (unter Verwendung einer Anzahl von möglichen chromatographischen Trägern, einschließlich C4, C18, Phenol und Ionenaustausch, vorzugsweise C18). Diese Trennung kann beim pH-Wert 2,1–3,5 und bei 4–0°C und vorzugsweise beim pH-Wert 2,7 und 0°C durchgeführt werden, was durch Verwendung beliebiger Puffersysteme, die bei diesem pH-Wert funktionsfähig sind, erreicht werden kann, einschließlich Citrat, Chlorid, Acetat und insbesondere Phosphat. Peptide werden aus der Umkehrphasensäule mit einem auf ähnliche Weise gepufferten Gradienten von polaren Kolösungsmitteln, einschließlich Methanol, Dioxan, Propanol und vorzugsweise Acetonitril, eluiert. Die eluierten Peptide werden durch on-line-UV-Licht-Absorptionsspektroskopie, die bei Frequenzen von 200 bis 300 nm und vorzugsweise bei 214 nm durchgeführt wird, nachgewiesen. Die Tritium-Markierung wird durch Szintillationszählung einer Probenfraktion des HPLC-Säulenausflusses nachgewiesen. Peptide, die die Markierung tragen, die durch Komplexbildung mit einem Bindungspartner spezifisch gegen den AUS-Austausch geschützt ist, werden durch Vergleich der spezifischen Aktivität der einzelnen markierten Peptide mit der spezifischen Aktivität des gleichen Peptids identifiziert, das aus einem Protein hergestellt worden ist, das identischen AN-AUS-Austausch-, Proteolyse- und HPLC-Bedingungen unterworfen worden ist, wobei aber der AUS-Austausch ohne zugesetzten Bindungspartner vorgenommen worden ist.
HPLC-Fraktionen, die Peptide mit derartigen funktionell markierten Amiden enthalten, werden sodann einer RP-HPLC-Trennung in einer zweiten Dimension unterzogen, die beim pH-Wert 2,1–3,5 und 4–0°C und vorzugsweise beim pH-Wert 2,1 und 0°C durchgeführt werden kann, in Verbindung mit beliebigen Puffersystemen, die bei diesem pH-Wert funktionsfähig sind, einschließlich Citrat, Chlorid, Acetat, Phosphat und insbesondere TFA (0,1–0,115%). Peptide werden von ihrer Umkehrphasensäule mit einem in ähnlicher Weise gepufferten Gradienten von polaren Kolösungsmitteln, einschließlich Methanol, Dioxan, Propanol und insbesondere Acetonitril, eluiert. Die eluierten Peptide werden nachgewiesen, Tritium wird gemessen und funktionell markierte Peptide werden wie bei der vorstehend beschriebenen HPLC-Analyse der ersten Dimension identifiziert. Funktionell markierte Peptide werden isoliert (Sammlung der entsprechenden Fraktion des Säulenausflusses), Wasser, Acetonitril und TFA werden durch Abdampfen entfernt und die verbleibenden gereinigten Peptide werden jeweils durch herkömmliche Techniken in Bezug auf ihre primäre Aminosäurestruktur charakterisiert, z. B. durch Aminosäureanalyse von vollständigen Säurehydrolysaten oder durch Gasphasen-Edman-Abbau-Mikrosequenzierung. Sodann wird Bezug genommen auf die vorher bekannte Aminosäuresequenz des intakten Proteins um auf die Position der mit Tritium markierten Peptide innerhalb der intakten primären Sequenz des Proteins zu schließen. Eine Verwendung von TFA-Puffer bei der zweiten Dimension hat den zusätzlichen Vorteil, dass kein restliches Salz (d. h. Phosphat) nach der Abdampfung des Lösungsmittels verbleibt. Das restliche Phosphat stört häufig die chemischen Reaktionen, die für die Aminosäureanalyse und den Edman-Abbau erforderlich sind, ein Problem, das durch die Verwendung von flüchtigem TFA im Puffer der zweiten Dimension vermieden wird.
Insbesondere werden proteolytische Verdauungsprodukte zunächst beim pH-Wert 2,7 in phosphatgepufferten Lösungs mitteln getrennt und die einzelnen Peptid-Peakfraktionen, die die mit Tritium markierten Amide enthalten, werden identifiziert, gesammelt und sodann einer zweiten HPLC-Trennung unterzogen, die in mit Trifluoressigsäure (TFA) gepufferten Lösungsmitteln beim pH-Wert 2,1 durchgeführt wird.
7. Hochauflösende Sublokalisierung von markierten Amiden innerhalb von einer Markierung tragenden Peptiden
Um routinemäßig Peptidamid-Tritium-Markierungen auf dem Niveau von einzelnen Aminosäuren zu lokalisieren, spaltet die Anmelderin systematisch die einzelnen Peptidbindungen innerhalb des markierten Proteins oder eines gereinigten, eine Markierung tragenden Peptidfragments. Bedingungen eines langsamen H-Austausches müssen für diese Proteolyse herangezogen werden, da die erzeugten kleinen Peptide keine stabile Konformationsstruktur aufweisen und ein rascher Verlust an Tritium-Markierung aus den Amiden auftreten würde, wenn die Austauschgeschwindigkeiten nicht verlangsamt würden, z. B. durch eine saure pH-Umgebung.
Die meisten bekannten säurereaktiven Proteasen spalten Peptide in einer im Grunde genommen unspezifischen Art und Weise, ähnlich wie Pepsin. Untersuchungen unter Verwendung von anderen pepsinartigen Proteasen haben keine signifikante Eignung zur Erhöhung der Auflösung der markierten Amide ergeben.
Eine spezielle Klasse von säurereaktiven Proteasen, die Carboxypeptidasen, sind zur Erzeugung sämtlicher erforderlicher Unterfragmente von markierten Proteinen oder durch Pepsin erzeugten Peptide in Mengen befähigt, die für eine hochauflösende Tritium-Lokalisierung ausreichen. Zahlreiche Carboxypeptidasen sind beim pH-Wert 2,7 aktiv und spalten sequenziell Aminosäuren vom Carboxy-Terminus der Peptide. Derartige Enzyme umfassen Carboxypeptidase P, Y, W und C (Druckschrift 39). Während Carboxypeptidasen für eine be grenzte carboxyterminale Sequenzierung von Peptiden, häufig beim pH-Wert im Bereich von 2,7 (Druckschrift 40), verwendet werden, wurde ihre Verwendung bei Tritium-Austauschtechniken nicht beschrieben. Die Notwendigkeit zur Minimierung von Tritium-Verlusten verbietet die Verwendung von Carboxypeptidasen, die in sauren Puffern (pH-Wert 2,7) inaktiv sind, z. B. von Carboxypeptidasen A und B. Jedoch sind Carboxypeptidase P und Y sowie mehrere weitere säurereaktive Carboxypeptidasen (W, C) für die Proteolyse von Peptiden unter sauren Bedingungen geeignet (Druckschrift 39). Im Stand der Technik in Bezug auf den Tritium-Austausch erkannte man nicht die Eignung von Carboxypeptidasen für Untersuchungen des Tritium-Austausches, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass die Carboxypeptidasen in Bezug auf die Typen von Peptidbindungen, die sie spalten, noch unspezifischer sind als pepsinartige Proteasen, so dass man annahm, dass sie zu einer unzureichenden Gewinnung von einzelnen Unterfragmenten führen würden.
Ferner können chemische Verfahren unter Verwendung von Pentafluorpropionsäureanhydrid Sätze von C-terminal geschnittenen Peptidfragmenten unter Bedingungen eines langsamen Amidaustausches liefern (vergl. die nachstehenden Ausführungen, Druckschriften 41 und 42).
In der bevorzugten Ausführungsform werden durch Tritium-Austausch markierte Proteine unspezifisch mit Pepsin oder pepsinartigen Proteasen fragmentiert, die erhaltenen, mit Tritium markierten Peptide durch zweidimensionale HPLC isoliert und diese wiederum durch kontrollierten, stufenweisen Verdau mit sauren Exopeptidasen (d. h. unter sauren Bedingungen enzymatisch aktive Enzyme) und/oder durch chemische Maßnahmen (vergl. die nachstehenden Ausführungen) erschöpfend unterfragmentiert. Diese Verdauungsprodukte werden sodann durch RP-HPLC, die bei 0°C in TFA enthaltenden Puffern (pH-Wert 2,1) durchgeführt wird, analysiert. Die einzelnen erzeugten Unterfragmente (typischerweise 5– 20) werden sodann identifiziert. Die Identität von jedem der mehreren Unterfragmente kann durch eine geeignete Aminosäureanalyse, Peptidsequenzierung oder unter Verwendung von synthetischen HPLC-Mobilitätsmarkerpeptiden bestimmt werden. Die Menge der Tritium-Markierung, die an jedem Unterfragment des geschnittenen Peptids gebunden ist, kann durch Szintillationszählung ermittelt werden. Auf diese Weise wird innerhalb des Proteins die genaue Position der einzelnen Peptidamide, die funktionell mit Tritium aufgrund der Wechselwirkung mit dem Bindungspartner markiert sind, bestimmt. Durch Berücksichtigung des Tritiumgehalts der einzelnen identifizierten Unterfragmente kann ein Rückschluss auf Amidwasserstoffatome, die während der "AN-Austausch"-Stufe durch Tritium ersetzt worden sind, gezogen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass der Zweck der Behandlung mit Carboxypeptidase darin besteht, Unterfragmente zu erzeugen. Das Verfahren erfordert nicht die Verwendung von Carboxypeptidase zur Sequenzierung der Fragmente oder Unterfragmente. Vorzugsweise ist die Sequenz des Bindungsproteins oder zumindest des materiellen Teils davon vor Beginn des vorliegenden Verfahrens bekannt. Jedoch kann sie zu einem beliebigen Zeitpunkt, auch nach der Unterfragmentierung, bestimmt werden, obgleich die aus den Unterfragmenten gesammelten Daten nicht in geeigneter Weise interpretiert werden können, bis die Sequenzen zumindest der Quelle bekannt sind.
Ein kontrollierter sequenzieller, carboxyterminaler Verdau der mit Tritium markierten Peptide mit Carboxypeptidasen kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die zur Bildung von analytisch ausreichenden Mengen eines Satzes von carboxyterminalen, geschnittenen Tochterpeptiden führen, die jeweils um 1 bis etwa 5 carboxyterminale Aminosäurereste kürzer als das vorhergehende Peptid sind, und vorzugsweise um eine einzige carboxyterminale Aminosäure. Während die einzelnen carboxyterminalen Aminosäuren des funktionell markierten Peptids sequenziell durch die Carboxypeptidase abgespalten werden, wird der Stickstoff, der das dem langsamen Austausch unterliegende Peptidamid in der intakten Peptidbindung bildete, zu einem rasch austauschenden sekundären Amin umgewandelt und eine etwaige Tritium-Markierung an diesem Stickstoff geht aus dem Peptid innerhalb von Sekunden verloren, selbst bei einem sauren pH-Wert. Eine Differenz in der molaren Menge der Tritium-Markierung, die mit beliebigen zwei sequenziellen Unterpeptiden verbunden ist, lässt darauf schließen, dass sich die Markierung an dem peptidgebundenen Amid befindet, das zwischen den beiden Unterpeptiden unterschiedlich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden synthetische Peptide erzeugt (durch übliche Peptidsynthesetechniken), die in Bezug auf ihre primäre Aminosäuresequenz mit jedem der in Stufe 6 identifizierten, funktionell markierten, durch Pepsin erzeugten Peptide identisch sind. Die synthetischen Peptide können sodann bei vorläufigen Untersuchungen des Carboxypeptidase-Verdaus (pH-Wert 2,7, 0°C) und der HPLC-Analyse (in mit TFA gepufferten Lösungsmitteln) herangezogen werden, um Folgendes festzustellen: (1) die optimalen Bedingungen der Verdauungszeit und der Proteasekonzentration, die zur Bildung und zum identifizierenden Verdau sämtlicher möglicher Carboxypeptidase-Produkte des zu untersuchenden Peptids führen; und (2) die HPLC-Elutionsposition (Mobilität) der einzelnen, durch Carboxypeptidase erzeugten Unterfragmente des synthetischen Peptids.
Um diese letztgenannte Vorgehensweise zu erleichtern, kann ein Satz von Vergleichspeptiden hergestellt werden, die aus sämtlichen möglichen, carboxyterminalen, geschnittenen Tochterpeptiden bestehen, die eine saure Carboxypeptidase bei Verdau eines "parentalen" Peptids erzeugen könnte. Diese dienen als Identitätsstandard für die HPLC-Mobilität und ermöglichen die Ableitung der Identität von Tochterpeptiden, die durch den Carboxypeptidase-Verdau tatsächlich erzeugt worden sind. Bestimmte Tochterpeptide lassen sich enzymatisch in für die direkte Aminosäureanalyse oder Sequenzierung unzureichenden Mengen erzeugen, jedoch kann ihre HPLC-Mobilität gemessen und mit der von synthetischen Peptiden verglichen werden. Peptide können durch übliche in-line-Spektrophotometer (typischerweise UV-Absorption bei 200–214 nm) in Konzentrationen nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden, die deutlich unterhalb der Mengen liegen, die für die Aminosäureanalyse oder die Gasphasen-Edman-Sequenzierung erforderlich sind.
Nach diesen Voruntersuchungen wird das durch Pepsin erzeugte, durch HPLC isolierte, funktionell markierte Peptid (in Stufe 6 hergestellt) sodann mit Carboxypeptidase verdaut und unter den vorerwähnten, experimentell optimierten Bedingungen analysiert, wobei die Identität der einzelnen Fragmente bestimmt wird (durch Peptidsequenzierung oder durch Vergleich mit der Mobilität des Referenzpeptid-Mobilitätsmarkers) und die Menge des mit jedem Unterfragment verbundenen Tritiums wird bestimmt.
Alternativ kann eine chemische Technik zum sukzessiven, carboxyterminalen Abbau von Peptiden unter Bedingungen eines verlangsamten Tritiumaustausches herangezogen werden. Mit Tritium markierte Peptide in HPLC-Puffern werden bei –35°C gehalten und die Lösungsmittel werden durch Kryosublimation entfernt (Druckschriften 40a, 40b; Vakuum 1–20 mtorr, Gewinnen der Lösungsmittel in einer Falle mit flüssigem Stickstoff). Das getrocknete Peptid wird sodann in der Dampfphase mit Pentafluorpropionsäureanhydrid (PFPA) gemäß den Angaben in den Druckschriften 54 und 55 umgesetzt, mit der Ausnahme, dass die Peptidtemperatur bis zu 3 Stunden bei –35°C gehalten wird. Anschließend wird PFPA unter Vakuum entfernt. Das fragmentierte Peptid wird auf 50 mM PO₄, pH-Wert 2,7, gebracht und mit HPLC analysiert.
Im Allgemeinen sind die bekannten Aminopeptidasen nicht dazu befähigt, sequenziell ein Peptid unter Bedingungen des langsamen Wasserstoffaustausches abzubauen. Wenn jedoch eine säurereaktive Aminopeptidase in der Natur aufgefunden oder durch Mutation einer bekannten Aminopeptidase erzeugt werden sollte, ist kein Grund ersichtlich, dass eine Aminopeptidase nicht anstelle der derzeit bevorzugten Carboxypeptidase verwendet werden könnte. In diesem Fall beginnt der stufenweise Abbau am N-Terminus, statt am C-Terminus der einzelnen analysierten Peptidfragmente.
Es ist darauf hinzuweisen, dass durch Verwendung von polaren, nicht-wässrigen Kolösungsmitteln in hohen Konzentrationen zur Verschiebung des pH_min-Werts der H-Austauschgeschwindigkeit eine größere Vielzahl von Reagenzien verwendet werden kann, als es ansonsten der Fall ist. Bei einem Kolösungsmittel, das diesbezüglich von besonderem Interesse ist, handelt es sich um Glycerin (oder um andere Polyole), da bei Glycerin die Wahrscheinlichkeit einer Denaturierung des Enzyms bei Verwendung in einer hohen Konzentration, um den pH_min-Wert erheblich zu verschieben, unwahrscheinlich ist.
8. Optimierung der AN- und AUS-Austauschzeiten
Die einzelnen Peptidamid-Wasserstoffatome, die mit der Protein-Bindungspartner-Wechselwirkungsoberfläche verbunden sind, weisen eine besondere Austauschgeschwindigkeit mit Lösungsmittel-Tritium im nativen, gefalteten, unligierten Zustand auf, die dann zu einer anderen, unterschiedlichen Austauschgeschwindigkeit verschoben wird, nachdem die Protein-Bindungspartner-Komplexbildung stattgefunden hat. Das Signal-Rausch-Verhältnis (Verhältnis des funktionell an dieses Peptidamid gebundenen Tritiums zum gesamten Hintergrund-Tritium, das an sämtliche übrigen Peptidamide im Protein gebunden ist), kann durch Kenntnis der Austauschgeschwindigkeiten dieses Amidwasserstoffatoms im nativen, unligierten Protein und im Protein-Bindungspartner-Komplex optimiert werden.
Ein Amidwasserstoffatom mit einer Austauschhalbwertszeit von 1 Minute im nativen, unligierten Zustand des Proteins und von 10 Minuten im ligierten Zustand könnte in optimaler Weise durch AN-Austausch des Rezeptorproteins für 2 Minuten (2 Halbwertszeiten der AN-Austauschzeit führen zu einem Einbau von Tritium in einer Menge von 75% der maximal möglichen Gleichgewichtsmarkierung des Peptidamids) und anschließendem 10-minütigem AUS-Austausch im ligierten Zustand (50% der dem AN-Austausch unterzogenen Markierung verbleiben am funktionell markierten Peptidamid und weniger als 0,1% der dem AN-Austausch unterzogenen Markierung verbleiben an jedem der markierten Hintergrund-Peptidamide) untersucht werden.
Zur Messung der Austauschgeschwindigkeiten eines speziellen, funktionell markierbaren Peptidamids, wie es im nativen, unligierten Protein vorliegt, werden Aliquotanteile des Proteins für unterschiedliche Zeitspannen (0,5 Sekunden bis 24 Stunden) einem AN-Austausch unterzogen, an den Bindungspartner gebunden und sodann für eine festgelegte Zeitspanne und vorzugsweise für 24 Stunden einem AUS-Austausch unterzogen. Nach proteolytischem Verdau beim pH-Wert 2,7 und 0°C und HPLC-Trennung wird die mit dem Peptidfragment, die das zu untersuchende Peptidamid enthält, verbundene Radioaktivität gemessen. Die Radioaktivitätsmenge, die den Hintergrund bildet (Amide, die nicht funktionell markiert sind), wird bestimmt, indem man die Menge der Markierung misst, die mit dem gleichen Peptid verbunden ist, wenn das Protein für die gleiche Dauer einem AN-Austausch unterzogen wird, jedoch einem AUS-Austausch für 24 Stunden in Abwesenheit von zugesetztem Liganden unterzogen wird, bevor die Proteolyse und HPLC-Analyse durchgeführt wird. Eine spezifische Radioaktivität, die mit dem Amid verbunden ist, wird als Funktion der AN-Austauschzeit bestimmt. Die Halbwertszeit des AN-Austausches des Amids im unligierten Protein wird berechnet.
Zur Bestimmung der Austauschgeschwindigkeit des gleichen Peptidamids für den Fall, dass dieses im Protein-Bindungspartner-Komplex vorliegt, wird das Protein für eine festge legte, lange Zeitdauer (vorzugsweise 24 Stunden) einem AN-Austausch unterzogen, mit dem Bindungspartner komplexiert, für verschiedene Zeitspannen einem AUS-Austausch (vorzugsweise 10 Sekunden bis 4 Tage) unterzogen, mit Säure proteolysiert und auf die vorstehende Weise einer HPLC-Analyse unterzogen. Die spezifische Radioaktivität, die mit dem Amid verbunden ist, ward als eine Funktion der AUS-Austauschzeit bestimmt. Die Halbwertszeit des (AUS)-Austausches des Amids im ligierten Protein wird berechnet. Mit dieser Information werden die Zeiten des AN- und AUS-Austausches so eingestellt, dass das Signal/Rausch-Verhältnis für jedes der funktionell markierten Amide im untersuchten Protein-Bindungspartner-System optimiert wird.
9. Modellbildung von Rezeptor-Ligand-Kontaktoberflächen
Untersuchungen, die in identischer Weise für die vorstehend beschriebenen Untersuchungen (1–8) konzipiert sind, können auch am entsprechenden Bindungspartnerprotein durchgeführt werden (das Bindungspartnerprotein wird einem AN-Austausch unterzogen, an das Rezeptorprotein ligiert, einem AUS-Austausch unterzogen und dergl., was zur Identifizierung der Amide des Bindungspartners führt, die durch Wechselwirkung mit dem Rezeptorprotein eine Verlangsamung des Austausches erfahren haben. Die Kenntnis der Identität der genauen Kontaktpeptide sowohl im Protein als auch im Bindungspartner kann dazu herangezogen werden, rechnergestützte Modelle für die komplementären, dreidimensionalen Strukturen der Protein- und Bindungspartner-Oberflächen zu erzeugen.
Eine Konstruktion dieser Modelle wird durch die zusätzlichen Informationen, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, unterstützt, was die Identifizierung einer Untergruppe von Peptidamiden an der Protein-Bindungsoberfläche ermöglicht, die vermutlich Wasserstoffbrückenbindungen mit Akzeptorresten an der verwandten Bindungsprotein-Kontaktoberfläche bilden. Während für den Großteil der Peptidamide, die an den nativen, unkomplexierten Protein- oder Bindungspartner-Wechselwirkungsoberflächen vorliegen, eine Wasserstoffbrückenbindung mit anderen Teilen des gleichen Proteins erwartet werden kann, kann eine Fraktion dieser Peptidamide, die möglicherweise 50% erreicht, Wasserstoffbrückenbindungen nur mit dem Lösungsmittel eingehen. Da die meisten Protein-Bindungspartner-Kontaktoberflächen miteinander hochgradig komplementär sind, ist es wahrscheinlich, dass bei der Komplexbildung Lösungsmittelwasser von den Wechselwirkungsoberflächen entfernt wird und Amide, die vorher durch Wasserstoffbrückenbindungen an Wasser gebunden sind, neue Wasserstoffbrückenbindungen mit der komplementären Oberfläche des Partners ausbilden. Diese Untergruppe von bindenden Oberflächenamiden wird in unseren Untersuchungen (Stufe 8) rasch identifiziert, da sie eine Austauschgeschwindigkeit im nativen, unligierten Zustand des Proteins beim pH-Wert 7,0 und 0°C von 0,5 Sekunden aufweisen. Diese Amide können Wasserstoffbrückenbindungen mit der komplementären Oberfläche nur bilden, wenn ihre Wasserstoffatome in Richtung der komplementären Oberfläche orientiert sind. Dies ergibt wiederum Orientierungsbeschränkungen in Bezug auf die gesamte assoziierte Peptidbindung und in geringerem Umfang auf die Seitenketten der beiden flankierenden Aminosäurereste an jedem derartigen Amid. Eine Anwendung dieser Beschränkungen auf die vorstehenden Modelle der Wechselwirkungsoberflächenstruktur ermöglicht eine Modellbildung der dreidimensionalen Struktur der Protein-Bindungspartner-Ligand-Wechselwirkungsoberflächen mit höherer Auflösung.
10. Automatisierung der für die Durchführung des enzymatischen Abbaus und der HPLC-Analyse unter Bedingungen eines verlangsamten Tritium-Austausches erforderlichen Verfahrens
Obgleich der Verdau und die Analyseverfahren bei 0°C durchgeführt werden, müssen analytische Proben von durch Tritium-Austausch markierten Peptiden bei Temperaturen von etwa –60 bis –80°C gelagert werden, wenn inakzeptable Verluste an Markierung aus dem Peptid im Zeitraum von Stunden bis Wochen vermieden werden sollen. Der Tritium-Austausch setzt sich in gefrorenen Proben umgekehrt proportional zur Temperatur fort, wird aber in wirksamer Weise bei Temperaturen von etwa –70°C gestoppt. Derzeit wird die Tritium-Austauschanalyse durchgeführt, indem man manuell Proben des bei –70°C gelagerten Produkts entnimmt, sie manuell bei 0°C schmilzt, manuell Reagenzien (Puffer, Enzyme) zusetzt und manuell die Proben in die HPLC-Säule injiziert. Diese Vorgänge sind arbeitsintensiv und belasten die Proben durch ein unabsichtliches Erwärmen während der Handhabung. Wenn durch HPLC getrennte Peptide für zukünftige Untersuchungen gewonnen und gelagert werden sollen, werden sie manuell gesammelt und bei –70°C aufbewahrt. Kein derzeit verfügbarer, mit einem Roboter ausgestatteter HPLC-Autosampler weist die Fähigkeit zur Durchführung der erforderlichen Maßnahmen an in gefrorenem Zustand aufbewahrten Proben auf.
Ein Spectraphysics AS3000^R-Autosampler kann so modifiziert werden, dass eine Automatisierung dieser Stufen ermöglicht wird. Es handelt sich um die folgenden bevorzugten Modifikationen: Bereitstellung eines Trockeneisbades, in dem die Proben bis zur Analyse gelagert werden; Verwendung von modifizierten Flüssigkeitsspritzen, die bei 0°C zuverlässig arbeiten; Steuerung des Autosamplers durch einen externen Rechner; und Platzieren der Autosampler-HPLC-Säule und des Spektrophotometers in einem Kühlschrank von 0°C. Unter Steuerung durch den Rechner entnimmt der mechanische Arm des Autosamplers die erwünschte Probe aus dem Bad von –70°C und stellt sie in einen Heizmischer, der die Probe rasch bei 0°C schmilzt. Die verflüssigte Probe wird sodann automatisch in die HPLC-Säule injiziert. Der Betrieb von HPLC-Pumpen und eines on-line-Strahlungszählers sowie die Datensammlung werden auf ähnliche Weise automatisiert.
Zur Gewinnung von mit Tritium markierten, der HPLC-Trennung unterworfenen Peptiden unter Bedingungen eines verlangsamten Austausches wird ein Gilson 303^R-Fraktionssammler (ebenfalls im Kühlschrank bei 0°C) so modifiziert, dass die Probensammelröhrchen in ein Trockeneisbad eintauchen. Eine rechnergestützte Umleitung der erwünschten HPLC-Ausflussfraktionen in diese vorgekühlten Röhrchen führt zu einem raschen Einfrieren der erwünschten, mit Tritium markierten Peptide auf –70°C.
Ausführungsformen mit Austausch von Deuterium
In einer weiteren Ausführungsform werden funktionell markierte, proteolytische Fragmente, die aus einem Protein erzeugt worden sind, das funktionell mit Deuterium (anstelle von Tritium) vor der Bildung des Rezeptor-Ligand-Komplexes markiert worden ist, durch Massenspektroskopie analysiert, die unter Bedingungen durchgeführt wird, die den AUS-Austausch des Peptidamid-Deuteriums aus Peptidfragmenten auf ein Minimum beschränken und die direkte Bestimmung der Position der funktionell gebundenen Markierung innerhalb eines Peptids im Größenbereich von 3–30 Aminosäuren ermöglichen.
Die Massenspektroskopie ist zu einer üblichen Technik geworden, mit der die Aminosäuresequenz von proteolytisch erzeugten Peptiden rasch bestimmt werden kann (Druckschrift 43). Sie wird üblicherweise zur Untersuchung von Peptiden herangezogen, die Aminosäuren enthalten, die an Kohlenstoff-Wasserstoff-Positionen deuteriert worden sind. Sie dienen somit zur Bestimmung der genauen Position der deuterierten Aminosäure innerhalb der Primärsequenz des Peptids. Dies ist möglich, da massenspektroskopische Techniken die geringfügige Zunahme des Molekulargewichts einer speziellen Aminosäure aufgrund der schwereren Masse von Deuterium nachweisen können. McCloskey et al. (Druckschrift 44) beschreiben die Anwendung des Deuterium-Austausches von Proteinen zur Untersuchung von Konformationsänderungen durch Massenspektrometrie.
Die Anmelderin hat eine Deuterium-Austauschtechnik konzipiert, die in den Stufen 1–5 im Wesentlichen identisch mit der vorstehend beschriebenen Tritium-Austauschtechnik ist, mit der Ausnahme, dass der AN-Austausch in deuteriertem Wasser (vorzugsweise 80–99% Molanteil an deuteriertem Wasser) durchgeführt wird. Dieses modifizierte Verfahren markiert nach Zugabe von Bindungspartner und AUS-Austausch die Peptidamide, die die Wechselwirkungsoberfläche zwischen Protein und Bindungspartner bilden, mit ausgetauschtem Deuterium. Proteolytisch erzeugte Fragmente des Proteins, die funktionell mit Deuterium markiert sind, werden identifiziert, isoliert und sodann der Massenspektroskopie unter Bedingungen unterworfen, bei denen das Deuterium an den funktionell markierten Peptidamiden an Ort und Stelle bleibt. Eine übliche Peptidsequenzanalyse durch Massenspektroskopie kann unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen der Peptidamid-Protonenaustausch auf ein Minimum beschränkt wird: Proben können bei 4°C bis 0°C unter Verwendung einer gekühlten Probenzufuhrsonde gehalten werden, Proben können in Puffern im pH-Bereich von 1 bis 3 zugeführt werden; und Analysen werden innerhalb von Minuten fertiggestellt. MS-Ionen können durch MALDI (matrixgestützte Laser-Desorptionsionisation)-"Elektrospray", Fast-Atom-Bombardement (FAB) und dergl. erzeugt werden. Die Carboxypeptidase kann vor den Ionisierungsereignissen oder gleichzeitig damit einwirken. Unterfragmente werden aufgrund ihrer Masse, z. B, durch Magnetsektor-Quadropol-Ionencyclotron- oder Flugzeitverfahren, getrennt. Bezüglich MS-Verfahren wird allgemein auf G. Siuzdak, Mass Spectrometry for Biotechnology (Academic Press, 1996) verwiesen.
Da Deuterium nicht radioaktiv ist, müssen die mit Deuterium markierten Peptide durch andere Maßnahmen identifiziert werden, z. B. durch Massenspektrometrie (ihr Molekulargewicht ist größer als es für das gleiche Peptid ohne eine derartige Markierung vorausgesagt wird).
Gegebenenfalls kann der gleiche Bindungsprotein-Bindungspartner-Komplex sowohl durch Tritium-Austausch (der nur bis zu einer mittleren Auflösung erfolgen muss) als auch durch Deuterium-Austausch untersucht werden. Die Tritium-Austauschmethode identifiziert die einschlägigen Fragmente. Da die HPLC-Mobilitäten dieser mit Tritium markierten Fragmente dann bekannt ist, können die entsprechenden, mit Deuterium markierten Fragmente durch ihre gemeinsamen Mobilitäten identifiziert und anschließend unterfragmentiert werden und dergl.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden getrennte Tritium- und Deuterium-Austauschansätze vermieden. Statt dessen wird das deuterierte Wasser mit tritiertem Wasser versetzt, z. B. weist das Lösungsmittel einen 98%igen Molanteil an deuteriertem Wasser und einen 2%igen Molanteil an tritiertem Wasser (z. B. 50 Ci/ml) auf. Im Ergebnis werden die Fragmente sowohl mit Deuterium als auch mit Tritium markiert. Die einschlägigen Fragmente werden durch ihre von Tritium hervorgerufene Radioaktivität identifiziert. Die Unterfragmente werden ferner durch Massenspektroskopie auf die Anwesenheit von deuterierter Markierung analysiert (unter entsprechender Korrektur auf die relativ geringe Menge an ebenfalls vorhandenem Tritium. Die Aufgabe des Tritiums besteht darin, Peptidfragmente, die bindende Oberflächenreste enthalten, radioaktiv zu markieren. Jedoch werden die genauen Reste, die beteiligt sind, durch MS-Analyse der Deuterium tragenden Peptide identifiziert, die ferner mit säurereaktiven Carboxypeptidasen verdaut worden sind, was eine Identifizierung der deuterierten Reste der radioaktiven Peptide ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Rezeptor-Bindungspartner-Komplexe, die funktionell mit Deuterium und Tritium markiert sind, an ihrer Wechselwirkungsoberfläche (unter Bedingungen eines verlangsamten Austausches gemäß den vorstehend gemachten Ausführungen für eine hochauflösende Tritium-Austauschanalyse) mit Pepsin verdaut, einer RP-HPLC in 0,1% TFA enthaltenden Puffern unterworfen und die die mit Tritium markierten Peptiden enthaltenden Säulenausflüsse werden einer massenspektroskopischen Ana lyse unterzogen. Um die Deuterium-Markierung innerhalb eines jeden Peptids genauer zu lokalisieren, wird eine Massenspektrometrie an markierten proteolytischen Fragmenten durchgeführt, die zunehmend weiter mit säurereaktiven Carboxypeptidasen verdaut sind (unter Bedingungen eines verlangsamten Austausches) (Druckschrift 41). Dieser Verdau kann vor Einführung der Probe in den Massenspektrometer oder kontinuierlich in situ durchgeführt werden, während die Probe im Massenspektrometer gehalten wird. Mit fortschreitender Verdauung werden die einzelnen erhaltenen, enzymatisch erzeugten, carboxyterminalen, geschnittenen Peptidunterfragmente durch den Massenspektrometer nachgewiesen. Ihr Molekulargewicht wird mit dem Molekulargewicht für die undeuterierte Form des gleichen Peptidfragments verglichen. Peptidfragmente, die funktionell gebundenes Deuterium enthalten, werden aufgrund der Zunahme ihres Molekulargewichts um 1 Atomeinheit im Vergleich mit dem gleichen Peptidfragment, das aus dem undeuterierten Rezeptor-Bindungspartner erhalten worden ist, identifiziert. Durch eine ausreichende Unterfragmentierung und Analyse gemäß den vorstehenden Ausführungen kann man auf die durch die Protease erzeugten Fragmente schließen, die funktionell gebundenes Deuterium enthalten. Dadurch wird die Position eines jeden deuterierten Amids innerhalb des Peptids bestimmt.
In vivo-Analyse
Eine in situ-Analyse von Protein-Bindungspartner-Wechselwirkungen ist in vivo möglich. Das Protein liegt zwar in seiner nativen Umgebung als eine Komponente einer intakten lebenden Zelle oder als eine Komponente einer zellulären Ausscheidung, wie Blutplasma, vor, wird aber durch Inkubation von Zellen oder Plasma in physiologischen Puffern, die mit tritiertem (oder deuteriertem) Wasser ergänzt sind, einem AN-Austausch unterworfen. Der Bindungspartner wird sodann zugesetzt, was es ermöglicht, das zell- oder plasmaassoziierte Protein zu komplexieren. Anschließend wird der AUS-Austausch durch Rückführung der Zelle oder des Plasmas auf physiologische Bedingungen in Abwesenheit von tritiertem (oder deuteriertem) Wasser eingeleitet. Während der AUS-Austauschperiode (Stunden bis Tage) wird der gebildete Protein-Bindungspartner-Komplex von der Zelle oder dem Plasma durch ein beliebiges Reinigungsverfahren, das es ermöglicht, den Komplex ständig intakt zu halten, isoliert. Am Ende der geeigneten AUS-Austauschperiode läuft die Fragmentierung und Analyse des gereinigten Komplexes gemäß den vorstehenden Ausführungen ab.
Dieses analytische Verfahren eignet sich insbesondere für Proteine, die eine erhebliche Aktivität als Folge einer Reinigung verlieren, da die Bindungsstelle vor der Reinigung markiert wird.
Bindungsstellenanalyse durch indirekten Wasserstoffaustausch
Bei den vorstehend beschriebenen Verfahren wird zunächst die gesamte Oberfläche des Proteins markiert. Die Markierung wird sodann von den Oberflächen entfernt, die nach der Bildung des Komplexes aus dem Bindungsprotein und dessen Bindungspartner dem Lösungsmittel ausgesetzt bleiben. Die Bindungsstelle des Proteins wird durch den Bindungspartner verschlossen, so dass die Markierung an dieser Stelle gehalten wird.
Wenn der Komplex gebildet ist, kann das Bindungsprotein Konformationsänderungen (allosterischen Änderungen) auch an anderen Stellen unterliegen. Wenn diese Veränderungen in bedeckten Segmenten des Proteins, die sich vorher an der Oberfläche befanden, erfolgen, behalten diese Segmente ebenfalls ihre Markierung.
Es ist möglich, zwischen Bindungsstellenresten und Resten, die gegen einen "AUS-Austausch" durch allosterische Effekte geschützt sind, zu unterscheiden. Im Wesentlichen wird zu nächst der Bindungspartner und nicht das Bindungsprotein markiert. Das Bindungsprotein wird indirekt als Ergebnis der Übertragung der Markierung vom Bindungspartner auf das Bindungsprotein markiert. Eine derartige Übertragung erfolgt hauptsächlich an der Bindungsoberfläche.
Diese Verfahrensweise markiert funktionell Rezeptor-Proteinamide wenn sie durch Komplexbildung verlangsamt sind und im komplexierten Zustand in innigem Kontakt mit dem Bindungspartner stehen. Rezeptor-Proteinamide, die aufgrund der durch Komplexbildung induzierten allosterischen Veränderungen in Regionen des Proteins, die nicht in der Nähe der Protein-Bindungspartner-Wechselwirkungsoberfläche stehen, verlangsamt sind, werden nicht markiert. Dieses Verfahren kann folgendermaßen durchgeführt werden:

1) Bindungspartner wird zu tritiertem Wasser (vorzugsweise von hoher spezifischer Aktivität) gegeben, um eine Tritium-Austauschmarkierung des Bindungspartners einzuleiten.
2) Nach Erreichen einer ausreichenden Markierung wird der Bindungspartner vom überschüssigen Lösungsmittel-Tritium unter Bedingungen abgetrennt, die einen minimalen Verlust an Tritium-Markierung aus dem Bindungspartner ergeben. Dies kann erreicht werden, indem man beispielsweise a) die Pufferbedingungen auf einen verlangsamten Austausch (0°C, saurer pH-Wert) verschiebt, wonach sich eine G-25-Schleudersäulentrennung des Bindungspartners in tritiumfreien Puffer anschließt, oder b) stopped-flow-Techniken anwendet, bei denen das AN-Austauschgemisch rasch mit großen Volumina an tritiumfreien Puffer verdünnt wird.
3) Der mit Tritium markierte Bindungspartner, der nunmehr im Wesentlichen frei von überschüssigem Lösungsmittel-Tritium ist, wird zum Rezeptorprotein gegeben und die Bedingungen werden so eingestellt, dass eine spontane reversible (Gleichgewichts)-Komplexbildung zwischen den beiden Bestandteilen erfolgen kann. Die Temperatur- und pH-Bedin gungen sollten ferner die spezifische Übertragung der Tritium-Markierung vom markierten Bindungspartner auf Amide an der Bindungsprotein-Wechselwirkungsoberfläche mit dem Partner ermöglichen und vorzugsweise optimieren. Typischerweise liegt der pH-Wert im Bereich von 5–8 (was zur Ligandenbindung führt) und die Temperatur im Bereich von 0–37°C. Zunächst werden ein pH-Wert von 7 und eine Temperatur von 22°C empfohlen, wobei die Übertragung durch Steuerung der Inkubationszeit gesteuert wird. Eine typische versuchsweise Inkubationszeit beträgt 24 Stunden. Diese Bedingungen in Bezug auf pH-Wert, Temperatur und Inkubationszeit können selbstverständlich variiert werden.
4) Der Komplex wird sodann für Zeitspannen, die zur Übertragung der Tritium-Markierung vom markierten Bindungspartner auf das Rezeptorprotein ausreichen, inkubiert. Während dieser Inkubationsdauer verlässt Tritium, das dem AN-Austausch auf Regionen des Bindungspartners, die von der Rezeptor-Bindungspartner-Wechselwirkungsoberfläche entfernt sind, unterzogen worden ist, den Bindungspartner durch Austausch mit Lösungsmittel-Wasserstoff und wird rasch und hochgradig im großen Volumen an Lösungsmittelwasser verdünnt, wodurch dessen wirksame anschließende Wechselwirkung mit dem Bindungsprotein verhindert wird. Jedoch ist die Tritium-Markierung, die an Bindungspartneramide, die innerhalb der (neu gebildeten) Protein-Bindungspartner-Wechselwirkungsoberfläche vorhanden sind, gebunden ist, zu einem AUS-Austausch vom Bindungspartner nur während der kurzen Zeitspannen, in denen die Wechselwirkungsoberfläche dem Lösungsmittelwasser ausgesetzt ist, befähigt, d. h. wenn der Komplex vorübergehend dissoziiert ist. Im derart dissoziierten Zustand und bei Einwirkung von Lösungsmittel verlässt ein Teil des an den Amiden innerhalb der Bindungspartner-Wechselwirkungsoberfläche vorhandenen Tritiums die Oberfläche und verbleibt für eine kurze Zeitspanne in der Nähe dieser Oberfläche. Aufgrund der raschen (im Wesentlichen durch Diffusion limitierten) erneuten Bindung von Bindungsprotein und Partner unterliegt ein Großteil des freigesetzten Tritiums, das (kurzzeitig) innerhalb der Umgebung der Bindungspartneroberfläche verbleibt, einem teilweisen Austausch mit Amiden an der (zukünftigen) Wechselwirkungsoberfläche des sich nähernden Bindungsproteinsmoleküls, das anschließend an den Bindungspartner bindet. Sobald eine derartige Bindung erfolgt, ist das übertragene Tritium erneut gegen einen Austausch mit Lösungsmittel geschützt, bis der Komplex wieder dissoziiert. Somit ergibt sich eine progressive Übertragung eines Teils des Tritiums von der Bindungspartner-Wechselwirkungsoberfläche auf austauschbare Amide an der verwandten Protein-Wechselwirkungsoberfläche. Amide, deren Austauschgeschwindigkeiten jedes Mal dann, wenn eine Komplexbildung erfolgt, konformationsbedingt verlangsamt werden, können ebenfalls mit Tritium markiert werden, wobei dies aber mit einer wesentlich langsameren Geschwindigkeit als bei Amiden innerhalb der Bindungsoberfläche erfolgt, da sie sich in größerem Abstand von der hohen Konzentration an Tritium befinden, das an der Wechselwirkungsoberfläche bei jedem Komplexdissoziationsereignis "freigesetzt" wird. Die Wirksamkeit der Übertragung ist grob gesprochen umgekehrt proportional zum Abstand zwischen derartigen Konformationsänderungen und der Bindungsoberfläche in der dritten Potenz. Die Inkubationsbedingungen des Bindungsprotein-tritierter Bindungspartner-Komplexes werden so eingestellt, dass die spezifische Wechselwirkungsoberfläche-Amid-Tritium-Übertragung (SISATT) für ein spezielles Bindungsprotein-Partner-Paar optimiert wird. Der SISATT-Wert ist definiert als das Verhältnis der Menge an Tritium (CPM), das vom Bindungspartner auf Bindungsprotein-Peptidamide übertragen wird, von denen vorher (durch die Technik von Anspruch 1) festgestellt worden ist, dass sie einer Verlangsamung des Amid-Wasserstoffaustausches bei der Bildung des Bindungsprotein-Partner-Komplexes unterliegen, dividiert durch das gesamte Tritium (CPM), das vom Bindungspartner auf sämtliche Peptidamide im Bindungsprotein übertragen worden ist.
5) Nach einer Inkubationsdauer, die den SISATT-Wert ermöglicht und vorzugsweise optimiert, werden die Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches wieder hergestellt, der Komplex wird dissoziiert und das Bindungsprotein wird fragmentiert. Fragmente des Bindungsproteins (im Gegensatz zum ursprünglich markierten Bindungspartner), die eine Tritium-Markierung tragen, werden identifiziert und einer weiteren Charakterisierung gemäß den vorstehenden Ausführungen zugeführt. Alternativ wird Deuterium anstelle von Tritium als Markierung verwendet. Deuterium hat den Vorteil, dass es eine wesentlich höhere Beladung mit Markierung erlaubt (da Deuterium wesentlich billiger als Tritium ist).

Ferner ist es möglich, eine direkte Markierung des Bindungspartners mit Deuterium und des Bindungsproteins mit Tritium vorzunehmen. Als Ergebnis werden sowohl die Bindungsstelle als auch die allosterisch bedeckten Amide des Bindungsproteins tritiert, während nur die Bindungsstellenamide deuteriert werden.
Dieses indirekte Verfahren eignet sich insbesondere zur Untersuchung von Proteinen, die anschließend oder im Verlauf der Bindung erheblichen Konformationsänderungen unterliegen, z. B. Insulin und dessen Rezeptor.
Zusammensetzungen
Nach Bestimmung der Bindungsstellen eines Bindungsproteins oder eines Bindungspartners nach den vorliegenden Verfahren (allein oder in Verbindung mit anderen Verfahren) werden die Informationen zur Bereitstellung neuer diagnostischer oder therapeutischer Mittel ausgenützt. Bei derartigen Mitteln kann es sich um Fragmente, die im Wesentlichen diesen Bindungsstellen entsprechen (mit geeigneten Linkern, um sie in der richtigen räumlichen Beziehung zu halten, wenn die Bindungsstelle diskontinuierlich ist) oder um Peptidyl- oder Nichtpeptidyl-Analoge davon mit ähnlichen oder verbesserten Bindungseigenschaften handeln. Ferner können auch Moleküle bereitgestellt werden, die an diese Bindungsstellen binden, die gegebenenfalls dem Paratop des Bindungspartners entsprechen.
Die diagnostischen Mittel können ferner in geeigneter Weise eine Markierung oder einen Träger umfassen. Die therapeutischen Mittel können ferner einen Trägerstoff enthalten, der die Abgabe verstärkt oder anderweitig die therapeutische Wirkung verbessert.
Die Mittel können ein oder mehr Epitope aufweisen, die gleich oder verschieden sind und die Epitopen der gleichen oder unterschiedlicher Bindungsproteine oder Bindungspartner entsprechen.
Beispiele
Zum Nachweis der praktischen Eignung dieser Technik hat die Anmelderin die Wechselwirkung von humanem Hämoglobin mit zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern untersucht, von denen bekannt ist, dass sie mit definierten und vorher identifizierten Unterregionen des Hämoglobin-Bindungsproteins Haptoglobin reaktiv sind. Bei diesen Untersuchungen bediente man sich des monoklonalen Antikörpers β6-1-23456 (spezifisch für die humane Hämoglobin β-Kette; Epitop zentriert an oder um β6-Glu) und des monoklonalen Antikörpers β-121 (spezifisch für die humane Hämoglobin β-Kette in der Region des Restes β-121). Beide Antikörper wurden großzügigerweise von C. R. Kiefer, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, zur Verfügung gestellt (Druckschrift 51). Humanes Haptoglobin wurde von der Fa. Calbiochem Corporation, La Jolla, Kalifornien, bezogen.
Präparation von Hämoglobin: Blut wurde einem normalen Spender entnommen, und zwar in Natriumheparin mit 10 U/ml. Die roten Blutkörperchen wurden 5-mal in kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH-Wert 7,4) gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang der Leukozytenfilm abgesaugt wurde. Zur Lysis der Zellen wurde dem gewaschenen Zellpellet ein gleiches Volumen an kaltem, destilliertem Wasser zugesetzt. Anschließend wurde unter heftigem Aufwirbeln ein halbes Volumen an kaltem Toluol zugesetzt. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten in einem kalten Sorvall^R-Zentrifugenrotor (Dupont) mit 15000 U/min (33000 g) zentrifugiert. Die Hämoglobinschicht (Mittelschicht) wurde entfernt und die Zentrifugation und das Dekantieren des Hämoglobins wurden wiederholt. Das isolierte Hämoglobin wurde gegen 0,1 M Natriumphosphat, 0,5% NaCl, pH-Wert 7,4, bei 4-maligem Austausch dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Probe 15 Minuten mit Kohlenmonoxid behandelt. Die endgültige Hämoglobinkonzentration wurde unter Zugrundelegung einer molaren Extinktion für Häm bei 540 nm von 14 270 gemessen. Das Präparat wurde in eingefrorenem Zustand bei –70°C in Aliquotanteilen gelagert.
Präparation von Pepsin: Schweine-Pepsin (Worthington Biochemical Corp.) wurde mit 10 mg/ml in 50 mM Natriumacetat vom pH-Wert 4,5 gelöst und gegen die gleiche Verdünnung dialysiert, um proteolytische Fragmente zu entfernen. Das Produkt wurde in eingefrorenem Zustand bei –70°C in Aliquotanteilen gelagert.
Tritiumaustausch: Sämtliche Stufen wurden bei 0°C durchgeführt. Der AN-Austausch wurde durch Vermischen gleicher Volumina (5 ml) an isoliertem Hämoglobin (300 mg/ml) und tritiertem Wasser (50 Ci/ml) eingeleitet und das Gemisch wurde 4 Stunden inkubiert. Aliquotanteile dieses Gemisches (1,3 μl) wurden sodann zu äquimolaren Mengen entweder an monoklonalem β6, monoklonalem β121, Haptoglobin, (alle in einer Konzentration von 10 mg/ml in PBS, pH-Wert 7,4, in einem endgültigen Inkubationsvolumen von 75 μl) oder zu 75 μl PBS allein gegeben. Diese Hämoglobin-Ligand-Gemische wurden sodann sofort auf 2 ml Sephadex^R G-25-Schleudersäulen aufgesetzt und 4 Minuten bei 1100 g zentrifugiert. Die Schleudersäulen wurden vorbereitet, indem 3 ml fassende Polypropylen-Säulen (Fisher Scientific) mit 2 ml Sephadex G-25 fine, das in PBS, pH-Wert 7,4, 0,1% Triton^R × 100, äquilibriert worden war, gepackt wurden. Die Säulen wurden unmittelbar vor der Verwendung mit 1100 g vorzentrifugiert. Nach der Säulentrennung wurden die Proben einem AUS-Austausch durch 40-stündige Inkubation (10-fache Dauer des AN-Austausches) unterzogen. Anschließend wurden die Proben mit Pepsin hydrolysiert. Typischerweise wurden 25 μl des AUS-Austauschgemisches mit einem Gehalt an 70 μg Hämoglobin zu 10 μg Pepsin in 110 μl 0,1 M NaPO₄, pH-Wert 2,7, plus 2,5 μl 0,5 M H₃PO₄ gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert und sodann in die HPLC-Säule injiziert. Ein Aliquotanteil von einem AN-Austausch unterzogenen Hämoglobin wurde sofort auf den pH-Wert 2,7 eingestellt, über einen pH-Wert von 2,7 (0,1 M NaPO₄, pH-Wert 2,7) geleitet und ohne eine Periode des AUS-Austausches auf die vorstehend beschriebene Weise ebenfalls proteolysiert und analysiert. Zur Messung der AN-Austauschgeschwindigkeiten von spezifisch markierten Amidprotonen wurde Hämoglobin auf die vorstehende Weise einem AN-Austausch unterzogen, wobei die Zeitabstände aber 10 Sekunden bis 18 Stunden betrugen, mit Ligand umgesetzt und einem 18-stündigen AUS-Austausch unterzogen. Die Proben wurden sodann auf die vorstehend beschriebene Weise proteolysiert und einer HPLC-Analyse unterworfen. Die spezifische Markierung an Peptiden wurde quantitativ als Funktion der AN-Austauschzeit bestimmt.
Hochdruck-Flüssigchromatographie: Verdaute Proben wurden an einer Waters HPLC-Einheit analysiert, die so modifiziert war, dass die Säule und die Injektionsvorrichtung sich im schmelzenden Eis befanden. Die mobile Phase wurde unter Verwendung von Barnstead-Nanopur-Wasser, Aldrich-Ultrapur-Natriumphosphat, J. T. Baker Ultrex^R-HCL und HPLC-Acetonitril der Fa. Burdick & Jackson zubereitet. Die mobile Phase bestand aus 50 mM NaPO₄, pH-Wert 2,7 (Lösungsmittel A) und einem Gemisch aus 20% 50 mM NaPO₄4 und 80% Acetonitril (ACN), endgültiger pH-Wert 2,7 (Lösungsmittel B). Die Trennung von Peptiden wurde unter Verwendung einer 30 cm-Phenomenex Bondclone^R 10 C18-Säule erreicht. Das Gradientenprogramm begann mit 100% A, 0% B und veränderte sich im Verlauf von 3,4 Minuten auf 83% A, 17% B. Im Zeitraum von 3,4 bis 6,7 Minuten wurde das System konstant mit 83% A, 17% B betrieben. Im Zeitraum von 6,7 bis 73,3 Minuten bewirkte das Programm einen linearen Anstieg der prozentualen Zunahme von B von 17% auf 51%. Die Absorption wurde bei 214 nm mit einem Detektor Waters Modell 441 überwacht.
Für die Trennung in der zweiten Dimension wurden Peptidpeaks mit der spezifischen Markierung, die bei 0°C gesammelt wurden, isoliert, in eingefrorenem Zustand bei –70°C gelagert, bei 0°C aufgetaut, mit einem gleichen Volumen an 100 mM PO₄, pH-Wert 2,7 vermischt und auf die vorstehende Weise der HPLC-Analyse unterzogen, mit der Ausnahme, dass es sich beim Puffer A um 0,115% Trifluoressigsäure (TFA) in H₂O und beim Puffer B um 80% ACN, 20% H₂O, 0,1% TFA handelte. Peaks, die eine spezifische radioaktive Markierung trugen, wurden identifiziert und isoliert.
Probengewinnung: Der HPLC-Ausfluss wurde am HPLC-Detektorausfluss mit einem Gilson Modell 203^R-Fraktionssammler gesammelt. Proben (100 bis 400 Fraktionen pro Ansatz) wurden gesammelt. Ihre Radioaktivität wurde durch Zugabe von 5 Volumina Aquamix (ICN Radiochemicals) und anschließende Szintillationszählung bestimmt. Bei weiteren Untersuchungen wurde eine on-line-Flüssigszintillationszählung unter Verwendung eines B-RAM-Durchflussstrahlungsdetektors (INUS Inc.) durchgeführt.
Peptididentifizierung: Durch HPLC isolierte Peptide wurden durch Gasphasen-Edman-Sequenzierung und Aminosäureanalyse in der UCSD-Proteinsequenzieranlage analysiert.
Ergebnisse
Hämoglobia-monoklonale Antikörper-Epitop-Kartierung
Hämoglobin wurde 4 Stunden einem AN-Austausch unterzogen und sodann entweder ohne eine Zeitspanne des AUS-Austausches proteolysiert (1b), mit einer äquimolaren Menge an monoklonalem β6-Antikörper vermischt und sodann einem 40-stündigem AUS-Austausch unterzogen (1c), mit monoklonalem β-121-Antikörper vermischt und einem 40-stündigen AUS-Austausch unterzogen (Daten nicht dargestellt) oder einem 40-stündigen AUS-Austausch in Abwesenheit von zugesetztem Antikörper unterzogen (1d). Bei Prüfung des markierten Hämoglobins ohne eine Zeitspanne des AUS-Austausches (1b) erfolgte eine Auftrennung in mindestens 17 radioaktiv markierte Peaks, die allgemein den Peaks entsprachen, die bei der Verfolgung der optischen Dichte des gleichen HPLC-Ansatzes auftraten (1a). Überließ man markiertes Hämoglobin einem vollständigen AUS-Austausch ohne Anwesenheit eines schützenden monoklonalen Antikörpers, so verschwanden sämtliche radioaktiv markierten Peaks (1d). Wenn jedoch markiertes Hämoglobin. in Gegenwart des monoklonalen β6-Antikörpers einem AUS-Austausch unterzogen wurde, trat ein einziger besonderer Peak mit radioaktiver Markierung auf, was darauf hinweist, dass diese Fraktion das monoklonale β6-antigene Epitop enthält (1c).
Wurde dieser Peak einer HPLC in der zweiten Dimension in TFA enthaltenden Lösungsmitteln unter Bedingungen eines verlangsamten Protonenaustausches unterzogen, so wurden 2 Peptide aufgrund ihrer optischen Dichte bei 214 nm aufgetrennt, wobei nur eines davon radioaktiv markiert war (2). Durch Gasphasen-Mikrosequenzierung und Aminosäureanalyse wurde festgestellt, dass dieses markierte Peptid die Reste 1–14 der β-Kette von Hämoglobin darstellt. Eine Messung der AN-Austauschgeschwindigkeiten der markierten Amide in diesem Peptid belegte zwei Geschwindigkeitsklassen, beide von gleicher Größe: eine tauschte mit einer Halbwertszeit von weniger als 10 Sekunden aus und die andere mit einer Halbwertszeit von etwa 1 Stunde. Messungen der spezifischen Aktivität zeigen, dass 4,3 Amidprotonen innerhalb dieses 14-meren Peptids durch Wechselwirkung des β6-Antikörpers mit Hämoglobin verlangsamt sind. Ein synthetisches Peptid, das mit den Resten 1–14 der Hämoglobin β-Kette (β1-14) identisch war, wurde synthetisiert, durch Protonenaustausch mit Tritium markiert und einem abgestuften Verdau mit Carboxypeptidase P unterzogen (vergl. 6a–e).
Ähnliche Untersuchungen wurden mit Hämoglobin, das dem AUS-Austausch nach Wechselwirkung mit monoklonalem β-121-Antikörper unterzogen worden war, durchgeführt (3a–c). Drei durch Pepsin erzeugte Peptide wiesen eine Tritium-Markierung auf (3b). Nach HPLC-Trennung in der zweiten Dimension in TFA enthaltenden Lösungsmitteln wurden diese Peaks in ähnlicher Weise von Verunreinigungen abgetrennt und sequenziert. Es wurde festgestellt, dass es sich um die Hämoglobin-Polypeptide β1-14, β113-128 und β15-31 handelte. Bei vorläufigen Protonen-Zähluntersuchungen waren an jedem dieser drei Peptide zwei verlangsamte monoklonale β121-Protonen vorhanden.
Die Positionen dieser Peptidregionen im gefalteten Hämoglobin-Tetrameren sind in den 5a und 5b dargestellt. Monoklonales β6 markiert sechs Amidbindungen, die am extern angeordneten Segment des gefalteten Hämoglobinmoleküls angeordnet sind (β-Kette-Aminosäuren 1–14), die das vorher charakterisierte Zielepitop dieses monoklonalen Antikörpers (β6-9) umfassen (Druckschrift 51). Der monoklonale β-121-Antikörper markiert insgesamt etwa 6 Protonen, die, obgleich sie an den nicht-zusammenhängenden Regionen der linearen Aminosäuresequenz von Hämoglobin vorliegen, an der Oberfläche angeordnet sind und in enger Nähe zueinander im gefalteten Hämoglobinmolekül auftreten und den Rest der Hämoglobin β-Kette 121 umfassen.
Kartierung von Hämoglobin-Haptoglobin-Wechselwirkungsstellen
Bei der Bindung von Hämoglobin an Haptoglobin ist es bekannt, dass das Hämoglobinmolekül Haptoglobin über drei nicht-zusammenhängende Peptidregionen kontaktiert, die aus Hämoglobin α-Kette 121-127, β11-25 und β131-146 bestehen (Druckschriften 52, 53). Wir erwarteten daher, dass eine Pepsinspaltung von Hämoglobin, das an den Haptoglobin-Wechselwirkungsstellen markiert ist, zwischen 2 und 10 radioaktiv markierte Peptide ergeben würde. Wir führten daher unsere Untersuchungen an Haptoglobin mit einem höheren Auflösungsgrad durch, der durch Sammeln einer größeren Anzahl an HPLC-Fraktionen erreicht wurde (vergl. Figg. 4a–d). Unter diesen Bedingungen zeigt markiertes Hämoglobin, das ohne eine Zeitspanne des AUS-Austausches analysiert worden ist, mehr als 33 unterscheidbare, radioaktiv markierte Peaks (4b), was wiederum mit dem Verlauf der optischen Dichte übereinstimmt (4a). Markiertes Hämoglobin, das in Gegenwart von Haptoglobin einem AUS-Austausch unterzogen worden ist, bildet 7 spezifisch radioaktiv markierte Peaks (4c), die nicht vorhanden sind, wenn Hämoglobin in Abwesenheit von Haptoglobin einem AUS-Austausch unterzogen wird (4d). Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Technik gut mit einem rezeptorartigen Liganden-Wechselwirkungssystem als Komplex, wie der von Hämoglobin mit Haptoglobin, funktioniert.
Lösungsmitteleffekt
Synthetisches Hämoglobin-β1-14-Peptid wurde durch Protonenaustausch an sämtlichen Peptidamiden mit Tritium markiert. Aliquotanteile von markiertem Peptid wurden bei 0°C einer HPLC-Analyse, wie in den 1a–d unterworfen, mit der Ausnahme, dass ein Bereich von Lösungsmittel-pH-Werten gemäß den folgenden Angaben verwendet wurde. Der prozentuale Anteil des ursprünglich peptidgebundenen Tritiums, das an das Peptid unter sämtlichen HPLC-Bedingungen gebunden blieb, wurde sodann bestimmt.
Die Tritium-Retention betrug etwa 57% für TFA (pH-Wert 2,1), 46% für PO₄ (pH-Wert 2,7), 34% für PO₄ (pH-Wert 3,5) und 14% für PO₄ (pH-Wert 4,0).
Die Erfindung soll durch die beschriebenen speziellen Ausführungsformen nicht bezüglich ihrer Schutzumfangs beschränkt werden. Diese Ausführungsformen dienen nur als einzelne Erläuterungen individueller Aspekte der Erfindung. Auch funktionell äquivalente Methoden und Bestandteile fallen unter den Umfang der Erfindung. Tatsächlich sind zusätzlich zu den hier dargestellten und beschriebenen Ausführungsformen zahlreiche Modifikationen möglich, die sich für den Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnung ergeben. Derartige Modifikationen fallen unter den Umfang der beigefügten Ansprüche.
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Claims

Verfahren zur Bestimmung der Position einer markierten Peptid-Amidgruppe in einem Polypeptid mit einer Auflösung von 1–5 Aminosäureresten, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst: (a) Unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches wird ein Polypeptid mit bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz, in der mindestens eine Peptid-Amidgruppe mit schwerem Wasserstoff markiert ist, progressiv zu einer Reihe von Unterfragmenten abgebaut, wobei jedes Unterfragment in der Reihe aus 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist; (b) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff an jedem Unterfragment wird quantitativ bestimmt; (c) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff der Unterfragmente wird mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids in Korrelation gesetzt, wodurch die Position der markierten Peptid-Amidgruppe im Polypeptid auf eine Position innerhalb von 1–5 Aminosäureresten lokalisiert wird.
Verfahren zur Bestimmung der Position einer markierten Peptid-Amidgruppe in einem Polypeptid mit einer Auflösung von 1–5 Aminosäureresten, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst (a) Unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches wird ein Polypeptid mit bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz, in der mindestens eine Peptid-Amidgruppe mit schwerem Wasserstoff markiert ist, zu einer Mehrzahl von Fragmenten fragmentiert; (b) unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches wird festgestellt, welches der Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert ist, (c) die einzelnen markierten Fragmente werden unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches progressiv abgebaut, wodurch man eine Reihe von Unterfragmenten erhält, wobei jedes Unterfragment in der Reihe aus 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist; (d) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff an jedem Unterfragment wird quantitativ bestimmt; (e) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff der Unterfragmente wird mit der Aminosäuresequenz des markierten Fragments in Korrelation gesetzt, wodurch die Position des markierten Peptidamids im Fragment auf eine Position innerhalb von 1–5 Aminosäureresten lokalisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der schweren Wasserstoffmarkierung um Tritium handelt und die Gegenwart oder die Menge der schweren Wasserstoffmarkierung an einem Fragment oder Unterfragment durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der schweren Wasserstoffmarkierung um Deuterium handelt und das Vorliegen oder die Menge einer schweren Wasserstoffmarkierung an einem Fragment oder Unterfragment durch Messen der Masse des Unterfragments bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das markierte Polypeptid unter den Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches vor Durchführung der Stufe (a) denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem etwaige Disulfidbrücken im markierten Polypeptid unter den Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches vor Durchführung der Stufe (a) aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Disulfidbrücken durch Kontaktieren des markierten Polypeptids mit einem wasserlöslichen Phosphin aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der progressive Abbau das Kontaktieren des markierten Polypeptids mit einer säurebeständigen Carboxypeptidase umfasst, die aus der Gruppe Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase W und Carboxypeptidase C ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem es sich bei der säurebeständigen Carboxypeptidase um Carboxypeptidase P handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Bedingungen des langsamen Wasserstoffaustausches einen pH-Wert im Bereich von 2–3 und eine Temperatur im Bereich 0–10°C umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der pH-Wert etwa 2,7 und die Temperatur etwa 0°C betragen.
Verfahren zur Bestimmung der Tatsache, welche Peptid-Amidgruppen in einem Polypeptid von Interesse für ein Lösungsmittel zugänglich sind, mit einer Auflösung von 1–5 Aminosäureresten, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst: (a) ein Polypeptid von bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz wird mit schwerem Wasserstoff unter Bedingun gen in Kontakt gebracht, bei denen die Peptid-Amid-Wasserstoffatome des Polypeptids, die frei für das Lösungsmittel zugänglich sind, einem Austausch mit schwerem Wasserstoff unterliegen und durch diesen selektiv markiert werden; (b) das selektiv markierte Polypeptid wird unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches progressiv zu einer Reihe von Unterfragmenten abgebaut, wobei jedes Unterfragment in der Reihe aus 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist; (c) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff an jedem Unterfragment wird quantitativ bestimmt; (d) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff der Unterfragmente wird mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids in Korrelation gesetzt, wodurch die Position der markierten Peptid-Amidgruppe im Polypeptid auf eine Position innerhalb von 1–5 Aminosäureresten lokalisiert wird.
Verfahren zur Bestimmung der Tatsache, welche Peptid-Amidgruppen in einem Polypeptid von Interesse für ein Lösungsmittel zugänglich sind, mit einer Auflösung von 1–5 Aminosäureresten, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst (a) ein Polypeptid von bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz wird mit schwerem Wasserstoff unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen die Peptid-Amid-Wasserstoffatome im Polypeptid, die frei für das Lösungsmittel zugänglich sind, einem Austausch mit schwerem Wasserstoff unterliegen und durch diesen selektiv markiert werden; (b) das selektiv markierte Polypeptid wird unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches zu einer Mehrzahl von Fragmenten fragmentiert; (c) unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches wird festgestellt, welche der Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert worden sind; (d) jedes der markierten Fragmente wird unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches progressiv zu einer Reihe von Unterfragmenten abgebaut, wobei jedes Unterfragment in der Reihe aus 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist; (e) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff an jedem Unterfragment wird quantitativ bestimmt; (f) die Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff der Unterfragmente wird mit der Aminosäuresequenz des markierten Fragments in Korrelation gesetzt, wodurch die Position des markierten Peptidamids im Fragment auf eine Position innerhalb von 1–5 Aminosäureresten lokalisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 13, wobei die Fragmentierungsstufe durch Verwendung einer säuretoleranten Protease aus der Aspergillus-Protease-Familie erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei es sich bei der schweren Wasserstoffmarkierung um Tritium handelt und die Anwesenheit oder die Menge der schweren Wasserstoffmarkierung an einem Fragment oder Unterfragment durch Radioaktivitätsmessungen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei es sich bei der schweren Wasserstoffmarkierung um Deuterium handelt und die Anwesenheit oder die Menge der schweren Wasserstoffmarkierung an einem Fragment oder Unterfragment durch Messung der Masse des Unterfragments bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das markierte Polypeptid unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches vor Durchführung der Stufe (a) denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei etwaige Disulfidbrücken im markierten Polypeptid unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches vor Durchführung der Stufe (a) aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Disulfidbrücken durch Kontaktieren des markierten Polypeptids mit einem wasserlöslichen Phosphin aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem der progressive Abbau das Kontaktieren des markierten Polypeptids mit einer säurebeständigen Carboxypeptidase umfasst, die aus der Gruppe Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase W und Carboxypeptidase C ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem es sich bei der säurebeständigen Carboxypeptidase um Carboxypeptidase P handelt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem die Bedingungen des langsamen Wasserstoffaustausches einen pH-Wert im Bereich von 2–3 und eine Temperatur im Bereich 0–10°C umfassen.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der pH-Wert etwa 2,7 und die Temperatur etwa 0°C betragen.
Verfahren zum Charakterisieren einer Bindungsstelle eines Bindungsproteins von bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst (a) Peptid-Amid-Wasserstoffatome eines Bindungsproteins, die im wesentlichen gegen einen Austausch mit Lösungsmittel-Wasserstoffatomen geschützt sind, wenn das Bindungsprotein seinen Bindungspartner bindet, werden selektiv markiert; (b) unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches wird das selektiv markierte Bindungsprotein progressiv abgebaut, wodurch man eine Reihe von Unterfragmenten erhält, wobei jedes Unterfragment in der Reihe aus 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist; (c) die Menge der Markierung an jedem Unterfragment wird quantitativ bestimmt; (d) die Menge der Markierung der Unterfragmente wird mit der Aminosäuresequenz des Bindungsproteins in Korrelation gesetzt, wodurch die Positionen des Bindungsproteins, die markiert worden sind, auf 1–5 Aminosäurereste lokalisiert werden und somit die Bindungsstelle des Bindungsproteins charakterisiert wird.
Verfahren zum Charakterisieren einer Bindungsstelle eines Bindungsproteins von bekannter oder bestimmbarer Aminosäuresequenz, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Peptid-Amidgruppen eines Bindungsproteins, die im wesentlichen für ein Lösungsmittel unzugänglich sind, wenn das Bindungsprotein einen Bindungspartner bindet, werden selektiv markiert, wodurch man ein selektiv markiertes Bindungsprotein erhält, bei dem entweder (i) die für das Lösungsmittel unzugänglichen Peptid-Amidgruppen des Bindungsproteins schweren Wasserstoff umfassen und die für das Lösungsmittel unzugänglichen Peptid-Amidgruppen normalen Wasserstoff umfassen oder (ii) die für das Lösungsmittel unzu gänglichen Peptid-Amidgruppen des Bindungsproteins normalen Wasserstoff umfassen und die für das Lösungsmittel unzugänglichen Peptid-Amidgruppen schweren Wasserstoff umfassen; (b) das selektiv markierte Bindungsprotein wird unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches zu einer Mehrzahl von Fragmenten fragmentiert; (c) es wird bestimmt, welche Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert sind; (d) unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches werden die einzelnen, mit schwerem Wasserstoff markierten Fragmente progressiv abgebaut, wodurch man eine Reihe von Unterfragmenten erhält, wobei jedes Unterfragment in der Reihe aus 1–5 Aminosäureresten weniger als das vorhergehende Unterfragment in der Reihe zusammengesetzt ist; (e) die Menge des schweren Wasserstoffes an den einzelnen Unterfragmenten wird quantitativ bestimmt; (f) die Menge des schweren Wasserstoffes der Unterfragmente wird mit den Aminosäuresequenzen der Fragmente, aus denen die Unterfragmente erzeugt worden sind, in Korrelation gesetzt, wodurch die Positionen des Fragments, das mit schwerem Wasserstoff markiert worden ist, mit einer Auflösung von 1–5 Aminosäureresten lokalisiert werden und somit die Bindungsstelle des Bindungsproteins charakterisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, bei dem das Bindungsprotein selektiv durch ein Verfahren markiert wird, das die folgenden Stufen umfasst: (i) Das Bindungsprotein wird mit einem Bindungspartner unter Bedingungen kontaktiert, bei dem das Bindungsprotein den Bindungspartner bindet, so dass ein Bindungsprotein-Bindungspartner-Komplex gebildet wird; (ii) der Komplex wird mit einem mit schwerem Wasserstoff markierten Lösungsmittel unter Bedingungen eines raschen Wasserstoffaustausches für eine "An-Austausch"-Periode kontak tiert, die ausreicht, dass die für das Lösungsmittel zugänglichen Peptid-Amid-Wasserstoffatome des Komplexes durch schwere Wasserstoffatome des Lösungsmittel ausgetauscht und im wesentlichen ersetzt werden, und zwar in einer nachweisbaren Anzahl von Molekülen des Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, bei dem das Bindungsprotein selektiv durch ein Verfahren markiert wird, das die folgenden Stufen umfasst: (i) Das Bindungsprotein wird mit einem mit schwerem Wasserstoff markierten Lösungsmittel unter Bedingungen eines raschen Wasserstoffaustausches für eine "An-Austausch"-Periode in Kontakt gebracht, die ausreicht, dass die für das Lösungsmittel zugänglichen Peptid-Amid-Wasserstoffatome des Bindungsproteins durch schwere Wasserstoffatome des Lösungsmittels ausgetauscht und im wesentlichen ersetzt werden, und zwar in einer nachweisbaren Anzahl von Molekülen des Bindungsproteins; (ii) das Bindungsprotein wird mit einem Bindungspartner unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen die schweren Wasserstoffmarkierungen im wesentlichen erhalten bleiben und bei denen das Bindungsprotein den Bindungspartner so bindet, dass ein Bindungsprotein-Bindungspartner-Komplex gebildet wird; und (iii) der Komplex wird mit einem Lösungsmittel, das im wesentlichen frei von schweren Wasserstoffatomen ist, unter Bedingungen eines raschen Wasserstoffaustausches für eine "Aus-Austausch"-Periode in Kontakt gebracht, die ausreicht, die für das Lösungsmittel zugänglichen Peptid-Amid-Wasserstoffatome oder schweren Wasserstoffatome des Komplexes mit normalem Wasserstoff des Lösungsmittel ausgetauscht und im wesentlichen ersetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei es sich bei der schweren Wasserstoffmarkierung um Tritium handelt und das Vorliegen oder die Menge des schweren Wasserstoffs an einem Fragment oder Unterfragment durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei es sich bei der schweren Wasserstoffmarkierung um Deuterium handelt und das Vorliegen oder die Menge eines schweren Wasserstoffs des Fragments oder Unterfragments durch Messen der Masse des Unterfragments bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, 13 oder 25, ferner umfassend die Stufe des Trennens der Fragmente vor der Feststellung, welche Fragmente mit schwerem Wasserstoff markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Trennung zwei sequenzielle Trennungsstufen umfasst, die unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 31, bei dem die erste sequenzielle Trennungsstufe bei einem pH-Wert im Bereich 2,1–3,0 und die zweite sequenzielle Trennung bei einem pH-Wert im Bereich von 2,1–3,0 durchgeführt wird, wobei die pH-Werte der ersten und zweiten Trennungsstufe unterschiedlich sind.
Verfahren nach Anspruch 32, bei dem die erste sequenzielle Trennungsstufe bei einem pH-Wert von 2,7 durchgeführt wird und die zweite sequenzielle Trennungsstufe bei einem pH-Wert von 2,1 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der Abbau des selektiv markierten Bindungsproteins oder der markierten Fragmente das Kontaktierten des selektiv markierten Bindungsproteins oder der markierten Fragmente mit einer säurebeständigen Carboxypeptidase umfasst, die aus der Gruppe Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase W und Carboxypeptidase C ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der Abbau des selektiv markierten Bindungsproteins oder der markierten Fragmente das Kontaktieren des selektiv markierten Bindungsproteins oder der markierten Fragmente mit Pentafluorpropionsäureanhydrid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem etwaige Disulfidbrücken im selektiv markierten Bindungsprotein unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches aufgebrochen werden, bevor eine Fragmentierung oder progressive Unterfragmentierung vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 36, bei dem die Disulfidbrücken durch Kontaktieren des selektiv markierten Bindungsproteins mit einem wasserlöslichen Phosphin aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei vor der Fragmentierung oder Unterfragmentierung das selektiv markierte Bindungsprotein unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustausches denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 38, bei dem die Denaturierung in einem Lösungsmittel durchgeführt wird, bei dem der pH-Wert zur Minimierung des Wasserstoffaustausches erheblich höher als der pH-Wert einer rein wässrigen Lösung ist.
Verfahren nach Anspruch 39, bei dem das Lösungsmittel 5–20% Wasser umfasst und es sich beim Rest um ein nicht-wässriges polares Lösungsmittel handelt.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem das nichtwässrige polare Lösungsmittel aus der Gruppe Acetonitril, Dimethylsulfoxid, ein Polyol und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 41, bei dem es sich beim Polyol um Glycerin handelt.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem das Lösungsmittel ferner 2–4 M Guanidinthiocyanat enthält.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der pH-Wert des Lösungsmittels 4,8–5,2 beträgt.