DE60119580T2

DE60119580T2 - Schnelle und quantitative proteomanalyse und damit zusammenhängende verfahren

Info

Publication number: DE60119580T2
Application number: DE60119580T
Authority: DE
Inventors: R. David Seattle GOODLETT; H. Rudolf Mercer Island AEBERSOLD
Original assignee: University of Washington; Institute for Systems Biology
Current assignee: University of Washington; Institute for Systems Biology
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: ATE475092T1; ATE326011T1; EP1710577B1; ATE521890T1; EP1710577A1; EP1356281A1; DE60119580D1; JP4048115B2; JP4672614B2; JP2006317468A; EP1356281A4; JP4672615B2; CA2433281C; EP1739424B1; JP2004528533A; JP2006349695A; WO2002052259A1; EP1739424A1; DE60142650D1; CA2433281A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren der Massenspektrometrie. Die bevorzugte Ausführungsform betrifft im Allgemeinen die Proteomanalyse und, genauer gesagt, Verfahren zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von einem Protein oder Proteinen, die in einer Mischung aus Proteinen enthalten sind.
Der klassische biochemische Ansatz zur Untersuchung biologischer Vorgänge basiert auf der Reinigung bis zur Homogenität mittels Sequenzfraktionierung und Assay-Zyklen spezifischer Aktivitäten, die einen Vorgang darstellen, der ausführlichen Struktur-, Funktions- und Regelungsanalyse jeder isolierten Komponente und der Wiederherstellung des Vorgangs anhand der isolierten Komponenten. Das Humangenomprojekt und andere Genomsequenzprogramme veröffentlichen in schneller Folge die vollständigen Genomsequenzen bestimmter Arten und somit prinzipiell die Aminosäuresequenz jedes Proteins, das möglicherweise von dieser Art kodiert wird. Es ist nur zu erwarten, dass diese in der Geschichte der Biologie einmalige Informationsquelle traditionelle Forschungsmethoden verbessern und Fortschritte in von Grund auf verschiedenen Forschungsparadigmen katalysieren wird, wovon eines die Proteomforschung ist.
Die Arbeit mit der Sequenzanalyse des gesamten humanen Genoms sowie der Genome einer Anzahl anderer Arten war ausgesprochen erfolgreich. Die Genome zahlreicher mikrobieller Arten (TIGR Microbial Database; www.tigr.org) liegen vollständig vor und die Genome von über mehr als hundertzwanzig anderen mikrobiellen Arten werden gerade sequenziert. Ferner sind die komplexeren Genome von Eukaryoten, insbesondere diejenigen des genetisch gut beschriebenen einzelligen Organismus Saccharomyces cerevisiae und der mehrzelligen Arten Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster vollständig sequenziert. Außerdem wurde eine "vorläufige Sequenz" des Reisgenoms veröffentlicht und die Vervollständigung des Humangenoms und des Genoms von Arabidopsis steht kurz bevor. Trotz des Fehlens vollständiger Genomsequenzen wurden umfangreiche DNA-Sequenzdatenbanken frei verfügbar gemacht, einschließlich solcher, die mehr als 2,1 Millionen menschliche und mehr als 1,2 Millionen Exprimierte Sequenz Tags (EST) von Mäusen umfassen.
EST sind Schnipsel mit etwa 300 bis 500 zusammenhängenden Nukleotiden, die Gensequenzfragmente darstellen, welche durch eine systematische Sequenzanalyse in einem Durchlauf von Klonen in cDNA-Bibliotheken erzeugt werden. Gemessen am zeitlichen Maßstab der meisten biologischen Vorgänge, natürlich mit Ausnahme der Evolution, kann die genomische DNA-Sequenz als statisch betrachtet werden und somit stellt eine Genomsequenz-Datenbank eine Informationsquelle dar, die einer Bibliothek ähnlich ist. Intensive Anstrengungen werden unternommen, um einzelnen Sequenzen in Sequenzdatenbanken "Funktionen" zuzuweisen. Versucht wird dies mithilfe von Computeranalysen der linearen Sequenzmotive oder der Strukturmotive höherer Ordnung, die eine statistisch signifikante Ähnlichkeit einer Sequenz mit einer Familie von Sequenzen bekannter Funktion aufweisen, oder mithilfe von anderen Mitteln, wie einem Vergleich der artübergreifenden homologen Proteinfunktionen. Auch andere Verfahren wurden zur Bestimmung der Funktion einzelner Sequenzen verwendet, einschließlich experimenteller Verfahren, wie der Ausschaltung von Genen und der Unterdrückung der Genexpression unter Verwendung der antisense-Nukleotid-Technik, was zeitaufwändig und in einigen Fällen unzureichend sein kann, einem von der Sequenz kodierten Polypeptid eine biologische Funktion zuzuweisen.
Das Proteom ist als das von einem Genom exprimierte Proteinkomplement definiert. Diese etwas restriktive Definition unterstellt, dass das Proteom statisch ist. Tatsächlich ist das Proteom ausgesprochen dynamisch, da die Arten der exprimierten Proteine, deren Häufigkeit, Modifikationszustand und subzelluläre Stellen von dem physiologischen Zustand der Zelle oder des Gewebes abhängig sind. Aus diesem Grund kann das Proteom einen zellulären Zustand oder externe, von der Zelle angetroffene Bedingungen widerspiegeln und die Proteomanalyse kann als ein Assay des gesamten Genoms zur Differenzierung und Untersuchung zellulärer Zustände und zur Bestimmung der molekularen Mechanismen, die diese steuern, betrachtet werden. In Anbetracht der Tatsachen, dass das Proteom einer differenzierten Zelle aus schätzungsweise Tausenden bis Zehntausenden von differenzierten Proteinarten besteht, wobei der geschätzte dynamische Expressionsbereich mindestens 5 Größenordnungen beträgt, scheinen die Aussichten für eine Proteomanalyse eher entmutigend. Dank der Verfügbarkeit von DNA-Datenbanken, die die Sequenz jedes potenziell exprimierten Proteins enthalten, sowie der schnellen Fortschritte bei Technologien, mit denen sich Proteine, die tatsächlich exprimiert werden, identifizieren lassen, ist die Proteomik heute jedoch eine realistische Möglichkeit. Die Massenspektrometrie ist einer der wesentlichen Grundpfeiler der aktuellen Proteomiktechnik.
Die quantitative Proteomik ist die systematische Analyse aller Proteine, die von einer Zelle oder einem Gewebe exprimiert werden, bezüglich deren Quantität und Identität. Die Proteine, die von einer Zelle, einem Gewebe, einer biologischen Flüssigkeit oder einem Proteinkomplex zu jedem Zeitpunkt exprimiert werden, stellen eine präzise Definition des jeweiligen Zustands der Zelle oder des Gewebes dar. Die quantitativen und qualitativen Unterschiede von Proteinprofilen desselben Zelltyps in unterschiedlichen Zuständen können zum Verständnis der Übergänge zwischen den jeweiligen Zuständen beitragen. Traditionell wurde die Proteomanalyse mit einer Kombination aus hochauflösender Gelelektrophorese, insbesondere zweidimensionaler Gelelektrophorese, zur Trennung der Proteine und Massenspektrometrie zur Identifizierung von Proteinen durchgeführt. Dieser Ansatz ist sequenziell und Zeit raubend, aber noch wichtiger, er ist grundsätzlich beschränkt, da biologisch wichtige Proteinklassen im Wesentlichen nicht erfassbar sind.
WO 99/12040 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Zielpolypeptids unter Verwendung der Massenspektrometrie. Courchesne et al., Methods in Molecular Biology, Band 112, 1999, Seite 487–511, offenbart die Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie mit matrixunterstützter Laserdesorption/-ionisation unter Verwendung von Peptid- und Fragment-Ionenmassen. Corthals et al. offenbart die Identifizierung von Proteinen mithilfe der Massenspektrometrie in Proteome research: 2D gel electrophoresis and detection methods, Herausgeber: Rabilloud, T., Springer, New York, 1999, S. 197–231. Pennington et al. offenbart Verfahren zur Proteinidentifizierung in Trends in Cell Biology, Band 7, Nr. 7, April 1997 (1997-04), Seite 168–173.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Massenspektrometrie bereitgestellt.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt Verfahren zur Identifizierung von Polypeptiden bereit. Das Verfahren kann die Schritte des simultanen Bestimmens der Masse einer Untergruppe von parentalen Polypeptiden einer Population von Polypeptiden und der Masse von Fragmenten der Untergruppe von parentalen Polypeptiden; Vergleichens der bestimmten Massen mit einem annotierten Polypeptidindex und Identifizierens eines oder mehrerer Polypeptide des annotierten Polypeptidindex mit den bestimmten Massen umfassen. Die bevorzugte Ausführungsform stellt auch Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids durch Bestimmen zweier oder mehrerer Charakteristika, die mit dem Polypeptid oder einem Fragment davon assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Fragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie bestimmt wird; Vergleichen der Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, mit einem annotierten Polypeptidindex und Identifizieren eines oder mehrerer Polypeptide in dem annotierten Polypeptidindex mit diesen Charakteristika bereit. Das Verfahren kann darüber hinaus den Schritt eines Quantifizierens der Menge des identifizierten Polypeptids in einer Probe, die das Polypeptid enthält, umfassen.
Verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit anderen Anordnungen, die ausschließlich der Veranschaulichung dienen, sind nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen offenbart.
1 zeigt ein schematisches Diagramm einer Strategie zur Proteinidentifizierung auf der Grundlage von Messungen mittels Massenspektrometrie (MS) und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS).
2 zeigt zwei unterschiedliche Verfahren zur Erzeugung von mittels Fragment-Ionen selektierten Peptid-Ionen, die ein Diagnosewerkzeug zur Identifizierung des parentalen Ions sind. 2A zeigt die Selektion eines parentalen Ions (in Q1), das in einer Kollisionszelle (Q2) fragmentiert wird. Von den Fragmenten wird ein Massenspektrum erstellt (in Q3). 2B zeigt, dass anstatt der Selektion eines einzigen parentalen Ions mehrere parentale Ionen (in der "Ursprungsregion" angegeben) gleichzeitig in der Postionisationsregion oder der Kollisionszelle fragmentiert werden. Die Fragment-Ionen werden dann in einem Q1- oder anderen Massenanalysegerät analysiert, was ein Massenspektrum ergibt, das aus Fragment-Ionen mehrerer parentaler Ionen besteht.
3 zeigt die Schritte eines Verfahrens zum Vergleichen und Quantifizieren zweier Polypeptidpopulationen unter Verwendung eines Polypeptididentifizierungsindex von annotierten Peptidtags.
4 zeigt die Identifizierung eines Polypeptids unter Verwendung der Massenspektrometrie (MS). 4A und 4B zeigen Massenspektren zweier Polypeptide (P1, ASHLGLAR, SEQ ID NO: 1; und P2, RPRGFSPR, SEQ ID NO: 2), die unter Verwendung von ESI-TOF erhalten wurden. Die Spektren wurden mit niedriger V_{Düse-Skimmer} (10 V) (4A) und hoher V_{Düse-Skimmer} (240 V) (4B) erhalten. 4C zeigt eine Liste mit 12 und 13 möglichen Polypeptididentifizierungen für P1 (SEQ ID NO: 3–12, 2, 13 bzw. 14) bzw. P2 (SEQ ID NO: 15–24, 1 bzw. 25).
5 zeigt eine chromatographische Analyse eines Extrakts von Saccharomyces cerevisiae. Das durch den Pfeil gekennzeichnete Peptid wurde mittels nicht fragmentarischer und fragmentarischer MS-Analyse analysiert.
6 zeigt die nicht fragmentarische MS-Analyse des in 5 durch den Pfeil gekennzeichneten Peptids (YRPNCPIILVTR; SEQ ID NO: 26).
7 zeigt die nicht fragmentarische MS-Analyse des in 5 durch den Pfeil gekennzeichneten Peptids (YRPNCPIILVTR; SEQ ID NO:26).
8 zeigt eine chromatographische Analyse. 8A zeigt das Basispeak-Chromatogramm, 8B zeigt das Einzelionenchromatogramm bei 496,26 m/z [M₁ + 3H] und 8C zeigt das Einzelionenchromatogramm bei 586, 30 m/z [M₂ + 3H].
9 zeigt eine nicht fragmentarische MS-Analyse.
10 zeigt eine fragmentarische MS-Analyse.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids aus einer Population von Polypeptiden durch Bestimmen von Charakteristika, die mit einem Polypeptid oder einem Peptidfragment davon assoziiert sind, Vergleichen der ermittelten Charakteristika mit einem Polypeptididentifizierungsindex und Identifizieren eines oder mehrerer Polypeptide in dem Polypeptididentifizierungsindex mit denselben Charakteristika bereit. Diese Verfahren sind bei der Proteomanalyse anwendbar und ermöglichen eine schnelle und wirksame Identifizierung eines oder mehrerer Polypeptide in einer komplexen Probe. Die Verfahren basieren auf der Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex, bei dem es sich um eine Datenbank aus Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, handelt. Der Polypeptididentifizierungsindex kann zum Vergleichen von Charakteristika verwendet werden, deren Assoziation mit einem Polypeptid aus einer Probe zur Identifizierung des Polypeptids bestimmt wurde. Ferner können die Verfahren nicht nur zur Identifizierung eines Polypeptids, sondern auch zur Quantifizierung der Menge bestimmter Proteine in der Probe verwendet werden.
Die Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids können zur Durchführung einer quantitativen Proteomanalyse oder für Vergleiche von Polypeptidpopulationen, die sowohl die Identifizierung als auch die Quantifizierung von Polypeptidproben beinhalten, angewendet werden. Eine derartige quantitative Analyse lässt sich, falls erwünscht, zweckmäßig in zwei Stadien durchführen. In einem ersten Schritt kann beispielsweise aus einer zu untersuchenden Art, einem zu untersuchenden Zelltyp oder Gewebetyp, wie hier beschrieben, ein Bezugspolypeptidindex erstellt werden, der für die zu prüfende Probe repräsentativ ist. Der zweite Schritt ist der Vergleich von Charakteristika, die mit dem unbekannten Polypeptid assoziiert sind, mit dem zuvor erzeugten Bezugspolypeptidindex oder den zuvor erzeugten Bezugspolypeptidindices. Ein Bezugspolypeptidindex ist eine Datenbank aus Polypeptididentifikationscodes, die die Polypeptide einer bestimmten Probe repräsentieren, wie einer Zelle, einer subzellulären Fraktion, eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann erzeugt werden, der für eine beliebige Anzahl von Polypeptiden in einer Probe repräsentativ ist, einschließlich im Wesentlichen aller Polypeptide, die potenziell in einer Probe exprimiert werden. Demzufolge ermöglichen die Verfahren vorteilhaft die Bestimmung von Polypeptiden in einer Probe, die mit einem bestimmten physiologischen Zustand der Probe, z. B. einem Krankheitszustand korreliert und diesen festlegt. Sobald ein Polypeptididentifizierungsindex erzeugt ist, kann der Index darüber hinaus wiederholt zur Identifizierung eines oder mehrerer Polypeptide in einer Probe, beispielsweise eine Probe eines Individuums, das möglicherweise an einer Krankheit leidet, verwendet werden.
Für die Quantifizierung eines Polypeptids in einer Probe wird ein Polypeptid mit einem chemisch identischen Molekül verglichen, das beispielsweise mit ¹³C anstatt ¹²C, Deuterium anstatt Wasserstoff oder ¹⁸O anstatt ¹⁶O isotopenmarkiert ist. Es kann eine beliebige Anzahl an differenzierten Isotopen eingearbeitet werden, mit der Maßgabe, dass, wie hier offenbart, eine ausreichende mittels Massenspektrometrie unterscheidbare Massendifferenz vorhanden ist. Da die Moleküle bis auf den Isotopenunterschied chemisch identisch sind, zeigen die Moleküle dasselbe physikalisch-chemische Verhalten. Falls erwünscht, können außerdem mehr als zwei Proben verglichen werden, sofern eine ausreichende Anzahl an Isotopenmarkierungen (zum Beispiel d0, d4, d8, d12) zur Verfügung steht, sodass die verschiedenen Proben mittels MS verglichen und unterschieden werden können. Die Quantifizierung basiert auf einer stabilen Isotopenverdünnung. Ein Verfahren zur Quantifizierung einer Probe ist das Anreichern der Probe mit einem internen Standard, der chemisch identisch ist, aber unterschiedliche Isotopen aufweist. Zum Extrapolieren der Menge an Molekül in einer Probe kann mit Verdünnung des Isotops eine Standardkurve erzeugt werden. In einem derartigen Fall muss das anzureichernde Molekül identisch sein und aus diesem Grund müssen die Moleküle in der Probe bekannt sein.
Ein anderes zweckmäßiges Verfahren zur Quantifizierung von Polypeptiden in einer Probe ist die Verwendung eines Reagenz, wie ICAT^TM (Gygi et al., Nature Biotechnol. 17: 994–999 (1999); WO 00/11208). Ein ICAT^TM-artiges Reagenz, das nachstehend ausführlicher beschrieben ist, enthält ein Affinitätstag, eine Linker-Einheit, in die ein oder mehrere stabile Isotope eingefügt werden können, und eine reaktive Gruppe, die kovalent an eine Aminosäureseitenkette eines Polypeptids, wie eines Cysteins, binden kann. Zur Quantifizierung unter Verwendung eines ICAT^TM-artigen Reagenz werden parallele Proben mit unterschiedlichen Isotopenversionen des ICAT^TM-artigen Reagenz behandelt. Eine Probe kann markiert und mit einer parallel markierten Probe beispielsweise für die Normalisierung mit einer Bezugs- oder Kontrollprobe für die Quantifizierung verglichen werden. Die Verwendung eines ICAT^TM-artigen Reagenz zur Identifizierung und Quantifizierung von Polypeptiden in einer Probe ist in 3 dargestellt. Da die mit unterschiedlichen Isotopenversionen des ICAT^TM-artigen Reagenz markierten Peptide dasselbe physikalisch-chemische Verhalten zeigen, lassen sich dieselben Polypeptide in den zwei Proben gemeinsam reinigen, sind aber weiterhin aufgrund der Isotopenunterschiede der ICAT^TM-artigen Markierung mittels MS unterscheidbar. Demzufolge können die relativen Mengen derselben Polypeptide einfach verglichen und quantifiziert werden (Gygi et al., supra, 1999). Jedes zweite Scan kann nur auf die Fragmentierung und anschließende Aufzeichnung von Sequenzdaten des eluierten Peptids (MS/MS-Spektrum) beschränkt sein. Das parentale Polypeptid, von dem dieses Peptid abstammt, kann durch eine Suche in einer Sequenzdatenbank mit dem aufgezeichneten MS/MS-Spektrum identifiziert werden. Das Verfahren stellt somit die relative Quantifizierung und Identifizierung der Komponenten von Proteinmischungen im Rahmen einer einzigen Analyse bereit. Ein derartiger Vergleich kann für die Quantifizierung der Expressionsniveaus von Polypeptiden im Verhältnis zu einer Bezugsprobe nützlich sein, beispielsweise beim Vergleich der Expressionsniveaus in einer Probe eines Individuums mit einer Krankheit oder mit Verdacht auf eine Krankheit mit einer Probe von einem gesunden Individuum oder für forensische Zwecke.
Ein ICAT^TM-artiges Reagenz dient, neben seiner Nützlichkeit bei der Quantifizierung von Polypeptiden, als eine Beschränkung der Komplexität des Systems, das heißt, nur wenn die Polypeptide affinitätsisoliert oder nebeneinander mit einer unterschiedlich isotopenmarkierten Probe verglichen wurden, werden die Polypeptide oder Fragment davon, die die Aminosäure enthalten, die mit dem ICAT^TM-artigen Reagenz reaktiv ist, markiert und charakterisiert (Gygi et al., supra, 1999). Demzufolge kann die Verwendung eines ICAT^TM-artigen Reagenz eine Senkung der Komplexität der Probe bereitstellen. Ferner ist die Fähigkeit eines Polypeptids oder eines Fragments davon, sich mit einem ICAT^TM-artigen Reagenz markieren zu lassen, das heißt, sofern das Peptid die reaktive Aminosäure enthält, ein Charakteristikum, das mit dem Polypeptid assoziiert ist und das für die Identifizierung des Polypeptids zusammen mit weiteren Charakteristika nützlich ist.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung eines ICAT^TM-artigen Reagenz ist die Tatsache, dass die Identität von Polypeptiden in einer Probe nicht vor der Analyse bekannt sein muss. Wie vorstehend beschrieben, verlangt eine Isotopenverdünnung, wenn die Probe mit einem internen Standard angereichert wird, dass die Probe mit einem chemisch identischen Molekül mit unterschiedlicher Isotopenmarkierung angereichert wird, und verlangt somit, dass ein zu quantifizierendes Polypeptid oder Fragment davon bekannt ist, sodass ein chemisch identisches Molekül mit unterschiedlicher Isotopenmarkierung zugegeben werden kann. Mit einem ICAT^TM-artigen Reagenz müssen die genauen Polypeptide oder Fragmente davon nicht bekannt sein. Ferner ist es nicht erforderlich, für die Charakterisierung einer Vielfalt von Polypeptiden in einer Probe eine Vielfalt von isotopenmarkierten Molekülen zu synthetisieren.
Neben der Verwendung eines Markierungsreagenz, wie eines ICAT^TM-artigen Reagenz, das einen Affinitätsmarker einschließt, können auch andere Markierungsreagenzien zur unterschiedlichen Isotopenmarkierung von zwei verschiedenen Polypeptide enthaltenden Proben verwendet werden. So können beispielsweise zwei chemisch identische Reagenzien, die unterschiedliche Isotope enthalten, verwendet werden, um zwei Polypeptidproben kovalent zu modifizieren, wobei die Reagenzien kein Affinitätstag enthalten. Demzufolge können, falls erwünscht, anstatt eines Affinitätsisolierschritts, der mit einem ICAT^TM-artigen Tag assoziiert ist, andere Isolierschritte verwendet werden. Nichtsdestotrotz können die Polypeptide mit unterschiedlicher Isotopenmarkierung für eine quantitative Analyse verglichen werden. Beispielsweise kann die Methylierung von Polypeptiden mittels Veresterung mit Methanol, das d0 (kein Deuterium) oder d3 (drei Deuteriumatome) enthält, zur unterschiedlichen Isotopenmarkierung von zwei Polypeptidproben verwendet werden. Auf ähnliche Weise kann jedes bekannte Verfahren zur Modifizierung von Seitenkettenaminosäuren an Polypeptiden analog mit unterschiedlicher Isotopenmarkierung, wie Deuterium anstatt Wasserstoff, C¹³ anstatt C¹², O¹⁸ anstatt O¹⁶ verwendet werden (siehe beispielsweise Glazer et al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Chemical Modification of Proteins, Kapitel 3, S. 68–120, Elsevier Biomedical Press, New York (1975); Pierce Catalog (1994), Pierce, Rockford IL). Es kann jede beliebige Anzahl an unterschiedlichen Isotopen eingeführt werden, solange parallel markierte Polypeptide einen Massenunterschied aufweisen, der ausreicht, um mittels MS erfasst zu werden. Zusätzlich zu der chemischen Modifizierung eines Polypeptids, wie vorstehend beschrieben, können zwei Polypeptidproben mit einer Protease, wie Trypsin oder dergleichen, in Gegenwart von O¹⁶- sowie O¹⁸-markiertem H₂O gespalten werden. Da die Spaltreaktion der Protease zur Addition von Wasser zu den gespaltenen Peptiden führt, kann die Spaltung in Gegenwart von H₂O mit unterschiedlicher Isotopenmarkierung zur Einführung unterschiedlicher Markierungen zu getrennten Polypeptidproben verwendet werden. Es ist offensichtlich, dass jedes Verfahren, das zur Einführung einer Isotopenmarkierung zur unterschiedlichen Markierung von zwei Polypeptidproben nützlich ist, in erfindungsgemäßen Verfahren, insbesondere quantitativen Verfahren, verwendbar ist, solange die zu vergleichenden Proben auf chemisch ähnliche Weise behandelt werden, sodass sich die gebildeten markierten Polypeptide im Wesentlichen nur durch die unterschiedliche Isotopenmarkierung unterscheiden.
Noch ein weiteres Verfahren zur Quantifizierung einer Probe ist die Inkubation einer Probe unter Bedingungen, die eine metabolische Einführung von Isotopen in zwei zu vergleichende Proben ermöglicht, indem eine Probe in Gegenwart eines Isotops inkubiert wird oder in einem Medium inkubiert wird, das zu einer Verarmung an einem natürlich vorkommenden Isotop führt (siehe beispielsweise Oda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6591–6596 (1999)). Ein derartiges Verfahren ist bei einer zweckgemäß gezüchteten Probe besonders nützlich, beispielsweise einer mikrobiellen Proben oder einer Primärkultur von Zellen, die von einem Individuum stammt. Demzufolge können sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Verfahren für die unterschiedliche Isotopenmarkierung zweier Proben für Vergleichs- oder Quantifizierungszwecke verwendet werden.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform basieren auf der Bestimmung der Charakteristika eines Polypeptids, die die Identifizierung des Polypeptids auf der Grundlage der bestimmten physikalisch-chemischen Charakteristika ermöglichen. Die Zusammenstellung der physikalisch-chemischen Charakteristika, die zur Identifizierung eines Polypeptids dienen können, ist im Wesentlichen ein "Strichcode" des Polypeptids, das heißt, eine Zusammenstellung von Charakteristika, die ausreicht, um ein Polypeptid auf der Grundlage einer Korrelation der Charakteristika mit einer Bezugsdatenbank, die als Polypeptididentifizierungsindex dient, eindeutig zu identifizieren. Die Verfahren sind für die schnelle und wirksame Analyse komplexer Proben, die viele verschiedene Polypeptide enthalten, was ansonsten mit anderen Verfahren zeitaufwändig und ineffizient ist, besonders vorteilhaft. Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform können somit zur Analyse komplexer Proben angewendet werden, die zahlreiche unterschiedliche Polypeptide enthalten, und sind besonders in Proteomikanwendungen nützlich. Demgemäß können die Verfahren vorteilhaft zur Identifizierung von Polypeptiden des Proteoms verwendet werden. Da das Proteom ein Spiegel der Polypeptidexpression und posttranslationaler Modifizierungen, die mit dem metabolischen Zustand der Zelle korrelieren, ist, können die Verfahren auch für Diagnoseanwendungen zur Bestimmung einer normalen oder anomalen Polypeptidexpression, die mit einer Krankheit assoziiert ist, verwendet werden. Demzufolge können die Verfahren in klinischen Anwendungen zur Diagnose einer Krankheit oder eines Zustands verwendet werden.
Die Verfahren verwenden vorteilhaft Beschränkungsparameter, die die Identifizierung eines Polypeptids in einer komplexen Mischung verschiedener Polypeptide ermöglichen. Diese Beschränkungen können zur Vereinfachung der Identifizierung von Polypeptiden verwendet werden. Eine Beschränkung kann beispielsweise der Einschluss einer oder mehrerer Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, die Identifikation einer Untergruppe von Polypeptiden in einer komplexen Mischung oder jede Art von Beschränkung sein, die zur Vereinfachung der Analyse einer komplexen Mischung aus Polypeptid herangezogen werden kann. Die Verfahren stellen somit einer wirksamere Identifizierung von Polypeptiden in einer komplexen Mischung, die eine große Anzahl an Polypeptiden enthält, bereit, was für die Proteomanalyse besonders nützlich ist.
Die Erzeugung und die Verwendung eines Polypeptididentifizierungsindex bietet mehrere Vorteile. Zum einen können die Verfahren in Verbindung mit der selektiven Isolierung von Polypeptidfragmenten verwendet werden, die spezifische Strukturmerkmale enthalten, welche durch Markieren mit spezifischen chemischen Reagenzien genutzt werden können. Die Selektion der "markierten" Fragmente mittels Affinität macht die Polypeptidmischung weniger komplex und kompatibel mit den hoch denaturierenden/solubilisierenden Bedingungen, die für die Proteinisolierung und -behandlung verwendet werden können. Die selektive Isolierung von Fragmenten kann auch durch eine Datenbankabfrage eingeschränkt werden. Beispielsweise senkt eine selektive Cystein-Markierung, wie hier offenbart, die Komplexität der Peptidmischung um etwa das Zehnfache.
Ein zweiter Vorteil der bevorzugten Verfahren ist deren einfache Verwendbarkeit in einer Vielfalt von Laborkonfigurationen. Massenmessungen sind beispielsweise absolut und Chromatographieparameter können problemlos standardisiert werden. Aus diesem Grund lässt sich ein Polypeptididentifizierungsindex, der mittels der Verfahren der bevorzugten Ausführungsform ermittelt wurde, problemlos von Labor zu Labor übertragen und die von verschiedenen Labors produzierten Daten können problemlos mit einem unter ähnlichen Bedingungen ermittelten Polypeptididentifizierungsindex verglichen werden. Dieser Vorteil kann durch die Verfügbarkeit des Verfahrens über ein Netzwerk, beispielsweise durch Erstellen eines webbasierten Suchwerkzeugs, weiter genutzt werden. Ein dritter Vorteil besteht darin, dass die Verfahren mit einer einstufigen Massenanalyse durchgeführt werden können, die schnell, einfach und empfindlich ist. Ein vierter Vorteil ist die Tatsache, dass die Verfahren zur präzisen Ermittlung des Verhältnisses jedes in der komplexen Polypeptidprobe vorhandenen Polypeptids genutzt werden können, mit der Maßgabe, dass die Proben mit einer stabilen Isotopenmarkierung modifiziert wurden. Schließlich haben die Verfahren eine im Wesentlichen unbegrenzte Kapazität, was die Möglichkeit einer Analyse von Polypeptiden mit sehr geringer Häufigkeit sichert, sowie eine hohe Peak-Kapazität, was wiederum die Analyse hoch komplexer Proben ermöglicht.
Wie hier offenbart können neben der Isolierung einzelner parentaler Ionen vor der Fragmentierung mehrere Ionen parallel und ohne die Selektion einzelner Ionen fragmentiert werden (siehe 2). Demgemäß besteht ein wesentlicher Vorteil eines derartigen Verfahrens darin, dass die Parameter für mehrere Polypeptide einfach und parallel anstatt, wie es bei der Proteinidentifizierung mittels MS/MS der Fall ist, einzeln für jedes Peptid bestimmbar sind.
In einer Ausführungsform kann ein Polypeptididentifizierungsindex durch Bestimmung der Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, insbesondere durch Messungen der Fragment-Ionenmasse, mittels MS/MS, die mit oder ohne Selektion parentaler Ionen (2) erzeugt wurde, und fakultativ einschließlich chromatographischer Schritte erzeugt werden. Diese Massenbestimmungen müssen nicht von hoher Genauigkeit sein. Die genaue Masse kann, falls erwünscht, berechnet und zusammen mit anderen Charakteristika, die mit einem bestimmten Polypeptid assoziiert sind, zu einem Index kompiliert werden. Um die Identifizierung eines Polypeptids im Index zu ermöglichen, wird eine ausreichende Anzahl an Charakteristika bestimmt. Die Verfahren können wahlweise und vorteilhaft zusammen mit einer Quantifizierung zur Bereitstellung zusätzlicher Angaben über den physiologischen Zustand einer Probe verwendet werden. Im Falle von einfacheren Systemen, beispielsweise mikrobiellen oder viralen Genomen oder Spezimen von Individuen mit einer geringeren Anzahl an Polypeptiden, wie Zerebrospinalflüssigkeit, kann jedoch die Komplexität der Polypeptide in einer Probe gering genug sein, dass in bestimmten Anwendungen eine qualitative Analyse der Polypeptide in einer Probe ausreicht. Wenn in diesem Fall eine qualitative Bestimmung der Expression eines Polypeptids in einer Probe für eine Korrelation mit einer bestimmten Bedingung, beispielsweise einer Krankheitsbedingung, ausreicht, können die erfindungsgemäßen Verfahren für eine qualitative Identifizierung eines Polypeptids in einer Probe verwendet werden.
Ein beispielhafter Polypeptididentifizierungsindex oder eine solche Datenbank ist in Beispiel IV beschrieben. Das wachsende Gebiet der auf Massenspektrometrie basierenden Proteomik verlangt die Einarbeitung neuer Verfahren zur schnellen Identifizierung von Proteinen für Abfragen betreffend den Zustand ganzer Zellen. Hierfür wurden erfolgreich Verfahren zur Probenvereinfachung verwendet, einschließlich der Reinigung mit cysteinhaltigem Peptid (Gygi et al., Nat. Biotechnol. 17: 994–999 (1999)). Unter Verwendung der sich natürlich daraus ergebenden Beschränkungen, kann die potenzielle Anzahl an Peptidkandidaten in einer Mischung so weit gesenkt werden, dass ein Peptid und dessen parentales Protein mit einer hohen Massengenauigkeit (~0,1–1 ppm) eindeutig identifiziert werden können (Goodlett et al., Anal Chem. 72: 1112–1118 (2000)). Es hat sich erwiesen, dass mit einer hohen Massengenauigkeit eines Peptids und wenigen Fragment-Ionen dieses Peptids auch ohne die Verwendung einer Beschränkung durch Cystein dieselben Ergebnisse sogar in Gegenwart von gleichzeitig eluierenden Peptiden erzielt werden können (Masselon et al., Anal Chem. 73: 1918–1924 (2000)). Wie hier offenbart, wurde eine Kombination dieser Konzepte unter Verwendung eines TOF-anstatt eines FT-ICR-Massenspektrometers anhand eines Extrakts von Saccharomyces cerevisiae getestet (siehe Beispiel IV). Dies erfolgte mit einer Kombination aus Beschränkung durch Cystein zur Reduzierung der Datenbankkomplexität und in-source CID zur Erzeugung von Fragment-Ionen. Das Verfahren ist erwiesenermaßen auch bei Co-Elution der Peptide wirksam. Dieser Vorgang ermöglicht eine Shotgun-Sequenzanalyse, die die Sequenz von co-eluierenden Peptiden wiedergibt.
Wie in 2 dargestellt, kann ein bevorzugtes Verfahren beispielsweise in Abwesenheit von Einzelionenselektion oder in Abwesenheit von Ionenselektion in einer Ursprungsregion durchgeführt werden. Die beispielsweise als Q₁, Q₂, Q₃ und dergleichen, bezeichneten Regionen beziehen sich auf Quadrupole. Diese sind physikalische Mittel zum Abtrennen eines selektierten Ions auf der Grundlage von m/z. Es ist jedoch offensichtlich, dass neben der Verwendung von Quadrupolen jedes passende Verfahren, das zum Abtrennen selektierter Ionen geeignet ist, in den Verfahren der bevorzugten Ausführungsform verwendet werden kann.
Der Begriff "Charakteristikum", wie hierin unter Bezugnahme auf ein Polypeptid verwendet, bezieht sich auf eine physikalisch-chemische Eigenschaft eines Polypeptids. Zu physikalisch-chemischen Eigenschaften gehören physikalisch-chemische Eigenschaften eines parentalen Polypeptids, wie die Molekülmasse, Aminosäurezusammensetzung, pI-Wert und dergleichen, sowie die physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Fragments eines Polypeptids, einschließlich Fragment-Ionen, die mit einem Polypeptid korrelierbar sind und somit als Charakteristika, die mit einem parentalen Polypeptid assoziiert sind, betrachtet werden. Zu den physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Polypeptids gehören auch messbare Verhalten eines Polypeptids, die sich aus den jeweiligen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergeben. Zu physikalisch-chemischen Eigenschaften gehören beispielsweise die Reihenfolge der Elution an einem bestimmten chromatographischen Medium unter bestimmten Bedingungen und die Position, zu der ein Polypeptid unter bestimmten Bedingungen in einem Polyacrylamidgel wandert. Die Charakteristika können empirisch ermittelt oder auf der Grundlage bekannter Informationen über das Polypeptid, beispielsweise Sequenzinformationen, vorhergesagt werden.
Der Begriff "Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine physikalisch-chemische Eigenschaft eines Polypeptids und/oder eines beliebigen Fragments des Polypeptids. Somit gehören zu Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, bestimmte Charakteristika eines parentalen Polypeptids sowie Charakteristika eines Fragments des parentalen Polypeptids, die als Charakteristika, die mit dem parentalen Polypeptid assoziiert sind, gelten, da das Fragment mit dem Polypeptid in Verbindung gebracht werden kann. Derartige Charakteristika können zur Identifizierung eines Polypeptids verwendet werden, beispielsweise anhand eines Vergleichs mit einem Polypeptididentifizierungsindex.
Der Begriff "Polypeptid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Peptid oder Polypeptid aus zwei oder mehr Aminosäuren. Ein Polypeptid kann auch mittels natürlich auftretender Modifizierungen, wie posttranslationaler Modifizierungen, einschließlich Phosphorylierung, Lipidbeladung, Prenylierung, Sulfatierung, Hydroxylierung, Acetylierung, Zugabe von Kohlenhydraten, Zugabe von prosthetischen Gruppen oder Cofaktoren, Bildung von Disulfidbindungen, Proteolyse, Zusammensetzen zu makromolekularen Komplexen und dergleichen, modifiziert werden.
Eine Modifikation eines Polypeptids, insbesondere Ligandenpolypeptide, kann nicht natürlich vorkommende Derivate, Analoge und funktionelle Mimetika davon umfassen, die mittels chemischer Synthese erzeugt wurden, mit der Maßgabe, dass eine derartige Polypeptidmodifikation eine ähnliche funktionelle Aktivität wie das parentale Polypeptid zeigt. Zu Derivaten können beispielsweise chemische Modifizierungen des Polypeptids, wie Alkylierung, Acylierung, Carbamylierung, Iodierung oder jede beliebige Modifizierung gehören, die das Polypeptid derivatisiert. Zu derartigen derivatisierten Molekülen gehören beispielsweise diejenigen Moleküle, in denen freie Aminogruppen unter Ausbildung von Aminhydrochloriden, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen derivatisiert wurden. Freie Carboxylgruppen können unter Ausbildung von Salzen, Methyl- und Ethylestern oder anderen Arten von Estern oder Hydraziden derivatisiert werden. Freie Hydroxylgruppen können unter Ausbildung von O-Acyl- oder O-Alkylderivaten derivatisiert werden. Der Imidazol-Stickstoff von Histidin kann unter Ausbildung von N-Im-Benzylhistidin derivatisiert werden. Zu Derivaten oder Analogen gehören auch diejenigen Polypeptide, die ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate der zwanzig üblichen Aminosäuren, beispielsweise 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, 3-Methylhistidin, Homoserin, Ornithin oder Carboxyglutamat, enthalten und die Aminosäuren enthalten können, die nicht über Peptidbindungen verbunden sind.
Ein besonders nützliches Polypeptidderivat umfasst eine Modifizierung von Sulfhydrylgruppen, beispielsweise die Modifizierung von Sulfhydrylgruppen, Affinitätsreagenzien, wie einem ICAT^TM-artiges Reagenz, zu binden. Eine besonders nützliche Modifizierung eines Polypeptids umfasst eine Modifizierung von Polypeptiden in einer Probe mit einer Einheit mit einem stabilen Isotop. Beispielsweise können zwei verschiedene Polypeptidproben getrennt mit Einheiten markiert werden, die unterschiedliche Isotope aufweisen, und derart unterschiedlich markierte Proben können verglichen werden. Die Modifizierung von Polypeptiden mit stabilen Isotopen ist für die Quantifizierung der relativen Menge einzelner Polypeptide in einer Probe besonders nützlich.
Ein "Fragment", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine verkürzte Form, entweder am Carboxy-Terminus, Amino-Terminus oder beiden, eines parentalen Polypeptids. Demzufolge gilt die Deletion einer einzigen Aminosäure am Carboxy-Terminus oder Amino-Terminus als Fragment eines parentalen Polypeptids. Ein Fragment bezieht sich im Allgemeinen auf eine Deletion von Aminosäuren am N- und/oder C-Terminus, umfasst aber auch Modifizierungen, bei denen eine Seitenkette entfernt wurde, die Peptidbindung jedoch erhalten bleibt. Ein Fragment umfasst ein gekürztes Polypeptid, das beispielsweise durch Spaltung des Polypeptids unter Verwendung eines chemischen Reagenz, eines Enzyms oder Energiezufuhr gebildet wird. Ein Fragment kann das Ergebnis eines sequenzspezifischen oder sequenzunabhängigen Spaltereignisses sein. Zu Beispielen für Reagenzien, die üblicherweise zum Spalten von Polypeptiden verwendet werden, gehören Enzyme, beispielsweise Proteasen, wie Thrombin, Trypsin, Chymotrypsin und dergleichen, und Chemikalien, wie Cyanogenbromid, Säuren, Basen und o-Iodbenzoesäure, wie hier offenbart. Ein Fragment kann auch mittels eines Massenspektrometrieverfahrens erzeugt werden. Ferner kann ein Fragment auch das Ergebnis mehrerer Spaltereignisse sein, sodass ein gekürztes Polypeptid, das aus einem Spaltereignis hervorgeht, durch zusätzliche Spaltereignisse weiter gekürzt wird.
Der Begriff "Polypeptididentifizierungsindex", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Zusammenstellung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, die zur Identifizierung und Unterscheidung von anderen Polypeptiden im Index ausreicht. Ein Polypeptididentifizierungsindex ist somit eine Zusammenstellung von Polypeptididentifikationscodes zur Identifizierung eines Polypeptids auf der Grundlage der Charakteristika des Polypeptids oder eines Fragments davon. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann auf hergeleiteten Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, basieren, beispielsweise Charakteristika, die aufgrund der Sequenzinformationen, wie der Genomsequenz, cDNA-Sequenz oder EST-Datenbanken vorhergesagt wurden. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann auch auf empirisch bestimmten Charakteristika oder einer Kombination aus hergeleiteten und empirisch bestimmten Charakteristika basieren. Ein "annotierter Polypeptidindex (AP)" bezieht sich auf einen Polypeptididentifizierungsindex, der für jedes der Polypeptide im Index mindestens ein empirisch bestimmtes Charakteristikum umfasst, welches beispielsweise mittels der hier offenbarten Verfahren bestimmt werden kann. Falls erwünscht, kann ein AP-Index vollständig auf empirisch bestimmten Charakteristika oder auf einer Kombination aus hergeleiteten und empirisch bestimmten Charakteristika basieren. Die Verwendung eines annotierten Polypeptidindex ist besonders zur Identifizierung von Polypeptiden nützlich, die mittels posttranslationaler Modifikationen modifiziert wurden, die Charakteristika aufweisen können, welche unvorhersehbar ausschließlich auf einer Herleitung aus einer Sequenzdatenbank basieren.
Ein "Polypeptididentifizierungssubindex" bezieht sich auf eine Untergruppe eines Polypeptididentifizierungsindex, die weniger als alle Polypeptididentifikationscodes des Polypeptididentifizierungsindex enthält. Ein Subindex kann beispielsweise fünf Polypeptididentifikationscodes eines Polypeptididentifizierungsindex mit zehn Polypeptididentifikationscodes enthalten, der eine Untergruppe des gesamten Index ist. Die Identifizierung eines Subindex kann beispielsweise beim Reduzieren der Komplexität einer Suche in einem Polypeptididentifizierungsindex nützlich sein, was der Reduzierung der Komplexität ähnlich ist, die bei einer Polypeptidprobe mittels der hier offenbarten Fraktionierverfahren erreicht wird. Demzufolge kann die Suche in einem Subindex vorteilhaft weniger Rechenzeit erfordern, als für die Suche des gesamten Index erforderlich ist.
Der Begriff "Identifikationscode", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Gruppe von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, die zur Bestimmung der Identität des Polypeptids und zur Unterscheidung des Polypeptids von anderen Polypeptiden in einem Polypeptididentifizierungsindex ausreicht. Ein Identifikationscode ist im Wesentlichen ein annotiertes Peptidtag oder ein "Strichcode", der zur Identifizierung eines Polypeptids verwendet werden kann.
Die bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids. Das Verfahren umfasst die Schritte des Bestimmens zweier oder mehrerer Charakteristika, die mit einem Polypeptid oder einem Fragment davon assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Fragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie bestimmt wird; Vergleichens der Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, mit einem Polypeptididentifizierungsindex, wie einem annotierten Polypeptidindex, und Identifizierens eines oder mehrerer Polypeptide in dem Polypeptididentifizierungsindex mit den bestimmten Charakteristika. Das Fragment kann mit einer Genauigkeit in ppm von mehr als 1 Teil je Million (ppm) oder mit einer noch geringeren Genauigkeit (höherem ppm) bestimmt werden. Das Verfahren umfasst ferner das Bestimmen eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, und Vergleichen der in jedem der Schritte bestimmten Charakteristika mit dem Polypeptididentifizierungsindex. Wahlweise können die Schritte des Bestimmens eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, und des Vergleichens der in jedem der Schritte bestimmten Charakteristika mit dem Polypeptididentifizierungsindex einmal oder mehrmals wiederholt werden, wobei eine Gruppe von Charakteristika bestimmt wird, die ein einzelnes Polypeptid im Polypeptididentifizierungsindex identifiziert. Das vorstehende Verfahren sowie andere Verfahren können weiter die Quantifizierung der Menge an Polypeptid in einer Probe umfassen. Darüber hinaus können die Verfahren zum Messen der relativen Häufigkeit in zwei oder mehr unterschiedlichen Populationen von Polypeptiden, das heißt Polypeptidmischungen, verwendet werden, beispielsweise Populationen von Polypeptiden in unterschiedlichen Proben.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform zur Identifizierung eines Polypeptids umfassen die Bestimmung von Charakteristika, die mit dem Polypeptid oder einem Fragment des Polypeptids assoziiert sind. Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind und die zur Identifizierung eines Polypeptids nützlich sind, sind solche Charakteristika, die sich wiederholfähig bestimmen lassen. Zu physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Polypeptids oder Fragments gehören beispielsweise die Atommasse, die Aminosäurezusammensetzung, die partielle Aminosäuresequenz, das scheinbare Molekulargewicht, der pI-Wert und die Reihenfolge der Elution an einem spezifischen chromatographischen Medium unter bestimmten Bedingungen. Derartige Charakteristika, deren Assoziation mit einem Polypeptid bestimmt wurde, werden zur Identifizierung des Polypeptids verwendet. Verfahren zur Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
Eines der Charakteristika, das in Verfahren der bevorzugten Ausführungsform besonders nützlich ist, ist die Masse eines Polypeptids oder eines Fragments oder mehrerer Fragmente davon. Ein Fragment eines Polypeptids kann vor oder während des Vorgangs der Massenbestimmung mittels Massenspektrometrie erzeugt werden. Die Masse eines Polypeptidfragments kann somit die Masse eines Fragments eines Polypeptids, das während der Vorbereitung der Polypeptidprobe erzeugt wurde, oder die Masse eines Fragments sein, das durch eine Polypeptidspaltung erzeugt wurde, welche während der Massenspektrometrie auftrat.
Die Masse eines Polypeptidfragments wird mittels Massenspektrometrie bestimmt und kann vorteilhaft in Abwesenheit von Ionenselektion zur Herstellung von Fragment-Ionen bestimmt werden. Die Verfahren ermöglichen die Identifizierung eines Polypeptids, ohne dass eine Sequenzanalyse des Polypeptids oder des Fragments davon erforderlich ist. Die Masse eines Polypeptidfragments kann unter Verwendung einer Vielfalt von im Fachgebiet bekannten Verfahren für die Massenspektrometrie, die hier beschrieben sind, bestimmt werden.
In den Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids können eine Vielfalt von Massenspektrometrie-Systemen verwendet werden. Zu Massenanalysatoren mit hoher Massengenauigkeit, hoher Empfindlichkeit und hoher Auflösung gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, matrixgestützte dynamische Laser-Desorptionsmassenspektrometer (MALDI-TOF), ESI-TOF-Massenspektrometer und Fourier-Transformations-Ionenzyklotron-Massenanalysatoren (FT-ICR-MS). Zu weiteren MS-Verfahren gehören Elektrosprayvorgänge mit MS und Ionenfalle. Bei der Ionenfalle-MS werden Fragmente mittels Elektrospray oder MALDI ionisiert und dann in eine Ionenfalle überführt. Gefangene Ionen können dann getrennt und nach selektiver Freisetzung aus der Ionenfalle mittels MS analysiert werden. In der Ionenfalle können auch Fragmente erzeugt und analysiert werden. Die mit einem ICAT^TM-artigen Reagenz markierten Polypeptide, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kommen können, können beispielsweise mithilfe einer einstufigen Massenspektrometrie mit einem MALDI-TOF- oder ESI-TOF-System analysiert werden. Massenspektrometrieverfahren für Proteomikanwendungen sind beschrieben (siehe Aebersold und Goodlett, Chem. Rev. 101: 269–295 (2001)). Falls erwünscht, können MS-Verfahren beispielsweise, wie hier beschrieben, unter Verwendung von ICAT^TM- oder IDEnT-artigen Reagenzien modifiziert werden, um die Erfassung von Peptiden mit Affinitätstags zu ermöglichen.
Falls erwünscht, können zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex andere MS-Analysen als zur Bestimmung von Charakteristika eines unbekannten Polypeptids verwendet werden. Beispielsweise kann zum Sammeln von Daten für den Identifizierungsindex LC-MS/MS und zur Ermittlung von Charakteristika eines unbekannten Polypeptids LC-ESI TOF verwendet werden. Es ist offensichtlich, dass jedes beliebige MS-Verfahren und jede beliebige Kombination aus MS-Verfahren verwendet werden kann, solange die Proben auf im Wesentlichen gleiche Weise behandelt werden und solange die MS-Verfahren für den Vergleich der mittels der verschiedenen Verfahren bestimmten Massen kompatibel sind.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform können einen Schritt der Polypeptidtrennung im Anschluss an einen Schritt der Massenanalyse beinhalten. Die Schritte der Polypeptidtrennung und Massenanalyse können unabhängig voneinander durchgeführt werden oder in einem "online"-Analyseverfahren gekoppelt sein.
Verschiedene Arten von Techniken zur Polypeptidtrennung können an einen Massenanalysator gekoppelt sein. Polypeptide können beispielsweise mithilfe von Chromatographie unter Verwendung von Mikrokapillar-HPLC, mithilfe von Festphasenextraktion-Kapillarelektrophorese-Systemen, die an einen Massenanalysator gekoppelt sein können, oder mithilfe von Gelelektrophoreseverfahren getrennt werden. Ein spezifisches Beispiel für ein gekoppeltes Verfahren zur Polypeptidtrennung und Massenanalyse ist die Mikrokapillar-HPLC, die an ein ESI-MS/MS-System gekoppelt ist, das unter dynamischem Ausschluss mit einer Ionenfalle-MS verwendet wird.
Für die verschiedenen Anwendungen der Verfahren der bevorzugten Ausführungsform können verschiedene Arten der Massenspektrometrie verwendet werden. Für bestimmte Anwendungen, wie der Massenbestimmung eines Polypeptidfragments zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex, ein Verfahren, das eine hohe Genauigkeit vorsieht, wie eine Genauigkeit von weniger als 1 Teil je Million. Die Verfahren sind jedoch dahingehend vorteilhaft, dass zweckmäßig MS mit geringer Genauigkeit, das heißt hoher ppm Auflösung, verwendet werden kann, ohne dass dies teurerer Instrumente, die für Bestimmungen mit höherer Genauigkeit erforderlich sind, bedarf. Bei Anwendungen, die die Analyse einer Population von Polypeptiden mit hohem Durchsatz beinhalten, kann eine Massenbestimmung mit geringerer Genauigkeit ausreichend sein. Massenbestimmungen mit geringerer Genauigkeit ergeben im Allgemeinen einen höheren Probendurchsatz, da der Zeitaufwand für eine Massenbestimmung geringer ist.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform, die Massenbestimmungen beinhalten, sind zweckmäßig mit geringerer Genauigkeit durchführbar. Instrumente mit hoher Massengenauigkeit, wie FTMS oder FTICR MS können beispielsweise zur Bestimmung der Genauigkeit bei 0,2 ppm verwendet werden (Goodlett et al., Anal. Chem. 72: 1112–1118 (2000); Masselon et al., Anal. Chem. 72: 1918–1924 (2000)). Die Verwendung einer sehr hohen Massengenauigkeit, wie 0,1 ppm, dient als Beschränkung. Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform weisen jedoch den Vorteil auf, dass mehrere Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, bestimmt werden können. In Kombination mit zusätzlichen Charakteristika können die Massen mit einer geringeren Genauigkeit, das heißt höherem ppm, bestimmt werden. Die Bestimmung einer Masse mit geringerer Genauigkeit ermöglicht die Verwendung weniger teurer MS-Instrumente, die weiter verbreitet sind als FTMS. Die Massenbestimmungen können mit einer Genauigkeit in ppm von 1 Teil je Million (ppm) oder mehr als 1 ppm bestimmt werden und können mit einer Genauigkeit in ppm von 2,5 ppm oder mehr, von etwa 5 ppm oder mehr, etwa 10 ppm oder mehr, etwa 50 ppm oder mehr, etwa 100 ppm oder mehr, etwa 200 ppm oder mehr, etwa 500 ppm oder mehr oder sogar etwa 1000 ppm oder mehr bestimmt werden, die jeweils sequenziell eine geringere Genauigkeit des MS-Instruments verlangen. Die Verfahren ermöglichen, wie hier offenbart, vorteilhaft die Verwendung einer MS-Analyse mit geringer Genauigkeit in Kombination mit anderen physikalisch-chemischen Charakteristika zur Identifizierung eines Polypeptids in einer Probe. Die Genauigkeit der MS-Messungen für eine bestimmte Anwendung kann von einem Fachmann problemlos und beispielsweise in Abhängigkeit von der Komplexität der Probe und/oder dem zu verwendenden Index bestimmt werden.
Die Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids können die Bestimmung der Masse eines Polypeptidfragments mit einer Genauigkeit von mehr als 1 Teil je Million beinhalten. Aus diesem Grund verlangt das Verfahren kein MS-Verfahren mit hoher Genauigkeit. Demzufolge kann in den Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids ein preiswertes MS-System verwendet werden. Die Anpassung eines Massenspektrometers an ein Format mit hohem Durchsatz, wie ein Format mit 96-Well-Platte oder 384-Tüpfelplatte, oder an ein Autoinjektionssystem, das einen unbeaufsichtigten Betrieb ermöglicht, ist zur Erhöhung des Probendurchsatzes vorteilhaft.
In Verfahren der bevorzugten Ausführungsform kann die Masse eines Polypeptids oder eines Fragments davon in der Abwesenheit von Ionenselektion zur Herstellung von Fragment-Ionen bestimmt werden. 1 zeigt einen Überblick über die Strategie eines Verfahrens zur Proteinidentifizierung. Polypeptide werden wahlweise beispielsweise unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und die Polypeptide können weiter in Peptide fragmentiert werden. Die Peptide können darüber hinaus wahlweise mittels Chromatographie fraktioniert werden. Eine Chromatographiefraktion, oder ein Speicher (in 1 mit "*" gekennzeichnet), wird MS unterworfen. Traditionell wird ein Ion oder werden dominante Ionen in einer Kollisionszelle für eine kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) selektiert. In Q1 in 1 ist die Selektion eines einzigen Ions dargestellt. Wie in Q3 in 1 dargestellt, wird ein Ion selektiert und anschließend fragmentiert. In Abwesenheit von Ionenselektion wird anstatt der Selektion eines einzigen Ions keine Ionenselektion angewendet, sondern stattdessen werden alle Ionen fragmentiert, was zu vielen Peptidfragmenten führt. Die Peptidfragmente werden dekonvoliert, um zu bestimmen, welches einem bestimmten parentalen Polypeptid entspricht, und derartige Daten über die Masse eines Fragments eines Polypeptids stellen ein Charakteristikum dar, das mit dem Polypeptid assoziiert ist (siehe 4). Wie unten in 1 dargestellt, können die Fragmentmassen mit einer beliebigen Anzahl von zusätzlichen Charakteristika kombiniert und mit einem Polypeptididentifizierungsindex, beispielsweise einer Sequenzdatenbank oder einem annotierten Polypeptidindex, verglichen werden und das Polypeptid wird auf der Grundlage dieser bestimmten Charakteristika identifiziert.
Eine Gruppe von bestimmten Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, werden mit den Charakteristika, die mit einem Polypeptid in einem Polypeptididentifizierungsindex assoziiert sind, verglichen. Ein Polypeptididentifizierungsindex ist eine Zusammenstellung von Charakteristika, die mit einzelnen Polypeptiden assoziiert sind, zur Identifizierung und Unterscheidung der Polypeptide von anderen im Index annotierten Polypeptiden. Anhand eines Vergleichs der Gruppe von bestimmten Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, mit einem Polypeptididentifizierungsindex können ein oder mehrere Polypeptide im Polypeptididentifizierungsindex mit denselben Charakteristika identifiziert werden. Wenn festgestellt wird, dass mehr als ein Polypeptid dieselben Charakteristika aufweist, können weitere Beschränkungen auferlegt werden, beispielsweise die Bestimmung eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann auf hergeleiteten Charakteristika eines Polypeptids basieren, beispielsweise einem oder mehreren Charakteristika, die aus Gensequenzdatenbanken hergeleitet sind, oder kann empirisch bestimmt werden, wie mit dem hier beschriebenen annotierten Peptidtagindex.
Ein beispielhaftes Verfahren zur Erzeugung eines annotierten Peptidindex sieht wie folgt aus: Ernten von Proteinen; Markieren der Proteine mit einem Isotope coded Affinity Tag-artigen (ICAT^TM) Reagenz; Fraktionieren der Proteine über das Molekulargewicht; Spalten der Proteine zu Peptiden (z. B. unter Verwendung von Trypsin); Trennen der Peptide mittels Ionenaustausch; Reinigen jeder Ionenaustauschfraktion mittels Affinitätschromatographie; Analyse jeder Affinitätschromatographiefraktion mittels LC/MS/MS (oder CE/MS/MS); Identifizieren aller exprimierten Proteine mittels einer Datenbankabfrage der einzelnen MS/MS-Peptidspektren; Erzeugen einer Datenbank mit annotierten Peptidtags, die einen eindeutigen Strichcode eines individuellen Peptids basierend auf gemessenen physikalisch-chemischen Eigenschaften und somit des parentalen Proteins des Peptids darstellen. Es ist offensichtlich, dass das vorstehend beschriebene Verfahren, Kombinationen dieser Schritte, Modifikationen davon oder jedes andere Verfahren, das geeignet ist, die Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, zu ermöglichen, verwendet werden kann, um einen Polypeptididentifizierungsindex zu erzeugen, der, wie hier beschrieben, mindestens ein empirisch bestimmtes Charakteristikum umfasst.
Die Verfahren können ferner die Bestimmung eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, zum Vergleich mit einem Polypeptididentifizierungsindex umfassen. Das Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, mit anschließendem Vergleich mit einem Polypeptididentifizierungsindex kann wiederholt werden, bis ein einziges Polypeptid eindeutig im Polypeptididentifizierungsindex identifiziert ist. Demzufolge können, sofern zusätzliche Beschränkungen anzuwenden sind, diese die Identifizierung eines Polypeptids durch Vergleich mit einem Polypeptididentifizierungsindex umfassen (siehe 4C).
Die Anzahl an Charakteristika, die zur Identifizierung eines Polypeptids ausreicht, kann von einem Fachmann problemlos anhand eines Vergleichs der Gruppe von bestimmten Charakteristika mit dem Polypeptididentifizierungsindex festgelegt werden. Die Identifizierung eines einzigen. Polypeptids in einem Polypeptididentifizierungsindex bezieht sich auf die Bestimmung einer Gruppe von Charakteristika, die zur Unterscheidung des Polypeptids von anderen Polypeptiden in einem Polypeptididentifizierungsindex ausreicht. Wenn beispielsweise zwei bestimmte Charakteristika auf ein einziges Polypeptid in einem Polypeptididentifizierungsindex zutreffen, dann reichen diese beiden Charakteristika zur Identifizierung des Polypeptids aus. Analog können für ein anderes Polypeptid drei bestimmte Charakteristika für eine eindeutige Identifizierung des Polypeptids im Index erforderlich sein. Demgemäß wird ein Vergleich mit einem Polypeptididentifizierungsindex auf der Grundlage der für ein Polypeptid bestimmten Charakteristika angestellt. Wenn ein einziges Polypeptid identifiziert ist, wurde eine ausreichende Anzahl an Charakteristika bestimmt. Wenn mehr als ein Polypeptid identifiziert wurde, können ein oder mehrere Charakteristika bestimmt werden, bis ein einziges Polypeptid eindeutig den bestimmten Charakteristika entspricht und somit eine Identifizierung des Polypeptids ermöglicht. Somit kann ein Fachmann problemlos bestimmen, ob auf der Grundlage eines Vergleichs mit einem bestimmten Polypeptididentifizierungsindex eine ausreichende Anzahl an Charakteristika für ein Polypeptid bestimmt wurde, um eine Identifizierung eines eindeutigen Polypeptids des Polypeptididentifizierungsindex zu ermöglichen.
Die Verfahren basieren vorteilhaft auf dem Einschluss ausgewählter Beschränkungen, die eine wirksamere Identifizierung eines Polypeptids ermöglichen, insbesondere in komplexen Proben, die zahlreiche unterschiedliche Polypeptide enthalten. Die Verfahren können auch vorteilhaft zur Identifizierung mehrerer Polypeptide simultan in einer komplexen Probe eingesetzt werden. Demzufolge können die Verfahren, anstatt eine große Anzahl an Charakteristika zu bestimmen, die mit verschiedenen Polypeptiden assoziiert sind, falls erwünscht, auf iterative Weise unter Einschluss zusätzlicher Beschränkungen nach Bedarf zur Identifizierung eines einzigen Polypeptids in einem Polypeptididentifizierungsindex durchgeführt werden.
Homologe Polypeptide haben beispielsweise im Allgemeinen Segmente mit hoher Sequenzidentität. Derartige Polypeptide können beispielsweise von Polypeptiden mit ähnlicher Funktion, von Spleißvarianten derselben Nukleinsäure und dergleichen abstammen. Polypeptide mit Segmenten mit hoher Sequenzidentität können mehrere physikalisch-chemische Charakteristika gemeinsam haben, insbesondere in Verbindung mit homologen Fragmenten des Polypeptids. Polypeptide, die hohe Ähnlichkeit aufweisen, können somit eine ähnliche oder identische Gruppe von assoziierten Charakteristika aufweisen. Bei derartigen ähnlichen Polypeptiden kann eine vorgegebene Gruppe von Charakteristika, die zur Unterscheidung zweier nicht ähnlicher Polypeptide ausreicht, zur Identifizierung eines einzigen Polypeptids in einem Polypeptididentifizierungsindex unzureichend sein, wenn die Polypeptide ähnliche Regionen aufweisen. In einem solchen Fall können ein oder mehrere zusätzliche Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, bestimmt werden und die Bestimmung zusätzlicher Charakteristika kann wiederholt werden, bis das fragliche Polypeptid von anderen Polypeptiden in einem Polypeptididentifizierungsindex unterschieden werden kann. Die Verfahren des Bestimmens einer Gruppe von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, des Vergleichens mit einem Polypeptididentifizierungsindex und des Bestimmens eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, bis ein einziges Polypeptid in einem Polypeptididentifizierungsindex identifiziert ist, kann auf ein oder mehrere Polypeptide angewendet werden.
Somit können zusätzliche Beschränkungen nach Bedarf zur Identifizierung eines einzigen Polypeptids erwogen werden. Wenn beispielsweise mehr als ein Polypeptid in einem Polypeptididentifizierungsindex eine vorgegebene Gruppe von Charakteristika aufweist, dient die Identifizierung ausgewählter Polypeptide des Polypeptididentifizierungsindex, das heißt einer Untergruppe von Polypeptiden im Index oder eines Subindex des Index, im Wesentlichen als Beschränkung. Demzufolge kann ein anschließender Vergleich mit dem Polypeptididentifizierungsindex mit dem Subindex erfolgen, wodurch die Rechenzeit herabgesetzt wird und, falls erwünscht, ein wirksamerer Vergleich bereitgestellt wird. Anschließend kann eine zusätzliche Beschränkung, beispielsweise ein zusätzliches Charakteristikum, erwogen und mit dem Subindex verglichen werden, was zu einer Reduzierung der Anzahl an Polypeptiden führt, die alle die bestimmten Charakteristika aufweisen. Derartige Schritte können wahlweise wiederholt werden, bis ein einziges Polypeptid in dem Polypeptididentifizierungsindex identifiziert ist. Ein derartiger Ansatz ist bei der simultanen Bestimmung der Identität von mehreren Polypeptiden vorteilhaft, da nur die Charakteristika bestimmt werden müssen die zur Identifizierung eines Polypeptids ausreichen. Die Verfahren können somit problemlos die Bestimmung der Identität einer Vielfalt von Polypeptiden und die Komplexitäten, die mit der Proteomikanalyse assoziiert sind, umfassen, ohne Ressourcen für unnötige Datenerfassungen zu verbrauchen.
Die Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex beinhalten die Bestimmung einer Gruppe von Charakteristika für zwei oder mehrere Polypeptide, die zur Identifizierung des Polypeptids genutzt werden kann. Eine Gruppe von Charakteristika, die ein Polypeptid in einem Polypeptididentifizierungsindex eindeutig identifiziert, legt einen Polypeptididentifikationscode oder "Strichcode" des Polypeptids fest. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann eine Vielfalt von Charakteristika aufweisen, die mit einem indexierten Polypeptid assoziiert sind. Zu Polypeptidcharakteristika, die in einem Polypeptididentifizierungsindex enthalten sind, gehören die Polypeptidmasse, die Aminosäurezusammensetzung, die partielle Aminosäurezusammensetzung, beispielsweise die Gegenwart einer bestimmten die Aminosäuren, der pI-Wert, die Reihenfolge der Elution an einem spezifischen chromatographischen Medium und eine Masse eines oder mehrerer Polypeptidfragmente. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann darüber hinaus die Aminosäuresequenz, Verweise auf verwandte Polypeptide, Datenbankeinträge oder Literatur sowie andere Daten umfassen, die zur Identifizierung eines Polypeptids relevant sind. Der Anwender weiß, welche Arten von Informationen für einen Polypeptidindex nützlich sind und kann jede physikalisch-chemische Eigenschaft oder Information mit Bezug zu dem Polypeptid einschließen. Ein Polypeptididentifizierungsindex, der eine große Anzahl an Identifikationscodes für eine Vielfalt von Polypeptiden umfasst, ist zur Identifizierung von Polypeptiden in komplexen Proben besonders nützlich.
Die Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids basieren auf einem Vergleich von Charakteristika, die für ein Polypeptid bestimmt wurden, mit einem Polypeptididentifizierungsindex. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann eine im Handel oder öffentlich erhältliche Datenbank sein, wie (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), in der ein oder mehrere Charakteristika eines Polypeptids, beispielsweise die Aminosäurezusammensetzung, die Masse eines Polypeptids oder eines Fragments davon und dergleichen, vorhergesagt sind. Außerdem kann ein Polypeptididentifizierungsindex auf empirisch bestimmten Charakteristika basieren, die mittels der hier beschriebenen Verfahren bestimmt wurden. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann beispielsweise empirisch bestimmt sein oder eine Kombination aus vorhergesagten und empirisch bestimmten Charakteristika darstellen, wie beispielsweise der hier offenbarte annotierte Polypeptidindex (AP), der auch als annotierter Peptidtagindex (APT) bezeichnet wird.
Eine Gruppe von empirisch bestimmten Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, kann experimentell unter Verwendung einer Vielfalt von Verfahren bestimmt werden. Ein beispielhaftes Verfahren für die Polypeptididentifizierung und/oder Bestimmung von Charakteristika zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex ist in 1 dargestellt und nachstehend beschrieben. Das Verfahren ist zur Festlegung eines Polypeptididentifikationscodes nützlich, da das Verfahren eine Serie von Schritten beinhaltet, was die Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, ermöglicht, wobei der letzte Schritt eine Massenbestimmung eines Polypeptids oder Fragments darstellt. Das Verfahren kann umfassen: (i) Vorbereitung der Polypeptidprobe; (ii) Polypeptidmarkierung; (iii) wahlweise Polypeptidfraktionierung; (iv) Polypeptidfragmentierung; (v) Trennung der Polypeptidfragmente; (vi) Affinitätsisolierung der markierten Polypeptidfragmente; (vii) hochauflösende Trennung der Polypeptidfragmente; (viii) Datenbankabfrage und (ix) Erstellung des Polypeptididentifizierungsindex (siehe Beispiel I).
Für die Vorbereitung der Polypeptidprobe werden Polypeptidproben, mit denen eine quantitative Proteomanalyse durchgeführt werden soll, unter Verwendung von Standardprotokollen zur Erhaltung der Solubilität der Polypeptide von den jeweiligen Quellen isoliert. Polypeptidproben und die Vorbereitung der Polypeptidprobe sind nachstehend ausführlicher besprochen.
Für die Polypeptidmarkierung können die Polypeptide in der Probe denaturiert werden, wahlweise reduziert werden und eine chemisch reaktive Gruppe der Polypeptide kann kovalent mit einem chemischen Modifizierungsreagenz derivatisiert werden. Eine beispielhafte Gruppe ist eine Sulfhydrylgruppe, die eine Seitenkette eines reduzierten Cysteinrests darstellt, die mit einem Reagenz, wie einem ICAT^TM-Reagenz (Gygi et al., Nature Biotechnol. 17: 994–999 (1999)) oder IDEnT-Reagenz (Goodlett et al., Anal. Chem. 72: 1112–1118 (2000)) derivatisiert werden kann. Zu weiteren nützlichen reaktiven Gruppen gehören Amino- oder Carboxylgruppen von Polypeptiden oder spezifische posttranslationale Modifikationen, einschließlich Phosphat, Kohlenhydrat oder Lipid. Jede beliebige chemische Reaktion, die für eine chemische Gruppe im Polypeptid spezifisch ist, kann in diesem Schritt angewendet werden. Das ICAT^TM-artige Reagenz und IDEnT-Reagenzien sowie Verfahren zur Verwendung sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
Für die fakultative Polypeptidfraktionierung kann die Mischung aus markierten Polypeptiden unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens zur Polypeptidtrennung fraktioniert werden. Ein in erfindungsgemäßen Verfahren nützliches Fraktionierverfahren ist wiederholfähig, erhält die Löslichkeit der Polypeptide und hat eine hohe Proben- und Peakkapazität. Jede fakultative Fraktioniertechnik kann zur Anreicherung von Proteinen, die mit geringer Häufigkeit auftreten, und/oder zur Senkung der Komplexität der Mischung durchgeführt werden und die relativen Mengen können erhalten bleiben. Zu beispielhaften Fraktionierverfahren gehören beispielsweise die Natriumdodecylsulfate-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE), chromatographische Verfahren, wie Größenausschluss, Ionenaustausch, Hydrophobie und dergleichen, wie hier offenbart. Verfahren zur Polypeptidfraktionierung sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
Für die Polypeptidfragmentierung können die Polypeptide in der Probenmischung oder, falls eine fakultative Probenfraktionierung vorgenommen wurde, die in jeder Fraktion enthaltenen Polypeptide einer sequenzspezifischen Spaltung, wie einer Spaltung mittels Trypsin, unterworfen werden. Die Verwendung der sequenzspezifischen Spaltung kann besonders nützlich sein, da die Termini von Peptiden, die mittels eines sequenzspezifischen Verfahren gespalten wurden, als eine Beschränkung dienen können. Es ist jedoch offensichtlich, dass das zur Erzeugung von Fragmenten verwendete Spaltverfahren, falls erwünscht, nicht sequenzspezifisch zu sein braucht. Verfahren, die zur Spaltung von Polypeptiden auf eine sequenzspezifische Weise nützlich sind, sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
Für die Trennung der Polypeptidfragmente kann die gebildete Mischung aus Polypeptidfragmenten wahlweise einer Peptidtrennung der ersten Dimension unterworfen werden. In diesem Schritt sind Trennverfahren mit einer hohen Probenkapazität, einer mindestens mäßigen Auflösung und hoch wiederholfähiger Trennmuster nützlich. Zu Beispielen für Trennverfahren für die erste Dimension gehören Anionen- und Kationenaustauchchromatographie. Diese und andere chromatographische Verfahren sind nachstehend ausführlicher beschrieben. Obwohl die Trennung der Polypeptidfragmente wahlweise durchgeführt werden kann, können die Verfahren vorteilhaft dazu eingesetzt werden, die Charakteristika der Peptidfragmente in der "Menge" zu bestimmen, das heißt, diese Verfahren verlangen keine Reinigung der Peptidfragmente bis zur Homogenität.
Für die Affinitätsisolierung der markierten Polypeptidfragmente können die Polypeptidfragmente mithilfe eines Affinitätsreagenz, das an das Polypeptidtag bindet, von jeder chromatographischen Fraktion isoliert werden. Polypeptidfragmente, die mit dem hier beispielhaft genannten ICAT^TM-Reagenz markiert wurden, können beispielsweise unter Verwendung von Avidin- oder Streptavidin-Affinitätschromatographie isoliert werden. Ein Beispiel für ein nützliches Affinitätsmedium zur Isolierung von mit ICAT^TM markierten Polypeptidfragmenten ist monomeres Avidin, das auf Polymerkügelchen immobilisiert wurde. Wenn ICAT^TM-artige Reagenzien verwendet werden, deren Affinitätstags von Biotin verschieden sind, wird ein entsprechendes Affinitätsmedium verwendet, das das Affinitätstag bindet. Wie hier offenbart, kann die Trennung mittels Affinitätsisolierung parallel durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit Affinitätskügelchen in den Wells der oberen Kammer, die eine Membran oder Fritte oder eine andere Einrichtung enthält, welche ein Durchdringen der Kügelchen verhindert. Die Probe wird in die obere Kammer gegeben und mit den Affinitätskügelchen inkubiert, gewaschen, um nicht spezifische Bindungen und anschließend spezifische Bindemittel zu entfernen, welche in eine zweite Mikrotiterplatte mit undurchlässigem Boden eluiert werden.
Für eine Trennung der Polypeptidfragmente mit hoher Auflösung kann Flüssigkeitschromatographie-ESI-MS/MS verwendet werden. Die Mischungen aus Polypeptidfragmenten, die aus den Affinitätschromatographiesäulen eluiert wurden, können mittels automatisierter LC-MS/MS unter Verwendung von Kapillar-Umkehrphasenchromatographie als Trennverfahren (Yates et al., Methods Mol. Biol. 112: 553–569 (1999)) und datenabhängiger CID mit dynamischem Ausschluss (Goodlett et al., supra, 2000) als Massenspektrometrieverfahren individuell analysiert werden.
Für eine simultane Analyse mit hohem Durchsatz aller Affinitätsfraktionen können die hochauflösenden Trennungen parallel durchgeführt werden. Eine Vorrichtung hierfür besteht aus parallelen Trennkapillarröhrchen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, CE, SPE-CE, HPLC, die jeweils an einer piezoelektrischen Pumpe oder einer anderen Vorrichtung enden, die zu einer schnellen Probenaufgabe auf eine MALDI-MS-Probenplatte fähig ist. Jede piezoelektrische Pumpe oder ähnliche Vorrichtung ist zu einer schnellen Probenaufgabe im Stande, die die Auflösung aus der Trennung aufrecht erhält und durch Ablegen der Probe auf einem eng begrenzten Punkt eine erhöhte MALDI-TOF-Empfindlichkeit bereitstellt. Das Eluat jeder Trennung kann gleichzeitig auf einem MALDI-Target oder aber auch auf einer Mikrotiterplatte abgelegt werden.
Für die Datenbankabfrage werden die Sequenzen der Polypeptidfragmente, für die geeignete CID-Spektren erhalten wurden, durch Abfragen einer Sequenzdatenbank der zu untersuchenden Art bestimmt. Für Abfragen einer Datenbank kann vorteilhaft ein Suchprogramm für Sequenzdatenbanken, wie SEQUEST (Eng, J. et al., J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5: 976–989, (1994)), oder ein Programm mit ähnlichen Funktionen verwendet werden.
Für die Erstellung des Polypeptididentifizierungsindex können die Sequenzen aller Peptide, die mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens identifiziert wurden, in eine Datenbank eingegeben und mit den Charakteristika, die während der vorstehend beschriebenen Schritte erzeugt wurden, als Attribute versehen werden. Zu diesen Attributen können beispielsweise die partielle Aminosäurezusammensetzung, die ungefähre Molekülmasse des parentalen Polypeptids, die beispielsweise mittels des fakultativen Fraktionierschritts bestimmt werden kann, die Reihenfolge der Elution in einem ersten Chromatographieschritt, die Reihenfolge der Elutionszeit in einem zweiten Chromatographieschritt und dergleichen, gehören.
Kollektiv können eine ausreichende Anzahl an Charakteristika bestimmt werden, mit der jedes Polypeptidfragment in einem Polypeptididentifizierungsindex unterschieden werden kann. Die Zusammenstellung von Charakteristika, die ein Polypeptid eindeutig identifizieren, stellt einen "Strichcode" oder Polypeptididentifikationscode dar. Anschließend können Charakteristika, die mit einem unbekannten Polypeptid assoziiert sind, bestimmt und mit einem zuvor erzeugten Polypeptididentifizierungsindex verglichen werden. Alternativ kann ein Polypeptididentifizierungsindex zusammen mit dem unbekannten Polypeptid bestimmt werden. Die Sammlung von Informationen zu Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, und die Zusammenstellung zu einem Index ist für die Minimierung der Versuchsschritte, die zum Zeitpunkt der Probenanalyse erforderlich sind, zweckmäßig. Aus diesem Grund kann ein Polypeptididentifikationscode, der für ein Fragment eines Polypeptids bestimmt wurde, welches in einem anschließenden Versuch erzeugt wird, zur Identifizierung eines Polypeptids in einer Probe verwendet werden, indem der Polypeptididentifikationscode, der für ein unbekanntes Polypeptid neu erzeugt wurde, zur Identifizierung des unbekannten Polypeptids mit dem Polypeptididentifizierungsindex korreliert wird.
Für die Identifizierung eines Polypeptids durch Vergleich mit einem Polypeptididentifizierungsindex kann eine Gruppe von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, wie im Allgemeinen hier beschrieben zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex bestimmt werden oder sie kann unter Verwendung eines gleichwertigen, modifizierten oder verkürzten Verfahrens oder jedes beliebigen Verfahrens bestimmt werden, die die Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, ermöglicht. Die Anzahl an Charakteristika, die zur eindeutigen Identifizierung eines Polypeptid ausreicht, lässt sich von Fachleuten, wie hier offenbart, problemlos festlegen. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen die Identifizierung von 2 oder mehr Charakteristika und können 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr, 6 oder mehr, 7 oder mehr, 8 oder mehr, 9 oder mehr, 10 oder mehr, 15 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr oder sogar 50 oder mehr Charakteristika oder jede beliebige Anzahl an Charakteristika umfassen, solange eine ausreichende Anzahl an Charakteristika bestimmt wird, die jedes der Polypeptide in dem Index unterscheidet. Die Anzahl an Charakteristika, die in einen Polypeptididentifizierungsindex aufgenommen werden müssen, ist von der jeweiligen Verwendung des Index und der Komplexität der zu analysierenden Probe abhängig.
Bei der Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex können Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, dazu verwendet werden, die Polypeptidsequenz mittels Suche in einer Sequenzdatenbank zu erhalten. Beispielsweise kann eine partielle Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder eines Fragments, die wahlweise mittels Massenspektrometrie bestimmt wurde, problemlos zur Suche in einer Datenbank mit Polypeptiden oder translatierten Nukleinsäuresequenzen für die Identifizierung eines Namens oder einer Sequenzidentifikationsnummer, wie einer Zugriffsnummer, die ein Polypeptid eindeutig beschreibt, verwendet werden. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann somit Polypeptidcharakteristika, wie den Trivialnamen, einen numerischen oder alphanumerischen Identifikationscode einer öffentlich zugänglichen Datenbank oder jeden anderen Identifikationscode, der zur Identifizierung eines Polypeptids in einem Polypeptididentifizierungsindex ausgewählt wurde, enthalten.
Für die Beschaffung von Sequenzinformationen von Polypeptiden, die kein parentales Polypeptid oder keine Nukleinsäuresequenz in einer Datenbank aufweisen oder die eine unerwartete posttranslationale Modifikation enthalten, die die Identifizierung erschwert, kann eine De-novo-Sequenzanalyse durchgeführt werden. Für die Suche in einer Datenbank mit Polypeptiden oder Nukleinsäuresequenzen können, wie vorstehend beschrieben, identifizierte Aminosäuresequenzen verwendet werden. Eine De-novo-Sequenzanalyse kann unter Verwendung einer Vielfalt von Verfahren durchgeführt werden. Ein besonders nützliches Verfahren für die De-novo-Sequenzanalyse beinhaltet einen MS-Datensatz, der für die Polypeptididentifizierung erzeugt wurde. Verfahren für die Sequenzanalyse von Polypeptiden unter Verwendung der Massenspektrometrie sind Fachleuten gut bekannt (siehe beispielsweise Kinter und Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, John Wiley & Sons, New York (2000)).
Es ist offensichtlich, dass Sequenzinformationen zu einem Polypeptid oder einem Teil davon, die beispielsweise mittels eines Verfahrens wie CID erhalten wurden, zwar als Charakteristikum in einen Polypeptididentifizierungsindex aufgenommen werden können, die erfindungsgemäßen Verfahren machen jedoch eine Sequenzanalyse eines unbekannten Polypeptids zu Identifikationszwecken unnötig, obwohl die Sequenzinformation, falls erwünscht, in die Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex einfließen kann. Demgemäß kann ein Polypeptididentifizierungsindex Informationen über Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, die zusätzlich zu den Charakteristika vorliegen, die zur Identifizierung eines Polypeptids ausreichen, beispielsweise Sequenzinformationen. Durch die Ansammlung von Informationen zu Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, in einem Index kann die Identität eines Polypeptids bei Nichtbeschaffen von Sequenzinformationen problemlos über ein unbekanntes Polypeptid bestimmt werden.
Zur Bestimmung eines Charakteristikums eines Polypeptids kann eine chromatographische Trennung verwendet werden, da sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Polypeptids im Verhalten eines Polypeptids auf einem chromatographischen Medium widerspiegeln. Ein hoch geladenes Polypeptid lässt sich beispielsweise aus einer Anionen- oder Kationenaustauschsäule unter spezifischen pH- und/oder Salzbedingungen eluieren, die sich von den pH- und/oder Salzbedingungen unterscheiden, bei denen ein nicht geladenes Polypeptid oder ein Polypeptid mit entgegengesetzter Ladung eluiert werden kann. Aus diesem Grund kann ein Charakteristikum, das mit einem Polypeptid assoziiert ist, ein bestimmter pH-Wert und/oder eine bestimmte Salzbedingung sein, bei der das Polypeptid aus einer Chromatographiesäule eluiert wird. Analog können Bedingungen bestimmt werden, bei denen ein Polypeptid aus jeder beliebigen Art von Chromatographiesäule eluiert wird. Einer Reihenfolge der Elution oder einer Pufferbedingung, mit der ein Polypeptid aus einer Säule eluiert wird, kann ein Wert zugewiesen werden, der als Attribut in einen Polypeptidindex aufgenommen oder zum Vergleich mit entsprechenden Werten in einem Polypeptidindex verwendet wird. Ein Wert kann beispielsweise eine relative Position in einem Elutionsprofil unter festgelegten Bedingungen, eine Elutionszeit unter einem vorgegebenen Satz Bedingungen oder einer Durchflussgeschwindigkeit, die relative Zeit oder Elutionsreihenfolge im Verhältnis zur Fraktionsnummer eines externen Standards oder zu einem internen Standard, die Salzkonzentration, der pH-Wert oder jeder beliebige Parameter sein, der das wiederholfähig bestimmbare verhalten eines Polypeptids in einer bestimmten Chromatographiesäule beschreibt. Zu alternativen Verfahren gehören beispielsweise die Gelelektrophorese, die Elektrofokussierung (IEF) oder andere elektrophoretische Analyseverfahren. IEF hat sich beispielsweise als ein nützliches Charakteristikum für die Erzeugung eines Strichcodes zur Identifizierung eines Polypeptids erwiesen (siehe Beispiel VI). Verfahren zur Fraktionierung von Polypeptiden sind Fachleuten gut bekannt (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3. Ausgabe, Springer Verlag, New York (1993)). Die Chromatographieverfahren können in einem herkömmlichen Chromatographieformat oder als chargenweises Bindungs- und Elutionsverfahren beispielsweise in einem Massen- oder Multiwell-Format verwendet werden.
Proteinfraktionierschritte sind in den Verfahren der bevorzugten Ausführungsform sowohl für die Reduzierung der Komplexität einer Polypeptidprobe vor der Massenanalyse eines Polypeptids oder eines Fragments davon als auch zur Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, nützlich. Neben der vorstehend beschriebenen chromatographischen Fraktionierung kann jeder gut bekannte Fraktionierschritt zur Reduzierung der Komplexität der Probe verwendet werden und/oder als bestimmtes Charakteristikum, das mit einem Polypeptid assoziiert ist, dienen. Zu beispielhaften Fraktionierschritten gehört die Fällung mit Salz, wie Ammoniumsulfat, oder die Fällung mit Chemikalien, wie Polyethylenglycol oder Polyethylenimin, die subzelluläre Fraktionierung, die Gewebefraktionierung, die Immunpräzipitation und dergleichen (siehe Scopes, supra, 1993). Ein Fraktionierschritt kann zur Reduzierung der Komplexität einer Polypeptidpopulation verwendet werden. Die Reduzierung der Komplexität kann beispielsweise zur Isolierung einer Polypeptidsubpopulation verwendet werden, die an einer bestimmten Aminosäure markierte Polypeptide enthält. Im Fall von Gewebeproben kann die Fraktionierung die Isolierung eines oder mehrerer bestimmter Zelltypen umfassen, beispielsweise mittels Zentrifugiertechniken oder Immunselektion. Ferner können auch andere Fraktionierschritte, wie die subzelluläre Fraktionierung, zur Reduzierung der Komplexität einer Probe und/oder zur Bereitstellung eines zur Identifizierung eines Polypeptids nützlichen Charakteristikums angewandt werden. Die Fraktionierschritte können möglicherweise biologisch wichtige Informationen über das Polypeptid bereitstellen, beispielsweise, ob sich das Polypeptid auf einer Organelle befindet oder ein Zellkernprotein, ein Membranprotein und/oder ein Teil eines Signalkomplexes und dergleichen ist. Jeder Fraktionierschritt, der vorteilhaft die Komplexität der Polypeptidpopulation senkt, kann in den verfahren der bevorzugten Ausführungsform angewandt werden.
Ein Polypeptidfraktionierschritt ist in den Verfahren der bevorzugten Ausführungsform zur Bestimmung eines Charakteristikums, das mit einem Polypeptid assoziiert ist, nützlich. Zur Bestimmung des Molekulargewichts eines Polypeptids kann beispielsweise ein Proteinfraktionierverfahren auf der Grundlage des Molekulargewichts verwendet werden. Verfahren, wie SDS-PAGE, im Handel erhältliche Gelelution oder präparative Zellsysteme (BIO-RAD) sowie Größenausschluss-Chromatographie sind zur Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts eines Polypeptids oder Fragments verwendbar. Das Molekulargewicht eines Polypeptids oder Fragments ist ein Charakteristikum, das in einen Polypeptididentifizierungsindex aufgenommen werden kann.
Die bestimmte Gruppe von Charakteristika, die bei der Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex für ein Polypeptid oder für die Identifizierung eines Polypeptids bestimmt wurde, kann vom Anwender ausgewählt werden und ist von der Polypeptidprobe, den zur Vorbereitung der Polypeptidprobe verwendeten Verfahren, dem verwendeten Massenspektrometrie-Verfahren und den Wünschen des Anwenders abhängig. Die Charakteristika eines Polypeptids können in jeder zeitlichen Reihenfolge bestimmt werden. Polypeptidcharakteristika können beispielsweise in einer Reihenfolge gesammelt werden, die zeitlich effektiv oder zweckmäßig ist, oder so gesammelt werden, wie dies durch ein bestimmtes Verfahren, das für die Verarbeitung der Probe gewählt wurde, vorgegeben ist.
Bei der Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex können Sequenzinformationen, die beispielsweise mittels CID bestimmt wurden, sowie andere Charakteristika eines Polypeptids verwendet werden und die Sequenzinformation ist besonders bei der Korrelation von anderen Charakteristika eines Polypeptids mit einer speziellen Sequenz zur Identifizierung des Polypeptids nützlich. Der Vorteil der Verfahren besteht jedoch darin, dass die Beschaffung von Sequenzinformationen über ein Polypeptid nicht erforderlich ist, sobald der Polypeptididentifizierungsindex erzeugt wurde. Stattdessen können andere Charakteristika bestimmt werden, die zur Identifizierung eines Polypeptids ausreichen, beispielsweise Massen und/oder Verhältnisse von Peptiden, sowie andere Charakteristika und mit einem Polypeptididentifizierungsindex verglichen werden, der selbst Sequenzinformationen umfassen kann, wodurch eine Sequenzanalyse eines Polypeptids zu Identifizierungszwecken überflüssig wird.
Die Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex beinhalten das Bestimmen einer Gruppe von Charakteristika, die mit einem ersten und einem zweiten Polypeptid assoziiert sind, wobei die bestimmten Charakteristika zur Unterscheidung des ersten und zweiten Polypeptids ausreichen. Charakteristika, die zur Unterscheidung des ersten und zweiten Polypeptids ausreichen, beziehen sich auf eine Gruppe von Charakteristika, die einem Polypeptid eindeutig zugeordnet werden können, sodass die Polypeptididentität mit dem Polypeptididentifizierungsindex unzweideutig bestimmt werden kann. Falls eine Gruppe von Charakteristika einem oder mehreren Polypeptiden gemeinsam ist, wird ein zusätzliches Charakteristikum bestimmt, das eine Unterscheidung eines Polypeptids von anderen Polypeptiden ermöglicht. Somit können die in einem Polypeptididentifizierungsindex vertretenen Polypeptide anhand der Gruppe an Charakteristika, die jedes Polypeptid identifiziert, voneinander unterschieden werden.
Die Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids können auf eine Population von Polypeptiden angewandt werden, in der zwei oder mehr Polypeptide identifiziert sind, und können, falls erwünscht, zweckmäßig zur simultanen Identifizierung mehrerer Polypeptide in einer Probe verwendet werden. Aus diesem Grund kann das Verfahren bei einer einfachen und einer komplexen Polypeptidprobe angewandt werden. Eine einfache Polypeptidprobe kann beispielsweise eine gereinigte Polypeptidprobe sein, die ein bis mehrere Polypeptide enthält. Eine komplexe Probe kann beispielsweise ein Zell- oder ein Gewebelysat oder eine solche Fraktion sein, das bzw. die einige bis mehrere Hundert Polypeptide oder sogar Tausende oder Zehntausende Polypeptide enthält. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren kann die Bestimmung der Polypeptidcharakteristika das Sammeln von Versuchsdaten erforderlich machen, die das Ergebnis einer Reihe von Schritten, wie beispielsweise einer Reihe von chromatographischen Trennungen, sind.
Ein beispielhaftes Verfahren, das zur Organisation von Daten, die während der Analyse von komplexen Polypeptidproben erhalten wurden, nützlich ist, beinhaltet das Aufteilen von Informationen in theoretische "Speicher". Eine ICAT^TM-artig markierte Mischung aus Polypeptiden kann der Größe nach in eine bestimmte Anzahl von Speichern abgetrennt werden, wobei es sich um Fraktionen handeln kann, die aus einer Chromatographiesäule, wie für den Größenausschluss, den Ionenaustausch und dergleichen, eluiert wurden, oder um Segmente eines SDS-Polyacrylamid-Gels. Die Polypeptide in jedem Speicher können mittels eines sequenzspezifischen Spaltverfahrens fragmentiert werden. Alternativ kann die Analyse der Polypeptide in einer Probe ohne Fraktionieren der Polypeptide durchgeführt werden, solange eine ausreichende Reduzierung der Komplexität der Probe erfolgt, sodass die Identifizierung des Polypeptids ohne Fraktionierung möglich ist. Die in Speicher fraktionierte Peptidmischung kann mittels verschiedener Verfahren, einschließlich beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, wie sie zur Isolierung von ICAT^TM-artig markierten Peptiden verwendet wird, Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie oder anderer chromatographischer Techniken, weiter fraktioniert werden. Jeder Speicher mit Peptiden kann anschließend in einem weiteren Fraktionierschritt, wie Ionenaustauschchromatographie, gespeichert und erneut weiter in eine bestimmte Anzahl an Speicher aufgeteilt werden. Jeder dieser Speicher wiederum kann mittels eines anderen Fraktionierschritts, wie Umkehrphasenchromatographie, getrennt und weiter in eine bestimmte Anzahl an Speicher aufgeteilt werden, die jeweils mittels Massenspektrometrie analysiert werden können. Somit hat jedes mittels eines derartigen Verfahrens analysierte Polypeptid fünf assoziierte Charakteristika, die beispielsweise mittels eines 5-stelligen Polypeptididentifikationscodes oder "Strichcodes" auf der Grundlage von Cysteingehalt, Größe, Ladung, Hydrophobie und Masse dargestellt werden können.
Die Verfahren zur Indexierung der Charakteristika, die mit einer großen Anzahl an Polypeptiden assoziiert sind, benötigt Computerspeicherplatz, dessen Menge dem Quadrat zur Sequenzlänge entspricht. Zur Reduzierung der Anforderungen an den Speicherplatz kann eine moderne Datenstruktur, wie beispielsweise Suffixbäume, verwendet werden (Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences: Computer Science and Computational Biology, Cambridge University Press (1997)). Suffixbäume sind eine kompakte Datendarstellung für alle Suffixe einer Sequenzdatenbank. In ihrer Reinform können sie in linearer Zeit konstruiert und in einem linearen Speicher anstatt eines quadratischen Speichers gespeichert werden. Zur Optimierung der Rechenzeit und der Verwendung von Speicherplatz, der mit der Abfrage eines Polypeptididentifizierungsindex assoziiert ist, können verschiedene Modifikationen von Suffixbäumen und Traversal-Algorithmen verwendet werden.
Eine Gruppe bestimmter Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, werden mit einem Polypeptididentifizierungsindex verglichen. Zum Abgleich von Werten, die den bestimmten Charakteristika zugewiesen wurden, mit den annotierten Werten des Index können verschiedene Suchalgorithmen verwendet werden. Eine nützliche Strategie zur Verbesserung der Wirksamkeit einer Datenbankabfrage ist das Einengen oder "Beschränken" der Datenbank. Der Begriff "Beschränkung" bezieht sich, wenn er in Bezug auf einen Polypeptididentifizierungsindex verwendet wird, auf eine Begrenzung, die bei einem Polypeptididentifizierungsindex angewendet wird, um einen Subindex zu erhalten, der eine Fraktion der Polypeptididentifikationscodes enthält, die den Polypeptiden entspricht, die die Charakteristika aufweisen, die einem oder mehreren Charakteristika eines zu identifizierenden Polypeptids entsprechen. Ein Subindex kann dann erzeugt werden, wenn eine Gruppe von Polypeptiden mit einem gemeinsamen Charakteristikum in einem Polypeptididentifizierungsindex ausgewählt ist oder wenn ein bestimmtes Charakteristikum, das in einem Polypeptididentifikationscode enthalten ist, zum Ausschluss eines oder mehrerer Polypeptide von einem Index verwendet wird. Ein gemeinsames Charakteristikum kann ein festgelegtes physikalisch-chemisches Charakteristikum, wie eine partielle Aminosäuresequenz oder jedes andere bestimmte Charakteristikum sein, das einen Wertebereich zugewiesen hat. Die Masse eines Polypeptidfragments, die als ein Wertebereich ausgedrückt ist, der der Grund für den Fehler bei der Massenbestimmung ist, kann beispielsweise als eine Beschränkung bei der Selektion einer Untergruppe an Polypeptiden oder Fragmenten einer bestimmten Masse dienen.
Ein Charakteristikum, das mit einem Polypeptid assoziiert ist und das als Beschränkung für eine Datenbank verwendet werden kann, ist die partielle Aminosäurezusammensetzung. Die partielle Aminosäurezusammensetzung eines Polypeptids umfasst die Identifizierung mindestens einer einzigen Aminosäure, die in einem bestimmten Polypeptid oder Fragment davon vorhanden ist. Eine partielle Aminosäuresequenz kann beispielsweise durch Behandeln eines Polypeptids oder eines Fragments davon mit einer Reagenz erhalten werden, was zur Erzeugung eines Polypeptids oder Fragments davon führt, das eine oder mehrere festgelegte Aminosäuren enthält. Ein sequenzspezifisches Spaltverfahren für Polypeptide erzeugt beispielsweise Fragmente mit einem oder mehreren bekannten Aminosäureresten an dem Carboxy- oder Amino-Terminus des Fragments. Es ist jedoch nicht nötig zu wissen, ob sich ein spezifischer Aminosäurerest an dem Carboxy- oder Amino-Terminus des Fragments eines Polypeptids befindet. Demzufolge zeigt die Spaltung eines Polypeptids mit einer sequenzspezifischen Protease die Gegenwart der entsprechenden Aminosäure und/oder Sequenz im Polypeptid oder Peptidfragment davon an. Analog kann ein Reagenz dazu verwendet werden, einen oder mehrere spezifische Aminosäurereste eines Polypeptids oder Fragments spezifisch zu modifizieren oder zu markieren. Ein Polypeptid oder Fragment, das eine derartige Modifizierung oder Markierung enthält, enthält bekanntermaßen eine spezifische Aminosäure. Die partielle Aminosäurezusammensetzung ist ein Charakteristikum, das mit einem Polypeptid assoziiert ist und das als Beschränkung eines Polypeptididentifizierungsindex bei der Erzeugung eines Polypeptididentifizierungssubindex nützlich ist.
Der Vergleich einer Gruppe bestimmt Charakteristika mit einem Polypeptididentifizierungsindex kann somit eine Reihe von Anfragen beinhalten, die durch ein bestimmtes Charakteristikum eines Polypeptids beschränkt sind. Beispielsweise kann eine erste Abfrage betreffend die Masse eines parentalen Polypeptids oder Fragments durchgeführt werden, die zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungssubindex führt, der Massenwerte für Polypeptide und Fragmente enthält, die dem zu identifizierenden Polypeptid oder Fragment davon ähnlich sind, das heißt, innerhalb des Toleranzbereichs des Instruments liegen. Ein zweites Charakteristikum, mit dem der erzeugte Polypeptididentifizierungssubindex durchsucht wird, wie die Gegenwart eines Cysteinrests in dem zu identifizierenden Polypeptid, sieht eine weitere Beschränkung vor und kann zur Erzeugung eines weiteren Polypeptididentifizierungssubindex verwendet werden.
Die bestimmte Masse eines Polypeptids oder Fragments ist ein Charakteristikum, das vorteilhaft zur Beschränkung einer derartigen Datenbankabfrage verwendet werden kann, um die Wirksamkeit beim Durchsuchen einer großen Datenbank zu erhöhen. So können beispielsweise die Tandem-MS-Spektren unter Verwendung einer Software, wie SEQUEST^TM, analysiert werden, die eine Liste von Peptiden aus einer Datenbank erzeugt, die der Molekülmasse des unbekannten Peptids entsprechen, das einer CID unterworfen worden war, und die dann das beobachtete CID-Spektrum des unbekannten Peptids mit denen aller mögliche Isobare vergleicht (Eng, J. et al., J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5: 976–989, (1994)). Somit stellt die Gruppe von Peptiden mit einer dem zu analysierenden Polypeptidfragment ähnlichen Masse, die durch diese Art der Abfrage erzeugt wird, eine Untergruppe von möglichen parentalen Polypeptiden bereit, die durch das Polypeptidfragment repräsentiert ist. Die Untergruppe kann dann zur Identifizierung des parentalen Polypeptids beispielsweise unter Verwendung einer partiellen Aminosäurezusammensetzung durchsucht werden. Fachleuten sind die passenden Korrelationspunktparameter für eine bestimmte Abfrage unter Verwendung von Softwareanwendungen, wie SEQUEST^TM, bekannt oder sie können diese problemlos bestimmen.
Ein Verfahren zum Vergleich von zwei oder mehr Polypeptidpopulationen bedient sich eines Verfahren zur quantitativen Unterscheidung der beiden Polypeptidpopulationen, wie des hier beschriebenen Verfahrens unter Verwendung eines ICAT^TM-artigen Reagenz, das in 3 dargestellt ist. In diesem Schritt können zwei oder mehr chemisch identische aber unterschiedlich isotopenmarkierte ICAT^TM-artige Reagenzien verwendet werden. Somit können mehrere Proben mit den hier beschriebenen Verfahren verglichen werden, obwohl 3 nur zwei Proben darstellt. Die in 3 dargestellten Proben enthalten Polypeptidpopulationen, die vom selben Probentyp geerntet wurden, sich jedoch hinsichtlich der Wachstumsbedingungen unterscheiden. Zu beispielhaften unterschiedlichen Wachstumsbedingungen können das Wachstum unter unterschiedlichen Stoffwechselbedingungen oder Zellen mit unterschiedlichem Stoffwechselzustand, der Vergleich einer normalen und einer krankhaften Probe, wie einer Tumorprobe, der Vergleich von nicht behandelten und mit einem pharmazeutischen Wirkstoff behandelten Zellen und dergleichen gehören.
Wie in 3 dargestellt, werden die Proben unabhängig voneinander unter Verwendung eines ICAT^TM-artigen Reagenz markiert, vereinigt und die Charakteristika der Polypeptide und entsprechenden Fragmente werden wie hier beschrieben bestimmt. Während dieses Vorgangs erzeugte Polypeptide und Fragmente können, falls erwünscht, unter Verwendung einer einstufigen Massenspektrometrie anstatt MS/MS analysiert werden, um den Probendurchsatz und die Empfindlichkeit zu erhöhen (Goodlett et al., supra, 2000). Die für die Polypeptide und Fragmente bestimmten Charakteristika werden, wie hier beschrieben, zur Bestimmung der Polypeptididentitäten verwendet. Anschließend können die Massenspektren auf Paare von Peptid-Ionen untersucht werden, die während des gesamten Vorgangs gemeinsam fraktioniert wurden und die einen Massenunterschied aufweisen, der genau dem von dem ICAT^TM-artigen Reagenz kodierten Massenunterschied entspricht. Die relative Signalstärke der beiden Peaks gibt die relative Häufigkeit der Fragmentpolypeptide an und ist somit ein Anzeichen für die relative Häufigkeit des entsprechenden parentalen Polypeptids, das anfänglich in der Probe vorhanden war. Somit kann ein Verfahren zum Vergleichen der in zwei Polypeptidproben enthaltenen Polypeptide die Erzeugung von zwei Polypeptid-Bezugsindices beinhalten, die neben einem Polypeptididentifikationscode eine quantitative Bestimmung einer Polypeptidmenge für jedes identifizierte Polypeptid enthalten.
Ein alternatives Verfahren zum Vergleichen von zwei oder mehr Polypeptidpopulationen ist der Vergleich von einer oder mehreren Polypeptidproben mit einem zuvor bestimmten Polypeptid-Bezugsindex. Eine Gruppe von Charakteristika für ein oder mehrere Polypeptide in einer Polypeptidprobe kann identifiziert und mit einem Polypeptididentifizierungs-Bezugsindex verglichen werden, um die Identitäten eines oder mehrerer Polypeptide und die relativen Mengen der identifizierten Polypeptide zu bestimmen. Falls erwünscht, kann eine unbekannte Probe unter Verwendung der vorstehend beschriebenen quantitativen Verfahren mit einer Bezugsprobe verglichen werden, um die relativen Expressionsniveaus der Polypeptide zu bestimmen. Eine Bezugsprobe kann beispielsweise eine Probe von einem gesunden Individuum oder eine unter einer Kontrollbedingung erstellte Probe sein, die für den Vergleich des physiologischen Zustands einer anderen Probe, wie einer krankhaften Probe, nützlich ist.
Ein Polypeptididentifizierungsindex, der quantitative Bestimmungen der Polypeptidmenge enthält, gilt als ein "Polypeptidprofil" der jeweiligen zur Erzeugung des Index verwendeten Probe. Ein Polypeptidprofil, wie hier verwendet, ist eine Gruppe von Polypeptididentifikationscodes, die eine für eine spezifische Probe erzeugte Polypeptidmenge umfassen.
Ein Polypeptidprofil ist für Proteomikverfahren nützlich, da ein derartiges Profil zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Bedingungen und Zuständen der Zellen, Gewebe, Organe und Organismen verwendet werden kann. Das Polypeptid, das von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird, kann zur Festlegung des Zustands der Zelle oder des Gewebes zum Messzeitpunkt herangezogen werden. Somit können die quantitativen und qualitativen Unterschiede von Proteinprofilen desselben Zelltyps in unterschiedlichen Zuständen zur Diagnose der jeweiligen Zustände beitragen. Zu Beispielen für derartige Vergleiche gehören normale und Tumorzellen, Zellen mit unterschiedlichen Stoffwechselzuständen sowie nicht behandelte und mit einem pharmazeutischen Wirkstoff behandelte Zellen. Der Unterschied zwischen zwei Polypeptidprofilen kann als "differenzielles Polypeptidprofil" bezeichnet werden. Ein differenzielles Polypeptidprofil ist bei der Analyse quantitativer Änderungen von Polypeptiden nützlich, die in Proben enthalten sind, welche von verschiedenen Zelltypen, wie beispielsweise Krebs- und normalen Zellen, stimulierten und nicht stimulierten Zellen oder von verschiedenen Gewebeproben von klinischem Interesse abgeleitet sind.
Die Verfahren zur Erzeugung differenzieller Polypeptidprofile sind für die Analyse der Veränderungen von Polypeptidprofilen in Proben, wie Körperflüssigkeiten, anwendbar. Ein differenzielles Polypeptidprofil wird mithilfe eines Vergleichs des Polypeptidprofils zweier Spezimens, beispielsweise eines normalen und eines mit einer Krankheit verbundenen Polypeptidprofils, bestimmt. Beispielsweise kann ein Polypeptidprofil, das einen normalen Zustand des Spezimens darstellt, erzeugt und mit einem Spezimen verglichen werden, das unter Verdacht steht, einen anomalen oder krankhaften Zustand zu haben. Alternativ kann ein Polypeptidbezugsprofil, das einen Krankheitszustand darstellt, mit einem Spezimen eines Individuums verglichen werden, das einen bestimmten Krankheitszustand aufweist oder möglicherweise aufweist. Ein Polypeptidbezugsprofil, das einen normalen oder krankhaften Zustand darstellt, kann unter Verwendung eines Spezimens eines bestimmten Individuums oder einer Population aus Individuen bestimmt werden.
Falls erwünscht, kann die Analyse mit einer Population anstatt einem Individuum durchgeführt werden, insbesondere einer Bezugspopulation oder Kontrollpopulation. Eine derartige Bezugspopulation kann für den Vergleich mit einer unbekannten Probe verwendet werden. Ein Fachmann kann eine geeignete Bezugspopulation auf der Grundlage der jeweiligen Anwendung der bevorzugten Verfahren bestimmen. Die bevorzugten Verfahren können zur Erzeugung eines differenziellen Polypeptidprofils verwendet werden, mit dem die unterschiedliche Polypeptidexpression zwischen zwei Proben, beispielsweise einem normalen oder krankhaften Zustand, identifiziert wird. Die Größe der Bezugspopulation ist von den zur Auswahl der Bezugsindividuen angelegten Kriterien abhängig. In Abhängigkeit von den Selektionskriterien und der jeweiligen Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Bezugspopulation eine verhältnismäßig kleine Anzahl bis zu einer großen Anzahl an Individuen, bis einschließlich Tausender von Individuen, umfassen.
Die Analyse von Proben im Großmaßstab von Patienten mit einer spezifisch diagnostizierten Krankheit oder mit Anzeichen oder Symptomen einer Krankheit ist für die Identifizierung klinischer Marker oder Markerkonstellationen der jeweiligen Zustände nützlich. Proben von Individuen mit einer Krankheit können zur Erzeugung eines qualitativen und/oder quantitativen Polypeptididentifizierungsindex für diese Krankheit verwendet werden. Analog kann die vergleichende Analyse von Polypeptiden, die in Proben von Patienten enthalten sind, welche eine therapeutische Behandlung erhalten, zur Identifizierung von Diagnosemarkern oder Markerkonstellationen verwendet werden, die den Erfolg oder Misserfolg der Behandlung anzeigen. Die Verfahren sind auch bei der Analyse solcher Proben in einem systematischen, populationsweiten Maßstab für die Entdeckung oder das Screening von Markern oder Markerkonstellationen anwendbar, die für die Anzeige einer Prädisponierung von Individuen für bestimmte klinische Zustände nützlich sind.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des (a) Bestimmens einer Gruppe von zwei der mehr Charakteristika, die mit einem ersten Polypeptid oder einem Peptidfragment davon assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Peptidfragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie bestimmt wird; (b) Wiederholens von Schritt (a) mit einem zweiten Polypeptid; (c) wahlweise Bestimmens eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem ersten und dem zweiten Polypeptid assoziiert sind, wobei die bestimmten Charakteristika zur Unterscheidung des ersten und des zweiten Polypeptids ausreichen, wodurch ein Polypeptididentifizierungsindex für das erste und das zweite Polypeptid erzeugt wird. Das Verfahren kann ferner das ein- oder mehrmalige Wiederholen von Schritt (a) bis (c) mit einem unterschiedlichen Polypeptid umfassen, wobei die bestimmten Charakteristika zur Unterscheidung der jeweiligen Polypeptide ausreichen, wodurch ein Polypeptididentifizierungsindex für die jeweiligen Polypeptide erzeugt wird. Wie bei der Bestimmung von Charakteristika eines Polypeptids kann der Polypeptididentifizierungsindex mit jedem der hier offenbarten Verfahren oder jedem gut bekannten Verfahren zur Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind, bestimmt werden. Der Polypeptididentifizierungsindex kann wahlweise durch eine Massenbestimmung in Abwesenheit von Ionenselektion erhalten werden.
Die Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex können die Bestimmung der Polypeptid- oder Fragmentmasse in Abwesenheit von Ionenselektion zur Erzeugung von Fragment-Ionen beinhalten und können ferner die Bestimmung einer Fragmentmasse mit einer Genauigkeit von mehr als 1 Teil je Million oder, falls erwünscht, einer noch geringeren Genauigkeit (höherer ppm) beinhalten. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann zwar eine Aminosäuresequenz für ein Polypeptid umfassen, zur Durchführung der Verfahren der bevorzugten Ausführungsform zum Erzeugen eines Polypeptididentifizierungsindex oder zur Identifizierung eines Polypeptids unter Verwendung eines Polypeptididentifizierungsindex ist eine Sequenzanalyse eines Polypeptids oder Fragments jedoch nicht erforderlich.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids bereit. Das Verfahren kann die Schritte des (a) simultanen Bestimmens der Masse einer Untergruppe von parentalen Polypeptiden einer Population von Polypeptiden und der Masse von Peptidfragmenten der Untergruppe von parentalen Polypeptiden; (b) Vergleichens der bestimmten Massen mit einem Polypeptididentifizierungsindex und (c) Identifizierens eines oder mehrerer Polypeptide des Polypeptididentifizierungsindex mit den bestimmten Massen umfassen. Der Polypeptididentifizierungsindex kann ein annotierter Polypeptidindex sein. Das Verfahren kann ferner die Schritte des (d) Bestimmens eines oder mehrerer Charakteristika, die mit einem oder mehreren der parentalen Polypeptide assoziiert sind; (e) Vergleichens der in Schritt (a) und Schritt (d) bestimmten Charakteristika mit dem Polypeptididentifizierungsindex und (f) wahlweise Wiederholens der Schritte (d) und (e) ein oder mehrere Male umfassen, wobei eine Gruppe von Charakteristika bestimmt wird, die ein parentales Polypeptid als einziges Polypeptid im Polypeptididentifizierungsindex identifiziert. Die Verfahren können darüber hinaus das Quantifizieren der Menge des identifizierten Polypeptids in einer Probe, die das Polypeptid enthält, umfassen. Wie hier offenbart, können das vorstehende Verfahren sowie andere Verfahren mit bestimmten Massengenauigkeiten durchgeführt werden. Die Identifizierung eines parentalen Polypeptids als ein einziges Polypeptid in einem Polypeptididentifizierungsindex bezieht sich auf die Bestimmung einer ausreichenden Anzahl an Charakteristika, sodass ein bestimmtes Polypeptid in dem Polypeptididentifizierungsindex den bestimmten Charakteristika entspricht, das heißt, sodass ein Polypeptid identifiziert ist.
Ein Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids umfasst einen Schritt des simultanen Bestimmens der Masse einer Untergruppe von parentalen Polypeptiden einer Population von Polypeptiden und der Masse von Polypeptidfragmenten der Untergruppe von parentalen Polypeptiden (siehe Beispiel III). Die simultane Bestimmung der Masse einer Untergruppe von parentalen Polypeptiden bezieht sich auf die Erfassung von Massewerten für eine Untergruppe von parentalen Polypeptiden aus einer einzige Probe, die eine Polypeptidpopulation enthält. Der Begriff "simultan" soll hier bedeuten, dass die Massen von parentalen Polypeptiden und Polypeptidfragmenten derart gleichzeitig bestimmt werden, dass das verwendete MS-Verfahren die Massen der parentalen Polypeptide und der entsprechenden Fragmente innerhalb eines Zeitrahmens erfassen kann, der dafür ausreicht, die parentale und fragmentarische Masse mit derselben Untergruppe an Polypeptiden zu korrelieren. Die mittels eines MS- Verfahrens untersuchten Polypeptide verändern sich im Laufe der Zeit, da unterschiedliche Untergruppen von Polypeptiden aus einer Chromatographiesäule eluieren, wie dies durch die Durchflussgeschwindigkeit der Säule vorgegeben ist. Eine simultane Bestimmung tritt während eines Zeitintervalls vor der Veränderung einer bestimmten Untergruppe an Polypeptiden aufgrund der Einführung eines zusätzlichen Polypeptids oder des Verlustes eines Polypeptids der Polypeptiduntergruppe auf, was aufgrund der online Probennahmeverfahren erfolgt.
Die simultane Bestimmung der Masse einer Untergruppe an Polypeptiden kann beispielsweise in Abwesenheit der Selektion eines Einzelions für die Massenbestimmung durchgeführt werden. Anstatt eines einzigen Ions können beispielsweise mehrere Polypeptide selektiert werden (Masselon et al., Anal. Chem. 72: 1918–1924 (2000)). In Verfahren der bevorzugten Ausführungsform werden vorzugsweise mehr als 5 Ionen, beispielsweise 6 Ionen, 7 Ionen, 8 Ionen, 9 Ionen, 10 Ionen oder sogar noch größere Ionenzahlen selektiert. In einem solchen Fall ist der Polypeptididentifizierungsindex vorzugsweise ein annotierter Polypeptidindex.
Alternativ kann eine simultane Bestimmung der Massen einer Untergruppe an Polypeptiden in Abwesenheit von Einzelionenselektion oder in Abwesenheit von Ionenselektion in einer Ursprungsregion durchgeführt werden (siehe 2). In einem solchen Fall werden die erhaltenen Fragment-Ionen dekonvoliert, um zu bestimmen, welche Ionen mit einem bestimmten parentalen Polypeptid assoziiert und somit als Charakteristikum, das mit dem parentalen Polypeptid assoziiert ist, nützlich sind. Ein derartiges Verfahren kann für den Nachweis und die Identifizierung weniger häufiger Ionen, die mittels üblicher MS-Verfahren nicht für die Fragmentierung selektiert werden, nützlich sein.
Ein Massenspektrometrieverfahren, das zum simultanen Erhalten der Massen von Polypeptiden und Polypeptidfragmenten nützlich ist, ist in-source CID auf ESI-TOF. Das Verfahren beinhaltet das kontinuierliche Verändern zwischen Scans des parentalen Ions und in-source CID. In-source CID Scans stellen spezifische Fragment-Ionen bereit, die selbst in Gegenwart von mehreren fragmentierten parentalen Ionen zu einem bestimmten parentalen Ion zurückführbar sind. Die Stammbäume parentaler Fragment-Ionen können mittels Dekonvolieren der Massenspektrometriedaten unter Verwendung einer geeigneten Software bestimmt werden. MS-Instrumente, die Messungen mit geringerer Genauigkeit bereitstellen, z. B. ESI-TOF, können vorteilhaft zur Bereitstellung eindeutiger Beschränkungen der Polypeptididentifizierung verwendet werden.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des (a) Bestimmens zweier oder mehrerer Charakteristika, die mit dem Polypeptid oder einem Fragment davon assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Fragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie in Abwesenheit von Ionenselektion für die Erzeugung von Fragment-Ionen bestimmt wird; (b) Vergleichens der Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, mit einem Polypeptididentifizierungsindex, und (c) Identifizierens eines oder mehrerer Polypeptide in dem Polypeptididentifizierungsindex mit den bestimmten Charakteristika. Das Verfahren kann ferner die Schritte des (d) Bestimmens eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, und (e) Vergleichens der in Schritt (a) und Schritt (d) bestimmten Charakteristika mit dem Polypeptididentifizierungsindex umfassen. Wie bei den anderen Verfahren der bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren das Quantifizieren der Menge des identifizierten Polypeptids in einer Probe umfassen. Die Verfahren können auch mit einer bestimmten Massengenauigkeit durchgeführt werden.
Somit stellt die bevorzugte Ausführungsform auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Polypeptids bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des (a) Bestimmens zweier oder mehrerer Charakteristika, die mit dem Polypeptid oder einem Fragment davon assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Fragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie mit einer Genauigkeit in ppm von mehr als 2,5 ppm bestimmt wird; (b) Vergleichens der Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, mit einem Polypeptididentifizierungsindex, und (c) Identifizierens eines oder mehrerer Polypeptide in dem Polypeptididentifizierungsindex mit den bestimmten Charakteristika. Das Verfahren kann ferner die Schritte des (d) Bestimmens eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit dem Polypeptid assoziiert sind, und (e) Vergleichens der in Schritt (a) und Schritt (d) bestimmten Charakteristika mit dem Polypeptididentifizierungsindex umfassen. Die Verfahren können auch mit einer niedrigeren Genauigkeit (höherer ppm) durchgeführt werden.
Wie hier offenbart, wurden parentale Proteine mithilfe einer Kombination aus (1) Cysteingehalt, (2) genauer Peptidmasse und (3) genauer Peptidfragmentmasse ohne Selektion spezifischer Ionen identifiziert (siehe Beispiel IV). Obwohl in diesem bestimmten Beispiel der Cysteingehalt gewählt wurde, ist der Cysteingehalt nicht zwingend ein bestimmtes Charakteristikum. Im Gegensatz zur herkömmlichen Tandem-MS wurden alle gemeinsam MS unterworfenen Peptide ohne Einzelionenselektion fragmentiert. Alle Fragment-Ionen der beiden simultan fragmentierten Peptide wurden im Gegensatz zur Tandem-MS, bei der Fragment-Ionen jeweils pro Einzelpeptid gemessen werden, gemeinsam gemessen.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform beinhalten die Bestimmung von Charakteristika, die mit einem Polypeptid assoziiert sind. Eine ein Polypeptid enthaltende Probe kann so einfach sein wie eine isolierte ein Polypeptid enthaltende Polypeptidmischung oder so komplex wie eine Probe, die im Wesentlichen alle in einem Organismus exprimierten Polypeptide enthält. Ferner kann eine Probe, falls erwünscht unter Verwendung der hier offenbarten Verfahren fraktioniert werden.
Ein Polypeptid kann in einer aus einer Vielfalt von Quellen isolierten Probe sein. Eine Polypeptidprobe kann beispielsweise aus jeder beliebigen biologischen Flüssigkeit, Zelle, Gewebe, Organ oder einem Teil davon oder jeder beliebigen Art eines Organismus gewonnen werden. Eine Probe kann in einem Individuum vorliegen oder von dem Individuum genommen oder abgeleitet werden. Eine Probe kann beispielsweise ein histologischer Schnitt eines Spezimens, das mittels Biopsie erhalten wurde, oder Zellen, die von einem Individuum isoliert und in eine Gewebekultur gegeben oder zu einer solchen umgewandelt wurden, darstellen. Eine Probe kann ferner eine subzelluläre Fraktion oder ein solches Extrakt darstellen. Eine Probe kann mittels Verfahren vorbereitet werden, die im Fachgebiet zur Erhaltung der Polypeptidsolubilität bekannt sind, wie derjenigen, die hier nachstehend beschrieben sind.
Ein Spezimen bezieht sich spezifisch auf eine von einem Individuum erhaltene Probe. Ein Spezimen kann von einem Individuum als Flüssigkeits- oder Gewebegut gewonnen werden. Ein Gewebespezimen kann beispielsweise mittels einer Biopsie, wie einer Hautbiopsie, Gewebebiopsie oder Tumorbiopsie, gewonnen werden. Ein flüssiges Spezimen kann Blut, Serum, Urin, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit oder jede andere Körperflüssigkeit sein. Insbesondere ein flüssiges Spezimen ist bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich, da flüssige Spezimens schnell von einem Individuum erhalten werden können. Verfahren zum Sammeln von Spezimens sind dem Fachmann gut bekannt (siehe beispielsweise Young and Bermes, in Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3. Ausgabe, Burtis and Ashwood, Herausgeber, W. B. Saunders, Philadelphia, Kapitel 2, S. 42–72 (1999)).
Ein Polypeptid, das in den Verfahren der bevorzugten Ausführungsform verwendet werden soll, kann aus einer Quelle, wie einer Zelle, Gewebe, einem Organ oder einem Organismus, gewonnen werden. Im Fachgebiet sind eine Vielfalt von Verfahren zur Lyse einer Zelle bekannt. Zellen können beispielsweise mithilfe von Denaturierungsmitteln, einem oder mehreren Gefrier- und Auftauzyklen, Ultraschallbehandlung und dergleichen aufgelöst werden. Nach der Lyse kann die Polypeptidmischung einem Fraktionierschritt unterworfen werden, um beispielsweise Nukleinsäure oder Lipide zu entfernen oder um intakte subzelluläre Fraktionen oder Organellen zu entfernen. Verfahren zum Auflösen und Fraktionieren sind Fachleuten gut bekannt (siehe Scopes, supra, 1993).
Zur Identifizierung eines Polypeptids kann eine Probe oder ein Spezimen in einem Puffer enthalten sein, der sich zur Aufrechterhaltung der Polypeptidsolubilität eignet, wie beispielsweise ein Puffer, der ein Tensid enthält, einschließlich Denaturierungsmittel, wie Natriumdodecylsulfat (SDS). Zu Denaturierungsmitteln, die zur Solubilisierung von Polypeptiden nützlich sind, gehören beispielsweise Guanidin-HCl, Guanidinisothiocyanat, Harnstoff und dergleichen. Im Falle von Guanidinisothiocyanat kann ein solches Reagenz, wie bei der Behandlung mit jedem Reagenz, das ein Polypeptid kovalent modifizieren kann, verwendet werden, solange der Polypeptididentifizierungsindex, mit dem die Probe verglichen werden soll, im Wesentlichen auf dieselbe weise hergestellt wurde wie die Probe, sodass dies für einen Vergleich desselben Polypeptids ausreicht. Andere im Fachgebiet bekannte Denaturierungsmittel können auf ähnliche Weise für solubilisierte Polypeptide verwendet werden. Darüber hinaus können Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE) oder Mercaptoethanol enthalten sein.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform können wahlweise Proteinfraktionierschritte beinhalten. Die Proteinfraktionierung bezieht sich auf jedes Verfahren, das zum Entfernen von einem oder mehreren Polypeptiden aus einer Polypeptidpopulation nützlich ist. Zum Fraktionieren kann beispielsweise ein Zentrifugierschritt gehören, der lösliche von unlöslichen Komponenten trennt, ein Elektrophoreseverfahren, ein Chromatographieverfahren oder jedes der offenbarten Verfahren. Für die chromatographische Trennung kann eine große Vielfalt an im Fachgebiet gut bekannten chromatographischen Medien zum Trennen von Polypeptidpopulationen verwendet werden. Polypeptide können beispielsweise auf der Grundlage von Größe, Ladung, Hydrophobie, Bindung an bestimmte Farbstoffe und andere Gruppierungen, einschließlich Affinitätsliganden, die mit chromatographischen Medien assoziiert sind, getrennt werden. Harze für den Größenausschluss, die Gelfiltration und die Gelpermeation sind für die Polypeptidtrennung auf Grundlage der Größe nützlich. Beispiele für chromatographische Medien für eine Trennung auf Ladungsbasis sind starke und schwache Anionenaustausch- sowie starke und schwache Kationenaustauschharze. Hydrophobe oder Umkehrphasenchromatographie können ebenfalls verwendet werden.
Auch die Affinitätschromatographie kann verwendet werden, einschließlich Farbstoff bindender Harze, wie Cibacron Blau, Substratanaloge, einschließlich Analoger von Cofaktoren, wie ATP, NAD und dergleichen, Liganden, spezifischer Antikörper, entweder polyklonal oder monoklonal, und dergleichen. Ein beispielhaftes Affinitätsharz umfasst die Affinitätsharze, die an spezifische Gruppierungen binden, welche in ein Polypeptid eingearbeitet werden können, wie Avidinharz, das an ein Biotintag auf einem Polypeptid bindet, wie hier offenbart. Die Auflösung und die Kapazität eines bestimmten chromatographischen Mediums sind im Fachgebiet bekannt und können von Fachleuten bestimmt werden. Die Nützlichkeit einer bestimmten chromatographischen Trennung für eine bestimmte Anwendung kann auf ähnliche Weise von Fachleuten beurteilt werden.
Fachleute können die passenden Chromatographiebedingungen für eine bestimmte Probengröße oder -zusammensetzung bestimmen und wissen, wie wiederholfähige Ergebnisse für chromatographische Trennungen bei Festlegung von Puffer, Säulenabmessungen, Durchflussgeschwindigkeit, Temperatur und anderen Bedingungen erhalten werden können. Proteinfraktionierverfahren können wahlweise die Verwendung eines internen Standards umfassen, beispielsweise zur Beurteilung der Wiederholfähigkeit einer bestimmten chromatographischen Anwendung oder eines anderen Fraktionierschritts. Passende interne Standards variieren und sind von dem chromatographischen Medium oder Fraktionierschritt abhängig. Fachleute können einen internen Standard, der für ein Chromatographieverfahren oder einen Fraktionierschritt geeignet ist, festlegen.
Zur Reduzierung der Komplexität einer Polypeptidprobe für die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform ist das Markieren von Polypeptiden nützlich und stellt eine Beschränkung für eine Datenbankabfrage dar und ermöglicht quantitative Polypeptidvergleiche. Die Komplexität einer Polypeptidprobe kann durch Markieren eines Polypeptids mit einem Affinitätstag reduziert werden, der zur Isolierung einer Subpopulation von Polypeptiden, die dieses Tag. enthält, verwendet werden kann. Eine Population aus Polypeptiden und Fragmenten kann beispielsweise an einer verhältnismäßig seltenen Aminosäure, wie Cystein, oder auf der Grundlage einer posttranslationalen Modifikation markiert und eine Subpopulation aus Polypeptiden und Fragmenten, die dieses Tag enthalten, kann isoliert werden. Die Subpopulation an Polypeptiden und Fragmenten, die durch Markieren einer bestimmten Aminosäure isoliert wurde, enthält somit eine bekannte Aminosäure. Wie hierin beschrieben, stellt eine bekannte Aminosäure eine partielle Aminosäurezusammensetzung dar, die zur Beschränkung einer Datenbankabfrage nützlich ist. Mittels unterschiedlicher Markierung zweier Polypeptide oder Polypeptidpopulationen können quantitative Polypeptidvergleiche vorgenommen werden. Ein ICAT^TM-artiges Affinitätsreagenz oder ein IDEnT-artiges Reagenz, die nachstehend ausführlicher besprochen werden, sind für diesen Zweck besonders nützlich, es kann jedoch auch jedes andere Verfahren zum Markieren von Polypeptiden auf ähnliche Weise für Polypeptidvergleiche angewandt werden.
Das Markieren von Polypeptiden kann unter Verwendung einer Vielfalt von im Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden. Ein Reagenz zum Markieren oder Modifizieren von Polypeptiden kann verschiedene Komponenten enthalten, die durch Linker-Regionen voneinander getrennt sind. Komponenten eines Reagenz zum Markieren von Polypeptiden können eine reaktive Gruppe umfassen, die eine spezifische chemische Gruppe eines Polypeptids modifiziert, eine Gruppierung, die beispielsweise mittels Massenspektrometrie erfasst werden kann, und ein Affinitätstag, das zur Isolierung des Polypeptids verwendet wird. Nachstehend sind zwei Beispiele für Reagenzien zum Markieren von Polypeptiden, ICAT^TM-artig und IDEnT, ausführlich beschrieben, es kann jedoch, falls erwünscht, jede andere Art von Polypeptidtag verwendet werden.
Die Verfahren für den quantitativen Vergleich zweier Polypeptidpopulationen können die Verwendung eines Isotope coded Affinity Tag-artigen (ICAT^TM) Verfahrens beinhalten (Gygi et al., Nature Biotechnol. 17: 994–999 (1999); WO 00/11208) umfassen. Ein ICAT^TM-artiges Reagenz kann darüber hinaus für Anwendungen zum Markieren von Polypeptiden nützlich sein, die keinen quantitativen Vergleich beinhalten. Das Verfahren mit einem ICAT^TM-artigen Reagenz verwendet ein Affinitätstag, das differenziell mit einem Isotop markiert ist, welches sich problemlos unter Verwendung der Massenspektrometrie unterscheiden lässt, wie Wasserstoff und Deuterium. Das ICAT^TM-artige Affinitätsreagenz besteht aus drei Elementen, einem Affinitätstag, einem Linker und einer reaktiven Gruppe.
Ein Element des ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz ist ein Affinitätstag, das eine Isolierung von Peptiden ermöglicht, welche durch Binden an einen spezifischen Bindungspartner des Affinitätstags an das Affinitätstag gekoppelt sind. Ein besonders nützliches Affinitätstag ist Biotin, das mit hoher Affinität an seinen spezifischen Bindungspartner Avidin oder verwandte Moleküle, wie Streptavidin, bindet und somit gegenüber weiteren biochemischen Manipulationen stabil ist. Es kann jedes beliebige Affinitätstag verwendet werden, solange eine ausreichende Bindungsaffinität mit dem spezifischen Bindungspartner besteht, die eine Isolierung von Peptiden ermöglicht, welche an das ICAT^TM-artige Affinitätsreagenz gekoppelt sind. Ein Affinitätstag kann auch zur Isolierung eines markierten Peptids mit magnetischen Kügelchen oder einem anderen magnetischen Format, das zur Isolierung eines magnetischen Affinitätstags geeignet ist, verwendet werden. Bei Verfahren mit einem ICAT^TM-artigen Reagenz oder jedem anderen Verfahren zur Affinitätsmarkierung eines Peptids kann ein kovalentes Abfangen dazu verwendet werden, die markierten Peptide, falls erwünscht, an einen festen Träger zu binden.
Ein zweites Element des ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz ist ein Linker, der in ein stabiles Isotop eingearbeitet werden kann. Der Linker hat eine Länge, die ausreicht, um das Binden der reaktiven Gruppe an ein Polypeptid des Spezimens und das Binden des Affinitätstags an den spezifischen Bindungspartner zu ermöglichen. Der Linker weist auch eine Zusammensetzung auf, die geeignet ist, die Einarbeitung eines stabilen Isotops an einem oder mehreren Atomen zu ermöglichen. Ein besonders nützliches stabiles Isotopenpaar ist Wasserstoff und Deuterium, die unter Verwendung der Massenspektrometrie problemlos als leichte bzw. schwere Form unterscheidbar sind. In den Linker kann eine beliebige Anzahl isotoper Atome eingearbeitet werden, solange die leichte und die schwere Form unter Verwendung der Massenspektrometrie unterschieden werden kann. Zu beispielhaften Linkern gehören der Linker auf der Grundlage von 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin und dessen verwandte deuterierte Form, 2,2',3,3',11,11',12,12'-Octadeutero-4,7,10-trioxa-1,13-tridecandiamin, die von Gygi et al. (supra, 1999) beschrieben sind. Der Fachmann kann problemlos jeden beliebigen einer Anzahl an passenden Linker finden, der in einem ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz, das die vorstehend genannten Kriterien erfüllt, nützlich ist.
Das dritte Element des ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz ist eine reaktive Gruppe, die kovalent an ein Polypeptid des Spezimens gekoppelt werden kann. Verfahren zur Modifizierung von Seitenkettenaminosäuren an Polypeptiden sind Fachleuten gut bekannt (siehe beispielsweise Glazer et al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Chemical Modification of Proteins, Kapitel 3, S. 68–120, Elsevier Biomedical Press, New York (1975); Pierce Catalog (1994), Pierce, Rockford IL). Jede beliebige einer Vielfalt von reaktiven Gruppen kann in ein ICAT^TM-artiges Affinitätsreagenz eingearbeitet werden, solange die reaktive Gruppe kovalent an ein Polypeptid gekoppelt werden kann. Ein Polypeptid kann beispielsweise über eine für Sulfhydryl reaktive Gruppe, die mit den freien Sulfhydrylen von Cystein reagiert oder Cystine in einem Polypeptid reduziert, an ein ICAT^TM-artiges Affinitätsreagenz gekoppelt werden. Eine beispielhafte für Sulfhydryl reaktive Gruppe umfasst eine Iodacetamidgruppe, wie bei Gygi et al. (supra, 1999) beschrieben. Zu weiteren beispielhaften für Sulfhydryl reaktiven Gruppen gehören Maleinimide, Alkyl- und Arylhalogenide, α-Halogenacyle und Pyridyldisulfide. Falls erwünscht, können die Polypeptide vor der Reaktion mit einem ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz reduziert werden, was dann besonders nützlich ist, wenn das ICAT^TM-artige Affinitätsreagenz eine für Sulfhydryl reaktive Gruppe enthält.
Eine reaktive Gruppe kann auch mit Aminen, wie beispielsweise Lys, Imidestern und N-Hydroxysuccinimidylestern, reagieren. Eine reaktive Gruppe kann auch mit Carboxylgruppen reagieren, die in Asp oder Glu vorkommen, der die reaktive Gruppe kann mit einer anderen Aminosäure, wie His, Tyr, Arg und Met, reagieren. Eine reaktive Gruppe kann auch mit einer Phosphatgruppe unter selektivem Markieren von Phosphopeptiden reagieren oder mit anderen kovalent modifizierten Peptiden, einschließlich Glycopeptide, Lipopeptide oder jeder beliebigen kovalenten hier offenbarten Polypeptidmodifikation. Der Fachmann kann problemlos die Bedingungen für die Modifizierung von Molekülen des Spezimens unter Verwendung verschiedener Reagenzien, Inkubationsbedingungen und Inkubationszeiten bestimmen, mit denen optimale Bedingungen für die Modifizierung von Molekülen des Spezimens zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
Das Verfahren mit der ICAT^TM-artigen Reagenz basiert auf der Derivatisierung eines Moleküls des Spezimens, wie eines Polypeptids, mit einem ICAT^TM-artigen Reagenz. Für den Vergleich von zwei Proben und/oder für die Quantifizierung werden ein Bezugsspezimen für Kontrollzwecke und ein Spezimen von einem zu prüfenden Individuum unterschiedlich mit der leichten und der schweren Form des ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz markiert. Die derivatisierten Spezimens werden vereinigt und die derivatisierten Moleküle zur Erzeugung von Fragmenten gespalten. Ein Polypeptidmolekül kann beispielsweise enzymatisch mit einer oder mehreren Proteasen in Peptidfragmente gespalten werden. Zu beispielhaften Proteasen, die beim Spalten von Polypeptiden nützlich sind, gehören Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Staphylococcus aureus (V8) Protease und dergleichen. Polypeptide können auch chemisch, beispielsweise unter Verwendung von CNBr, Säure oder anderen chemischen Reagenzien, gespalten werden.
Nach der Spaltung in Fragmente werden die mit dem ICAT^TM-artigen Affinitätsreagenz markierten Fragmente über das Affinitätstag isoliert, biotinylierte Fragmente können beispielsweise durch Bindung an Avidin in einem Festphasen- oder Chromatographieformat isoliert werden. Falls erwünscht, können die isolierten, markierten Fragment weiter unter Verwendung einer oder mehrerer alternativer Trenntechniken, einschließlich Ionenaustausch-, Umkehrphasen-, Größenausschluss-Affinitätschromatographie und dergleichen, oder elektrophoretischer Verfahren, einschließlich Elektrofokussierung, weiter fraktioniert werden. Die isolierten, markierten Fragmente können beispielsweise mittels Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC), einschließlich Mikrokapillar-HPLC, fraktioniert werden.
Die Fragmente werden unter Verwendung von Massenspektrometrie (MS) analysiert. Da die Moleküle des Spezimens unterschiedlich mit leichten und schweren Affinitätstags markiert sind, können die Peptidfragmente mittels MS unterschieden werden, was einen SBS-Vergleich der relativen Mengen jedes Peptidfragments des Bezugsspezimens zu Kontrollzwecken und des Prüfspezimens ermöglicht. Falls erwünscht, kann MS auch zur Sequenzanalyse der entsprechend markierten Peptide verwendet werden, was eine Identifizierung von Molekülen ermöglicht, die den markierten Peptidfragmenten entsprechen.
Ein Vorteil des Verfahrens mit ICAT^TM-artigem Reagenz ist, dass das mit der leichten und der schweren ICAT^TM-artigen Reagenz markierte Peptidpaar chemisch identisch ist und somit als gegenseitiger interner Standard für eine genaue Quantifizierung dient (Gygi et al., supra, 1999). Mit MS stellen die Intensitätsverhältnisse der Komponenten mit der geringer und hoher Masse der Paare mit schwer und leicht markierten Fragmenten ein präzises Maß der verhältnismäßigen Häufigkeit der Peptidfragmente dar. Somit kann das Verfahren mit ICAT^TM-artigem Reagenz, falls erwünscht, zweckmäßig zur Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Polypeptiden verwendet werden.
Ein IDEnT-Reagenz kann zur Modifizierung eines Polypeptids durch Einführen eines isotopischen Tags an einer speziellen funktionellen Proteingruppe verwendet werden. Ein beispielhaftes IDEnT-Reagenz ist bei Goodlett et al., supra, 2000, beschrieben. Ein IDEnT-Reagenz enthält mindestens ein Element mit einer Isotopenverteilung, die in einem Massenspektrometer eine einmalige Signatur schafft. Ein IDEnT-Reagenz kann beispielsweise Chlor, Deuterium oder ein anderes Element, einschließlich eines radioaktiven Elements, enthalten. Ein IDEnT-Reagenz kann so entwickelt sein, dass es an eine Aminosäure eines Polypeptids mit geringer Häufigkeit, wie Cystein, bindet. Das Markieren eines Polypeptids mit einem IDEnT-Tag kann auf die Verfahren angewendet werden, indem eine Beschränkung für die Abfrage eines Polypeptididentifizierungsindex mit Massen von Polypeptidfragmenten bereitgestellt wird.
Die Proteinspaltung oder -fragmentierung ist für die Verfahren nützlich, da sie eine Beschränkung der Datenbankabfrage darstellt. Die Polypeptidfragmentation kann sequenzspezifisch oder nicht sequenzspezifisch sein. Eine sequenzspezifische Polypeptidspaltung hält den Vorteil bereit, dass Polypeptidfragmente erhalten werden, die bekannte Aminosäuren enthalten, was als Beschränkung bei der Datenbankabfrage verwendet werden kann. Zu Beispielen für Reagenzien, die bei der Durchführung einer nicht spezifischen Polypeptidspaltung nützlich sind, gehören Papain, Pepsin und Protease Sg. Diese Proteasen können dazu verwendet werden, einen erwünschten Proteinfragmentierungsgrad zu erreichen, wie beispielsweise die Erzeugung von etwa zwei bis vier Polypeptidfragmenten aus einem Polypeptid, indem die Reaktionsbedingungen geändert werden. Bedingungen für die Verwendung dieser Proteasen sind im Fachgebiet gut bekannt. Zu Beispielen für Reagenzien, die für die Durchführung einer sequenzspezifischen Polypeptidspaltung nützlich sind, gehören Trypsin, V-8-Protease, o-Iodosobenzoesäure, Cyanogenbromid und Säure.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt auch einen Polypeptididentifizierungsindex zur Identifizierung eines Polypeptids in einer Population von Polypeptiden bereit. Der Index umfasst eine annotierte Gruppe an Charakteristika, die mit Polypeptiden des Index assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Fragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie in Abwesenheit von Ionenselektion zur Erzeugung von Fragment-Ionen bestimmt wird. Die Charakteristika reichen aus, um eines der Polypeptide von den anderen Polypeptiden im Index zu unterscheiden. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann Charakteristika für 2 oder mehr, 3 oder mehr, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 150 oder mehr, 200 oder mehr, 500 oder mehr, 1000 oder mehr, 2000 oder mehr, 5000 oder mehr oder sogar 10.000 oder mehr Polypeptide umfassen. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann auch im Wesentlichen alle Polypeptide einer Probe umfassen. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann beispielsweise im Wesentlichen alle die Polypeptide umfassen, die in einem Genom, wie einem viralen, bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Genom, einschließlich eines Säugetiergenoms, wie eines Genoms von einem Menschen, nicht humanen Primaten, einer Maus, einer Ratte, eines Rinds, einer Ziege, eines Kaninchens oder anderen Säugetierarten, exprimiert werden. Die Anzahl an Polypeptiden in einem Polypeptididentifizierungsindex ist von den Bedürfnissen des Anwenders abhängig und schwankt in Abhängigkeit vom Ursprung der Probe, die zur Identifizierung von Polypeptiden verwendet werden soll, und der Komplexität der Polypeptidexpression in der Probe. Ein Beispiel für die Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex für Drosophila melanogaster ist hier offenbart (siehe Beispiel V).
Der Polypeptididentifizierungsindex kann, nach Wunsch, auf einen gesamten Organismus oder auf bestimmte Gewebe oder Zellen im Organismus oder auf spezifische subzelluläre Fraktionen, beispielsweise Organellen, bezogen sein. Demzufolge kann ein Polypeptididentifizierungsindex, der auf ein bestimmtes Target bezogen ist, wie einen Organismus, ein Gewebe, eine Zelle oder eine subzelluläre Fraktion, ähnlich wie bei der Reduzierung der Komplexität, die bei einer zu prüfenden Probe angewendet wird, zur Vereinfachung der Suche nach der Identifikation eines bestimmten Polypeptids bei einer bestimmten Anwendung nützlich sein. Beispielsweise kann in einer bestimmten Diagnoseanwendung, bei der die Expression eines bestimmten Polypeptids oder einer Gruppe von Polypeptiden oder der Umfang der Expression der Polypeptide mit einer bestimmten Bedingung, wie einem Krankheitszustand, korreliert, ein auf ein bestimmtes Target bezogener Polypeptididentifizierungsindex verwendet werden. Wenn beispielsweise bekannt ist, dass eine Gruppe von Kernproteinen in einer Krebszelle überexprimiert wird, kann die Verwendung eines Polypeptididentifizierungsindex, der auf Kernproteine bezogen ist, zur Prüfung der Überexpression von Kernproteinen in einer Probe eines Individuums mithilfe der hier offenbarten quantitativen Verfahren verwendet werden. Außerdem kann die Erzeugung eines Target-Polypeptididentifizierungsindex und ein Vergleich mit einer einschlägigen krankhaften Probe zur Identifizierung von aberrant exprimierten Polypeptiden verwendet werden, was wiederum, wie hier offenbart, in Diagnoseanwendungen Verwendung findet.
Die bevorzugte Ausführungsform stellt darüber hinaus einen Polypeptididentifizierungsindex bereit, der eine annotierte Gruppe an Charakteristika, die mit Polypeptiden des Index assoziiert sind, umfasst, welche zwei oder mehr Charakteristika umfasst, die mit Polypeptiden des Index oder einem Fragment davon assoziiert sind, wobei eines der Charakteristika die Masse eines Fragments des Polypeptids ist, wobei die Fragmentmasse mithilfe der Massenspektrometrie in Abwesenheit von Ionenselektion zur Erzeugung von Fragment-Ionen bestimmt wird, und wobei die Masse mit einer Genauigkeit in ppm von mehr als 1 ppm bestimmt wird.
Falls erwünscht, kann der Polypeptididentifizierungsindex zweckmäßig auf einem elektronisch lesbaren Medium gespeichert sein. Demgemäß stellt die bevorzugte Ausführungsform ein elektronisch lesbares Medium bereit, das einen Polypeptididentifizierungsindex, beispielsweise einen annotierten Polypeptidindex, umfasst. Ein derartiges elektronisch lesbares Medium, das einen Polypeptididentifizierungsindex umfasst, ist für den Vergleich der Charakteristika eines Polypeptids mit dem Polypeptididentifizierungsindex nützlich, der zweckmäßig mit einer Computervorrichtung durchgeführt werden kann. Die Verwendung einer Computervorrichtung ist zweckmäßig, da ein Polypeptididentifizierungsindex zweckmäßig darauf gespeichert werden kann und für Vergleiche mit Charakteristika und/oder quantitativen Mengen eines Polypeptids in einer Probe zugänglich ist. Ein Polypeptididentifizierungsindex kann zweckmäßig unter Verwendung geeigneter Hardware, Software und/oder Netzwerke, beispielsweise unter Verwendung von Hardware, die an Netzwerke, einschließlich des Internets, angeschlossen sein kann, zugänglich sein.
Unter Verwendung von verschiedenen Hardware-, Software- und Netzwerkkombinationen können die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform, einschließlich des Schritts des Vergleichens der für ein Polypeptid bestimmten Charakteristika mit einem Polypeptididentifizierungsindex, zweckmäßig in einer Vielfalt von Konfigurationen durchgeführt werden. Demzufolge stellt eine bevorzugte Ausführungsform zusätzlich eine Computervorrichtung zur Durchführung von elektronisch ausführbaren Schritten bereit, die Verfahrensschritten entsprechen. Eine einzige Computervorrichtung kann beispielsweise Anweisungen zur Durchführung des bzw. der elektronisch ausführbaren Schritts(e) des Vergleichens von für ein Polypeptid bestimmten Charakteristika mit einem Polypeptididentifizierungsindex, einen Polypeptididentifizierungsindex und Anweisungen zur Bestimmung, ob die für das Polypeptid bestimmten Charakteristika einem oder mehreren Polypeptiden des Polypeptididentifizierungsindex entsprechen, enthalten.
Alternativ kann die Computervorrichtung Anweisungen zur Durchführung der Schritte eines bevorzugten Verfahrens enthalten, wohingegen der Polypeptididentifizierungsindex auf einem getrennten Medium gespeichert ist. Ferner können Anweisungen zur Bestimmung, ob ein Polypeptid einem oder mehreren Polypeptiden des Polypeptididentifizierungsindex entspricht, auf einer getrennten Computervorrichtung oder einem getrennten Medium enthalten oder mit der Computervorrichtung verbunden sein, die die elektronisch ausführbaren Schritte des Verfahrens und/oder die Datenbank auf einem getrennten Medium enthält. Ein derartiges elektronisch lesbares Medium kann eine andere Computervorrichtung, ein Speichermedium, wie eine Diskette, eine Zip-Diskette oder ein Server, wie ein Fileserver, sein, auf die bzw. den über eine Trägerwelle, wie eine elektromagnetische Trägerwelle zugegriffen werden kann. Somit kann über ein Netzwerk, wie das Internet, ein Fernzugriff auf eine Computervorrichtung, die einen Polypeptididentifizierungsindex enthält, oder einen Fileserver, auf der der Polypeptididentifizierungsindex gespeichert ist, erfolgen. Der Fachmann kennt geeignete Hardware-, Software- oder Netzwerkschnittstellen, die eine Kopplung mit einer erfindungsgemäßen Computervorrichtung zulassen, oder kann diese problemlos bestimmen.
Falls erwünscht, können Algorithmen zur Optimierung und Verbesserung der Leistungsfähigkeit bei der Identifizierung eines Polypeptids unter Verwendung eines Polypeptididentifizierungsindex verwendet werden. Beispielsweise kann, wie vorstehend beschrieben, ein Subindex eines Polypeptididentifizierungsindex bestimmt und der Subindex durch Verkleinerung der Größe der Vergleichsdatenbank zur weiteren Identifizierung eines Polypeptids verwendet werden. Eine derartige Verkleinerung mithilfe eines Subindex stellt eine Beschränkung dar, die die Rechenzeit für die Datenabfrage verkürzt. Der Fachmann kennt verschiedene Verfahren zur Erhöhung der Leistungsfähigkeit der Datenbankabfrage.
Zur Verbesserung der Analyse der Massenspektraldaten kann ein Algorithmus verwendet werden. Die Gegenwart von Komplementärionen in einem Tandem-Massenspektrum kann zur Entwicklung von Algorithmen verwendet werden, um die Masse des parentalen Ions genauer zu bestimmen. Damit wird durch Einschränken der Toleranz der Peptidmasse auf eine kleinere Untergruppe isobarer Datenbankpeptide die Bewertung verbessert und die Suchzeit verkürzt. Zur Erhöhung der Proteomdeckung kann ein ESI-MS/MS mit Ionenfallen durchgeführt werden, sodass explizite Bestimmungen des Peptidlandungszustands ausgeschlossen sind, wodurch alle Tandem-Massenspektren von Peptiden zweimal, als [M + 2H]2+ und [M + 3H]3+, abgefragt werden müssen. Der die beste Bewertung ergebende Ladungszustand wird bewahrt, der andere verworfen. Zur Erhöhung des Durchsatzes kann ein Algorithmus zur Bestimmung des Ladungszustands vor der Datenbankabfrage verwendet werden. Damit sich Spektren vor und nach der Datenbankabfrage katalogisieren lassen, kann ein Programm zum Messen der Spektralqualität verwendet werden. Damit wird, wie hier offenbart, durch Verwerfen schlechter Spektren vor der Suche und die Möglichkeit einer Follow-up-Analyse mit Spektren "guter Qualität", die aber möglicherweise aufgrund unerwarteter posttranslationaler Modifikationen versagten, der Durchsatz zur Erzeugung eines guten Datenbankabgleichs erhöht.
BEISPIEL I
Erzeugung eines annotierten Polypeptidindex
In diesem Beispiel ist die Erzeugung eines annotierten Polypeptidindex und die Verwendung des annotierten Polypeptidindex zur Identifizierung eines Polypeptids in einer Probe beschrieben.
Die Elemente eines annotierten Polypeptidindex (AP), der auch als ein annotierter Peptidtagindex (APT) oder -datenbank bezeichnet wird, sind die Sequenzen im Wesentlichen aller Peptide oder ausgewählter Peptide mit spezifischen Strukturmerkmalen, die durch eine sequenzspezifische chemische oder enzymatische Fragmentierung der Proteine, die von der zu untersuchenden Art, Zelle oder Gewebe produziert werden, erzeugt werden. Jedes Peptid wird anhand von Attributen oder Charakteristika annotiert, die einfach experimentell bestimmt werden und die die unzweideutige Korrelation zwischen dem annotierten Peptid und dem Protein, von dem das Peptid stammt, ermöglichen.
Die Erzeugung eines beispielhaften AP-Index kann die folgenden spezifischen Schritte beinhalten: Ernten von Proteinen; Markieren der Proteine mit einem Isotope coded Affinity Tag-artigen (ICAT^TM) Reagenz; Fraktionieren der Proteine über das Molekulargewicht; Spalten der Proteine mit einer Protease, beispielsweise Trypsin, zur Erzeugung von Peptiden; Trennen der Peptide mittels Chromatographie, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie; Reinigen jeder Ionenaustauschfraktion mittels Affinitätschromatographie, beispielsweise auf der Grundlage eines ICAT^TM-artigen Affinitätstags; Analyse jeder Affinitätschromatographiefraktion mittels LC/MS/MS oder CE/MS/MS; Identifizieren im Wesentlichen aller exprimierten Proteine mittels einer Datenbankabfrage der einzelnen MS/MS-Peptidspektren und Erzeugen einer Datenbank mit annotierten Peptidtags, die einen eindeutigen Strichcode eines individuellen Peptids basierend auf gemessenen physikalisch-chemischen Eigenschaften und somit des parentalen Proteins des Peptids darstellen.
Der AP-Index kann wie folgt erzeugt werden: (i) Vorbereitung der Proteinprobe; (ii) Proteinmarkierung; (iii) wahlweise Proteinfraktionierung; (iv) Proteinfragmentierung; (v) Peptidtrennung; (vi) Affinitätsisolierung der markierten Polypeptide; (vii) hochauflösende Peptidtrennung; (viii) Datenbankabfrage und (ix) Erstellung des AP-Index (APT-Datenbank).

(i) Vorbereitung der Proteinprobe. Proteinproben, mit denen eine quantitative Proteomanalyse durchgeführt werden soll, beispielsweise Zellen, Gewebe, subzelluläre Fraktionen, Körperflüssigkeiten, Zellausscheidungen und dergleichen, werden unter Verwendung von Standardprotokollen für die Erhaltung der Solubilität der Proteine aus den jeweiligen Ursprungsorten isoliert.
(ii) Proteinmarkierung. Die Proteine der Proben werden vollständig denaturiert, reduziert und alle die Sulfhydrylgruppen, die die Seitenketten reduzierter Cysteinreste darstellen, werden kovalent mit der leichten bzw. schweren Form von für Sulfhydryl spezifischen ICAT^TM-artigen Reagenzien unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen derivatisiert (Gygi et al., Nature Biotechnol. 17: 994–999 (1999)) (siehe 3). Die Cysteinmarkierung ist zwar eine besonders nützliche Durchführung des Verfahrens, es kann jedoch jede andere chemische Reaktion, die für eine chemische Gruppe des Proteins spezifisch ist, angewendet werden.
(iii) Wahlweise Proteinfraktionierung. Die Mischung aus markierten Proteinen wird unter Verwendung eines beliebigen bekannten üblichen Proteintrennverfahrens fraktioniert. Das angewendete Verfahren ist wiederholfähig, hält die Proteine in Lösung und weist eine hohe Probenkapazität auf. Ein besonders nützliches Verfahren ist die präparative Natriumdodecylsulfate-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
(iv) Proteinfragmentierung. Die Proteine der Probenmischung oder die Proteine, die in jeder Fraktion enthalten sind, sofern eine fakultative Probenfraktionierung verwendet wird, werden einer sequenzspezifischen Spaltung unterworfen. Ein besonders nützliches Verfahren ist die Proteasespaltung, beispielsweise mit Trypsin.
(v) Peptidtrennung. Die gebildeten Peptidmischungen werden einer Peptidtrennung der ersten Dimension unterworfen. Das Verfahren zur Peptidtrennung weist, ungeachtet der Komplexität der angewendeten Proben, eine hohe Probenkapazität, eine mindestens mäßige Auflösung auf und erzeugt hoch wiederholfähige Trennmuster. Ein besonders nützliches Trennverfahren der ersten Dimension ist die Ionenaustauschchromatographie, wie der Kationen- oder Anionenaustausch.
(vi) Affinitätsisolierung der markierten Polypeptide. Aus jeder chromatographischen Fraktion werden die mit dem ICAT^TM-artigen Reagenz markierten Peptide, beispielsweise cysteinhaltige Peptide, oder Peptide, die eine andere Aminosäure oder posttranslationale Modifikation enthalten, die affinitätsmarkiert werden kann, unter Verwendung von Avidin- oder Streptavidin-Affinitätschromatographie isoliert. Ein besonders nützliches Affinitätsmedium ist monomeres Avidin, das auf Polymerkügelchen immobilisiert wurde. Wenn ICAT^TM-artige Reagenzien verwendet werden, deren Affinitätstags von Biotin verschieden sind, wird ein dem verwendeten Tag entsprechendes Affinitätsmedium verwendet.
(vii) Hochauflösende Peptidtrennung. Ein besonders nützliches Verfahren für eine hochauflösende Peptidtrennung ist die Flüssigkeitschromatographie-ESI-MS/MS. Die Peptidmischungen, die aus den Affinitätschromatographiesäulen eluiert wurden, werden mittels automatisierter LC-MS/MS unter Verwendung von Kapillar-Umkehrphasenchromatographie als Trennverfahren (Yates et al., Methods Mol. Biol. 112: 553–569 (1999)) und datenabhängiger CID mit dynamischem Ausschluss (Goodlett et al., Anal. Chem. 15: 1112–1118 (2000)) als Massenspektrometrieverfahren individuell analysiert.
(viii) Datenbankabfrage. Die Sequenzen aller Peptide, für die geeignete CID-Spektren erhalten wurden, wird durch Abfragen einer Sequenzdatenbank der zu untersuchenden Art bestimmt. Eine besonders nützliche Sequenzdatenbank ist eine Datenbank, die im Wesentlichen alle Proteinsequenzen enthält, die potenziell von der zu untersuchenden Art exprimiert werden können. Ein verwendbares Suchprogramm für Sequenzdatenbanken ist das Programm SEQUEST (Eng, J. et al., J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5: 976–989, (1994)) oder ein Programm mit ähnlichen Funktionen.
(ix) Erstellung des AP-Index (APT-Datenbank). Die Sequenzen aller Peptide, die mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens identifiziert wurden, werden in eine Datenbank eingegeben und mit den Charakteristika oder Attributen, die in den Schritten (i)–(viii) erzeugt wurden, versehen. Diese Charakteristika oder Attribute können, ohne darauf beschränkt zu sein, Folgendes umfassen: die partielle Aminosäurezusammensetzung (wie die Gegenwart eines Cysteinrests in jedem selektierten Peptid; siehe Goodlett et al., supra, 2000); die ungefähre Molekülmasse des parentalen Proteins (wie mittels der fakultativen SDS-PAGE-Fraktionierung bestimmt); die Reihenfolge der Elution oder die Elutionszeit an der Ionenaustauschsäule; die Elutionszeit an der Umkehrphasensäule und jedes andere bestimmte Charakteristikum. Gemeinsam sind die Attribute für jedes Peptid in der Datenbank einmalig und kommen damit einem Strichcode jedes Peptids gleich. Wenn für Peptide, die in anschließenden Versuchen erzeugt werden, derselbe Strichcode bestimmt wird, werden diese somit eindeutig durch Korrelation der Strichcodes, die beim Versuch erzeugt wurden, mit den im AP-Index (der APT-Datenbank) vorhandenen Strichcodes als die beim Versuch erzeugten Peptide identifiziert.

Für die Korrelation von Polypeptiden mit dem AP-Index (der APT-Datenbank) werden die Peptidproben, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren für die quantitative Proteomanalyse erzeugt wurden, genauso wie die für den AP-Index (die APT-Datenbank) erzeugten Peptide, jedoch mit folgenden Ausnahmen erzeugt, behandelt und verarbeitet. (i) Die zu vergleichenden Proteine in den zwei (oder mehr) Proben werden mit unterschiedlich isotopenmarkierten ICAT^TM-artigen Reagenzien markiert. In diesem Schritt können zwei oder mehr chemisch identische, aber unterschiedlich isotopenmarkierte ICAT^TM-artige Reagenzien verwendet werden. (ii) Die erzeugten Peptide werden anstatt mit MS/MS nur mittels einer einstufigen Massenspektrometrie untersucht. Massenanalysatoren haben im Allgemeinen eine hohe Massengenauigkeit, eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Massenauflösung. Zu Instrumenten mit diesen Charakteristika gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, MALDI-TOF-Massenspektrometer, ESI-TOF-Massenspektrometer und Fourier-Transformations-Ionenzyklotron-Massenanalysatoren (FT-ICR-MS). Die Attribute, die mittels dieses Verfahrens für jedes Peptid bestimmt wurden (alle Attribute oder eine Auswahl davon werden wie vorstehend beschrieben bestimmt), werden in einen Strichcode für jedes Peptid umgewandelt und der experimentell bestimmte Strichcode wird mit den Strichcodes des AP-Index (der APT-Datenbank) korreliert, was zu einer unzweideutigen Identifizierung des Peptids und damit des Proteins, aus dem das Peptid stammt, führt. Anschließend werden die Massenspektren auf Paare von Peptid-Ionen untersucht, die während des gesamten Vorgangs gemeinsam fraktioniert wurden und die einen Massenunterschied aufweisen, der genau dem von dem ICAT^TM-artigen Reagenz kodierten Massenunterschied entspricht. Die relative Signalstärke der beiden Peaks gibt die relative Häufigkeit der Peptide und damit die relative Häufigkeit der entsprechenden parentalen Proteine an, die anfänglich in der Probe vorhanden waren. Folglich ermöglicht die Korrelation der experimentell bestimmten Daten mit dem AP-Index (der APT-Datenbank) die Quantifizierung und Identifizierung der Proteine in den analysierten Proben.
BEISPIEL II
Erzeugung eines annotierten Polypeptidindex für Hefe
In diesem Beispiel ist die Erzeugung eines annotierten Polypeptidindex für Hefe beschrieben.
Es wurde geschätzt, dass bei der Empfindlichkeit derzeitiger Massenspektrometer für die Erfassung von Proteinen mit geringer Häufigkeit mittels des LC/LC/MS/MS-Verfahrens (Gygi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 9390–9395 (2000)) mindestens 5 mg Gesamtprotein erforderlich sind und diese Menge wurde experimentell im Wesentlichen bestätigt. Gygi et al., supra, 2000, zeigten auch, dass das "Speicher-Verfahren" für die Erfassung von Proteinen mit geringer Häufigkeit ausreicht und eine ausreichende Probenkapazität aufweist, um die verhältnismäßig großen Mengen der Gesamtprobe zu verarbeiten.
Für die Erstellung der Datenbank wird folgendes Verfahren verwendet. Für die Proteinmarkierung wird eine Proteinprobe in 0,5% SDS, 50 mM Tris, pH 8,3, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/ml erzeugt. Insgesamt werden 25 mg Gesamthefeprotein verwendet. Sobald die Proteine gelöst sind, wird die SDS-Konzentration durch Verdünnen der Probe 1:10 mit Wasser und Zugabe von EDTA zur Erhaltung einer EDTA-Konzentration von 5 mM verdünnt. Die Endkonzentration beträgt 0,05% SDS, 5 mM Tris, 5 mM EDTA. Die Proben wird dann 3–5 min lang bei 100°C gekocht und anschließend abgekühlt. Die Reduzierung der Disulfidbindungen wird durch Zugabe von ausreichend Tributylphosphin (TBP) für einen 5 mM-Gehalt in der Probenlösung erreicht. Dem folgt eine 30 min lange Inkubation der Probe bei 37°C. Zu der reduzierten Probe wird das Alkylierungsreagenz (beispielsweise ein ICAT^TM-artiges Reagenz) mit etwa 5-fach molarem Überschuss im Verhältnis zu den in der Proben vorhandenen SH-Gruppen gegeben. Die Alkylierungsreaktion läuft 90 min lang in Dunkelheit ab.
Für die Proteintrennung wird die reduzierte und alkylierte Probe mit 0,2 Volumenanteilen des 5 × SDS-Gelprobenpuffers angereichert und 5 min lang gekocht. Die abgekühlte Probe wird dann auf ein präparatives SDS-Gel mit den Abmessungen 20 cm × 20 cm × 1,5 mm aufgebracht. Nach der Elektrophorese wird das Gel senkrecht zur Elektrophoresendimension in 10 Streifen gleicher Größe geschnitten. Diese Streifen stellen 10 Größenspeicher der intakten Proteine dar. Die Proteine in den Gelstreifen werden dann unter Verwendung von Standardprotokollen einer Spaltung im Gel unterworfen.
Für die Peptidtrennung werden die aus den Gelscheiben extrahierten Peptide drei aufeinander folgenden chromatographischen Trennungen unterworfen. Zuerst werden sie mittels Kationenaustauschchromatographie getrennt. Dann werden die biotinylierten Peptide mittels Avidin-Chromatographie isoliert. Schließlich werden die Peptide mittels Kapillar-Umkehrphasenchromatographie weiter fraktioniert.
Für die Kationenaustauschchromatographie wird eine Kationenaustausch-HPLC-Säule verwendet (PolyLC Inc., Columbia MD; 2,1 mm × 20 cm, Teilchengröße 5 μm, Porengröße 300 Å, stark saures Kationenaustauschmaterial Polysulfoethyl A). Es wurden die folgenden Puffer verwendet: Puffer A, 10 mM KH₂PO₄, 25% CH₃CN, pH 3,0; Puffer B, 10 mM KH₂PO₄, 25% CH₃CN, 350 mM KCl, pH 3,0. Es wurde der folgende Gradient verwendet:
Die Durchflussrate beträgt 200 μl pro Minute. Fraktionen werden in Zeitabständen von 1–2 Minuten gesammelt. Die Säule wird mit Mengen von etwa 200 Mikrogramm bis zu etwa 5 mg gespaltenem, ICAT^TM-markiertem Gesamtprotein, üblicherweise mit 2 ml-Probenschleifen, beladen. Wichtig ist, die Proben vor dem Beladen der Kationenaustauschsäule auf pH 3,0 oder weniger anzusäuern, da die Peptide bei höheren pH-Werten nicht vollständig geladen werden und möglicherweise nicht in der Säule haften bleiben. Der gezeigte Gradient ist so gewählt, dass die Elution doppelt geladener Peptide so weit wie möglich verteilt wird, sodass diese Peptide üblicherweise beginnend bei etwa 8–9 Minuten bis etwa Minute 15–16 in den Durchlauf eluiert werden, wonach dreifach geladene Peptide zu eluieren beginnen. Über die Dauer des Gradienten werden etwa 30 Fraktionen gesammelt.
Für die Avidin-Affinitätschromatographie wird Ultralink Monomeric Avidin (Pierce, Katalog-Nr. 53146) verwendet. Der Hals eines Pipettenglases aus Glas wird mit einem kleinen Stück Glaswolle verschlossen. 400 μl Avidin-Chromatographiematerial wird in das Glas gepackt (die Aufschlämmung wird in einer 50%igen Verdünnung geliefert, um 400 μl Avidin-Chromatographiematerial zu erhalten, müssen also 800 μl 50%ige Aufschlämmung zugegeben werden). Die Kügelchen setzen sich ab und die Säule wird mit 2 × PBS gewaschen, um die Kügelchen von der Seite des Glases abzuspülen. Die -gepackte Säule wird mit 30% Acetonitril (ACN) mit 0,4% Trifluoressigsäure (TFA) durchgespült, bis der Abfluss-pH ~1 beträgt, wonach mit einem weiteren Säulenvolumen ACN/TFA durchgespült wird. Dieser Säuerungsschritt dient dazu, mit den Kügelchen assoziierte Polymere zu entfernen. Die Säule wird mit 2 × PBS, pH 7,2, gewaschen, bis der pH-Wert ~7,2 ist. Dann wird die Säule mit drei weiteren Säulenvolumen (1200 μl) desselben Puffers durchgespült.
Die Säule wird mit 3–4 Säulenvolumen eines Biotin blockierenden Puffers (2 mM d-Biotin in PBS) gewaschen. Das Biotin blockiert die Avidin-Stellen der Säule mit größerer Aufnahmefähigkeit, wodurch die spätere Rückgewinnung der Proben an den restlichen Bindungsstellen gesichert ist.
Leicht gebundenes Biotin wird mit ~6 Säulenvolumen (2,400 μl) Regenerationspuffer (100 mM Glycin, pH 2,8) ausgewaschen, bis der Abfluss auf pH ~2,8 fällt. Diese Glycinlösung wird vor der Benutzung autoklaviert und bei 4°C aufbewahrt und kann so eine Woche halten.
Die Säule wird mit 6 Säulenvolumen 2 × PBS gewaschen, um wieder den korrekten pH-Wert (~7,2) einzustellen. Der Durchfluss-pH wird überwacht. Die Peptidproben, die aus individuellen oder vereinigten Fraktionen aus der Ionenaustauschsäule stammen, werden dann auf die Säule aufgebracht und ~20 min in der Säule inkubiert. Anschließend wird nicht gebundenes Material durch Aufbringen von 5 Säulenvolumen 2 × PBS, pH 7,2 aus der Säule gewaschen und die Fraktionen werden gesammelt. Die Säule wird weiter mit 5 × Säulenvolumen 1 × PBS (dieser Schritt dient der Herabsetzung der Salzkonzentration) und 6 Säulenvolumen 50 mM AMBIC (Ammoniumbicarbonat), pH 8,3, mit 20% Methanol (MeOH) durchgespült, während weiter Fraktionen gesammelt werden (50 mM AMBIC dient dazu, die Salzkonzentration zu verringern; MeOH dient dazu, hydrophobe Peptide zu entfernen). Biotinylierte Peptide werden mit einem Elutionspuffer (30% CN/0,4% TFA) eluiert und manuell in einem Reagenzglas gesammelt. Diese Proben werden mittels Kapillar-Umkehrphasenchromatographie weiter getrennt.
Für die Umkehrphasenchromatographie werden gereinigte biotinylierte Peptide mittels Umkehrphasen-Kapillarchromatographie unter Verwendung von Standardprotokollen getrennt. Der Lösungsmittel-Gradient ist so gewählt, dass die Peptide über einen Zeitraum von 60 min eluieren. Wenn alle 1 min Fraktionen gesammelt und im Massenspektrometer analysiert werden, werden mittels dieses Verfahrens 60 Speicher geschaffen.
Für die Massenanalyse und die Sequenzanalyse werden biotinylierte Peptide, die aus den UP-Säulen eluieren, mittels ESI MS/MS für die Erzeugung der Datenbank und mittels ESI-MS für die Datenbankabfrage analysiert. Für die Erstellung der Datenbank wird ein Massenspektrometer mit Ionenfalle mit einer Massengenauigkeit von etwa 1 Masseneinheit verwendet. Für die Massenbestimmungen für Datenbankabfragen wird ein ESI-TOF-Massenspektrometer mit einer Massengenauigkeit von mehr als 50 ppm und einer Auflösung von mehr als 10.000 verwendet. Das bedeutet, dass ein Peptid mit 1000 Masseneinheiten von einem Peptid mit 1000,1 Masseneinheiten unterschieden werden kann. Wenn ein Massenbereich für Trypsin-Peptide von zwischen 500 und 3000 Masseneinheiten angenommen wird, erzeugt ein Massenspektrometer mit dieser Leistung 25.000 Speicher.
Bei der Proteomanalyse der Hefe S. cerevisiae enthält das Genom des Organismus etwa 6200 offene Leseraster (ORF). Das Hefeproteom enthält somit erwartungsgemäß, etwa 6200 verschiedene Proteine, wobei differenziell modifizierte Formen desselben Proteins unberücksichtigt bleiben. Bei Anlegen von empirisch abgeleiteten Spezifizitätsregeln für Trypsin würde die Trypsinspaltung eines Hefeproteoms etwa 350.000 Peptide ergeben. Diese Probenkomplexität wird auf etwa 35.000 Peptide reduziert, nur wenn die cysteinhaltigen Peptide ausgehend von einer chemischen Derivatisierung mit den ICAT^TM-artigen Reagenzien extrahiert werden. Die Gesamtanzahl an Speichern, die für das vorstehend beschriebene Verfahren zur Verfügung stehen, beträgt 10 × 30 × 60 × 25.000 = 4,5 × 10⁸ und übersteigt somit bei weitem die Anzahl an Peptiden, die bei einer Analyse des Gesamthefeproteoms zu erwarten sind. Deswegen ist zu erwarten, dass das Verfahren zur Erzeugung von Daten für eine Datenbankabfrage bei einer Probe mit der Komplexität eines Hefeextrakts vereinfacht werden kann. Als ein Beispiel kann der Schritt einer Trennung mittels Gelelektrophorese wahlweise ausgeschaltet werden.
Weder das Verfahren zur Erzeugung von Daten, die in eine Datenbank eingegeben werden, noch das Verfahren zur Erzeugung von Daten für eine Datenbankabfrage ist festgelegt. Für die Optimierung kann die Anzahl der verfügbaren Speicher somit problemlos und in Abhängigkeit von der Probenkomplexität angepasst werden. Im Allgemeinen ist die Anzahl der Speicher, die für die Erzeugung der Datenbank gewählt wird, hoch, wohingegen die Anzahl der Speicher für die Erzeugung der Daten für eine Datenbankabfrage so gering wie möglich gewählt wird, um den Probendurchsatz zu maximieren. Die Anzahl an verfügbaren Speichern kann problemlos auf mannigfaltige Weise angepasst werden. Zum einen kann der Einschluss von zusätzlichen orthogonalen Trenndimensionen für Proteine und Peptide erwogen werden. Bei der Proteintrennung können Elektrofokussierung, Ionenaustauschchromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie oder ähnliche elektrophoretische oder chromatographische Techniken eingeschlossen werden. Bei der Peptidtrennung können eine Trennung auf der Grundlage von der Peptidgröße oder Kapillar-Elektrophorese-Verfahren eingeschlossen werden.
Zum andern kann der Trennbereich der vorstehend beschriebenen Trennverfahren erweitert werden. Die Proteintrennung kann durch Verwendung von Gradientengelen oder längeren Gelen mit größerem Trennbereich ausgedehnt werden. Bei chromatographischen Verfahren zur Peptidtrennung kann die Anzahl der Speicher durch Erzeugen umfassenderer, flacherer Gradienten und/oder durch häufigere Probennahme problemlos erhöht werden. Schließlich ist die Anzahl der Speicher von der Auflösung und der Massengenauigkeit des verwendeten Massenanalysators abhängig. Die zusätzliche Verwendung eines Massenanalysators mit höherer Leistung senkt die Anzahl an Speichern, die durch die in dem Verfahren verwendeten Trennverfahren bereitgestellt werden.
BEISPIEL III
Verwendung von ESI-TOF für die MS-Analyse komplexer Proben
In diesem Beispiel ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Polypeptididentifizierungssubindex unter Verwendung der Masse von Polypeptidfragmenten, die mittels ESI-TOF bestimmt wurde, beschrieben.
Die Massen einer Gruppe von Polypeptiden, oder Fragmenten davon, wurden unter Verwendung von ESI-TOF bestimmt, um einen Polypeptididentifizierungsindex anhand der Massenwerte zu beschränken, um wiederum einen Polypeptididentifizierungssubindex zur Verwendung mit komplexen Genomen zu erzeugen. Zwei Peptide, ASHLAGAR (P1) und RPPGFSPR (P2), wurden zusammen in einen ESI-TOF infundiert. Die Mischung sollte eine gemeinsame Elution von Peptiden während der HPLC-Trennung simulieren. Die Spektren wurden mit niedriger (4A) und hoher (4B) V_{Düse-Skimmer} erhalten.
Wie aus 4B hervorgeht, liegen für beide Peptide zahlreiche Fragmente vor. Oberhalb des P1 1 + Ion erschienen keine Fragment-Ionen, weswegen dieser m/z-Bereich nicht in 4B aufgenommen wurde. Zum Dekonvolieren der Mischung aus parentalen und Fragment-Ionen in einem einzigen Massenspektrum wurde ein Algorithmus geschrieben (4B). Die P1- und P2-Sequenz wurde in eine Liste aller möglichen Trypsin-Peptide aus einer Datenbank mit 60.884 humanen Polypeptiden aufgenommen. Ein Vergleich der beobachteten Massen von P1 und P2 (4A) mit allen möglichen Trypsin-Peptiden der 60.884 Polypeptide ergab eine Liste von 57 bzw. 124 Isobaren. Die Liste mit b- und y-Ionenfragmenten aller Isobare, die mit 10 ppm berechnet wurden, wurde dann mit den zwischen 500 und 825 m/z in 4B beobachteten Fragment-Ionen verglichen. Dieses Verfahren ergab eine Liste von 12 bzw. 13 möglichen Polypeptididentifikationen für P1 bzw. P2, wie aus 4C hervorgeht. Dieses Verfahren ist für die Anwendung einer Beschränkung auf einen Polypeptididentifizierungsindex beispielsweise zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungssubindex zur Verwendung mit komplexen Genomen nützlich. In-source CID mit Peptiden kann leicht und schnell auf kontinuierlich wechselnde Weise von ESI-TOF und möglicherweise von in-source Zerfall mit MALDI-TOF erfasst werden. Ferner führt das Verfahren nicht zu Datenverlusten, wie sie mit Tandem-MS auftreten, bei der während der CID eines selektierten Ions gleichzeitig eluierende Ionen notwendigerweise nicht in die Analyse aufgenommen werden. Wenn die Peptide eine geringe Häufigkeit haben (das heißt ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis), dann werden sie von datenabhängigen (DD) Tandem-MS-Verfahren nicht für CID selektiert. Der Grund hierfür besteht darin, dass übliche DD-Verfahren zuerst den Basis-Peak (das heißt, das intensivste Fenster für Ionen pro m/z) untersuchen, damit CID durchführen und diesen dynamisch von weiteren Überlegungen ausschließen und mit dem am zweithäufigsten vorkommenden Ion fortsetzen.
Die in 4C dargestellten Peptide stellen eine Reduzierung der Komplexität von mehr als 60.000 möglichen Polypeptiden auf etwa 12 oder 13 Polypeptide dar. Für parentale Polypeptide oder eines oder mehrere zusätzliche Peptidfragmente davon werden zusätzlich Charakteristika bestimmt, beispielsweise die Atommasse, die Aminosäurezusammensetzung, die partielle Aminosäuresequenz, das scheinbare Molekulargewicht, der pI-Wert und die Reihenfolge der Elution an einem spezifischen chromatographischen Medium unter bestimmten Bedingungen. Verfahren zur Fraktionierung von Polypeptiden sind bereits beschrieben (siehe beispielsweise Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3. Ausgabe, Springer Verlag, New York (1993)). Um die Identifizierung eines einzigen Polypeptids im Polypeptididentifizierungsindex zu ermöglichen, wird eine ausreichende Anzahl an Charakteristika bestimmt.
BEISPIEL IV
Shotgun-Peptidsequenzanalyse zur Erzeugung eines Polypeptididentifizierungsindex
In diesem Beispiel ist die Sequenzanalyse von Peptiden mit hoher Massengenauigkeit beschrieben.
Es wurde ein Verfahren für die Sequenzanalyse von Peptiden unter Verwendung von parentalen und Fragment-Ionen mit hoher Massengenauigkeit (50 ppm oder besser) in einem ESI-TOF-LC/MS-System entwickelt. Das Verfahren beinhaltete die Einführung gereinigter Proteinspaltproben bei abwechselnd hohem und niedrigem Ionenquellen-Gradientpotenzial, wodurch Fragmentierungsdaten über Peptide aufgezeichnet und mit nicht fragmentarischen Daten für eine positive Identifizierung einer Peptidsequenz und des parentalen Proteins über eine Datenbankabfrage kombiniert werden. Obwohl in diesem bestimmten Beispiel der Cysteingehalt gewählt wurde, ist der Cysteingehalt nicht zwingend ein bestimmtes Charakteristikum. Im Gegensatz zur herkömmlichen Tandem-MS wurden alle gemeinsam MS unterworfenen Peptide ohne Einzelionenselektion fragmentiert. Alle Fragment-Ionen der beiden simultan fragmentierten Peptide wurden im Gegensatz zur Tandem-MS, bei der Fragment-Ionen jeweils pro Einzelpeptid gemessen werden, gemeinsam gemessen.
Kurz gesagt, wurde Saccharomyces cerevisiae (BWG1-7A) in YPD-Medium bis zu einem OD₆₀₀ von 3 (gerade nach der log-Phase) gezüchtet. Mittels Lyticase-Spaltung und anschließender mechanischer Lyse wurden Sphäroplasten gebildet. Die Kerne wurden mittels Zentrifugieren (13.000 Umdr./min, 30 min) isoliert und durch Zugabe von Ammoniumsulfat gelyst. Unlösliches Material wurde zentrifugiert (28.000 Umdr./min, 90 min) und der Überstand extrahiert. Proteine wurden mit Ammoniumsulfat gefällt. Der Niederschlag wurde erneut suspendiert und gegen 20 mM Hepes, 20% Glycerol, 10 mM MgSO₄, 1 mM EGTA und 75 mM Ammoniumsulfat dialysiert.
Das Proteinextrakt (5,6 mg) wurde in einem Speedvac (Savant Instruments; Holbrook NY) getrocknet und erneut suspendiert und mittels Kochen 3 min lang in 0,5% SDS, 50 mM Tris, 1 mM EDTA denaturiert. Dithiothreitol (DTT; 5 mM) wurde zugegeben und die Probe wurde 30 min lang bei 50°C inkubiert. Die Proteine wurden in kaltes Aceton/Ethanol (EtOH) (50:50 Vol.:Vol.) ausgefällt. Die Pellets wurden gewaschen und erneut in 0,05% SDS, 6 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 8,3, und 1 mM EDTA suspendiert und es wurden 3 mg EZ-Link PEO-Iodacetyl-Biotin (Pierce Katalog-Nr. 21334; Pierce Chemical Co.; Rockford IL) zugegeben. Die Probe wurde 90 min lang dunkel unter Rühren inkubiert. Gleiche Volumen 20 mM DTT wurden zugegeben, um die Biotinylierungsreaktion abzubrechen. Dann wurde die Probe mit 50 mM Tris, 1 mM EDTA auf das 6-fache ihres Volumens verdünnt. Es wurden 200 μg Trypsin zugegeben und die Probe wurde über Nacht bei 37°C inkubiert.
Etwa 2 mg der mit Trypsin gespaltenen Lösung wurden durch eine stark saure Kationenaustauschsäule Polysulfoethyl A (PolyLC #202SE0503, 2,1 mm × 200 mm, 300 Å, 5 μm) (Gradient = 0% bis 25% über 30 min, 25% bis 100% über 20 min, 300 mM KCl in 10 mM K₂PO₄, 25% Acetonitril (ACN), pH 3,0, bei 200 μl/min) geführt, wobei alle 5 Minuten Fraktionen gesammelt wurden. Jede Fraktion wurde unter Verwendung einer ABI-Affinitätspatrone, Patronenhalter und zugehörigem Puffersystem (ABI #4326740 und #4326688-90; Applied Biosystems; Foster City CA) von biotinylierten Cysteinylpeptiden gereinigt. Die gereinigten Fraktionsvolumen (die 0,1 Kationenaustauschabsorbanzeinheiten bei 214 nm UV-Spur repräsentieren) wurden vollständig in einem Speedvac getrocknet und erneut in 0,2% Essigsäure (HOAc) auf 5 μl Volumen suspendiert.
Die getrocknete Probe wurde auf einer Umkehrphasensäule mithilfe eines integrierten Autosampler/μHPLC-Systems von LC Packings (San Francisco CA), das mit einer handgepackten 100 μm × 10 cm C-18-Quarzglassäule (Michrom Magic C18) gekoppelt war, unter Verwendung eines linearen Gradienten aus ACN (Lösungsmittel B) von 5% bis 50% mit etwa 700 nl pro Minute über einen Zeitraum von 60 Minuten getrennt. Lösungsmittel A war 0,2% HOAc/0,001% Heptafluorbuttersäure. Die Quarzglas-Kapillarsäule wurde über eine Mikrovolumen-Verschraubung mit 0,15 mm Durchmesser aus Edelstahl von Valco (MUIXCS6), an die 4000 VDC (Gleichspannung) angelegt wurde, mit einer Quarznadel mit einer sich von 75 auf 30 μm zuspitzenden Spitze (New Objective, FS360-75-30-N) gekoppelt. Die biotinylierten Peptide wurden unter Verwendung eines ESI-TOF-Massenspektrometers für eine Biospektrometrie-Workstation von ABI Mariner zweimal mittels μLC/MS analysiert, zuerst mit einem Düsen/Skimmer-Potenzial (V_NZ) von 70/25 VDC, dann erneut mit einem V_NZ-Potenzial von 200/25 VDC.
Im Rahmen der manuellen Untersuchung des gesamten chromatographischen Durchlaufs wurde eine Liste nicht fragmentierter potenzieller Peptide erstellt. Identifizierbare doppelt, dreifach und vierfach geladene m/z-Monoisotopenwerte wurden in eine Tabellenkalkulation überführt und dekonvoltiert. Dekonvoltierte Massen wurden in ein einfaches Datenbanksuchprogramm eingegeben, das eine Liste mit Peptiden erzeugte, die folgende Kriterien erfüllten: Masse mit einer Genauigkeit von 30 ppm, Peptid mit einem Cysteinylrest, Peptid mit Trypsin-Stellen an beiden Enden, zwei mögliche Trypsin-Spaltstellen dürfen fehlen, Cystein mit 414,1931 Da (PEO-Iodacetylierung). Jede potenzielle Peptidsequenz wurde dann in silico fragmentiert, um eine Liste möglicher Fragment-Ionen-m/z-Werte zu erstellen. Der fragmentierte chromatographische Durchlauf wurde dann manuell auf Gegenwart oder Abwesenheit solcher potenzieller Fragmente untersucht, die innerhalb des experimentell festgelegten m/z-Bereichs liegen. Jeder potenzielle Peptidkandidat wurde dann hinsichtlich seiner Übereinstimmung mit den tatsächlichen Fragmenten entsprechend der Massenspektrometriedaten mit einem Fehler von 40 ppm überprüft. Ferner wurden die Fragmente und die Vorstufenmassen, von denen diese stammten, manuell in SEQUEST^TM eingegeben und eine Abfrage derselben Datenbank durchgeführt, um die Werte für Kreuzkorrelation (XCorr) und Delta-Korrelation (dCn) für Vergleiche mit Ionenfallendaten zu erzeugen. Schließlich wurde dieselbe Probe unter Verwendung einer ähnlichen Strategie für die Umkehrphasentrennung in einer LCQ-Ionenfallen-LC/MS (MS)-Konfiguration von ThermoFinnigan untersucht. Die Ergebnisse wurden einer automatischen Datenbankanalyse mit SEQUEST^TM (Eng et al., supra, 1994) unterworfen, um die ESI-TOF-Ergebnisse zu bestätigen.
Die Scans des chromatographischen Bereichs in 5 wurden für sowohl nicht fragmentarische als auch fragmentarische Durchläufe summiert und in 6 bzw. 7 dargestellt. Der dreifach geladene Peak bei 620,3436 m/z und der doppelt geladene Peak bei 930,0258 m/z wurde auf [M + H] = 1859,03 dekonvoltiert. Die Datenbank über offene Leseraster für Hefe wurde auf cysteinhaltige Peptide mit diesem [M + H] durchsucht, die vollständig tryptisch waren, zwei mögliche übersehene Spaltungen enthielten und innerhalb von 30 ppm der dekonvoltierten Masse lagen. In 5 zeigt die Pfeilspitze auf das Peptid YRPNCPIILVTR (SEQ ID NO: 26), das sich nach Chromatographie als einziges Peptid ergab. Obwohl während der MS keine Ionenselektion durchgeführt wurde, wurde das Peptid trotzdem positiv identifiziert. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 1 hervor, wobei ein Peptid, die Sequenz YRPNCPIILVTR (SEQ ID NO: 26), durch 22 von 33 erkannten Ionen positiv identifiziert wurde (Tabelle 1, SEQ ID NOS: 27–33, 26 bzw. 34–38).
Tabelle 2 zeigt die theoretischen Massen jedes Fragments, das im experimentellen m/z-Bereich (300–1500 m/z) liegt, wobei die übereinstimmenden Peaks mit "*" und dem jeweiligen ppm-Fehler angegeben sind. Die Massen wurden von Hand in SEQUEST^TM eingegeben, um die in Tabelle 1 gezeigten Werte für die Kreuzkorrelation und die delta-Korrelation zu erzeugen. Schließlich wurde das Peptid auch bei einer Abfrage von Ionenfallendaten derselben Probe in SEQUEST^TM gefunden, wobei der Xcorr-Wert 3,75 und der Wert der delta-Korrelation 0,325 betrug.
In einer komplexeren Probe wurden zwei Peptide gleichzeitig im Chromatogramm eluiert (siehe 8). Die gemeinsam eluierten Peptide wurden in der Ursprungsregion ohne Ionenselektion fragmentiert. Obwohl MS ohne Ionenselektion durchgeführt wurde, wurden die beiden gemeinsam eluierenden Peptide trotzdem identifiziert.
Die in 9 dargestellten nicht fragmentarischen Massen wurde in das vorstehend verwendete Suchprogramm für eine Datenbank eingegeben. Die potenziellen Peptide wurden in silico fragmentiert und die erhaltenen Fragmentmassen mit den fragmentarischen m/z-Spektralwerten aus 10 verglichen. Tabelle 3 zeigt die Kandidatpeptide für [M1 + H] = 1486,76 und die Anzahl der abgeglichenen Ionen. Als Peptidsequenz wurde VCSSHTGLIR (SEQ ID NO: 44) bestimmt (Tabelle 3, SEQ ID NOS: 39–49) bestimmt.
Tabelle 4 zeigt die Kandidatpeptide für [M2 + H] 1758,84 und die Anzahl der abgeglichenen Ionen. Als Peptidsequenz wurde GHNIPCTSTISGR (SEQ ID NO: 60) (Tabelle 4, SEQ ID NOS: 50–63) bestimmt.
Im Falle beider Peptide ([M1 + H) = 1486, 76 und [M2 + H] = 1758,84) wurden die m/z-Werte der Fragmente von Hand in SEQUEST^TM eingegeben und die Werte für XCorr und dCn erzeugt. Sie gehen aus Tabelle 3 bzw. 4 hervor.
Tabelle 5 und 6 zeigen, welche Fragment-Ionen abgeglichen wurden ("*"), die theoretischen m/z-Werte der Fragmente und die ppm-Fehler der tatsächlichen m/z-Werte. Schließlich wurden auch diese Peptide bei einer Abfrage der Ionenfallendaten derselben Probe mittels SEQUEST^TM gefunden, wobei der Xcorr-Wert für [M1 + H] = 1486,76 2,84 und der Wert der delta-Korrelation 0,198 und der Xcorr-Wert für (M2 + H) = 1758,84 3.18 und der Wert der delta-Korrelation 0,299 betrug.
Diese Ergebnisse zeigen, dass positive Identifizierungen von Peptidsequenzen für Peptide in Reinform und zusammen mit anderen Peptiden erhalten wurden, das heißt, für einzeln bzw. gemeinsam mit anderen eluierende Peptide. Bei gleichzeitig eluierenden Peptiden wurde eine "Shotgun"-Sequenzanalyse unter Verwendung von in-source CID auf einem einstufigen ESI-TOF-Massenspektrometer durchgeführt. Verglichen mit einer herkömmlichen Peptid-Sequenzanalyse mithilfe von Tandem-MS, bei der parentale Ionen sequenziell selektiert werden, ermöglicht eine Kombination aus Cystein-Beschränkung, hoher Massengenauigkeit und hoher Massenauflösung die parallele Shotgun-Sequenzanalyse von Peptiden. Das Verfahren kann auch mit ICAT (Gygi et al., Nature Biotechnol. 17: 994–999 (1999)) bei der Analyse von mit ICAT-markierten Peptiden in einer Analyse verwendet werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass parentale Proteine aus einer Kombination aus bestimmten Charakteristika identifiziert werden können. In diesem Beispiel waren die bestimmten Charakteristika (1) Cysteingehalt, (2) genaue Peptidmasse und (3) genaue Peptidfragmentmasse ohne Selektion spezifischer Ionen.
BEISPIEL V
Erzeugung einer Datenbank für Drosophila als Polypeptididentifizierungsindex
In diesem Beispiel ist die Erzeugung einer Datenbank zur Identifizierung von Drosophila-Proteinen beschrieben.
Als Modellorganismus, der eine Art repräsentiert, für die die vollständige Genomsequenz bestimmt wurde und deren Genomsequenz eine große Anzahl an Exonen enthält, wurde Drosophila gewählt. Der Zweck des Versuchs war die Erzeugung einer großen Gruppe an Peptiden und Proteinen von einer Art, deren Genomsequenz vollständig bestimmt war, um die Peptide mittels mehrdimensionaler Chromatographie zu trennen und die Peptide über die Erzeugung von CID-Spektren und Abfragen einer Sequenzdatenbank zu identifizieren und jedes identifizierte Peptid mit einem Strichcode mit Informationen zu annotieren, die während des Fraktionier-/Identifizierverfahrens erhalten wurden.
Schneider-Zellen (S2) (10⁹) von Drosophila melanogaster wurden durch Züchten in einer geeigneten Gewebekulturnährlösung vorbereitet. Die Zellen wurden gelyst und die gebildeten Lysate durch differenzielles Zentrifugieren in eine Kernfraktion, eine Zytoplasmafraktion und eine mikrosomale Fraktion fraktioniert. Jede Fraktion wurde in zwei identische Hälften geteilt und die Proteine, die in jeder Probe enthalten waren, mit entweder dem isotopisch normalen (d0) oder dem isotopisch schweren (d8) ICAT-Reagenz markiert. Die markierten Proben, die dieselben subzellulären Fraktionen darstellen, wurden dann vereinigt, um eine 1:1 Proteinmischung aus isotopenmarkierten Proteinen zu erstellen, und trypsinitiert. Die gebildeten Peptide wurden mittels Kationenaustauschchromatographie wie in Beispiel II bestimmt und anschließender Avidin-Chromatographie zur selektiven Isolierung der markierten Peptide und Umkehrphasenchromatographie fraktioniert. Die getrennten Peptide wurden analysiert und in einem LCQ-Ionenfallen-Massenspektrometer CID unterworfen. Die gebildeten Peptid-CID-Spektren wurden einer Datenbankabfrage unterworfen, wobei die Fliegen-Sequenzdatenbank des Fliegen-Genomsequenz-Konsortiums und der Suchalgorithmus Sequest^TM verwendet wurden.
Zur Identifizierung der Proteine mittels Abfrage einer Sequenzdatenbank anhand von Peptid-CID-Spektren wurden die folgenden Suchparameter verwendet: Es wurden ausschließlich doppeltryptische Peptide mit mindestens einem Cysteinrest berücksichtigt. Es waren ein delta-Korrelationsfaktor von mehr als 0,1 und für ein doppelt geladenes Vorläufer-Ion ein X-Korrelationskoeffizient von mehr als 2,0 erforderlich (X-corr. > 1,5 für einfach geladene Peptide; X-corr. > 2,5 für dreifach geladene Peptide).
In der Kernfraktion wurden 1470 Proteine identifiziert. In der Zytoplasmafraktion wurden 967 Proteine identifiziert. In der mikrosomalen Fraktion wurden 1500 Proteine identifiziert. Somit wurden mit dieser Analyse etwa 4000 Proteine identifiziert. Die Daten belegen somit die Verwendbarkeit multidimensionaler Chromatographie, Tandem-Massenspektrometrie und Abfragen von Sequenzdatenbanken zur Errichtung einer annotierten Peptiddatenbank für ein spezifisches Gewebe, einen Zelltyp oder ein Art.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich ein Polypeptididentifizierungsindex erzeugen lässt, der zur Identifizierung einer großen Anzahl an Polypeptiden verwendet werden kann.
BEISPIEL VI
Verwendung des isoelektrischen Punkts als Unterscheidungscharakteristikum für die Polypeptididentifizierung
In diesem Beispiel ist die Verwendung des isoelektrischen Punkts (pI) als Charakteristikum zur Identifizierung eines Polypeptids beschrieben.
Der isoelektrische Punkt von Peptiden wurde als Unterscheidungskomponente geprüft, die für einen Peptid-Strichcode nützlich ist. Zu den Vorteilen der Verwendung des pI als Komponenten des Strichcodes gehören: i) der pI ist einfach und genau anhand der Aminosäuresequenz eines Peptids vorhersagbar; ii) der pI kann mittels IEF präzise gemessen werden und iii) die Peptide können wirksam aus den IEF-Gelen wiedergewonnen werden.
Eine Ionenaustauschfraktion der in Beispiel V beschriebenen Peptidproben von Fliegen wurde weiter mittels Elektrofokussierung in einem Polyacrylamid-Gel mit immobilisiertem pH-Gradient (IPG-IEF) getrennt. Die Peptide, die an einem Segment um pI 6,8–7,0 fokussierten, wurden ausgeschnitten und die in dieser Fraktion enthaltenen Peptide wurden extrahiert und mittels LC-MS/MS analysiert. Die gebildeten CID-Spektren wurden, wie in Beispiel V beschrieben, einer Abfrage in einer Sequenzdatenbank unterworfen und der pI jedes identifizierten Peptids wurde unter Verwendung der Sequenz der besten Übereinstimmung mit der Sequenzdatenbank ermittelt. Tabelle 7 zeigt zur Veranschaulichung des Verfahrens eine Teilliste der Ergebnisse (SEQ ID NOS: 64–117). Die pI der meisten identifizierten Peptide häuften sich in einem engen pI-Bereich, ein Anzeichen dafür, dass der pI zur genauen Berechnung anhand der Sequenz verwendbar ist.
Die Daten zeigen ferner, dass eine (geringe) Anzahl an Peptiden vorkam, deren beste Übereinstimmung zu einem pI außerhalb des aus dem Gel extrahierten Bereichs führte. Eine genauere Untersuchung dieser Peptide lässt vermuten, dass der Sequenzdatenbankabgleich für diese Peptide außerhalb des pI-Bereichs des extrahierten Gels mit größter Sicherheit falsch war, da die Suchwerte Randwerte waren, die Peptide üblicherweise einen höheren Anteil an übersehenen Trypsin-Spaltstellen enthielten und zahlreiche Peptide nicht tryptisch waren. Insgesamt gesehen zeigen die Daten die Effektivität der Verwendung des Peptid-pI als eine Komponente für den Strichcode zur Identifizierung eines Polypeptids in einem Polypeptididentifizierungsindex.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der pI als Charakteristikum eines Polypeptids zur Identifizierung eines Polypeptids unter Verwendung eines Polypeptididentifizierungsindex verwendet werden kann.
Die Erfindung ist hier zwar unter Bezugnahme auf die offenbarten Ausführungsformen beschrieben, für Fachleute ist es jedoch offensichtlich, dass die spezifischen ausführlich beschriebenen Versuche nur als Veranschaulichung der Erfindung dienen. Es ist offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen möglich sind, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verfahren der Massenspektrometrie, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte umfasst: kontinuierliches Verändern eines Massenspektrometers zwischen: (i) einem parentalen Ionen Scan-Modus der Durchführung, wobei eine Vielzahl parentaler Polypeptid-Ionen im Hinblick auf ihre Masse analysiert werden; und (ii) einem kollisionsinduzierten Disoziations- (CID) Scan-Modus der Durchführung, wobei eine Vielzahl parentaler Polypeptid-Ionen simultan fragmentiert und die resultierenden Fragment-Ionen in Bezug auf ihre Masse analysiert werden; Bestimmen der Masse der parentalen Polypeptid-Ionen; Bestimmen der Masse der Fragment-Ionen; Vergleichen der Masse der parentalen Polypeptid-Ionen und der Masse der Fragment-Ionen mit einem annotierten Polypeptidindex; und Identifizieren eines oder mehrerer Polypeptide des annotierten Polypeptidindex auf Basis der bestimmten Massen der parentalen Polypeptid-Ionen und der Fragment-Ionen.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Quantifizieren der Menge eines identifizierten Polypeptids in einer Probe, die das Polypeptid enthält, umfasst.
verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ferner das Messen der relativen Häufigkeit in zwei oder mehr verschiedenen Populationen von Polypeptiden umfasst.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, das ferner das Bestimmen eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit einem oder mehreren parentalen Polypeptiden assoziiert sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Schritt des Vergleichens der Masse der parentalen Ionen und der Masse der Fragment-Ionen mit einem annotierten Polypeptidindex ferner das Vergleichen eines oder mehrerer zusätzlicher Charakteristika, die mit einem oder mehreren parentalen Polypeptiden assoziiert sind, mit dem annotierten Polypeptidindex umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem das eine oder die mehreren zusätzlichen Charakteristika die Aminosäurezusammensetzung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, bei dem das eine oder die mehreren zusätzlichen Charakteristika den pI-Wert umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, bei dem das eine oder die mehreren zusätzlichen Charakteristika die Reihenfolge der Elution an einem chromatographischen Medium umfasst.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, bei dem in dem kollisionsinduzierten Dissoziations-Scan-Modus der Durchführung die Vielzahl parentaler Ionen simultan in Abwesenheit der Ionenselektion fragmentiert werden.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, bei dem die Fragment-Ionen in Bezug auf ihre Masse mit einer Genauigkeit in ppm von mehr als 1 ppm analysiert werden.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, bei dem die Fragment-Ionen in Bezug auf ihre Masse mit einer Genauigkeit in ppm von mehr als 2,5 ppm analysiert werden.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, bei dem die Fragment-Ionen in Bezug auf ihre Masse mit einer Genauigkeit in ppm von 5 ppm oder mehr ppm analysiert werden.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, bei dem die Fragment-Ionen in Bezug auf ihre Masse mit einer Genauigkeit in ppm von 10 ppm oder mehr ppm analysiert werden.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch, bei dem die Fragment-Ionen in Bezug auf ihre Masse mit einer Genauigkeit in ppm von 100 ppm oder mehr ppm analysiert werden.