DE69631054T2

DE69631054T2 - Verfahren zur charakterisierung der feinstruktur von proteinbindungsstellen

Info

Publication number: DE69631054T2
Application number: DE69631054T
Authority: DE
Inventors: L. Virgil WOODS
Original assignee: ExSAR Corp
Current assignee: ExSAR Corp
Priority date: 1996-04-29
Filing date: 1996-04-29
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2016-04-30
Also published as: ATE256289T1; DE69631054D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Charakterisierung der Bindungsstelle, die in die Bindung zwischen einem Bindeprotein und einem Bindungspartner involviert ist.
Stand des Wissens
Limitierungen gegenwärtiger Verfahren zur Charakterisierung von Bindungsstellen von Proteinen
Für die genaue Charakterisierung einer Bindungsstelle sind erhebliche experimentelle Arbeiten und viel Zeit erforderlich. Im allgemeinen führen die Techniken, die am einfachsten eingesetzt werden können und die am schnellsten Antworten liefern, zu einer ungenauen und nur ungefähren Vorstellung über die Art der kritischen Strukturmerkmale. Zu Techniken in dieser Kategorie gehören die Untersuchung proteolytisch erzeugter Fragmente von Proteinen, die eine Bindungsfunktion beibehalten, gentechnologische Verfahren, bei denen Proteine mit einer veränderten Aminosäuresequenz konstruiert werden (ortsgerichtete Mutagenese), Untersuchungen an Peptiden mittels eines Epitop-Scanning (Konstruktion einer großen Zahl kleiner Peptide, die Unterbereiche des intakten Proteins repräsentieren, gefolgt von der Untersuchung der Fähigkeit der Peptide, die Bindung des Liganden an den Rezeptor zu hemmen), ein kovalentes Vernetzen des Proteins mit seinem Bindungspartner im Bereich der Bindungsstelle gefolgt von einer Fragmentierung des Proteins und Identifizierung vernetzter Fragmente sowie eine Affinitätsmarkierung von Bereichen des Rezeptors, die in der Nähe der Ligandenbindungsstelle des Rezeptors lokalisiert sind, gefolgt von der Charakterisierung derartiger „nearest-neighbour"-Peptide (Übersichtsartikel siehe 1, 2).
Diese Techniken eignen sich am besten für die Bestimmung der Struktur bindender Unterbereiche, die eine einfache Struktur haben, z. B. wenn ein einziger kurzer, zusammenhängender Abschnitt eines Polypeptids in einem Protein für den größten Teil der Bindungsaktivität verantwortlich ist. Jedoch werden bei vielen Systemen aus einem Protein und seinem Bindungspartner, die derzeit von Interesse sind, die Strukturen, die beim Rezeptor und beim Liganden oder Antikörper für die Bindung verantwortlich sind, durch die komplexe Wechselwirkung mehrerer, nicht zusammenhängender Peptidsequenzen erzeugt. Die Komplexitäten dieser Wechselwirkungen können herkömmliche analytische Techniken beeinträchtigen, da die Bindungsfunktion oft verloren geht, sobald eine der dreidimensionalen Konformationen der verschiedenen beitragenden Polypeptidsequenzen direkt oder indirekt gestört wird.
Die eindeutigsten Techniken zur Charakterisierung der Struktur von Rezeptorbindungsstellen sind die NMR-Spektroskopie und die Röntgenkristallographie. Diese Techniken können zwar im Idealfall eine genaue Charakterisierung der relevanten Strukturmerkmale liefern, aber sie weisen größere Limitierungen auf, zu denen unverhältnismäßig lange Zeiten, die für die Untersuchung benötigt werden, die Unfähigkeit zur Untersuchung großer Proteine und, bei der Röntgenanalyse, der Bedarf an Kristallen aus dem Protein und dem Bindungspartner gehören (Literaturstelle 3).
Die Technologie des Anmelders überwindet diese Einschränkungen und ermöglicht die schnelle Identifizierung aller spezifischen Polypeptide und der Aminosäuren in einem Protein, die dessen Bindungsstelle für seinen Proteinliganden oder seinen Antikörper-bindenden Unterbereich ausmachen, und zwar in praktisch jedem beliebigen System aus Protein und Ligand oder aus Antigen und Antikörper, unabhängig von der Komplexität der vorliegenden Bindungsstellen oder der Größe der beteiligten Proteine. Diese Technologie ist bezüglich der Geschwindigkeit und der Auflösung den derzeit eingesetzten biochemischen Techniken überlegen.
Wasserstoffaustausch (Protonenaustausch)
Wenn ein Protein in seinem nativen, gefalteten Zustand in Puffern inkubiert wird, die mit schwerem Wasserstoff (Tritium oder Deuterium) markiertes Wasser enthalten, dann tauscht sich schwerer Wasserstoff im Puffer reversibel mit normalem Wasserstoff, der im Protein in sauren Positionen (z. B. O-H-, S-H- und N-H-Gruppen) vorliegt, aus, wobei die Austauschgeschwindigkeiten von der chemischem Umgebung eines jeden austauschbaren Wasserstoffes, von der Temperatur und, am wichtigsten, von seiner Zugänglichkeit für das tritiierte Wasser im Puffer abhängig sind (Literaturstellen 4, 5). Die Zugänglichkeit wird ihrerseits sowohl von der Oberflächenlokalisation (Lösemittelzugänglichkeit) des Wasserstoffes als auch von dem Ausmaß bestimmt, indem er mit anderen Bereichen des gefalteten Proteins über Wasserstoffbrücken verknüpft ist. Einfach ausgedrückt tauscht sich ein saurer Wasserstoff, der in Aminosäureresten vorliegt, die sich auf der äußeren (Puffer-exponierten) Oberfläche des Proteins befinden und in einer Wasserstoffbrückenbindung mit dem Lösemittel Wasser vorliegen, schneller mit schwerem Wasserstoff im Puffer aus, als es ein ähnlicher saurer Wasserstoffe tut, der im Inneren des gefalteten Proteins versteckt ist und dort Wasserstoffbrücken ausgebildet hat.
Die Wasserstoffaustausch-Reaktionen können sowohl durch eine saure als auch durch eine basische Katalyse stark beschleunigt werden, und die Austauschgeschwindigkeit, die bei einem bestimmten pH-Wert beobachtet wird, ist die Summe des durch die Säure und des durch die Base vermittelten Mechanismus. Für viele saure Wasserstoffe führt ein pH von 2,7 zu einer minimalen Gesamt-Austauschgeschwindigkeit (Literaturstelle 6, Seite 238, 3, Literaturstellen 7–11). Während sich Wasserstoffe in Hydroxy- und Amino-Gruppen von Proteinen mit Tritium im Puffer im Bereich von Millisekunden austauschen, liegt die Austauschgeschwindigkeit eines bestimmten sauren Wasserstoffes, des Wasserstoffes der Peptidamidbindung, beträchtlich niedriger, mit einer Halbwertszeit des Austauschs (wenn er frei über eine Wasserstoffbrückenbindung an das Lösemittel Wasser gebunden ist) von ungefähr 0,5 Sekunden bei 0°C pH 7, und sie ist stark verlangsamt auf eine Halbwertszeit des Austauschs von 70 Minuten bei 0°C und pH 2,7.
Wenn Peptidamidwasserstoffe im Inneren eines gefalteten Proteins verborgen sind, oder wenn sie mit anderen Teilen des Proteins über eine Wasserstoffbrückenbindung verknüpft sind, sind die Halbwertszeiten des Austauschs mit den Wasserstoffen des Lösemittels oft beträchtlich verlängert, wobei die gemessenen Zeiten bei Stunden bis Tagen liegen. Der Wasserstoffaustausch an Peptidamiden ist eine vollständig reversible Reaktion, und die Geschwindigkeiten des „Eintrittsaustauschs" (schwerer Wasserstoff des Lösemittels ersetzt proteingebundenen normalen Wasserstoff) sind mit den Geschwindigkeiten des „Austrittsaustauschs" (Wasserstoff ersetzt proteingebundenen schweren Wasserstoff) identisch, wenn der Zustand eines bestimmten Peptidamids in einem Protein, einschließlich seiner chemischen Umgebung und Zugänglichkeit für Wasserstoffe des Lösemittels, während der Bedingungen des Eintrittsaustauschs und denen des Austrittsaustauschs identisch ist.
Der Wasserstoffaustausch wird üblicherweise bestimmt, indem Studien mit Proteinen und wässrigen Puffern durchgeführt werden, die auf unterschiedliche Weise mit Paaren der drei Isotopenformen des Wasserstoffs (¹H normaler Wasserstoff, ²H Deuterium, ³H Tritium) markiert sind. Wenn das Paar aus normalem Wasserstoff und Tritium eingesetzt wird, wird er als Tritiumaustausch bezeichnet; wenn normaler Wasserstoff und Deuterium eingesetzt werden, als Deuteriumaustausch. Es werden im allgemeinen verschiedene physikochemische Techniken eingesetzt, um die Verteilung der beiden Isotope im Deuteriumaustausch bzw. im Tritiumaustausch zu verfolgen.
Techniken des Tritiumaustauschs
Techniken des Tritiumaustauschs (bei denen die Menge des Isotops über Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird) sind extensiv zur Messung von Peptidamid-Austauschgeschwindigkeiten innerhalb eines einzelnen Proteins eingesetzt worden (Übersichtsartikel siehe 4). Die Austauschgeschwindigkeiten anderer saurer Protonen (OH, NH, SH) sind so schnell, dass sie mit diesen Techniken nicht verfolgt werden können, und die nachfolgende Diskussion bezieht sich ausschließlich auf den Peptidamidprotonenaustausch. In diesen Studien werden gereinigte Proteine durch die Inkubation in Puffern, die tritiiertes Wasser enthalten, für unterschiedliche Zeiträume einem Eintrittsaustausch unterzogen, dann in Puffer transferiert, die frei von Tritium sind, und es wird die Geschwindigkeit des Austrittsaustauschs von Tritium bestimmt. Über die Analyse der Geschwindigkeiten des Eintrittsaustauschs und des Austrittsaustauschs von Tritium können Abschätzungen der Zahlen der Peptidamidprotonen im Protein, deren Austauschgeschwindigkeiten in bestimmte Bereiche von Austauschgeschwindigkeiten fallen, gemacht werden. Diese Studien ermöglichen keine Identifizierung (Lokalisation innerhalb der primären Aminosäuresequenz des Proteins) der gemessenen, sich austauschenden Amidwasserstoffe.
Weiterentwicklungen dieser Techniken sind eingesetzt worden, um in Proteinen das Vorkommen von Peptidamiden zu bestimmen, die allosterisch induzierten Veränderungen ihrer lokalen chemischen Umgebung ausgesetzt sind, und um die Wege der Proteinfaltung zu untersuchen (5, 12–14). Für diese Studien lässt man Proteine, die einem Tritium-Eintrittsaustausch unterzogen wurden, einen Austrittsaustausch durchlaufen, nachdem sie entweder eine allosterische Veränderung ihrer Form erfahren haben oder nachdem sie eine zeitabhängige Faltung durchlaufen haben, und es wird die Zahl der Peptidamide, die nach den Modifikationen eine Veränderung ihrer Austauschgeschwindigkeit erfahren haben, bestimmt. Änderungen der Austauschgeschwindigkeit zeigen an, dass es zu Veränderungen der chemischen Umgebung der jeweiligen Peptidamide gekommen ist, die für den Protonenaustausch relevant sind (Zugänglichkeit für das Lösemittel, Wasserstoffbindung etc.). Peptidamide, die eine induzierte Verlangsamung ihrer Austauschgeschwindigkeit erfahren, werden als „verlangsamte Amide" bezeichnet, und wenn ein Tritium, das zuvor einen Eintrittsaustausch durchlaufen hat, bezüglich seines Austrittsaustauschs aus derartigen Amiden ausreichend verlangsamt wurde, kommt es zu einer „funktionellen Tritiummarkierung" dieser Amide. Aus diesen Messungen werden Rückschlüsse auf die Art der Struktur der Formveränderungen gezogen, die im isolierten Protein abgelaufen sind. Eine Identifizierung der jeweiligen Peptidamide, die Veränderungen ihrer Umgebung erfahren haben, ist mit diesen Techniken ebenfalls nicht möglich.
Vier Forschergruppen haben technische Weiterentwicklungen (die gemeinsam als Tritiumaustausch mittlerer Auflösung bezeichnet werden) beschrieben, die die Bestimmung der Lokalisation besonders verlangsamter Tritium-markierter Peptidamide in der Primärsequenz kleiner Proteine erlauben, so dass sie einem bestimmten proteolytischen Fragment zugeordnet werden können, wenn auch nicht einer bestimmten Aminosäure.
Rosa und Richards waren die ersten, die in ihren Studien zur Faltung von Proteinfragmenten der Ribonuklease S (15–17) Tritiumtechniken mit mittlerer Auflösung beschrieben und eingesetzt haben. Die von Rosa und Richards beschriebenen Techniken waren jedoch von marginaler Nützlichkeit, was in erster Linie darauf beruhte, dass sie bestimmte kritische experimentelle Schritte nicht optimierten (Übersichtsartikel siehe 6, Seite 238, 244). Es wurden bis zu den Arbeiten von Englander und Mitarbeitern, in denen erstmals extensive Modifikationen und Optimierungen der Technik von Rosa und Richards beschrieben wurden, keine Studien veröffentlicht, die verwandte Techniken einsetzten.
Die Untersuchungen von Englander, die einen Tritiumaustausch einsetzten, waren ausschließlich auf die Untersuchung allosterischer Veränderungen gerichtet, die in tetramerem Hämoglobin (dessen α-Untereinheit und β-Untereinheit jeweils eine Größe von 16 Kilodalton haben) als Folge der Desoxygenierung ablaufen (6, 18–21). Beim Verfahren von Englander wird natives Hämoglobin (in Milligrammmengen) im oxygenierten Zustand in tritiiertem Wasser relativ niedriger spezifischer Aktivität (2-100 mCi/ml) einem Eintrittsaustausch unterzogen. Das Hämoglobin wird dann desoxygeniert (wodurch eine allosterische Veränderung indiziert wird), durch Gelpermeations-Säulenchromatographie in Tritium-freie Puffer transferiert, und dann lässt man es für Zeiten, die 10- bis 50-mal länger sind als die Zeit des Eintrittsaustauschs, einen Austrittsaustausch durchlaufen. Durch Eintrittsaustausch aufgenommenes Tritium, das in Peptidamiden vorliegt, die nach der induzierten allosterischen Veränderung der Hämoglobinstruktur keine Veränderung der Austauschgeschwindigkeit erfahren, durchläuft einen Austrittsaustausch mit Geschwindigkeiten, die mit den Geschwindigkeiten seines Eintrittsaustauschs identisch sind, und es wird demnach nach dem langen Zeitraum des Austrittsaustauschs praktisch vollständig aus dem Protein entfernt. Peptidamide dagegen, die nach den induzierten allosterischen Veränderungen eine Verlangsamung ihrer Austauschgeschwindigkeit erfahren, behalten vorzugsweise ihre Tritiummarkierung während des Zeitraums des Austrittsaustauschs.
Zur Lokalisierung (bezüglich der Primärsequenz des Hämoglobins) der verlangsamten Amide, die die verbleibende Tritiummarkierung tragen, fragmentiert Englander dann das Hämoglobin, das den Austrittsaustausch durchlaufen hat, proteolytisch mit der Protease Pepsin, trennt, isoliert und identifiziert die verschiedenen Peptidfragmente mittels Reverse-Phase-Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC) und bestimmt mittels Szintillationszählung, welche Fragmente die verbleibende Tritiummarkierung tragen. Mit dem Voranschreiten der Fragmentierung des Hämoglobins gehen jedoch die Sekundärstruktur und Tertiärstruktur eines jeden Fragments verloren, und die aufgefalteten Peptidamide werden frei für das H₂O im Puffer zugänglich. Bei physiologischem pH (> 6) verlässt jede Amid-gebundene Tritiummarkierung die aufgefalteten Fragmente innerhalb von Sekunden. Englander führt die Verfahren der Fragmentierung und der Peptidisolierung mittels HPLC deshalb unter Bedingungen durch, von denen er annimmt, dass sie den Protonenaustausch des Peptidamids minimieren, und zu denen eine niedrige Temperatur (4°C) und die Verwendung von Phosphatpuffern mit einem pH von 2,7 gehören (Übersichtsartikel siehe 6). Diese Technik wurde von Englander erfolgreich dazu eingesetzt, die Peptidbereiche der α- und β-Ketten des Hämoglobins, die an den durch die Desoxygenierung induzierten allosterischen Veränderungen teilnehmen, grob zu identifizieren und zu lokalisieren (18–21). Die Fähigkeit der Technik von Englander zur Lokalisierung Tritiummarkierter Amide bleibt, auch wenn sie einen wichtigen Fortschritt darstellt, gering; im besten Fall berichtet Englander, dass diese Technik eine Amidtritiummarkierung in Hämoglobinpeptiden von einer Größe von 14 Aminosäuren oder darüber nachweist, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, die Markierung genauer zu lokalisieren.
In den Arbeiten von Englander gibt es keinen Hinweis darauf, dass eine auf geeignete Weise adaptierte Technik eines Tritiumaustauschs dazu verwendet werden könnte, die Peptidamide zu identifizieren, die in der Kontaktfläche zwischen einem Proteinrezeptor und seinem Bindungspartner liegen: seine Offenbarungen betreffen ausschließlich die Kartierung allosterischer Veränderungen im Hämoglobin. Weiterhin lehrt und warnt Englander, basierend auf seinen Optimierungsstudien (6–11, 13), dass ein pH von 2,7 sowohl im Proteolyse- als auch im HPLC-Schritt eingesetzt werden muss, was die Verwendung von Proteasen erforderlich macht, die bei diesen pHs arbeiten können (saure Proteasen). Unglücklicherweise sind saure Proteasen bezüglich der Orte der proteolytischen Spaltung relativ unspezifisch, was zur Erzeugung einer sehr großen Zahl unterschiedlicher Peptidfragmente und somit zu beträchtlichen Schwierigkeiten bei der HPLC-Auftrennung führt. Der Zwang, den HPLC-Trennschritt bei pH 2,7 durchführen zu müssen, schränkt die Möglichkeit stark ein, die chromatographische Trennung vieler überlappender Peptide über eine Variation des pH, bei dem die HPLC durchgeführt wird, zu optimieren. Englander versuchte zur Lokalisierung von Hämoglobinpeptiden, die allosterische Veränderungen durchlaufen, diese Probleme zu umgehen, indem er die Tatsache ausnützte, dass einige Peptidbindungen etwas empfindlicher gegenüber Pepsin sind als andere. Er schränkt deshalb die Dauer der Exposition des Proteins gegen Pepsin ein, um die Zahl der Fragmente zu vermindern. Sogar dann war es schwierig, die Fragmente sauber zu trennen. Sie waren auch natürlich länger (im Durchschnitt), und deshalb war die Auflösung geringer. Er versuchte auch die Muster zu vereinfachen, indem er zuerst die Alpha- und Beta-Ketten des Hämoglobins trennte. Es kam dabei jedoch zu einem Nachteil: einem erhöhten Tritiumverlust während der Alpha-beta-Trennung und der Entfernung des Lösemittels, die zur Vorbereitung der Proteolyse erfolgte. Englander zieht die Schlussfolgerung:
„Derzeit ist die Gesamtanalyse des Verhaltens eines gegebenen Proteins hinsichtlich des HX (Wasserstoffaustauschs) mittels dieser Verfahren eine immense Aufgabe. In einem umfassenderen Sinne müssen die besten Strategien für die Durchführung einer derartigen Aufgabe erst noch formuliert werden. Außerdem würden diese Bemühungen von weiteren technischen Fortschritten profitieren, beispielsweise hinsichtlich der Trennfähigkeit der HPLC und vielleicht besonders bezüglich der Entwicklung weiterer saurer Proteasen mit Eigenschaften, die an die Erfordernisse dieser Experimente adaptiert sind" (6).
Während der anschließenden sieben Jahre, die auf diese Beobachtung folgten, wurden keine Fortschritte offenbart, die diese kritischen Einschränkungen der Tritiumaustauschtechnik mittlerer Auflösung zum Thema hatten. Es wurde klar, dass Verbesserungen bezüglich des HPLC-Trennschritts wegen des Zwanges, bei pH 2,7 arbeiten zu müssen, problematisch waren. Der derzeitige begrenzte Erfolg mit kleinen Proteinen hat es sinnlos erscheinen lassen, ähnliche Studien mit größeren Proteinen zu versuchen, bei denen die Probleme einer nicht ausreichenden Peptidtrennung durch HPLC bei einem pH von 2,7 und die Ungenauigkeit hinsichtlich der Fähigkeit, markierte Amide genauer zu lokalisieren, noch gewichtiger sein würden. Außerdem sind die meisten im Sauren arbeitenden Proteasen im allgemeinen nicht spezifischer bezüglich ihrer Spaltmuster, als es Pepsin ist, und Bemühungen, die Technologie durch den Einsatz anderer, im Sauren arbeitender Proteasen als Pepsin zu verbessern, haben die Technik nicht nennenswert verbessert. Vor dem Hintergrund dieser Einschränkungen auf dem Gebiet des Tritiumaustauschs mittlerer Auflösung wurden keine Studien offenbart, die Proteine mit einer Größe der Untereinheiten von über 16 Kilodalton einsetzten.
Allewell und Mitarbeiter haben Studien offenbart, bei denen die Techniken von Englander eingesetzt wurden, um induzierte allosterische Veränderungen im Enzym Aspartat-Transcarbamylase von Escherichia coli zu lokalisieren (22, 23). Die Literaturstelle Burz et al. (22) ist eine kurze Offenbarung, in der die isolierte R2-Untereinheit dieses Enzyms in einem tritiierten Puffer mit einer spezifischen Aktivität von 100 mCi/ml einem Eintrittsaustausch unterzogen wird, eine allosterische Veränderung durch die Zugabe von ATP induziert wird und dann die bezüglich ihrer Konformation veränderte Untereinheit einem Austrittsaustausch unterzogen wird. Die R2-Untereinheit des Enzyms wurde dann proteolytisch mit Pepsin gespalten und bezüglich der Menge der Markierung, die in bestimmten Fragmenten vorlag, analysiert. Die Analyse setzte Techniken ein, die sich eng an den Empfehlungen von Englander orientierten, wobei eine einzige Trennung mittels RP-HPLC in einem Puffer von pH 2,8 eingesetzt wurde.
Die Autoren weisen auf die Schwierigkeit hin, die große Zahl der erzeugten Peptide aufzutrennen, sogar bei diesem kleinen Unterfragment des Proteins, im Hinblick auf die Einschränkungen der Methodik von Englander. Sie kommentieren, dass „die prinzipielle Limitierung dieser Methode derzeit die Trennung mit Säulen, die derzeit zur Verfügung stehen, ist". Es wurde gezeigt, dass die ATP-Bindung an das Enzym die Austauschgeschwindigkeit von Wasserstoffen in verschiedenen, relativ großen Peptidfragmenten der R2-Untereinheit verändert. In einer darauf folgenden vollständigeren Offenbarung (23) offenbart die Gruppe von Allewell Untersuchungen der allosterischen Veränderungen, die in der R2-Untereinheit durch ATP und durch CTP induziert werden. Sie offenbaren einen Eintrittsaustausch der R2-Untereinheit in einem Puffer, der tritiiertes Wasser mit einer spezifischen Aktivität von 22–45 mCi/ml enthält, die Zugabe von ATP oder CTP gefolgt von einem Austrittsaustausch des Tritiums in einem Puffer, der normales Wasser enthält. Die Analyse umfasste den Verdau des Komplexes mit Pepsin und die Trennung der Peptidfragmente durch eine Reverse-Phase-HPLC in einem Puffer von pH 2,8 oder pH 2,7, wobei sich all das eng an die Lehren von Englander anlehnt. Die Peptide wurden über ihre Aminosäure-Zusammensetzung oder über eine N-terminale Analyse identifiziert, und die Radioaktivität eines jeden Fragments wurde mittels Szintillationszählung bestimmt. In beiden dieser Studien war die Lokalisierung der Tritiummarkierung auf Peptide mit einer durchschnittlichen Größe von 10–15 Aminosäuren begrenzt, ohne dass eine höhere Auflösung versucht wurde.
Beasty et al. (24) schließlich haben Untersuchungen offenbart, die Techniken des Tritiumaustauschs zur Untersuchung der Faltung der α-Untereinheit der Tryptophan-Synthetase von E. coli einsetzten. Die Autoren setzten tritiiertes Wasser mit einer spezifischen Aktivität von 20 mCi/ml ein, und sie fragmentierten das Tritium-markierte Enzymprotein mit Trypsin bei einem pH von 5,5, Bedingungen, unter denen das Protein und die erzeugten großen Fragmente in ausreichendem Maß eine gefaltete Struktur behielten, um Amidwasserstoffe während der Proteolyse und der HPLC-Analyse vor einem Austrittsaustausch zu schützen. Unter diesen Bedingungen waren die Autoren imstande, lediglich drei Proteinfragmente zu erzeugen, von denen das kleinste eine Größe von 70 Aminosäuren hatte. Die Autoren unternahmen keinen weiteren Versuch, die Markierung durch einen weiteren Verdau und/oder eine weitere HPLC-Analyse genauer zu lokalisieren. Tatsächlich wäre es unter den experimentellen Bedingungen, die sie einsetzten (sie führten alle Schritte bei 12°C anstelle von 4°C durch, und sie führten die Proteolyse bei pH 5,5 anstelle eines pHs im Bereich von 2 bis 3 durch) unmöglich gewesen, die markierten Amide über einen Tritiumaustausch genauer zu lokalisieren, da die Markierung aufgrund der Entfaltung anschließend erzeugter proteolytischer Fragmente bei pH 5,5, wenn sie kleiner als 10–30 Aminosäuren gewesen wären, sofort verloren gegangen wäre (einen Austrittsaustausch durchlaufen hätte).
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die obigen Offenbarungen auf Studien mittels eines Tritiumaustauschs mittlerer Auflösung der folgenden Themen beschränkt sind: 1) die spontane Rückfaltung verschiedener Teile eines bestimmten Proteins (α-Untereinheit der Tryptophan-Synthetase) (24), 2) die spontane Rückfaltung von zwei Fragmenten, die proteolytisch aus dem gleichen Protein (Ribonuklease-S) erzeugt wurden (15–17), 3) die Veränderungen der Form (allosterische Veränderung), die ein bestimmtes Protein (Hämoglobin) nach der Entfernung von Sauerstoff (Hämoglobin) durchlief (4–6, 12–14, 18–21), und 4) die allosterischen Veränderungen in einem Protein nach der Zugabe von Stoffen, von denen bekannt war, dass sie allosterische Veränderungen induzieren (Aspartat-Transcarbamylase) (22, 23).
Da das Fachgebiet des Tritiumsaustauschs auf die Fähigkeit zur Untersuchung großer Proteine beschränkt war, offenbarte keiner dieser oder anderer Forscher oder schlug keiner dieser oder anderer Forscher vor, dass Techniken des Tritiumaustauschs adaptiert werden könnten, um Kontaktflächen zwischen zwei verschiedenen, großen Proteinen (Untereinheiten von >16 Kilodalton Größe) auf wirkungsvolle Weise zu untersuchen, oder dass Peptidamide, die in Wechselwirkungen zwischen großen Proteinen und ihrem Bindungspartner funktionell mit Tritium markiert sind, auf der Ebene der Aminosäuresequenz auf wirkungsvolle Weise exakt lokalisiert werden könnten.
Fromageot et al., US-Patent 3 828 102 (25), offenbaren die Verwendung des Tritiumaustauschs zur Tritiummarkierung eines Proteins und seines Bindungspartners. Der Komplex aus dem Protein und dem Bindungspartner wird gebildet, ehe man einen Eintrittsaustausch zulässt, und somit wird die Bindungsstelle nicht selektiv markiert. Bei der vorliegenden Erfindung wird das Protein vor seiner Wechselwirkung mit dem Bindungspartner und dem nachfolgenden Austrittsaustausch durch einen Eintrittsaustausch markiert, und somit behalten die Peptidamide, die in der Fläche der Wechselwirkung liegen, spezifisch ihre Markierung, während andere Stellen es nicht tun.
Benson, US-Patente 3 560 158 und 3 623 840 (26), offenbart die Verwendung eines Tritiumaustauschs zur Tritiierung von Verbindungen für analytische Zwecke. Diese Literaturstellen unterscheiden sich von der Erfindung insofern, als sie keinerlei Mechanismus für die Unterscheidung zwischen einer möglichen potenziellen Bindungsstelle und dem Rest des Moleküls bereit stellen.
Techniken des Deuteriumaustauschs
Fesik et al. (27) offenbaren die Messung des Wasserstoffaustauschs (Deuteriumaustauschs) eines Peptids mittels NMR bevor und nachdem es an ein Protein gebunden ist. Aus diesen Daten werden die Wechselwirkungen verschiedener Wasserstoffe im Peptid mit der Bindungsstelle des Proteins analysiert.
Patterson et al. (28) und Mayne et al. (29) offenbaren die NMR-Kartierung einer Antikörper-bindenden Stelle auf einem Protein (Cytochrom c) unter Verwendung eines Deuteriumaustauschs. Dieses relativ kleine Protein mit aufgeklärter NMR-Struktur wird zuerst mit einem monoklonalen Antikörper gegen Cytochrom c komplexiert, und der vorgeformte Komplex wird dann in Puffern, die deuteriertes Wasser enthalten, inkubiert, und es werden zu verschiedenen Zeitpunkten NMR-Spektren aufgenommen. Die NMR-Spektren des Komplexes aus dem Antigen und dem Antikörper werden bezüglich des Vorliegens von Peptidamiden untersucht, die im Vergleich zur Austauschgeschwindigkeit in nicht-komplexiertem nativem Cytochrom c einen verlangsamten Wasserstoffaustausch mit Deuterium des Lösemittels zeigen. Benjamin et al. (30) setzen eine identische NMR-Deuterium-Technik ein, um die Wechselwirkung von Hühnerei...zu studieren.
Kürzlich wurden von anderen (45–50) Techniken offenbart, bei denen Proteine, die über einen Austausch deuteriert worden waren, mit einem Bindungspartner inkubiert werden, einem Austrittsaustausch unterzogen werden, der komplex mit Pepsin fragmentiert wird und Deuterium-haltige Peptide über ein einstufiges Fast-atom-bombardment (Fab) oder eine Elektrospray-Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. In diesen Studien wurde kein Versuch unternommen, das Peptid-gebundene Deuterium in den proteolytisch oder auf andere Weise erzeugten Peptidfragmenten genauer zu lokalisieren.
Johnson R. S. und Walsh K. A. (Mass spectrometric measurement of protein amide hydrogen exchange rates of apo- and holo-myoglobin, Protein Science, Dezember 1994, Bd. 3, S. 2411–2418) beschreiben die Messung der Austauschgeschwindigkeiten des Proteinamidwasserstoffs im Apo- und Holomyoglobin über eine Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS). Im einzelnen setzt Johnson einen Pepsinverdau des ursprünglichen Proteins zur Erzeugung von Peptidfragmenten ein, deren Deuterium-Gehalt mittels ESI-MS gemessen wird und deren Sequenzen mittels MS/MS bestimmt werden. Johnson misst das Ausmaß der Deuteriumaufnahme als Funktion der Zeit des Deuteriumaustauschs, um zu einer Austauschgeschwindigkeit zu kommen. Johnson setzt auch bestimmte Bedingungen, wie eine niedrige Temperatur und saure Puffer, ein, um die Auswirkungen des Rückaustauschs der Deuteriummarkierungen zu vermindern. Allerdings setzt Johnson keine Carboxypeptidasen ein, um die Peptidfragmente zunehmend zu weiteren Serien von Unterfragmenten abzubauen. Daher führt die Tatsache, dass Johnson einen Pepsinverdau des ursprünglichen Proteins einsetzt, zu einer Begrenzung der Auflösung, mit der die Position der Deuteriummarkierungen bestimmt werden kann. (Siehe z. B. Johnson, S. 2417, Spalte 1, Zeilen 13–14: „Although hydrogen exchange measurements for peptides typically cannot provide information on individual residues ..." (Betonung zugefügt)). Johnson stellt ferner fest, dass aufgrund der intrinsischen Fehler wegen des Rückaustauschs von Deuterium die Genauigkeit, mit der Markierungen in kleineren Peptiden präzise lokalisiert werden können, durch Zunahmen der Messfehler aufgehoben werden (siehe Johnson, S. 2413, Spalte 2, Zeilen 49–55).
Zhang Z., Post B. P. und Smith D. L. (Amide hydrogen exchange determined by mass spectrometry: application to rabbit muscle aldolase, Biochemistry, 23. Jan. 1996, Bd. 35, S. 799–791) demonstrieren den Einsatz einer Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie („FAB"-Massenspektrometrie) zur Messung von Austauschgeschwindigkeiten von Proteinamidwasserstoffen der Aldolase aus Kaninchenmuskel. Im einzelnen setzen Zhang et al. einen Pepsinverdau des Ausgangsproteins ein, um Peptidfragmente zu erzeugen, die mittels HPLC aufgetrennt werden und deren Deuterium-Gehalte mittels FAB-MS gemessen werden. Die Sequenzen der Peptide werden entweder über eine Computer-unterstützte Analyse der Massenspektren oder mittels anderer Sequenzierungstechniken bestimmt. Zhang setzt bestimmte Bedingungen, wie eine niedrige Temperatur und saure Puffer, ein, um die Auswirkungen des Rückaustauschs der Deuteriummarkierungen zu vermindern. Allerdings setzt Zhang keine Carboxypeptidasen ein, um die Peptidfragmente zunehmend zu weiteren Serien von Unterfragmenten abzubauen. Daher führt die Tatsache, dass Zhang nur einen Pepsinverdau des ursprünglichen Proteins einsetzt, zu einer Begrenzung der Auflösung, mit der die Position der Deuteriummarkierungen bestimmt werden kann. (Siehe z. B. Zhang, S. 783, Spalte 1, Zeilen 26–41: „Although the range of rate constants...") Zhang beschreibt ferner eine gewisse Korrelation zwischen der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindung und den Geschwindigkeiten des Wasserstoffaustauschs (siehe Zhang, S. 785, 7). Diese Korrelation wird jedoch nicht auf der Ebene der einzelnen Aminosäurereste, sondern auf der Ebene der Peptidfragmente bestimmt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur funktionellen Markierung spezifischer Aminosäurereste bereit, die an Wechselwirkungen zwischen einem Bindeprotein und seinem Bindungspartner beteiligt sind. Sie ist bei der Untersuchung der Unterbereiche des Bindeproteins und des Bindungspartners besonders für große (>30 Kilodalton) Proteine geeignet, auch wenn sie nur in geringen Mengen vorliegen.
Bei einer Ausführungsform ist die Markierung Tritium, und die Menge der Markierung auf einem Fragment oder Unterfragment wird über die Messung seiner Radioaktivität bestimmt. Bei einer zweiten Ausführungsform ist die Markierung Deuterium, und die Menge der Markierung auf einem Fragment oder Unterfragment wird mittels Massenspektrometrie bestimmt. Der Begriff „schwerer Wasserstoff" wird hier verwendet, um ganz allgemein entweder Tritium oder Deuterium zu bezeichnen. Außerdem gilt die Bezugnahme auf Tritium mutatis mutandis für Deuterium, es sei denn, es wird eindeutig ausgeschlossen.
Letztlich wird das Bindeprotein zuerst unter Bedingungen tritiiert oder deuteriert, unter denen native Wasserstoffe durch die Tritium- oder Deuteriummarkierung ersetzt werden (das ist der Schritt des „Eintrittsaustauschs"). Dann lässt man den Bindungspartner mit dem markierten Protein in Wechselwirkung treten. Der Bindungspartner besetzt die Bindungsstelle und schützt die Tritium- oder Deuteriummarkierungen dieser Stelle vor einem nachfolgenden „Austrittsaustausch". Somit sind nach dem „Austrittsaustausch" nur die Reste der Bindungsstelle markiert. Da die Bindungsstelle normalerweise nur einen kleinen Teil des Moleküls ausmacht, wird mit diesem Ansatz ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis erhalten als mit der konventionelleren Methode von Englander.
Um die markierten Reste tatsächlich zu identifizieren, muss man den Komplex zuerst unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffisotopenaustauschs (H³/H¹ oder H²/H¹) dissoziieren, da ansonsten die Markierungen die Bindungsstelle verlassen würden, sobald der Ligand entfernt worden ist. Das Bindeprotein wird dann fragmentiert (z. B. mit einer Endoprotease wie Pepsin), und zwar immer noch unter Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs, um Fragmente zu erhalten. Diejenigen Fragmente, die eine Markierung tragen, enthalten vermutlich die Reste der Bindungsstelle. An diesem Punkt ist die Auflösung der Bindungsstelle nicht besser als die Fragmentgröße.
Eine genauere Lokalisierung der Markierungen wird über die Analyse von Unterfragmenten erreicht, die über einen gesteuerten schrittweisen Abbau eines jeden isolierten markierten Peptidfragments unter Bedingungen eines verlangsamten Austauschs erzeugt werden. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird von einem Peptidfragment gesagt, dass es „fortschreitend", „schrittweise" oder „sequenziell" abgebaut wird, wenn eine Serie von Fragmenten erhalten wird, die typisch für das sind, was man mittels einer idealen Exopeptidase erhalten würde, d. h. bei jedem Schritt wird nur eine endständige Aminosäure entfernt. Somit wären, wenn die n Aminosäuren eines Peptides als A₁ bis A_n bezeichnet würden (wobei die Nummerierung an demjenigen Ende anfängt, an dem der Abbau beginnt), die Unterfragmente A₂...A_n, A₃...A_n, ..., A_n–1-A_n und letztlich A_n. Die durch die aufeinanderfolgenden Unterfragmenten erzeugten Signale werden in ihrer Reihenfolge miteinander korreliert, um zu bestimmen, welche Aminosäuren des fraglichen Fragments markiert waren.
Dieses Verfahren wurde in keiner der zitierten Literaturstellen dazu eingesetzt, die Markierungsstellen genauer zu lokalisieren, obwohl eine verbesserte Auflösung sicherlich ein Ziel in diesem Fachgebiet war. In dem Fachgebiet kommt man diesem Ziel am nächsten mit Englanders allgemeinen Vorschlägen weiterer Fragmentierungen mit einer anderen „sauren Protease".
Der fortschreitende Abbau wird vorzugsweise mittels eines Enzyms, und bevorzugter mittels einer Carboxypeptidase, erreicht. Die Notwendigkeit, einen sauren pH zum Zeitpunkt des Abbaus einzusetzen, um Tritiumverluste zu minimieren, führt dazu, dass keine Carboxypeptidasen eingesetzt werden, die durch die benötigten sauren Puffer im wesentlichen inaktiviert werden. Jedoch sind die Carboxypeptidase P, die Carboxypeptidase Y und verschiedene andere, im Sauren aktive (d. h. enzymatisch unter sauren Bedingungen aktive) Carboxypeptidasen für eine Proteolyse von Peptiden unter sauren Bedingungen, sogar bei pH 2,7, geeignet. Die fortschreitende Unterfragmentierung gereinigter Peptide, die eine Tritiummarkierung tragen, wird mit im Sauren aktiven Carboxypeptidasen unter Bedingungen durchgeführt, die ein komplettes Set von amidmarkierten Tochterpeptiden erzeugen, bei denen jedes um eine einzige carboxyterminale Aminosäure kürzer als das vorhergehende ist. Eine HPLC-Analyse der verschiedenen Mitglieder dieses Sets aus fortschreitend verkürzten Peptiden ermöglicht die zuverlässige Zuordnung der Markierung zu bestimmten Amidpositionen innerhalb des Ausgangspeptids. Alternativ zieht die vorliegende Erfindung Techniken eines C-terminalen chemischen Abbaus in Betracht, die unter „Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs" durchgeführt werden können, z. B. mittels Pentafluorpropionsäureanhydrid. Die Empfindlichkeit der Technik kann durch die Verwendung von Referenz-Peptidunterfragmenten als HPLC-Mobilitätsmarker verbessert werden.
Im allgemeinen ist in diesem Fachgebiet den Problemen einer Denaturierung des Bindeproteins in einem Ausmaß, das die Proteolyse unter den Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoffaustauschs erleichtert, nicht genügend Aufmerksamkeit geschenkt worden. Pepsin ist beispielsweise bei 0°C viel weniger aktiv als bei Raumtemperatur. Zwar ist Pepsin imstande, Hämoglobin, das bei einem sauren pH und bei 0°C denaturiert wurde, extensiv zu verdauen, aber andere Bindeproteine, wie das Lysozym aus dem Hühnerei, sind gegenüber einer Denaturierung durch Bedingungen eines langsamen H-Austauschs und somit gegenüber einem anschließenden Pepsinverdau viel resistenter. Als Ergebnis davon werden viel weniger und längere Fragmente erzeugt. Das kompliziert die Analyse.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das markierte Bindeprotein vor der Fragmentierung denaturierenden Bedingungen ausgesetzt, die mit einem langsamen Wasserstoffaustausch kompatibel und ausreichend stark sind, um das Protein genügend zu denaturieren, um es entsprechend empfindlich für die vorgesehene proteolytische Behandlung zu machen. Wenn diese denaturierenden Bedingungen auch die Protease denaturieren würden, dann wird das denaturierte Protein vor der Proteolyse in weniger denaturierte Bedingungen (immer noch kompatibel mit einem langsamen H-Austausch) überführt, die in ausreichendem Maße denaturierend sind, um das Protein in einem für die Protease zugänglichen Zustand zu halten, aber für die fragliche Protease wesentlich weniger schädlich sind.
Vorzugsweise ist das zunächst verwendete Denaturierungsmittel Guanidinthiocyanat, und die weniger denaturierenden Bedingungen werden über eine Verdünnung mit Guanidin-HCl erhalten.
Disulfidbindungen können, wenn sie in dem Bindeprotein, das verdaut werden soll, vorkommen, ebenfalls die Analyse stören. Disulfidbindungen können das Protein in einem gefalteten Zustand halten, wobei nur eine relativ kleine Zahl der Peptidbindungen einem proteolytischen Angriff ausgesetzt ist. Eine fehlende Spaltung der Disulfidbindungen würde, auch wenn einige Peptidbindungen gespalten werden, die Aufglösung der Peptidfragmente vermindern, die noch über die Disulfidbindungen miteinander verknüpft sind; sie würden, statt voneinander getrennt zu werden, zusammenbleiben. Das würde die Auflösung wenigstens um einen Faktor von zwei verringern (möglicherweise von mehr, in Abhängigkeit von der Beziehung der Topologie der Disulfidbindung zur Stellen der Peptidspaltung). Wenn die Disulfidbindungen nicht gespalten werden, wäre eine weitere genauere Lokalisierung der Tritium-markierten Amide innerhalb eines jeden der über Disulfidbindungen verknüpften Peptide sehr schwierig, da es zu unterschiedlichen Zeiten und mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zu einer Entfernung von Aminosäuren an jedem C-Terminus der über Disulfide verknüpften Segmente kommen würde.
Der Anmelden hat entdeckt, dass wasserlösliche Phosphine verwendet werden können, um die Disulfidbindungen eines Proteins unter Bedingungen eines „langsamen Wasserstoffaustauschs" zu spalten. Das ermöglicht eine viel effektivere Fragmentierung großer Proteine, die Disulfidbindungen enthalten, ohne zu bewirken, dass eine Tritiummarkierung vom Protein oder seinen proteolytischen Fragmenten verloren geht (was bei konventionellen Techniken einer Disulfidreduktion der Fall wäre, die bei pH-Werten durchgeführt werden müssen, die für die Erhaltung der Tritiummarkierung sehr ungünstig sind).
Bei einer anderen Ausführungsform werden Peptidamide auf der Oberfläche des Bindeproteins indirekt über den Transfer von Tritium oder Deuterium markiert, das zuvor über einen Wasserstoffaustausch an der Wechselwirkungsoberfläche des Bindungspartners befestigt wurde. Dieses Verfahren führt zu einer funktionellen Markierung von Rezeptorproteinamiden, wenn sie über eine Komplexbildung verlangsamt sind und sich im komplexierten Zustand auch in engem Kontakt mit dem Bindungspartner befinden. Amide, die entfernt von der Wechselwirkungsoberfläche vorliegen, aufgrund einer durch die Komplexbildung induzierten allosterischen Veränderung im Protein bezüglich ihres Austausches aber verlangsamt werden, werden nicht markiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Analyse des Tritiums, das mit Hämoglobin-Fragmenten (Hgb-Fragmenten) assoziiert ist, die durch einen Pepsinverdau von Tritium-ausgetauschtem Hämoglobin ± einem monoklonalen Antikörper erzeugt wurden, gefolgt von einer HPLC in PO₄-gepufferten Lösemitteln, pH 2,7. Kasten A: Absorptionsspur (214 nm) des unmarkierten, proteolytisch gespaltenen Hgb. Kasten B: Hgb, das 4 Stunden einem Eintrittsaustausch unterzogen, nach pH 2,7 transferiert und dann ohne einen Austrittsaustausch verdaut wurde. Kasten C: Hgb, das 4 Stunden einem Eintrittsaustausch unterzogen, mit dem monoklonalen Antikörper β6 gemischt und dann 40 Stunden einem Austrittsaustausch unterzogen wurde, ehe die Proteolyse bei pH 2,7 erfolgte. Kasten D: Hgb, das 4 Stunden einem Eintrittsaustausch und dann 40 Stunden einem Austrittsaustausch unterzogen wurde, ehe die Proteolyse bei pH 2,7 erfolgte.
2 Auftrennung in der zweiten Dimension (HPLC mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthaltenden Lösemitteln) bei 0°C der Tritium-haltigen rpHPLC-Fraktion aus der Auftrennung in der ersten Dimension, 1, Kasten C.
3 Kästen A bis C. Identifizierung von funktionell über eine Wechselwirkung mit dem monoklonalen Antikörper β121 markierten Hämoglobinpeptiden. Ähnlich wie in der 1, aber Einsatz des monoklonalen Antikörpers β121 anstelle des monoklonalen Antikörpers β6.
4 Kästen A bis D. Identifizierung von funktionell über eine Wechselwirkung mit Haptoglobin markierten Hämoglobinpeptiden. Ähnlich wie in der 1, aber Einsatz von Haptoglobin anstelle eines Antikörpers.
5 Struktur von Hämoglobin mit markierten Peptidbereichen. Kasten A: Peptide, die mit dem monoklonalen β6 in Wechselwirkung treten; Kasten B: Peptide, die mit dem monoklonalen Antikörper β121 in Wechselwirkung treten.
6 Carboxypeptidase P-Verdau des β1–14-Peptids. Über einen Tritiumaustausch markiertes synthetisches β1–14-Peptid wurde unter Einsatz verschiedener Enzymkonzentrationen und Verdauzeiten (angegeben am Rand ganz links) mit Carboxypeptidase-P (CP-P) verdaut (0°C). Die HPLC-Analyse wurde dann wie in der 1 durchgeführt, aber unter gleichzeitiger Messung der Absorption bei 214 nm (linke Kästen) und der Radioaktivität (rechte Kästen) des Säuleneffluats. Die Positionen der verschiedenen erzeugten C-terminal verkürzten Peptidfragmente sind angegeben (Zahlen 3 bis 9). Es wird eine fortschreitende Erzeugung von Fragmenten beobachtet.
7 Reduktion von Disulfidbindungen bei pH 2,7. Mittels Tritiumaustausch markiertes β1–14-Peptid (2 μg bei 0°C, pH 2,7) wurde mit dem Peptid Endothelin (4 μg) supplementiert, das zwei Disulfidbindungen enthält (35), und die Mischung wurde ohne (A) oder mit (B–E) 50 mM Tris (2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) für unterschiedliche Zeiten bei 0°C (A, C–E) oder 2 Minuten bei 22°C (B) inkubiert. Die Mischungen wurden dann einer HPLC wie in der 7 unterzogen. Der prozentuale Anteil des Endothelins, der unter den jeweiligen Bedingungen unreduziert blieb, ist angegeben (linke Kästen) so wie der Anteil der Tritiummarkierung, der am β1–14-Peptid befestigt blieb (rechte Kästen). Es wird eine 50%ige Reduktion der Endothelindisulfide bei pH 2,7 erzielt, bei einem nicht-signifikanten Verlust von Peptidamid-gebundenem Tritium vom β1–14 Peptid. „R" bezeichnet die Positionen der reduzierten Formen des Endothelins.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVRZUGTEN AUSFÜHRUNGSFRMEN
Biochemische Bindung, ganz allgemein
Viele biologische Prozesse werden über eine nicht-kovalente Bindungswechselwirkung zwischen einem Protein und einem anderem Molekül, seinem Bindungspartner, vermittelt. Die Identifizierung der Strukturmerkmale der beiden bindenden Moleküle, die unmittelbar zu diesen Wechselwirkungen beitragen, wäre für die Entwicklung von Arzneimitteln nützlich, die diese Prozesse verändern.
Die Moleküle, die bevorzugt aneinander binden, können als Partner eines „spezifischen Bindungspaares" bezeichnet werden. Derartige Paare schließen einen Antikörper und sein Antigen ein, ein Lectin und ein Kohlenhydrat, an das es bindet, ein Enzym und sein Substrat und ein Hormon und seinen zellulären Rezeptor. In einigen Texten werden die Begriffe „Rezeptor" und „Ligand" verwendet, um ein Paar von bindenden Molekülen zu bezeichnen. Gewöhnlich wird der Begriff „Rezeptor" für einen Partner eines spezifischen Bindungspaares verwendet, der zu einer Molekülklasse gehört, die für ihre Bindungsaktivität bekannt ist, z. B. Antikörper. Der Begriff „Rezeptor" wird auch vorzugsweise demjenigen Partner des Paares zugeordnet, der größer ist, z. B. dem Avidin im Falle des Paares Avidin-Biotin. Allerdings ist die Identifizierung eines Rezeptors und eines Liganden letztlich willkürlich, und der Begriff „Ligand" kann verwendet werden, um ein Molekül zu bezeichnen, das andere einen „Rezeptor" nennen würden. Der Begriff „Antiligand" wird manchmal anstelle von „Rezeptor" verwendet.
Zwar können Bindungswechselwirkungen zwischen jedem beliebigen Molekülpaar vorkommen, z. B. zwei DNA-Strängen, aber die vorliegende Beschreibung betrifft in erster Linie Wechselwirkungen, bei denen wenigstens eines der Moleküle ein Protein ist. Somit scheint es passend zu sein, von einem „Bindeprotein" und seinem „Bindungspartner" zu sprechen. Der Begriff „Protein" wird hier in einem breiten Sinne verwendet, der mutatis mutandis Polypeptide und ligopeptide einschließt sowie Derivate von diesen, wie Glycoproteine, Lipoproteine und Phosphoproteine sowie Metalloproteine. Die entscheidende Anforderung ist, dass das „Bindeprotein" eine oder mehrere Peptidbindung(en) (-NHCO-) enthält, da der Amidwasserstoff der Peptidbindung (sowie in den Seitenketten bestimmter Aminosäuren) bestimmte Eigenschaften aufweist, die sich für eine Analyse über einen Protonenaustausch anbieten.
Das Bindeprotein kann mit einem natürlich vorkommenden Protein identisch sein, oder es kann ein bindendes Fragment oder eine andere Mutante eines derartigen Proteins sein. Das Fragment oder die Mutante kann im Vergleich zum Ausgangsprotein die gleichen oder andere Bindungseigenschaften zeigen.
Integrale Membranproteine sind von besonderem Interesse, da es schwierig ist, sie für Untersuchungen über eine Röntgenbeugung zu kristallisieren. Proteine, die zu groß für eine Untersuchung mittels NMR-Verfahren sind, z. B. solche, die größer als ungefähr 50 Kilodalton sind, sind auch von speziellem Interesse, insbesondere wenn sie sich nicht als eine Verbundstruktur aus zwei oder mehreren, getrennt analysierbaren Domänen charakterisieren lassen. Beispiele für geeignete Proteine sind Integrie (die große integrale Membranproteine sind), Zelloberflächenrezeptoren für Wachstumsfaktoren (einschließlich von Cytokin-Rezeptoren), Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen, Selectin und Zelloberflächenrezeptoren der Immunglobulin-Superfamilie (z. B. ICAM-1).
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders nützlich für die Untersuchung von Proteinen mit diskontinuierlichen Epitopen, wie bestimmten Antikörpern einschließlich bestimmter klinisch wichtiger Autoimmunantikörper.
Eine „Bindungsstelle" ist ein Kontaktpunkt zwischen einer bindenden Oberfläche („Paratop") des Bindeproteins und einer komplementären Oberfläche („Epitop") des Bindungspartners. (Wenn der Bindungspartner ein Protein ist, dann ist die Bezeichnung „Paratop" und „Epitop" im wesentlichen willkürlich. Im Falle von Wechselwirkungen zwischen einem Antikörper und einem Antigen bezeichnet man jedoch herkömmlicherweise die Antigen-bindende Stelle des Antikörpers als das „Paratop" und die Zielstelle auf dem Antigen als das „Epitop".) Ein spezifisches Bindungspaar kann mehr als eine Bindungsstelle aufweisen, und der Begriff „Paar" wird locker verwendet, da das Bindeprotein zwei oder mehr Bindungspartner binden kann (wie im Falle eines divalenten Antikörpers). Außerdem können andere Moleküle, z. B. allosterische Effektoren, die Konformation eines Partners des „Paares" verändern und dadurch die Bindung modulieren. Der Begriff „Paar" soll diese komplexeren Wechselwirkungen mit umfassen.
Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoffaustauschs
Die vorliegende Erfindung betrachtet die Markierung der Bindungsstelle eines Bindeproteins (oder eines Bindungspartners) mit einem schweren Wasserstoffisotop und die Bestimmung der Lokalisation der Markierungen unter Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoffaustauschs. „Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoffaustauschs" werden hiermit als Bedingungen definiert, unter denen die Geschwindigkeit des Austauschs von normalem Wasserstoff gegen schweren Wasserstoff in Amidwasserstoffen, die dem Lösemittel frei ausgesetzt sind, beträchtlich vermindert ist, d. h. genügend, um eine ausreichende Zeit für die Bestimmung der genauen Positionen des Amidwasserstoffes, die mit dem schweren Wasserstoff markiert worden waren, mittels der hier beschriebenen Verfahren zu ermöglichen. Die Geschwindigkeit des H-Austauschs ist eine Funktion der Temperatur, des pH und des Lösemittels. Die Geschwindigkeit nimmt pro 10°C Temperaturerniedrigung um einen Faktor von 3 ab. Deshalb wird der Einsatz von Temperaturen um 0°C bevorzugt. In Wasser liegt die minimale Geschwindigkeit des H-Austauschs bei einem pH von 2–3. Wenn sich die Bedingungen vom optimalen pH entfernen, dann steigt die Geschwindigkeit des H-Austauschs an, typischerweise 10-fach bei einer Entfernung vom Minimum um eine pH-Einheit nach oben oder nach unten. Der Einsatz hoher Konzentrationen eines polaren organischen Co-Lösemittels verschiebt das pH-Minimum zu einem höheren pH, der potenziell bei pH 6 und vielleicht, mit dem richtigen Lösemittel, sogar noch höher liegt.
Bei pH 2,7 und 0°C liegt die typische Halbwertszeit einer Tritiummarkierung in einer Amidposition, die frei für das Lösemittel Wasser zugänglich ist, bei ungefähr 70 Minuten. Vorzugsweise führen die verlangsamten Bedingungen der vorliegenden Erfindung zu einer Halbwertszeit von wenigstens 10 Minuten, bevorzugter von wenigstens 60 Minuten.
Ausführungsformen des Tritiumaustauschs
Bei einer Ausführungsform betrachtet die vorliegende Erfindung das folgende Verfahren zur Charakterisierung einer Bindungsstelle:

A. Es wird das Phänomen des Wasserstoffaustauschs (Tritium) dazu verwendet, jeden der Amidwasserstoffe auf den Aminosäuren, die die Oberfläche des Rezeptorproteins ausmachen, einschließlich der Oberfläche der Ligandenbindungsstelle des Rezeptors, mit einer radioaktiven Sonde (Tritium) zu ersetzen. Diese Markierung wird unter im wesentlichen physiologischen Bedingungen erzielt, indem das Rezeptorprotein in Lösungen inkubiert wird, die tritiiertes Wasser enthalten. (Vorzugsweise hat das Wasser eine hohe spezifische Aktivität.)
B. Ein Proteinligand (Bindungspartner) wird dann dem über einen Eintrittsaustausch markierten (tritiierten) Rezeptorprotein zugesetzt, und man lässt ihn an seine spezifische Stelle auf dem Rezeptor binden. Sobald der Ligand an den Rezeptor gebunden hat, sind Wasserstoffe auf den Aminosäuren, die die Oberfläche der Bindungsstelle des Rezeptors ausmachen, nicht länger imstande, effizient mit dem umgebenden wässrigen Puffer in Wechselwirkung zu treten, und ein weiterer Wasserstoffaustausch wird stark gehemmt.
C. Der Komplex aus dem tritiierten Rezeptor und dem Liganden wird dann in physiologische Puffer, die frei von Tritium sind, transferiert. Man lässt die Tritiummarkierung auf dem Rezeptor-Liganden-Komplex einen Austrittsaustausch aus dem Rezeptor durchlaufen. Jedoch sind die vom Bindungskomplex abhängige Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Protein und dem Bindungspartner sowie die beschränkte Zugänglichkeit der Grenzfläche zwischen dem Protein und dem Bindungspartner im Komplex für das Lösemittel selektive Hindernisse für den Austrittsaustausch einer Tritiummarkierung des Peptidamids, das sandwichartig zwischen dem Protein und dem Bindungspartner eingeschlossen ist. Wenn die Entfernung (der Austrittsaustausch) aus anderen Bereichen des Komplexes aus dem Protein und seinem Bindungspartner im wesentlichen beendet ist, besteht das Ergebnis aus der bevorzugten Zurückhaltung der Tritiummarkierung an den Amiden, für die der Wasserstoffaustausch aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem Protein und dem Bindungspartner verlangsamt ist, typischerweise den Amiden, die mit den Aminosäuren assoziiert sind, die die Oberfläche der Ligandenbindungsstelle des Rezeptors ausmachen. Gegebenenfalls kann der Komplex, während der Austrittsaustausch abläuft, einem begrenzten proteolytischen Verdau, einer Denaturierung und/oder einer Disulfidreduktion unterzogen werden, solange die Integrität der Wechselwirkung zwischen dem Bindeprotein und dem Bindungspartner nicht wesentlich durch derartige Manöver gestört wird.
D. Die spezifischen Amide der Peptidbindungen, die das verbleibende Tritium tragen, werden dann identifiziert. Das erfolgt mittels:
(1) Verschieben des markierten Komplexes aus Rezeptor und Ligand zu Bedingungen (z. B. 0–4°C, pH 2,7), die den Komplex dissoziieren und gleichzeitig den Austausch des Amidwasserstoffs verlangsamen.
(2) Unterziehen des Rezeptors einer Proteolyse, gefolgt von einer Trennung mittels Reverse-Phase-Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC) (vorzugsweise zweidimensional) der resultierenden Rezeptorfragmente unter anhaltenden Bedingungen eines verlangsamten Protonenaustauschs. Rezeptorfragmente, die eine Tritiummarkierung tragen, werden identifiziert, isoliert und bezüglich ihrer Aminosäuresequenz und deshalb ihrer Lokalisation innerhalb der primären Aminosäuresequenz des intakten Rezeptors charakterisiert.

Die Präparation des Bindeproteins für die proteolytische Analyse kann umfassen:

(a) Abtrennen der Anteile des Proteins, die nicht für die Komplexbildung benötigt werden,
(b) Spaltung der Disulfidbindungen, die die Analyse der Fragmente komplizieren könnten (siehe Abschnitt 5A), und/oder
(c) Denaturierung des Proteins, um es empfindlicher gegenüber einem proteolytischen Angriff zu machen (siehe Abschnitt 5B).

Der Schritt (a) kann vor oder nach dem Übergang zu Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs durchgeführt werden, da er nicht zu einer Dissoziation der miteinander in Kontakt stehenden Oberflächen führt. Die Schritte (b) und (c) verursachen eine derartige Dissoziation mit größerer Wahrscheinlichkeit, und man muss sie deshalb häufiger unter den Bedingungen eines langsamen Austauschs durchführen.

(3) Bestimmen der Lokalisation der Tritiummarkierung innerhalb eines jedes Peptids durch das Unterfragmentieren der markierten Peptide (z. B. mit im Sauren aktiven Carboxypeptidasen oder chemischen Verfahren, die mit einem Tritiumaustausch kompatibel sind) unter Bedingungen eines langsamen Protonenaustauschs und Charakterisieren der markierten Unterfragmente. Zum Beispiel kann die Identität eines jeden Unterfragmentes über eine Aminosäure-Analyse, über eine Peptidsequenzierung oder über einen Vergleich seiner Beweglichkeit mit denjenigen synthetischer Markerpeptide für die HPLC-Beweglichkeit bestimmt werden, und die Menge der in jedem Unterfragment enthaltenen Tritiummarkierung kann mittels Szintillationszählung bestimmt werden. Da jede carboxyterminale Aminosäure des funktionell markierten Peptids sequenziell mit der Carboxypeptidase abgespalten wird, wird der Stickstoff, der das sich langsam austauschende Peptidamid in der intakten Peptidbindung bildete, in ein sich schnell austauschendes sekundäres Amin umgewandelt, und jede möglicherweise an diesem Stickstoff vorhandene Tritiummarkierung verschwindet innerhalb von Sekunden aus dem Peptid, während das gesamte andere, am Amid gebundene Tritium an Ort und Stelle verbleibt. Eine Abnahme der Radioaktivität vom einem Unterfragment zum nächst kleineren zeigt an, dass das soeben veränderte Amid mit Tritium markiert war.

Auf diese Weise wird die genaue Lokalisation eines jedes Peptidamids, das aufgrund seiner Wechselwirkung mit dem Bindungspartner funktionell mit Tritium markiert wurde, innerhalb des Proteins bestimmt. Als Schlussfolgerung ergibt sich dann auf diese Weise, dass man die genauen Aminosäuren, die die Oberfläche der Bindungsstelle des Rezeptors ausmachen, kennt. Es können Untersuchungen durchgeführt werden; um die Austauschgeschwindigkeiten eines jeden den der markierten Amide, die oben identifiziert wurden, sowohl vor als auch nach der Komplexbildung mit dem Bindungspartner zu bestimmen. Das ermöglicht die Berechnung des Ausmaßes der Austauschverlangsamung, die alle diese Amide als Folge der Komplexbildung erfahren, und es ermöglicht die Optimierung der Zeiten für den Eintrittsaustausch und den Austrittsaustausch.

E. Es können parallele Untersuchungen durchgeführt werden, in denen der verwandte Bindungspartner einem Eintrittsaustausch mit Tritium unterzogen wird, mit dem Rezeptorprotein komplexiert wird, als Komplex aus dem Bindungspartner und dem Protein einem Austrittsaustausch unterzogen wird und die verlangsamten Amide im Bindungspartner wie oben identifiziert werden. Dieses Vorgehen führt zur Identifizierung der Unterbereiche des Bindungspartners, die mit dem Protein in Wechselwirkung treten.
F. Die Kenntnis der Identität der genauen Kontaktpeptide sowohl im Rezeptor als auch im Liganden können mit zusätzlichen Strukturinformationen kombiniert werden, die durch die Erfindung bereit gestellt werden (Identifizierung der Peptidamide des Proteins und des Bindungspartners, die nach der Komplexbildung wahrscheinlich direkt Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Protein und dem Bindungspartner bilden), um Modelle für die komplementären,< dreidimensionalen Strukturen der Wechselwirkungsoberflächen des Rezeptors und des Liganden zu erzeugen. Diese Modelle können dann als die Basis für die Konstruktion und Erzeugung von Peptidarzneimitteln oder peptidomimetischen Arzneimitteln verwendet werden.

Die einzelnen Schritte dieses Verfahrens werden nun detaillierter erörtert.
1. Eintrittsaustausch
Das untersuchte Protein wird in einem Puffer inkubiert, der mit tritiiertem Wasser (³H₂O), vorzugsweise von hoher spezifischer Aktivität, supplementiert ist. Das führt zur zeitabhängigen, reversiblen Inkorporation einer Tritiummarkierung in jedes Peptidamid der Oberfläche des Proteins, einschließlich seines (potenziellen) ligandenbindenden Unterbereiches, über den Mechanismus des Protonenaustauschs.
Es kann jeder beliebige physiologische Puffer, der für die Wechselwirkung des Proteins mit seinem Bindungspartner geeignet ist, eingesetzt werden (mit keinerlei Einschränkungen bezüglich des pHs oder der Temperatur des Puffers). Zu geeigneten Puffern gehören Phosphat-gepufferte Saline (0,15 mM NaCl, 10 mM PO₄, pH 7,4 (PBS)). Es wird die Verwendung kleiner Inkubationsvolumina (0,1–10 μl), die hohe Konzentrationen des Rezeptorproteins (10–100 mg/ml) enthalten, bevorzugt.
Das erforderliche Ausmaß der Tritiierung (und somit der Konzentration des Tritiums im Puffer) hängt von der Gesamtmenge des Proteins, die für die Analyse zur Verfügung steht, ab. Für die Analyse von 1 mg Protein sind wenigstens 10 Ci/ml wünschenswert, für 0,1 mg 100 Ci/ml und für 0,01 mg 1000 Ci/ml. (Reines tritiiertes H₂O hat ungefähr 2500 Ci/ml.) Für die meisten Anwendungen hat das tritiierte Wasser 50–500 Ci/ml. hne den Einsatz dieser hohen spezifischen Aktivitäten wären Untersuchungen von Proteinen, die in begrenzter Menge zur Verfügung stehen, viel schwieriger. (Es kann sogar eine noch höhere spezifische Aktivität (z. B. 500–1500 Ci/ml) in der Erfindung eingesetzt werden, aber Überlegungen hinsichtlich des Strahlenschutzes machen es notwendig, derartige Eintritts- und Austrittsaustauschverfahren in besonderen Einrichtungen durchzuführen, wie sie im Tritium-Labor der National Tritium Facility, Lawrence Berkely Laboratories, University of California, Berkeley, zur Verfügung stehen.)
Es sollte angemerkt werden, dass mit den üblichen Tritiummengen nur ein kleiner prozentualer Anteil der Moleküle des Bindungsproteins an einer beliebigen exponierten Position tritiiert sein wird. Alles, was erforderlich ist, ist, dass im wesentlichen jedes der exponierten Amidwasserstoffatome in einer (mittels Strahlungsmessung) nachweisbaren Zahl der Moleküle des Bindungsproteins ersetzt ist.
Es muss nicht sein, dass sich die Analyse des Tritiumaustauschs auf lediglich eine einzige Zeit des „Eintrittsaustauschs" stützt. Statt dessen kann der geschickte Experimentator das Experiment unter Einsatz verschiedener Eintrittsaustauschzeiten durchführen, die vorzugsweise mehrere Größenordnungen (Sekunden bis Tage) umspannen, um die Auswahl von Eintrittsaustauschzeiten zu ermöglichen, die eine effektive Markierung der verschiedenen Peptidamide, die im Protein vorliegen, zu ermöglichen, deren Austauschgeschwindigkeiten als Folge der Wechselwirkung des Proteins mit seinem Bindungspartner verlangsamt werden, und gleichzeitig die Background-Markierung anderer Amidpositionen zu minimieren, nachdem der Austrittsaustausch abgeschlossen ist (siehe Abschnitt 10 unten).
2. Bildung des Komplexes aus dem Rezeptor und dem Bindungspartner
Nach einer geeigneten Dauer des Tritium-Eintrittsaustauschs wird der Bindungspartner des Proteins der gepufferten Lösung des tritiierten Proteins zugesetzt, und man lässt die beiden einen Bindungskomplex bilden. Der Bindungspartner wird vorzugsweise in Mengen zugesetzt, die ausreichen, eine Sättigung der Bindung an das Protein zu erzeugen (üblicherweise äquimolare Mengen), und außerdem in hohen Konzentrationen (z. B. 10–100 mg/ml), um die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Bindung zu maximieren. Zur Minimierung einer Tritiummarkierung des zugesetzten Bindungspartners über einen Protonenaustausch (was wichtig ist, wenn kurze Zeiten des Eintrittsaustauschs eingesetzt werden), wird ³H₂O im Puffer vorzugsweise mit tritiumfreiem Puffer verdünnt (10- bis 1000-fache Verdünnung), und zwar innerhalb von 0–100 Sekunden nach der Zugabe des Bindungspartners. Es können weitere, weiter unten detailliert beschriebene Manipulationen bei diesem Schritt durchgeführt werden, um die Inkorporation einer Tritiummarkierung in den Bindungspartner zu minimieren.
3. Austrittsaustausch
Der Komplex aus dem tritiierten Protein und dem Bindungspartner wird dann in physiologische Puffer übertragen, die mit denjenigen identisch sind, die während des Eintrittsaustauschs eingesetzt wurden, die aber im wesentlichen frei von Tritium sind. Die Tritiummarkierung auf dem Protein durchläuft dann einen Austrittsaustausch aus dem Protein mit Geschwindigkeiten, die mit denjenigen des Eintrittsaustauschs identisch sind, außer an denjenigen Amiden, die aufgrund der Wechselwirkung des Proteins mit dem Bindungspartner hinsichtlich ihrer Austauschgeschwindigkeit verlangsamt wurden. Bei einer ausreichenden Zeit des Austrittsaustauschs führt das zu einer spezifischen Zurückhaltung einer Tritiummarkierung an jeder der Peptidamidbindungen, die zwischen den Aminosäuren vorliegen, die die Oberfläche der Bindungsstelle des Proteins für den Bindungspartner ausmachen. Wir beziehen uns auf diesen Prozess als eine komplexbildungsabhängige funktionelle Markierung des Proteins mit Tritium. Wenigstens 90%, bevorzugter wenigstens 99%, der an anderen Stellen über den Eintrittsaustausch aufgenommenen Tritiummarkierung verlassen das Protein über einen Austrittsaustausch.
Im allgemeinen lässt man den Austrittsaustausch über den 5- bis 50-fachen Zeitraum, vorzugsweise den ungefähr 10-fachen Zeitraum, des Zeitraums des Eintrittsaustauschs ablaufen, da dieses einen Austrittsaustausch aus dem Protein von über 99% der durch den Eintrittsaustausch aufgenommen Tritiummarkierung, die nach der Wechselwirkung des Proteins mit seinem Bindungspartner keine Verlangsamung der Austrittsgeschwindigkeit erfahren hat, ermöglicht. Es können mit dem Protein und seinem Bindungspartner vorläufige Studien durchgeführt werden, um die Eintritts- und Austrittsaustauschzeiten zu bestimmen, die das Verhältnis des Signals (Tritium, das in funktionell markierten Amiden zurück bleibt) zum Rauschen (Tritium, das in Background-Amiden zurück bleibt) optimieren (siehe Abschnitt 8).
Bei bevorzugten Ausführungsformen kann die Prozedur des Austrittsaustauschs über die Verwendung von Sephadex-G-25-Spin-Säulen durchgeführt werden, die hergestellt und eingesetzt werden, wie es im Beispiel 1 (unten) beschrieben wird, über eine G25-Säulenchromatographie, wie es von Englander (6, 19) beschrieben wurde, oder über die Verwendung perfusiver HPLC-Träger, die eine schnelle Abtrennung des Peptids/Proteins vom Lösemittel ermöglichen (Poros-Säulen, PerSeptive Biosystems, Boston, Massachusetts). Die Verwendung der G25-Spinsäulen ermöglicht die Abtrennung des Komplexes von mehr als 99,9% des Tritiums im Puffer. Restliches Tritium im Puffer und Tritium, das aus einem Austrittsaustausch des Komplexes stammt, kann gegebenenfalls weiter über eine Dialyse des Komplexes gegen tritiumfreiem Puffer während des Austrittsaustauschs entfernt werden.
Alternativ können die Komplexbildung und der Austrittsaustausch dadurch erreicht werden, dass zunächst die Mischung aus dem über den Eintrittsaustausch markierten Protein und dem Puffer mit dem Bindungspartner umgesetzt wird, der kovalent an einem festen Träger befestigt wurde (z. B. Bindungspartner-Sepharose), was es dem über den Eintrittsaustausch markierten Protein ermöglicht, einen Komplex mit dem als feste Phase vorliegenden Bindungs partner zu bilden, woran sich ein Waschen des Konjugates aus der Sepharose und dem Bindungspartner-Protein mit tritiumfreiem Puffer anschließt. Alternativ können lösliche Komplexe aus dem Protein und dem Bindungspartner wie oben gebildet und dann mit einem Adsorbens aus einer festen Phase abgefangen werden, das entweder an die Protein- oder die Bindungspartnerkomponente des Komplexes binden kann (z. B. Sepharose mit kovalent befestigten Antikörpern, die für das Protein oder den Bindungspartner spezifisch sind).
Die meisten Bindungswechselwirkungen zwischen dem Protein und dem Liganden, die mittels dieser Technik nachgewiesen werden können, sind reversible Reaktionen: Der Bindungspartner dissoziiert während der Periode des Austrittsaustauschs vom Protein und bindet erneut an dieses, und in den kurzen Intervallen, in denen die Bindungsstelle des Proteins nicht vom Bindungspartner besetzt ist, kommt es an der ungeschützten Stelle zu einem Austrittsaustausch von Protonen. Es ist deshalb wichtig, die Zeit zu minimieren, für die die Bindungsstelle nicht besetzt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das dadurch erreicht, dass sowohl der Rezeptor als auch der Bindungspartner in hohen Konzentrationen vorliegen, z. B. in Konzentrationen von wenigstens mg/ml und bis zu 100 mg/ml für jeden, und zwar während des gesamten Zeitraums des Austrittsaustauschs, und dadurch, dass die Eintritts- und Austrittsaustauschreaktionen bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise bei 4°C, durchgeführt werden.
4. Verkürzung des Bindeproteins (optional)
Vor der Dissoziation des Komplexes, z. B. während des Zeitraums des Austrittsaustauschs, der typischerweise Stunden bis Tage dauert, kann der Komplex gegebenenfalls chemisch oder enzymatisch behandelt werden, um das kleinste Fragment des Proteins zu erzeugen, das noch imstande ist, eng am Bindungspartner gebunden zu bleiben, und dieser restliche verkürzte Komplex kann isoliert werden. Die Entfernung der Teile des Proteins, die für die anhaltende Komplexbildung nicht essentiell sind, verringert die Zahl der Background-Peptide, die während der sich anschließenden sauren Proteolyse des verkürzten Komplexes erzeugt werden (Abschnitt 6). Dieser Vorverdau und diese Reinigung können mit vielen verschiedenen Proteasen (z. B. Trypsin, Pronase, V-8-Protease, Chymotrypsin, Proteinase K) sowie mit bestimmten Chemikalien (z. B. Cyanogenbromid, Iodosobenzoesäure) durchgeführt werden, und außerdem unter praktisch beliebigen Bedingungen einer induzierten partiellen Proteindenaturierung (z. B. Harnstoff, Guanidiniumchlorid, Natriumdodecylsulfat, nichtionische Detergenzien, Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol), der Ionenstärke, der Temperatur, der Zeit und des pH, die die miteinander in Kontakt stehenden Oberflächen des Komplexes aus dem Protein und dem Bindungspartner im wesentlichen nicht dissoziieren. Ein exzessiver Verdau, der zur Dissoziation dieser Oberflächen führt, bewirkt, dass ein großer Teil der funktionellen Tritiummarkierung sofort einen Austrittsaustausch durchläuft, da mehr als 50% der Peptidamide in den dissoziierenden Oberflächen bei einem pH von ungefähr 7 Halbwertszeiten des Austauschs von weniger als einer Minute haben. Das Ziel besteht darin, ein Fragment des Proteins, vorzugsweise von 15–100 Kilodalton Größe, bevorzugter von 15 Kilodalton, zu erzeugen und zu isolieren, das am Bindungspartner befestigt bleibt. Oft erlaubt eine „Ligandenstabilisierung" von Proteinen, die einem proteolytischen Verdau unterzogen werden, während sie an einen Bindungspartner gebunden sind, die anhaltende Bindung der Proteinfragmente an den Partner.
Es können mit dem Komplex, der den Austrittsaustausch durchlaufen hat, vorläufige Studien durchgeführt werden, um Bedingungen zu bestimmen, die zu einem auf geeignete Weise verkürzten Komplex aus Protein und Bindungspartner führen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird zuerst die Menge des verbleibenden Tritiums, die funktionell an den intakten Komplex, der den Austrittsaustausch durchlaufen hat, gebunden ist, über die Messung des Tritiums bestimmt, das mit dem Totvolumen (Mr >10 000 Kilodalton) auf einer G25-Spin-Säule (pH 7,4) wandert. Aliquots des Komplexes werden dann unterschiedlichen Fragmentierungsbedingungen unterworfen, und der Anteil der Tritiummarkierung, der bei jeder Verdauungsbedingung an den Polypeptiden befestigt bleibt (mit dem G25-Totvolumen wandert), wird bestimmt. Die Proteolyseprodukte der intensivsten Verdaus, die weniger als 5% des mit dem Komplex assoziierten Tritiums „freisetzen", werden (wie im Abschnitt 5) auf einen pH von 2,7 und 0°C eingestellt, bei pH 2,7 und 0°C einer RP-HPLC unterzogen, und Peptide/Proteinfragmente, die eine Markierung tragen, werden identifiziert und isoliert, und ihre Molekulargewichte werden mittels SDS-PAGE bestimmt. Die in diesen beschränkten Verdaus erzeugten markierten Proteolyseprodukte sind wahrscheinlich große Polypeptide, und deshalb werden RP-HPLC-Träger, die für die Reinigung derartiger Peptide geeignet sind (C-4, Phenyl-Säulen) eingesetzt. Alternativ lässt man, wenn Festphaseadsorbenzien für die Komplexbildung/den Austrittsaustausch (Schritt 3) eingesetzt werden, die Proteolyse wie oben, und zwar jetzt des Festphase-Komplexes aus dem Bindungspartner und dem Protein; so intensiv wie möglich ablaufen, ohne dass dabei mehr als 5% des funktionell befestigten Tritiums vom festen Träger freigesetzt werden. Das vorverdaute Protein oder der vorverdaute Komplex wird dann mit Denaturierungsmitteln, wobei eine pH-Verschiebung auf 2,7 eingeschlossen ist, vom Immunoadsorbens freigesetzt, und das vorverdaute Protein wird weiter mit Pepsin oder anderen, im Sauren aktiven Proteasen proteolytisch gespalten.
Ein Bindeprotein kann auch früher verkürzt werden, z. B. vor dem Eintrittsaustausch oder vor der Komplexbildung, vorausgesetzt, dass das verkürzte Protein den Partner in ausreichendem Umfang und ähnlich dem ursprünglichen interessierenden Protein bindet.
5. Wechsel zu Bedingungen eines langsamen Amidwasserstoffaustauschs
Der Komplex aus dem Protein und dem Bindungspartner (oder der vorverdaute Komplex – siehe Schritt 4) wird dann in Bedingungen bezüglich der Temperatur und des pH überführt, die die Halbwertszeit des Peptidamidwasserstoffaustauschs stark verlangsamen und die Tritiummarkierung, die in der Bindungsstelle des Proteins zurückgehalten ist, praktisch an Ort und Stelle „einfrieren". Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex zu Bedingungen von 0°C und pH 2,7 verschoben, bei denen die Halbwertszeit des Austauschs der Peptidamidmarkierung in vollständig denaturierten Peptiden wenigstens 70 Minuten beträgt. Die Markierung wird unter diesen Bedingungen in ausreichendem Maße festgehalten, so dass mehrere Runden aus einer proteolytischen Fragmentierung, einer HPLC-Auftrennung und einer Tritiumquantifizierung durchgeführt werden können, ohne dass es zu einem nicht-annehmbaren Verlust der Markierung kommt.
Bei einigen Bindeproteinen reicht die Umschaltung auf Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs aus, um eine Dissoziation des Komplexes zu bewirken. Wenn das nicht der Fall ist, kann ein dissoziierendes Mittel, beispielsweise ein chaotropes Mittel, zugesetzt werden.
5A. Spaltung von Proteindisulfidbindungen unter sauren Bedingungen (optional):
Die hochauflösende Lokalisierung von Amiden, die eine Tritiummarkierung tragen, erfordert die proteolytische Erzeugung von Peptiden von weniger als ungefähr 15–20 Aminosäuren Größe, und zwar unter Bedingungen, die es erlauben, dass die Markierung an rt und Stelle verbleibt (z. B. 0°C, pH 2,7). Die Fähigkeit einer beliebigen Protease zur Fragmentierung eines Proteins oder Peptids wird durch die Zugänglichkeit entsprechender Peptidbindungen für die Protease begrenzt. Zwar können Denaturierungsmittel, wie ein saurer pH, Harnstoff, Detergenzien und organische Co-Lösemittel, Proteine partiell denaturieren und viele ansonsten strukturell abgeschirmten Peptidbindungen exponieren, aber bereits bestehende Disulfidbindungen innerhalb eines Proteins können eine ausreichende Denaturierung mit diesen Mitteln allein verhindern. In herkömmlichen Untersuchungen zur Struktur von Proteinen werden Disulfide üblicherweise über eine Reduktion mit 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol und anderen Reduktionsmittel gespalten, die für eine ausreichende Aktivität unglücklicherweise einen pH von über 6 sowie erhöhte Temperaturen erfordern und die deshalb nicht für die Reduktion von Disulfiden bei pH 2,7 oder darunter nützlich sind. Aus diesem Grund wurde auf dem Gebiet des Tritiumaustauschs nie versucht, die Disulfidbindungen zu spalten, hat man sich größtenteils auf die Untersuchung von Proteinen ohne intrinsische Disulfidbindungen beschränkt und hat man die niedrige Auflösung akzeptiert, die ohne eine Spaltung von Disulfidbindungen erreichbar ist. Die Anmelden haben erkannt und gezeigt, dass im Sauren reaktive Phosphine wie Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) (31–36) dazu verwendet werden können, Disulfide unter den Limitierungen durch einen sauren pH und eine niedrigen Temperatur, die für die Analyse des Tritiumaustauschs erforderlich sind, zu spalten (siehe 7). Wir haben nachgewiesen, dass diese Manipulationen diese Assoziationen auflösen und gleichzeitig eine deutlich verlangsamte Geschwindigkeit des Protonenaustauschs für Peptidamidprotonen bewirken.
5B. Proteindenaturierung (optional)
In früheren Studien von Englander et al. sowie anderen, die einen Tritiumaustausch mittlerer Auflösung einsetzten, wurde die proteolytische Fragmentierung Tritium-markierter Proteine unter den Bedingungen eines verlangsamten Austauschs durch eine Verschiebung des pHs des Proteins auf 2,7 und die Zugabe hoher Konzentrationen von Pepsin in flüssiger Phase, gefolgt von einer kurzen (10-minütigen) Inkubation bei 0°C, erreicht. Bei den von Englander et al. untersuchten Proteinen war es ausreichend, einfach den pH von physiologischen Bedingungen (7,0) auf 2,7 zu verschieben, um sie in ausreichendem Maße so zu denaturieren, dass sie für eine Pepsinspaltung bei 0°C geeignet wurden. Weiterhin enthielten diese Proteine im allgemeinen keine Disulfidbindungen, die die wirkungsvolle Denaturierung bei derartigen (sauren) pH-Bedingungen störten, oder sie enthielten keine Disulfidbindungen in Teilen des Proteins, die mittels dieser Technik untersucht wurden. Der Anmelden hat gefunden, dass andere Proteine (z. B. das Lysozym aus dem Hühnerei), wenn sie fortgesetzt bei einem ähnlichen sauren pH und erniedrigter Temperatur (10–0°C) inkubiert werden, nicht nennenswert denaturiert werden und im wesentlichen nicht für eine Proteolyse durch Pepsin zugänglich werden. Das ist die Konsequenz des Vorliegens einer thermischen Barriere gegenüber einer Denaturierung bei vielen Proteinen, die in vielen Denaturierungsmitteln inkubiert werden; d. h. die Denaturierung von Proteinen bei niedrigen Temperaturen (10–0°C) ist oft ein ineffizienter und langsamer Prozess, der mit den Anforderungen von Tritiumaustauschtechniken mittlerer Auflösung, dass die Manipulationen schnell durchgeführt werden können, nicht kompatibel ist, so dass die befestigte Tritiummarkierung an funktionell markierten Amiden des Bindeproteins im wesentlichen zurückgehalten wird.
Der Anmelder hat entdeckt, dass solche Proteine außerordentlich empfindlich gegenüber einer Pepsinproteolyse bei 0°C werden, wenn sie mittels der unten beschriebenen sequenziellen Denaturierungsprozedur behandelt werden. Außerdem hat der Anmelder entdeckt, dass TCEP zwar die Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen bei 0°C und pH-Werten im Bereich von 2 bis 3 bewirken kann, es aber unter diesen Bedingungen relativ ineffizient ist und bei einem pH von 5,0 oder darüber bezüglich der Bewirkung der Reduktion viel effizienter wird. Die Bedingungen können so eingestellt werden, dass die Wirksamkeit der TCEP-vermittelten Reduktion stark erhöht wird, während gleichzeitig die Bedingungen eines langsamen Austauschs erhalten bleiben. Das wird dadurch erreicht, dass das Protein mit Guanidinthiocyanat denaturiert wird und gleichzeitig sehr hohe TCEP-Konzentrationen einge setzt werden und der pH der Lösung auf 5,0 erhöht wird. Dieser pH würde zwar normalerweise eine nicht-annehmbare 100-fache Erhöhung (im Vergleich zu den Bedingungen bei pH 2,7) der Geschwindigkeit des Tritiumverlustes vom unmarkierten Protein bewirken, aber die durch den erhöhten pH-Wert induzierte Erhöhung der Geschwindigkeit des Tritiumverlustes wird im wesentlichen durch die Begrenzung des Wassergehaltes der Inkubationsmischung (und die dadurch bewirkte ausgeprägte Verlangsamung der Geschwindigkeit des Tritiumverlustes) ausgeglichen, wenn das Protein bei pH 5,0 reduziert wird und der pH der Lösung dann wieder auf 2,7 eingestellt wird, sobald die Reduktion vollständig ist. Das Ergebnis ist eine effektive Reduktion des Proteins bei einem pH von 5 und 0°C bei im wesentlichen vollständiger Zurückhaltung der Tritiummarkierung im Bindeprotein.
Die Lösung des denaturierten (oder denaturierten und reduzierten} Proteins wird dann über eine Pepsin-Agarose-Säule geleitet, was zu einer effizienten und schnellen Fragmentierung des Proteins (in ≤1 min) führt. Die Fragmente können, und werden üblicherweise auch, sofort mittels RP-HPLC analysiert, ohne dass es zu einer unnötigen Verunreinigung der Peptidmischung mit dem Enzym Pepsin oder Fragmenten des Enzyms Pepsin kommt. Eine derartige Kontamination ist für die Technik, wie sie von Englander et al. gelehrt wurde, problematisch, da hohe Pepsin-Konzentrationen (in ihrer Masse oft derjenigen des untersuchten Proteins ähnlich) eingesetzt werden, um eine ausreichend schnelle Proteolyse bei 0°C zu erzwingen.
Proteine werden zwar vor dem Verdau mit Pepsin oft einer entschlossenen Denaturierung mit anderen Mitteln als einer pH-Verschiebung unterworfen, aber das wurde bisher nie bei erniedrigten Temperaturen (10–0°C) gemacht, und der Anmelder hat entdeckt, dass Guanidinthiocyanat zwar in den angegebenen Konzentrationen ausreicht, sie auf geeignete Weise zu denaturieren und für eine Pepsinproteolyse bei 10–0°C zugänglich zu machen, aber verschiedene andere starke Denaturierungsmittel, einschließlich von Harnstoff, HCl, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Guanidin-HCl, waren, zumindest wenn sie allein eingesetzt werden, nicht imstande, Lysozym bei diesen niedrigen Temperaturen ausreichend zu denaturieren. Jedoch sind die Konzentrationen des Guanidinthiocyanats, die für eine derartige Denaturierung erforderlich sind, nicht mit einem Pepsinverdau kompatibel; d. h. sie denaturieren das Enzym Pepsin, ehe es auf das denaturierte Bindeprotein wirken kann. Wenn das Guanidinthiocyanat (bei 10–0°C) in einem Versuch, diese Hemmung der Pepsinaktivität zu überwinden, aus der Lösung entfernt wird, nachdem die Proteindenaturierung erzielt worden ist, dann faltet sich das Proteinschnell zurück und/oder aggregiert, was es wiederum refraktär gegenüber der proteolytischen Wirkung von Pepsin macht.
Der Anmelder hat entdeckt, dass, wenn Proteine zuerst in ≥2 M Guanidinthiocyanat bei 0°C denaturiert werden und die Konzentration des Thiocyanats dann auf ≤2 M vermindert wird, während gleichzeitig das Guanidin-Ion bei einer Konzentration von ≥2 M gehalten wird (indem das Guanidinthiocyanat mit Guanidinhydrochlorid verdünnt wird), das denaturierte Protein in Lösung bleibt, denaturiert bleibt und das Enzym Pepsin in dieser Lösung bei 0°C gegenüber dem denaturierten Protein wirkungsvoll proteolytisch aktiv ist. Die Stabilität von Pepsin-Agarose gegenüber diesem Verdaupuffer ist derart, dass keine nachweisbare Abnahme der Aktivität der vom Anmelder eingesetzten Pepsinsäule beobachtet wurde, nachdem sie innerhalb von eineinhalb Jahren für die Proteolyse von über 500 Proben eingesetzt worden war. Unter diesen Bedingungen kommt es zu keinem Selbstverdau des Pepsins.
Eine Denaturierung ohne eine gleichzeitige Reduktion des Bindeproteins kann erzielt werden, indem es (bei 0–5°C) mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die 2 M Guanidinthiocyanat mit einem pH von 2,7 enthält, gefolgt von der Zugabe eines gleichen Volumens von 4 M Guanidinhydrochlorid von pH 2,7.
Eine Denaturierung mit einer Disulfidreduktion kann erreicht werden, indem das Bindeprotein mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die 2 M Guanidinthiocyanat, 0,7 M TCEP und 5–20% H₂O (in Volumeneinheiten) enthält, wobei der Rest des Volumens aus Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder einem anderen wassermischbaren, nicht-wässrigen Lösemittel besteht, in der das Denaturierungsmittel (z. B. Guanidinthiocyanat) und das Disulfidbindungen spaltende Mittel (z. B. TCEP), wenn eines verwendet wird, bei diesen Konzentrationen im wesentlichen löslich bleiben, und unter Bedingungen, das das Lösemittelsystem bei der Temperatur des „langsamen Austauschs" nicht einfriert. Der pH der Lösung liegt vorzugsweise im Bereich von 4,8–5,2, optimalerweise bei 5,0. Nach dieser Inkubation werden 2 Volumina einer 2,5 M Lösung von Guanidinhydrochlorid zugegeben, wobei der pH und die Pufferkapazität der Lösung so gewählt werden, dass in der sich ergebenden Mischung ein pH von 2,7 erzielt wird.
Das (mit oder ohne Reduktion) denaturierte Bindeprotein wird dann über eine Säule geleitet, die unlösliches (festes) Pepsin enthält, wodurch dieses denaturierte oder denaturierte und reduzierte Bindeprotein beim Durchgang durch die Säule durch das Pepsin im wesentlichen vollständig zu Peptiden im Größenbereich von 1 – 20 Aminosäuren bei 0°C und pH 2,7 fragmentiert wird. Das Effluat aus dieser Säule (das proteolytisch erzeugte Fragmente des Bindeproteins enthält) wird direkt und sofort dem chromatographischen Verfahren zugeführt, das eingesetzt wird, um die Proteinfragmente zu trennen und zu isolieren, und zwar vorzugsweise einer analytischen Reverse-Phase-HPLC-Chromatographie.
Es sollte angemerkt werden, dass Denaturierungsmittel nicht nur das Bindeprotein empfindlicher gegenüber einer Proteolyse machen, sondern auch dazu beitragen, es von seinem Partner zu dissoziieren.
6. Erzeugung Tritium-markierter Peptidfragmente
Um letztlich die Proteinamide zu lokalisieren, die funktionell mit Tritium markiert sind, müssen kleine Peptide (von vorzugsweise 5–25 Aminosäuren Länge), die die zurückgehaltene Tritiummarkierung tragen, proteolytisch aus dem markierten Protein erzeugt und von den vielen anderen nicht-markierten Peptiden abgetrennt werden, die durch die Fragmentierung des Proteins erzeugt werden, und zwar alles unter Bedingungen, die einen Austrittsaustausch eines Amidtritiums aus dem Peptid minimieren. Kleine Peptide weisen nur eine geringfügige Sekundärstruktur auf, und deshalb stehen ihre Amide frei für einen Austausch mit Lösemittelwasserstoff zur Verfügung. Wenn eine Tritiummarkierung bei solchen Peptiden an Ort und Stelle bleiben soll, müssen die Proteolyse und die Reinigung (z. B. RP-HPLC) so eingestellt werden, dass ein derartiger Austrittsaustausch verlangsamt wird.
Das markierte und dissoziierte Bindeprotein wird deshalb unter Bedingungen eines langsamen H-Austauschs fragmentiert, z. B. durch eine Proteolyse mit hohen Konzentrationen einer Protease, die unter den genannten Bedingungen (z. B. pH 2,7, 0°C) stabil und aktiv ist. Zu geeigneten säuretoleranten Proteasen gehören Pepsin (19), Cathepsin D (37), Aspergillus-Proteasen (37a–37c), Thermolysin (38) und Mischungen dieser Proteasen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Pepsin verwendet, vorzugsweise in einer Konzentration von 10 mg Pepsin/ml bei 0°C und pH 2,7, und zwar für 5–30 Minuten, vorzugsweise 10 Minuten.
Es können andere physikalische und chemische Fragmentierungsverfahren eingesetzt werden, vorausgesetzt (1) sie sind kompatibel mit den Bedingungen des langsamen H-Austauschs, (2) sie verursachen keine Verschiebungen der Positionen der Amidmarkierungen und (3) sie erzeugen aus dem interessierenden Protein eine vernünftige Zahl von Fragmenten.
Vorzugsweise wird vor der Fragmentierung des Bindeproteins der Bindungspartner entfernt (wenn er empfindlich gegenüber dem Fragmentierungsmittel ist), so dass er die Reinigung nicht durch Fragmente des Bindungspartners kompliziert.
6A. Reinigung von Fragmenten
Da saure Proteasen im allgemeinen eine sehr breite Spaltungsspezifität aufweisen, fragmentieren sie das Protein in eine sehr große Zahl unterschiedlicher Peptide. In den meisten mittels Tritiumaustausch untersuchten Systemen aus einem Protein und seinem Bindungspartner ist es wahrscheinlich, dass die in Wechselwirkung tretenden Bindungsoberflächen ungefähr 10–20 Tritium-markierte Peptidamide enthalten, die nach einer Proteolyse zu ungefähr 1–5 eine Markierung tragenden Peptiden führen, wobei die genaue Zahl vom inhärenten Fragmentierungsmodus des untersuchten Proteins mit den verwendeten Proteasen abhängt. Die Zahl der nicht-markierten „Background"-Peptide (die aus Bereichen des Proteins und des Bindungspartners stammen, die nicht an der Bindungswechselwirkung teilnehmen), die durch den Fragmentierungsvorgang erzeugt werden, ist eine direkte Funktion der Größe des Proteins. Background-Peptide sind im proteolytischen Verdau 10- bis 1000-mal häufiger, als es funktionell markierte Peptide sind, wenn Proteine mit Größen im Bereich von 30–200 Kilodalton proteolytisch gespalten werden.
Die große Zahl von Background-Peptiden verursacht zwei Schwierigkeiten: Erstens müssen sie alle sauber von den funktionell markierten Peptiden abgetrennt werden, um eine Identifizierung der Peptide, die die Markierung tragen, zu ermöglichen. Zweitens enthalten die Background-Peptide geringe Mengen einer Tritiummarkierung, und auch wenn die Menge der Markierung pro Background-Peptid im allgemeinen bei unter 1% von derjenigen der funktionell markierten Peptide liegt, so sind die Background-Peptide doch in viel größeren Mengen vorhanden, und es ist wahrscheinlich, dass sie das Vorliegen funktionell markierter Peptide und die analytische Trennung überdecken.
Vor diesem Hintergrund sind in der Vergangenheit nur Proteine mit einer Größe von unter 30 Kilodalton erfolgreich über einen Tritiumaustausch mittlerer Auflösung charakterisiert worden. Bei der sauren Proteolyse größerer Proteine würden so viele verschiedene Fragmente erhalten werden, dass die einzelnen Fraktionen, die bei einer einzigen HPLC-Trennung, die bei pH 2,7 durchgeführt würde, auf unannehmbare Weise durch die Background-Peptide verunreinigt wären.
Es ist jedes beliebige Verfahren zur Reinigung der Fragmente annehmbar, das imstande ist, die Mischung aufzutrennen und gleichzeitig die Bedingungen eines langsamen H-Austauschs aufrecht zu erhalten. Das bevorzugte Verfahren ist eine Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), insbesondere in der Reverse-Phase-Form (RP). (Ein alternatives Verfahren ist die Massenspektroskopie.) In diesem Fachgebiet hat man die Empfindlichkeit der Tritiummarkierung gegenüber dem pH übertrieben dargestellt. Englander (10) berichtete, dass bei 0°C die Tritiummarkierung (wenn das tritiierte Protein in einen wässrigen nicht-tritiierten Puffer gegeben wurde) bei pH 2,7 am stabilsten war, und dass die Geschwindigkeit des Austrittsaustauschs sich schnell erhöhte (10-fach pro pH-Einheit), wenn man sich von diesem pH entfernte. Überraschenderweise fand der Anmelden, dass bei 0°C die Markierung ausreichend stabil war, um eine Analyse sogar bei einem pH von 2,1 zu ermöglichen. Zwar hängt der annehmbare pH-Bereich von der Temperatur sowie von der Auswahl des Lösemittels ab (der optimale pH steigt an, wenn ein polares, nichtwässriges Lösemittel verwendet wird), aber die Tatsache bleibt bestehen, dass man früher davon ausging, dass der pH im wesentlichen unveränderlich war. Da die Tritiummarkierung über einen breiteren pH-Bereich stabil ist, z. B. von 2,1–3,5, ist es möglich, von dem von Englander empfohlenen pH von 2,7 bei der Suche nach HPLC-Bedingungen, die zu einer effektiven Auftrennung der Peptidfragmente führen, abzuweichen.
Wenn die bindenden Moleküle groß sind, werden nach dem proteolytischen Verdau so viele verschiedene Fragmente erhalten, dass einige der einzelnen Peaks bei einer einzigen HPLC-Trennung sogar bei optimiertem pH heterogen sein können.
Die RP-HPLC-Auflösung zusammen wandernder multipler Peptide kann stark verbessert werden, wenn man zu einer zweidimensionalen RP-HPLC-Trennung übergeht, bei der zwei sequenzielle RP-HPLC-Trennungen bei deutlich. unterschiedlichen pH-Werten, z. B. 2,7 und 2,1, durchgeführt werden.
Eine zweidimensionale HPLC-Trennung ermöglicht eine hocheffiziente Abtrennung von Peptiden, die eine Tritiummarkierung tragen, von der riesigen Zahl der unmarkierten Peptide, die bei der peptischen Fragmentierung großer Proteine erzeugt werden. Die zweidimensionale Auftrennung von Molekülen ist auf dem Gebiet der Chromatographie gut bekannt. Jedoch sind trotz der häufigen Klagen in der Literatur zum Tritiumaustausch über Auflösungsprobleme bisher keine 2D-Trennungen im Zusammenhang mit dem Tritiumaustausch eingesetzt worden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Tritium-markierte Proteinfragmente zuerst über ein Verfahren, das zur ausreichenden Auftrennung der Fragmente imstande ist, aufgetrennt, beispielsweise durch RP-HPLC (unter Einsatz eines beliebigen aus einer Vielzahl potenzieller chromatographischer Träger, einschließlich von C4, C18, Phenol und Ionenaustauscher, vorzugsweise C18). Diese Trennung kann bei pH 2,1–3,5 und bei 4–0°C, bevorzugter bei pH 2,7 und 0°C, durchgeführt werden, was durch die Verwendung eines beliebigen Puffersystems erreicht werden kann, das bei diesem pH einsetzbar ist, einschließlich von Citrat, Chlorid und Acetat, bevorzugter von Phosphat. Die Peptide werden aus der Reverse-Phase-Säule mit einem ähnlich gepufferten Gradienten aus polaren Co-Lösemitten eluiert, zu denen Methanol, Dioxan, Propanol und, bevorzugter, Acetonitril gehören. Die eluierfen Peptide werden online spektroskopisch über ihre Ultraviolettabsorption nachgewiesen, und zwar bei Wellenlängen zwischen 200 und 300 nM, vorzugsweise bei 214 nM. Die Tritiummarkierung wird über die Szintillationszählung einer Probe der Fraktionen des Effluats der HPLC-Säule nachgewiesen. Peptide, die eine Markierung tragen, die spezifisch durch eine Komplexbildung mit dem Bindungspartner vor einem Austrittsaustausch geschützt wurde, werden über den Vergleich der spezifischen Aktivität eines jeden markierten Peptids mit der spezifischen Aktivität des gleichen Peptids verglichen, das aus einem Protein präpariert wurde, das identischen Eintritts- und Austrittsaustauschvorgängen sowie identischen Bedingungen bezüglich der Proteolyse und der HPLC unterzogen wurde, das aber dem Austrittsaustausch ohne den zugesetzten Bindungspartner unterzogen wurde.
HPLC-Fraktionen, die Peptide mit derartigen funktionell markierten Amiden enthalten, werden dann in der zweiten Dimension einer RP-HPLC-Trennung unterzogen, die bei einem pH von 2,1–3,5 und bei 4–0°C durchgeführt werden kann, bevorzugter bei pH 2,1 und 0°C, unter Verwendung beliebiger Puffersysteme, die bei diesem pH einsetzbar sind, einschließlich von Citrat, Chlorid, Acetat, Phosphat und, bevorzugter, TFA (0,1–0,115%). Die Peptide werden aus ihrer Reverse-Phase-Säule mit einem ähnlich gepufferten Gradienten aus polaren Co-Lösemitteln eluiert, zu denen Methanol, Dioxan, Propanol und, bevorzugter, Acetonitril gehören. Wie für die erste HPLC-Dimension oben beschrieben, werden die eluierten Peptide nachgewiesen, das Tritium gemessen und funktionell markierte Peptide identifiziert. Die funktionell markierten Peptide werden isoliert (Sammlung der entsprechenden Fraktion des Säuleneffluats), Wasser, Acetonitril und TFA werden durch Abdampfen entfernt, und die zurück bleibenden gereinigten Peptide werden jeweils bezüglich ihrer primären Aminosäurestruktur mittels herkömmlicher Techniken, z. B. über eine Aminosäureanalyse des vollständigen Säurehydrolysats oder über eine Mikrosequenzierung mittels eines Edman-Abbaus in der Gasphase charakterisiert. Man bezieht sich dann auf die vorher bekannte Aminosäuresequenz des intakten Proteins, um die Lokalisation der Tritium-markierten Peptide innerhalb der Primärsequenz des intakten Proteins abzuleiten. Der Einsatz von TFA-Puffer in der zweiten Dimension hat den zusätzlichen Vorteil, dass kein restliches Salz (d. h. Phosphat) nach der Abdampfung des Lösemittels zurück bleibt. Restliches Phosphat stört häufig die chemischen Reaktionen, die für die Aminosäureanalyse und den Edman-Abbau erforderlich sind, ein Problem, das durch die Verwendung der flüchtigen TFA im Puffer der zweiten Dimension umgangen wird.
Am bevorzugtesten werden die porteolytischen Verdaus zuerst bei pH 2,7 in Phosphatgepufferten Lösemitten aufgetrennt und jede eluierte Fraktion eines Peptid-Peaks, die Tritiummarkierte Amide enthält, wird identifiziert, gesammelt und dann einer zweiten HPLC-Auftrennung unterzogen, die in Trifluoressigsäure gepufferten Lösemitteln bei pH 2,1 durchgeführt wird.
7. Hochauflösende Unterlokalisation markierter Amide innerhalb von markierungstragenden Peptiden
Zur routinemäßigen Lokalisierung von Peptidamid-Tritiummarkierungen auf der Ebene einzelner Aminosäuren spaltet der Anmelden systematisch jede Peptidbindung innerhalb eines gereinigten markierungstragenden Peptids. Für die Proteolyse müssen Bedingungen eines langsamen H-Austauschs eingesetzt werden, da die erzeugten kleinen Peptide keine stabile Konformation besitzen und es zu einem schnellen Verlust der Tritiummarkierung aus den Amiden kommen würde, wenn die Austauschgeschwindigkeiten nicht verlangsamt würden, z. B. durch einen sauren pH der Umgebung.
Die meisten bekannten, im Sauren aktiven Proteasen spalten Peptide auf eine im wesentlichen unspezifische Weise, die derjenigen von Pepsin ähnlich ist; Untersuchungen, die andere pepsinartige Proteasen eingesetzt haben, haben nicht bewiesen, dass sie für die Erhöhung der Auflösung der markierten Amide nützlich sind.
Eine spezielle Klasse von im Sauren aktiven Proteasen, der Carboxypeptidasen, ist imstande, alle benötigten Unterfragmente von Pepsin-erzeugten Peptiden in Mengen zu erzeugen, die für eine hochauflösenden Lokalisation des Tritiums ausreichend sind. Viele Carboxypeptidasen sind bei einem pH von 2,7 aktiv und spalten Aminosäuren sequenziell vom Carboxyterminus der Peptide ab. Zu solchen Enzymen gehören die Carboxypeptidasen P, Y, W und C (39). Zwar sind Carboxypeptidasen für die begrenzte carboxyterminale Sequenzierung von Peptiden eingesetzt worden, oft bei einem pH im Bereich von 2,7 (40), aber ihr Einsatz in Techniken des Tritiumaustauschs ist nicht offenbart worden. Die Notwendigkeit einer Minimierung von Tritiumverlusten verbietet den Einsatz von Carboxypeptidasen, die in sauren Puffern (pH 2,7) inaktiv sind, beispielsweise der Carboxypeptidasen A und B. Die Carboxypeptidasen P und Y sowie verschiedene andere, im Sauren aktiven Carboxypeptidasen (W, C) sind jedoch für eine Proteolyse von Peptiden unter sauren Bedingungen geeignet (39). Auf dem Gebiet des Tritiumaustauschs hat man die Nützlichkeit von Carboxypeptidasen für Untersuchungen zum Tritiumaustausch nicht erkannt, möglicherweise weil die Carboxypeptidasen bezüglich der Typen der Peptidbindungen, die sie spalten, sogar noch unspezifischer als pepsinartige Proteasen sind, und deshalb hat man vielleicht angenommen, dass sie zu einer ungenügenden Ausbeute eines beliebigen einzelnen Unterfragments führen.
Ferner können chemische Verfahren unter Einsatz von Pentafluorpropionsäureanhydrid Sets von C-terminal verkürzten Peptidfragmenten unter Bedingungen eines verlangsamten Amidaustauschs erzeugen (siehe unten, 41, 42).
Bei der bevorzugten Ausführungsform werden Proteine, die über einen Tritiumaustausch markiert wurden, unspezifisch mit Pepsin oder pepsinartigen Proteasen fragmentiert, die resultierenden Tritium-markierten Peptide werden mittels zweidimensionaler HPLC isoliert und diese wiederum erschöpfend über einen gesteuerten schrittweisen Verdau mit sauren (d. h. unter sauren Bedingungen enzymatisch aktiven) Exopeptidasen und/oder mittels chemischer Verfahren (siehe unten) erschöpfend unterfragmentiert. Diese Verdaus werden dann mittels RP-HPLC bei 0°C in TFA-haltigen Puffern (pH 2,1) analysiert, und ein jedes der erzeugten Unterfragmente (typischerweise 5–20) wird dann identifiziert. Die Identität eines jeden der verschiedenen Unterfragmente kann mittels einer beliebigen geeigneten Aminosäure-Analyse oder Peptidsequenzierung oder die Verwendung synthetischer Markerpeptide für die HPLC-Mobilität bestimmt werden, und die Menge der Tritiummarkierung, die an einem jeden verkürzten Unterfragment-Peptid befestigt ist, wird durch Szintillationsmessung bestimmt. Auf diese Weise wird die genaue Lokalisation eines jeden Peptidamids, das aufgrund seiner Wechselwirkung mit dem Bindungspartner funktionell mit Tritium markiert ist, bestimmt. Über die Berücksichtigung des Tritiumgehaltes eines jeden der identifizierten Unterfragmente können die Amidwasserstoffe, die während des Schrittes des Eintrittsaustauschs durch Tritium ersetzt worden waren, abgeleitet werden. Es sollte festgehalten werden, dass der Zweck der Behandlung mit der Carboxypeptidase in der Erzeugung der Unterfragmente liegt; das Verfahren erfordert nicht den Einsatz der Carboxypeptidase zur Sequenzierunq der Fragmente oder Unterfragmente. Vorzugsweise ist die Sequenz des Bindeproteins, oder wenigstens des größten Teils von diesem, vor dem Einsatz des vorliegenden Verfahrens bekannt. Sie kann jedoch zu jeder beliebigen Zeit bestimmt werden, sogar nach der Unterfragmentierung, auch wenn die aus den Unterfragmentierungen erhaltenen Daten nicht richtig interpretiert werden können, solange nicht die Sequenzen wenigstens der Quelle bekannt ist.
Ein gesteuerter, sequenzieller, carboxyterminaler Verdau von Tritium-markierten Peptiden mit Carboxypeptidasen kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die zur Erzeugung analytisch ausreichender Mengen eines Sets von carboxyterminal verkürzten Tochterpeptiden führen, von denen jedes um eine einzige carboxyterminale Aminosäure kürzer als das vorhergehende ist. Da jede carboxyterminale Aminosäure des funktionell markierten Peptids sequenziell durch die Carboxypeptidase abgespalten wird, wird der Stickstoff, der das langsam austauschende Peptidamid in der intakten Peptidbindung bildete, in ein schnell austauschendes sekundäres Amin umgewandelt, und jede Tritiummarkierung an diesem Stickstoff geht innerhalb von Sekunden vom Peptid verloren, sogar bei saurem pH. Ein Unterschied der molaren Mengen der Tritiummarkierung, die mit einem von zwei aufeinanderfolgenden Subpeptiden assoziiert ist, impliziert, dass die Markierung an dem Amid der Peptidbindung lokalisiert ist, um die sich die beiden Unterpeptide unterscheiden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden synthetische Peptide (mittels Standardverfahren der Peptidsynthese) erzeugt, die bezüglich ihrer primären Aminosäuresequenz mit einem jeden der funktionell markierten, durch Pepsin erzeugten Peptide identisch sind, die im Schritt 6 identifiziert wurden. Die synthetischen Peptide können dann in vorläufigen Studien zum Carboxypeptidase-Verdau (pH 2,7, 0°C) und in NPLC-Studien (in TFA-gepufferten Lösemitteln) eingesetzt werden, um zu bestimmen 1) die optimalen Bedingungen bezüglich der Verdauzeit und der Protease-Konzentration, die zur Erzeugung und Identifizierung aller möglichen Carboxypeptidase-Produkte des untersuchten Peptids führen; und 2) der Position eines jeden durch die Carboxypeptidase erzeugten Unterfragments des synthetischen Peptids bei der NPLC-Elution (Mobilität).
Zur Erleichterung dieses letzteren Verfahrens kann ein Set von Referenzpeptiden erzeugt werden, das aus allen möglichen carboxyterminal verkürzten Tochterpeptiden besteht, die eine saure Carboxypeptidase beim Verdau eines Ausgangspeptids erzeugen könnte. Diese dienen als Standards bezüglich der HPLC-Mobilität und ermöglichen die Ableitung der Identität der Tochterpeptide, die tatsächlich beim Carboxypeptidase-Verdau erzeugt werden. Bestimmte Tochterpeptide können möglicherweise enzymatisch in Mengen erzeugt werden, die für eine direkte Aminosäureanalyse oder eine Sequenzierung nicht ausreichend sind, aber ihre HPLC-Mobilitäten können gemessen und mit denjenigen der synthetischen Peptide verglichen werden. Die Peptide können mittels Standard-Inline-Spektralphotometern (typischerweise UV-Absorption bei 200–214 nM) in Mengen nachgewiesen und quantifiziert werden, die deutlich unterhalb der Mengen liegen, die für eine Aminosäureanalyse oder eine Edman-Gasphasen-Sequenzierung benötigt werden.
Nach diesen vorläufigen Untersuchungen wird das mittels Pepsin erzeugte, durch HPLC isolierte, funktionell markierte (im Schritt 6 hergestellte) Peptid dann mit Carboxypeptidase verdaut und unter den oben genannten, experimentell optimierten Bedingungen analysiert, die Identität eines jeden Fragments wird bestimmt (durch Peptidsequenzierung oder durch die Bezugnahme auf die Mobilität des Referenzpeptid-Mobilitätsmarkers), und es wird die Menge des Tritiums bestimmt, die mit einem jeden Peptid-Unterfragment assoziiert ist.
Alternativ kann eine chemische Technik für den sukzessiven carboxyterminalen Abbau der Peptide unter Bedingungen eines verlangsamten Tritiumaustauschs eingesetzt werden. Die Tritium-markierten Peptide in HPLC-Puffer werden bei –35°C gehalten, und die Lösemittel werden über eine Kryosublimation entfernt (40a, 40b; Vakuum von 1 – 20 Millitorr, Lösemittel gesammelt in einer Falle aus flüssigem Stickstoff). Das getrocknete Peptid wird dann in der Dampfphase mit Pentafluorpropionsäureanhydrid (PFPA), wie es in (54, 55) beschrieben wurde, umgesetzt, außer dass die Temperatur des Peptids für Zeiten von bis zu 3 Stunden bei –35°C gehalten wird. Das PFPA wird dann im Vakuum abgezogen, und das fragmentierte Peptid wird auf eine PO₄-Konzentration von 50 mM und pH 2,7 eingestellt und mittels HPLC analysiert.
Im allgemeinen sind die bekannten Aminopeptidasen nicht imstande, ein Peptid sequenziell unter den Bedingungen eines langsamen Wasserstoffaustauschs abzubauen. Wenn jedoch eine im Sauren aktive Aminopeptidase in der Natur entdeckt wird oder über eine Mutation einer bekannten Aminopeptidase erzeugt wird, besteht kein Grund, dass nicht eine Aminopeptidase anstelle der derzeit bevorzugten Carboxypeptidase eingesetzt werden kann. In diesem Falle beginnt der schrittweise Abbau am N-Terminus und nicht am C-Terminus eines jeden analysierten Peptidfragments.
Es sollte angemerkt werden, dass durch die Verwendung polarer, nicht-wässriger Co-Lösemittel in hohen Konzentrationen zur Verschiebung des pH_min der Geschwindigkeit des H-Austauschs eine größere Vielzahl an Reagenzien eingesetzt werden kann, als es anderenfalls der Fall wäre. Ein Co-Lösemittel, das diesbezüglich von besonderem Interesse ist, ist Glycerin (oder sind andere Polyole), da es unwahrscheinlich ist, dass es das Enzym denaturiert, wenn es in den hohen Konzentrationen eingesetzt wird, die zur Verschiebung des pH_min erforderlich sind.
8. Optimierung der Zeiten des Eintritts- und des Austrittsaustauschs
Jeder Peptidamidwasserstoff, der mit der Oberfläche der Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Bindungspartner assoziiert ist, hat im nativen gefalteten, ligandenfreien Zustand eine eigene Geschwindigkeit des Austauschs mit Tritium im Lösemittel, die dann zu einer anderen bestimmten Austauschgeschwindigkeit verschoben wird, sobald die Bildung des Komplexes aus dem Protein und dem Bindungspartner erfolgt ist. Das Signal-Rausch-Verhältnis (Verhältnis des Tritiums, das funktionell an dieses Peptidamid gebunden ist, zum gesamten Background-Tritium, das an alle anderen Peptidamide im Protein gebunden ist) kann über die Kenntnis der Austauschgeschwindigkeiten dieses Amidwasserstoffs im nativen, ligandenfreien Protein und im Komplex aus dem Protein und dem Bindungspartner optimiert werden.
Ein Amidwasserstoff mit einer Halbwertszeit des Austauschs von einer Minute im nativen, ligandenfreien Zustand des Proteins und von 10 Minuten im ligandenhaltigen Zustand könnte auf optimale Weise untersucht werden, indem das Rezeptorprotein zwei Minuten lang einem Eintrittsaustausch unterzogen wird (zwei Halbwertszeiten der Zeit des Eintrittsaustauschs führen zu einer Tritium-Inkorporation von 75% der maximal möglichen Gleichgewichtsmarkierung des Peptidamids), gefolgt von 10 Minuten eines Austrittsaustauschs im ligandenhaltigen Zustand (50% der eingetretenen Markierung bleiben auf dem funktionell markierten Peptidamid, und weniger als 0,1% der eingetretenen Markierung bleiben auf jedem der markierten Background-Peptidamide).
Zur Messung der Austauschgeschwindigkeiten eines bestimmten funktionell markierbaren Peptidamids, wie es im nativen, ligandenfreien Protein vorliegt, werden Aliquots des Proteins für unterschiedliche Zeiten (0,5 Sekunden bis 24 Stunden) einem Eintrittsaustausch unterzogen, an den Bindungspartner gebunden und dann für eine festgelegte Zeit, vorzugsweise 24 Stunden, einem Austrittsaustausch unterzogen. Nach einem proteolytischen Verdau bei pH 2,7 und 0°C und einer HPLC-Trennung wird die Radioaktivität gemessen, die mit dem Peptidfragment assoziiert ist, das das untersuchte Peptidamid enthält. Die Menge an Radioaktivität, die den Background darstellt (Amide, die nicht funktionell markiert sind) wird bestimmt, indem die Menge der Markierung gemessen wird, die mit dem gleichen Peptid assoziiert ist, wenn das Protein für die gleiche Zeitdauer einem Eintrittsaustausch unterzogen wird, aber vor der Proteolyse und HPLC-Analyse 24 Stunden lang einem Austrittsaustausch in Abwesenheit des zugesetzten Liganden unterzogen wird. Die mit dem Amid assoziierte spezifische Radioaktivität wird als Funktion der Zeit des Eintrittsaustauschs bestimmt, und es wird die Halbwertszeit des Eintrittsaustauschs des Amids im ligandenfreien Protein berechnet.
Um die Austauschgeschwindigkeit des gleichen Peptidamids, wenn es im Komplex aus dem Protein und dem Bindungspartner vorliegt; zu bestimmen, wird das Protein für eine feste, lange Zeit (vorzugsweise 24 Stunden) als Komplex mit seinem Bindungspartner einem Eintritts austausch unterzogen, für unterschiedliche Zeiten (vorzugsweise 10 Sekunden bis 4 Tage) einem Austrittsaustausch unterzogen, im Sauren proteolytisch gespalten und wie oben mittels HPLC analysiert. Es wird die mit dem Amid assoziierte spezifische Radioaktivität als Funktion der Zeit des Austrittsaustauschs bestimmt und die Halbwertszeit des Austrittsaustauschs des Amids im Protein mit dem Liganden berechnet. Mit dieser Information werden die Zeiten des Eintritts- und des Austrittsaustauschs so eingestellt, dass das Signal-Rausch-Verhältnis für jedes der untersuchten, funktionell markierten Amide im System aus dem Protein und dem Bindungspartner optimiert wird.
9. Modellierung der Kontaktoberflächen von Rezeptor und Ligand
Untersuchungen, die in ihrem Design mit den oben beschriebenen (1–8) identisch sind, können auch mit dem entsprechenden Bindungspartner-Protein durchgeführt werden (das Bindungspartner-Protein wird einem Eintrittsaustausch unterzogen, als Ligand an das Rezeptorprotein gebunden, einem Austrittsaustausch unterzogen etc.), was zur Identifizierung der Amide des Bindungspartners führt, die aufgrund der Wechselwirkung mit dem Rezeptorprotein bezüglich ihres Austauschs verlangsamt sind. Die Kenntnis der Identität der genauen Kontaktpeptide sowohl im Protein als auch in seinem Bindungspartner kann dazu verwendet werden, Computer-unterstützte Modelle der komplementären dreidimensionalen Strukturen der Oberflächen des Proteins und des Bindungspartners zu erzeugen.
Die Konstruktion dieser Modelle wird durch zusätzliche Informationen unterstützt, die durch die Erfindung bereit gestellt werden und die die Identifizierung einer Untergruppe von Peptidamiden auf der Bindungsoberfläche des Proteins ermöglichen, die wahrscheinlich Wasserstoffbrückenbindungen bilden mit Akzeptorresten auf der Kontaktoberfläche des entsprechenden Bindeproteins. Während man von den meisten der Peptidamide, die auf dem nativen, nicht-komplexierten Protein oder den Oberflächen für die Wechselwirkung mit dem Bindungspartner vorhanden sind, erwarten kann, dass sie eine Wasserstoffbrückenbindung mit anderen Teilen desselben Proteins eingehen, kann es sein, dass ein Teil dieser Peptidamide, möglicherweise von bis zu 50%, nur Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Lösemittel ausbildet. Da die meisten Kontaktoberflächen zwischen Protein und Bindungspartner stark komplementär zueinander sind, ist es wahrscheinlich, dass bei der Komplexbildung das Lösemittel Wasser von den in Wechselwirkung tretenden Oberflächen verdrängt wird und Amide, die zuvor in einer Wasserstoffbrückenbindung mit Wasser vorlagen, neue Wasserstoffbrückenbindungen mit der komplementären Oberfläche des Partner ausbilden. Diese Untergruppe bindender Amide auf der Oberfläche wird in unseren Untersuchungen leicht identifiziert (Schritt 8), da sie im nativen, nicht mit Liganden besetzten Zustand des Proteins bei einem pH von 7,0 und bei 0°C eine Austauschgeschwindigkeit von 0,5 Sekunden hat. Diese Amide können Wasserstoffbrückenbindungen mit der komplementären Oberfläche nur dann bilden, wenn ihre Wasserstoffe in Richtung der komplementären Oberfläche ausgerichtet sind. Das wiederum verursacht Einschränkungen bezüglich der Orientierung der gesamten assoziierten Peptidbindung und, in einem geringeren Ausmaße, der Seitenketten der beiden flankierenden Aminosäurereste eines jeden solchen Amids. Die Anwendung dieser Einschränkungen auf die vorangehenden Modelle der Struktur der Wechselwirkungsoberfläche ermöglicht eine Modellierung der dreidimensionalen Struktur der in Wechselwirkung stehenden Oberflächen des Proteins und des Bindungspartnerliganden mit höherer Auflösung.
10. Automatisierung der Verfahren, die für die Durchführung des enzymatischen Abbaus und der HPLC-Analyse unter Bedingungen eines verlangsamten Tritiumaustauschs erforderlich sind
Die Verdau- und Analyseverfahren werden zwar bei 0°C durchgeführt, aber die analytischen Proben von Peptiden, die über einen Tritiumaustausch markiert wurden, müssen bei Temperaturen von ungefähr –60 bis –80°C aufbewahrt werden, wenn inakzeptable Verluste der Markierung aus dem Peptid in Zeiträumen von Stunden bis zu Wochen vermieden werden sollen. Der Tritiumaustausch setzt sich in gefrorenen Proben auf eine Weise fort, die in umgekehrter Beziehung zur Temperatur steht, aber bei Temperaturen von ungefähr –70°C praktisch aufhört. Derzeit wird die Analyse des Tritiumaustauschs durchgeführt, indem Proben manuell aus der Lagerung bei –70°C entnommen werden, sie manuell bei 0°C geschmolzen werden, manuell Reagenzien (Puffer, Enzyme) zugegeben werden und die Proben manuell in die HPLC-Säule injiziert werden. Diese Manipulationen sind arbeitsintensiv und setzen die Proben während der Handhabung einer unbeabsichtigten Erwärmung aus. Wenn HPLC-getrennte Peptide gesammelt und für spätere Untersuchungen gelagert werden sollen, dann werden sie manuell gesammelt und bei –70°C gelagert. Kein derzeit verfügbarer automatischer HPLC-Autosampler hat die Fähigkeit, die erforderlichen Manipulationen mit Proben, die im gefrorenen Zustand aufbewahrt werden, durchzuführen.
Ein Autosampler AS30000^® von Spectraphysics kann so modifiziert werden, dass er die Automatisierung dieser Schritte ermöglicht. Diese bevorzugten Modifikationen waren: Einarbeitung eines Bades mit festem Trockeneis, in dem Proben bis zur Analyse aufbewahrt werden; Verwendung modifizierter Flüssigkeitsspritzen, die zuverlässig bei 0°C funktionieren; Steuerung des Autosamplers über einen externen Computer; und Anordnung des Autosamplers, der HPLC-Säule und des Spektralphotometers in einem Kühlschrank mit 0°C. Unter Computersteuerung hebt der mechanischer Arm des Autosamplers die gewünschte Probe aus dem Bad mit –70°C und setzt sie in ein Heizgerät/einen Mischer, wodurch die Probe schnell bei 0°C geschmolzen wird. Die verflüssigte Probe wird dann automatisch in die HPLC-Säule injiziert. Der Betrieb der HPLC-Pumpen, des Online-Radioaktivitätszählers und die Datenaufnahme sind auf ähnliche Weise automatisiert.
Zur Sammlung der Tritium-markierten, HPLC-getrennten Peptide unter den Bedingungen eines verlangsamten Austauschs muss ein Gilson-303^®-Fraktionssammler (der auch im Kühlschrank mit 0°C enthalten ist) so modifiziert werden, dass die Röhrchen für die Probensammlung in einem Bad mit Trockeneis eingetaucht sind. Die Computer-gesteuerte Verteilung der gewünschten Fraktionen des HPLC-Effluats in diese vorgekühlten Röhrchen führt zu einem schnellen Einfrieren der gewünschten Tritium-markierten Peptide bei –70°C.
Ausführungsformen für den Deuterium-Austausch:
Bei einer anderen Ausführungsform werden funktionell markierte proteolytische Fragmente, die aus einem Protein erzeugt wurden, das vor der Bildung des Komplexes aus dem Rezeptor und dem Liganden funktionell mit Deuterium (anstelle von Tritium) markiert worden war, mittels Massenspektrometrie analysiert, die unter Bedingungen durchgeführt wird, die den Austrittsaustausch von Peptidamid-Deuterium aus Peptidfragmenten minimiert und die direkte Bestimmung der Lokalisation der funktionell befestigten Markierung innerhalb eines Peptides im Größenbereich von 3–30 Aminosäuren ermöglicht.
Die Massenspektrometrie ist eine Standardtechnologie geworden, mit der sich die Aminosäuresequenz proteolytisch erzeugter Peptide schnell bestimmen lässt (43). Sie wird üblicherweise eingesetzt, um Peptide zu untersuchen, die Aminosäuren enthalten, die in Kohlenstoff-Wasserstoff-Positionen deuteriert wurden, und dadurch die genaue Lokalisation der deuterierten Aminosäure innerhalb der Primärsequenz des Peptids zu bestimmen. Das ist möglich, weil massenspektrometrische Verfahren den geringen Zuwachs im Molekulargewicht einer bestimmten Aminosäure aufgrund der größeren Masse von Deuterium nachweisen können. McCloskey et al. (44) offenbaren die Verwendung des Deuteriumaustauschs von Proteinen für die Untersuchung von Konformationsänderungen mittels Massenspektrometrie.
Der Anmelden hat eine Technik des Deuteriumaustauschs entwickelt, die in den Schritten 1–5 im wesentlichen mit der Technik des Tritiumaustauschs identisch ist, die oben beschrieben wurde, außer dass der Eintrittsaustausch in deuteriertem Wasser (vorzugsweise 80–99 Mol-% an deuteriertem Wasser) durchgeführt wird. Diese modifizierte Prozedur markiert nach dem Zusatz des Bindungspartners und dem Austrittsaustausch spezifisch diejenigen Peptidamide mit ausgetauschtem Deuterium, die die Oberfläche der Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Bindungspartner ausmachen. Die proteolytisch erzeugten Fragmente des funktionell mit Deuterium markierten Proteins werden identifiziert, isoliert und dann der Massenspektrometrie unter Bedingungen unterzogen, unter denen das Deuterium auf den funktionell markierten Peptidamiden an Ort und Stelle verbleibt. Eine Massenspektrometrie für die Standardanalyse der Peptidsequenz kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die den Austausch von Peptidamidprotonen minimiert: Die Proben können durch die Verwendung einer gekühlten Sonde für die Einführung der Probe bei 4°C bis 0°C gehalten werden; die Proben können in Puffer eingeführt werden, die einen pH im Bereich zwischen 1 und 3 aufweisen; und die Analysen werden innerhalb von Minuten abgeschlossen. Die MS-Ionen können mittels MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization), Elektrospray, Fast-Atom-Bombardment (FAB) etc. erzeugt werden. Die Carboxypeptidase kann vor oder gleichzeitig mit den Ionisierungsereignissen wirken. Die Unterfragmente werden auf der Basis ihrer Masse aufgetrennt, z. B. mittels Magnetsektor-, Quadropol-, Ionencyclotron- oder Time-of-Flight-Verfahren. Bezüglich MS-Verfahren im allgemeinen siehe Siuzdak, G., Mass Spectrometry for Biotechnolopy (Academic Press 1996).
Da Deuterium nicht radioaktiv ist, müssen die Deuterium-markierten Peptide mit anderen Verfahren identifiziert werden, z. B. durch Massenspektrometrie (ihr Molekulargewicht ist größer als dasjenige, das für das gleiche Peptid ohne eine derartige Markierung vorhergesagt wird).
Wenn es gewünscht wird, kann der gleiche Komplex aus Bindeprotein und Bindungspartner sowohl mittels Tritiumaustausch (der nur eine mittlere Auflösung zeigen muss) und mittels Deuteriumaustausch untersucht werden. Das Verfahren des Tritiumaustauschs identifiziert die relevanten Fragmente. Da dann die HPLC-Mobilitäten dieser Tritium-markierten Fragmente bekannt sind, können die entsprechenden Deuterium-markierten Fragmente über ihre gleichen Mobilitäten identifiziert und dann unterfragmentiert werden etc.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden getrennte Läufe eines Tritium- und eines Deuteriumaustauschs vermieden. Statt dessen wird das deuterierte Wasser mit tritiiertem Wasser supplementiert, z. B. besteht das Lösemittel aus 98 Mol-% deuteriertem Wasser und 2 Mol-% tritiiertem Wasser (z. B. 50 Ci/ml). Als Ergebnis davon sind die Fragmente sowohl mit Deuterium als auch mit Tritium markiert, und die relevanten Fragmente werden anhand ihrer vom Tritium vermittelten Radioaktivität identifiziert. Die Unterfragmente werden noch mittels Massenspektrometrie hinsichtlich des Vorkommens der Deuteriummarkierung analysiert (mit einer entsprechenden Korrektur hinsichtlich der relativ kleinen Menge an Tritium, die ebenfalls vorhanden ist). Der Zweck des Tritiums ist es, Peptidfragmente radioaktiv zu markieren, die Reste der Bindungsoberfläche enthalten. Die exakten involvierten Reste werden jedoch mittels MS-Analyse der Deuterium enthaltenden Peptide, identifiziert, die weiter mit im Sauren aktiven Carboxypeptidasen verdaut wurden, was die Identifizierung der deuterierten Reste der radioaktiven Peptide ermöglicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Komplexe aus Rezeptor und Bindungspartner, die funktionell mit Deuterium und Tritium in ihren in Wechselwirkung stehenden Oberflächen markiert wurden (unter Bedingungen eines verlangsamten Austauschs, wie sie oben für die Analyse des Tritiumaustauschs mit hoher Auflösung beschrieben wurden), mit Pepsin verdaut, einer RP-HPLC in Puffer, die 0,1% TFA enthalten, unterzogen, und das Säuleneffluat, das Tritium-markierte Peptide enthält, wird einer Analyse mittels Massenspektrometrie unterzogen. Um die Deuteriummarkierung innerhalb eines jeden Peptids genauer zu lokalisieren, wird die Massenspektrometrie mit markierten proteolytischen Fragmenten durchgeführt, die fortschreitend (unter Bedingungen eines verlangsamten Austauschs) mit im Sauren aktiven Carboxypeptidasen (41) weiter verdaut werden. Dieser Verdau kann vor der Einbringung der Probe in das Massenspektrometer erfolgen oder kontinuierlich in situ, während die Probe im Massenspektrometer gehalten wird. Beim Voranschreiten des Verdaus werden Molekülionen von jedem der resultierenden enzymatisch erzeugten, carboxyterminal verkürzten Peptidunterfragmente vom Massenspektrometer nachgewiesen, und ihre Molekulargewichte werden mit denjenigen, die für die nicht-deuterierte Form des gleichen Peptidfragments bekannt sind, verglichen. Peptidfragmente, die ein funktionell befestigtes Deuterium tragen, werden über eine Zunahme ihres Molekulargewichtes um eine Einheit im Vergleich zum gleichen Peptidfragment, das aus dem nicht-deuterierten Rezeptor-bindenden Partner erzeugt wurde, identifiziert. Eine ausreichende Unterfragmentierung und eine Analyse, wie sie oben beschrieben wurde, führt zur Ableitung der Protease-erzeugten Fragmente, die funktionell gebundenes Deuterium enthalten. Dadurch wird die Lokalisation eines jeden deuterierten Amids innerhalb des Peptids bestimmt.
In-vivo-Analyse
Eine In-situ-Analyse der Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Bindungspartner ist in vivo möglich. Das Protein wird, während es in seiner nativen Umgebung als Komponente einer intakten lebenden Zelle oder als sekretierte Komponente, z. B. von Blutplasma, vorliegt, durch die Inkubation von Zellen oder Plasma in physiologischen Puffern, die mit tritiiertem (oder deuteriertem) Wasser supplementiert sind, einem Eintrittsaustausch unterzogen. Dann wird der Bindungspartner zugesetzt, man lässt ihn einen Komplex mit dem Zellen- oder Plasma-assoziierten Protein bilden, und dann wird ein Austrittsaustausch eingeleitet, indem die Zelle oder das Plasma wieder in physiologische Bedingungen in Abwesenheit von tritiiertem (oder deuteriertem) Wasser zurückgebracht wird. Während der Dauer des Austrittsaustauschs (Stunden bis Tage) wird der gebildete Komplex aus dem Protein und dem Bindungspartner aus der Zelle oder dem Plasma mittels eines beliebigen Reinigungsverfahrens isoliert, das es ermöglicht, dass der Komplex kontinuierlich intakt bleibt. Am Ende des entsprechenden Zeitraums des Austrittsaustauschs erfolgen die Fragmentierung und die Analyse des gereinigten Komplexes wie oben.
Diese analytische Verfahren ist insbesondere für Proteine geeignet, die als Ergebnis der Reinigung erheblich an Aktivität verlieren, da die Bindungsstelle vor der Reinigung markiert wird.
Analyse der Bindungsstelle über einen indirekten Wasserstoffaustausch
Bei den oben beschrieben Verfahren wird zunächst die gesamte Oberfläche des Proteins markiert, und die Markierung wird dann von denjenigen Oberflächen entfernt, die nach der Bildung des Komplexes aus dem Bindeprotein und seinem Bindungspartner gegen das Lösemittel exponiert bleiben. Die Bindungsstelle des Proteins wird vom Bindungspartner besetzt, und die Markierung wird deshalb an dieser Stelle zurückgehalten.
Wenn der Komplex gebildet wird, kann es sein, dass das Bindeprotein seine Konformation auch an anderen Stellen ändert (allosterische Veränderungen). Wenn diese Veränderungen dazu führen, dass Abschnitte des Proteins, die zuvor auf der Oberfläche lagen, im Inneren des Proteins zu liegen kommen, dann werden diese Segmente auch die Markierung zurückhalten.
Es ist möglich, zwischen Resten in Bindungsstellen und Resten, die über allosterische Effekte vor einem Austrittsaustausch geschützt sind, zu unterscheiden. Im Prinzip beruht es darauf, dass zunächst der Bindungspartner und nicht das Bindeprotein markiert wird. Das Bindeprotein wird indirekt als Ergebnis der Übertragung der Markierung vom Bindungspartner auf das Bindeprotein markiert. Eine derartige Übertragung erfolgt prinzipiell an der Bindungsoberfläche.
Dieses Verfahren bewirkt eine funktionelle Markierung von Rezeptor-Proteinamiden, wenn sie durch eine Komplexbildung verlangsamt sind und sich im komplexierten Zustand auch in engem Kontakt mit dem Bindungspartner befinden. Rezeptor-Proteinamide, die aufgrund einer durch die Komplexbildung induzierten allosterischen Veränderung in Bereichen des Proteins verlangsamt sind, die nicht in der Nähe der Wechselwirkungsoberfläche zwischen dem Protein und dem Bindungspartner gelegen sind, werden nicht markiert. Dieses Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden:

1) Der Bindungspartner wird tritiiertem Wasser (vorzugsweise von hoher spezifischer Aktivität) zugesetzt, um eine Markierung des Bindungspartners über einen Tritiumaustausch einzuleiten.
2) Nachdem eine ausreichende Markierung erzielt worden ist, wird der Bindungspartner vom Tritiumüberschuss im Lösemittel unter Bedingungen abgetrennt, die nur einen minimalen Verlust der Tritiummarkierung vom Bindungspartner bewirken. Das kann z. B. erreicht werden durch a) Wechseln der Pufferbedingungen zu solchen eines verlangsamten Austauschs (0°C, saurer pH), gefolgt von einer Abtrennung des Bindungspartners in tritiumfreien Puffer mittels einer G-25-Spin-Säule, oder b) Anwenden von Stopped-Flow-Techniken, bei denen die Mischung für den Eintrittsaustausch schnell mit großen Volumina an tritiumfreiem Puffer verdünnt wird.
3) Der Tritium-markierte Bindungspartner, der nun frei von überschüssigem Lösemittel-Tritium ist, wird dem Rezeptor-Protein zugesetzt, und die Bedingungen werden so eingestellt, dass eine spontane reversible (Gleichgewicht) Komplexbildung zwischen den beiden erfolgt. Die Bedingungen bezüglich der Temperatur und des pH sollten auch den spezifischen Transfer der Tritiummarkierung vom markierten Bindungspartner auf Amide der Oberfläche des Bindeproteins für die Wechselwirkung mit dem Partner erlauben und vorzugsweise maximieren. Typischerweise liegt der pH bei 5–8 (womit er die Ligandenbindung förderlich ist) und die Temperatur bei 0–37°C. Für den Anfang wird die Verwendung von pH 7 und 22°C empfohlen, wobei der Transfer über die Steuerung der Inkubationszeit gesteuert wird. Ein typische Inkubationszeit für das Ausprobieren ist 24 Stunden. Diese Bedingungen bezüglich des pH, der Temperatur und der Inkubationszeit können natürlich verändert werden.
4) Der Komplex wird dann für Zeitabschnitte inkubiert, die ausreichend sind, um einen Transfer der Tritiummarkierung vom markierten Bindungspartner auf das Rezeptor-Protein zu ermöglichen. Während dieser Inkubationszeit verlässt Tritium, das über einen Eintrittsaustausch in Bereiche des Bindungspartners aufgenommen wurde, die entfernt von der Oberfläche der Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem Bindungspartner liegen, den Bindungspartner über einen Austausch mit Wasserstoff des Lösemittels und wird schnell und stark im großen Volumen des Lösemittelwassers verdünnt, wodurch seine effiziente anschließende Wechselwirkung mit dem Bindeprotein verhindert wird. Eine Tritiummarkierung jedoch, die an Amiden des Bindungspartners angebracht wurde, die in der (neu gebildeten) Oberfläche der Wechselwirkung des Proteins mit dem Bindungspartner liegen, sind nur in den kurzen Zeiträumen, wenn die Oberfläche der Wechselwirkung dem Lösemittel Wasser ausgesetzt ist, d. h. wenn der Komplex vorübergehend dissoziiert vorliegt, zu einem Austrittsaustausch aus dem Bindungspartner fähig. Wenn er so dissoziiert und dem Lösemittel exponiert vorliegt, verlässt ein Teil des Tritiums, das auf den Amiden innerhalb der Wechselwirkungsoberfläche des Bindungspartners vorliegt, die Oberfläche und verbleibt für einen kurzen Zeitraum in der Nähe der Oberfläche. Im Hinblick auf die schnelle (im wesentlichen diffusionsbegrenzte) erneute Bindung zwischen dem Bindeprotein und dem Partner wird ein großer Teil des freigesetzten Tritiums, das (kurz) in der Umgebung der bindenden Oberfläche des Partners verbleibt, teilweise mit den Amiden auf der (zukünftigen) Wechselwirkungsoberfläche des sich nähernden Moleküls des Bindeproteins austauschen, das anschließend an den Bindungspartner bindet. Sobald diese Bindung erfolgt, ist das übertragene Tritium erneut vor einem Austausch mit dem Lösemittel geschützt, bis der Komplex erneut dissoziiert. Das Ergebnis ist der voranschreitende Transfer eines Teils des Tritiums von der Wechselwirkungsoberfläche des Bindungspartners auf austauschbare Amide auf der Wechselwirkungsoberfläche der verwandten Proteins.

Amide, deren Austauschgeschwindigkeiten jedes Mal konformationsabhängig verlangsamt werden, sobald die Komplexbildung erfolgt, können ebenfalls mit Tritium markiert werden, aber sie werden es mit viel geringerer Geschwindigkeit als Amide innerhalb der Bindungsoberfläche, da sie weiter entfernt von der hohen Konzentration an Tritium sind, die bei jedem Dissoziationsereignis des Komplexes an der Wechselwirkungsoberfläche „freigesetzt" werden. Die Wirksamkeit des Transfers ist ungefähr umgekehrt proportional zur dritten Potenz der Distanz zwischen derartigen Konformationsänderungen und der Bindungsoberfläche.
Die Inkubationsbedingungen für den Komplex aus dem Bindeprotein und dem tritiierten Bindungspartner werden so eingestellt, dass der spezifische Amidtritiumtransfer der Wechselwirkungsoberfläche („specific interaction surface amide tritium transfer", „SISATT") für das jeweilige Paar aus dem Bindeprotein und dem Partner optimiert wird. SISATT ist definiert als das Verhältnis der Tritiummenge (cpm), die vom Bindungspartner zu den Peptidamiden des Bindeproteins transferiert wird, von denen (mittels der Technik aus dem Anspruch 1) zuvor bestimmt worden war, dass sie bei der Komplexbildung zwischen dem Bindeprotein und dem Partner eine Verlangsamung des Amidwasserstoffaustauschs erfahren, zur gesamten Tritiummenge (cpm), die vom Bindungspartner auf alle Peptidamide im Bindeprotein transferiert wurde.

5) Nach einem Inkubationszeitraum, der SISATT ermöglicht und vorzugsweise maximiert, werden wieder die Bedingungen eines verlangsamten Wasserstoffaustauschs hergestellt, der Komplex wird dissoziiert und das Bindeprotein fragmentiert. Die Fragmente des Bindeproteins (und nicht die des zunächst markierten Bindungspartners), die die Tritiummarkierung tragen, werden identifiziert und weiter wie zuvor beschrieben charakterisiert.

Alternativ wird Deuterium anstelle von Tritium als Markierung verwendet. Deuterium hat den Vorteil, dass es eine viel höhere Beladung mit der Markierung ermöglicht (da Deuterium viel billiger als Tritium ist).
Es ist auch möglich, direkt den Bindungspartner mit Deuterium und das Bindeprotein mit Tritium zu markieren. Als Ergebnis davon sind sowohl die Bindungsstelle als auch allosterisch verborgene Amide des Bindeproteins tritiiert, aber nur Amide der bindenden Stelle sind deuteriert.
Das indirekte Verfahren ist besonders für die Untersuchung von Proteinen anwendbar, bei denen es nach oder während der Bindung zu erheblichen Konformationsänderungen kommt, wie im Falle von Insulin und seinem Rezeptor.
Zusammensetzungen
Nach der Bestimmung der Bindungsstellen eines Bindeproteins oder eines Bindungspartners mittels der vorliegenden Verfahren (allein oder in Verbindung mit anderen Verfahren) kann die Information für die Entwicklung neuer diagnostischer oder therapeutischer Mittel ausgenützt werden. Solche Mittel können Fragmente sein, die im wesentlichen den genannten Bindungsstellen entsprechen (mit geeigneten Linkern, um sie in der richtigen räumlichen Anordnung zu halten, wenn die Bindungsstelle diskontinuierlich ist), oder die Peptidyl- oder Nicht-Peptidyl-Analogen von ihnen mit ähnlichen oder verbesserten Bindungseigenschaften entsprechen. Oder sie können Moleküle sein, die so konstruiert sind, dass sie an die genannten Bindungsstellen binden, die, wenn es gewünscht ist, dem Paratop des Bindungspartners entsprechen können.
Die diagnostischen Mittel können ferner eine geeignete Markierung oder einen geeigneten Träger umfassen. Die therapeutischen Mittel können ferner einen Träger umfassen, der die Zufuhr unterstützt oder auf andere Weise die therapeutische Wirkung verbessert.
Die Mittel können ein Epitop oder mehrere Epitope präsentieren, die gleich oder unterschiedlich sein können, und die Epitopen des gleichen Bindeproteins oder Bindungspartners oder unterschiedlicher Bindeproteine oder Bindungspartner entsprechen können.
Beispiele
Zur Demonstration der praktischen Anwendung dieser Technologie hat der Anmelder die Wechselwirkung von menschlichem Hämoglobin mit zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern untersucht, von denen bekannt ist, dass mit definierten und kürzlich identifizierten Unterbereichen des Hämoglobin-bindenden Proteins Haptoglobin reagieren. Für diese Untersuchungen habe ich den monoklonalen Antikörper β⁶-1-23456 (spezifisch für die β-Kette des humanen Hämoglobins; epitopzentriert auf oder die Umgebung von β6Glu) und den monoklonalen Antikörper β¹²¹ (spezifisch für die β-Kette des humanen Hämoglobins im Bereich des Restes β121) eingesetzt, wobei beide Antikörper die großzügige Gabe von C. R. Kiefer, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia (51) waren. Das humane Haptoglobin wurde von Calbiochem Corporation, La Jolla, Kalifornien, bezogen.
Präparation von Hämoglobin:
Blut wurde einem normalen Spender in Natriumheparin mit einer Konzentration von 10 U/ml abgenommen. Die roten Blutzellen wurden 5-mal in kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) (pH 7,4) gewaschen, wobei der Buffy Coat nach jeder Waschung abgesaugt wurde. Es wurde dem gewaschenen Zellpellet ein gleiches Volumen an kaltem destilliertem Wasser zugesetzt, um die Zellen zu lysieren, und dann wurde ein halbes Volumen an kaltem Toluol unter kräftigem Mischen zugesetzt. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang in einem kalten Sorvall-Zentrifugenrotor (Dupont) bei 15 000 Upm (33 000 × g) zentrifugiert. Die (mittlere) Schicht des Hämoglobins wurde entnommen, und die Zentrifugation und das Dekantieren des Hämoglobins wurden wiederholt. Das isolierte Hämoglobin wurde gegen vier Wechsel an kaltem 0,1 M Natriumphosphat, 0,5% NaCl, pH 7,4, dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Probe 15 Minuten mit Kohlenmonoxid behandelt. Die letztendliche Hämoglobin-Konzentration wurde unter Einsatz einer molaren Extinktion für das Häm bei 540 nm von 14 270 gemessen. Die Präparation wurde bei –70°C in Aliquots eingefroren aufbewahrt.
Präparation von Pepsin:
Pepsin vom Schwein (Worthington Biochemical Corp.) wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in 50 mM Natriumacetat, pH 4,5, gelöst und zur Entfernung proteolytischer Fragmente gegen die gleiche Lösung dialysiert. Sie wurde bei –70°C in Aliquots eingefroren aufbewahrt.
Tritium-Austausch:
Alle Schritte wurden bei 0°C durchgeführt. Der Eintrittsaustausch wurde durch das Mischen gleicher Volumina (5 μl) an isoliertem Hämoglobin (300 mg/ml) und tritiiertem Wasser (50 Ci/ml) initiiert, und die Mischung wurde 4 Stunden inkubiert. Aliquots dieser Mischung (1,3 μl) wurden dann äquimolaren Mengen entweder des monoklonalen Antikörpers β⁶, des monoklonalen Antikörpers β¹²¹ oder von Haptoglobin (alle in einer Konzentration von 10 mg/ml in PBS, pH 7,4, in einem letztendlichen Inkubationsvolumen von 75 μl) zugesetzt oder zur 75 μl PBS allein gegeben. Diese Mischungen aus Hämoglobin und Ligand wurden dann sofort auf 2-ml-Sephadex^®-G-25-Spin-Säulen gegeben und 4 Minuten bei 1100 × g zentrifugiert. Die Spin-Säulen wurden präpariert, indem 3-ml-Polypropylensäulen (Fisher Scientific) mit 2 ml Sephadex G-25, das in PBS, pH 7,4, plus 0,1% Triton^® X-100 äquilibriert worden war, gefüllt wurden. Die Säulen wurden unmittelbar vor ihrer Verwendung 2 Minuten bei 1100 × g vorzentrifugiert. Nach der Säulenauftrennung wurden die Proben über eine Inkubation über einen Zeitraum von 40 Stunden, die 10-fache Zeit des Eintrittsaustauschs, einem Austrittsaustausch unterzogen. Die Proben wurden dann mit Pepsin hydrolysiert. Typischerweise wurden 25 μl der dem Austrittsaustausch unterzogenen Mischung, die 70 μg Hämoglobin enthielten, zu 10 μg Pepsin in 110 μl 0,1 M NaPO₄, pH 2,7, plus 2,5 μl 0,5 M H₃PO₄ gegeben, die Mischung wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert und dann in die HPLC-Säule injiziert. Ein Aliquot des dem Eintrittsaustausch unterzogenen Hämoglobins wurde sofort auf pH 2,7 (0,1 M NaPO₄, pH 2,7) eingestellt, ebenfalls proteolytisch gespalten und wie oben ohne einen Austrittsaustausch analysiert. Zur Messung der Geschwindigkeiten des Eintrittsaustauschs spezifisch markierter Amidprotonen wurde das Hämoglobin wie oben beschrieben einem Eintrittsaustausch unterzogen, wobei jedoch die Zeiträume von 10 Sekunden bis 18 Stunden reichten, mit dem Liganden umgesetzt und 18 Stunden lang einem Austrittsaustausch unterzogen. Die Proben wurden dann proteolytisch gespalten, wie unten einer HPLC-Analyse unterzogen, und die spezifische Markierung auf den Peptiden wurde als Funktion der Zeit des Eintrittsaustauschs quantifiziert.
Hochdruckflüssigchromafographie:
Die verdauten Proben wurden auf einer HPLC-Einheit (Waters) analysiert, die modifiziert wurde, indem die Säule und der Injektor unter schmelzendem Eis gelagert wurden. Die mobile Phase wurde unter Verwendung von nanoreinem Wasser von Barnstead, Ultrapure-Natriumphosphat von Aldrich, HCl von J. T. Baker (Ultrex^®-Grade) und Acetonitril (HPLC-Grade) von Burdick & Jackson hergestellt. Die mobile Phase bestand aus 50 mM NaPO₄, pH 2,7, (Lösemittel A) und einer Mischung aus 20% 50 mM NaPO₄ und 80% Acetonitril (ACN) mit einem letztendlichen pH von 2,7 (Lösemittel B). Die Trennung der Peptide erfolgte mittels einer 30-cm-Phenomenex-Bondclone^®-10-C18-Säule. Das Gradientenprogramm startete bei 100% A und 0% B und wechselte dann innerhalb von 3,4 Minuten zu 83% A und 17% B. Zwischen 3,4 und 6,7 Minuten wurden konstante 83% A und 17% B gehalten, und von 6,7 bis 73,3 Minuten bewirkte das Programm einen linearen Anstieg von B von 17% auf 51%. Die Absorption bei 214 nm wurde mittels eines Detektors von Waters, Modell 441, verfolgt.
Für die Trennung in der zweiten Dimension wurden Peptid-Peaks, die eine spezifische Markierung trugen, isoliert und bei 0°C gesammelt, im gefrorenen Zustand bei –70°C aufbewahrt, bei 0°C aufgetaut, mit einem gleichen Volumen an 100 mM PO₄, pH 2,7, gemischt und einer HPLC-Analyse wie oben unterzogen, außer dass der Puffer A aus 0,115% Trifluoressigsäure (TFA) in H₂O und der Puffer B aus 80% ACN, 20% H₂O und 0,1% TFA bestand. Peaks, die eine spezifische radioaktive Markierung trugen, wurden identifiziert und isoliert.
Probensammlung:
Das HPLC-Effluat wurde am Auslass des HPLC-Detektors mittels eines Fraktionssammlers 203 von Gilson gesammelt. Die Proben (100 bis 400 Fraktionen pro Lauf) wurden gesammelt, und die Radioaktivität wurde gemessen, indem 5 Volumina Aquamix (ICN Radiochemicals) zugegeben wurden, woran sich eine Szintillationszählung anschloss. In anderen Untersuchungen wurde eine Online-Flüssigszintillationszählung mittels eines B-RAM-Durchfluss-Radioaktivitätsdetektors (INUS Inc.) durchgeführt.
Peptididentifizierung:
Über HPLC isolierte Peptide wurden sowohl über eine Gasphasen-Edman-Sequenzierung als auch über eine Aminosäureanalyse an der UCSD-Proteinsequenzierungseinrichtung analysiert.
ERGEBNISSE
Epitopkartierunq des Komplexes aus Hämoglobin und monoklonalem Antikörper.
Hämoglobin wurde 4 Stunden lang einem Eintrittsaustausch unterzogen und dann entweder ohne einen Zeitraum eines Austrittsaustauschs proteolytisch gespalten (1, Kasten B), mit einer äquimolaren Menge des monoklonalen Antikörpers β⁶ gemischt und dann 40 Stunden lang einem Austrittsaustausch unterzogen (1, Kasten C), mit dem monoklonalen Antikörper β¹²¹gemischt und 40 Stunden lang einem Austrittsaustausch unterzogen (Daten nicht gezeigt), oder 40 Stunden lang in Abwesenheit eines zugesetzten Antikörpers einem Austrittsaustausch unterzogen (1, Kasten D). Wenn das markierte Hämoglobin ohne einen Zeitraum eines Austrittsaustauschs untersucht wurde (1, Kasten B), dann wurden wenigstens 17 radioaktiv markierte Peaks erhalten, die im allgemeinen den Peaks entsprachen, die in der Absorptionsspur desselben HPLC-Laufes gesehen wurden, (1, Kasten A). Wenn man das markierte Hämoglobin ohne die Anwesenheit eines schützenden monoklonalen Antikörpers einem vollständigem Austrittsaustausch unterzog, dann verschwanden alle radioaktiv markierten Peaks (1, Kasten D). Wenn jedoch das markierte Hämoglobin in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers β⁶ einem Austrittsaustausch unterzogen wurde, dann wurde ein einziger Peak, der eine radioaktive Markierung trug, gesehen, was anzeigte, dass diese Fraktion das Antigenepitop des monoklonalen Antikörpers β⁶ enthielt (1, Kasten C).
Wenn dieser Peak in der zweiten Dimension einer HPLC-Analyse in TFA-haltigen Lösemitteln unter Bedingungen eines verlangsamten Protonenaustauschs unterzogen wurde, dann wurden anhand ihrer Absorption bei 214 nM zwei Peptide gefunden, wobei nur eines von ihnen eine radioaktive Markierung trug (siehe 2). Von diesem, die Markierung tragenden Peptid wurde mittels Gasphasen-Mikrosequenzierung und Aminosäureanalyse gefunden, dass es die Reste 1–14 der Beta-Kette des Hämoglobins repräsentierte. Die Messung der Geschwindigkeiten des Eintrittsaustauschs der markierten Amide in diesem Peptid zeigte zwei Geschwindigkeitsklassen, beide von gleicher Größe; eine, die mit einer Halbwertszeit von weniger als 10 Sekunden austauschte, und eine andere mit einer Halbwertszeit von ungefähr 1 Stunde. Messungen der spezifischen Aktivität zeigten, dass 4,3 Amidprotonen innerhalb dieses 14-mer-Peptids über die Wechselwirkung des β⁶-Antikörpers mit Hämoglobin verlangsamt waren. Es wurde ein synthetisches Peptid, das mit den Resten 1 – 14 der Beta-Kette des Hämoglobins (B1–14) identisch war, synthetisiert, über einen Protonenaustausch Tritiummarkiert und einem abgestuften Verdau mit Carboxypeptidase P unterzogen (siehe 6).
Ähnliche Untersuchungen wurden mit Hämoglobin durchgeführt, das nach der Wechselwirkung mit dem monoklonalen Antikörper β¹²¹ einem Austrittsaustausch unterzogen wurde (3). Es wurden drei durch Pepsin erzeugte Peptide gefunden, die eine Tritiummarkierung trugen (3, Kasten B). Nach der HPLC-Trennung der zweiten Dimension in TFA-haltigem Lösemitteln wurden diese Peaks ganz ähnlich von Verunreinigungen abgetrennt und sequenziert, und es zeigte sich, dass es sich um die Hämoglobin-Polypeptide β1–14, β113–128 und β15–31 handelte. Nach vorläufigen Protonenzählungs-Untersuchungen sind in jedem dieser drei Peptide ungefähr zwei durch den monoklonalen Antikörper β121 verlangsamte Protonen enthalten.
Die Positionen der drei Peptidbereiche im gefalteten Hämoglobin-Tetramer sind in der 5 gezeigt. Der monoklonale Antikörper β⁶ markiert sechs Amidbindungen, die auf einem außen angeordneten Abschnitt des gefalteten Hämoglobin-Moleküls (Aminosäuren 1–14 der β-Kette) liegen, der das kürzlich charakterisierte Zielepitop dieses monoklonalen Antikörpers (β6–9) (51) einschließt. Der monoklonale Antikörper β¹²¹ markiert insgesamt ungefähr sechs Protonen, von denen man, obwohl sie in nicht-zusammenhängenden Bereichen der linearen Aminosäuresequenz des Hämoglobins enthalten sind, sieht, dass sie im gefalteten Hämoglobin-Molekül auf der Oberfläche und in enger Nachbarschaft zueinander liegen, und dass sie den Rest 121 der β-Kette des Hämoglobins ein schließen.
Kartierung der Stellen der Wechselwirkung zwischen Hämoglobin und Haptoglobin:
Wenn Hämoglobin an Haptoglobin bindet weiß man, dass das Hämoglobin-Molekül mit Haptoglobin über drei nicht-zusammenhängende Peptidbereiche in Kontakt tritt, die aus den Resten 121–127 der α-Kette, den Resten 11–25 der β-Kette und den Resten 131–146 der β-Kette des Hämoglobins bestehen (52,53). Wir sagten deshalb voraus, dass die Pepsinspaltung von Hämoglobin, das an den Wechselwirkungsstellen mit Haptoglobin markiert war, zwischen 2 und 10 radioaktiv markierte Peptide liefern würde. Wir führten deshalb unsere Haptoglobin-Studien bei einer höheren Auflösung durch, die erreicht wurde, indem eine größere Anzahl von HPLC-Fraktionen gesammelt wurde (siehe 4). Unter diesen Bedingungen zeigte markiertes Hämoglobin, das ohne einen Zeitraum eines Austrittsaustauschs analysiert wurde, mehr als 33 unterscheidbare, radioaktiv markierte Peaks (4, Kasten B), die wiederum der Absorptionsspur entsprachen (4, Kasten A). Markiertes Hämoglobin, das in Gegenwart von Haptoglobin einem Austrittsaustausch unterzogen wurde, erzeugte 7 spezifisch radioaktiv markierte Peaks (4, Kasten C), die nicht vorhanden waren, wenn Hämoglobin in Abwesenheit von Haptoglobin einem Austrittsaustausch unterzogen wurde (4, Kasten D). Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Technologie mit einem Wechselwirkungssystem mit einem rezeptorartigen Liganden, das so komplex wie dasjenige aus Hämoglobin und Haptoglobin ist, gut funktioniert.
Lösemitteleffekt
Das synthetische Hämoglobin-Peptid β1–14 wurde an allen Peptidamiden über einen Protonenaustausch Tritium-markiert, und Aliquots des markierten Peptids wurden bei 0°C einer HPLC-Analyse wie in der 1 unterzogen, außer dass ein Bereich von Lösemittel-pHs wie unten angegeben eingesetzt wurde. Es wurde dann der prozentuale Anteil des ursprünglichen Peptid-gebundenen Tritiums, der unter den jeweiligen HPLC-Bedingungen am Peptid gebunden blieb, bestimmt.
Die Tritium-Retention betrug ungefähr 57% für TFA (pH 2,1), 46% für PO₄ (pH 2,7), 34% für PO₄ (pH 3,5) und 14% für PO₄ (pH 4,0).
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Claims

Verfahren zur Charakterisierung der Bindungsstelle, die am Binden eines Bindeproteins mit einer bekannten oder bestimmbaren Aminosäuresequenz an einen Bindungspartner beteiligt ist, das umfaßt: (a) Bereitstellen eines Komplexes des Bindeproteins und des Bindungspartners, wobei eine oder mehrere Amidpositionen einer Bindungsstelle des genannten Bindeproteins mit schwerem Wasserstoff markiert sind und die genannten Positionen im Ergebnis der Komplexierung mit dem genannten Bindungspartner für ein Lösemittel nicht frei zugänglich sind, wobei die Markierung in den genannten Positionen stärker ist als in denjenigen Amidpositionen, die für ein Lösemittel frei zugänglich sind; (b) Dissoziieren des Bindeproteins von dem Bindungspartner und Fragmentieren des Bindeproteins, um eine Vielzahl von Fragmenten zu erhalten, die sich im Hinblick auf ihren Gehalt an schwerem Wasserstoff unterscheiden; (c) Auftrennen und Reinigen der Fragmente; (d) Feststellen, welche gereinigten Fragmente markiert sind; (e) Abbauen eines jeden gereinigten markierten Fragments, um eine Reihe von Unterfragmenten einer zunehmend kleineren Größe zu erhalten, wobei sich jedes Glied der Reihe von dem nächsten Glied durch eine endständige Aminosäure unterscheidet, sowie Quantifizieren der Menge der Markierung mit schwerem Wasserstoff, die jedem Unterfragment zugeordnet ist; und (f) Korrelieren der Menge an Markierung aus schwerem Wasserstoff in den Unterfragmenten mit den Aminosäuresequenzen ihrer Stammfragmente, wodurch die. speziellen Amidpositionen des Bindeproteins lokalisiert werden, die mit dem schweren Wasserstoff markiert waren, und auf diese Weise ein weiteres Charakterisieren der Bindungsstelle des genannten Bindeproteins, wobei Stufen (b) bis (e) unter Bedingungen eines verzögerten Wasserstoffaustauschs durchgeführt werden, unter denen die Markierung aus schwerem Wasserstoff in den markierten Amidwasserstoffstellungen des Bindeproteins erhalten bleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Komplex von Stufe (a) dadurch bereitgestellt wird, dass man (i) das Bindeprotein mit einem mit schwerem Wasserstoff markierten Lösemittel für einen "Eintritts-Austausch"-Zeitraum in Kontakt bringt, der ausreicht, dass jedes der exponierten Peptidamidwasserstoffatome des Proteins bei einer nachweisbaren Zahl von Molekülen des Proteins durch schweren Wasserstoff ersetzt wird; (ii) Bilden eines Komplexes aus dem Bindeprotein und seinem Bindungspartner, wobei im Ergebnis der genannten Bindung einige der Atome aus schwerem Wasserstoff für das Lösemittel weniger zugänglich werden; und (iii) Umsetzen des Komplexes mit einem im wesentlichen unmarkierten Lösemittel, das normale Wasserstoffatome enthält, für einen "Austritts-Austausch"-Zeitraum, der ausreicht, dass alle schweren Wasserstoffatome, die noch dem Lösemittel ausgesetzt sind, durch normale Wasserstoffatome ersetzt werden, wobei jedoch wenigstens ein Atom schwerer Wasserstoff erhalten bleibt, das, in Abwesenheit des genannten Bindungspartners, durch ein normales Wasserstoffatom ersetzt würde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Komplex von Stufe (a) dadurch bereitgestellt wird, dass man (i) den Bindungspartner mit einem schweren Wasserstoff enthaltenden Lösemittel für einen "Eintritts-Austausch"-Zeitraum in Kontakt bringt, der ausreicht, dass exponierte Peptidamid-Wasserstoffatome des Bindungspartners gegen schweren Wasserstoff aus dem Lösemittel ausgetauscht werden; (ii) den mit schwerem Wasserstoff markierten Bindungspartner von dem Lösemittel unter solchen Bedingungen ab trennt und isoliert, dass die Markierung mit schwerem Wasserstoff erhalten bleibt; (iii) Inkontaktbringen des isolierten, mit schwerem Wasserstoff markierten Bindungspartners mit einer Lösung eines Bindeproteins, das ursprünglich frei von schwerem Wasserstoff aus dem Lösemittel ist, unter solchen Bedingungen, dass spontan eine Komplexbildung zwischen dem ursprünglich unmarkierten Bindeprotein und dem mit schwerem Wasserstoff markierten Bindungspartner erfolgt; und (iv) Zulassen eines Transfers von schwerem Wasserstoff von dem Bindungspartner auf den Teil des Bindeproteins, der für eine wirksame Wechselwirkung mit dem Lösemittel aufgrund seiner Wechselwirkung mit dem Bindungspartner unzugänglich ist; wodurch Amidwasserstoffe der Bindungsstelle stärker markiert sind als Amidwasserstoffe, die gegenüber dem Lösemittel im Ergebnis von rein allosterischen Veränderungen, die im Bindeprotein als Ergebnis der Bindung des Bindungspartners auftreten, abgeschirmt sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Markierung Tritium ist und die Anwesenheit oder Menge der Markierung in einem Fragment oder Unterfragment durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Markierung Deuterium ist und die Menge der Markierung in einem Unterfragment durch Messung der Masse des Unterfragments bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei auch eine Tritiummarkierung verwendet wird und die markierten Fragmente durch Radioaktivitätsmessungen identifiziert werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Auftrennung als zwei aufeinanderfolgende Auftrennungen unter unterschiedlichen Bedingungen bei zwei unterschied lichen pH-Werten, von denen jeder im Bereich 3,0–2,1 liegt, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei einer der beiden unterschiedlichen pH-Werte 2,7 und der andere 2,1 beträgt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Abbau der Fragmente in Stufe (e) die Einwirkung einer säureresistenten Carboxypeptidase auf die Fragmente umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die säureresistente Carboxypeptidase irgendeine der Carboxypeptidasen P, Y, W oder C ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Bindeprotein ursprünglich eine oder mehrere Disulfidbindungen aufweist und das Verfahren das Brechen dieser Bindungen vor der Fragmentierung gemäß Stufe (b) unter Bedingungen umfaßt, unter denen die tritiierte oder deuterierte Markierung in den Peptidamidwasserstoffen des Bindeproteins erhalten bleibt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die genannten Bedingungen die Reaktion mit einem wasserlöslichen Phosphin umfassen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei, in Stufe (b), das Protein vor der Fragmentierung denaturiert wird, um seine Empfindlichkeit gegenüber einer Fragmentierung zu erhöhen, und in einem empfindlichen Zustand, der mit einer enzymnatischen Fragmentierung kompatibel ist, gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das genannte Protein mit Guanidinthiocyanat denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Protein durch Verdünnung mit Guanidin-HCl in einem empfindlichen Zustand gehalten wird, der mit der enzymatischen Fragmentierung kompatibel ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Fragmentierung, oder eine die Fragmentierung vorbereitende Denaturierung, in einem Lösemittel so durchgeführt wird, dass der pH für eine Minimierung des Wasserstoffaustauschs höher ist als der einer rein wäßrigen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das genannte Lösemittel 5–20% Wasser aufweist und der Rest ein nicht-wäßriges polares Lösemittel ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Acetonitril, Dimethylsulfoxid und einem Polyol.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Polyol Glycerin ist.