KR20040032826A - 단백질 프로파일링에 의한 신장 질병 검출 방법 - Google Patents

단백질 프로파일링에 의한 신장 질병 검출 방법 Download PDF

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KR20040032826A
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Abstract

본 발명은 신장의 질병 상태의 특성이 되는 단백질 폴리펩타이드 사슬을 따라 효소 절단이 일어나는 위치에서 함께 본래의 여과 단백질로부터 유래된 특정 단편의 크기 및 서열의 표현으로 소변 단백질 단편화 프로파일을 생성 및 분석하는 방법을 제공한다. 신장 통과도중 여과된 단백질이 분해되는 것을 인지하는 본 출원서에 기술된 방법은 비-신장성 질병에 의해 생성된 단백질로부터 유래된 단백질 단편을 검출할 수 있을 것이다. 이러한 여과 단백질의 소변 분석은 현재 이들 단백질의 본래 형태를 검출할 수 없다. 따라서, 신장 통과도중 분해의 결과로 형성된 단편을 검출하고 분석하는 기술된 바와 같은 방법은 그 질병의 정도를 검출할 수 있을 것이다.

Description

단백질 프로파일링에 의한 신장 질병 검출 방법{METHOD FOR KIDNEY DISEASE DETECTION BY PROTEIN PROFILING}
본 발명은 신장 질병의 초기 및/또는 질병, 특히 당뇨의 신장 합병증을 검출하는 개선된 방법에 관한 것이다.
본 출원인은 알부민을 포함하는 단백질은 일반적으로 본래 단백질과 신장 통과도중 특이적으로 생성되는 단편의 혼합물로 방출되는 것을 발견하였다(Osicka T.M. 등, Nephrology, 2:199-212(1996)). 단백질들은 신장 통과도중 세뇨관 세포를 포함할 수 있는 포스트-사구체(기저 막) 세포에 의해 상당히 분해된다. 신장 세뇨관 세포내 리조솜은 신장 통과도중 방출된 단백질의 파괴를 초래할 수 있다. 도 1은 여과된 본래의 알부민이 세뇨관 세포내로 들어가고 알부민이 파괴되어 방출된 알부민 단편을 제공하는 진행과정을 나타낸 것이다. 파괴 산물은 세뇨관 세포내강으로 분비된다. 정상적인 개체에서 소변내 대부분의 알부민은 단편화된 것이다.
리소좀 활성 혹은 리소좀에 대한 세포내 공정 관련 물질이 감소되는 경우 보다 고분자량이며 실질적으로 전장 알부민이 소변에 나타나게된다. 이는 신장 조직내 세포 공정에 있어서 불균형이 있음을 반영한다.
본 출원인은 알부민 및 면역글로블린과 같은 주요 혈장 단백질을 포함하는 단백질이 신장에 의해 여과되는 경우, 이들은 방출되기전에 후속적으로 신장내의 세포에 의해 분해되는 것을 발견하였다(참조 PCT 공개 출원 WO 00/37944). 여과된 단백질은 세뇨관 세포에 의해 취해지는 것으로 여겨진다. 세뇨관 세포는 신장 여과막에서 먼 편에 놓여져 있으며 일차 여액과 직접 접촉하게 된다. 단백질이 세뇨관 세포에 의해 내면화되는 경우, 이들은 리소좀을 향해가며, 리소좀에서 이들은 부분적으로 다양한 크기의 단편으로 분해된 다음 그 세포를 바깥으로 되내뿜는다. 이러한 분비된 단편들은 어느 하나의 특정 타입 단백질로부터 생성된 최소 60개의 다른 단편일 수 있으며, 이는 소변내로 방출된다.
본 출원인은 신장 질병에 있어서 단백질의 단편화가 저해됨을 발견하였다. 이는 신장 질병 환자에 있어서 실질적으로 전-장 여과된 단백질이 방출되는 것을 의미한다. 방출된 단백질의 단편화에서 단편화 저해로의 이러한 변화가 새로운 약 및 진단 어세이의 개발에 기초가 되었다. 예를들어, 당뇨병에서 신장 합병증의 시작과 함께 일어나는 초기 변화는 방출된 알부민의 단편화 프로파일의 변화와 연관이 있다. 이는 당뇨병성 신장병의 발달과 같은 분명한 마이크로알부민뇨증을 일으킨다. 이는 당뇨병에 있어서 세뇨관 세포의 리소좀 활성 억제에 기인하는 것으로 여겨진다. 따라서, 신장 합병증이 일어나는 당뇨병에서 리소좀 활성을 일으키는 약이 처방될 수 있다. 상기 약은 또한 리소좀 활성이 영향을 받는 다른 신장 질병에 또는 신장 합병증이 없는 당뇨병에서 비-신장 조직에서 리소좀 활성이 저하되는 상황에 유용할 수 있다. 이러한 약은 항암 약제와 같은 항증식성 약을 포함한다.
그러나, 과도한 알부민이 검출될때에는 신장 질병이 아마도 되돌릴 수 없으며 치료가 거의 효과가 없는 단계일 정도로 진전되어 있다. 따라서 이러한 질병을 검출하는데 있어, 그 질병이 억제되거나 질병 초기에 치료 프로토콜을 적용할 수 있도록 가능한 한 초기에 검출되도록 현재 알려진 방사성면역측정법보다 민감한 검출법을 제공하는 것이 이 분야에 계속 요구되고 있다.
그러나, 진단 목적으로 소변 단백질 프로파일을 사용하는 종래 시도는 불충분한 재현성, 민감성 및 이용가능한 기술의 신속성때문에 부분적으로 이들의 임상적 타당성과 관련하여 실망스러웠다. 따라서, 신장 질병 및/또는 질병, 특히 당뇨의 신장 합병증의 초기 단계를 검출하는 개선된 방법이 계속 요구되어 진다.
본 출원은 미국 가출원 일련번호 60/301,251(2001. 6. 28.)에 대한 우선권을 주장한다.
일 구체화로, 본 발명은 신장 질병 및/또는 질병, 특히 당뇨의 신장 합병증의 초기 단계를 검출하는 개선된 방법을 제공한다. 단편화 프로파일은 단백질 폴리펩타이드 사슬을 따라 효소 절단이 일어나는 위치를 갖는 본래의 여과된 단백질로 부터 유래된 특정 단편의 크기 및 서열로 검출된다. 단편화 프로파일은 신장의 병에 걸린 상태의 특성이 된다. 따라서, 신징 질병을 포함하는 질병의 초기 신호를 검출하는 방법, 그 질병에 대한 환자의 성향을 검출하는 방법, 그 질병의 시작을 억제하는 방법 및 가장 초기 단계에 그 질병을 치료하는 방법이 본 발명의 목적의 일부이다.
본 방법은 대상자로부터 소변을 취하는 단계, 및 상기 단편을 모두 분리하는 단계를 포함한다. 특정 구체화로, 분리는 HPLC(단일 차원 또는 이차원 또는 삼차원 전기영동 및/또는 크로마토그래피)에 의해 이루어지며, 그 다음 그 단편은 질량 분광분석법에 의해 크기가 조사되어지며 아미노산 시퀀싱을 이용하여 펩타이드 서열을 결정하고 효소 절단이 일어나는 위치를 알아낸다.
어느 특정 질병으로 한정하는 것은 아니나, 본 발명의 방법에 의해 진단되어지는 질병은 신장병, 요붕증, 당뇨병 타입 I, 당뇨병 II, 신장 질병(사구체 신염, 세균 및 바이러스성 사구체신염, IgA 신장병 및 Henoch-Schonlein Purpura, 멤브라노프로리퍼러티브 사구체신염, 멤브레인성 신장질병, Sjogren 신드롬, 신증 증후군(최소 변화 질병, 집중 사구체경화증 및 관련 질병), 급성 신장 쇠약, 급성 세뇨관간질 신염, 신우신염, GU 트랙 염증 질병, 프리-클램프시아(Pre-clampsia), 신장성 그라프트 거부, 나병, 역류성 신장병, 신결석증), 일반적인 신장 질병(수질 낭성, 수질 해면, 다낭성 신장 질병(상염색체 우성 다낭성 신장 질병, 상염색체 열성 다낭성 신장 질병, 결절성 경화증), von Hippel-Lindau 질병, 가족성의 얇은-사구체 기저막 질병, 콜라겐 III 사구체병증, 피브로넥틴 사구체병증, Alport 신드롬, Fabry 질병, Nail-Patella 신드롬, 선천성 요도성 기형), 모노클로날 감마글로불린장애(다중 골수종, 아밀로이도시스 및 관련 질병), 페브릴 질병(가족성 지중해병 열병, HIV 감염-AIDS), 염증 질병(전신성 맥관염(결절성다발동맥염, Wegener 육아종증, 다발성동맥염, 과사성 및 초승달모양의 사구체염), 다발성근염-피부근염, 췌장염, 류마토이드 관절염, 전신성 파종상홍반성 루프스, 통풍), 혈관 질병(겸상적혈구 질병, 혈전성혈소판감소성자반증, 용혈성 요독증후군, 급성 피질성 괴사, 신장성 혈전색전증), 외상성 및 외과(광범위한 상처, 화상, 복부 및 맥관 외과, 마취의 도입), 약(페니실린, 스테로이드) 및 약물 남용 악성 질병(표피(폐, 유방), 아데노카시노마(신장), 흑피증, 림프세망, 다중 골수종), 순환기 질병(심근 골굴절, 심장 질병, 말초 혈관 질병, 고혈압, 관동맥 심장 질병, 비-동맥경화성 심장혈관 질병, 동맥경화성 심장혈관 질병), 피부 질병(건선, 전신성 경화), 호흡기 질병(COPD, 폐쇄성 수면 무호흡, 고도에서 저호흡증) 및 내분비 질병(말단거대증, 진성 당뇨병, 병리 요붕증)을 포함한다. 특정 단백뇨, 및 특히 알부민뇨증이 이러한 질병의 표지이다.
두번째 구체화로, 본 발명은 비-신장성 질병을 검출하는 개선된 방법을 제공한다. 신장 통과도중 여과된 단백질이 분해되는 것을 인식하여 본 출원서에 기술된 방법은 또한 비-신장성 질병에 의해 생성된 단백질로부터 유래된 단백질 단편을 검출할 수 있다. 암과 같은 비-신장성 질병은 순환되는 단백질의 증가된 수준을 생성한다. 여과된 단백질의 소변 검사는 현재 이러한 단백질의 본래 형태를 검출할 수 없다. 따라서 신장 통과도중 분해된 단편을 검출하고 분석하는 아래에 기술된 방법이 이러한 질병의 심각성을 검출할 수 있을 것이다.
두 구체화는 소변 시료로부터 삼차원 형태로 원하는 단백질 및 그 단편을 추출하고; 그 단편을 분리하고; 그리고 상기 단백질 및 그 단편의 서열을 검출함으로써 비-항체 기술을 이용할 수 있다. 이러한 어세이는 주기적인 기간의 시간에 걸쳐 반복된다. 시간에 걸친 단편화 프로파일의 변화는 특정 질병의 초기 단계를 나타낸다. 서열 분석에 의해 검출된 단편의 크기 변화는 그 대상자가 갖는 발달 성향인 신장 질병의 타입을 나타낸다.
본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적은 하기 상세한 설명, 본 명세서에 첨부된 도면 및 청구항으로부터 보다 완전히 이해될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 여과된 본래의 알부민이 세뇨관 세포내로 들어가고 알부민의 파괴되어 방출된 알부민 단편을 제공하는 진행과정을 나타낸다.
도 2(2a 및 2b)는 정상적인 건강한 지원자로부터 수집된 (a)소변 및 (b)혈장내에서 크기 배제 크로마토그래피에 의한 (3H)HSA의 대표적 프로파일을 나타낸다. 소변은 대부분 단편화된 알부민을 함유한다. 그리고 혈장은 대부분 본래의 알부민을 함유한다.
도 3은 크기 배제 크로마토그래피 검사시 단편화된 알부민의 피크는 나타나나 본래 알부민의 피크는 나타나지않는 정상적인 건강한 지원자의 소변을 나타낸다.
도 4는 크기 배제 크로마토그래피 검사시 본래의 알부민 및 단편화된 알부민 두가지 모두의 피크를 보여주는 당뇨 환자의 소변을 나타낸다.
도 5는 알부민 단독의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 6은 알부민 피크를 나타내는 정상적인 건강한 지원자 혈장의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 7은 알부민의 단편화된 생성물 피크를 나타내나 본래 알부민의 피크를 나타내지않는 정상적인 건강한 지원자 소변의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 8은 알부민 파괴 생성물 및 소-변형된 알부민 피크가 약 39-44분 체류시간에서 나타나는 정상단백뇨성 당뇨병 환자의 소변 시료의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 9는 신장 질병의 신호 및 그 특징적인 급격한 알부민 피크의 존재가 약 39-44분 체류시간에서 나타내는 정상단백뇨성 당뇨병 환자 소변의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 10은 신장 질병의 신호 및 그 특징적인 급격한 변형된 알부민 피크의 존재가 약 39-44분 체류시간에서 나타나는 정상단백뇨성 당뇨병 환자 소변의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 11은 약 39-44분 체류시간에서 나타나는 그 특징적인 급격한 출현 뿐만 아니라 고수준의 정상적인 알부민을 나타내는 대단백뇨성 당뇨병 환자의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 12는 환자의 장기적인 연구를 나타내는 것으로 변형된 단백질은 당뇨병성 신장질병의 시작전 시기에 검출되었으며, 이는 당뇨병성 신장질병에 대한 성향을 나타내며 그리고 통상적인 RIA 방법에 의존하는 것에 기인하는 치료 지연을 나타낸다.
도 13은 환자의 장기적인 연구를 나타내는 것으로 변형된 단백질은 당뇨병성신장질병의 시작전 시기에 검출되었으며, 이는 당뇨병성 신장질병에 대한 성향을 나타내며 그리고 통상적인 RIA 방법에 의존하는 것에 기인하는 치료 지연을 나타낸다.
도 14는 환자의 장기적인 연구를 나타내는 것으로 변형된 단백질은 당뇨병성 신장질병의 시작전 시기에 검출되었으며, 이는 당뇨병성 신장질병에 대한 성향을 나타내며 그리고 통상적인 RIA 방법에 의존하는 것에 기인하는 치료 지연을 나타낸다.
도 15는 실시예 4의 변형된 알부민의 순도의 기준으로 사용된 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 16은 본래의 여과된 단백질이 정상적 기능 신장 및 질병에 걸린 신장에 의해 분해되는 방식을 나타내는 개략도이다.
도 17은 30,000 분자량 컷-오프 막을 통해 여과된 알부민의 트립신 분해된 시료의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 그 여액은 2-30분에서 다수의 피크를 생성한다.
도 18은 다수의 단편이 10-30분범위에서 나타타는 대조구, 정상인의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 대알부민뇨증을 갖는 당뇨병 환자(분당 1457마이크로그램)의 HPLC 프로파일은 10-30분범위에서 현저히 다른 단편 프로파일을 나타낸다.
도 19는 신장 질병을 갖는 대상자의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 도 18과 비교하여, 여과된 단백질의 단편화 진행은 저해된다. 단편의 수는 감소되고 그 단편의 크기는 증가된다.
본 출원인은 알부민 및 면역글로블린과 같은 주요 혈장 단백질을 포함하는 단백질이 신장에 의해 여과되는 경우 이들은 방출되기전에 후속적으로 신장에서 세포에 의해 분해되는 것을 발견하였다. 여과된 단백질은 세뇨관 세포에 의해 취해되는 것으로 여겨진다. 세뇨관 세포는 신장 여과막에서 먼 편에 놓여져 있으며 일차 여과물과 직접 접촉하게 된다. 단백질이 세뇨관에 의해 내부화되는 경우, 이들은 리소좀을 향해가게 되며, 이곳에서 이들은 부분적으로 다양한 크기의 단편으로 분해된 다음 그 세포를 바깥으로 되내뿜는다. 이러한 분비된 단편들은 어느 하나의 특정 타입 단백질로부터 생성된 최소 60개의 다른 단편일 수 있으며, 이는 소변으로 방출된다.
본 출원인은 신장 질병에 있어서 단백질의 단편화가 저해됨을 발견하였다. 이는 신장 질병 환자에 있어서 실질적으로 전-장 여과된 단백질이 방출되는 것을 의미한다. 방출된 단백질의 단편화에서 단편화 저해로의 이러한 변화가 새로운 약 및 진단 어세이의 개발에 기초가 되었다. 예를들어, 당뇨병에서 신장 합병증의 시작과 함께 일어나는 초기 변화는 방출된 알부민의 단편화 프로파일의 변화와 연관이 있다. 이는 당뇨병성 신장병의 발달과 같은 분명한 마이크로알부민뇨증을 일으킨다. 이는 당뇨병에 있어서 세뇨관 세포의 리소좀 활성 억제에 기인하는 것으로 여겨진다.
따라서, 신장 합병증이 일어나는 당뇨병에서 리소좀 활성을 일으키는 약이 처방될 수 있다. 상기 약은 또한 리소좀 활성이 영향을 받는 다른 신장 질병에 또는 신장 합병증이 없는 당뇨병에서 비-신장 조직에서 리소좀 활성이 저하되는 상황에 유용할 수 있다. 이러한 약은 항암 약제 또는 TGF-베타를 중화하는 항체와 같은 항증식성 약을 포함한다.
본 출원인은 대상자의 소변에서 검출되는 특정 단백질의 단백질 단편 배열을 검출하는 독특한 어세이를 발견하였다. 단백질 단편 배열 및 상기 단백질 단편 배열에 대한 변화의 검출은 신장 질병에 대한 경향을 예측한다.
단백질 단편 배열의 원리는 도 16에 나타나 있다. 본래 단백질은 그 단백질의 특정 아미노산 서열을 대표하는 일련의 구역에 의해 나타내어진다. 모든 단백질은 특정한 일차 구조를 갖는다. 알부민 혹은 면역글로블린과 같이 혈장으로부터 얻어진 이러한 단백질이 여과되는 경우 이는 그대로 여과된다. 그러나, 그 단백질이 여과된 후 이는 초기 근접 세뇨관 세포와 같은 신장 세포에 의해 취해지고 리소좀내에서 효소에 의해 분해되어 다수의 단편으로 될 수 있다(도 16). 이러한 단편은 소변으로 방출된다. 정상적인 기능의 신장에 있어서, 단편화 공정은 생성되어지고 최종적으로 방출되어지는 다수의 각 여과된 단백질로부터 유래된 소 단편으로 극대화된다. 도 17은 알부민의 트립신 분해로부터 얻어진 단편화 프로파일을 나타낸다. 유사한 프로파일은 대조구인 정상 지원자의 소변에서 보여진다(도 18). 각 단백질로 부터 생성된 단편의 수 및 그 펩타이드 분열의 특성(즉, 절단이 일어나는 단백질에 따른 위치)의 표현에 있어서, 단편화 프로파일은 특이적이다. 각 단편의 크기 및 서열 특성은 그 단백질에 작용하는 리소좀 효소의 특이성 및 활성의 특성이 될 것이다.
V-8, 트립신 및 Lys-C와 같은 프로테아제가 정제된 단백질의 펩타이드 맵을생성하는데 이용될 수 있다. 다른 프로테아제가 사용될 수 있으며 바람직하게 프로테아제는 표적 단백질의 단지 하나 또는 제한된 수의 펩타이드 결합을 분리하는 제한된 단백질 가수분해("효소 절단")를 일으키는 프로테아제가 사용될 수 있다. 프로테아제는 세린 단백질가수분해효소(키모트립신, 트립신, 엘라스타아제, 칼리크레인 및 서브스틸리신과), 시스테인 단백질가수분해효소(파파인, 액티니딘 또는 브로멜라인, 일부 카뎁신, 사이토졸릭 칼파인과 같은 식물 프로테아제, 및 기생성 단백질가수분해효소(예, 트리파노소마(Trypanosoma), 쉬스토소마(Schistosoma)로 부터 유래된), 아스파틱 단백질가수분해효소(펩신과 같은 펩신과 멤버, 키모신, 일부 카뎁신 D, 및 레닌; 특정 진균성 단백질가수분해효소(페니실로펩신, 리조퍼스펩신, 엔도티아펩신); 및 레트로펩신과 같은 바이러스성 단백질가수분해효소); 및 메탈로프로테인아제(metalloproteinases)(서몰리신, 네프릴리신, 알라닐 아미노펩타다아제 및 아스타신을 포함)와 같은 어느 그룹의 프로테아제일 수 있다.
신장 질병에서, 여과된 단백질의 단편화 공정이 저해된다. 단편의 수는 감소되고 단편의 크기는 증가한다(도 19). 이는 리소좀 효소에 의한 절단지점이 적어지는 사실에 기인한다. 따라서, 그 크기 및 아미노산 서열에 있어서 단편 프로파일은 알부민 혹은 면역글로블린과 같은 어느 특정 여과 단백질에 대하여 정상 신장에서 획득된 것과 상당히 다르다. 단편화의 저해 정도는 그 질병의 심각도에 따라 달라질 것이다. 질병이 진전됨에 따라 단편화 정도는 도 A에 나타낸 바와 같이 감소될 것이다.
미국 특허 제 5,246,835에는 사람 소변에서 알부민의 단편을 검출함으로써신장 질병을 진단하는 방법이 개시되어 있다. 상기 '835 특허에는 단편이 혈장으로부터 유래되고 신장에 의해 그대로 여과되고 최종적으로 방출되는 것을 기술하고 있다. '835 특허에서 소변의 단편을 검출하는 방법은 통상적인 알부민 항체에 대한 친화 결합의 이용을 포함한다. 본 발명의 방법과는 대조적으로, '835 특허의 방법에서는 당뇨병에서 알부민 단편의 증가된 검출이 있다. 본 발명에서, 당뇨병성 신장병의 진단은 단편의 수가 증가하는 경우 일어날 수 있다. 본 발명에서 조사된 알부민 단편은 알부민 항체에 의해 검출될 필요가 없다.
'835 특허의 방법과 달리, 본 발명의 일 구체화는 환자로부터 소변을 취하는 단계, HPLC(일차원 또는 이차원 또는 삼차원 전기영동 및/또는 크로마토그래피)에 의해 모든 단편을 분리하는 단계; 및 그 다음 상기 단편을 질량 분광계로 크기를 측정한 다음 아미노산 시퀀싱을 이용하여 펩타이드 서열 및 펩타이드 절단일 일어난 부위를 검출하는 단계이다.
단백질 단편은 이에 한정하는 것은 아니나, 크로마토그래피, 전기영동 및 침강, 혹은 이들의 조합을 포함하는 이 기술분야에 잘-알려진 여러가지 방법(Karger BL. Hancock WS(eds)High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Vol. 270, 1996, Academic Press, San Diego, California, USA; Karger BL, Hancock WS(eds.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part B Applications in Methods in Enzymology, Vol. 271, 1996. Academic Press, San Diego, California, USA; 또는 Harding SE, Rowe, AJ, Horton JC(eds.)AnalyticalUltracentrifugation in biochemistry and Polymer Science.1992, Royal Soc. Chemistry, Cambrige, UK)에 의해 검출 및 분리될 수 있다.
전기영동 방법은 이에 한정하는 것은 아니지만 이동-경계 전기영동, 영역 전기영동 및 등전점 집중을 포함한다.
크로마토그래피 방법은 이에 한정하는 것은 아니지만 분할 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피, 박-층 크로마토그래피, 가스-액체 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토크래피를 포함한다. 바람직하게, 상기 방법은 사이징 겔 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피이다. 보다 바람직하게, 상기 방법은 HPLC 컬럼을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피이다.
HPLC는 단편화 프로파일을 생성하는데 바람직하다. HPLC에서의 단편화 프로파일은 다수의 단편 종을 나타내는 일련의 피크에 의해 특성화된다.
변형된 알부민 혹은 비변형된 알부민을 검출하는 HPLC는 Zorbax 300 SB-CB(4.6mm × 150mm)와 같은 소수성 컬럼일 수 있다. 50㎕ 시료 루프가 이용될 수 있다. 알부민 및 그 파괴 생성물을 검출하는 HPLC에 적절한 용출 용매는 아세토니트릴 용매와 같은 표준 용출 용매를 포함한다. 바람직하게 물/1% 트리플루오로 아세트산(TFA)의 버퍼, 그 다음 60% 아세토니트릴/0.09% TFA의 버퍼가 사용될 수 있다. 60% 아세토니트릴/0.09% TFA의 0내지 100%의 구배가 적절한 것으로 발견되었다.
소수성 컬럼에 대한 적절한 HPLC 조건은 다음과 같다:
용매 A H2O, 1% 트리플루오로 아세트산
용매 B 60% 아세토니트릴, 0.09% TFA
용매 A2 99.96>00.00:49.58분
압력 9.014Mpascalls(~1100psi)
용매 B2 0.04>100.0:49.58분
압력 7.154Mpascalls
HPLC에 사용된 파장은 약 214nm일 수 있다.
알부민에 대하여, 변형된 알부민은 39-44분 사이에 용출될 수 있다(도 5). 알부민 단편은 상당히 보다 이른 주로 29분미만에서 용출될 수 있다.
정의
"단편화된 단백질 또는 단편 알부민"은 신장 통과도중 일어나는 화학적, 효소적 혹은 물리적 파괴후인 사구체 후 파괴 생성물을 포함한다. 이러한 성분은 감소된 크기를 가지며 그리고/또는 변화된 소수성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 "본래 알부민, 변형된 알부민, 또는 변형된 형태의 알부민"은 고유 알부민과 유사한 크기 및 구조 특성을 갖는 화합물을 의미하며, 여기서 그 아미노산 서열은 실질적으로 고유 알부민과 동일하다. 이는 바람직하게 여과된 본래 단백질이다. 이는 고-압 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 고유 알부민과 동일한 지점에서 혹은 그 근처에서 용출된다(도 5). 그러나, 그 구조는 소수의 효소 매개 변형 또는 그 기본 구조의 첨가에 의해 생화학적으로 변형되거나 그리고/또는 통상적으로 사용되는 항-알부민 항체에 의해 검출을 빠져나갈 수 있는 삼차원 구조의 변화를 통해 물리적으로 변형된다. 생화학적 변형은 엔도- 혹은 엑소- 펩타이드와 같은 효소에 의해 이루어질 수 있다. 알부민의 3D 구조는 몇몇 방식으로 변화될 수 있다. 리간드가 상기 알부민에 결합될 수 있으며, 또는 이는 이들의 어느 조합일 수 있다. 본 발명의 방법으로 검출된 변형 알부민은 이용가능한 항체를 이용한 현재의 어느 통상적인 방사성면역측정법에 의해 검출되지않으며 하나의 단편이 아니다.
통상적인 항-알부민 항체는 면역화학물의 어느 납품업자로부터 구입될 수 있다. 예를들어, 액상 전 혈청, 동결건조된 분획물, 액상 IgG 분획물 및 액상 복수 유체 형태의 모노클로날 항체 뿐만 아니라 모노클로날 항체 카타로그 번호 A6684(클론 번호 HSA-11), 및 A2672(클론 번호 HSA-9)는 Sigma, St. Louis, MO(1994 Sigma-Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents 카타로그에서 면역화학물 섹션 p1151-1152)로 부터 얻어질 수 있다.
본 명세서에 사용된, 본래/변형된 알부민은 실질적으로 전-장(full-length), 단편화된, 화학적으로 변형된, 또는 물리적으로 변형된 알부민을 포함한다. 본 명세서에 사용된, 본래/변형된 알부민은 전-장 알부민보다 분자량이 작거나, 같거나 혹은 크며 그리고 크로마토그래피, 바람직하게는 HPLC, 그리고 가장 바람직하게는 소수성 HPLC와 같은 분리 매체에서 고유 알부민 포지션에서 혹은 근처에서 용출되는 알부민을 의미한다. 본 명세서에 사용된, 단편화된 알부민은 통상적인 항-알부민 항체에 의해 검출되지 않으며 그 존재는 신장 질병 및/또는 질병의 신장 합병증의 초기 단계 진단시 검출되는 알부민의 단편을 가리킨다. 본래/변형된 알부민 존재의 검출은 신장 질병에 대한 성향의 표지이다.
본 명세서에 사용된 "본래 단백질, 변형된 단백질 또는 변형된 형태의 단백질"은 통상적인 방사성면역측정에 의해 검출불가능한 실질적으로 전-장 단백질의 형태를 포함한다. 상기 단백질은 이에 한정하는 것은 아니나 알부민, 글로블린(α-글로블린(α1-글로블린, α2-글로블린), β-글로블린, γ-글로블린), 유글로블린(euglobulin), 슈도글로블린 I 및 II, 피브리노겐, α1산 글리코프로테인(오르소뮤코이드), α1글리코프로테인, α1리포프로테인, 세룰로플라스민, α219S 글리코프로테인, β1트랜스페린, β1리포프로테인, 면역글로블린 A, E, G 및 M, 양고추냉이 페록시다아제, 락테이트 디하이드로게나아제, 글루코즈 옥시다아제, 미오글리블린, 리소자임, 단백질 호르몬, 성장 호르몬, 인슐린 또는 파라티로이드 호르몬을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "신장 질병"은 신장의 어느 기능장애를 포함한다. 신장 질병은 소변내에서 본래 혹은 변형된 알부민의 존재에 의해 확인될 수 있다. 바람직하게, 신장 질병의 초기 진단은 소변에서 변형된 단백질의 존재를 검출하거나 혹은 소변에서 시간에 걸친 변형된 단백질의 증가를 검출함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 "저 리소솜 활성"은 정상 개체에서 단백질을 리소좀으로수송하는 정상 수준의 리소좀 활성 및/또는 리소좀 기구와 비교한 것이다. 본래 단백질이 정상적인 저 수준보다 높은 양으로 방출되는 것과 같이 단편 단백질에 대한 리소좀의 활성이 불충분한 것이다.
본 명세서에 사용된 "리소좀-활성 화합물"은 리소좀의 재활성에 유익한 화합물을 가리킨다. 상기 화합물은 리소좀에 직접 혹은 간접적으로 작용하여 리소좀 기능을 활성화시킨다. 이러한 화합물은 이에 한정하는 것은 아니지만 항암 화합물, 항증식 화합물, 파라세타몰, 비타민 A(레티노익 산) 혹은 레티놀의 유도체, 또는 TGF 베타를 중화하는 항체를 포함하는 화합물을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
"대알부민뇨증"은 개체가 통상적인 방사성면역측정(RIA)에 의해 측정시 소변에서 200㎍ 알부민/분 이상을 방출하는 조건이다.
"마이크로알부민뇨증"은 개체가 통상적인 방사성면역측정(RIA)에 의해 측정시 소변에서 최소 20㎍ 알부민/분 이상을 방출하는 조건이다. RIA 측정치는 15.6ng/ml으로 내려가며 6㎍/분 미만의 클리어런스를 갖는 정상자의 소변에서 알부민을 측정될 수 있다. 그러나, 알부민 방출이 20㎍/분을 초과하는 경우에는, 신장 질병의 치료가 제한되며 이 시점에서 완전한 회복이 어렵다.
본 명세서에 사용된 "마이크로알부민뇨성"은 알부민이 통상적인 RIA에 의해 측정시 최소 20㎍/분의 방출 속도로 소변에서 검출되는 경우의 조건이다.
본 명세서에 사용된 "고유" 및 "비변형된"은 유기체에서, 바람직하게 사람에서 자연적으로 발견되는 단백질을 기술하는 것으로 상호교환적으로 사용되며, 이는신사구체의 여과 공정에 의해 여과되지않은 것이다.
본 명세서에 사용된 "정상 개체"는 소변에서 발견되는 본래 단백질이 그 질병의 표지인 질병을 갖지않는 개체이다. 바람직하게, 상기 질병은 신장 질병이다.
"정상 수준의 리소좀 활성"은 질병에 걸리지않은 정상 개체의 신장에서 발견되는 리소좀 활성의 수준이다.
본 명세서에 사용된 "정상알부민뇨성"은 알부민이 소변으로 방출되며 RIA에 의해 검출되지않거나 혹은 20㎍/분 미만(RIA에 의해 검출시)이 방출되는 경우의 조건을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "질병에 대한 성향"은 변형된 알부민과 같은 변형된 단백질의 존재 및 방출 속도의 검출에 의해 판단되는 것과 같이, 질병이 개체에서 일으킬 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "단백뇨"는 소변에서 단백질, 일반적으로 알부민 형태의, 물에 용해가능하며 열에 의해 응집될 수 있는 단백질의 존재를 의미한다. 이와 관련된 "특정 단백뇨"는 소변에서 특정 단백질의 존재를 가리킨다.
본 명세서에 사용된 "방사성면역측정" 은 방사성 표지된 특정 항체 혹은 항원을 이용한 물질의 검출 및 측정 방법을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "리소좀의 재활성화"는 바람직하게 단백질, 특히 알부민의 파괴가 활성화된 상태의 리소좀에 비하여 증가되도록 하는 리소좀 활성의 활성화를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "회복"은 회복되어지는 성분이 이전 기능에 비하여 향상된 기능을 갖도록 완전히 또는 부분적으로 회복되는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "본래 및 본래의 변형된 단백질의 합"은 생물학적 시료내에 존재하는 본래 단백질과 본래의 변형된 단백질의 총 량을 가리킨다.
본 명세서에 사용된 "총 단백질"은 소변으로 방출되는 고유, 비변형된, 변형된 혹은 단편화된 형태로 존재하는 특정 여과 단백질을 가리킨다. 이는 통상적인 방사성측정 혹은 그 단백질을 검출하는 현재 이용가능한 통상적인 방법에 의해 검출되지않는 단백질을 포함한다. 바람직하게 상기 단백질은 알부민이다.
검출방법
소변 단백질 프로파일을 생성하고, 감응, 고-처리량 기술 즉, 플라이트(flight) 질량 분광계의 표면-증가된 레이져 탈착(desorption)/이온화(SELDI) ProteinChip?어레이-시간을 연구한 Hampel DJ et al., J. Am. Soc. Nephrol. 12(5): 1026~35(2001)의 방법을 사용하여 시험할 수 있다. Hampel et al.,은 소변의 단백질을 프로파일하는 기술 적용성을 시험하였으며, 방사선 대조(radiocontrast) 매질을 회수하는 환자를 위한 그 용도를 예시하고 있다. 시험 소변 단백질의 프로파일링(profiling)에서 SELDI의 정확성, 감도 및 재현성의 평가는 대조군으로서 이옥실란 혹은 하이퍼토닉 살린용액을 정맥투여 하기전 혹은 정맥투여한 후의 쥐로 시험하였다. 이옥실란을 쥐에 투여하면 다양한 중량의 풍부한 단백질이 변화된다. 그 후, 심장 카테터(catheterization)를 거친 환자의 소변 샘플을 얻었다. 심장 카테터 도중에 방사선 대조 매질을 주입하는 질병이 심하지 않은 환자의 경우에, 단백질 조성에서 섭동(perturbation)이 일어나지만, 6~12시간 후에 기준값으로 되돌아 간다. 특정 제한된 분자량을 갖는 단백질이 많이 변화되었다. 신장기능이 손상된 환자의 경우에, 이러한 변화는 6~12시간 내에 가역적이지 않았다. 주성분의 증명에 있어서, 단백질 중 하나는 β2-마이크로글로블린으로 확인되었다. 신장 합병증이 없는 환자의 경우에는, 광범위한 분자량을 갖는 단백질이 소변에 나타나거나 혹은 사라졌다.
또한 소변 단백질 프로파일을 생성하고 생물학적 샘플로부터 바로 펨토몰 수준으로 단백질을 분리, 검출 및 분석을 빠르게 수행하는 SELDI(표면-증가된 레이져 탈착/이온화)기술을 사용하는 상업적으로 이용가능한 Protein Chip?시스템(Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA)을 사용하여 시험할 수 있다. 각 알루미늄 칩은 샘플 적용을 위한 8개의 독립적인, 화학 처리된 스팟상에 함유되며; 이러한 셋업은 여러개의 샘플의 동시 분석을 용이하게 한다. 착색된 소수성 코팅은 스팟에 샘플을 보유하며 동시에 칩종류를 빠르게 확인하도록 한다. 일반적으로, ProteinChip?Array에 적용된 소량의 마이크로리터의 샘플을 ProteinChip?Reader를 이용하여 분석을 하기 위한 충분한 단백질을 얻는다.
보다 희석된 샘플의 경우에, ProteinChip?Bioprocessor는 최대 500㎕를 적용하여 사용될 수 있다. 단백질 샘플의 질량 측정은 샘플 결정화, 샘플 이온화, 진공튜브를 통한 플라이트, 및 이온화된 단백질의 검출에 의해 달성된다. ProteinChip?Array로부터 비-특정 결합된 단백질 및 다른 오염물을 헹군후에, 화학적 에너지 흡수 분자(Energy Absorbing Molecule)(EAM) 용액을 적용하고 몇분동안 칩상에 결정이 형성되도록 건조시킨다. 이러한 결정은 EAM 및 중요한 단백질을 함유한다. Protein Chip Array를 ProteinChip Reader에 삽입한 후, 레이져 빔을 샘플에 맞추고, 탈착 및 이온화를 위하여 EAM 결정에 매립된 단백질이 유발된다. 그 후, 방출된 이온은 이온 검출기를 향해 진공 튜브를 통해 "날라가도록(fly)" 하는 전기장의 가속화를 거친다. 마지막으로, 상기 이온화된 단백질을 검출하고 정확한 질량을 플라이트 시간(TOF)을 기준으로 측정한다.
V-8, 트립신 및 Lys-C와 같은 프로테아제는 도의 오른쪽에 나타낸 바와 같이 칩상의 프로테아제 소화에 의해 ProteinChip?Array에 결합된 정제 단백질의 펩타이트 맵의 생성에 사용될 수 있다. 결과 프래그먼트의 분자량은 확인을 위해 펩타이드 데이타베이스와 비교될 수 있다. 상기 방법은 1시간 미만으로 소요된다.
부가적으로, 나란히 배열된 12개의 ProteinChip Array는 96-웰 플래이트 풋프린트를 생성한다. ProteinChip Array 기술을 사용하는 일반적인 실험은 벤치에서 1~3시간의 작업 후 Protein Chip Reader를 이용한 자동화 샘플 분석이 요구된다. 이에 따라 전체 방법은 1일 오후내에 완료될 수 있다.
다른 방법
본 발명에 따라서, 처리되는 질병으로는 이에 제한하는 것은 아니나, 신장병(사구체 신염, 박테리아성 및 바이러스성 사구체 신염, IgA 신병증 및Henoch-Schonlein 증후군, 막성증식 사구체신염, 막성 신증, Sjogren's 증후군, 당병성 신증, 신증후군(미소변화형 질환(minimal change disease), 국소 사구체신염, 및 관계 질병), 급성 신장병, 급성 세뇨관 간질성 신염, 신우신염, GU로염 질환, 프리-클램시아(Pre-clampsia), 신장 이식편거부, 나병, 역류성 신병증, 결석증), 유전성 신장병(속질 담낭(medullary cystic), 속질 스폰지, 다담낭성 신장 질환(상염색체 우성 다담낭성 신장질환, 상염색체성 열성다담낭성 신장질환, 관상경화증), 비-Hippel-Lindau 질환, 가족성 가는 사구체 기저막 질환, 콜라겐 Ⅲ 사구체신염, 섬유증식증 사구체신염, Alport's 증후군, Fabry's 증후군, Nail-Patella 증후군, 선천성 요로 기형을 포함한다.
본 발명의 일견지에 있어서, 신장 질병 및/혹은 신장질병 합병증의 경향을 결정하거나 혹은 초기 진단하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 소변 샘플에서 알부민 함량의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 질병은 신장 질병일 수 있으나, 이를 신장 질병으로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 알부민은 소변에서 검출되는 단백질의 예로서만 사용된다. 환자의 알부민을 통상적인 RIA로 분석하는 경우, 정상 단백뇨증(normoalbuminuric) 환자 혹은 정상 개체는 젊은 사람의 경우 3~10㎍/min으로, 그리고 보다 나이가 많은 사람의 경우에는 그 이상으로 소변에 알부민을 가질 것으로 예상된다. 그러나, 또한 정상 단백뇨증 환자는 HPLC로 측정하는 경우 소변의 알부민 수준을 나타낸다. 본 발명자는 이러한 수준이 5㎍/min 정도일 수 있음을 발견하였다. 신장 질병이 진행됨에 따라, 본래의(intact)/개질된(modified) 알부민의 수준은 RIA로 측정된 바와 같이 20~200㎍/min정도로 미세단백뇨 수준이 증가될 것이다. 이는 HPLC에 의해 혹은 본래 알부민 및 본래의 개질된(intact modified) 알부민의 합을 측정하는 방법으로 결정되는 경우 보다 높을 것이다. 본래의/개질된 알부민의 증가를 모니터하여, 신장 질병의 초기 징후가 검출될 수 있다. 그러나, 이러한 수준은 항체가 특정한 에피토프를 검출하기 때문에 현재 상업적으로 이용가능한 항체를 사용한 방사선 면역측정과 같은 현재 이용가능한 방법으로 검출되지 않는다. 상기 알부민이 상기한 바와 같이 어떠한 방법으로 개질되는 경우, 상기 에피토프(epitope)는 분해되며, 이에 따라 검출가능하지 않은 개질된 알부민을 남길 수 있다.
당뇨 신장 질병을 갖는 것으로 예상되는 환자는 RIA방법과 같은 현재 이용가능한 방법에 의해 알부민을 검출하는 경우 10~15년 후까지 신장 변질의 징후가 나타나지 않을 것이다. 최소 20㎍/min의 소변 배출속도는 개체가 미세단백뇨 상태가 되는 경우 RIA에 의해 검출될 수 있다. 다시, 개질된 알부민의 배출을 관찰하여, 신장에서의 변화 및 신장 질병의 가능한 발병이 검출될 수 있다.
정상단백뇨증 대상 혹은 정상단백뇨증 당뇨환자는 여러해동안 RIA로 측정한 바와 같이 20㎍/min 미만의 낮은 알부민 배출속도를 갖도록 유지될 수 있다. 소변에서 알부민의 존재는 신장기능이 손상될 수 있는 징후이다. 일단 이러한 수준이 변화되기 시작하면, 치료를 시작할 수 있다.
정상개체에서 소량의 알부민이 소변에서 검출가능하다. 전체 여과된 알부민은 소변에서 프래그먼트된 알부민으로 주로 나타난다. 일부 알부민은 정상단백뇨증개체에서 검출될 수 있다. 그러나, 정상 단백뇨증 개체의 소변에서 알부민의 배출속도는 5㎍/min 정도일 수 있다. 일반적으로 이는 RIA로 검출가능한 수준이다.
본 발명의 개질된 단백질은 이에 제한하는 것은 아니나, 크로마토그래피, 전기이동 및 침전, 혹은 이들의 혼합을 포함하는 이 기술분야에 잘알려진 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 이는 본 발명에 참고문헌으로 편입된 Karger BL, Hancock WS(eds.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Vol. 270, 1996, Academic Press, San Diego, California, USA; Karger BL, Hancock WS(eds.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolcules. Part B Applications in Methods in Enzymology, Vol. 271, 1996, Academic Press, San Diego, California, USA; 혹은 Harding SE, Rowe, AJ, Horton JC(eds.) Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. 1992, Royal Soc. Chemistry, Cambridge, UK에 개시되어 있다.
상기 전기이동 방법으로는 이에 제한하는 것은 아니나, 이동-한계 전자이동(moving-boundary electrophoresis), 지역 전자이동 및 등전 접속(isoelectric focusing)을 포함한다.
상기 크로마토그래피 방법으로는 이에 제한하는 것은 아니나, 분할 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 종이 크로마토그래피, 박판 크로마토그래피, 가스-액체 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 바람직하게 상기 방법은정립 겔 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피이다. 보다 바람직하게, 상기 방법은 HPLC 컬럼을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피이다.
개질된 단백질은 또한 특정한 알부민 염료를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 방법은 Pegoraro et al., American Journal of Kidney Diseases 35(4): 739-744(April 2000)에 개시되고 있으며, 이는 본 발명에 참고문헌으로 편입되어 있다. 개질된 알부민 뿐만 아니라 전체 알부민은 개질된 알부민 및 전체 혹은 본래의 알부민의 합을 제공하는 이러한 염료 방법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 검출 방법은 소변의 알부민 성분을 초기 분리하여 혹은 초기 분리없이 사용할 수 있다. 일반적으로 이러한 염료는 분자량이 <10,000인 프래그먼트를 검출하지 않으나, 개질된 알부민은 검출될 것이다.
이러한 염료 검출 방법에 있어서, Albumin Blue 580과 같은 염료가 사용된다. 이러한 염료는 천연 비-형광성이나 본래의 알부민 뿐만 아니라 개질된 알부민에 결합에 의해 형광을 내지만 글로블린에는 결합하지 않는다. 따라서 글로블린은 비프랙션화된 소변에서 측정되도록 어세이와 간섭하지 않는다.
본 출원인은 통상적인 RIA에 의해 분석되는 경우 당뇨 중에서 정상 단백뇨증 당뇨 환자는 개질된 알부민 혹은 알부민의 프래그먼트가 거의 검출가능하지 않은 수준임을 발견하였다. 그러나, 상기 소변을 HPLC로 시험하는 경우, 개질된 알부민의 수준은 정상 개체에서 발견되는 것보다 훨씬 높은 것이다. 알부민의 차이는 본래의 혹은 개질된 형태로 모든 알부민(전체 알부민)을 적합하게 검출하는 통상적인 RIA's의 무력화에 기여할 수 있다. 이에 따라, HPLC는 프래그먼트 프로파일의 재생에 바람직하다. HPLC상의 프래그먼트 프로파일은 프래그먼트로 혹은 본래의 혹은 개질된 형태로 여러 종류의 알부민을 나타내는 연속 피크에 의해 특징화된다.
본 발명의 바람직한 견지에 있어서, 대상의 신장 질병의 경향 혹은 초기 진단의 측정방법은 대상이 미세단백뇨증(microalbuminuric)이 되기 전에 측정된다.
본 발명의 HPLC 방법으로 샘플의 알부민 함량을 측정하는 것은 통상적인 RIA에 의한 것과 상이한 결과를 제공할 수 있다. HPLC 기술에 있어서, 저수준의 알부민이 정상 개체에서 관찰된다. 개질된 알부민의 수준의 검출이 시작되고 그 수준이 증가되는 경우, 미세단백뇨증으로 진행된 다음 환자는 신장 질병 경향을 갖는 것으로 결정될 수 있다.
정상 개체에 있어서, 상기 HPLC 발생된 프래그먼트 프로파일은 온-길이(full-length)의 네이티브(native) 알부민이 용출되는 범위에서 피크가 없음으로 특징화된다. 대신, 다중 프래그먼트된 알부민이 검출가능하다. 순수한 단백질 생성물(개질되지 않은)은 필수적으로 단일 피크를 생성한다. 예를 들어, 소수성 HPLC를 사용하여, 알부민이 39~44분의 범위에서 용출되는 것으로 관찰된다(도 5). 이에 따라, 정상 개체는 신장 질병이 없는 혹은 신장질병의 경향이 없는 명확한 프래그먼트 프로파일을 제공할 것이다. 그러나, 신장 질병이 진행됨에 따라, 먼저 개질된 알부민의 양이 증가한 다음, 네이티브 형태가 검출가능하다. 프레그먼트 프로라일이 변화하기 시작하며, 온-길이의 알부민 범위에서 보다 많은 생성물이 소변에서 보다 본래의/개질된 알부민의 추가적인 스파이크 혹은 확장된 피크로서 명확하다.
소변 샘플의 HPLC 발생된 프래그먼트 프로파일에서, 상기 개질된 알부민은 네이티브 알부민이 용출되는 범위에서 나타날 수 있으나 개질된 알부민의 여러 형태의 존재를 표시하는 다중 피크로서 나타날 수 있다.
보다 바람직한 구현에 있어서, 신장 질병의 경향은 개질된 알부민의 존재를 측정하거나 혹은 최소 하나의 개질된 알부민 종류를 확인하여 측정될 수 있다. 이는 HPLC 프로파일로 특정 피크의 존재에 의해 결정되거나 혹은 확인될 수 있으며, 바람직하게 상기 피크는 네이티브 알부민의 용출 위치에 상응하는 위치의 범위내에 있다.
신장 질병의 경향을 측정하는 방법은 어떠한 개체에 적용가능하다. 신장 질병은 박테리아 감염, 알러지, 선천성 결함, 담석, 종양, 화학물 혹은 당뇨를 포함하는 여러 요인에 의해 유발될 수 있다. 바람직하게, 상기 방법은 신장질병으로 진행될 수 있는 당뇨 환자의 신장 질병 경향을 측정하는데 적용가능한 것이다. 바람직하게, 상기 개체는 정상단백뇨증 당뇨이다. 그러나, 정상 개체는 소변에서 본래의 혹은 개질된 알부민의 증가된 수준을 측정하여 질병의 경향을 모니터할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 개시된 바와 같이 비-항체 분리 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 개질된 단백질을 위한 특정 항체는 개질된 단백질 존재의 검출에 또한 사용될 수 있다.
개질된 단백질의 항체는 다음 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 상기 방법은 실시예의 방법에 의해 알부민에 대해 개시하고 있으며, 이는 소변의 어떠한 다른단백질에 대한 항체 생성에 쉽게 적용될 수 있다. 상기 방법으로 개질된 알부민 분자가 예를 들어, 신장 합병증으로 진행되는 당뇨 환자의 확인에 가장 민감한 마커임을 발견하였다.
개질된 알부민은 예비 HPLC에 의한 것과 같이 개질된 알부민 분자의 양적인 분리를 수행함으로써 특징화된다. 개질된 단백질은 글리케이션(glycation)과 같은 리간드 결합을 분석한다. 후속적으로 개체 개질된 단백질의 아미노산 시퀀스는 본 발명에 참고문헌으로 편입되어 있는 방법으로 질량 분광법에 의해 측정되며, 이는 Karger BL, Hancock WS(eds.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Vol. 270, 1996, Academic Press, San Diego, California, USA; 혹은 Karger BL, Hancock WS(eds.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part B Applications in Methods in Enzymology, Vol. 271, 1996, Academic Press, San Diego, California, USA에 개시되어 있다. 바람직한 구현에 있어서, 약 3~4개의 개질된 알부민 종류가 있을 수 있다.
개질된 알부민에 대한 항체 발생방법은 예를 들어, 신장 합병증으로 진행되는 당뇨 환자로 예상되는 개질된 알부민의 진단 면역측정을 개발하는 것이다. 이를 달성하기 위하여, 충분한 양의 개질된 알부민을 HPLC에 의해 준비한다. 항체는 우수한 적정농도를 발생하는 토끼와 같은 동물에 개질된 알부민의 후속적으로 주입하여 생성되며, 상기 항체는 본 발명에 편입된, Goding JW. Monoclonal Antibodies; Principles and Practice. Production and Application of Monoclonal Antibodiesin Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 2nd Edition 1986. Academic Press, London,UK; 혹은 Johnstone A, Thorpe R, Immunochemistry in Practice, 3rd edition 1996, Blackwell Science Ltd. Oxford, UK에 개시되어 있다. 상기 얻어진 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 혹은 모노클로날(monoclonal) 항체일 수 있다.
바람직하게, 최소 하나의 개질된 알부민 종류를 분리하여 신장 질병 경향의 측정에 사용을 위해 확인된다. 상기 분리된 종류는 면역 측정법에서 사용을 위한 항체의 발생에 사용될 수 있다. 항체는 효소, 방사선활성, 형광형 혹은 화학발광 라벨로 표시될 수 있다. 검출 방법으로는 이에 제한하는 것은 아니나, 방사선 면역측정, 면역방사선 측정법, 형광 면역측정법, 효소 링크된 면역측정법 및 단백질 A면역측정법을 포함할 수 있다. 어세이는 본 발명에 참고문헌으로 편입된, Goding JW, Monoclonical Antibodies; Principles and Practice. Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology. 2nd Edition 1986, Academic Press, London, UK; Johnstone A, Thrope R, Immunochemistry in Practice, 3rd edition 1996, Blackwell Science Ltd, Oxford, UK; 혹은 Price CP, Newman DJ(eds.) Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Edition, 1997 Stockton Press, New York, NY, USA에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 필요에 따라 샘플에서 양적으로 혹은 비-양적으로 개질된 알부민과 같은 개질된 단백질의 유무를 빠르고 정확하게 측정하는 물품 혹은 키트를 제공하는 것이다. 키트의 각 성분은 그 고유의 적합한 용기에 독립적으로 포장될 수 있다. 독립적인 용기는 또한 함량을 확인하는 방법으로 식별할 수 있다. 또한, 독립적으로 포장된 성분은 모든 원하는 성분을 유지할 수 있는 보다 큰 용기에 위치시킬 수 있다. 키트와 관련된 키트의 사용방법을 설명할 수 있다. 이러한 지시가 키트에 쓰여져 있거나 혹은 부착될 수 있다.
본 발명은 또한
(a)질병을 치료할 것으로 예상되는 약품을 인간에게 투여하는 단계;
(b)상기 인간으로부터 소변 샘플을 얻는 단계; 및
(c)상기 샘플에서 단백질의 개질된 형태를 어세이하는 단계
를 포함하며, 이 때, 소변에서 개질된 형태의 단백질의 존재 혹은 존재의 결핍 혹은 시간에 따른 개질된 형태의 단백질의 감소량은 상기 약품이 질병의 치료제임을 나타내는 신장질병 및/혹은 신장질병 합병증의 치료제를 측정하는 방법에 관한 것이다. 상기 치료제는 리소좀의 직접적인 혹은 간접적인 활성화에 작용할 수 있는 리소좀 활성화제일 수 있으며, 이에 따라 후-사구체 여과된 단백질을 소화하는 리소좀을 유발하며, 이는 신장이 건강함을 나타내는 것이다.
단백질을 리소좀으로 트래피킹하는 방법은 당뇨의 단백뇨증 메카니즘에 역할을 한다. 트래피킹(trafficking)에 포함되는 세포내 분자는 단백질 키나아제 C(PKC)이다. 약제 혹은 약품은 리소좀의 트래피킹을 활성화하거나 혹은 PKC를 억제하도록 배합될 수 있는 것으로 여겨진다.
따라서, 본 발명의 일견지에 있어서, 리소좀의 재활성화에 사용되는 리소좀-활성화 화합물 및 리소좀 혹은 리소좀과 떨어진 생성물로 기질을 배치하는 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 리소좀-활성화 화합물 및 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 있어서 유효량의 리소좀-활성 화합물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 신장 질병의 예방 혹은 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 있어서,
(a)화합물을 리소좀에 노출시키는 단계 및 활성화되는 경우 변화된 활성을 갖는 리소좀을 활성화할 수 있는 상기 화합물을 어세이하는 단계;
(b)낮은 리소좀 활성을 갖는 신장조직에서 실질적으로 정상 수준으로 세포질 프로세스가 회복되도록 어세이하는 단계; 및/혹은
(c)낮은 리소좀 활성을 갖는 신장 조직에서 실질적으로 정상 수준으로 조직 전도(turnover)를 회복하도록 어세이하는 단계
를 포함하는 리소좀을 활성화할 수 있는 화합물 혹은 리소좀 혹은 리소좀에서 떨어진 생성물로 기질을 향하도록 하는 방법을 확인하는 여러개의 화합물의 스크린 방법이 제공된다.
리소좀은 신장에서 단백질 특히, 알부민의 분해와 관련될 수 있다. 미세단백뇨증의 경우에, 상당한 양의 알부민이 리소좀의 비활성화로 인해 리소좀 분해를 피한다. 리소좀의 분해(breakdown)의 복구(restoration)로 세포질 조작 및 조직 전복의 신장에서 균형을 회복할 수 있다.
리소좀-활성화 화합물은 리소좀에 직접적으로 혹은 간접적으로 작용하는 화합물일 수 있다. 간접적으로 작용함으로써, 상기 화합물은 성분에 작용할 수 있으며, 리소좀의 활성에 영향을 미친다. 결과적으로 리소좀이 활성화되며, 이에 따라 단백질의 분해가 증가된다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 리소좀 활성화 화합물 및 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 생리학적으로 수용가능하거나 혹은 약제학적으로 수용가능한 조성물일 수 있다. 그러나, 리소좀 활성화 화합물을 안정하게 회복시키는 조성물일 수 있다. 상기 조성물이 약제학적으로 수용가능한 조성물인 경우에, 이는 신장 질병의 예방 및 치료방법에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 유효량의 리소좀 활성화 화합물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 신장 질병의 예방 혹은 치료방법이 제공된다.
상기 개시된 바와 같이, 상기 리소좀-활성화 화합물은 세포질 조작 및 조직 전복이 완전히 혹은 부분적으로 회복되며, 이에 따라 부분적으로 혹은 완전히 신장이 회복되도록 리소좀의 재활성화에 의해 작용할 수 있다. 어떠한 경우에, 리소좀 활성 화합물을 신장 질병을 갖는 동물에 투여하여 리소좀 활성을 완전히 혹은 부분적으로 회복할 수 있다.
투여방법은 경구 혹은 비경구일 수 있다. 정제, 캡슐, 분말, 시럽등이 경구투여일 수 있다. 비경구투여로는 정맥주사, 근육내, 피하, 혹은 복막내 경로를 포함할 수 있다.
바람직하게 리소좀의 변화된 활성은 알부민 분해가 증가되도록 리소좀의 활성을 증가시키는 변화이다. 리소좀의 활성화 뿐만 아니라 세포질 조작(cellular process) 및/혹은 조직 전복의 개선은 가장 바람직한 리소좀 활성화 화합물의 특징이다. 바람직하게, 신장 기능을 회복하는 리소좀 활성화 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 견지에 있어서,
(a)소변 샘플에서 본래의 및 개질된 본래의 알부민 함량의 양을 측정하는 단계;
(b)통상적인 RIA 방법에 의해 검출가능하도록 개질된 소변의 본래의(intact) 알부민의 양 변화를 측정하는 단계(이 때, 상기 변화는 신장 질병의 경향을 표시하는 것이다); 및
(c)변화가 측정된 경우 동물의 신장질병을 치료하는 단계
를 포함하는 대상의 신장질병의 예방방법이 제공된다.
이하 실시예로서 본 발명을 설명하고자 하며, 이로써 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 인간혈청 알부민(HSA)의 크기배제 크로마토그래피
소변의 알부민 분포를 분석하는데 정상의, 건강한 지원자의 소변을 사용하였다.
3H[HSA](Human Serum Albumin)을 건강한 지원자에게 주입하고 소변 및 혈장을 수집하여 G-100 컬럼을 사용하는 크기배제 크로마토그래피로 분석하였다. 상기 컬럼을 4℃에서 20ml/hr의 속도로 PBS(pH=7.4)로 용리하였다. 컬럼의 공극 부피(Vo)는 블루 덱스트란 T-2000으로 측정하고 전체 부피는 삼중수소수로 측정하였다.
3중수소 방사능을 5ml의 섬광과 함께 1ml의 수성 샘플에서 측정하고 Wallac 1410 액체 섬광 계수기(Wallac Turku, Finland)로 측정하였다.
도 2는 소변 및 혈장의 알부민 분포를 나타낸다.
실시예 2: 정상의 건강한 지원자 및 당뇨 환자의 알부민 배출
실시예 1에서 사용된3H[HSA]를 정상의 건강한 지원자 및 당뇨 환자에게 주입하였다. 소변 샘플을 수집하고3H[HSA]를 실시예 1과 같이 측정하였다.
정상의 건강한 지원자(도 3)는 실시예 1에서 수행된 바와 같이 크기배제 크로마토그래피에서 알부민의 프래그먼트 배출을 나타낸다.
당뇨 환자(도 4)는 크기배제 크로마토그래피에서 실질적으로 온-길이 및 프래그먼트된 알부민의 존재를 나타낸다. 그러나, 이러한 방법으로 검출되는 알부민의 배출속도는 5㎍/min(대조군) 및 1457㎍/min(당뇨) 정도였다.
실시예 3: 본래의 알부민 및 본래의/개질된 알부민을 HPLC로 측정
정상의 건강한 지원자, 정상단백뇨증 당뇨환자 및 거대단백뇨증(macroalbuminuric) 환자로부터 소변샘플을 수집하였다. 50ml의 소변 표본 용기에서 수집된 소변의 중간 스트림을 수집하였다. 사용할 때까지 소변을 냉각하였다. HPLC 분석전에 소변을 5000g으로 원심분리하였다.
샘플을 소수성 컬럼 Zorbax 300 SB-CB(4.6mmx 150mm)를 사용하여 HPLC로 분석하였다. 50㎕ 샘플 루프를 사용하였다.
샘플은 다음 조건을 사용하여 컬럼에서 용리하였다.
용매 A H2O, 1% 트리플루오로아세트산
용매 B 60% 아세토니트릴, 0.09% TFA
용매 A2 99.96>00.00:49.58min
압력 9.014Mpascalls(~1100psi)
용매 B2 0.04>100.0:49.58min
압력 7.154Mpascalls
214nm의 파장을 사용하였다.
실시예 4: 표준 기술에 의한 항체생성을 위한 개질된 알부틴의 정제
튜비티머(turbitimer)로 측정된 바와 같이 43.5mg/L의 본래의 알부민 농도를 갖는 미세단백뇨증 환자의 소변을 30kDa 막을 통하여 초기 여과하여 소변에서 저분자량(<30,000)의 단백질 프래그먼트로부터 개질된 알부민을 분리하였다. 여과로 보유된 물질은 튜비티머 어세이로 측정된 바와 같이 27.4mg/L의 본래의 알부민 수득율을 얻었다. 이러한 보유된 물질은 그 후, Sephadex G100으로 크기배제 크로마토그래피에 적용하였다. 상기 수집된 물질은 본래의 알부민과 함께 함께 용출되는 피크 프랙션이었다. 이 물질은 튜비티머에 의해 측정된 바와 같이 알부민이 15.2ml을 수득율로 얻었다. 이 물질을 그 후, 본래의 알부민 항체 컬럼으로 친화 크로마토그래피에 적용하였다. 이 컬럼은 통상적인 에피토프를 갖는 알부민에 결합될 것이다. 컬럼으로부터 용출된 물질의 수득율은 <6mg/L(튜비티머의 가장 낮은 감도)였다. 이는 친화컬럼에 결합되는 면역반응성 알부민으로 예상된다. 그 후, 상기 용출액을 역상 HPLC 크로마토그래피에 적용하여(상기한 바와 같이) 샘플의 면역-비활성 알부민의 양을 측정하였다. 정제된 개질 알부민의 30.91mg/L에 상응하는 1452 단위면적은 도 5에 개시된 바와 같다. 이러한 정제된 개질 알부민은 표준 방법에 의해 항체 생성에 사용될 수 있다.
결과
도 5는 알부민 단독의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 약 39~44분의 체류시간에서 용출되는 필수적인 단일 피크가 얻어졌다.
도 6에서는 약 39~44분에서의 구별되는 알부민 피크 뿐만 아니라 다른 혈장 단백질에 상응하는 피크를 나타내는 혈장의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 7은 소변 샘플에서 알부민 피크가 없는 정상의, 건강한 지원자의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 이러한 개체는 활성 리소좀에 의해 소변으로 배출된 알부민을 분해한다. 실질적인 프래그먼트된 생성물은 약 14.5분 미만의 체류시간에서 특별한종류가 현저함을 보여준다.
정상단백뇨증 당뇨환자(RIA로 측정한 바와 같이, 8.07㎍/min의 알부민 배출속도를 갖음)의 소변을 분석하는 경우(도 8), 약 39~44분의 체류시간에서 용출되는 소량의 개질된 알부민을 나타낸다. 반면에, 통상적인 시험은 소변 샘플에서 알부민이 <6mg/L로 존재하는 경우, 본 발명의 방법은 소변 샘플에서 실제 알부민의 함량이 26.7mg/L임을 나타내었다. 질병 치료는 개체에서 시작되어야 한다. 알부민-부생성물 혹은 프래그먼트된 알부민은 정상의 건강한 지원자에게서 나타난다.
정상 단백뇨증 당뇨환자(17.04㎍/min의 알부민 배출속도를 갖음)의 다른 소변 샘플을 분석하였다(도 9). RIA 시험은 이러한 환자의 소변에서 배출되는 알부민을 나타낸다. 그러나, HPLC(도 9)상에서, 알부민 혹은 개질된 알부민 피크는 약 39~44분의 체류시간에서 나타난다. 반면에 통상적인 시험은 소변 샘플에서 알부민이 <6mg/l로 존재하는 경우, 본 발명의 방법은 소변 샘플에 실제 알부민 함량이 81.3mg/l임을 나타낸다. 질병 치료는 개체에서 시작되어야 한다. 이러한 피크는 여러개의 피크형태를 나타내기 시작한다. 본래의 알부민에 상응하는 보다 작은 피크는 개질된 알부민이 39~44분에 피크를 나타낼 수 있음을 보여준다. 알부민 피크가 없는 정상의, 건강한 지원자의 프로파일과 비교하여 이러한 알부민 피크의 존재는 본래의/개질된 알부민의 양의 검출 가능한 수준에서의 변화를 보여준다. 이는 신장 질병 경향을 보일 수 있다.
정상단백뇨증 당뇨환자의 소변샘플(4.37㎍/min의 알부민 배출속도를 갖는)을 분석하고, HPLC 프로파일을 도 10에 나타낸다. 다시, 개질된 알부민은 여러개의 피크를 보이는 약 39~44분의 체류시간에서 검출되었다. 이 환자를 다시 RIA에 의한 정상 알부민을 다시 하였다. 반대로 통상의 시험은 소변 샘플에서 알부민이 <6mg/l로 존재함을 나타내며, 본 발명의 방법은 소변샘플에서 실제 알부민 함량이 491mg/l임을 보여주었다. 질병 치료는 개체에서 시작되어야 한다. 개질된 알부민 평가는 이러한 변화의 확인에 필요한 것이 분명하다. 이 환자는 신장 질병의 경향을 갖는 것으로 결정될 것이다. 신장 질병이 진행됨에 따라, 상기 개질된 알부민 피크는 증가되도록 유지될 것이다.
도 11에서는 거대단백뇨증 환자의 소변 샘플 분석을 보여주고 있다. 여러개의 피크를 보이는 약 39~44분의 체류시간에서 상당한 알부민 피크를 나타내었다. 환자의 알부민 함량은 1796mg/l였다. 각각의 치료가 진행된다.
본 발명의 방법으로 도 12~14에서 장기적인 연구에 의해 설명되는 바와 같이 신장병 경향의 초기분석이 결과된다. 도 12~14에서는 당뇨병의 ACE 억제제 치료가 본 발명의 개질된 알부민 검출방법이 사용된 후에 시작되는 경우를 보여준다. 본 발명의 방법을 사용하는 개질된 단백질의 검출은 통상적인 RIA를 사용하는 것보다 신장 질병의 발병 예상방법에 보다 효과적인 것이다.
실시예 5
도 16은 본래의 여과된 단백질이 정상 기능의 신장 및 질병을 갖는 신장에 의해 분해될 수 있는 방법을 설명하는 도식적인 다이아그램이다.
도 17은 30,000 분자량 절단 막을 통하여 여과된 알부민의 트립신 소화된 샘플의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 여과물은 2~30분 사이에 용출되는 여러개의 피크가 얻어진다.
도 18은 10~30분의 용출 범위에서 여러개의 프래그먼트를 나타내는 대조, 정상군의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 거대단백뇨증을 갖는 당뇨환자(분당 1457마이크로그램)의 HPLC 프로파일은 10~30분에서 상당히 상이한 프래그먼트 프로파일을 나타낸다.
도 19는 신장 질병을 갖는 대상의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 도 18과 비교하여, 여과된 단백질의 프래그먼트화 프로세스가 억제된다. 프래그먼트의 수는 감소되며 프래그먼트의 크기는 증가된다.
본 발명의 모든 참고문헌은 편입되어 있다.
마지막으로, 다양한 다른 개질 및/혹은 변경은 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 것으로 여겨진다.

Claims (16)

  1. (a) 대상자로부터 소변 시료를 얻는 단계;
    (b) 상기 소변 시료를 장치에 적재하여 소변 단백질의 단편화 프로파일(fragmentation profile)을 크레이트(crate)하는 단계;
    (c) 소변시료에서 상기 단백질을 단백질 가수분해적으로 절단하는 조건하에서 프로테아제로 환자의 소변 시료를 처리하는 단계;
    (d) 단백질 가수분해적으로 처리된 소변 시료를 장치에 적재하여 단백질 가수분해적으로 처리된 소변 단백질의 단편화 프로파일을 생성하는 단계;
    (e) 단계(c)와 단계(d)의 단편화 프로파일을 비교하는 단계(여기서 단백질 프로파일은 대상자 신장의 질병 상태의 표지가 됨)
    를 포함하는, 대상자에서 신장 질병 및/또는 질병의 신장 합병증을 진단하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 단편화 프로파일은 본래의 여과된 단백질로부터 유래된 특정 단편의 크기 및 서열에 대하여 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 단편화 프로파일은 효소 절단이 일어나는 단백질의 위치에 대하여 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 단편화 프로파일은 대조구 시료의 단백질 단편화 프로파일과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 장치는 크로마토그래피, 전기영동 또는 침강(sedimentation) 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 장치는 크로마토그래피, 전기영동 또는 침강 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 장치는 일차원 또는 2-차원 또는 3-차원 전기영동 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 장치는 HPLC 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
    [청구항 5]
    제 1항에 있어서, 상기 장치는 질량분석 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 나아가 펩타이드 서열을 분석하기위한 아미노산 시퀀싱 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 단계들은 주기적인 시간에 걸쳐 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 시간에 걸친 단편화 프로파일의 변화는 신장 질병의 초기 단계를 나타내주는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 질병은 신장병, 요붕증, 당뇨병 타입 I, 당뇨병 II, 신장 질병(사구체 신염, 세균 및 바이러스성 사구체신염, IgA 신장병 및 Henoch-Schonlein Purpura, 멤브라노프로리퍼러티브 사구체신염, 멤브레인성 신장질병, Sjogren 신드롬, 신증 증후군(최소 변화 질병, 집중 사구체경화증 및 관련 질병), 급성 신장 쇠약, 급성 세뇨관간질 신염, 신우신염, GU 트랙 염증 질병, 프리-클램프시아(Pre-clampsia), 신장성 그라프트 거부, 나병, 역류성 신장병, 신결석증), 일반적인 신장 질병(수질 낭성, 수질 해면, 다낭성 신장 질병(상염색체 우성 다낭성 신장 질병, 상염색체 열성 다낭성 신장 질병, 결절성 경화증), von Hippel-Lindau 질병, 가족성의 얇은-사구체 기저막 질병, 콜라겐 III 사구체병증, 피브로넥틴 사구체병증, Alport 신드롬, Fabry 질병, Nail-Patella 신드롬, 선천성 요도성 기형), 모노클로날 감마글로블린장애(다중 골수종, 아밀로이도시스 및 관련 질병), 페브릴 질병(가족성 지중해병 열병, HIV 감염-AIDS), 염증 질병(전신성 맥관염(결절성다발동맥염, Wegener 육아종증, 다발성동맥염, 과사성 및 초승달모양의 사구체염), 다발성근염-피부근염, 췌장염, 류마토이드 관절염, 전신성 파종상홍반성 루프스, 통풍), 혈관 질병(겸상적혈구 질병, 혈전성혈소판감소성자반증, 용혈성요독증후군, 급성 피질성 괴사, 신장성 혈전색전증), 외상성 및 외과(광범위한 상처, 화상, 복부 및 맥관 외과, 마취의 도입), 약(페니실린, 스테로이드) 및 약물 남용 악성 질병(표피(폐, 유방), 아데노카시노마(신장), 흑피증, 림프세망, 다중 골수종), 순환기 질병(심근 골굴절, 심장 질병, 말초 혈관 질병, 고혈압, 관동맥 심장 질병, 비-동맥경화성 심장혈관 질병, 동맥경화성 심장혈관 질병), 피부 질병(건선, 전신성 경화), 호흡기 질병(COPD, 폐쇄성 수면 무호흡, 고도에서 저호흡증) 및 내분비 질병(말단거대증, 진성 당뇨병, 병리 요붕증)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 알부민, 글로블린(α-글로블린(α1-글로블린, α2-글로블린), β-글로블린, γ-글로블린), 유글로블린(euglobulin), 슈도글로블린 I 및 II, 피브리노겐, α1산 글리코프로테인(오르소뮤코이드), α1글리코프로테인, α1리포프로테인, 세룰로플라스민, α219S 글리코프로테인, β1트랜스페린, β1리포프로테인, 면역글로블린 A, E, G 및 M, 양고추냉이 페록시다아제, 락테이트 디하이드로게나아제, 글루코즈 옥시다아제, 미오글리블린, 리소자임, 단백질 호르몬, 성장 호르몬, 인슐린 또는 파라티로이드 호르몬을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. (a) 대상자로부터 소변 시료를 얻는 단계;
    (b) 상기 소변 시료를 장치에 적재하여 소변 단백질의 단편화 프로파일을 크레이트(crate)하는 단계;
    (c) 소변시료에서 상기 단백질을 단백질 가수분해적으로 절단하는 조건하에서 프로테아제로 환자의 소변 시료를 처리하는 단계;
    (d) 단백질 가수분해적으로 처리된 소변 시료를 장치에 적재하여 단백질 가수분해적으로 처리된 소변 단백질의 단편화 프로파일을 생성하는 단계;
    (e) 단계(c)와 단계(d)의 단편화 프로파일을 비교하는 단계(여기서 단백질 프로파일은 대상자의 신장을 통한 단백질의 증가된 통과의 표지가 됨)
    를 포함하는, 대상자에서 비-신장성 질병을 진단하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 질병은 증가된 수준의 단백질이 순환되는 것을 일으키는 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 질병은 암을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10304106A1 (de) * 2003-01-31 2004-08-26 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Verfahren und Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines Protein- und/oder Peptidmusters einer Flüssigkeitsprobe, die dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wird
GB0316075D0 (en) * 2003-07-09 2003-08-13 Molecular Sensing Plc Protease detection assay
CA2554836A1 (en) 2004-02-05 2005-08-25 Medtronic, Inc. Methods and apparatus for identifying patients at risk for life threatening arrhythmias
US7608458B2 (en) 2004-02-05 2009-10-27 Medtronic, Inc. Identifying patients at risk for life threatening arrhythmias
US20060286602A1 (en) * 2004-05-10 2006-12-21 Harald Mischak Method and markers for the diagnosis of renal diseases
US8335652B2 (en) 2004-06-23 2012-12-18 Yougene Corp. Self-improving identification method
US8027791B2 (en) 2004-06-23 2011-09-27 Medtronic, Inc. Self-improving classification system
US20060024725A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Robert Hussa Oncofetal fibronectin as a marker for pregnancy-related indications
WO2006056037A1 (en) * 2004-09-21 2006-06-01 University Of Manitoba Method of detecting kidney dysfunction
GB0617429D0 (en) * 2006-09-05 2006-10-18 Electrophoretics Ltd Markers of renal transplant rejection and renal damage
DK2118666T3 (da) * 2007-03-07 2011-11-21 Mosaiques Diagnostics & Therap Fremgangsmåde til normalisering af koncentrationen af analytter i en urinprøve
EP1972940A1 (de) * 2007-03-14 2008-09-24 mosaiques diagnostics and therapeutics AG Verfahren und Marker zur Diagnose von Nierenerkrankungen
EP2153234A2 (en) * 2007-05-11 2010-02-17 The Institutes for Pharmaceutical Discovery, LLC Methods for early diagnosis of kidney disease
AU2008309605A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Polypeptide marker for the diagnosis of prostate cancer
EP2051078A1 (de) * 2007-10-19 2009-04-22 mosaiques diagnostics and therapeutics AG Verfahren und Marker zur Diagnose von Diabetes Mellitus
EP2255203A2 (de) * 2008-03-19 2010-12-01 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics AG Verfahren und marker zur diagnose von tubulären nierenschäden und -erkrankungen
KR101061009B1 (ko) * 2008-07-23 2011-09-01 경상대학교산학협력단 바이러스 진단 방법 및 시스템
KR20110073471A (ko) * 2008-08-28 2011-06-29 아스튜트 메디컬 인코포레이티드 신손상 및 신부전의 진단 및 예후를 위한 방법 및 조성물
EP2813848A3 (en) * 2008-08-29 2015-03-11 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2010031822A1 (de) * 2008-09-17 2010-03-25 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Nierenzellkarzinom
MX2011004174A (es) 2008-10-21 2011-09-27 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para diagnosis y prognosis de lesion renal e insuficiencia renal.
JP2012506538A (ja) * 2008-10-21 2012-03-15 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後のための方法および組成物
CN102264230B (zh) 2008-11-10 2014-12-10 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
CN103439510B (zh) * 2008-11-22 2016-09-14 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
WO2011017654A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2394166B1 (en) * 2009-02-06 2016-07-13 Astute Medical, Inc. Methods for diagnosis and prognosis of renal injury and failure
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
KR101077275B1 (ko) * 2009-05-07 2011-10-27 한국기초과학지원연구원 당단백질의 당쇄화를 이용한 암 진단 방법
CA2772336A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP2013510322A (ja) 2009-11-07 2013-03-21 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
JP2013510321A (ja) * 2009-11-07 2013-03-21 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
MX342967B (es) 2009-12-20 2016-10-19 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para la diagnosis y prognosis de lesion renal y falla renal.
JP2013519095A (ja) 2010-02-05 2013-05-23 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
JP5998057B2 (ja) 2010-02-26 2016-11-30 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断と予後のための方法と組成物
IN2012MN02812A (ko) 2010-06-23 2015-05-22 Astute Medical Inc
EP3339860A1 (en) 2010-06-23 2018-06-27 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CN102221588A (zh) * 2011-02-24 2011-10-19 中南大学 一种用高效液相色谱法快速测定尿中微量白蛋白的方法
EP2518512A1 (en) 2011-04-29 2012-10-31 Medizinische Universität Wien Method for indicating a renal disease in a patient by determining at least one protein in isolated HDL
WO2013086359A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CN104641229B (zh) * 2012-07-20 2017-07-25 新加坡科技研究局 预测肾近曲小管细胞毒性的体外试验
PT2946211T (pt) 2013-01-17 2018-06-04 Astute Medical Inc Processos e composições para o diagnóstico e o prognóstico de lesões renais e insuficiência renal
DE102013012023A1 (de) * 2013-07-19 2015-01-22 Merck Patent Gmbh Pigmentgemisch
JP6199828B2 (ja) * 2014-08-14 2017-09-20 藤森工業株式会社 表面保護フィルム、及びそれが貼合された光学部品
GB201415367D0 (en) * 2014-08-29 2014-10-15 Iles Raymond K And Docherty Suzanne M E And Abban Thomas And Naase Mahmoud And Iles Jason K Methods for detecting abnormalities in haemoglobin
CN105987945A (zh) * 2015-02-05 2016-10-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量糖蛋白上n-连唾液酸化糖链占有率的方法及其在肝癌标志物筛选中的应用
CN105784830A (zh) * 2016-04-06 2016-07-20 深圳市老年医学研究所 慢性肾小球肾炎肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
CN105891315A (zh) * 2016-04-06 2016-08-24 深圳市老年医学研究所 慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
CN109844526A (zh) 2016-06-06 2019-06-04 机敏医药股份有限公司 使用胰岛素样生长因子结合蛋白7和金属蛋白酶2的组织抑制剂管理急性肾损伤
WO2017212463A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Warszawski Uniwersytet Medyczny Methods for diagnosis, differentiation and monitoring using urine proteins as markers in iga nephropathy
CN117577321A (zh) 2017-08-08 2024-02-20 费森尤斯医疗保健控股公司 用于治疗和评估慢性肾脏疾病的进程的系统和方法
US20230137242A1 (en) 2020-01-31 2023-05-04 Warszawski Uniwersytet Medyczny Method of screening for a chronic kidney disease or glomerulopathy method of monitoring a response to treatment of a chronic kidney disease or glomerulopathy in a subject and a method of treatment of a chronic kidney disease or glomerulopathy
AU2020425858A1 (en) 2020-01-31 2022-12-15 Instytut Biochemii I Biofizyki Pan Method of differentiating of a chronic kidney disease or glomerulopathy, method of monitoring a response to treatment of a chronic kidney disease or glomerulopathy in a subject and a method of treatment of a chronic kidney disease or glomerulopathy
RU2759237C1 (ru) * 2021-02-16 2021-11-11 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования уратного нефролитиаза
RU2762139C1 (ru) * 2021-04-16 2021-12-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Средство для лечения уратного нефролитиаза
RU2768464C1 (ru) * 2021-04-27 2022-03-24 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики мембранозной нефропатии как одной из форм хронического гломерулонефрита
CN113552369B (zh) * 2021-07-23 2023-10-20 江苏省中医院 蛋白标志物联合用于2型糖尿病、2型糖尿病肾病的诊断的用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69221666T2 (de) * 1991-05-24 1998-01-15 Wakamoto Pharma Co Ltd Verfahren zur Diagnose von Nierenkrankheiten durch Nachweisung von Albuminfragmenten
US5534431A (en) * 1994-02-28 1996-07-09 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Hybridomas and monoclonal antibodies specific for unique determinants of nephropathy-related immunoglobulin G and complexes thereof
US5908925A (en) * 1996-06-27 1999-06-01 Exocell, Inc. Genetically engineered immunoglobulins with specificity for glycated albumin
AUPP784398A0 (en) * 1998-12-21 1999-01-21 Monash University Kidney disease detection and treatment
DK1141728T3 (da) * 1998-12-21 2008-02-04 Univ Monash Påvisning af nyresygdom og behandling deraf

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Publication number Publication date
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